KR20240004564A - 디스트로핀병증의 치료를 위한 마이크로디스트로핀 유전자 치료법 투여 - Google Patents

디스트로핀병증의 치료를 위한 마이크로디스트로핀 유전자 치료법 투여 Download PDF

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Abstract

마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 함유하는 치료 유효 용량의 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)의 투여에 의해 디스트로핀병증, 예컨대 뒤시엔느 근이영양증 및 베커 근이영양증의 증상을 치료하거나 완화하는 방법이 제공된다.

Description

디스트로핀병증의 치료를 위한 마이크로디스트로핀 유전자 치료법 투여
1. 발명의 분야
본 발명은 유전자 치료법 벡터, 예컨대 이식유전자가 마이크로디스트로핀을 암호화하는 AAV 유전자 치료법 벡터의 용량 투여에 의한 디스트로핀병증의 치료에 관한 것이다.
2. 배경
디스트로핀병증이라 불리는 일군의 신경근 질환은 DMD 유전자의 돌연변이로 인해 발생한다. 각 디스트로핀병증은 뚜렷한 표현형을 갖고 있으며, 모든 환자는 근육 약화 그리고 궁극적으로는 중증도가 다양한 심근병증을 앓는다. 뒤시엔느 근이영양증(DMD)은 중증 X-연관 진행성 신경근 질환으로 대략 출생 남아 3,600 내지 9,200명 중 1명에게 영향을 미친다. 이 장애는 디스트로핀 단백질의 발현을 없애는 디스트로핀 유전자의 프레임이동 돌연변이로 인해 발생한다. 디스트로핀 단백질의 부재로 인해, 골격근, 그리고 궁극적으로 심장 및 호흡 근육(예를 들어, 늑간근 및 횡경막)이 변성되어 조기 사망을 유발한다. 진행성 약화 및 근육 위축은 소아기에 시작된다. 영향을 받은 개인은 호흡 곤란, 호흡기 감염 및 삼킴 문제를 경험한다. 거의 모든 DMD 환자는 심근병증을 앓게 된다. 심장 침범이 복합된 폐렴은 가장 빈번한 사망 원인으로, 30대 이전에 자주 발생한다.
베커 근이영양증(BMD)은 DMD보다 증상이 덜 중증이지만 여전히 조기 사망으로 이어진다. DMD와 비교하여 BMD는 나중에 발병하는 골격근 약화가 특징이다. DMD 환자는 13세 이전에 휠체어에 의존하는 반면, BMD 환자는 16세 이후 보행 능력을 상실하고 휠체어를 필요로 한다. 또한 BMD 환자는 DMD 환자와 달리 목 굴근 강도의 보존을 나타낸다. 더 경도의 골격근 침범에도 불구하고 DMD 관련 확장성 심근병증(DCM)으로 인한 심부전은 BMD에서 이환율의 일반적인 원인이며 가장 흔한 사망 원인이고, 평균 40대 중반에 발생한다.
디스트로핀은 DMD 유전자에 의해 암호화되는 세포질 단백질이며, 세포골격 액틴 필라멘트를 막 단백질에 연결하는 기능을 한다. 일반적으로 디스트로핀 단백질은 주로 골격근 및 심장근에 위치하며 뇌에서는 더 소량 발현되고, 수축 기구의 액틴을 각각의 근섬유를 둘러싸는 결합 조직층에 연결하여 근섬유 수축 동안 충격 흡수장치로서 작용한다. 근육에서 디스트로핀은 근육속막의 세포질 면에 편재된다.
DMD 유전자는 알려진 인간 유전자 중 가장 큰 것이다. DMD 또는 BMD를 유발하는 가장 흔한 돌연변이는 하나 이상의 엑손의 대규모 결실 돌연변이(60-70%)이지만 중복 돌연변이(5-10%) 및 단일 뉴클레오티드 변이체(DMD가 있는 남성에서 병원성 변이체의 대략 25-35%, 및 BMD가 있는 남성의 약 10 내지 20%를 차지하는 작은 결실 또는 삽입, 단일 염기 변화 및 스플라이스 부위 변화 포함)도 병원성 디스트로핀 변이체를 유발할 수 있다. DMD에서 돌연변이는 종종 프레임 이동으로 이어져 조기 정지 코돈 및 절단되거나 기능이 없거나 불안정한 단백질을 초래한다. 논센스 점 돌연변이가 또한 동일한 결과를 갖는 조기 종료 코돈을 초래할 수 있다. DMD를 유발하는 돌연변이는 임의의 엑손에 영향을 미칠 수 있지만 엑손 2-20 및 45-55가 대규모 결실 및 중복 돌연변이의 일반적인 핫스팟이다. 프레임-내 결실은 덜 중증인 베커 근이영양증(BMD)을 초래하며, 환자는 절단되고 부분적으로 기능하는 디스트로핀을 발현한다.
전장 디스트로핀은 그 기능에 기여하는 여러 하위도메인을 포함하는 대형(427 kDa) 단백질이다. 이러한 하위 도메인은 아미노 말단에서 카복시 말단 방향으로 N 말단 액틴 결합 도메인, 중앙의 소위 "막대" 도메인, 시스테인 풍부 도메인 및 마지막으로 카복시 말단 도메인 또는 영역을 포함한다. 막대 도메인은 하기 순서로 4개의 프롤린 풍부 힌지 도메인(H로 약칭) 및 24개의 스펙트린 유사 반복부(R로 약칭)로 이루어진다: 첫 번째 힌지 도메인(H1), 3개의 스펙트린 유사 반복부(R1, R2, R3), 두 번째 힌지 도메인(H2), 16개의 추가 스펙트린 유사 반복부(R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19), 세 번째 힌지 도메인(H3), 5개의 추가 스펙트린 유사 반복부(R20, R21, R22, R23, R24) 및 네 번째 힌지 도메인(H4)(WW 도메인 포함). 막대 도메인 다음에는 시스테인 풍부 도메인 및 COOH(C)-말단(CT) 도메인이 있다.
다양한 희귀 질환을 잠재적으로 치료하기 위한 아데노 관련 바이러스(AAV) 매개 유전자 치료법의 사용이 발전함에 따라 AAV가 DMD, BMD 및 덜 중증인 디스트로핀병증을 치료하기 위해 사용될 수 있다는 희망과 관심이 있었다. AAV 벡터의 페이로드 크기 제한으로 인해 전장 단백질의 적어도 일부 기능을 유지하면서 비필수하위도메인을 제거하는 더 작은 버전의 디스트로핀인 마이크로- 또는 미니-디스트로핀을 생성하는 데 관심이 집중되었다. DMD에 대한 동물 모델인 mdx 마우스에서의 AAV 매개 마이크로디스트로핀 유전자 치료법은 근육에서 효율적인 발현 및 개선된 근육 기능을 나타내는 것으로 보고되었다(예를 들어, Wang 등, J. Orthop. Res. 27:421 (2009) 참고).
따라서, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 AAV 벡터를 DMD 또는 BMD를 포함하는 디스트로핀병증 증상의 치료 또는 완화를 위해 치료 유효 투여량으로 투여하고 바람직하게는 치료 단백질에 대한 면역 반응을 최소화하는 방법에 대한 필요성이 당분야에 존재한다.
3. 발명의 요약
마이크로디스트로핀을 암호화하는 핵산 게놈, 예컨대 도 2의 재조합 게놈(벡터로부터 생성되며, 본원에 사용된 바와 같은 "작제물"은 일반적으로 마이크로디스트로핀을 형성하고 재조합 AAV 입자를 제조하기 위해 사용되는 시스 플라스미드를 포함하는, 마이크로디스트로핀의 발현을 제어하는 조절 요소 및 AAV 입자에 패키징된 재조합 게놈을 포함할 수 있는 디스트로핀 단백질의 서브유닛 배열을 기재함)을 함유하는 rAAV 벡터 입자의 투여에 의해 디스트로핀병증의 증상을 치료하거나 완화하는 방법이 제공된다. 예를 들어 본원의 실시예 6, 7 및 8(하기 섹션 6.6, 6.7 및 6.8)에 기재된 바와 같은 약리 연구에 기반하여, 치료 유효 투여량의 말초 투여, 예컨대 정맥내 투여를 포함하는 투여에 의한 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법, 및 유전자 치료법에서 사용하기 위한 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 유전자 작제물에 대한 용도가 제공된다. 본원에 기재된 생체내 약리 연구에 기반하여, 본 개시의 마이크로디스트로핀 유전자 치료법을 투여하는 방법은 투여 후 적어도 12주, 26주 또는 52주에 디스트로핀병증 질환의 증상 및 바이오마커, 예컨대 크레아틴 키나제 활성, 비복근 병변, 근육 병변의 T2-이완 시간, 북극성 이동 평가(NSAA) 점수 그리고 이동성 및 근육 강도, 심장 기능 및 폐 기능의 다른 마커의 개선을 초래한다.
본원에 기재된 구현예는 치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 디스트로핀병증을 치료하는 방법이며, rAAV 입자는 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하고, 마이크로디스트로핀 단백질은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 다음을 갖고:
ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT
ABD는 디스트로핀의 액틴-결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, CR은 β-디스트로글리칸에 결합하는 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역 또는 이의 적어도 일부이고, CT는 디스트로핀의 C-말단 영역의 적어도 일부이고, 이 일부는 α1-신트로핀 결합 부위 및/또는 α-디스트로브레빈 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, CT 도메인은 디스트로핀의 C-말단의 근위 194개 아미노산(서열 번호 16의 아미노산 서열) 또는 적어도 서열 번호 92(UniProtKB-P11532)의 인간 디스트로핀 아미노산 잔기 3361-3554를 암호화하는 C-말단의 근위 부분 또는 적어도 엑손 70 내지 74에 의해 암호화된 C-말단의 근위 부분 및 엑손 75의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열의 처음 36개 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다. 대안적으로, CT 도메인은 절단되고 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하지만 α-디스트로브레빈 결합 부위는 포함하지 않는다(예컨대, 서열 번호 83의 아미노산 서열). 작제물은 조절 서열, 예컨대 SPc5-12 프로모터(서열 번호 39), 또는 대안적으로 절단된 SPc5-12 프로모터(서열 번호 40) 또는 SPc5-12 프로모터 변이체, 이의 돌연변이체 또는 전사 활성 부분(예컨대, 변형된 Spc5-12 프로모터 Spc5v1(서열 번호 93) 또는 Spc5v2(서열 번호 94))을 포함하는 근육-특이적 프로모터 서열, 및 폴리아데닐화 신호 서열, 예컨대 작은 폴리A 신호 서열(서열 번호 42)을 포함한다. 특정 작제물은 각각 조절 서열에 작동 가능하게 연결되고 AAV2 ITR 서열이 측면에 있는 서열 번호 20 및 서열 번호 81의 마이크로디스트로핀 암호화 뉴클레오티드 서열을 갖는 RGX-DYS1 및 RGX-DYS5(도 2 참고)를 포함하며, 재조합 게놈을 포함한 전체 작제물은 각각 서열 번호 53 또는 82의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 재조합 게놈을 함유하는 rAAV 입자는 구현예에서 AAV8이다. 예를 들어, rAAV 입자 또는 유전자 치료법 벡터는 AAV8-RGX-DYS1(서열 번호 53의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV8)이다.
특정 구현예에서, 구현예에서 AAV8-RGX-DYS1을 포함하여 본원에 개시된 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV 입자의 치료 유효량은 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg을 포함하는 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여된다. 특정 구현예에서, AAV8-RGX-DYS1을 포함하여 본원에 개시된 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV 입자의 치료 유효량은 1x1014, 1.1x1014, 1.2x1014, 1.3x1014, 1.4x1014, 1.5x1014, 1.6x1014, 1.7x1014, 1.8x1014, 1.9x1014, 2x1014, 2.1x1014, 2.2x1014, 2.3x1014, 2.4x1014, 2.5x1014, 2.6x1014, 2.7x1014, 2.8x1014, 2.9x1014, 또는 3x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여된다. 특정 구현예에서, rAAV 입자(AAV8-RGX-DYS1 포함)의 치료 유효량은 1x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 투여된다. 다른 구현예에서, rAAV 입자(AAV8-RGX-DYS1 포함)의 치료 유효량은 2x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 투여된다. 또 다른 구현예에서, rAAV 입자(AAV8-RGX-DYS1 포함)의 치료 유효량은 3x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 투여된다. 구현예에서, 치료제가 투여된 대상체에는 본원에 개시된 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 갖는 rAAV 입자의 투여 전에, 동시에 및/또는 이후 유지 치료법을 포함하여 후에 면역억제제가 예방적으로 투여된다. 면역억제제는 코르티코스테로이드, 항보체제, 예컨대 항-C3 및 C5 항체, 항사이토카인제, 예컨대 항사이토카인 항체, 예컨대 항-IL-6 및 항-IL6R 항체, 항-CD20 항체, 항-C5 및 항-CD20 항체의 조합, 라파마이신, 또는 항-IgG 치료법, 예컨대 임리피다제를 포함한다. 구현예에서, 동반 면역억제 요법은 마이크로디스트로핀 투여 전에 및 후에 경구 프레드니솔론의 일일 용량 및/또는 에쿨리주맙(항-C5 항체; SOLIRIS®)의 용량, 및 선택적으로 경구 시롤리무스(라파마이신으로도 알려짐; RAPAMUNE®)의 투여를 포함한다.
특정 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 0.2 g/L 염화칼륨, 0.2 g/L 일염기성 인산칼륨, 1.2 g/L 이염기성 인산나트륨 무수물, 5.8 g/L 염화나트륨, 40 g/L 수크로스 및 0.01 g/L 폴록사머 188, pH 7.4를 포함하는 수크로스 완충액을 포함하는 변형된 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS)를 포함한다.
또한, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 본원에 제공된 마이크로디스트로핀을 암호화하는 재조합 벡터를 포함하는 약학 조성물 및 1x1014 게놈 카피/kg, 2×1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg 게놈 카피/kg을 포함하는 5 x 1013 내지 1 x 1015 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 투여를 포함하여, 치료를 필요로 하는 대상체에 본원에 기재된 유전자 치료법 벡터(AAV8-RGX-DYS1 포함)의 투여에 의한, 임의의 디스트로핀병증, 예컨대 뒤시엔느 근이영양증(DMD) 및 베커 근이영양증(BMD), X-연관 확장형 심근병증뿐만 아니라 DMD 또는 BMD 여성 보인자에 대한 치료 방법이 제공된다. 마이크로디스트로핀이 근육(골격근, 심장근 및/또는 평활근 포함)으로 전달되도록 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 투여에 의한 본원에 기재된 이식유전자 또는 유전자 카세트를 함유하는 rAAV(AAV8-RGX-DYS1 포함)의 투여에 의해, 디스트로핀병증, 예컨대 뒤시엔느 근이영양증(DMD) 및 베커 근이영양증(BMD), X-연관 확장성 심근병증을 치료, 증상 완화 또는 관리하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, rAAV는 정맥내 또는 근육내를 포함하여 전신 투여된다.
또한 개시된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여하는 단계를 포함하는, 염증 또는 섬유증 및/또는 근육 변성 감소를 필요로 하는 대상체의 근육에서 염증 또는 섬유증 및/또는 근육 변성을 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명은 마이크로디스트로핀 벡터의 작제 및 제조, 그리고 효과를 실증하는 시험관내 및 생체내 검정을 기재하는 하기 예에 의해 예시된다.
3.1 본 발명의 구현예
1. 치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스트로핀병증을 치료하는 방법으로서,
rAAV 입자가 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성된 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하고, ABD는 디스트로핀의 액틴 결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하고,
rAAV 입자의 치료 유효량은 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되는, 방법.
2. 구현예 1에 있어서, CT가 디스트로핀의 C-말단의 근위 194개 아미노산 또는 적어도 서열 번호 92(UniProtKB-P11532)의 인간 디스트로핀 아미노산 잔기 3361-3554를 암호화하는 C-말단의 근위 부분 또는 적어도 엑손 70 내지 74에 의해 암호화된 C-말단의 근위 부분 및 엑손 75의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열의 처음 36개 아미노산을 포함하거나 이로 구성된, 방법.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
4. 구현예 3에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 20의 핵산 서열에 의해 암호화된, 방법.
5. 구현예 1에 있어서, CT가 서열 번호 83의 아미노산 서열, 또는 α1-신트로핀 결합 부위는 포함하지만 디스트로브레빈 결합 부위는 포함하지 않는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 방법.
6. 구현예 1 또는 5에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 79의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
7. 구현예 6에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 81의 핵산 서열에 의해 암호화된, 방법.
8. 구현예 1-7 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 근육에서의 발현을 촉진하는 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 방법.
9. 구현예 8에 있어서, 전사 조절 요소가 근육-특이적 프로모터를 포함하는, 방법.
10. 구현예 9에 있어서, 근육 특이적 프로모터가 골격근, 평활근 또는 심장근 특이적 프로모터인, 방법.
11. 구현예 9 또는 10에 있어서, 근육 특이적 프로모터가 SPc5-12 또는 이의 전사 활성 부분 또는 돌연변이체인, 방법.
12. 구현예 11에 있어서, 프로모터가 서열 번호 39의 핵산 서열로 구성된, 방법.
13. 구현예 1-12 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 3'의 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 방법.
14. 구현예 1-13 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 프로모터와 마이크로디스트로핀 코딩 서열 사이에 인트론 서열을 포함하는, 방법.
15. 구현예 14에 있어서, 인트론 서열이 VH4 인트론 서열(서열 번호 41)인, 방법.
16. 구현예 1-4 및 8-13 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 서열 번호 53의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
17. 구현예 1, 및 5-13 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 서열 번호 82의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
18. 구현예 1-17 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자가 서열 번호 77과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 갖는, 방법.
19. 구현예 18에 있어서, rAAV가 AAV8 혈청형인, 방법.
20. 구현예 1-19 중 어느 하나에 있어서, 디스트로핀병증이 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근이영양증(BMD), 또는 X-연관 확장성 심근병증인, 방법.
21. 구현예 1-20 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자의 치료 유효량이 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
22. 구현예 1-21 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물이 정맥내 투여되는, 방법.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 크레아틴 키나제 활성이 대상체에서 상기 투여 전 수준에 비해 감소되는, 방법.
24. 구현예 23에 있어서, 크레아틴 키나제 활성의 감소가 0.5배 내지 1.5배인, 방법.
25. 구현예 23에 있어서, 크레아틴 키나제 활성의 감소가 3000 내지 10000 크레아틴 키나제 단위/리터인, 방법.
26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체의 비복근 병변이 상기 투여 전 비복근 병변과 비교하여 감소되는, 방법.
27. 구현예 26에 있어서, 대상체의 비복근 병변이 자기 공명 영상화(MRI)를 사용하여 평가되는, 방법.
28. 구현예 26 또는 27에 있어서, 투여 후 비복근 병변의 감소가 상기 투여 전 비복근 병변과 비교하여 약 3-10%인, 방법.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체의 비복근 부피가 상기 투여 전 비복근 부피와 비교하여 감소되는, 방법.
30. 구현예 29에 있어서, 비복근 부피 감소가 20 내지 100 mm3인, 방법.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 근육 병변의 T2-이완 시간이 상기 투여 전 T2-이완 시간과 비교하여 감소되는, 방법.
32. 구현예 31에 있어서, 감소가 2 내지 8밀리초인, 방법.
33. 구현예 31 또는 32에 있어서, 근육 병변이 비복근 병변인, 방법.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체가 약 -1 내지 2의 보행 점수를 나타내는, 방법.
35. 구현예 34에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주까지, 대상체가 약 1의 보행 점수를 나타내는, 방법.
36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 북극성 이동 평가(NSAA) 점수가 상기 투여 전 NSAA 점수와 비교하여 증가되는, 방법.
37. 구현예 36에 있어서, 증가가 0에서 1까지, 0에서 2까지 또는 1에서 2까지인, 방법.
38. 구현예 1-37 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체가 일어서거나, 정해진 거리를 뛰거나/걷거나, 정해진 수의 계단을 올라가는 데 걸리는 시간의 양이 감소되는, 방법.
39. 구현예 38에 있어서, 정해진 거리가 10미터인, 방법.
40. 구현예 38 또는 39에 있어서, 정해진 계단수가 4인, 방법.
41. 구현예 38-40 중 어느 하나에 있어서, 일어서는 데 걸리는 시간의 양 감소가 상기 투여 전과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30% 감소인, 방법.
42. 구현예 38-41 중 어느 하나에 있어서, 정해진 거리를 뛰는/걷는 데 걸리는 시간의 양 감소가 상기 투여 전과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30% 감소인, 방법.
43. 구현예 38-42 중 어느 하나에 있어서, 정해진 수의 계단을 올라가는 데 걸리는 시간의 양 감소가 상기 투여 전과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30% 감소인, 방법.
44. 구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체가 상기 투여 전 심장 기능과 비교하여 개선된 심장 기능을 나타내는, 방법.
45. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체가 상기 투여 전 폐 기능과 비교하여 개선된 폐 기능을 나타내는, 방법.
46. 염증 및/또는 섬유증 감소를 필요로 하는 대상체의 근육에서 염증 및/또는 섬유증을 감소시키는 방법으로서,
치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고;
rAAV 입자는 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고;
마이크로디스트로핀 단백질은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성되며, ABD는 디스트로핀의 액틴 결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 디스트로핀의 전체 C-말단 또는 α1-신트로핀 결합 부위 및 디스트로브레빈 결합 부위를 포함하는 CT의 일부를 포함하고;
rAAV 입자의 치료 유효량은 킬로그램당 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피(GC/kg)의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되고;
투여는 대상체의 근육에 대한 마이크로디스트로핀 단백질의 전달을 초래하는, 방법.
47. 근육 변성 감소를 필요로 하는 대상체에서 근육 변성을 감소시키는 방법으로서,
치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고;
rAAV 입자는 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고;
마이크로디스트로핀 단백질은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT를 포함하거나 이로 구성되며, ABD는 디스트로핀의 액틴 결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 디스트로핀의 전체 C 말단 또는 α1-신트로핀 결합 부위 및 디스트로브레빈 결합 부위를 포함하는 CT의 일부를 포함하고;
rAAV 입자의 치료 유효량은 킬로그램당 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피(GC/kg)의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되고;
투여는 대상체의 근육에 대한 마이크로디스트로핀 단백질의 전달을 초래하는, 방법.
48. 구현예 46 또는 47에 있어서, 근육이 대상체의 횡경막인, 방법.
49. 보행 변경을 필요로 하는 대상체에서 보행을 변경하는 방법으로서,
치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
rAAV 입자는 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고;
마이크로디스트로핀 단백질은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT를 포함하거나 이로 구성되며, ABD는 디스트로핀의 액틴 결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하며,
rAAV 입자의 치료 유효량은 킬로그램당 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피(GC/kg)의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되고;
대상체의 보행은 상기 투여 전 대상체의 보행과 비교하여 상기 투여 12주 후 변경되는, 방법.
50. 구현예 49에 있어서, 보행 변경이 균형의 증가, 보폭의 변화, 머리 움직임의 감소, 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
51. 구현예 46-50 중 어느 하나에 있어서, CT가 디스트로핀의 C-말단의 근위 194개 아미노산 또는 적어도 서열 번호 92(UniProtKB-P11532)의 인간 디스트로핀 아미노산 잔기 3361-3554를 암호화하는 C-말단의 근위 부분 또는 적어도 엑손 70 내지 74에 의해 암호화된 C-말단의 근위 부분 및 엑손 75의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열의 처음 36개 아미노산을 포함하거나 이로 구성된, 방법.
52. 구현예 46-51 중 어느 하나에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
53. 구현예 52에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 20의 핵산 서열에 의해 암호화된, 방법.
54. 구현예 46-53 중 어느 하나에 있어서, CT가 서열 번호 83의 아미노산 서열, 또는 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하지만 디스트로브레빈 결합 부위는 포함하지 않는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 방법.
55. 구현예 46-54 중 어느 하나에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 79의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
56. 구현예 55에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 81의 핵산 서열에 의해 암호화된, 방법.
57. 구현예 46-56 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 근육에서의 발현을 촉진하는 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 방법.
58. 구현예 57에 있어서, 전사 조절 요소가 근육-특이적 프로모터를 포함하는, 방법.
59. 구현예 58에 있어서, 근육 특이적 프로모터가 골격근, 평활근 또는 심장근 특이적 프로모터인, 방법.
60. 구현예 58 또는 59에 있어서, 근육 특이적 프로모터가 SPc5-12 또는 이의 전사 활성 부분 또는 돌연변이체인, 방법.
61. 구현예 58에 있어서, 프로모터가 서열 번호 39의 핵산 서열로 구성된, 방법.
62. 구현예 46-61 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 3'의 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 방법.
63. 구현예 46-62 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 프로모터와 마이크로디스트로핀 코딩 서열 사이에 인트론 서열을 포함하는, 방법.
64. 구현예 63에 있어서, 인트론 서열이 VH4 인트론 서열(서열 번호 41)인, 방법.
65. 구현예 46-64 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 서열 53의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
66. 구현예 46-65 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 서열 번호 82의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
67. 구현예 46-66 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자가 서열 번호 77과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 갖는, 방법.
68. 구현예 67에 있어서, rAAV가 AAV8 혈청형인, 방법.
69. 구현예 46-68 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자의 치료 유효량이 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
70. 구현예 46-69 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물이 정맥내 투여되는, 방법.
71. 구현예 1 내지 70 중 어느 하나에 있어서, AAV 입자의 상기 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 상기 대상체에 면역억제 치료법을 예방적으로 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
72. 구현예 71에 있어서, 면역억제 치료법이 코르티코스테로이드, 항-C5 항체, 항-IL6 또는 항-IL6R 항체, 및 항-CD20 항체, 항-C5와 항-CD20 항체의 조합, 라파마이신, 임리피다제, 또는 이의 조합인, 방법.
73. 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스트로핀병증의 치료에서 사용하기 위한 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물은 치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고,
rAAV 입자는 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고;
마이크로디스트로핀 단백질은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT를 포함하거나 이로 구성되며, ABD는 디스트로핀의 액틴 결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하고;
rAAV 입자의 치료 유효량은 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되는, 조성물.
74. 구현예 73에 있어서, CT가 디스트로핀의 C-말단의 근위 194개 아미노산 또는 적어도 서열 번호 92(UniProtKB-P11532)의 인간 디스트로핀 아미노산 잔기 3361-3554를 암호화하는 C-말단의 근위 부분 또는 적어도 엑손 70 내지 74에 의해 암호화된 C-말단의 근위 부분 및 엑손 75의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열의 처음 36개 아미노산을 포함하거나 이로 구성된, 조성물.
75. 구현예 73 또는 74에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
76. 구현예 75에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 20의 핵산 서열에 의해 암호화된, 조성물.
77. 구현예 73에 있어서, CT가 서열 번호 83의 아미노산 서열, 또는 α1-신트로핀 결합 부위는 포함하지만 디스트로브레빈 결합 부위는 포함하지 않는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 조성물.
78. 구현예 73 또는 77에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 79의 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
79. 구현예 78에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 81의 핵산 서열에 의해 암호화된, 조성물.
80. 구현예 73-79 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 근육에서의 발현을 촉진하는 전사 조절 요소를 추가로 포함하는, 조성물.
81. 구현예 80에 있어서, 전사 조절 요소가 근육-특이적 프로모터를 포함하는, 조성물.
82. 구현예 81에 있어서, 근육 특이적 프로모터가 골격근, 평활근 또는 심장근 특이적 프로모터인, 조성물.
83. 구현예 81 또는 82에 있어서, 근육 특이적 프로모터가 SPc5-12 또는 이의 전사 활성 부분 또는 돌연변이체인, 조성물.
84. 구현예 83에 있어서, 프로모터가 서열 번호 39의 핵산 서열로 구성된, 조성물.
85. 구현예 73-84 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 3'의 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 조성물.
86. 구현예 73-85 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 프로모터와 마이크로디스트로핀 암호화 서열 사이에 인트론 서열을 포함하는, 조성물.
87. 구현예 86에 있어서, 인트론 서열이 VH4 인트론 서열(서열 번호 41)인, 조성물.
88. 구현예 73-76 및 80-85 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 서열 53의 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
89. 구현예 73 및 77-85 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 서열 번호 82의 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
90. 구현예 73-89 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자가 서열 번호 77과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 갖는, 조성물.
91. 구현예 90에 있어서, rAAV가 AAV8 혈청형인, 조성물.
92. 구현예 73-91 중 어느 하나에 있어서, 디스트로핀병증이 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근이영양증(BMD), 또는 X-연관 확장성 심근병증인, 조성물.
93. 구현예 73-92 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자의 치료 유효량이 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 투여되는, 조성물.
94. 구현예 73-93 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물이 정맥내 투여되는, 조성물.
95. 구현예 73-94 중 어느 하나에 있어서, 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 크레아틴 키나제 활성이 대상체에서 상기 투여 전 수준에 비해 감소되는, 조성물.
96. 구현예 95에 있어서, 크레아틴 키나제 활성의 감소가 0.5배 내지 1.5배인, 조성물.
97. 구현예 95에 있어서, 크레아틴 키나제 활성의 감소가 3000 내지 10000 크레아틴 키나제 단위/리터인, 조성물.
98. 구현예 73-97 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체의 비복근 병변이 상기 투여 전 비복근 병변과 비교하여 감소되는, 조성물.
99. 구현예 98에 있어서,대상체의 비복근 병변이 자기 공명 영상화(MRI)를 사용하여 평가되는, 조성물.
100. 구현예 98 또는 99에 있어서, 투여 후 비복근 병변의 감소가 상기 투여 전 비복근 병변과 비교하여 약 3-10%인, 조성물.
101. 구현예 73-100 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체의 비복근 부피가 상기 투여 전 비복근 부피와 비교하여 감소되는, 조성물.
102. 구현예 101에 있어서, 비복근 부피 감소가 20 내지 100 mm3인, 조성물.
103. 구현예 73-102 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 근육 병변의 T2-이완 시간이 상기 투여 전 T2-이완 시간과 비교하여 감소되는, 조성물.
104. 구현예 103에 있어서, 감소가 2 내지 8밀리초인, 조성물.
105. 구현예 103 또는 104에 있어서, 근육의 병변이 비복근 병변인, 조성물.
106. 구현예 73-105 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체가 약 -1 내지 2의 보행 점수를 나타내는, 조성물.
107. 구현예 106에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주까지, 대상체가 약 1의 보행 점수를 나타내는, 조성물.
108. 구현예 73-107 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 북극성 이동 평가(NSAA) 점수가 상기 투여 전 NSAA 점수와 비교하여 증가되는, 조성물.
109. 구현예 108에 있어서, 증가가 0에서 1까지, 0에서 2까지 또는 1에서 2까지인, 조성물.
110. 구현예 73-109 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체가 일어서거나 정해진 거리를 뛰거나/걷거나, 정해진 수의 계단을 올라가는 데 걸리는 시간의 양이 감소되는, 조성물.
111. 구현예 110에 있어서, 정해진 거리가 10미터인, 조성물.
112. 구현예 110 또는 111에 있어서, 정해진 계단수가 4인, 조성물.
113. 구현예 110-112 중 어느 하나에 있어서, 일어서는 데 걸리는 시간의 양 감소가 일어서는 데 걸리는 시간의 양 감소가 상기 투여 전과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30% 감소인, 조성물.
114. 구현예 110-113 중 어느 하나에 있어서, 정해진 거리를 뛰는/걷는 데 걸리는 시간의 양 감소가 상기 투여 전과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30% 감소인, 조성물.
115. 구현예 110-114 중 어느 하나에 있어서, 정해진 수의 계단을 올라가는 데 걸리는 시간의 양 감소가 상기 투여 전과 비교하여 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30% 감소인, 조성물.
116. 구현예 73-115 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체가 상기 투여 전 심장 기능과 비교하여 개선된 심장 기능을 나타내는, 조성물.
117. 구현예 73-116 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물의 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 대상체가 상기 투여 전 폐 기능과 비교하여 개선된 폐 기능을 나타내는, 조성물.
118. 구현예 73 내지 117 중 어느 하나에 있어서, AAV 입자의 상기 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 상기 대상체에 면역억제 치료법을 예방적으로 투여하는 단계를 추가로 포함하는 조성물.
119. 구현예 118에 있어서, 면역억제 치료법이 코르티코스테로이드, 항-C5 항체, 항-IL6 또는 항-IL6R 항체, 및 항-CD20 항체, 항-C5 및 항-CD20 항체의 조합, 라파마이신, 임리피다제, 또는 이의 조합인, 조성물.
120. 구현예 1 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에 예방적 면역억제 요법이 투여되는, 방법 또는 조성물.
121. 구현예 120에 있어서, 예방적 면역억제 요법이 (1) 제1일부터 제8주까지 경구 프레드니솔론의 "일일 용량"; (2) rAAV 투여 전 및 후 에쿨리주맙의 주입; 및 (3) 제-7일부터 제8주까지 일일 경구 시롤리무스를 포함하며, 제1일은 rAAV 투여일인, 방법 또는 조성물.
122. 구현예 121에 있어서, 경구 프레드니솔론이 제1일부터 제8주 종료까지 1 mg/kg/일로 투여되고, 제1일은 rAAV 투여일이며, 이후 안전성 우려사항이 확인되지 않는 경우 용량을 제9주부터 제10주까지 0.5 mg/kg/일로 낮춘 후, 안전성 우려사항이 확인되지 않는 경우 용량을 제11주부터 제12주까지 0.25 mg/kg/일로 낮추는, 방법 또는 조성물.
123. 구현예 121 또는 122에 있어서, 에쿨리주맙이 주입에 의해 투여되고, (1) 체중이 10 내지 < 20 kg인 대상체의 경우, 제-9일, 제-2일, 제4일 및 제12일에 600 mg 에쿨리주맙; (2) 체중이 20 kg 내지 < 30 kg인 대상체의 경우, 제-16일, 제-9일, 제-2일 및 제12일에 800 mg 에쿨리주맙; (3) 체중이 30 kg 내지 < 40 kg인 대상체의 경우, 제-16일, 제-9일, 제-2일 및 제12일에 900 mg 에쿨리주맙; (4) 체중이 40 kg 이상인 대상체의 경우, 제-30일, 제-23일, 제-16일, 제-9일, 제-2일 및 제12일에 1200 mg 에쿨리주맙을 투여하며, 제1일은 rAAV 투여일인, 방법 또는 조성물.
124. 구현예 121 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 시롤리무스가 제-7일에 3 mg/m2으로 투여되고, 제-6일부터 제8주까지 일일 8-12 ng/ml의 표적 혈중 농도를 달성하기 위해 1 mg/m2/일의 용량이 2개 용량으로 나누어 투여되고, 안전성 시험이 안정적으로 유지되는 경우 제9주-제10주 동안 용량을 0.5 mg/m2/일로 감소시키고, 안전성 시험이 안정적으로 유지되는 경우 제11주-제12주 동안 용량을 0.25 mg/m2/일로 감소시키는, 조성물 또는 방법.
125. 치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로서,
rAAV 입자는 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성된 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하며, ABD는 디스트로핀의 액틴 결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하고,
rAAV 입자의 치료 유효량은 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되는, 약학 조성물.
126. 치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로서, rAAV 입자는 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하고, 마이크로디스트로핀 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 약학 조성물.
127. 치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로서, rAAV 입자는 AAV8 입자이고 서열 번호 53의 뉴클레오티드 서열을 갖는 인공 게놈을 포함하는, 약학 조성물.
128. 구현예 125 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체가 0.2 g/L 염화칼륨, 0.2 g/L 일염기성 인산칼륨, 1.2 g/L 이염기성 인산나트륨 무수물, 5.8 g/L 염화나트륨, 40 g/L 수크로스 및 0.01 g/L 폴록사머 188, pH 7.4를 포함하는 수크로스 완충액을 포함하는 변형된 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS)를 포함하는, 방법.
129. 구현예 125 내지 128 중 어느 하나의 약학 조성물을 대상체에 정맥내 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스트로핀병증을 치료하는 방법.
130. 구현예 129에 있어서, 디스트로핀병증이 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근이영양증(BMD), 또는 X-연관 확장성 심근병증인, 방법.
131. 구현예 129 또는 130에 있어서, rAAV 입자의 치료 유효량이 1x1014, 1.1x1014, 1.2x1014, 1.3x1014, 1.4x1014, 1.5x1014, 1.6x1014, 1.7x1014, 1.8x1014, 1.9x1014, 2x1014, 2.1x1014, 2.2x1014, 2.3x1014, 2.4x1014, 2.5x1014, 2.6x1014, 2.7x1014, 2.8x1014, 2.9x1014, 또는 3x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
132. 구현예 129 또는 130에 있어서, rAAV 입자의 치료 유효량이 1x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
133. 구현예 129 또는 130에 있어서, rAAV 입자의 치료 유효량이 2x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
134. 구현예 129 또는 130에 있어서, rAAV 입자의 치료 유효량이 3x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 투여되는. 방법.
135. 치료 유효량의 arAAV 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 치료, 염증 및/또는 섬유증 감소, 근육 변성 감소 또는 보행 변경을 필요로 하는 대상체에서 디스트로핀병증을 치료하거나, 근육의 염증 및/또는 섬유증을 감소시키거나, 근육 변성을 감소시키거나, 보행을 변경하는 데 사용하기 위한 약학 조성물로서,
rAAV 입자는 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성된 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 인공 게놈을 포함하고, ABD는 디스트로핀의 액틴-결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 근육에서 발현을 촉진하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결되고 AAV ITR 서열이 측면에 있는, α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하고;
rAAV 입자의 치료 유효량은 킬로그램당 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피(GC/kg)의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되고;
투여는 대상체의 근육에서 50 ng/mg 초과의 마이크로디스트로핀 단백질을 생성하는, 약학 조성물.
136. 치료, 염증 및/또는 섬유증 감소, 근육 변성 감소 또는 보행 변경을 필요로 하는 대상체에서 치료, 염증 및/또는 섬유증 감소, 근육 변성 감소 또는 보행 변경을 필요로 하는 대상체에서 디스트로핀병증을 치료하거나, 근육의 염증 및/또는 섬유증을 감소시키거나, 근육 변성을 감소시키거나, 보행을 변경하는 방법으로서,
치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
rAAV 입자는 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성된 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 인공 게놈을 포함하고, ABD는 디스트로핀의 액틴-결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 근육에서 발현을 촉진하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결되고 AAV ITR 서열이 측면에 있는, α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하고;
rAAV 입자의 치료 유효량은 킬로그램당 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피(GC/kg)의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되고;
투여는 대상체의 근육에서 50 ng/mg 초과의 마이크로디스트로핀 단백질을 생성하는, 방법.
137. 구현예 135 또는 136에 있어서, 대상체의 근육에서 마이크로디스트로핀의 양이 투여 5주, 10주, 12주, 20주, 또는 26주 후 모세관 기반 웨스턴 검정에 의해 측정되는, 조성물 또는 방법.
138. 구현예 135 내지 137 중 어느 하나에 있어서, CT가 디스트로핀의 C-말단의 근위 194개 아미노산 또는 적어도 서열 번호 92(UniProtKB-P11532)의 인간 디스트로핀 아미노산 잔기 3361-3554를 암호화하는 C-말단의 근위 부분 또는 적어도 엑손 70 내지 74에 의해 암호화된 C-말단의 근위 부분 및 엑손 75의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열의 처음 36개 아미노산을 포함하거나 이로 구성된, 조성물 또는 방법.
139. 구현예 135-138 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 조성물 또는 방법.
140. 구현예 139에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 20의 핵산 서열에 의해 암호화되는, 조성물 또는 방법.
141. 구현예 135-137에 있어서, CT가 서열 번호 83의 아미노산 서열, 또는 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하지만 디스트로브레빈 결합 부위는 포함하지 않는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 조성물 또는 방법.
142. 구현예 135, 136, 137 또는 141 중 어느 하나에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 79의 아미노산 서열을 갖는, 조성물 또는 방법.
143. 구현예 142에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 81의 핵산 서열에 의해 암호화되는, 조성물 또는 방법.
144. 구현예 135-143 중 어느 하나에 있어서, 전사 조절 요소가 근육-특이적 프로모터를 포함하는, 조성물 또는 방법.
145. 구현예 144에 있어서, 근육 특이적 프로모터가 골격근, 평활근 또는 심장근 특이적 프로모터인, 조성물 또는 방법.
146. 구현예 144 또는 145에 있어서, 근육 특이적 프로모터가 SPc5-12 또는 이의 전사 활성 부분 또는 돌연변이체인, 조성물 또는 방법.
147. 구현예 146에 있어서, 프로모터가 서열 번호 39의 핵산 서열로 구성된, 조성물 또는 방법.
148. 구현예 135-147 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 3'의 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 조성물 또는 방법.
149. 구현예 135-148 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 프로모터와 마이크로디스트로핀 코딩 서열 사이에 인트론 서열을 포함하는, 조성물 또는 방법.
150. 구현예 149에 있어서, 인트론 서열이 VH4 인트론 서열(서열 번호 41)인, 조성물 또는 방법.
151. 구현예 135-140 및 144-150 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 서열 53의 핵산 서열을 포함하는, 조성물 또는 방법.
152. 구현예 135-137 및 141-150 중 어느 하나에 있어서, 이식유전자가 서열 번호 82의 핵산 서열을 포함하는, 조성물 또는 방법.
153. 구현예 135-152 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자가 서열 번호 77과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 캡시드 단백질을 갖는, 조성물 또는 방법.
154. 구현예 153에 있어서, rAAV가 AAV8 혈청형인, 조성물 또는 방법.
155. 구현예 135-154 중 어느 하나에 있어서, 디스트로핀병증이 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근이영양증(BMD), 또는 X-연관 확장성 심근병증인, 조성물 또는 방법.
156. 구현예 135-155 중 어느 하나에 있어서, rAAV 입자의 치료 유효량이 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 투여되는, 조성물 또는 방법.
157. 구현예 135-156 중 어느 하나에 있어서, 약학 조성물이 정맥내 투여되는, 조성물 또는 방법.
4. 도면의 간단한 설명
도 1a-1b. (a) RGX-DYS1 마이크로디스트로핀(디스트로브레빈 및 α1-신트로핀 결합 부위(뿐만 아니라 β1-신트로핀 결합 부위)를 함유하는 C 말단 도메인을 가짐) 및 (b) 야생형 디스트로핀 단백질 및 액틴 세포골격과 디스트로핀 관련 단백질 복합체(DAPC) 간 상호작용을 나타내는 근육속막의 예시. 적어도 디스트로브레빈 및 신트로핀 결합 부위를 갖는 RGX-DYS1은 부분적으로 α1-신트로핀을 통해 nNOS를 모집하고 근육속막에 고정할 것으로 예상된다. Syn: 신트로핀; Dbr: 디스트로브레빈; CR: 시스테인 풍부 도메인; nNOS: 신경 산화질소 합성효소; DG: 디스트로글리칸; H: 힌지; R: 스펙트랄 유사 반복부; SG: 사코글리칸.
도 2는 AAV 재조합 게놈을 생성하는 유전자 치료법을 위한 시스 플라스미드에서 사용하기 위한, 다르게는 마이크로디스트로핀 작제물 또는 이식유전자로 지칭되는 벡터 유전자 발현 카세트를 예시한다. 각 성분 및 전체 이식유전자에 대한 DNA 길이가 각 작제물에 대해 나열되어 있다. SPc5-12: 합성 근육 특이적 프로모터; CT1.5: α1-신트로핀 결합 부위를 포함하지만 디스트로브레빈 결합 부위는 포함하지 않는 CT 도메인의 140개 아미노산(서열 번호 83)을 함유하는 절단된/최소 CT 도메인; VH4: 인간 면역글로빈 중쇄 가변 영역 인트론; ABD: 액틴 결합 도메인; H: 힌지; R: 막대; CR: 시스테인 풍부 도메인; CT: C-말단 도메인; smPA: 작은 폴리A; ABD: 액틴 결합 도메인 1(ABD1).
도 3a-3d: AAV-마이크로디스트로핀 벡터 주사 비복근 조직으로부터 추출된 디스트로핀에 대한 웨스턴 블롯. 레인 1 내지 4 = AAV8-RGX-DYS1 주사 mdx 마우스로부터의 단백질 샘플, 레인 5 내지 8 = AAV8-RGX-DYS5 주사 mdx 마우스로부터의 단백질 샘플, 및 레인 9 내지 12 = AAV8-RGX-DYS3 주사 mdx 마우스로부터의 단백질 샘플. α1-액틴은 각 레인에서 로딩 대조군으로서 작용한다. Mdx(레인 13)는 주사되지 않은 mdx 마우스를 표시한다. 디스트로핀 블롯의 경우 마우스 항-디스트로핀 모노클로날 항체를 사용했다(1:100 희석). 항-알파1-액틴 블롯의 경우, 폴리클로날 항체를 희석 인수 1:10,000으로 사용하였고, 2차(항토끼) 항체를 1:20,000으로 사용하였다. a(b)의 단백질 샘플로부터 웨스턴 블롯 분석에서 마이크로디스트로핀 밴드의 정량, ddPCR에 의한 비복근의 AAV-μ-Dys 벡터 카피수(c) 및 AAV-μ-Dys 벡터 카피수에 의해 정규화된 마이크로디스트로핀 단백질 밴드의 정량(d). * p< 0.05; ** P< 0.01; *** P< 0001.
도 4a-4b: 골격근(비복근)에서의 마이크로디스트로핀 및 야생형(WT) 디스트로핀의 mRNA 발현. 골격근으로부터 전체 RNA를 추출하고 cDNA를 합성했다. 마이크로디스트로핀, WT-디스트로핀 및 내인성 대조군 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수효소(GAPDH) mRNA의 카피수를 디지털 PCR(Naica Crystal Digital PCR 시스템, Stilla 기술)을 사용하여 측정하였다. a. GAPDH에 의해 정규화된 상대적 마이크로- 또는 WT-디스트로핀 mRNA 발현. B6-WT 골격근에서 GAPDH에 대한 WT-디스트로핀의 비를 1로 간주하였다. b. 단일 세포에서의 상대적 마이크로- 또는 WT-디스트로핀 mRNA 발현. 마이크로- 또는 WT-디스트로핀 mRNA 발현 카피수를 세포당 GAPDH 및 게놈 카피수 의해 정규화하였다.
도 5a-5d: 골격근에서의 알파-신트로핀 발현. mdx 마우스 및 마우스로부터 추출된 비복근을 기재된 바와 같이 처리하였다: Bl6(미처리 야생형 마우스); RGX-DYS1(마우스 ID 3553 및 마우스 ID 3588); RGX-DYS3(마우스 ID 5 및 마우스 ID 7); 및 RGX-DYS5(마우스 ID 9 및 마우스 ID 11). a. 근육 조직 용해물로부터의 신트로핀에 대한 웨스턴 블롯. b. 웨스턴 블롯 밴드의 정량. *, p< 0.05; ***, p< 0.0001. c. 전체 근육 막 단백질로부터의 신트로핀에 대한 웨스턴 블롯. d. 웨스턴 블롯 밴드의 정량.
도 6a-6c: 골격근에서의 nNOS 발현. a. nNOS에 대한 면역형광 염색. b. nNOS에 대한 웨스턴 블롯. c. 웨스턴 블롯 밴드의 정량.
도 7a-7c: 마이크로디스트로핀 유전자를 암호화하는 AAV 벡터에 의한 위성 세포의 형질도입 및 세포 재생의 완화. a. AAV-DMD 형질도입 위성 세포의 백분율. b. RNAscope® 이미지의 전체 위성 세포 계수. c. ddPCR에 의해 드러난 상이한 그룹으로부터의 골격근에서의 Pax7 mRNA 발현. 마이크로디스트로핀에 대한 프라이머 및 탐침은 이전에 기재된 바와 동일하다. B6-WT 골격근에서 pax7 대 GAPDH의 비를 1로 간주하였다. 미처리 mdx 마우스와 비교하여 **, p< 0.01; ***, p< 0.001; ****, p< 0.0001.
도 8a-8f는 NHP에서 AAV8 및 AAV9의 생체분포 및 이식유전자 발현의 비교를 나타낸다. 고유한 바코드를 갖는 AAV8 및 AAV9 패키징 CAG-GFP 카세트를 개별적으로 제조하고 거의 동일한 농도로 다른 캡시드와 함께 풀링하여 118개의 바코드화 AAV의 라이브러리를 생성했다. 이 라이브러리(PAVE118)를 1.77e13 GC/kg의 용량으로 3마리 시노몰구스 원숭이에 정맥내 투여하였다. 투약 3주 후 다양한 NHP 조직으로부터 단리된 DNA 및 RNA로 상대적 존재비에 대해 차세대 서열(NGS) 분석을 실시했다. 비인간 영장류의 골격근(각각 a 및 b), 심장근(각각 c 및 d) 및 간(각각 e 및 f)에서 AAV8 및 AAV9 캡시드로부터의 DNA와 RNA 수준 간에는 유의차가 없었다.
도 9a-9d: EDL 근육의 그립 강도 및 시험관내 힘. AAV8-RGX-DYS1 투여가 mdx 마우스의 근육 기능을 개선하였다. (a 및 b) 제5주의 그립 강도를 측정했다. (a) 최대력, 및 (b) 각 마우스 체중에 의해 계산된 정규화된 앞다리 값. (c 및 d). EDL 근육의 시험관내 힘은 제6주에 수행하였다. (c) 절대적 앞다리 및 (d) 근육의 단면적에 의해 생성된 최대력을 정규화함으로써 얻은 EDL 근육의 비력. 야생형(WT) 데이터는 시험 시설에서 연령 일치 HCD로부터 얻었다. *** p<0.001. 야생형 HCD 데이터 대비; *** p<0.001. 비히클 대조군 mdx 대비; 스튜던트(student's) t-시험을 사용하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다.
도 10a-10k: mdx 비히클 대조군 마우스 및 AAV8-RGX-DYS1이 투여된 mdx 마우스의 근육 병리. AAV8-RGX-DYS1 투여는 mdx 마우스의 골격근 염증, 변성 및 재생을 약화시켰다. (a-c) 염증을 H&E 염색에 기반하여 평가했다. 노란색 점선은 조직 내 염증성 병소의 영역을 나타낸다. TA(b) 및 횡경막(c)의 염증%를 측정했다. (d-f) TA 및 횡경막의 재생 섬유를 재생의 마커인 항-eMHC 염색에 의해 검사했다; 빨간색 점선은 변성 영역의 면적을 나타낸다. 양성 섬유를 TA(e) 및 횡경막(f)에서 계수하고 해당 섹션의 전체 면적 mm2에 대해(섬유/mm2) 정규화하였다. (g-i) TA 및 횡격막의 변성 섬유를 항-IgM 염색에 의해 검사했다; 빨간색 점선은 변성 영역의 면적을 나타낸다. 양성 섬유를 TA(h) 및 횡경막(i)에서 계수하고 해당 섹션의 전체 면적 mm2에 대해(섬유/mm2) 정규화하였다. (j 및 k) TA(j) 및 횡격막(k) 조직 섹션의 5개 무작위 필드에서 중앙 유핵 백분율(%) 계산을 수행했다. 각 필드에서 중앙 유핵 섬유 및 전체 섬유를 계수하고 중앙 유핵 섬유(CNF)의 백분율을 계산했다. 확대된 영역(막대=200 μm)을 사용한 20X에서 TA 및 횡경막의 모든 대표적 이미지. TA 근육(n=3)에 대한 연령 일치 BL10 야생형 대조군을 시험 시설 조직 은행에서 염색했다. 횡경막의 경우 연령 일치 BL10 야생형 HCD를 사용했다. *** p<0.001, 야생형 HCD 데이터 대비. * p<0.05, *** p<0.001, 비히클 대조군 mdx 대비; 스튜던트 t-시험을 사용하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다.
도 11a-11b: 2x1014 GC/kg 용량으로 mdx 마우스에서의 RGX-DYS1 벡터 DNA 생체분포. AAV8-RGX-DYS1 투여 그룹(n=12)으로부터 수집된 조직 및 비히클 대조군 그룹(n=11)으로부터의 간을 ddPCR에 의해 분석했다. AAV8-RGX-DYS1 투여 그룹의 마우스로부터 수집된 모든 조직은 추정 정량 하한(LLOQ)(약 0.08 GC/dg)보다 2-4 log 높았으며, 비히클 대조군 그룹의 마우스로부터의 간 샘플은 대략 LLOQ에 있었다. 벡터 게놈 카피 데이터는 GC/dg(a) 및 GC/μg DNA(b) 둘 모두로 제시되었다. EDL: 장지신근; TA: 전경골근. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다.
도 12: 웨스턴 블롯에 의해 측정된, RGX-DYS1-투여 mdx 마우스로부터의 횡격막, 비복근 및 TA 근육의 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 수준. 막대는 BL10 야생형 마우스 및 독일 쇼트헤어 포인터 근이영양증(GSHPMD) 개 근육 용해물(조직당 n = 10)의 혼합물로 제조된 표준 곡선에 기반한 평균 디스트로핀% + S.D.를 나타낸다.
도 13a-13c: 면역형광에 의한 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 이식유전자 발현. a. 마이크로디스트로핀/디스트로핀에 대한 면역형광을 비히클 또는 AAV8-RGX-DYS1 투여 6주 후 TA 및 횡격막에서 수행하였다. AAV8-RGX-DYS1 투여는 각각 TA(b) 및 횡격막(c)에서 마이크로디스트로핀을 갖는 막에 편재된 섬유 96% 및 89.1% 섬유를 생성한다. 확대된 영역(막대=200 μm)을 사용한 20X에서 TA 및 횡경막의 모든 대표적 이미지. TA 근육에 대한 연령 일치 BL10 야생형 대조군(n=3)을 시험 시설 조직 은행으로부터 염색하였다. 횡경막의 경우 시험 시설로부터의 연령 일치 BL10 야생형 HCD를 사용했다. *** p<0.001, 야생형 대비; * p<0.05, *** p<0.001, 비히클 대조군 mdx 대비; 스튜던트 t-시험을 사용하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다.
도 14: 면역형광에 의한 디스트로핀 관련 단백질 복합체(DAPC). DAPC 단백질: α1-신트로핀, 디스트로브레빈, nNOS-1 및 β-디스트로글리칸과 디스트로핀을 면역형광에 의해 TA 조직에서 측정했다. AAV8-RGX-DYS1 투여는 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 양성 섬유와 함께 편재된 신트로핀 및 디스트로브레빈 발현을 회복시켰다; β-디스트로글리칸 발현은 부분적으로 회복되었다. nNOS 발현은 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스에서 검출 가능했으며 비히클 대조군 mdx 마우스보다 높았지만 야생형만큼 강력하지는 않았다. 확대된 영역(막대 = 100 μm)을 사용한 20X에서 TA의 모든 대표적 이미지. 각 그룹에서 별은 동일한 섬유를 표시한다. TA 근육에 대한 연령 일치 BL10 야생형 대조군(n=5)을 시험 시설 조직 은행에서 염색하였다.
도 15: 미세 운동 운동학적 보행 분석으로부터의 전반적 보행 점수 자동화 보행 분석을 mdx 마우스에 대한 AAV8-RGX-DYS1 투여(그룹당 n=8-10) 6주 및 12주 후 수행하였다. 전반적 보행 점수에서, 투약 6주 후 명확한 mdx 마우스 모델 효과가 관찰되었으며, 투약 12주 후에는 훨씬 더 큰 효과가 관찰되었다. 제12주에, 1x1014, 3x1014 및 5x1014 GC/kg의 용량으로 AAV8-RGX-DYS1이 투여된 mdx 마우스에서 전반적 보행 점수가 유의하게 개선되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성: * p < 0.05, *** p < 0.001, 야생형 비히클 대비(RM 양방향 ANOVA, 시닥(Sidak's) 사후 분석); * p < 0.05, ** p < 0.01, mdx 비히클 대비(혼합 효과 모델 ANOVA, 던넷(Dunnett's) 사후 분석).
도 16a-16e: T2-자기 공명 영상화. T2 가중 MRI를 mdx 마우스(그룹당 n=8-10)에 대한 비히클 또는 AAV8-RGX-DYS1 투여 6주 및 12주 후 수행하였다. (a) 대표적 이미지가 제시된다. 고강도 병변은 노란색 화살표(6주) 및 빨간색 화살표(12주)로 표시된다. (b) 비복근 부피(mm3) (c) 자동화 역치 분석을 사용하여 얻은 비복근 고강도 백분율(%) (d) 비복근 병변 및 비병변(e)의 T2 이완 시간(밀리초, ms)을 측정하였다. 모든 데이터는 조합된 양쪽 다리로부터 얻었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성: * p < 0.05, *** p < 0.001, 야생형 비히클 대비(RM 양방향 ANOVA, 시닥 사후 분석); ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, mdx 비히클 대조군 대비(혼합 효과 모델 ANOVA, 던넷 사후 분석).
도 17: 제6주, 제9주, 제12주의 그립 강도(체중에 대해 정규화). 그립 강도는 비히클 또는 AAV8-RGX-DYS1(군당 n=8-10)을 표시된 용량으로 투여한 6주, 9주, 12주 후 수행했다. 명확한 mdx 마우스 모델 효과는 투약 6주 및 9주 후 관찰되지 않았다. 투약 12주 후, 야생형 마우스와 mdx 마우스 사이에 차이가 주지되었으나 통계적 유의성은 없었다. 제12주에, 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교될 때, 3x1014 및 5x1014 GC/kg의 용량으로 AAV8-RGX-DYS1이 투여된 mdx 마우스에서 그립 강도가 유의하게 개선되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성: * p < 0.05, *** p < 0.001, mdx 비히클 대조군 대비(혼합 효과 모델 ANOVA, 던넷 사후 분석).
도 18: 제7주 및 제12주의 크레아틴 키나제 농도. mdx 마우스(그룹당 n=8-10)에 대한 비히클 또는 AAV8-RGX-DYS1 투여 7주 및 12주 후 혈청으로부터의 CK 분석을 수행했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성: **** p < 0.0001, 야생형 대비(RM 양방향 ANOVA, 시닥 사후 분석); * p < 0.05, **** p < 0.0001, mdx 비히클 대조군 대비(혼합 효과 모델 ANOVA, 던넷 사후 분석).
도 19: BL10 야생형 및 mdx 마우스(비히클- 또는 AAV8-RGX-DYS1-투여)의 간 및 근육 조직의 벡터 DNA 생체분포. 막대는 평균값 + S.D.를 나타내며, 그룹당 각 조직에 대해 n = 5이다. BL10 야생형 마우스 및 mdx 비히클 대조군 마우스로부터 수집된 조직은 정량 한계(BQL = 50 카피/μg DNA) 또는 검출 한계(LOD = 11.96 카피/μg DNA) 미만의 벡터 DNA 수준을 나타내었다.
도 20a-20b: 비복근, 횡격막 및 심장의 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀/디스트로핀 단백질 발현. (a). 막대는 BL10 마우스 및 GSHPMD 개 근육 용해물의 혼합물로 제조된 표준 곡선에 기반한 평균 디스트로핀% + S.E.를 나타낸다. BL10 야생형(n = 10); mdx 비히클 대조군(n = 9); AAV8-RGX-DYS1 mdx(용량 그룹당 n = 8 - 10). **** p<0.0001, 야생형 대비; * p<0.05, **** p<0.0001, 비히클 대조군 mdx 마우스 대비 (b) 횡격막에서 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀/디스트로핀 단백질의 대표적 웨스턴 블롯. 검은 상자: 야생형 디스트로핀의 예상 분자 위치; 점선 상자: 혈청으로부터의 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 이미지 분석의 예상 분자 위치 분석을 수행하였다.
도 21은 상이한 농도의 RGX-DYS1로 처리한 26주간 연구로부터의 마우스 체중을 나타낸다.
도 22는 T2-자기 공명 영상화를 나타낸다. 상이한 농도의 RGX-DYS1로 처리한 26주 연구의 제17주에 마우스의 MRI로부터의 대표적 이미지를 나타낸다.
도 23은 T2-자기 공명 영상화를 나타낸다. 상이한 농도의 RGX-DYS1을 처리한 26주 연구의 제26주에 마우스의 MRI로부터의 대표적 이미지를 나타낸다.
도 24a-24b는 비복근(a) 부피 및 (b) 병변의 MRI 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성: **** p < 0.0001, 야생형 비히클 대비(반복 측정(RM) 양방향 분산 분석(ANOVA), 시닥 사후 분석); * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, mdx 비히클 대비(혼합 효과 모델 ANOVA, 던넷 사후 분석).
도 25a-25b는 (a) T2 시간-병변(%) 및 (b) T2 시간-비병변(%)의 MRI 결과를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성: ** p < 0.01, **** p < 0.0001, 야생형 비히클 대비(반복 측정(RM) 양방향 분산 분석(ANOVA), 시닥 사후 분석); * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, mdx 비히클 대비(혼합 효과 모델 ANOVA, 던넷 사후 분석).
도 26은 mdx 마우스에 대한 AAV8-RGX-DYS1 투여 6주, 17주 및 26주 후 전반적 보행 점수를 제공한다. 전반적 보행 점수에서 모든 시점에 명확한 mdx 마우스 모델 효과가 관찰되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성: * p < 0.05, *** p < 0.001, 야생형 비히클 대비(반복 측정(RM) 양방향 분산 분석(ANOVA), 시닥 사후 분석); * p < 0.05, ** p < 0.01, mdx 비히클 대비(혼합 효과 모델 ANOVA, 던넷 사후 분석).
도 27은 대조군 마우스 또는 상이한 농도의 RGX-DYS1로 처리된 마우스에서 제12주, 제18주 및 제27주에서의 크레아틴 키나제 농도의 예를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성: **** p < 0.0001, 야생형 비히클 대비(반복 측정(RM) 양방향 분산 분석(ANOVA), 시닥 사후 분석); *** p < 0.001, **** p < 0.0001, mdx 비히클 대비(혼합 효과 모델 ANOVA, 던넷 사후 분석).
도 28은 제9주, 제17주 및 제26주에 처리군에서 체중에 대해 정규화된 그립 강도에 대한 예시적 데이터를 나타낸다.
도 29a-29f는 RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서의 섬유증 및 염증을 나타낸다. (a) 횡경막의 대표적 Masson 삼색 염색 및 그 정량(c)이 제시된다. 또한, 횡격막 및 심장에서 섬유증을 측정하였다(c 및 d). 횡격막의 염증성 세포에 대한 대표적 H&E 이미지(b) 및 그 정량(e). 염증성 세포의 수를 비복근(f)에서도 평가했다. 데이터는 변화 배율(야생형 대비)로 제시된다. 그룹당 4 내지 5마리 동물을 사용했다. * p < 0.05, 야생형 대비; * p < 0.05, mdx 비히클 대조군 대비.
도 30은 BL10 야생형 및 mdx 마우스(비히클- 또는 RGX-DYS1-투여)의 간 및 근육 조직에서의 벡터 DNA 생체분포를 나타낸다. 막대는 평균값 + SD를 나타내며, 그룹당 각 조직에 대해 n = 5이다. 야생형 마우스 및 mdx 비히클 대조군 마우스로부터 수집된 조직은 정량 수준 미만(BQL) = 50 카피 또는 LOD = 11.96의 벡터 DNA 수준을 나타냈다. 정량 한계(LOQ)(50 카피) 미만의 모든 벡터 DNA 수준은 평균 계산에서 0으로 가정하였다.
도 31은 AAV8-RGX-DYS1이 투여된 mdx 마우스의 비복근, 횡경막 및 심장에서의 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀/디스트로핀 단백질 발현을 나타낸다. 막대는 야생형 마우스 및 독일 쇼트헤어 포인터 근이영양증(GSHPMD) 개 근육 용해물의 혼합물로 제조된 표준 곡선에 기반한 평균 디스트로핀% + SEM을 나타낸다. n = 7 - 10/그룹. RGX-DYS1 투여 mdx와 비히클 mdx 그룹의 비교를 위해 비복근에서는 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 시험에 이어 던넷 사후 다중 비교 시험을 사용하였고, 횡경막 및 심장에서는 일원 분산 분석에 이어 다중 비교를 위한 던넷 사후 분석 조정을 사용하였다. 통계적 유의성은 a p < 0.002 및 b p < 0.001(AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 대 비히클 대조군 mdx 마우스)에서 확인되었다.
도 32a-32c는 면역형광에 의한 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현을 나타낸다. (a) 메로신(근섬유에 대한 마커)으로의 마이크로디스트로핀/디스트로핀에 대한 면역형광을 비히클 또는 RGX-DYS1 투여 26주 후 횡격막 조직에서 수행하였다. 디스트로핀/마이크로디스트로핀 섬유의 백분율(b) 및 근육속막에서 디스트로핀/마이크로디스트로핀 세기를 측정했다(c). 확대된 영역(막대 = 200 μm)을 사용한 20X에서 횡경막의 모든 대표적 이미지. *** p<0.001, * *** p<0.0001, 야생형 대비; ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, 비히클 대조군 mdx 대비. 데이터는 평균 ± SD로 제시된다.
도 33a-33b는 AAV8-RGX-DYS1 투여가 비력을 유의하게 증가시키고 횡경막 근육의 손상 저항 능력을 개선하였음을 나타낸다. (a) 그 단면적에 대해 근육에 의해 생성된 최대 B력을 정규화하여 계산된 횡경막 근육의 비력(N/cm2). 도면에서 분홍색 원 및 화살촉은 예상 강도 값 내에 있는 이상값을 나타낸다. (b) 야생형 또는 mdx 마우스로부터 단리된 횡격막 근육으로 5회 편심성 수축(ecc)을 거치고, 각 수축에서 측정된 힘을 첫 번째 수축 동안 생성된 힘의 백분율로 표현했다. 데이터는 평균 ± SD로 제시된다. **** p < 0.0001, 야생형 대비; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, mdx 비히클 대조군 대비.
도 34a-34b는 AAV8-RGX-DYS1 투여가 비력을 증가시키고 EDL 근육의 손상 저항 능력을 개선하였음을 나타낸다. (a) 그 단면적에 대해 근육에 의해 생성된 최대력을 정규화하여 계산된 횡격막 근육의 비력(N/cm2). (b) 야생형 또는 mdx 마우스로부터 단리된 EDL 근육으로 5회 편심성 수축(ecc)을 거치고, 각 수축에서 측정된 힘은 첫 번째 수축 동안 생성된 힘의 백분율로 표현했다. 데이터는 평균 ± SD로 제시된다. * p < 0.05, ** p < 0.01, 야생형 대비; * p < 0.05, ** p < 0.01, mdx 비히클 대조군 대비.
도 35a-35b는 RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서 염증의 유의한 감소가 관찰되었음을 나타낸다. 횡경막(a) 및 TA(b)전체 섹션의 염증성 세포수를 계수하여 변화 배율(야생형 대비)로 제시했다. 야생형 및 비히클 대조군 mdx 마우스(용량 그룹당 n = 4-5) 및 RGX-DYS1 투여 mdx 마우스(용량 그룹당 n = 4-5)를 사용했다. 통계적 유의성: * p < 0.05, 야생형 대비; * p < 0.05, mdx 비히클 대조군 대비.
도 36은 야생형 및 mdx 마우스로부터 수집된 횡경막, 비복근 및 심장근에서 제6주의 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 발현을 나타낸다. 조직의 단백질 수준은 모세관 기반의 웨스턴 면역검정에 의해 측정하였다. 막대는 평균 마이크로디스트로핀% ± SEM을 나타낸다. 야생형 마우스(n = 3) 및 비히클 대조군 mdx 마우스(n = 5)는 임의의 정량 가능한 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 수준을 나타내지 않았으며 모두 정량 수준 미만(BLQ) 값(정량 수준(LOQ) 5 ng/mg 단백질 미만)은 평균 계산에서 0으로 처리하였다; RGX-DYS1 투여 mdx 마우스(용량 그룹당 n = 4-5).
도 37a-37c는 살아있는 세포 형광 펄스-추적 영상화(a), 단백질 겔 형광(b) 및 사이클로헥시미드 추적(c) 방법에 따른 반감기 결정에 의해 측정된 RGX-DYS3(μDys-CT48)과 비교된 RGX-DYS1(μDys-CT194)의 마이크로디스트로핀 안정성을 예시한다.
5. 상세한 설명
뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근이영양증(BMD) 및 X-연관 확장성 심근병증을 포함하지만 이에 제한되지 않는 디스트로핀병증의 치료를 위해, 예를 들어 근육 세포에서, 발현을 위한 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 재조합 게놈(및 재조합 게놈과 함께 rAAV를 제조하기 위한 시스 플라스미드)을 포함하는 유전자 치료법 벡터, 특히 AAV 벡터를 투여하는 방법이 제공된다. 이식유전자에 의해 암호화된 마이크로디스트로핀 단백질은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성되며, ABD는 디스트로핀의 액틴 결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하거나, 적어도 서열 번호 92(UniProt-KB-P111532)의 인간 디스트로핀 아미노산 잔기 3361-3354를 암호화하는 C-말단의 근위 부분, 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있거나, 대안적으로 CT는 서열 번호 83을 포함하거나 이로 구성된 절단된 CT를 포함하고, 마이크로디스트로핀은 서열 번호 1(RGX-DYS1) 또는 서열 번호 79(RGX-DYS5)의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이식유전자는 예를 들어 근육 특이적 프로모터, 예컨대 SPc5-12(서열 번호 39) 및 폴리아데닐화 신호, 예컨대 작은 폴리A 신호(서열 번호 42)를 포함하는 조절 서열을 추가로 포함한다. 예시적인 작제물(시스 플라스미드 및 AAV 게놈 포함)은 예를 들어 도 2에 도시되며, (RGX-DYS1의 경우 서열 번호 53 및 RGX-DYS5의 경우 서열 번호 82)의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있고, ITR 서열(AAV2 ITR 서열, 예컨대 서열 번호 53 및 서열 번호 82의 뉴클레오티드 서열에서 확인되는 서열 포함)을 포함할 수 있다. 유전자 치료법 벡터는 AAV8 또는 AAV9 혈청형 벡터일 수 있다. 특정 구현예에서, 유전자 치료법 벡터는 서열 번호 53(RGX-DYS1)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 인공 게놈을 포함하는 AAV8이고, AAV8-RGX-DYS1로 지칭될 수 있다.
mdx 마우스(하기 실시예 6, 7 및 8에서 수행된 약리 연구에 기반하여, 본원에 기재된 이식유전자(RGX-DYS1 및 RGX-DYS5 포함)를 함유하는 rAAV(구현예에서, AAV8-RGX-DYS1 포함)의 말초(정맥내 포함) 투여를 위한 치료 유효 단일 용량은 5x1013 GC/kg 내지 1x1015 GC/kg이고 1x1014, 1.1Х1014, 1.2x1014, 1.3x1014, 1.4x1014, 1.5x1014, 1.6x1014, 1.7x1014, 1.8x1014, 1.9x1014, 2x1014, 2.1x1014, 2.2x1014, 2.3x1014, 2.4x1014, 2.5x1014, 2.6x1014, 2.7x1014, 2.8x1014, 2.9x1014, 또는 3x1014 GC/kg를 포함하는 그 범위 내의 투여량을 포함한다. 본원에 기재된 이식유전자를 포함하는 rAAV(AAV8-RGX-DYS1 포함)의 이러한 치료 유효 투여량의 투여는 투여로부터 12주, 26주, 52주 이상 이내에 디스트로핀병증 질환의 하나 이상의 지표 완화, 예컨대 크레아틴 키나제 활성 감소, 근육 부피 감소, 근육 병변, 보행 또는 이동 점수(예컨대, NSAA 점수) 또는 다른 강도 또는 이동성 측정 개선을 초래한다.
따라서, 투여를 필요로 하는 대상체를 포함하는 대상체에, RGX-DYS1 및 RGX-DYS5 작제물을 포함하는, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 재조합 게놈을 포함하는, rAAV8을 포함하는 rAAV를 투여하는 방법이 본원에 제공되고 기재되며, 투여는 5Х1013 GC/kg 내지 1Х1015 GC/kg의 투여량으로의 정맥내 또는 다른 말초 투여이고, 1Х1014, 1.1Х1014, 1.2Х1014, 1.3Х1014, 1.4Х1014, 1.5Х1014, 1.6Х1014, 1.7Х1014, 1.8Х1014, 1.9Х1014, 2Х1014, 2.1Х1014, 2.2Х1014, 2.3Х1014, 2.4Х1014, 2.5Х1014, 2.6Х1014, 2.7Х1014, 2.8Х1014, 2.9Х1014, 또는 3Х1014 GC/kg를 포함하는 그 범위 내의 투여량을 포함한다. 또한, 본원에 기재된 마이크로디스트로핀-암호화 rAAV의 정맥내 투여를 포함하는, 말초용으로 제형화된 약학 조성물이 제공된다.
5.1. 정의
"AAV" 또는 "아데노 관련 바이러스"라는 용어는 파보비리대 바이러스 속 내의 종속 파보바이러스를 지칭한다. AAV는 자연 발생 "야생형" 바이러스로부터 유래된 AAV, 자연 발생 cap 유전자에 의해 암호화된 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드에 패키징된 rAAV 게놈으로부터 및/또는 비-천연 발생 캡시드 cap 유전자에 의해 암호화된 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드에 패키징된 rAAV 게놈으로부터 유래된 AAV일 수 있다. 후자의 예는 변형된 서열을 갖는 캡시드 단백질 및/또는 자연 발생 캡시드의 아미노산 서열로의 펩티드 삽입을 갖는 rAAV를 포함한다.
"rAAV"라는 용어는 "재조합 AAV"를 지칭한다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV는 rep 및 cap 유전자의 일부 또는 전부가 이종 서열로 대체된 AAV 게놈을 갖는다.
"rep-cap 헬퍼 플라스미드"라는 용어는 바이러스성 rep 및 cap 유전자 기능을 제공하고 기능적 rep 및/또는 cap 유전자 서열이 결여된 rAAV 게놈으로부터 AAV의 제조를 돕는 플라스미드를 지칭한다.
"cap 유전자"라는 용어는 바이러스의 캡시드 코트를 형성하거나 형성하는 것을 돕는 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다. AAV의 경우 캡시드 단백질은 VP1, VP2 또는 VP3일 수 있다.
"rep 유전자"라는 용어는 바이러스의 복제 및 제조에 필요한 비구조 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다.
"핵산" 및 "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), DNA와 RNA 분자의 조합 또는 하이브리드 DNA/RNA 분자, 그리고 DNA 또는 RNA 분자의 유사체를 포함한다. 이러한 유사체는 예를 들어 이노신 또는 트리틸화 염기를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 유사체는 또한 분자에 유익한 속성, 예를 들어 뉴클레아제 저항성 또는 세포막을 통과하는 증가된 능력을 부여하는 변형된 골격을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있고, 단일 가닥 및 이중 가닥 부분을 둘 모두 함유할 수 있으며, 삼중 가닥 부분을 함유할 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
본원에 개시된 아미노산 잔기는 보존적 치환에 의해 변형되어 전반적 폴리펩티드 구조 및/또는 기능을 유지하거나 실질적으로 유지할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "보존적 아미노산 치환"은 소수성 아미노산(즉, Ala, Cys, Gly, Pro, Met, Val, lie 및 Leu)이 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있고; 부피가 큰 측쇄를 갖는 소수성 아미노산(즉, Phe, Tyr 및 Trp)이 부피가 큰 측쇄를 갖는 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있고; 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산(즉, Arg, His 및 Lys)이 양으로 하전된 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고; 음으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산(즉, Asp 및 Glu)이 음으로 하전된 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며; 극성 비하전 측쇄를 갖는 아미노산(즉, Ser, Thr, Asn 및 Gln)이 극성 비하전 측쇄를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있음을 표시한다.
"대상체", "숙주" 및 "환자"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 바람직하게는 포유동물, 예컨대 비영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간), 가장 바람직하게는 인간이다.
"치료적으로 기능적인 마이크로디스트로핀"이라는 용어는 마이크로디스트로핀이 본원의 섹션 5.4에 기재된 치료적 유용성에 대한 검정 중 하나 이상에서 또는 본원의 섹션 5.5에 기재된 치료 방법의 평가에서 치료적 유효성을 나타냄을 의미한다.
"대상체", "숙주" 및 "환자"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 바람직하게는 포유동물, 예컨대 비영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간), 가장 바람직하게는 인간이다.
"치료제"라는 용어는 질환 또는 장애와 관련된 증상을 치료, 관리 또는 완화하는 데 사용될 수 있는 임의의 제제를 지칭하며, 질환 또는 장애는 이식유전자에 의해 제공되는 기능과 관련된다. "치료 유효량"은 표적 질환 또는 장애를 앓는 대상체에 투여될 때 표적 질환 또는 장애의 치료 또는 관리에 있어서 적어도 하나의 치료적 이점을 제공하는 제제의 양(예를 들어, 이식유전자에 의해 발현되는 생성물의 양)을 지칭한다. 또한, 본 발명의 제제에 대한 치료 유효량은 질환 또는 장애의 치료 또는 관리에 있어서 적어도 하나의 치료적 이점을 제공하는 단독으로 또는 다른 치료법과 조합될 때의 제제의 양을 의미한다.
"예방제"라는 용어는 질환 또는 장애의 방지, 발생 가능성 감소, 지연 또는 진행 둔화에서 사용될 수 있는 임의의 제제를 지칭하며, 질환 또는 장애는 이식유전자에 의해 제공될 기능과 관련된다. "예방 유효량"은 이에 대한 소인이 있는 대상체에 투여될 때, 표적 질환 또는 장애의 방지 또는 지연에 있어서 적어도 하나의 예방적 이점을 제공하는 예방제의 양(예를 들어, 이식유전자에 의해 발현되는 생성물의 양)을 지칭한다. 예방 유효량은 또한 표적 질환 또는 장애의 발생을 방지하거나, 그 가능성을 감소시키거나, 그 발생을 지연하거나; 표적 질환 또는 장애의 진행을 둔화시키기 충분한 제제의 양; 표적 질환 또는 장애의 발병을 지연하거나 최소화하기 충분한 양; 또는 이의 재발 또는 확산을 방지하거나 지연하기 충분한 양을 지칭할 수 있다. 예방 유효량은 또한 표적 질환 또는 장애의 증상 악화를 방지하거나 지연하기 충분한 제제의 양을 지칭할 수 있다. 또한, 본 발명의 예방제에 관한 예방 유효량은 질환 또는 장애의 방지 또는 지연에 있어서 적어도 하나의 예방적 이점을 제공하는, 단독으로, 또는 다른 제제와 조합될 때의 예방제의 양을 의미한다.
본 발명의 예방제는 표적 질환 또는 장애에 대한 "소인이 있는" 대상체에 투여될 수 있다. 질환 또는 장애에 대한 "소인이 있는" 대상체는 질환 또는 장애의 발생과 관련된 증상을 나타내거나 이러한 질환 또는 장애에 대한 유전적 구성, 환경적 노출 또는 다른 위험 요인을 갖지만 증상이 아직 질환 또는 장애로 진단될 수준에 이르지 못한 대상체이다. 예를 들어, 누락 유전자(이식유전자에 의해 제공될 것임)와 관련된 질환의 가족력을 갖는 환자는 이에 대한 소인이 있는 환자로 평가할 수 있다. 또한 원발성 종양의 제거 후에도 지속되는 휴면 종양을 갖는 환자는 종양 재발에 대한 소인이 있는 환자로 평가할 수 있다.
"CpG 섬"이라는 용어는 디뉴클레오티드 CpG(예를 들어, C(시토신) 염기 바로 다음에 G(구아닌) 염기가 뒤따름(CpG))를 높은 빈도로 함유하는 게놈의 독특한 영역을 의미하며, 이에 따라 CpG 섬의 G+C 함량은 섬이 아닌 DNA에서보다 훨씬 더 높다. CpG 섬은 뉴클레오티드 길이, 뉴클레오티드 조성 및 CpG 디뉴클레오티드의 빈도 분석에 의해 확인될 수 있다. 임의의 특정 뉴클레오티드 서열 또는 게놈의 CpG 섬 함량은 하기 기준을 사용하여 측정될 수 있다: 100 초과의 섬 크기, 50.0% 초과의 GC%, 및 0.6 초과의 관찰된 CG 디뉴클레오티드의 수 대 절편에서의 G 및 C의 수에 기반하여 예상된 수의 비(0.6 초과의 Obs/Exp).
Obs/Exp CpG = CpG의 수 * N / (C의 수 * G의 수)
식 중, N = 서열의 길이.
다양한 소프트웨어 도구, 예컨대 world-wide-web.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi, world-wide-web.cpgislands.usc.edu/, world-wide-web.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html 및 world-wide-web.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html이 이러한 계산을 위해 이용 가능하다(또한 Gardiner-Garden and Frommer, J Mol Biol. 1987 Jul 20;196(2):261-82; Li LC and Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 2002 Nov;18(11):1427-31 참고). 한 구현예에서 CpG 섬을 확인하는 알고리즘은 www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi에서 확인된다.
5.2. 마이크로드 이스트로핀 이식유전자
5.2.1 이식유전자에 의해 암호화된 마이크로디스트로핀
아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성된 마이크로디스트로핀이 본 발명의 방법을 위해 본원에 제공된 이식유전자에 의해 암호화되며, ABD는 디스트로핀의 액틴 결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 C 말단 도메인이다(그리고 서열 번호 84를 포함하는 α1-신트로핀 결합 부위를 함유하는 CT 도메인의 적어도 일부를 포함함). 아래 표 1은 특히 전장 인간 DMD 단백질로부터의 이들 성분에 대한 아미노산 서열(UniProtDB-11532, 본원에 참조로 포함됨)을 가지며, 이들은 표 3 및 4(야생형 및 코돈 최적화 서열 포함)의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
AAV 벡터에 전형적인 패키징 제한을 극복하기 위해 임상 용도를 위해 개발된 많은 마이크로디스트로핀 유전자에는 CT 도메인이 결여된다. 몇몇 연구자들은 DAPC가 조립하기 위해 C-말단 도메인을 필요로 하지 않거나 C-말단이 필수적이지 않음을 시사했다[Crawford, 등, J Cell Biol, 2000, 150(6):1399-1409; 및 Ramos, J.N, 등 Molecular Therapy 2019, 27(3):1-13]. 그러나 mdx 마우스의 골격근에서 CT 도메인의 꼬인 코일 모티프의 나선 1을 함유하는 마이크로디스트로핀 유전자의 과발현은 근육속막에 모집된 신호전달 단백질을 위한 모듈형 어댑터로서 역할을 하는 DAP 복합체의 구성원인 α1-신트로핀 및 α-디스트로브레빈 모집을 증가시켰다[Koo, T., 등, Delivery of AAV2/9-microdystrophin genes incorporating helix 1 of the coiled-coil motif in the C-terminal domain of dystrophin improves muscle pathology and restores the level of α1-syntrophin and α-dystrobrevin in skeletal muscles of mdx mice. Hum Gene Ther, 2011. 22(11): p. 1379-88]. 마이크로디스트로핀의 더 긴 버전의 과발현은 또한 더 짧은 버전과 비교하여 mdx 마우스에서 수축 유도 근육 손상의 연장에 대한 근육 저항을 개선했다[Koo, T., 등 2011, 상기 문헌]. CT 도메인은 디스트로핀 관련 단백질 복합체(DAPC)의 형성에서서 역할을 담당한다(도 1b 참고).
디스트로핀의 CT 도메인은 막대 도메인에서와 유사한 α-나선형 꼬인 코일을 형성할 것으로 예측되는 2개의 폴리펩티드 신장부를 함유한다(아래 표 1의 서열 번호 16에서 단일 밑줄로 나타낸 H1 및 이중 밑줄로 나타낸 H2 참고). 각 꼬인 코일은 류신이 "d" 위치에서 우세한 류신 지퍼에서 확인되는 것들과 유사한 보존된 반복 헵타드(a,b,c,d,e,f,g)n를 갖는다. 이 도메인은 CC(꼬인 코일) 도메인으로 명명되었다. 디스트로핀의 CC 영역은 디스트로브레빈에 대한 결합 부위를 형성하고 α1-신트로핀과 다른 디스트로핀 관련 단백질 사이의 상호작용을 조절할 수 있다.
두 신트로핀 이소형인 α1-신트로핀 및 β1-신트로핀은 디스트로핀 엑손 73 및 74에서 하나 초과의 결합 부위를 통해 디스트로핀과 직접 상호작용하는 것으로 생각된다(Yang 등, JBC 270(10):4975-8 (1995)). α1-신트로핀 및 β1-신트로핀은 디스트로핀 C 말단 도메인에 별도로 결합하며, α1-신트로핀에 대한 결합 부위는 적어도 아미노산 잔기 3447 내지 3481 내에 존재하는 것으로 보고된 반면, β1-신트로핀에 대한 결합 부위는 아미노산 잔기 3495 내지 3535 내에 존재하는 것으로 보고되었다(UniProtDB-11532(서열 번호 92)의 DMD 단백질에서 넘버링된 바와 같음, 또한 표 1, 서열 번호 16, 이탤릭체 참고). 알파1-(α1-) 신트로핀 및 알파-신트로핀은 전체적으로 상호교환적으로 사용된다.
본원에 개시된 마이크로디스트로핀은 nNOS뿐만 아니라 알파-신트로핀, 알파-디스트로브레빈 및 베타-디스트로글리칸에 결합하고 이를 모집하는 것으로 확인되었다. nNOS에 결합하는 디스트로핀의 C 말단 도메인을 포함하는 마이크로디스트로핀의 맥락에서 nNOS에 대한 결합은 근육 조직에서 발현된 마이크로디스트로핀이 형질도입된 근육 조직 세션에서 근육속막 내부 또는 근처의 알파-신트로핀, 알파-디스트로브레빈 및 nNOS 각각을 확인하기 위해 적절한 항체로의 면역염색에 의해 결정되었음을 의미한다. 하기 실시예 4 및 5를 참고한다. 특정 구현예에서, 마이크로디스트로핀 단백질은 C-말단 도메인을 함유하지 않는 필적하는 마이크로디스트로핀(그러나 다르게는 동일한 아미노산 서열을 갖는, 즉 "참조 마이크로디스트로핀 단백질")과 비교하여 α1-신트로핀, β-신트로핀 및/또는 디스트로브레빈에 대한 "결합을 증가시키는" C-말단 도메인을 가지며, 이는 DAPC가 참조 마이크로디스트로핀 단백질(C-말단 도메인을 갖지 않거나 CR 도메인 근위의 최소 48개 아미노산을 갖는 것을 제외하고 동일한 서열 및 디스트로핀 성분을 가짐)로 처리된 mdx 마우스 근육과 비교하여, C-말단 도메인을 갖는 마이크로디스트로핀으로 처리된 mdx 마우스 근육에서 α1-신트로핀, β-신트로핀, α-디스트로브레빈, β-디스트로글리칸 또는 nNOS를 포함하는 하나 이상의 DAPC 성분에 대한 근육 섹션의 면역염색 또는 근육 조직 용해물 또는 근육 막 조제물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 근육 막에서 하나 이상의 DAPC 성분의 더 큰 수준에 의해 결정되는, C-말단 도메인을 갖지 않는(그러나 다르게는 마이크로디스트로핀과 동일한 아미노산을 갖는) 참조 마이크로디스트로핀보다 큰 정도로 안정화되거나 근육속막에 고정됨을 의미한다(하기 섹션 6.4 및 6.5의 실시예 4 및 5 참고).
일부 구현예에서, 디스트로핀의 C-말단 도메인을 포함하는 마이크로디스트로핀은 C-말단 도메인에 α1-신트로핀 결합 부위 및/또는 디스트로브레빈 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 C-말단 도메인은 절단된 C-말단 도메인이다. α1-신트로핀 결합 부위는 부분적으로 α1-신트로핀을 통해 nNOS를 근육속막에 모집하고 고정하는 기능을 한다(도 1a 및 1b 참고).
본원에 기재된 구현예는 꼬인 코일 모티프의 나선 1을 포함하는 CT 도메인의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. C 말단 서열은 DMD 유전자의 엑손, 특히 엑손 70 내지 74, 및 엑손 75의 일부(특히, 엑손 75에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 처음 36개 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 의해 또는 인간 DMD 단백질의 서열, 예를 들어 UniProtKB-P11532(서열 번호 92)의 서열에 의해(CT는 UniProtKB-P11532 서열의 아미노산 3361 내지 3554임), 또는 디스트로브레빈 및/또는 α1-신트로핀에 대한 결합 부위(표 1, 서열 번호 16에 표시됨)를 포함하거나 이로 구성되는 것에 의해 정의될 수 있다. 특정 구현예에서, CT 도메인은 DMD 단백질의 194개 C-말단 아미노산, 예를 들어 UniProtKB-P11532(서열 번호 92)의 아미노산 서열의 잔기 3361 내지 3554, 엑손 70 내지 74에 의해 암호화된 아미노산, 및 DMD 유전자의 엑손 75의 뉴클레오티드 서열의 처음 36개 뉴클레오티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열(표 1 참고)로 구성되거나 이를 포함한다. 예를 들어, RGX-DYS1(또한 μDys-CT194)은 서열 번호 16의 194개 아미노산 CT 서열을 갖는다.
다른 구현예에서, C-말단 도메인의 아미노산 서열은 절단되고 적어도 디스트로브레빈 및/또는 α1-신트로핀에 대한 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 절단된 C-말단 도메인은 아미노산 서열 MENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQ(α1-신트로핀 결합 부위)(서열 번호 84)를 포함한다. 특정 구현예에서, 절단된 C-말단 도메인은 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하며, 결합 부위는 아미노산 서열 MENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQ(서열 번호 84)를 갖는다. 특정 구현예에서, CT 도메인 서열은 서열 번호 83의 아미노산 서열 또는 UniProtKB-P11532 인간 DMD 서열의 아미노산 3361 내지 3500을 갖는다(CT140 또는 CT1.5로 지칭). 예를 들어, RGX-DYS5(μDys-CT140)는 서열 번호 83의 아미노산 서열을 갖는 CT 도메인을 갖는다. 대안적 구현예에서, 마이크로디스트로핀에는 CT 도메인이 결여되고(또는 UniProtKB-P11532 인간 DMD 서열의 아미노산 3361 내지 3408인 CT48로 지칭되는 CT 도메인의 최소 48개 아미노산을 포함함; 서열 번호 91), 하기와 같이 배열된 도메인: ABD1-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR을 가질 수 있다, 예를 들어 RGX-DYS3(μDys-CT48)(도 2; 서열 번호 2). 구현예에서 예를 들어 RGX-DYS1과 같은 마이크로디스트로핀은, 예를 들어 본원의 실시예 11에 기재된 바와 같이, 조직 배양에서 펄스-추적 검정에 의해 결정되는, 마이크로디스트로핀, 예컨대 48개 아미노산의 CT 서열(서열 번호 91)을 갖는 RGS-DYS3보다 1.5배, 2배, 2.5배 또는 3배 더 긴 반감기를 갖는다.
NH2 말단 및 디스트로핀의 막대 도메인의 영역은 세포골격 액틴에 직접 결합하지만 이를 가교하지 않는다. 야생형 디스트로핀의 막대 도메인은 스펙트린의 삼중 나선형 반복부와 유사한 24개의 반복 단위로 이루어진다. 이 반복 단위는 디스트로핀 단백질의 대부분을 차지하며 분자에 β-스펙트린과 유사한 유연한 막대 유사 구조를 제공하는 것으로 생각된다. 이러한 α-나선형 꼬인 코일 반복부는 4개의 프롤린 풍부 힌지 영역에 의해 단속된다. 24번째 반복부의 끝에는 WW 도메인이 바로 이어지는 네 번째 힌지 영역이 있다[Blake, D. 등, Function and Genetics of Dystrophin and Dystrophin-Related Proteins in Muscle. Physiol. Rev. 82: 291-329, 2002]. 본원에 개시된 마이크로디스트로핀은 R4 내지 R23을 포함하지 않고, 4개의 힌지 영역 중 3개 또는 이의 일부만을 포함한다. 일부 구현예에서, 새로운 아미노산 잔기 또는 링커가 마이크로디스트로핀에 도입되지 않는다.
일부 구현예에서, 마이크로디스트로핀은 H3(예를 들어, 서열 번호 1, 2, 또는 79)을 포함한다. 구현예에서, H3은 N-말단에서 C-말단으로의 전체 내인성 H3 도메인(예를 들어, 서열 번호 11)일 수 있다. 달리 말하면, 일부 마이크로디스트로핀 구현예는 H3 도메인의 단편을 함유하지 않고 전체 H3 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, R3 도메인의 C-말단 아미노산은 H3 도메인의 N-말단 아미노산에 직접 커플링(또는 공유결합)된다. 일부 구현예에서, H3 도메인의 N-말단 아미노산에 커플링된 R3 도메인의 C-말단 아미노산은 Q이다. 일부 구현예에서, R3 도메인에 커플링된 H3 도메인의 5' 아미노산은 Q이다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않으면서, 유도된 마이크로디스트로핀 단백질에 전체 활성을 전달하기 위해 전체 힌지 도메인이 임의의 마이크로디스트로핀에 적합할 수 있다. 디스트로핀의 힌지 절편은 사실상 프롤린이 풍부한 것으로 인식되었으며 따라서 단백질 생성물에 유연성을 부여할 수 있다(Koenig and Kunkel, 265(6):4560-4566, 1990). 힌지의 일부의 임의의 결실, 특히 하나 이상의 프롤린 잔기의 제거는 유연성을 감소시킬 수 있으며 따라서 DAP 복합체에서 다른 단백질과의 그 상호작용을 방해하여 그 유효성을 감소시킬 수 있다.
본원에 개시된 마이크로디스트로핀은 CR 도메인(서열 번호 15에서 단일 밑줄(UniProtKB-P11532 aa 3307-3354)에 의해 표시되는 ZZ 도메인 함유)에 대한 및 이를 포함하는 야생형 디스트로핀 H4 서열(WW 도메인 함유)을 포함한다. WW 도메인은 몇몇 신호전달 및 조절 분자에서 확인되는 단백질 결합 모듈이다. WW 도메인은 src 상동성-3(SH3) 도메인과 유사한 방식으로 프롤린 풍부 기질에 결합한다. β-디스트로글리칸의 세포질 도메인은 프롤린이 풍부하므로, 이 영역은 β-디스트로글리칸과 디스트로핀 사이의 상호작용을 매개한다. WW 도메인은 힌지 4(H4 영역)에 있다. CR 도메인은 α-액티닌에서와 유사하고 세포내 Ca2+에 결합할 수 있는 두 개의 EF-핸드 모티프를 함유한다. ZZ 도메인은 2가 금속 양이온, 예컨대 Zn2+에 대한 배위 부위를 형성할 것으로 예측되는 여러 보존된 시스테인 잔기를 함유한다. ZZ 도메인은 여러 유형의 징크 핑거와 유사하며 핵 및 세포질 단백질 둘 모두에서 확인된다. 디스트로핀의 ZZ 도메인은 Ca2+ 의존적 방식으로 칼모듈린에 결합한다. 따라서 ZZ 도메인은 기능적 칼모듈린 결합 부위를 나타낼 수 있으며 다른 디스트로핀 관련 단백질에 대해 칼모듈린 결합에 대한 의미를 가질 수 있다.
마이크로디스트로핀 구현예는 하기 나타낸 바와 같이 도메인에 연결된 링커(L1, L2, L3, L4, L4.1 및/또는 L4.2) 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다: ABD1-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR-CT(예를 들어, 서열 번호 1, 79, 또는 91) 또는 ABD1-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR(예를 들어, 서열 번호 2). L1은 ABD1을 H1에 커플링할 수 있는 내인성 링커 L1(예를 들어, 서열 번호 4)일 수 있다. L2는 H1을 R1에 커플링할 수 있는 내인성 링커 L2(예를 들어, 서열 번호 6)일 수 있다. L3은 R2를 R3에 커플링할 수 있는 내인성 링커 L3(예를 들어, 서열 번호 9)일 수 있다.
L4는 또한 H3과 R24를 커플링할 수 있는 내인성 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, L4는 천연 디스트로핀 서열에서 R24에 선행하는 3개의 아미노산, 예를 들어 TLE(서열 번호 12)이다. 다른 구현예에서, L4는 천연 디스트로핀 서열에서 R24에 선행하는 4개 아미노산(서열 번호 17) 또는 R24에 선행하는 2개 아미노산(서열 번호 18)일 수 있다. 다른 구현예에서는 H3과 R24 사이에 링커, L4 등이 존재하지 않는다. 위에서 언급된 바와 같이 H3의 5' 말단에는 링커가 존재하지 않으며 오히려 R3은 H3 또는 대안적으로 H2에 직접 커플링된다.
구체적으로 기재되지 않은 마이크로디스트로핀 기타 도메인의 상술된 성분은 아래 표 1에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본원에 제공된 도메인에 대한 아미노산 서열은 본원에 참조로 포함된, UniProtKB-P11532(DMD_HUMAN)(서열 번호 92)의 디스트로핀 이소형에 해당한다. 다른 구현예는 당분야에 알려진 자연 발생 기능적 디스트로핀 이소형, 예컨대 UniProtKB-A0A075B6G3(A0A075B6G3_HUMAN)(본원에 참조로 포함됨)으로부터의 도메인을 포함할 수 있고, 예를 들어 R24는 서열 번호 13의 아미노산 3에서 Q에 대해 치환된 R을 갖는다.
추가 구현예는 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 2020년 11월 27일에 출원된 국제 출원 PCT/US2020/062484에 개시되어 있다.
본 개시는 또한 각 도메인 및 링커의 기능이 실질적으로 유지되고/되거나 이러한 변이체를 포함하는 마이크로디스트로핀의 치료적 유효성이 실질적으로 유지되는 한 이들 서열의 변이체를 고려한다. 기능적 활성은 (1) 액틴, β-디스트로글리칸, α1-신트로핀, α-디스트로브레빈 및 nNOS 중 하나, 이의 조합 또는 모두에 대한 결합; (2) 동물 모델(예를 들어, 본원에 기재된 mdx 마우스 모델) 또는 인간 대상체에서 개선된 근육 기능; 및/또는 (3) 동물 모델 또는 인간 환자에서의 심장보호 또는 심장근 기능 개선을 포함한다. 특히, 마이크로디스트로핀은 서열 번호 3으로 구성된 ABD 또는 서열 번호 3과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 서열 번호 5로 구성된 H1 또는 서열 번호 5와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 서열 번호 7로 구성된 R1 또는 서열 번호 7과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 서열 번호 8로 구성된 R2 또는 서열 번호 8과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 서열 번호 11로 구성된 H3 또는 서열 번호 11과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 서열 번호 13으로 구성된 R24 또는 서열 번호 13과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 서열 번호 14로 구성된 H4 또는 서열 번호 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 서열 번호 15 또는 90으로 구성된 CR 또는 서열 번호 15 또는 90과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 서열 번호 16 또는 83으로 구성된 CT 또는 서열 번호 16 또는 83과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 84를 포함하는 CT를 포함할 수 있다. 전술한 것 외에도, 마이크로디스트로핀은 하기와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성되는 상술된 위치에 링커를 포함할 수 있다: 서열 번호 4로 구성된 L1 또는 서열 번호 4와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 서열 번호 6으로 구성된 L2 또는 서열 번호 6과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 서열 번호 9로 구성된 L3 또는 서열 번호 9와 적어도 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 두 L3 잔기 모두에 대한 보존적 치환을 갖는 변이체; 및 서열 번호 12, 17, 또는 18로 구성된 L4, 또는 서열 번호 12, 17, 또는 18과 적어도 50%, 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
표 2는 본 개시에 따른 마이크로디스트로핀 구현예의 아미노산 서열을 제공한다. 또한, 다른 구현예는 서열 번호 1(RGX-DYS1), 2(RGX-DYS3) 또는 79(RGX-DYS5)에 의해 정의된 마이크로디스트로핀의 치환된 변이체임이 고려된다. 예를 들어, 서열 번호 1, 2, 또는 79에 대한 보존적 치환이 이루어질 수 있고 그 기능적 활성을 실질적으로 유지할 수 있다. 구현예에서, 마이크로디스트로핀은 서열 번호 1, 2 또는 79의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가질 수 있고, 예를 들어 하기 섹션 5.4에 개시된 동물 모델에서의 시험관내 검정 또는 생체내 검정 중 하나 이상에 의해 결정된 바와 같이, 기능적 마이크로디스트로핀 활성을 유지할 수 있다. 본 개시의 RGX-DYS2 및 RGX-DYS4는 또한 서열 번호 1을 포함하는 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화한다.
5.2.2 마이크로디스트로핀을 암호화하는 핵산 조성물
본 개시의 또 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 마이크로디스트로핀을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이다. 이러한 핵산은 하기와 같이 N-말단에서 C-말단으로 배열된 도메인을 갖는 마이크로디스트로핀을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다: 상기 섹션 5.2.1에 상세히 기재된 바와 같이 ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT. 뉴클레오티드 서열은 도메인을 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 적절한 맥락에서 발현을 위해 코돈 최적화되고/되거나 CpG 섬이 고갈될 수 있다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1, 2, 또는 79의 아미노산 서열을 갖는 마이크로디스트로핀을 암호화한다. 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 79의 마이크로디스트로핀을 포함하여 마이크로디스트로핀을 암호화하는 임의의 서열일 수 있고, 뉴클레오티드 서열은 코드의 축퇴로 인해 달라질 수 있다. 표 3 및 4는 DMD 도메인을 암호화하는 예시적 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 표 3은 성분에 대한 야생형 DMD 뉴클레오티드 서열을 제공하고 표 4는 하기와 같이 코돈 최적화되고/되거나 CpG 섬이 CpG 고갈을 포함하여 본원의 작제물(이식유전자, 발현 작제물, 시스 플라스미드 및 재조합 AAV 게놈)에서 사용된 DMD 성분에 대한 뉴클레오티드 서열을 제공한다:
일부 구현예에서, 이러한 조성물은 기능적 활성을 갖는 마이크로디스트로핀을 암호화하는, 서열 번호 22 또는 57로 구성된 ABD1을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 22 또는 57과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열; 서열 번호 24 또는 59로 구성된 H1을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 24 또는 59와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열; 서열 번호 26 또는 61로 구성된 R1을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 26 또는 61과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열; 서열 번호 27 또는 62로 구성된 R2를 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 27 또는 62와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열; 서열 번호 29 또는 64로 구성된 R3을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 29 또는 64와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열; 서열 번호 30 또는 65로 구성된 H3을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 30 또는 65와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열; 서열 번호 32 또는 67로 구성된 R24를 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 32 또는 67과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열; 서열 번호 33 또는 68로 구성된 H4를 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 33 또는 68과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열; 서열 번호 34, 47, 또는 69로 구성된 CR을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 34, 47 또는 69와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열; 및/또는 서열 번호 35 또는 70으로 구성된 CT를 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 35 또는 70과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이러한 조성물은 서열 번호 22 또는 57로 구성된 ABD1을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 22 또는 57과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열 번호 3의 ABD1 도메인을 암호화하는 서열; 서열 번호 24 또는 59로 구성된 H1을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 24 또는 59와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열 번호 5의 H1 도메인을 암호화하는 H1을 암호화하는 서열; 서열 번호 26 또는 61로 구성된 R1을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 26 또는 61과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열 번호 7의 R1 도메인을 암호화하는 서열; 서열 번호 27 또는 62로 구성된 R2를 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 27 또는 62와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열 번호 8의 R2 도메인을 암호화하는 서열; 서열 번호 29 또는 64로 구성된 R3을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 29 또는 64와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열 번호 10의 R3 도메인을 암호화하는 서열; 서열 번호 30 또는 65로 구성된 H3을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 30 또는 65와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열 번호 11의 H3 도메인을 암호화하는 서열; 서열 번호 32 또는 67로 구성된 R24를 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 32 또는 67과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열 번호 13의 R24 도메인을 암호화하는 서열; 서열 번호 33 또는 68로 구성된 H4를 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 33 또는 68과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열 번호 14의 H4 도메인을 암호화하는 서열; 서열 번호 34, 47 또는 69로 구성된 CR을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 34, 47 또는 69와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열 번호 15 또는 89의 CR 도메인을 암호화하는 서열; 및/또는 서열 번호 35, 70 또는 80으로 구성된 CT를 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 35, 70 또는 80과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열 번호 16 또는 83의 CT 도메인을 암호화하는 서열을 포함한다.
전술한 것 외에도, 핵산 조성물은 선택적으로 하기와 같은 서열을 포함하거나 이로 구성된 상술된 위치에 링커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다: 서열 번호 23 또는 58로 구성된 L1을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 23 또는 58과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열(예를 들어, 서열 번호 4의 L1 도메인을 암호화); 서열 번호 25 또는 60으로 구성된 L2를 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 25 또는 60과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열(예를 들어, 서열 번호 6의 L2 도메인을 암호화); 서열 번호 28 또는 63으로 구성된 L3을 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 9의 L3 도메인을 암호화하는, 서열 번호 28 또는 63과 적어도 50% 동일성을 갖는 서열 또는 두 L3 잔기 모두에 대한 보존적 치환을 갖는 변이체; 및 서열 번호 19, 31, 36, 37, 38, 46, 또는 66으로 구성된 L4를 암호화하는 핵산 서열, 또는 서열 번호 19, 31, 36, 37, 38, 46, 또는 66과 적어도 50%, 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 서열(예를 들어, 서열 번호 12, 17, 또는 18의 L4 도메인 또는 임의의 L4 잔기에 대한 보존적 치환을 갖는 변이체를 암호화).
다양한 구현예에서, 핵산은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 또는 서열 번호 79의 아미노산 서열을 갖는 마이크로디스트로핀을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구현예에서, 핵산은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 또는 서열 번호 81인 뉴클레오티드 서열을 포함한다(각각 서열 번호 1, 서열 번호 2, 또는 서열 번호 79의 마이크로디스트로핀을 암호화). 다양한 구현예에서, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 20, 21, 또는 83의 뉴클레오티드 서열(표 5) 또는 이의 역상보체와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가질 수 있고 치료 유효 마이크로디스트로핀을 암호화할 수 있다.
5.2.2.1 코돈 최적화 및 CpG 고갈
한 측면에서, 마이크로디스트로핀 카세트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 코돈 최적화 및 CpG 디뉴클레오티드 및 CpG 섬 고갈에 의해 변형된다. 마이크로디스트로핀 이식유전자에 대한 면역 반응은 최초의 뒤시엔느 근이영양증(DMD) 유전자 치료법 임상 시험 및 개 모델의 몇몇 아데노 관련 바이알(AAV) 미니디스트로핀 유전자 치료법에서 실증된 바와 같이 인간 임상 적용에 대한 우려사항이다[Mendell, J.R., 등, Dystrophin immunity in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med, 2010. 363(15): p. 1429-37; 및 Kornegay, J.N., 등, Widespread muscle expression of an AAV9 human mini-dystrophin vector after intravenous injection in neonatal dystrophin-deficient dogs. Mol Ther, 2010. 18(8): p. 1501-8].
AAV-유도 면역 반응은 AAV 게놈에서 CpG 디뉴클레오티드의 수를 감소시킴으로써 억제될 수 있다[Faust, S.M., 등, CpG-depleted adeno-associated virus vectors evade immune detection. J Clin Invest, 2013. 123(7): p. 2994-3001]. CpG 모티프의 이식유전자 서열을 고갈시키면 비자가로서 이식유전자의 인식 시 선천성 면역의 활성화에서 TLR9의 역할을 감소시킬 수 있으며, 따라서 안정하고 연장된 이식유전자 발현을 제공할 수 있다[또한 Wang, D., P.W.L. Tai, and G. Gao, Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(5): p. 358-378.; 및 Rabinowitz, J., Y.K. Chan, and R.J. Samulski, Adeno-associated Virus (AAV) versus Immune Response. Viruses, 2019. 11(2) 참고]. 구현예에서, 마이크로디스트로핀 카세트는 CpG 고갈로 인간 코돈 최적화된다. 코돈 최적화 및 CpG 고갈 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 GeneOptimizer(Waltham, MA USA)를 이용하는 Thermo Fisher Scientific GeneArt 유전자 합성 도구에 의한 것을 포함하여 당분야에 알려진 임의의 방법에 의해 설계될 수 있다. 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 서열 번호 20, 21, 57-72, 80, 81 및 101-103은 코돈 최적화 및 CpG 고갈 유전자를 나타낸다.
감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드 서열을 갖고, 그 결과 감소된 수의 CpG 섬을 갖는 마이크로디스트로핀 이식유전자가 제공된다. 특정 구현예에서, 마이크로디스트로핀 뉴클레오티드 서열은 2개 미만의(2) CpG 섬, 또는 1개의(1) CpG 섬 또는 0개의(0) CpG 섬을 갖는다. 구현예에서, 2개 초과의 CpG 섬을 갖는 마이크로디스트로핀 이식유전자와 비교하여 항-약물 항체 역가에 의해 측정되는, 감소된 면역원성을 갖는 2개 미만의 또는 1개의 CpG 섬, 또는 0개의 CpG 섬을 갖는 마이크로디스트로핀 이식유전자가 제공된다. 특정 구현예에서, 본질적으로 서열 번호 20, 21 또는 81로 구성된 마이크로디스트로핀 뉴클레오티드 서열은 0개의(0) CpG 섬을 갖는다. 다른 구현예에서, 마이크로디스트로핀 뉴클레오티드 서열은 본질적으로 프로모터에 작동 가능하게 연결된 마이크로디스트로핀 유전자로 구성되며, 마이크로디스트로핀 코딩 서열은 서열 번호 20, 21 또는 81로 구성되고, 2개 미만의(2) CpG 섬을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 마이크로디스트로핀 이식유전자 뉴클레오티드 서열은 본질적으로 프로모터에 작동 가능하게 연결된 마이크로디스트로핀 유전자로 구성되며, 마이크로디스트로핀 코딩 서열은 서열 번호 20, 21 또는 81로 구성되고, 1개의(1) CpG 섬을 갖는다.
5.3. 유전자 카세트 및 조절 요소
본 발명의 또 다른 측면은 마이크로디스트로핀의 발현을 부여하거나 향상시키도록 설계된 조절 요소를 포함하는 핵산 발현 카세트에 관한 것이다. 본 발명은 프로모터 요소, 및 이식유전자의 발현을 향상시키거나 촉진하기 위해 선택적으로 인핸서 요소 및/또는 인트론을 포함하는 조절 요소를 조작하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 또한 대상체의 표적 세포 내에서 핵산(이식유전자)에 의해 암호화된 RNA 및/또는 단백질 생성물의 발현에 영향을 미치는 것으로 당업자에게 알려진 이러한 조절 제어 요소를 포함한다. 조절 제어 요소는 조직 특이적일 수 있다, 즉 표적 세포/조직에서만 활성(또는 실질적으로 더 큰 활성 또는 훨씬 더 큰 활성)일 수 있다.
5.3.1 프로모터
5.3.1.1 조직-특이적 프로모터
특정 구현예에서, AAV 벡터의 발현 카세트는 표적 조직에서 발현을 허용하는 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 서열, 예컨대 프로모터를 포함한다. 프로모터는 근육 프로모터일 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 근육 특이적 프로모터이다. "근육 특이적", "근육 선택적" 또는 "근육 지향적"이라는 문구는 근육 세포의 세포내 환경과 이러한 요소의 상호작용으로 인해 근육 세포 또는 조직에서의 이의 활성을 적응시킨 핵산 요소를 지칭한다. 이러한 근육 세포는 근세포, 근관, 심근세포 등을 포함할 수 있다. 심장근, 골격근 및 평활근 세포와 같은 뚜렷한 특성을 갖는 특수한 형태의 근세포가 포함된다. 다양한 치료제가 이식유전자의 근육 특이적 발현으로부터 이익을 얻을 수 있다. 특히, 근육 세포에 전달되어 높은 형질도입 효율을 가능하게 하는 다양한 형태의 근이영양증을 치료하는 유전자 치료법은 이식유전자가 가장 필요한 세포에서 이식유전자의 발현을 유도할 수 있다는 부가적인 이점을 갖는다. 심장 조직이 또한 이식유전자의 근육 지향적 발현으로부터 이익을 얻을 것이다. 근육-특이적 프로모터는 본 발명의 이식유전자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 근육-특이적 프로모터는 SPc5-12 프로모터(서열 번호 39), 근육 크레아틴 키나제 미오신 경쇄(MLC) 프로모터, 미오신 중쇄(MHC) 프로모터, 데스민 프로모터(서열 번호 119), MHCK7 프로모터(서열 번호 120), CK6 프로모터, CK8 프로모터(서열 번호 115), MCK 프로모터(또는 이의 절단된 형태)(서열 번호 121), 알파 액틴 프로모터, 베타 액틴 프로모터, 감마 액틴 프로모터, E-syn 프로모터, 심장 트로포닌 C 프로모터, 트로포닌 I 프로모터, myoD 유전자 패밀리 프로모터, 또는 Pitx3의 안구 형태의 인트론 1 내에 존재하는 근육 선택적 프로모터로부터 선택된다.
SPc5-12 프로모터로 알려진 합성 프로모터 c5-12(Li, X. 등 Nature Biotechnology Vol. 17, pp. 241-245, MARCH 1999)는 세포 유형 제한 발현, 특히 근육-세포 특이적 발현을 갖는 것으로 나타났다. 길이가 350 bp 미만인 SPc5-12 프로모터는 대부분의 내인성 프로모터보다 길이가 짧으며, 이는 치료 단백질을 암호화하는 핵산의 길이가 상대적으로 길 때 유리할 수 있다.
벡터의 길이를 추가로 감소시키기 위해, 조절 요소는 본원에 기재된 프로모터 중 어느 하나의 감소된 또는 단형 버전(본원에서 "최소 프로모터"로 지칭)일 수 있다. 최소 프로모터는 적어도 전장 버전의 전사 활성 도메인을 포함하며 따라서 여전히 발현을 유도할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, AAV 벡터는 치료 단백질 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 근육 특이적 프로모터의 전사 활성, 예를 들어 최소 SPc5-12 프로모터(예를 들어, 서열 번호 40)를 포함할 수 있다. 구현예에서, 치료 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 마이크로디스트로핀이다. 본 개시의 최소 프로모터는 조직-특이적 방식으로 발현 조절에 기여하는 프로모터 서열의 일부를 함유할 수도 있고 함유하지 않을 수도 있다.
따라서, 구현예에서, SPc5-12 프로모터(서열 번호 39) 또는 SPc5-12 프로모터 변이체, 이의 돌연변이체 또는 단편을 갖는 유전자 치료법 카세트가 제공된다. 예를 들어, RGX-DYS1 및 RGX-DYS5(도 2)는 Spc5-12 프로모터를 갖는다. 이들 프로모터의 서열이 표 6에 제공된다.
일부 측면에서, 변경되거나 돌연변이된 변형된 SPc5-12 프로모터가 제공된다. 돌연변이체 SPc5-12 프로모터는 서열 번호 93 또는 서열 번호 94의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 고유한 SPc5-12 프로모터 서열은 근육 특이적 발현을 촉진하고 전체 게놈으로 제조된 캡시드의 수율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 구현예에서, 돌연변이체 SPc5-12 프로모터(서열 번호 93 또는 94)를 포함하는 유전자 치료법 벡터가 제공된다.
일부 측면에서, 서열 번호 93의 변이체가 제공된다. 일부 측면에서, 개시된 핵산은 근육 특이적 프로모터 활성, 서열 번호 93과 적어도 80% 서열 동일성, 특정 구현예에서는 서열 번호 93의 뉴클레오티드 121-129 및 197-209에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 개시된 핵산은 근육 특이적 프로모터 활성, 서열 번호 93과 적어도 85, 90, 95, 또는 100% 서열 동일성, 일부 구현예에서는 서열 번호 93의 뉴클레오티드 121-129 및 197-209에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 서열 번호 93의 변이체는 서열 번호 93의 서열을, 그러나 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 70개의 핵산 치환을 갖는 서열일 수 있다. 일부 측면에서, 임의의 변이체는 서열 번호 93의 121-129 및 197-209에 대해 100% 서열 동일성을 유지하고 근육 특이적 프로모터 활성을 유지한다. 일부 측면에서 서열 번호 94의 변이체가 제공된다. 일부 측면에서, 개시된 핵산은 근육-특이적 프로모터 활성, 서열 번호 94와 적어도 80% 서열 동일성, 일부 구현예에서는 서열 번호 94의 뉴클레오티드 113-131 및 191-212에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 개시된 핵산은 근육-특이적 프로모터 활성, 서열 번호 94와 적어도 85, 90, 95, 또는 100% 서열 동일성, 일부 구현예에서는 서열 94의 뉴클레오티드 113-131 및 191-212에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 서열 번호 94의 변이체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70개의 핵산 치환을 갖는 서열 번호 94의 서열일 수 있다. 일부 측면에서, 임의의 변이체는 서열 번호 94의 뉴클레오티드 113-131 및 191-212에 대해 100% 서열 동일성을 유지하고 근육 특이적 프로모터 활성을 유지한다.
대안적으로, 프로모터는 구성적 프로모터, 예를 들어 CB7 프로모터일 수 있다. 추가 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터(서열 번호 54), UB6 프로모터, 닭 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터(서열 번호 52), RPE65 프로모터, 옵신 프로모터, TBG(티록신 결합 글로불린) 프로모터, APOA2 프로모터, SERPINA1(hAAT) 프로모터 또는 MIR122 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 특히 이식유전자 발현을 차단하는 것이 바람직할 수 있는 경우, 유도성 프로모터, 예를 들어 저산소증-유도성 또는 라파마이신-유도성 프로모터가 사용된다.
특정 구현예에서, 프로모터는 CNS 특이적 프로모터이다. 예를 들어, 발현 카세트는 뉴런 특이적 에놀라제(NSE)의 유전자로부터 단리된 프로모터, 임의의 뉴런 프로모터, 예컨대 도파민-1 수용체 또는 도파민-2 수용체의 프로모터, 시냅신 프로모터, CB7 프로모터(닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서), RSV 프로모터, GFAP 프로모터(신경 아교 섬유성 산성 단백질), MBP 프로모터(미엘린 염기성 단백질), MMT 프로모터, EF-1α, U86 프로모터, RPE65 프로모터 또는 옵신 프로모터, 유도성 프로모터, 예를 들어 저산소증-유도성 프로모터, 및 약물 유도성 프로모터, 예컨대 라파마이신 및 관련 제제에 의해 유도된 프로모터로부터 선택된 프로모터를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 마이크로디스트로핀 이식유전자를 포함하는 발현 카세트에 일렬로 배치될 수 있는 다중 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 다중 조직 유형에 대한 발현을 향상시키고/시키거나 발현을 유도하기 위해 직렬 또는 하이브리드 프로모터(예를 들어, 본원에 참고로 포함된 2019년 8월 15일에 공개된 PCT 국제 공개 번호 WO2019154939A1 참고), 특히, 본원에 참조로 포함된, 2020년 7월 24일에 출원된 PCT 국제 출원 번호 PCT/US2020/043578에 개시된 LMTP6, LMTP13, LMTP14, LMTP15, LMTP18, LMTP19 또는 LMTP20이 사용될 수 있다).
5.3.2 인트론
특정 유전자 발현 카세트는 인트론을, 예를 들어 적절한 스플라이싱 및 이에 따른 마이크로디스트로핀 발현을 향상시킬 수 있는 마이크로디스트로핀 코딩 서열의 5' 인트론에 추가로 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 인트론은 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 서열의 5' 말단에 커플링된다. 특히, 인트론 뉴클레오티드 서열은 액틴 결합 도메인에 부착된 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 다른 구현예에서, 인트론은 100개 뉴클레오티드 미만의 길이이다.
구현예에서, 인트론은 VH4 인트론이다. VH4 인트론 핵산은 아래 표 7에 나타낸 바와 같이 서열 번호 41을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 인트론은 인간 β-글로빈 및 Ig 중쇄로부터 유래된 키메라 인트론(β-글로빈 스플라이스 공여체/면역글로불린 중쇄 스플라이스 수신체 인트론, 또는 β-글로빈/IgG 키메라 인트론으로도 알려짐)(표 7, 서열 번호 75)이다. 당업자에게 잘 알려진 다른 인트론, 예컨대 닭 β-액틴 인트론, 마우스 미닛(minute) 바이러스(MVM) 인트론, 인간 인자 IX 인트론(예를 들어, FIX 절단된 인트론 1), β-글로빈 스플라이스 공여체/면역글로불린 중쇄 스플라이스 수신체 인트론, 아데노바이러스 스플라이스 공여체/면역글로불린 스플라이스 수신체 인트론, SV40 후기 스플라이스 공여체/스플라이스 수신체(19S/16S) 인트론(표 7, 서열 번호 76)이 사용될 수 있다.
5.3.3 다른 조절 요소
5.3.3.1 폴리A
본 개시의 또 다른 측면은 마이크로디스트로핀 이식유전자의 코딩 영역 하류에 폴리아데닐화(폴리A) 부위를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다. 전사 종료 신호를 보내고 폴리A 테일의 합성을 유도하는 임의의 폴리A 부위가 본 개시의 AAV 벡터에서 사용하기 적합하다. 예시적인 폴리A 신호는 하기: SV40 후기 유전자, 토끼 β-글로빈 유전자, 소 성장 호르몬(BPH) 유전자, 인간 성장 호르몬(hGH) 유전자 및 합성 폴리A(SPA) 부위로부터 유래된다. 한 구현예에서, 폴리A 신호는 표 8에 나타낸 바와 같은 서열 번호 42를 포함한다.
5.3.4 바이러스 벡터
본 개시에 따른 마이크로디스트로핀 이식유전자는 인간 대상체에 대한 유전자 치료법 투여를 위한 AAV 벡터에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV(rAAV) 벡터는 AAV 바이러스 캡시드 및 AAV 역위 말단 반복부(ITR)가 측면에 있는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 또는 인공 게놈을 포함할 수 있으며, 발현 카세트는 마이크로디스트로핀을 발현하고 전달하기 위해 인간 근육 또는 CNS 세포에서 이식유전자의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 마이크로디스트로핀 이식유전자를 포함한다. 제공된 방법은 본원에 기재된 마이크로디스트로핀의 전달을 위한 임의의 단리된 재조합 AAV 입자의 제조, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 임의의 단리된 재조합 AAV 입자를 포함하는 조성물의 제조, 또는 본원에 기재된 마이크로디스트로핀을 암호화하는 임의의 단리된 재조합 AAV 입자의 투여 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체에서 마이크로디스트로핀을 이용한 치료에 적합한 질환 또는 장애를 치료하는 방법에서 사용하기 적합하다. 따라서, rAAV는 당분야에 알려진 임의의 혈청형, 변이체, 변형, 하이브리드 또는 유도체, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다(총칭하여 "혈청형"으로 지칭). 특정 구현예에서, AAV 혈청형은 근육 조직에 대한 친화성을 갖는다. 그리고, 다른 구현예에서, AAV 혈청형은 간에 대한 친화성을 가지며, 이 경우 AAV로 형질도입된 간 세포는 마이크로디스트로핀 분비 세포의 저장소를 형성하고 마이크로디스트로핀을 순환계로 분비한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 갖는다. AAV8 캡시드를 갖는 rAAV 입자의 RGX-DYS1 작제물(서열 번호 53의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV 게놈) 및 AAV9 캡시드를 갖는 rAAV 입자의 RGX-DYS1 작제물(재조합 AAV 게놈)이 본원에 제공된다. AAV8 캡시드를 갖는 rAAV 입자의 RGX-DYS5 작제물(서열 번호 82의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV 게놈) 및 AAV9 캡시드를갖는 rAAV 입자의 RGX-DYS5 작제물(재조합 AAV 게놈)도 제공된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu31, AAV.hu32, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, 및 AAV.7m8로 구성된 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu31, AAV.hu32, 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이의 유도체, 변형 또는 가유형(pseudotype)을 갖는다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV4의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이의 유도체, 변형 또는 가유형을 갖는다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV5의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이의 유도체, 변형 또는 가유형을 갖는다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이의 유도체, 변형 또는 가유형을 갖는다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이의 유도체, 변형 또는 가유형을 갖는다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 가유형인 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 최대 100% 동일한 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다(VP3의 아미노산 서열은 서열 번호 77임). 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질(아미노산 서열 서열 번호 78)의 유도체, 변형 또는 가유형인 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 최대 100% 동일한 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV7, AAV8, AAV9, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu31, AAV.hu32, AAV.hu37, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, 또는 AAV.7m8 캡시드 단배질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상의 동일성, 예를 들어 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 최대 100% 동일성을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질, 예컨대 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu31, AAV.hu32, 및 AAV.hu37의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일성, 예를 들어 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 최대 100% 동일성을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
대안적으로, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 또는 이의 유도체, 변형, 또는 가유형으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16, 또는 이의 유도체, 변형, 또는 가유형으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다.
예를 들어, rAAV 입자 집단은, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 또는 다른 rAAV 입자 중 2개 이상, 또는 이의 2개 이상의 조합을 포함하는, 2개 이상의 혈청형을 포함할 수 있다.)
일부 구현예에서, rAAV 입자는 그 전체가 참조로 포함된, 문헌(Zinn 등, 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068)에 기재된 바와 같이, Anc80 또는 Anc80L65의 캡시드를 포함한다. 특정 구현예에서, rAAV 입자는 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 9,193,956; 9458517; 및 9,587,282 그리고 US 특허 출원 공개 번호 2016/0376323에 기재된 바와 같이, 하기 아미노산 삽입: LGETTRP(서열 번호 87) 또는 LALGETTRP(서열 번호 88) 중 하나를 갖는 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 9,193,956; 9,458,517; 및 9,587,282 그리고 US 특허 출원 공개 번호 2016/0376323에 기재된 바와 같이 AAV.7m8의 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 미국 특허 번호 9,585,971에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대 AAVPHP.B를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 번호 9,840,719 및 WO 2015/013313에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예를 들어 AAV.Rh74 및 RHM4-1을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 그 전체가 본원에 참조로 포함된, WO 2014/172669에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대 AAV rh.74를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 각각 그 전체가 참조로 포함된, 문헌(Georgiadis 등, 2016, Gene Therapy 23: 857-862 및 Georgiadis 등, 2018, Gene Therapy 25: 450)에 기재된 바와 같이, AAV2/5의 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서 rAAV 입자는 그 전체가 본원에 참조로 포함된, WO 2017/070491에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대 AAV2tYF를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 그 전체가 참조로 포함된, 문헌(Puzzo 등, 2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418)에 기재된 바와 같이, AAVLK03 또는 AAV3B의 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 각각 그 전체가 참조로 포함된, US 특허 번호 8,628,966; US 8,927,514; US 9,923,120 및 WO 2016/049230에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대 HSC1, HSC2, HSC3, HSC4, HSC5, HSC6, HSC7, HSC8, HSC9, HSC10, HSC11, HSC12, HSC13, HSC14, HSC15, 또는 HSC16을 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 하기 특허 및 특허 출원: 미국 특허 번호 7,282,199; 7,906,111; 8,524,446; 8,999,678; 8,628,966; 8,927,514; 8,734,809; US 9,284,357; 9,409,953; 9,169,299; 9,193,956; 9458517; 및 9,587,282; US 특허 출원 공개 번호 2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; 및 국제 특허 출원 번호 PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335 중 어느 하나에 개시된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 하기 특허 및 특허 출원: 미국 특허 번호 7,282,199; 7,906,111; 8,524,446; 8,999,678; 8,628,966; 8,927,514; 8,734,809; US 9,284,357; 9,409,953; 9,169,299; 9,193,956; 9458517; 및 9,587,282; US 특허 출원 공개 번호 2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; 및 국제 특허 출원 번호 PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335 중 어느 것에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 갖는다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 각각 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된, 국제 출원 공개 번호 WO 2003/052051(예를 들어, '051의 서열 번호 2 참고), WO 2005/033321(예를 들어, '321의 서열 번호 123 및 88 참고), WO 03/042397(예를 들어, '397의 서열 번호 2, 81, 85, 및 97 참고), WO 2006/068888(예를 들어, '888의 서열 번호 1 및 3-6 참고), WO 2006/110689(예를 들어, '689의 서열 번호 5-38 참고), WO2009/104964(예를 들어, '964의 서열 번호 1-5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참고), WO 2010/127097(예를 들어, '097의 서열 번호 5-38 참고), 및 WO 2015/191508(예를 들어, '508의 서열 번호 80-294 참고), 및 U.S. 출원 공개 번호 20150023924(예를 들어, '924의 서열 번호 1, 5-10 참고)에 개시된 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 국제 출원 공개 번호 WO 2003/052051(예를 들어, '051의 서열 번호 2 참고), WO 2005/033321(예를 들어, '321의 서열 번호 123 및 88 참고), WO 03/042397(예를 들어, '397의 서열 번호 2, 81, 85, 및 97 참고), WO 2006/068888(예를 들어, '888의 서열 번호 1 및 3-6 참고), WO 2006/110689(예를 들어, '689의 서열 번호 5-38 참고), WO2009/104964(예를 들어, '964의 서열 번호 1-5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참고), WO 2010/127097(예를 들어, '097의 서열 번호 5-38 참고), 및 WO 2015/191508(예를 들어, '508의 서열 번호 80-294 참고), 및 U.S. 출원 공개 번호 20150023924(예를 들어, '924의 서열 번호 1, 5-10 참고)에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 갖는다.
AAV 기반 바이러스 벡터의 핵산 서열 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드를 제조하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,282,199; 7,906,111; 8,524,446; 8,999,678; 8,628,966; 8,927,514; 8,734,809; US 9,284,357; 9,409,953; 9,169,299; 9,193,956; 9458517; 및 9,587,282; US 특허 출원 공개 번호 2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; 국제 특허 출원 번호 PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335; WO 2003/052051, WO 2005/033321, WO 03/042397, WO 2006/068888, WO 2006/110689, WO2009/104964, WO 2010/127097, 및 WO 2015/191508, 그리고 U.S. 출원 공개 번호 20150023924에 교시되어 있다.
추가 구현예에서, rAAV 입자는 가유형화 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가유형화 AAV 캡시드는 rAAV2/8 또는 rAAV2/9 가유형화 AAV 캡시드이다. 가유형화 rAAV 입자를 제조하고 사용하는 방법은 당분야에 알려져 있다(예를 들어 Duan 등, J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert 등, J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin 등, Methods 28:158-167 (2002); 및 Auricchio 등, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001) 참고.
특정 구현예에서, 단일 가닥 AAV(ssAAV)가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 자기 상보적 벡터, 예를 들어 scAAV가 사용될 수 있다(예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty 등, 2001, Gene Therapy, Vol. 8, Number 16, Pages 1248-1254; 및 U.S. 특허 번호 6,596,535; 7,125,717; 및 7,456,683 참고).
추가 구현예에서, rAAV 입자는 모자이크 캡시드를 포함한다. 모자이크 AAV 입자는 AAV의 상이한 혈청형에서 유래된 바이러스 캡시드 단백질의 혼합물로 이루어진다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 함유하는 모자이크 캡시드를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.8, 및 AAVrh.10으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 함유하는 모자이크 캡시드를 포함한다.
추가 구현예에서, rAAV 입자는 가유형 rAAV 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 가유형화 rAAV 입자는 (a) AAV ITR을 포함하는 핵산 벡터 및 (b) AAVx(예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16)로부터 유래된 캡시드 단백질로 이루어진 캡시드를 포함한다. 추가 구현예에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu31, AAV.hu32, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형의 캡시드 단백질로 이루어진 가유형화 rAAV 입자를 포함한다. 추가 구현예에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질을 함유하는 가유형화 rAAV 입자를 포함한다. 추가 구현예에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질로 이루어진 가유형화 rAAV 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 가유형화 rAAV8 또는 rAAV9 입자는 rAAV2/8 또는 rAAV2/9 가유형화 입자이다. 가유형화 rAAV 입자를 제조하고 사용하는 방법은 당분야에 알려져 있다(예를 들어 Duan 등, J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert 등, J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin 등, Methods 28:158-167 (2002); 및 Auricchio 등, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001) 참고.
추가 구현예에서, rAAV 입자는 2개 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질 키메라를 함유하는 캡시드를 포함한다. 추가 구현예에서, 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, rAAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 2개 이상의 AAV 캡시드 단백질의 키메라이다. 추가 구현예에서, 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.8, 및 AAVrh.10으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 2개 이상의 AAV 캡시드 단백질의 키메라이다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질 및 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질 및 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAVrh.8, 및 AAVrh.10으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 및 AAV.HSC16로부터 선택된 하나 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, 및 AAVrh.10으로부터 선택된 하나 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다.
일부 구현예에서 rAAV 입자는 분기군 A, B, E 또는 F AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 입자는 분기군 F AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서 rAAV 입자는 분기군 E AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
표 9는 AAV8, AAV9, AAV.rh74, AAV.hu31, AAV.hu32 및 AAV.hu37 캡시드 단백질에 대한 아미노산 서열 및 AAV2 5'- 및 3' ITR의 핵산 서열의 예를 제공한다.
제공된 방법은 이식유전자를 암호화하는 재조합 AAV의 제조에서 사용하기 적합하다. 특정 구현예에서, 이식유전자는 본원에 기재된 바와 같은 마이크로디스트로핀이다. 일부 구현예에서, rAAV 게놈(또는 시스 플라스미드)은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV 역위 말단 반복부; (2) 조절 제어 요소, 예컨대 a) 프로모터/인핸서, b) 폴리 A 신호, 및 c) 선택적으로 인트론; 및 (3) 기재된 이식유전자를 코딩하는 핵산 서열. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물(시스 플라스미드 또는 재조합 AAV 게놈 서열)은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 또는 AAV8 역위 말단 반복부(ITR); (2) 근육 특이적 SPc5-12 프로모터 및 작은 폴리 A 신호를 포함하는 제어 요소; 및 (3) RGX-DYS1 이식유전자(서열 번호 20) 또는 RGX-DYS5 이식유전자(서열 번호 81)의 마이크로디스트로핀 코딩 서열을 포함하여, 본원에 기재된 바와 같은 마이크로디스트로핀을 암호화하는 핵산을 제공(예를 들어, 코딩)하는 이식유전자. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물(시스 플라스미드 또는 재조합 AAV 게놈)은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 또는 AAV8 ITR; (2) a) 근육 특이적 SPc5-12 프로모터, b) 작은 폴리 A 신호를 포함하는 제어 요소; 및 (3) N-말단에서 C-말단으로 ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT를 포함하는 마이크로디스트로핀 카세트로서, CT는 서열 번호 16 또는 83의 아미노산 서열을 갖는 CT를 포함하여 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 또는 AAV8 ITR 카세트; (2) a) 근육 특이적 SPc5-12 프로모터, b) 인트론(예를 들어, VH4) 및 c) 작은 폴리 A 신호를 포함하는 제어 요소; 및 (3) N-말단에서 C-말단으로 ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT를 포함하는 마이크로디스트로핀 카세트로서, CT는 서열 번호 16 또는 83의 아미노산 서열을 갖는 CT를 포함하여 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하고, ABD1은 VH4에 직접 커플링된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 ITR; (2) 근육 특이적 SPc5-12 프로모터를 포함하는 제어 요소, 및 b) 작은 폴리 A 신호; 및 (3) 서열 번호 20의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 포함하여, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀을 암호화하는 핵산. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV2 ITR; (2) 근육 특이적 SPc5-12 프로모터를 포함하는 제어 요소, 및 b) 작은 폴리 A 신호; 및 (3) 서열 번호 81의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 포함하여, 서열 번호 79의 아미노산 서열을 갖는 RXG-DYS5 마이크로디스트로핀을 암호화하는 핵산. 일부 구현예에서, N-말단에서 C-말단으로 ABD1-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR-CT를 포함하는 마이크로디스트로핀 발현 카세트 측면에 있는 AAV ITR을 포함하는 작제물이 본원에 기재되며, CT는 서열 번호 16 또는 83의 아미노산 서열을 갖는 CT를 포함하여 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하며, 4000개 뉴클레오티드 내지 5000개 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 작제물(ITR 서열을 포함하는 재조합 AAV 게놈))은 4900개 뉴클레오티드, 4800개 뉴클레오티드, 4700개 뉴클레오티드, 4600개 뉴클레오티드, 4500개 뉴클레오티드, 4400개 뉴클레오티드 또는 4300개 뉴클레오티드 미만이다.
본 개시의 일부 핵산 구현예는 아래 표 10에 제공된 서열 53, 55 또는 82의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성된 마이크로디스트로핀을 암호화하는 rAAV 벡터(시스 플라스미드 또는 재조합 AAV 게놈)를 포함한다. 다양한 구현예에서, rAAV 벡터는 서열 번호 53, 55, 또는 82의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 역상보체와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 근육 세포에서 치료 유효 마이크로디스트로핀의 발현에 적합한 rAAV 벡터를 암호화한다. 구현예에서, 서열 번호 53, 55 또는 82의 뉴클레오티드 서열을 갖는 작제물은 재조합 rAAV8 또는 rAAV9 입자에 있다. 구현예에서, 재조합 AAV 벡터 또는 입자는 AAV8-RGX-DYS1이다.
5.3.5 rAAV 입자를 제조하는 방법
본 발명의 또 다른 측면에는 본원에 개시된 분자를 제조하는 것이 관여된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 분자는 본원의 임의의 캡시드 단백질 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오티드를 제공하고; 패키징 세포 시스템을 사용하여 캡시드 단백질로 제조된 캡시드 코트를 갖는 해당하는 rAAV 입자를 제조함으로써 제조된다. 이러한 캡시드 단백질은 상기 섹션 5.3.4에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 본원에 기재된 캡시드 단백질 분자의 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일성을 갖는 서열을 암호화하고 캡시드 단백질 및 이종 단백질로부터의 삽입된 펩티드 또는 이의 생성물의 생물학적 기능을 유지(또는 실질적으로 유지)한다. 일부 구현예에서, 핵산은 AAV8 캡시드 단백질 및 삽입된 펩티드의 생물학적 기능을 유지(또는 실질적으로 유지)하면서 AAV8 캡시드 단백질의 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일성을 갖는 서열을 암호화한다.
캡시드 단백질, 코트 및 rAAV 입자는 당분야에 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 벡터로의 패키징을 허용하는 적어도 하나의 역위 말단 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 cap 유전자 및/또는 cap 유전자의 발현 및 스플라이싱을 위한 rep 유전자를 추가로 포함한다. 구현예에서, cap 및 rep 유전자는 패키징 세포에 의해 제공되며 바이러스 게놈에는 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, 조작된 캡시드 단백질을 암호화하는 핵산은 기존 캡시드 유전자 대신 AAV Rep-Cap 플라스미드로 클로닝된다. 숙주 세포에 함께 도입될 때, 이 플라스미드는 rAAV 게놈을 캡시드 코트로서 조작된 캡시드 단백질에 패키징하는 것을 돕는다. 패키징 세포는 AAV 게놈 복제, 캡시드 조립 및 패키징을 촉진하는 데 필요한 유전자를 보유하는 임의의 세포 유형일 수 있다.
rAAV 입자의 제조를 위해 여러 세포 배양 기반 시스템이 당분야에 알려져 있으며, 이들 중 임의의 것이 본원에 개시된 방법을 실시하기 위해 사용될 수 있다. 세포 배양 기반 시스템은 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 헤르페스바이러스-AAV 하이브리드 및 바쿨로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 형질감염, 안정한 세포주 제조 및 감염성 하이브리드 바이러스 제조 시스템을 포함한다. rAAV 바이러스 입자 제조를 위한 rAAV 제조 배양은 다음을 필요로 한다: (1) 예를 들어 인간 유래 세포주, 포유동물 세포주 또는 곤충 유래 세포주를 포함하는 적합한 숙주 세포; (2) 야생형 또는 돌연변이체 아데노바이러스(예컨대, 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 바쿨로바이러스 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물에 의해 제공되는 적합한 헬퍼 바이러스 기능; (3) AAV rep 및 cap 유전자 그리고 유전자 생성물; (4) AAV ITR 서열 및 선택적으로 조절 요소가 측면에 있는 이식유전자(예컨대, 치료용 이식유전자); 및 (5) 세포 성장/생존 및 rAAV 제조를 지원하는 적합한 배지 및 배지 성분(영양분).
숙주 세포의 비제한적인 예는 A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, HEK293 및 이의 유도체(HEK293T 세포, HEK293F 세포), Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, 일차 섬유아세포, 간세포, 근모세포, CHO 세포 또는 CHO 유래 세포 또는 곤충 유래 세포주, 예컨대 SF-9(예를 들어, 바쿨로바이러스 제조 시스템의 경우)를 포함한다. 검토를 위해, 제조 기술에 대해 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 문헌(Aponte-Ubillus 등, 2018, Appl. Microbiol. Biotechnol. 102:1045-1054)을 참고한다.
한 측면에서, (a) 곤충 세포를 포함하는 세포 배양을 제공하는 단계; (b) i. 패키징될 rAAV 게놈, ii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질, 및 iii. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 바쿨로바이러스 벡터를 세포에 도입하는 단계; (c) 세포 배양에 충분한 영양분을 첨가하고 rAAV 입자의 제조를 허용하는 조건 하에서 세포 배양을 유지하는 단계를 포함하는, rAAV 입자를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 제1 바쿨로바이러스 벡터 및 rAAV 게놈을 암호화하는 제2 바쿨로바이러스 벡터를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 rAAV 게놈을 암호화하는 바쿨로바이러스 그리고 rep 및 cap 유전자를 발현하는 곤충 세포를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 rep 및 cap 유전자 그리고 rAAV 게놈을 암호화하는 바쿨로바이러스 벡터를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 곤충 세포는 Sf-9 세포이다. 일부 구현예에서, 곤충 세포는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 하나 이상의 안정적으로 통합된 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Sf-9 세포이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 바쿨로바이러스 제조 시스템을 사용한다. 일부 구현예에서 바쿨로바이러스 제조 시스템은 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 제1 바쿨로바이러스 및 rAAV 게놈을 암호화하는 제2 바쿨로바이러스를 사용한다. 일부 구현예에서 바쿨로바이러스 제조 시스템은 rAAV 게놈을 암호화하는 바쿨로바이러스 그리고 rep 및 cap 유전자를 발현하는 숙주 세포를 사용한다. 일부 구현예에서 바쿨로바이러스 제조 시스템은 rep 및 cap 유전자 그리고 rAAV 게놈을 암호화하는 바쿨로바이러스를 사용한다. 일부 구현예에서, 바쿨로바이러스 제조 시스템은 곤충 세포, 예컨대 Sf-9 세포를 사용한다.
당업자는 AAV rep 및 cap 유전자, AAV 헬퍼 유전자(예를 들어, 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자) 그리고 rAAV 게놈(역위 말단 반복부(ITR)가 측면에 있는 하나 이상의 관심 유전자를 포함)이 rAAV를 제조하거나 패키징하기 위해 세포에 도입될 수 있는 여러 방법을 알고 있다. "아데노바이러스 헬퍼 기능"이라는 문구는 AAV가 세포에서 효율적으로 성장하도록 세포에서 발현되는(RNA 또는 단백질로서) 여러 바이러스 헬퍼 유전자를 지칭한다. 당업자는 아데노바이러스 및 단순 포진 바이러스(HSV)를 포함한 헬퍼 바이러스가 AAV 복제를 촉진하고 필수 기능을 제공하는 특정 유전자가 확인되었음을, 예를 들어 헬퍼가 이러한 AAV 유전자 발현 및 복제를 용이하게 하는 세포 환경에 대한 변화를 유도할 수 있음을 이해한다. 본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈은 AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈을 암호화하는 하나 이상의 플라스미드 벡터의 형질감염에 의해 세포에 도입된다. 본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈은 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈을 암호화하는 rHSV 벡터로의 형질도입에 의해 세포에 도입될 수 있다. 본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈 중 하나 이상이 rHSV 벡터로의 형질도입에 의해 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 헬퍼 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 rAAV 게놈을 암호화한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈을 암호화한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 헬퍼 유전자 그리고 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다.
한 측면에서, (a) 숙주 세포를 포함하는 세포 배양을 제공하는 단계; (b) i. 패키징될 rAAV 게놈, ii. rAAV 입자를 패키징하는 데 필요한 헬퍼 기능, iii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질, 및 iv. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 rHSV 벡터를 세포에 도입하는 단계; (c) 세포 배양에 충분한 영양분을 첨가하고 rAAV 입자의 제조를 허용하는 조건 하에서 세포 배양을 유지하는 단계를 포함하는, rAAV 입자를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 헬퍼 기능을 암호화한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 헬퍼 기능을 암호화하는 하나 이상의 내인성 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 헬퍼 기능을 암호화하는 하나 이상의 이종 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 rAAV 게놈을 암호화한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 헬퍼 기능 및 rAAV 게놈을 암호화한다. 일부 구현예에서, rHSV 벡터는 헬퍼 기능 그리고 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 세포는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 하나 이상의 안정적으로 통합된 이종 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 측면에서, (a) 포유동물 세포를 포함하는 세포 배양을 제공하는 단계; (b) i. 패키징될 rAAV 게놈(예를 들어, 서열 번호 53의 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 AAV 게놈 포함), ii. rAAV 입자를 패키징하는 데 필요한 헬퍼 기능, iii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질, 및 iv. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 단계; (c) 세포 배양에 충분한 영양분을 첨가하고 rAAV 입자의 제조를 허용하는 조건 하에서 세포 배양을 유지하는 단계를 포함하는, rAAV 입자를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 헬퍼 기능은 아데노바이러스 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 하나 이상의 안정적으로 통합된 이종 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자, 및/또는 rAAV 게놈을 암호화하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 개발하기 위한 분자 생물학 기술은 당분야에서 일반적으로 알려져 있다. 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자는 하나의 플라스미드 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV 헬퍼 유전자(예를 들어, 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자)는 하나의 플라스미드 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, E1a 유전자 또는 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, 나머지 AAV 헬퍼 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질감염에 의해 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, E1a 유전자 및 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자는 하나의 플라스미드 벡터에 의한 형질감염에 의해 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 헬퍼 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, 하나 이상의 헬퍼 유전자는 하나의 플라스미드 벡터에 의한 형질감염에 의해 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 헬퍼 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현된다. 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, AAV 헬퍼 유전자(예를 들어, 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자)는 하나의 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, E1a 유전자 또는 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, 나머지 AAV 헬퍼 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질감염에 의해 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, E1a 유전자 및 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질감염에 의해 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 헬퍼 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, 하나 이상의 헬퍼 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질감염에 의해 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, AAV rep 및 cap 유전자, 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능 및 패키징될 rAAV 게놈은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 벡터로의 형질감염에 의해 세포에 도입된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 3가지 폴리뉴클레오티드: cap 및 rep 유전자를 암호화하는 것, 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 암호화하는 것(예를 들어, 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자, 및 VA 유전자) 및 패키징될 rAAV 게놈을 암호화하는 것의 혼합물로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 AAV8 또는 AAV9 cap 유전자이다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB, 또는 AAV.7m8 cap 유전자이다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, 및 AAV.hu37을 암호화한다. 일부 구현예에서, 패키징될 rAAV 게놈을 암호화하는 벡터는 AAV ITR이 측면에 있는 관심 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 또는 다른 AAV 혈청형으로부터 유래된다.
벡터의 임의의 조합을 사용하여 rAAV 입자가 제조되거나 패키징될 세포에 AAV rep 및 cap 유전자, AAV 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈을 도입할 수 있다. 본원에 개시된 방법의 일부 구현예에서, AAV 역위 말단 반복부(ITR)가 측면에 있는 관심 유전자를 포함하는 rAAV 게놈을 암호화하는 제1 플라스미드 벡터, AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하는 제2 벡터, 및 헬퍼 유전자를 암호화하는 제3 벡터가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 3가지 벡터의 혼합물이 세포에 공동 형질감염된다. 일부 구현예에서, 형질감염 및 감염의 조합이 두 플라스미드 벡터 모두뿐만 아니라 바이러스 벡터의 사용에 의해 사용된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 rep 및 cap 유전자, 및 AAV 헬퍼 유전자는 세포에 의해 구성적으로 발현되며 세포에 형질감염되거나 형질도입될 필요가 없다. 일부 구현예에서, 세포는 구성적으로 rep 및/또는 cap 유전자를 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 AAV 헬퍼 유전자를 구성적으로 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 E1a를 구성적으로 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 rAAV 게놈을 암호화하는 안정한 이식유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, AAV rep, cap 및 헬퍼 유전자(예를 들어, Ela 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 또는 VA 유전자)는 임의의 AAV 혈청형일 수 있다. 유사하게, AAV ITR은 또한 임의의 AAV 혈청형일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 또는 다른 AAV 혈청형(예를 들어, 하나 초과의 혈청형으로부터의 연결을 보유하는 하이브리드 혈청형)으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 AAV8 또는 AAV9 cap 유전자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, AAV cap 유전자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, AAV.HSC16, AAV.rh74, AAV.hu31, AAV.hu32, 또는 AAV.hu37 또는 다른 AAV 혈청형(예를 들어, 하나 초과의 혈청형으로부터의 서열을 보유하는 하이브리드 혈청형)으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, rAAV 입자의 제조를 위한 AAV rep 및 cap 유전자는 상이한 혈청형으로부터 유래된다. 예를 들어, rep 유전자는 AAV2로부터 유래되는 반면 cap 유전자는 AAV8로부터 유래된다. 또 다른 예에서, rep 유전자는 AAV2로부터 유래되는 반면 cap 유전자는 AAV9로부터 유래된다.
일부 구현예에서, rep 유전자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 또는 다른 AAV 혈청형(예를 들어, 하나 초과의 혈청형으로부터의 서열을 보유하는 하이브리드 혈청형)으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, rep 및 cap 유전자는 동일한 혈청형으로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, rep 및 cap 유전자는 동일한 혈청형으로부터 유래되고, rep 유전자는 적어도 하나의 변형된 단백질 도메인 또는 변형된 프로모터 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 도메인은 캡시드 혈청형과 상이한 혈청형의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. Rep 유전자 내의 변형된 도메인은 상이한 혈청형의 단편으로 구성된 하이브리드 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
하이브리드 rep 유전자는 4 kb 초과, 4.1 kb 초과, 4.2 kb 초과, 4.3 kb 초과, 4.4 kb 초과, 4.5 kb 초과, 또는 4.6 kb 초과의 마이크로디스트로핀 이식유전자를 포함하는 바이러스 게놈의 패키징을 포함하여 rAAV 입자의 향상된 패키징 효율을 제공한다. AAV rep 유전자는 바이러스 복제 및 제조에 필요한 비구조 단백질을 암호화하는 핵산 서열로 구성된다. Rep 유전자의 전사는 p5 또는 p19 프로모터로부터 개시되어 각각 2개의 큰(Rep78 및 Rep68) 및 2개의 작은(Rep52 및 Rep40) 비구조 Rep 단백질을 제조한다. 추가적으로 Rep78/68 도메인은 ITR 내의 특정 ITR 서열을 인식하는 DNA 결합 도메인을 함유한다. 4가지 Rep 단백질 모두 게놈 복제 및/또는 캡슐화에서 기능하는 공통 헬리카제 및 ATPase 도메인을 갖는다(Maurer AC, 2020, DOI: 10.1089/hum.2020.069). Cap 유전자의 전사는 그 서열이 rep 유전자의 C-말단 내에 있는, p40 프로모터로부터 개시되며, rep 유전자의 다른 요소가 p40 프로모터 활성을 유도할 수 있다고 제안되어 왔다. p40 프로모터 도메인은 전사 인자 결합 요소 EF1A, MLTF 및 ATF, Fos/Jun 결합 요소(AP-1), Sp1 유사 요소(Sp1 및 GGT) 및 TATA 요소(Pereira and Muzyczka, Journal of Virology, June 1997, 71(6):4300-4309)를 포함한다. 일부 구현예에서, rep 유전자는 변형된 p40 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, p40 프로모터는 EF1A 결합 요소, MLTF 결합 요소, ATF 결합 요소, Fos/Jun 결합 요소(AP-1), Sp1 유사 요소(Sp1 또는 GGT), 또는 TATA 요소 중 임의의 하나 이상에서 변형된다. 다른 구현예에서, rep 유전자는 혈청형 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, rh8, rh10, rh20, rh39, rh.74, RHM4-1 또는 hu37을 갖고, p40 프로모터 도메인의 일부 또는 요소는 혈청형 2로 변형된다. 또 다른 구현예에서, rep 유전자는 혈청형 8 또는 9를 갖고, p40 프로모터 도메인의 일부 또는 요소는 혈청형 2로 변형된다.
ITR은 A 및 A' 상보 서열, B 및 B' 상보 서열, 그리고 C 및 C' 상보 서열을 함유한다; D 서열은 ssDNA 게놈과 인접해 있다. ITR의 상보 서열은 자가 어닐링에 의해 헤어핀 구조를 형성한다(Berns KI. The Unusual Properties of the AAV Inverted Terminal Repeat. Hum Gene Ther 2020). D 서열은 함께 AAV 복제 기점을 구성하는 Rep 결합 요소(RBE) 및 말단 분해 부위(TRS)를 함유한다. ITR은 복제 후 게놈 캡시드화를 위한 패키징 신호로서도 필요하다. 일부 구현예에서, ITR 서열 및 cap 유전자는 A 및 A' 상보 서열, B 및 B' 상보 서열, C 및 C' 상보 서열, 또는 D 서열 중 하나 이상이 캡시드와 상이한 혈청형으로부터의 서열을 함유하도록 변형되어야 하는 것을 제외하면, 동일한 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR 서열은 rep 유전자와 동일한 혈청형으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, ITR 서열 및 cap 유전자는 A 및 A' 상보 서열, B 및 B' 상보 서열, C 및 C' 상보 서열, 또는 D 서열로부터 선택된 ITR 서열 중 하나 이상이 캡시드(cap 유전자)와 동일한 혈청형으로부터 유래되고, ITR 서열 중 하나 이상이 rep 유전자와 동일한 혈청형으로부터 유래되는 것을 제외하면, 상이한 혈청형으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, rep 및 cap 유전자는 동일한 혈청형으로부터 유래되고, rep 유전자는 변형된 Rep78 돌연변이, DNA 결합 도메인, 엔도뉴클레아제 도메인, ATPase 도메인, 헬리카제 도메인, p5 프로모터 도메인, Rep68 도메인, p5 프로모터 도메인, Rep52 도메인, p19 프로모터 도메인, Rep40 도메인 또는 p40 프로모터 도메인을 연결한다. 다른 구현예에서, rep 및 cap 유전자는 동일한 혈청형으로부터 유래되고, rep 유전자는 상이한 혈청형으로부터의 적어도 하나의 단백질 도메인 또는 프로모터 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, rAAV는 AAV2 ITR 서열, AAV8 cap, 및 하이브리드 AAV2/8 cap이 측면에 있는 이식유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, AAV2/8 rep은 p40 프로모터 도메인 또는 이의 일부가 혈청형 2 rep으로부터 유래되는 것을 제외하고 혈청형 8 rep을 포함한다. 다른 구현예에서, AAV2/8 rep은 p40 프로모터 도메인 또는 이의 일부가 혈청형 8 rep으로부터 유래되는 것을 제외하면 혈청형 2 rep을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 초과의 혈청형이 rep/cap 플라스미드를 작제하기 위해 이용될 수 있다.
당분야에 알려진 임의의 적합한 방법이 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있고, 본원에 개시된 방법에 따라 rAAV 입자의 제조를 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 화학물질 기반 형질감염 방법을 사용하여 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학물질 기반 형질감염 방법은 인산칼슘, 고도로 분지된 유기 화합물(덴드리머), 양이온성 중합체(예를 들어, DEAE 덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(PEI)), 리포펙션을 사용한다. 일부 구현예에서, 화학물질 기반 형질감염 방법은 양이온성 중합체(예를 들어, DEAE 덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(PEI))를 사용한다. 일부 구현예에서, 화학물질 기반 형질감염 방법은 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용한다. 일부 구현예에서, 화학물질 기반 형질감염 방법은 DEAE 덱스트란을 사용한다. 일부 구현예에서, 화학물질 기반 형질감염 방법은 인산칼슘을 사용한다.
표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 그리고 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)을 위해 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 사양에 따라 또는 당분야에서 일반적으로 수행되거나 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로 당분야에 잘 알려져 있고 본 명세서에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 문헌(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)))을 참고한다. 구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 그리고 의약 및 약학 화학과 관련하여 이용되는 명명법, 및 이의 실험실 절차 및 기술은 당분야에서 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술이 화학적 합성, 화학적 분석, 약학적 제조, 제형화, 및 전달, 그리고 환자 치료를 위해 사용될 수 있다.
AAV 기반 바이러스 벡터의 핵산 서열 그리고 재조합 AAV 및 AAV 캡시드를 제조하는 방법은 예를 들어 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된, US 7,282,199; US 7,790,449; US 8,318,480; US 8,962,332; 및 PCT/EP2014/076466에 교시되어 있다.
서열 번호 53 또는 82의 작제물(RGX-DYS1 또는 RGX-DYS5)을 포함하여, 본원에 개시된 바와 같은 마이크로디스트로핀을 암호화하는 작제물(게놈)을 함유하는 rAAV 입자의 제조를 위한 숙주 세포주가 제공된다.
바람직한 구현예에서, rAAV는 아래에 더 상세히 논의된 바와 같이 치료적 및 예방적 적용에서 사용될 수 있는 이식유전자 전달 벡터를 제공한다.
5.4. 치료적 유용성
본원에 개시된 바와 같은 마이크로디스트로핀을 암호화하는 재조합 유전자 치료법 벡터 및 재조합 AAV 게놈을 포함하는 작제물을 치료적 유효성에 대해 검정하는 방법이 제공된다. 방법은 본원에 기재된 바와 같이 또는 마이크로디스트로핀의 활성 및 유효성을 시험하기 위해 당분야에 알려진 임의의 다른 방법을 사용하는 동물 모델에서의 시험관내 및 생체내 시험 둘 모두를 포함한다.
5.4.1 시험관내 검정
5.4.1.1 근육 세포에 대한 시험관내 감염 시스템
본원에 개시된 재조합 벡터, 예를 들어 rAAV 입자의 감염성을 시험하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 근육 세포에서 재조합 유전자 치료법 벡터의 감염성은 C2C12 근모세포에서 시험될 수 있다. T0034(인간), L6(래트), MM14(마우스), P19(마우스), G-7(마우스), G-8(마우스), QM7(메추라기), H9c2(2-1)(래트), Hs 74.Ht(인간) 및 Hs 171.Ht(인간) 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는 몇몇 근육 또는 심장 세포주가 이용될 수 있다. 벡터 카피수는 중합효소 연쇄 반응 기술을 사용하여 평가될 수 있으며, 마이크로디스트로핀 발현 수준은 세포에서 마이크로디스트로핀 mRNA의 수준을 측정함으로써 시험될 수 있다.
5.4.2 동물 모델
본원에 기재된 바와 같은 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 함유하는 바이러스 벡터의 유효성은, 예를 들어 mdx 마우스 및/또는 골든 레트리버 근이영양증(GRMD) 모델을 사용하여 돌연변이된 디스트로핀을 대체하고 이식유전자 발현의 생체분포, 발현 및 치료 효과를 평가하기 위해 동물 모델에 투여함으로써 시험될 수 있다. 치료 효과는, 예를 들어 마이크로디스트로핀 이식유전자를 수여받은 동물의 근육 강도의 변화를 평가함으로써 평가될 수 있다. 더 큰 포유동물뿐만 아니라 비포유동물 척추동물 및 무척추동물을 사용하는 동물 모델이 또한 본원에 기재된 벡터의 전임상 치료적 유효성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 치료적 유효성을 평가하기 위한 방법에 따라 효과적인 것으로 실증된 양의 본원에 개시된 마이크로디스트로핀 암호화 벡터의 용량을 포함하는 치료적 투여를 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
5.4.2.1 쥣과 모델
유전자 치료법 벡터의 유효성은 DMD의 쥣과 모델에서 평가될 수 있다. mdx 마우스 모델(Yucel, N., 등, Humanizing the mdx mouse model of DMD: the long and the short of it, Regenerative Medicine volume 3, Article number: 4 (2018))은 엑손 23에 논센스 돌연변이를 보유하여, 초기 종결 코돈 및 절단된 단백질(mdx)을 초래한다. Mdx 마우스는 한배새끼 대조군과 비교하여 3배 더 높은 혈중 피루베이트 키나제 활성 수준을 갖는다. 인간 DMD 질환과 마찬가지로, mdx 골격근은 활성 근섬유 괴사, 세포 침윤, 광범위한 근섬유 크기 및 여러 중앙 유핵 재생 근섬유를 나타낸다. 이 표현형은 횡격막에서 강화되어, 진행성 변성 및 근섬유 손실을 거쳐 근육 등척성 강도의 대략 5배 감소를 초래한다. 뒷다리 근육의 괴사 및 재생은 약 3 내지 4주령에 최고조에 달하지만 그 이후에는 정체된다. mdx 마우스 및 다른 마우스 배경(예를 들어, DBA/2J)과 교배된 mdx 마우스에서는 심장 박출률의 경도지지만 유의한 감소가 관찰된다(Van Westering, Molecules 2015, 20, 8823-8855). 심장 기능 결함을 갖는 이러한 DMD 모델 마우스는 본원에 기재된 유전자 치료법 벡터의 심장 보호 효과 또는 심장 기능의 개선 또는 유지 또는 심장 기능장애의 약화를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 실시예 5-8은 마이크로디스트로핀을 암호화하는 유전자 치료법 벡터를 평가하기 위한 mdx 마우스 모델의 용도를 상세히 기재한다.
추가 mdx 마우스 모델: mdx2cv, mdx3cv, mdx4cv 및 mdx5cv 계통(C57BL/6 유전적 배경)을 포함하는 상이한 유전적 배경의 여러 대안적 버전이 생성되었다. 이들 모델은 마우스를 화학적 돌연변이 유발물질인 N-에틸-N-니트로소우레아로 처리함으로써 생성되었다. 각 계통은 상이한 점 돌연변이를 보유한다. 전체적으로 mdx 마우스와 비교하여 mdxcv 모델에서 질환 표현형의 표현 제시에는 거의 차이가 없다. 추가 마우스 모델은 mdx 계통을 다양한 녹아웃 마우스 모델(예를 들어, Myod1 -/-, α-인테그린7 -/-, α-디스트로브레빈 -/-, 및 유트로핀 -/-)과 교배함으로써 생성되었다. 현재 DMD를 연구하기 위해 사용되는 모든 마우스 모델은 본원에 참조로 포함된, 문헌(Yucel, N., 등, Humanizing the mdx mouse model of DMD: the long and the short of it, npj Regenerative Medicine volume 3, Article number: 4 (2018))에 상세히 기재되어 있다.
심장 기능
mdx 마우스를 포함하는 마우스에서 심장 기능에 대한 유효성 평가가 측정될 수 있다. 혈압(BP)을 측정하기 위해 마우스는 마취면을 지속적으로 모니터링하고 체온을 36.5-37.58C로 유지하면서 1.5% 이소플루오란을 사용하여 진정된다. 심박수는 450-550 박동/분으로 유지된다. BP 커프가 꼬리 주위에 배치된 다음 마취 동안 비침습적 BP 모니터링을 위해 꼬리가 센서 어셈블리에 배치된다. 10회 연속 BP 측정이 이루어진다. 수축기 혈압, 이완기 혈압, 및 평균 혈압을 포함한 꼬리 BP의 정성적 및 정량적 측정은 분석 소프트웨어를 사용하여 오프라인으로 이루어진다. 예를 들어, 문헌(Wehling-Henricks 등, Human Molecular Genetics, 2005, Vol. 14, No. 14; Uaesoontrachoon 등, Human Molecular Genetics, 2014, Vol. 23, No. 12)을 참고한다.
깨어 있고 자유롭게 움직이는 마우스에서 ECG 파고 및 간격 지속시간을 모니터링하기 위해 무선 원격측정 장치가 사용된다. 송신기 장치는 마취된 마우스의 복강에 임플란트되고 2개의 전극은 극 II 배향으로 심장 꼭대기 및 오른쪽 견봉 근처에 고정된다. 마우스는 데이터 기록을 위해 컴퓨터 시스템에 연결된 안테나 수신기 위의 우리에 단독 수용된다. 필터링되지 않은 ECG 데이터는 35일 동안 매시간 10초 동안 수집된다. 처음 7일간의 데이터는 수술 과정으로부터의 회복을 허용하고 임의의 마취 효과가 사라졌는지 확인하기 위해 폐기된다. 데이터 파형 및 매개변수는 DSI 분석 패키지(ART 3.01 및 Physiostat 4.01)로 분석되며 측정은 컴파일링되고 평균내어 심박수, ECG 파고 및 간격 지속시간을 결정한다. 미가공 ECG 파형은 2명의 독립 관찰자에 의해 부정맥에 대해 스캐닝된다.
시험 마우스의 심장에서 섬유증 정도를 측정하기 위해 피크로-시리우스 레드(Picro-Sirius red) 염색이 수행된다. 간략하게, 실험 종료 시 안락사 직후 심장근이 제거되고 이후 가공을 위해 10% 포르말린에 고정된다. 심장이 섹션화되고 파라핀 섹션은 자일렌에서 탈파라핀화된 후 와이거트(Weigert) 헤마톡실린으로 8분 동안 핵 염색한다. 그런 다음 세척된 후 추가 30분 동안 피크로-시리우스 레드(시리우스 레드(Sirius red) F3B 0.5 g, 피크린산의 포화 수용액)로 염색된다. 섹션은 자일렌의 3회 변경에 의해 세정되고 퍼마운트에 실장된다. Eclipse E800(Nikon, Japan) 현미경을 사용하여 5개의 무작위 디지털 이미지가 촬영되고 Image J(NIH)를 사용하여 맹검 분석이 수행된다. 동물이 안락사될 때 심장 천자를 통해 혈액 샘플이 채취되고, 수집된 혈청은 근육 CK 수준의 측정을 위해 사용된다.
5.4.2.2 개과
대부분의 개과 연구는 골든 레트리버 근이영양증(GRMD) 모델에서 수행된다(그 전체가 참조로 포함된, Korneygay, J.N., 등, The golden retriever model of Duchenne muscular dystrophy. Skelet Muscle. 2017; 7: 9). GRMD를 갖는 개는 골격근 및 심장근 표현형과 선택적 근육 침범-DMD의 표현형과 더욱 밀접하게 유사한 중증 표현형을 갖는 진행성 치명적인 질환에 시달린다. GRMD 개는 엑손 건너뛰기 및 프레임-외 DMD 전사를 야기하는 단일 뉴클레오티드 변화를 보유한다. 개의 표현형 특징은 혈청 CK의 상승, EMG에서의 CRD, 및 그룹화된 근육 섬유 괴사 및 재생의 조직병리학적 증거를 포함한다. 표현형 다양성은 인간에서와 마찬가지로 GRMD에서도 자주 관찰된다. GRMD 개에서는 보행 시 경직, 감소된 관절 운동 범위 및 개구증이 일반적인 특징인, 이환 개의 표현형에서 역할을 하는 것으로 보이는 역설적 근육 비대가 발생한다. 질환 진행을 평가하기 위한 객관적 바이오마커는 경직성 굴곡, 경족근 관절 각도, 편심 수축 감소율(%), 최대 고관절 굴곡 각도, 골반 각도, 두개골 봉합근 둘레 및 대퇴 사두근 중량을 포함한다.
5.5. 치료 방법
기능적 디스트로핀을 제공함으로써 치료받을 수 있는 임의의 근이영양증 질환에 대해 인간 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. DMD가 이러한 질환 중 가장 일반적이지만, 본원에 제공된 마이크로디스트로핀을 발현하는 유전자 치료법 벡터는 베커 근이영양증(BMD), 근긴장성 근이영양증(스타이너트병), 안면견갑상완 질환(FSHD) 및 지대 근이영양증, X-연관 확장성 심근병증 또는 눈인두 근이영양증을 치료하기 위해 투여될 수 있다. 본 개시의 디스트로핀은 N-말단에서 C-말단으로 다음 순서의 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT을 갖는 것들을 포함하여 본원에 기재된 임의의 마이크로디스트로핀일 수 있고, ABD는 디스트로핀의 액틴 결합 단백질이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 디스트로핀의 C-말단 영역의 적어도 일부, 특정 구현예에서는 서열 번호 16 또는 서열 번호 83이다. 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1, 2 또는 79의 아미노산 서열을 갖는다. 마이크로디스트로핀을 암호화하는 벡터는 서열 번호 20, 21 또는 81의 핵산 서열을 갖고, 특정 구현예에서는 구성적, 근육 특이적(골격근, 평활근 및 심장근 특이적 포함) 발현 또는 CNS 특이적 발현을 위한 조절 요소 및 다른 조절 요소, 예컨대 폴리 A 부위에 작동 가능하게 연결된 것들을 포함한다. 이러한 핵산은 예를 들어 ITR 서열, 특히 AAV2 ITR 서열이 측면에 있는 rAAV 게놈의 맥락에 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 방법 및 조성물은 서열 번호 53, 55, 또는 82의 핵산 서열을 갖는 작제물(재조합 게놈)을 포함하는 rAAV를 투여를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 작제물 또는 재조합 게놈은 rAAV8 또는 rAAV9 입자에 있다. 구현예에서, 재조합 AAV는 AABV8-RGX-DYS1이다. 구현예에서, 환자는 DMD로 진단받았고/받았거나 이와 관련된 증상(들)을 갖는다.
마우스에서의 약리 연구에 기반하여, 본원의 실시예 6, 7 및 8(하기 섹션 6.6, 6.7 및 6.8)을 참고하여, 1Х1014 GC/kg 또는 2Х1014 GC/kg의 용량을 포함하는 5Х1013 내지 1x1015 GC/kg의 투여량으로 본원에 기재된 마이크로디스트로핀을 암호화하는 재조합 게놈(예를 들어, AAV8-RGX-DYS1)을 함유하는 rAAV8 또는 rAAV9 입자를 포함하는 rAAV 입자의 정맥내 투여를 포함하는, 말초로 기능적 디스트로핀으로의 치료에 적합한 디스트로핀병증, 예컨대 DMD 또는 BMD를 갖는 인간 환자의 치료 방법이 제공된다. 용량은 kg당 1×108 벡터 게놈 카피(GC/kg) 내지 1×1015 GC/kg의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 용량은 3Х1013, 1Х1014, 3Х1014, 5Х1014 GC/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 용량은 1Х1014, 1.1Х1014, 1.2Х1014, 1.3Х1014, 1.4Х1014, 1.5Х1014, 1.6Х1014, 1.7Х1014, 1.8Х1014 , 1.9Х1014 , 2Х1014, 2.1Х1014, 2.2Х1014, 2.3Х1014 , 2.4Х1014 , 2.5Х1014, 2.6Х1014, 2.7Х1014, 2.8Х1014 , 2.9Х1014 , 또는 3Х1014 GC/kg일 수 있다. 치료 유효 투여량은 단일 투여량으로 투여되며 정맥내 또는 근육내 투여될 수 있다. 대안적으로, 다중 용량이 치료 요법 과정(즉, 며칠, 몇 주, 몇 달 등) 동안 투여될 수 있다.
투여량은 치료적으로 효과적이며 12주, 26주, 52주 이상을 포함하여 투여 후 적절한 시점에 평가될 수 있으며, 당분야에 알려지고 본원에 상세히 나타낸 디스트로핀병증의 증상 및/또는 바이오마커의 개선 또는 완화에 대한 평가를 포함한다. 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 전달하는 데 사용되는 재조합 벡터가 본원에 기재되어 있다. 이러한 벡터는 인간 근육 세포(골격근, 평활근 및/또는 심장근 포함)에 대한 친화성을 가져야 하며 비복제 rAAV, 특히 AAV8 캡시드를 보유하는 것들을 포함할 수 있다. RGX-DYS1 또는 RGX-DYS5(도 2 참고)의 재조합 작제물 또는 게놈을 갖는 벡터를 포함하는 재조합 벡터(AAV8 또는 AAV9 재조합 벡터, 예를 들어 AAV8-RGX-DYS1 포함)는 재조합 벡터가 바람직하게는 정맥내 투여를 포함하여 재조합 벡터를 혈류에 도입함으로써 근육 조직 또는 CNS에 들어가도록 하는 임의의 방식으로 투여될 수 있다.
이러한 유전자 치료법이 투여되는 대상체는 근육에 대한 마이크로디스트로핀의 유전자 치료법 매개 전달에 반응하는 대상체일 수 있다. 특정 구현예에서, 방법은 DMD 또는 다른 근이영양증 질환, 예컨대 베커 근이영양증(BMD), 근긴장성 근이영양증(스타이너트병), 안면견갑상완 질환(FSHD), 대지 근이영양증, X-연관 확장성 심근병증, 눈인두 근이영양증으로 진단되었거나, 이와 관련된 하나 이상의 증상을 갖고 마이크로디스트로핀 치료에 반응성인 것으로 확인되거나, 마이크로디스트로핀의 유전자 매개 전달을 사용한 치료법에 대해 우수한 후보로 간주되는 환자를 치료하는 단계를 포괄한다. 특정 구현예에서, 환자는 이전에 디스트로핀의 합성 버전으로 치료를 받았으며 디스트로핀의 합성 버전 중 하나 이상에 반응성인 것으로 확인되었다. 반응성을 결정하기 위해 디스트로핀의 합성 버전(예를 들어, 인간 세포 배양, 생물반응기 등에서 제조됨)이 대상체에 직접 투여될 수 있다.
임의의 이러한 재조합 벡터의 치료 유효 용량은 재조합 벡터가 근육(예를 들어, 골격근 또는 심장근)에 들어가도록 하는 임의의 방식으로, 바람직하게는 재조합 벡터를 혈류에 도입함으로써 투여되어야 한다. 특정 구현예에서, 벡터는 피하, 근육내 또는 정맥내 투여된다. 근육내, 피하 또는 정맥내 투여는 근육(골격근, 심장근 및/또는 평활근 포함) 세포에서 가용성 이식유전자 생성물의 발현을 초래해야 한다. 이식유전자 생성물의 발현은 근육에서 이식유전자 생성물의 전달 및 유지를 초래한다. 대안적으로, 전달은 간에서 마이크로디스트로핀의 유전자 치료법 전달 및 발현을 초래할 수 있으며, 이어서 가용성 마이크로디스트로핀 생성물은 혈류를 통해 그 치료 효과를 부여할 수 있는 근육으로 운반된다.
AAV8-RGX-DYS1을 포함하여 본원에 기재된 유전자 치료법 벡터의 투여는 예를 들어 투여 후 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 10주, 12주, 20주 또는 26주 이내를 포함하여 근육 조직을 포함하는 대상체의 조직에서 마이크로디스트로핀 발현을 초래한다. 근육 조직 내 마이크로디스트로핀의 양은 예를 들어 본원의 실시예 12에 기재된 바와 같이(및 실시예 8에 나타냄) 모세관 기반 웨스턴 면역 검정을 포함하여 당분야에 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 구현예에서, 유전자 치료법의 투여는 투여 후 5주, 6주, 10주, 12주, 20주 또는 26주 이내를 포함하여 마이크로디스트로핀 암호화 유전자 치료법 벡터를 투여받은 대상체의 근육에서 10 ng/mg, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 또는 150 ng/mg 초과의 마이크로디스트로핀 단백질을 생성한다. 용량은 1X1014 GC/kg 또는 2X1014 GC/kg을 포함하여 5X1013 GC/kg 내지 1X1015 GC/kg으로 정맥내 투여될 수 있다.
정맥내, 근육내, 피하 또는 간 투여에 적합한 약학 조성물은 생리학적 상용성 수성 완충액을 포함하는 제형 완충액 중 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 재조합 벡터의 현탁액을 포함한다. 제형 완충액은 다당류, 계면활성제, 중합체 또는 오일 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 개시된 약학 조성물은 본원에 개시된 임의의 마이크로디스트로핀, 특히 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV 벡터를 포함할 수 있고 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 서열 번호 53의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RGX-DYS1 재조합 게놈을 포함하여, RGX-DYS1을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV8을 포함하는, rAAV를 포함하는 약학 조성물이 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 벡터(마이크로디스트로핀을 암호화하는 재조합 AAV 게놈)를 함유하는 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 8(AAV8)을 포함할 수 있다. RGX-DYS1 및 RGX-DYS5, 구현예에서는 AAV8-RGX-DYS1을 포함하는, 본원에 개시된 마이크로디스트로핀을 암호화하는 재조합 게놈을 함유하는 rAAV 입자는 0.2 g/L 염화칼륨, 0.2 g/L 일염기성 인산칼륨, 1.2 g/L 이염기성 인산나트륨 무수물, 5.8 g/L 염화나트륨, 40 g/L 수크로스 및 0.01 g/L 폴록사머 188, pH 7.4를 포함하는 수크로스 완충액을 포함하는 변형된 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS) 중 제형화된다. 약학 조성물은 정맥내(IV) 투여를 위한 멸균 일회용 바이알에 동결된 현탁액으로 공급될 수 있다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 라텍스가 없는 고무 마개 및 플립-오프 알루미늄 밀봉으로 밀봉된 Crystal Zenith®(CZ) 바이알에 충전될 수 있다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 하나의 구성으로: 10 mL 바이알 내 전달 가능 부피 5.0 mL로 이용 가능할 수 있다.
구현예에서, 면역억제 예방은 치료제, 예컨대 AAV8-RGX-DYS1(또는 본원에 개시된 다른 마이크로디스트로핀 암호화 벡터)과 함께 투여된다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함된, 문헌(Chu 및 Ng, Frontiers in Immunology, 12:, article 658038 (April 2021))을 참고한다. 구현예에서, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손 또는 베타메타손은 RGX-DYS1을 포함하여 유전자 치료법 전달의 적어도 1일 전, 그리고 최대 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 전에 시작하여 투여된다. 해당 기간 동안 일일 투여를 포함하고, 구현예에서는 유전자 치료법 투여일에 병용을 포함하여, 코르티코스테로이드 투여를 포함하고, 이어서 구현예에서는 일일 투여를 포함하여, 최대 1주, 2주, 3주, 4주, 2개월, 3개월, 4개월 5개월, 6개월 또는 최대 1년 동안 계속 투여를 포함하며, 코르티코스테로이드 용량을 일정하게 유지되거나 시간이 지남에 따라 0으로 감소될 수 있다. 특정 구현예에서, 환자는 유전자 치료법 전달 전 12주 동안 경구 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손 또는 프레드니솔론(하나의 용량, 예를 들어 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량)을 투여받은 후, 동일한 용량으로 1년 동안 계속되거나 4주, 8주 또는 12주에 걸쳐 용량이 감소된다. 구현예에서, 예방적 면역억제 요법이 대상체의 기준선 글루코코르티코이드 용량 1 mg/kg/일에 더하여 제-1일(AAV8-RGX-DYS1 투여 전날)부터 제8주 말까지 투여되고, 제8주에 안전성 우려사항이 없는 경우 제9주부터 제10주까지 0.5 mg/kg/일로, 제10주에 안전성 우려사항이 없는 경우 0.25 mg/kg/일로, 그리고 제12주에 안전성 우려사항이 없는 경우 추가 프레드니솔론을 투여하지 않는다. 구현예에서, 총 일일 스테로이드 용량(기준선 요법 용량 및 면역억제 용량)은 1일 60 mg과 동등한 용량을 초과하지 않는다. 환자는 또한 유전자 치료법 투여일에, 2시간 또는 1시간 이내를 포함하여, 아세트아미노펜 및 H1-항히스타민제로 사전 처리될 수 있다. 제0일은 유전자 치료법 투여일이다.
대안적으로 또는 코르티코스테로이드 예방에 추가하여, 환자에게 예방적으로 비스테로이드성 면역억제제가 투여될 수 있다. 면역억제제는 유전자 치료법, 예를 들어 AAV8-RGX-DYS1의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에, 예를 들어 유전자 치료법 전달 전 정기적 기준을 포함하여, 유전자 치료법 전달의 적어도 1일 전, 및 최대 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 전에 투여될 수 있고 및/또는 유전자 치료법 전달 후에, 예를 들어 최대 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 동안 또는 심지어 무기한으로 유지 치료법으로서 투여된다. 이러한 면역억제제는 사이클로스포린, 라파마이신, 항사이토카인 항체 치료, 예컨대 항-IL-6 또는 IL-6 수용체 항체, 예컨대 사트랄리주맙, 사릴루맙, 실툭시맙, 클라자키주맙, 시루쿠맙, 올로키주맙, 게릴림주맙 및 토실리주맙; 또는 항-C5 항체, 예컨대 그러나 비제한적으로 에쿨리주맙, 라불리주맙 또는 치돌루맙 또는 항-C3 항체, 예컨대 NGM621을 포함하는 항-보체 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 다른 면역억제제는 예를 들어 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙(이의 바이오시밀러 형태, 예컨대 루틱수맙-abbs 및 리툭시맙-arrx 포함) 및 오비누투주맙, 그리고 항-TNF-α 항체, 예컨대 그러나 비제한적으로 에타네르셉트, 아달리무맙, 인플릭시맙, 다클리주맙 또는 골리무맙을 포함한다. 한 구현예에서, 예방 요법은 항-CD-20 항체와 항-C5 항체의 조합, 예를 들어 리툭시맙과 에쿨리주맙 또는 라불리주맙의 조합이다. 한 구현예에서, 리툭시맙과 에쿨리주맙 또는 라불리주맙의 조합물은 유전자 치료법 투여 후에 투여된다. 다른 예방제는 임리피다제를 포함한다. 구현예에서, 마이크로디스트로핀 이식유전자를 함유하는 AAV 벡터의 투여 전에, 이어서 투여 12일 후까지 에쿨리주맙을 투여하는 항-보체(항-C5) 면역억제 요법이 마이크로디스트로핀 치료법과 조합으로 제공된다. 에쿨리주맙은 대상체의 체중에 따라 IV 주입에 의해 투여된다. 10 kg 내지 20 kg 미만의 대상체의 경우, 600 mg의 용량이 제-9일, 제-2일, 제4일 및 제12일에 투여되고; 20 kg 내지 30 kg 미만의 대상체의 경우, 800 mg이 제-16일, 제-9일, 제-2일 및 제12일에 투여되고; 30 kg 내지 40 kg 미만의 대상체의 경우 900 mg의 용량이 제-16일, 제-9일, 제-2일 및 제12일에 투여되고; 40 kg을 초과하는 대상체의 경우 1200 mg의 용량이 제-30일, 제-23일, 제-16일, 제-9일, 제-2일, 제12일에 투여되며, 제0일은 마이크로디스트로핀 유전자 치료법의 투여일이다.
다른 구현예에서, 유전자 치료법 투여는 세포내 신호전달 및 대사 경로를 차단함으로써 사이토카인이 T 세포 확장 및 성숙을 촉진하는 능력을 억제하는 시롤리무스(라파마이신으로도 알려짐) 투여의 면역억제 요법과 조합된다. 구현예에서, 유전자 치료법 투여는 제-7일에 3 mg/m2의 로딩 용량으로 경구 시롤리무스와 조합으로 투여되고, 이어서 제-6일부터 제8주까지, 경구 시롤리무스 1 mg/m2/일이 1일 2회(BID)로 나누어 투약되며, 크로마토그래피 검정을 사용하여 표적 혈액 수준은 8-12 mg/ml이다. 저점 모니터링은 제-2일, 제2일, 제6일, 제12일 및 제14일에, 그 후 필요에 따라 수행될 수 있다(제0일은 유전자 치료법 투여일임). 간 기능 시험, 혈소판 및 임의의 다른 관련 안전성 실험실 측정이 안정적으로 유지되는 경우, 시롤리무스의 일일 용량은 제9주-제10주 동안 50%(0.5 mg/m2/일까지) 감소되고, 간 기능 시험, 혈소판 및 임의의 다른 관련 안전성 실험실 측정 결과이 안정적으로 유지되는 경우, 시롤리무스의 일일 용량은 제11주-제12주 동안 50%(최대 0.25 mg/m2/일까지) 감소될 수 있으며, 그 후 간 기능 시험, 혈소판 및 임의의 다른 관련 안전성 실험실 측정이 안정하게 유지되는 경우, 제12주 이후 시롤리무스 투약은 중단될 수 있다. 구현예에서, 유전자 치료법과 함께 투여되는 면역억제 요법은 상기 상세히 나타낸 바와 같은 프레드니솔론 투약 요법 및/또는 에쿨리주맙 투약 요법 및/또는 시롤리무스 투약 요법의 조합일 수 있다. 일반적으로 환자는 예방적 면역억제제로 사전 처리될 것이며, 면역억제 치료법은 유전자 치료법 투여 후 며칠, 몇 주, 몇 달 또는 몇 년을 포함하여 계속될 수 있다.
본원에 제공된 유전자 치료 벡터는 코르티코스테로이드, 베타 차단제 및 ACE 억제제를 포함하여 근이영양증에 대한 다른 치료와 조합으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 유전자 치료법 투여는 근육 강도의 증가 또는 이의 감소 둔화, 근육 변성, 염증, 섬유증, 근육 병변 및 아래에 논의되는 다른 임상적 엔드포인트의 속도 또는 정도의 개선 또는 둔화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 근이영양증과 관련된 질환 매개변수 및/또는 증상의 개선을 초래할 수 있다.
개시된 치료 방법은 본원에 기재된 치료적 유효성을 표시하는 많은 엔드포인트 중 하나를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 엔드포인트는 개시된 마이크로디스트로핀 중 하나를 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV 입자의 투여 6주, 12주, 24주, 30주, 36주, 42주, 48주, 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년 후 모니터링될 수 있다.
일부 구현예에서, 크레아틴 키나제 활성은 본원에 개시된 치료 및 투여 방법의 치료적 유효성에 대한 엔드포인트으로서 사용될 수 있다. 크레아틴 키나제 활성은 상기 투여 전의 (크레아틴 키나제 활성의) 수준 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, 크레아틴 키나제 활성은 치료 전 대상체의 수준(크레아틴 키나제 활성) 대비 또는 디스트로핀병증을 갖는 미치료 대상체의 수준(크레아틴 키나제 활성)(예를 들어 자연적 이력 연구에서 확인된 참조 수준) 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 투여 후 인간 대상체에서 측정된 크레아틴 키나제 활성은 투여 전 대상체의 크레아틴 키나제 활성, 치료받지 않은 디스트로핀병증을 갖는 대상체의 크레아틴 키나제 활성, 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 크레아틴 키나제 활성, 표준에서의 크레아틴 키나제 활성일 수 있는 대조군 값일 수 있다.
일부 구현예에서, 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg 게놈 카피/kg을 포함하여 5×1013 게놈 카피/kg 내지 1x1015 게놈 카피/kg의 투여량을 포함하는 본원에 개시된 투여량으로, AAV8-RGX-DYS1을 포함하여 본원에 개시된 마이크로디스트로핀 재조합 게놈을 함유하는 rAAV 벡터의 정맥내 투여 단계를 포함하는, 말초로 DMD 및 BMD를 포함하는 디스트로핀병증을 치료하는 방법이 제공되며, 크레아틴 키나제 활성은 rAAV 치료제 투여의 적어도 12주, 26주 또는 52주 후 0.5배 내지 1.5배만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 크레아틴 키나제 활성의 감소는 대조군 또는 치료제 투여 전 대상체 양에서 측정된 값과 비교하여 1000 내지 10,000 단위/리터의 감소일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 후 엔드포인트에서 1000, 2000, 3000, 4000 또는 5000 단위/리터의 양이 감소를 표시한다.
일부 구현예에서, 비복근(또는 다른 근육) 병변의 감소는 본원에 개시된 치료 및 투여 방법에 대한 치료적 유효성에 대한 엔드포인트 측정으로서 사용될 수 있다. 비복근 병변은 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 상기 투여 전 수준(비복근 병변) 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, 비복근 병변은 디스트로핀병증을 갖는 비치료 대상체의 (비복근 병변의) 수준 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 비복근 병변의 비교는 표준에 대해 수행될 수 있으며, 표준은 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 병변 또는 디스트로핀을 갖는 비치료 대상체의 병변을 나타내는 숫자 또는 숫자 세트이다. 따라서, 일부 구현예에서, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 투여 후 비복근 병변의 비교는 대조군 대상체에 대해 수행될 수 있다. 대조군은 투여 전 대상체의 비복근 병변, 치료받지 않은 디스트로핀병증을 갖는 대상체의 비복근 병변, 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 비복근 병변, 또는 표준에서의 비복근 병변일 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체의 비복근 병변은 자기 공명 영상화(MRI)를 사용하여 평가된다. MRI는 근육, 인대, 및 힘줄을 상상하는 데 좋은 도구일 수 있으므로 근육 장애는 MRI를 사용하여 검출 및/또는 특성규명될 수 있다. 일부 구현예에서, 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg을 포함하여 5×1013 게놈 카피/kg 내지 1x1015 게놈 카피/kg의 투여량을 포함하는 본원에 개시된 투여량으로, AAV8-RGX-DYS1을 포함하는 본원에 개시된 마이크로디스트로핀 작제물을 함유하는 rAAV 벡터의 정맥내 투여 단계를 포함하는, 말초로 DMD 및 BMD를 포함하는 디스트로핀병증을 치료하는 방법이 제공되며, 투여 후 비복근 병변 감소는 대조군과 비교하여, 예를 들어 상기 투여 전 대상체의 비복근 병변과 비교하여 약 1-100%, 2-50%, 또는 3-10%이도록 초래한다. 예를 들어, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 갖는 rAAV로 치료받은 대상체는 대조군과 비교하여 병변의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50% 이상 감소를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 비복근 부피(또는 임의의 다른 근육의 근육 부피)가 치료적 유효성에 대한 엔드포인트으로서 사용될 수 있다. 비복근 부피는 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV(예를 들어 AAV8-RGX-DYS1)의 상기 투여 전 (비복근 부피의) 수준 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, 비복근 부피는 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 (비복근 부피의) 수준 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, 비복근 부피는 디스트로핀병증을 갖는 비치료 대상체의 (비복근 부피의) 수준 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 비복근 부피의 비교는 표준에 대해 수행될 수 있으며, 표준은 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 부피 또는 디스트로핀병증을 갖는 비치료 대상체의 부피를 나타내는 숫자 또는 숫자 세트이다. 따라서, 일부 구현예에서, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 투여 후 비복근 부피의 비교는 대조군에 대해 수행될 수 있다. 대조군은 투여 전 대상체의 비복근 부피, 치료받지 않은 디스트로핀병증을 갖는 대상체의 비복근 부피, 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 비복근 부피, 또는 표준에서의 비복근 부피일 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체의 비복근 부피는 MRI를 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg을 포함하여 5×1013 게놈 카피/kg 내지 1x1015 게놈 카피/kg의 투여량을 포함하는 본원에 개시된 투여량으로, AAV8-RGX-DYS1을 포함하는 본원에 개시된 마이크로디스트로핀 작제물을 함유하는 rAAV 벡터의 정맥내 투여 단계를 포함하여 말초로, DMD 및 BMD를 포함하는 디스트로핀병증을 치료하는 방법이 제공되며, 대조군과 비교하여, 예를 들어 상기 투여 전 비복근 부피와 비교하여 약 1-100%, 2-50%, 또는 3-20%의 비복근 부피의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV 투여 후 비복근 부피의 감소는 대조군과 비교하여 약 2-400 mm3, 5-200 mm3 또는 20-100 mm3일 수 있다. 예를 들어, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV로 치료받은 대상체는 대조군과 비교하여 비복근 부피의 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150 mm3 이상 감소를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 근육의 지방 분율은 본원에 개시된 rAAV 마이크로디스트로핀 암호화 치료제를 투여하는 방법의 치료적 유효성에 대한 엔드포인트으로서 사용될 수 있다. 근육은 골반대 및 허벅지의 근육(대둔근, 대내전근, 대퇴직근, 외측광근, 내측광근, 대퇴이두근, 반건양근 및 박근)일 수 있다. 근육의 지방 분율은 본원에 개시된 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 상기 투여 전 (근육의 지방 분율의) 수준 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, 근육의 지방 분율은 디스트로핀병증을 갖는 비치료 대상체의 (근육의 지방 분율의) 수준 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 근육의 지방 분율의 비교는 표준에 대해 수행될 수 있으며, 표준은 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 근육의 지방 분율의 양 또는 퍼센트 또는 디스트로핀병증을 갖는 비치료 대상체의 양 또는 퍼센트를 나타내는 숫자 또는 숫자 세트이다. 따라서, 일부 구현예에서, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 투여 후 근육의 지방 분율의 비교는 대조군에 대해 수행될 수 있다. 대조군은 투여 전 대상체의 근육의 지방 분율, 치료받지 않은 디스트로핀병증을 갖는 대상체의 근육의 지방 분율, 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 근육의 지방 분율, 또는 표준에서의 근육의 지방 분율일 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체의 근육의 지방 분율은 자기 공명 영상화(MRI)를 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 및 3x1014 게놈 카피/kg을 포함하여 5×1013 게놈 카피/kg 내지 1x1015 게놈 카피/kg의 투여량을 포함하는 본원에 개시된 투여량으로, AAV8-RGX-DYS1을 포함하는 본원에 개시된 마이크로디스트로핀 작제물을 함유하는 rAAV 벡터의 정맥내 투여 단계를 포함하는, 말초로 DMD 및 BMD를 포함하는 디스트로핀병증을 치료하는 방법이 제공되며, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 투여 후 근육의 지방 분율 감소가 대조군과 비교하여, 예를 들어 상기 투여 전 근육의 지방 분율과 비교하여 약 1-100%, 2-50%, 또는 3-10%일 수 있도록 초래한다. 예를 들어, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 갖는 rAAV로 치료받은 대상체는 대조군과 비교하여 근육의 지방 분율의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50% 이상 감소를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 근육 병변의 T2-이완 시간은 치료를 위한 엔드포인트으로서 사용될 수 있다. 근육은 임의의 근육, 예컨대 비복근일 수 있다. 근육 병변의 T2-이완 시간은 마이크로 디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 상기 투여 전 (근육 병변의 T2-이완 시간의) 수준 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, 근육 병변의 T2-이완 시간은 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 (근육 병변의 T2-이완 시간의) 수준 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, 근육 병변의 T2-이완 시간은 디스트로핀병증을 갖는 비치료 대상체의 근육 병변의 (T2-이완 시간의) 수준 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 근육 병변의 T2-이완 시간의 비교는 표준에 대해 수행될 수 있으며, 표준은 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 근육 병변의 T2-이완 시간 또는 디스트로핀병증을 갖는 비치료 대상체의 근육 병변의 T2-이완 시간을 나타내는 숫자 또는 숫자 세트이다. 따라서, 일부 구현예에서, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 투여 후 근육 병변의 T2-이완 시간의 비교는 대조군에 대해 수행될 수 있다. 대조군은 투여 전 대상체의 근육 병변의 T2-이완 시간, 치료받지 않은 디스트로핀병증을 갖는 대상체의 근육 병변의 T2-이완 시간, 디스트로핀 병증을 갖지 않는 대상체의 근육 병변의 T2-이완 시간, 또는 표준에서의 근육 병변의 T2-이완 시간일 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체의 근육 병변의 T2-이완 시간은 자기 공명 영상화(MRI)를 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV 투여 후 근육 병변의 T2-이완 시간의 감소는 대조군과 비교하여, 예를 들어 상기 투여 전 근육 병변의 T2-이완 시간과 비교하여 약 1-100%, 5-50%, 또는 10-30%일 수 있다. 일부 구현예에서, 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 및 3x1014 게놈 카피/kg을 포함하여 5×1013 게놈 카피/kg 내지 1x1015 게놈 카피/kg의 투여량을 포함하는 본원에 개시된 투여량으로, AAV8-RGX-DYS1을 포함하는 본원에 개시된 마이크로디스트로핀 작제물을 함유하는 rAAV 벡터의 정맥내 투여 단계를 포함하는, 말초로 DMD 및 BMD를 포함하는 디스트로핀병증을 치료하는 방법이 제공되며, 이는 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV 투여 후 근육 병변의 T2-이완 시간의 감소가 대조군과 비교하여 약 1-500밀리초(ms), 1-400 ms, 1-300 ms, 1-200 ms, 1-100 ms, 1-50 ms, 1-25 ms, 1-10 ms일 수 있도록 초래한다. 일부 구현예에서, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 투여 후 근육 병변의 T2-이완 시간의 감소는 약 2 내지 8 ms일 수 있다. 예를 들어, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV로 치료받은 대상체는 대조군과 비교하여 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ms 이상의 근육 병변의 T2 이완 시간의 감소를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 보행 점수가 치료를 위한 엔드포인트으로서 사용될 수 있다. 보행 점수는 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV 투여 후 약 -1 내지 2일 수 있다. 일부 구현예에서, 보행 점수는 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV 투여 후 약 1일 수 있다.
일부 구현예에서, 북극성 이동 평가(NSAA)가 치료를 위한 엔드포인트으로서 사용될 수 있다. 치료받은 대상체의 NSAA는 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV 투여 전 NSAA와 비교될 수 있다. 치료받은 대상체의 NSAA는 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 NSAA와 비교될 수 있다. 치료받은 대상체의 NSAA는 디스트로핀병증을 갖는 미치료 대상체와 비교될 수 있다. 치료받은 대상체의 NSAA는 표준과 비교될 수 있으며, 표준은 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 NSAA 또는 디스트로핀병증을 갖는 미치료 대상체의 NSAA를 나타내는 점수 또는 점수 세트이다.
일부 구현예에서, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV로 치료받은 대상체의 NSAA는 상기 투여 전 NSAA 점수와 비교하거나 상기 기재된 임의의 NSAA 비교와 비교하여 증가하였다. 일부 구현예에서, 증가는 0에서 1까지, 0에서 2까지 또는 1에서 2까지일 수 있다.
일부 구현예에서, NSAA에서 사용된 17개 항목 중 임의의 항목이 치료의 개별 엔드포인트으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 중 임의의 하나가 치료에 대한 엔드포인트일 수 있다: 일어서기, 걷기, 의자에서 일어서기, 한쪽 다리로 일어서기(오른쪽), 한쪽 다리로 일어서기(왼쪽), 박스 계단 오르기(오른쪽 다리 먼저), 박스 계단 올라가기(왼쪽 다리 먼저), 박스 계단 내려가기(오른쪽 다리 먼저), 박스 계단 내려가기(왼쪽 다리 먼저), 누운 상태에서 앉기, 바닥에서 일어나기, 머리 들어올리기, 발뒤꿈치로 서기, 점프하기, 오른쪽 다리로 뛰기, 왼쪽 다리로 뛰기 및 달리기(10 m). 이들 각각의 평가는 당분야에 잘 알려져 있다. 이러한 엔드포인트 중 하나 이상의 개선이 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 투여 후 나타날 수 있다. 당업자는 무엇이 개선으로 간주되는지 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV로 치료받은 대상체가 일어서고, 정해진 거리를 뛰고/걷고 및/또는 정해진 수의 계단을 올라가는 데 걸리는 시간의 양 감소가 달성될 수 있다.
마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV를 투여받은 대상체가 정해진 거리를 뛰는/걷는 데 걸리는 시간의 양 감소는 대조군, 예를 들어 rAAV의 투여 전에 대상체에서 걸린 시간의 양과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50% 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 뛰기 및/또는 걷기 위해 정해진 거리는 10미터일 수 있다.
마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV를 투여받은 대상체가 일어서는 데 걸리는 시간의 양 감소는 대조군, 예를 들어 rAAV의 투여 전 대상체에서 걸린 시간의 양과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50% 이상일 수 있다.
마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV를 투여받은 대상체가 정해진 수의 계단을 올라가는 데 걸리는 시간의 양 감소는 대조군, 예를 들어 rAAV의 투여 전 대상체에서 걸린 시간의 양과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50% 이상일 수 있다. 일부 구현예에서 정해진 계단 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 설문이 치료를 위한 엔드포인트으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 소아과 결과 데이터 수집 기구(PODCI) 설문이 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV로의 치료 전 및 후의 대상체의 기능적 능력을 정량하기 위해 사용될 수 있다.
5.5.1 심박출량
골격근 증상이 DMD를 정의하는 특징으로 간주되지만 환자는 가장 흔히 호흡 부전 또는 심부전으로 사망한다. DMD 환자에서는 수축 기능을 위해 필요한 심근세포에서의 디스트로핀 부재로 인해 확장성 심근병증(DCM)이 발생한다. 이는 세포외 칼슘의 유입을 야기하여 프로테아제 활성화, 심근세포 사멸, 조직 괴사 및 염증을 촉발하고, 궁극적으로 지방 축적 및 섬유증을 야기한다. 이 과정은 먼저 신체 대부분에 혈액을 펌핑하는 역할을 하는 좌심실(LV)에 영향을 미치며, 좌심실은 더 두꺼워져서 더 큰 부하를 경험하게 된다. 위축성 심근세포는 줄무늬 손실, 공포화, 단편화 및 핵 변성을 나타낸다. 기능적으로 위축 및 흉터형성은 LV의 구조적 불안정성 및 운동저하증을 야기하며 궁극적으로 범 DCM으로 진행된다. DMD는 동성 빈맥, 일주기 지수 감소, 감소된 심박수 다양성, 단형 PR 간격, 우심실 비대, ST 절편 저하 및 연장된 QTc와 같은 다양한 ECG 변화와 관련될 수 있다.
본원에 제공된 유전자 치료법(AAV8-RGX-DYS1 투여 포함)은 특히 심장 기능장애의 진행을 감소 또는 약화시키고 및/또는 심장 기능을 유지 또는 개선하기 위해, DMD 및 다른 디스트로핀병증의 진행을 둔화시키거나 정지시킬 수 있다. 유효성은 일련의 심전도 및 일련의 비침습적 영상화 연구(예를 들어, 심장초음파 검사 또는 심장 자기 공명 영상화(CMR) 등)를 사용하여 시험 집단의 연령 및 질환 단계에 적절한 심장 침범 또는 심부전의 징후 및 증상의 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. CMR이 강제 폐활량(FVC), 강제 호기량(FEV1), 최대 흡기압(MIP), 최대 호기압(MEP), 최대 호기 유량(PEF), 최대 기침 유량, 좌심실 박출률(LVEF), 좌심실 분획 단축(LVFS), 염증 및 섬유증의 기준선으로부터의 변화를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. ECG는 전도 이상 및 부정맥을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 특히, ECG는 PR 간격, V1의 R파, V6의 Q파, 심실 재분극, 하부 및/또는 상부 측벽의 QS파, 우각 가지의 전도 장애, QT C 및 QRS의 정상화를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 발현 카세트(AAV8-RGX-DYS1 포함) 및 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 포함하는 재조합 AAV 조성물, 및 예를 들어 일련의 심전도 및/또는 일련의 비침습적 영상화 연구(예를 들어, 심장초음파 검사 또는 심장 자기 공명 영상화(CMR))에 의해 측정된 바와 같이 LVEF를 45% 미만으로 감소시키는 감소 방지 및/또는 기능의 정상화(LVFS ≥28%)에 의해, 심장 기능을 개선 또는 유지하거나 심장 기능의 손실을 둔화시키는 조성물을 투여하는 방법이 제공된다. 측정은 미처리 대조군 또는 핵산 조성물로의 치료 전 대상체와 비교될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 핵산 조성물 및 핵산 조성물을 투여하는 방법은 강제 폐활량(FVC), 강제 호기량(FEV1), 최대 흡기압(MIP), 최대 호기압(MEP), 최대 호기 유량(PEF), 최대 기침 유량, 좌심실 박출률(LVEF), 좌심실 분획 단축(LVFS), 염증 및 섬유증의 기준선으로부터의 변화를 모니터링함으로써 평가된 바와 같이 심장 기능의 개선 또는 심장 기능의 손실 감소를 초래한다. ECG는 전도 이상 및 부정맥을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 특히, ECG는 PR 간격, V1의 R파, V6의 Q파, 심실 재분극, 하부 및/또는 상부 측벽의 QS파, 우각 가지의 전도 장애, QT C 및 QRS의 정상화를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 심장 기능 및/또는 폐 기능이 투여의 치료적 유효성의 평가를 위한 엔드포인트으로서 사용될 수 있다. 심장 기능 및/또는 폐 기능은 상기 투여 전 (심장 기능 및/또는 폐 기능의) 수준 대비 대상체에서 개선되거나 증가할 수 있다. 일부 구현예에서, 심장 기능 및/또는 폐 기능은 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 (심장 기능 및/또는 폐 기능의) 수준 대비 대상체에서 개선되거나 증가할 수 있다. 일부 구현예에서, 심장 기능 및/또는 폐 기능은 디스트로핀병증을 갖는 비치료 대상체의 (심장 기능 및/또는 폐 기능의) 수준 대비 대상체에서 감소할 수 있다. 심장 기능 및/또는 폐 기능의 비교는 표준에 대해 수행될 수 있으며, 표준은 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 심장 기능 및/또는 폐 기능 또는 디스트로핀병증을 갖는 대상체의 심장 기능 및/또는 폐 기능을 나타내는 숫자 또는 숫자 세트이다. 따라서, 일부 구현예에서, 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자의 투여 후 심장 기능 및/또는 폐 기능의 비교는 대조군에 대해 수행될 수 있다. 대조군은 투여 전 대상체의 심장 기능 및/또는 폐 기능, 치료받지 않은 디스트로핀병증을 갖는 대상체의 심장 기능 및/또는 폐 기능, 디스트로핀병증을 갖지 않는 대상체의 심장 기능 및/또는 폐 기능, 표준에서의 심장 기능 및/또는 폐 기능일 수 있다.
일부 구현예에서, 심장 기능 및/또는 폐 기능의 개선 또는 증가는 대조군과 비교하여, 예를 들어 마이크로디스트로핀을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 rAAV의 투여 전 대상체와 비교하여 1 내지 100%이다. 일부 구현예에서, 심장 기능은 임피던스, 전기적 활성 및 칼슘 취급을 사용하여 측정될 수 있다.
5.5.2 중추 신경계
DMD 환자의 일부는 또한 간질, 학습 및 인지 장애, 난독증, 신경발달 장애, 예컨대 주의력 결핍 과잉행동 장애(ADHD), 자폐증 및/또는 정신적 장애, 예컨대 강박 장애, 불안 또는 수면 장애를 가질 수 있다.
본원에 개시된 유전자 치료법 치료의 목표는 인지 기능을 개선하거나 간질 및/또는 정신적 장애의 증상을 경감시키는 것일 수 있다. 유효성은 시험 집단의 연령 및 질환 단계에 적절한 행동 및 인지 기능의 주기적 평가에 의해 및 또는 발작 사건의 정량 및 정성평가에 의해 평가될 수 있다.
따라서, 인지 기능을 개선하고, 발작의 발생 또는 중증도를 감소시키고, ADHD, 강박 장애, 불안 및/또는 수면 장애의 증상을 경감시키는 재조합 AAV 조성물 및 마이크로디스트로핀 유전자 치료법 조성물을 투여하는 방법이 제공된다.
5.5.3 환자 1차 엔드포인트
조성물의 투여량을 포함하는 조성물의 유효성, 및 본원에 기재된 방법은 치료받는 대상체의 임상 평가에서 평가될 수 있다. 환자의 1차 엔드포인트는 강제 폐활량(FVC), 강제 호기량(FEV1), 최대 흡기압(MIP), 최대 호기압(MEP), 최대 호기 유량(PEF), 최대 기침 유량, 좌심실 박출률(LVEF), 좌심실 분획 단축(LVFS)의 기준선으로부터의 변화 모니터링을 포함할 수 있다. NSAA의 기준선으로부터의 변화, 상지 수행(PUL) 점수의 기준선으로부터의 변화, 및 브루크 상부 말단 척도 점수(브룩(Brooke) 점수)의 기준선으로부터의 변화, 그립 강도, 핀치 강도의 기준선으로부터의 변화, MRI에 의한 심장 섬유증 점수의 변화, MRI에 의해 평가된 상완(이두근) 근육 지방 및 섬유증의 변화, 동력계를 사용한 다리 강도의 측정, 걷기 시험 6분, 걷기 시험 10분, 걷기 분석 - 걷기의 3D 기록, 면역 염색된 생검 섹션의 정량 가능한 영상화를 통한 유트로핀 막 염색의 변화, 그리고 섬유 크기 및 신생아 미오신 양성도의 조합을 (근육 생검을 통해) 측정함으로써 재생 섬유의 변화를 모니터링하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌(Mazzone E 등, North Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders 20 (2010) 712-716.; Abdelrahim Abdrabou Sadek, 등, Evaluation of cardiac functions in children with Duchenne Muscular Dystrophy: A prospective case-control study. Electron Physician (2017) Nov; 9(11): 5732-5739; Magrath, P. 등, Cardiac MRI biomarkers for Duchenne muscular dystrophy. BIOMARKERS IN MEDICINE (2018) VOL. 12, NO. 11.; Pane, M. 등, Upper limb function in Duchenne muscular dystrophy: 24 month longitudinal data. PLoS One. 2018 Jun 20;13(6):e0199223)을 참고한다.
6. 실시예
6.1 실시예 1 - 시스 플라스미드 삽입을 위한 마이크로디스트로핀(DMD) 유전자 발현 카세트의 작제.
DMD 작제물은 코어 골격: 5'(N-말단)-ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-3'(C-말단)(도 2)을 갖지만 C-말단(CT)의 존재 및 길이가 상이한 마이크로디스트로핀을 암호화한다. RGX-DYS1에 의해 암호화된 마이크로디스트로핀은 C 말단으로 야생형 DMD 단백질 C-말단 도메인(서열 번호 16)의 근위 194개 아미노산을 갖고, RGX-DYS3은 기능적 신트로핀 또는 α-디스트로브레빈 결합 도메인이 없는 짧은 C-말단(서열 번호 91의 48개 아미노산)을 갖는 마이크로디스트로핀을 암호화하고, RGX-DYS5는 α1-신트로핀 결합 부위는 함유하지만 디스트로브레빈 결합 부위는 함유하지 않는 C-말단 도메인(서열 번호 83)의 140개 아미노산을 갖는 마이크로디스트로핀을 암호화한다(도 1a 및 1b 참고). 작제물은 Spc5-12 프로모터(서열 번호 39) 및 smPA 조절 서열을 포함하고, RGX-DYS3은 VH4 인트론 서열(서열 번호 41)을 포함한다. 모두 ITR이 측면에 있는 시스 플라스미드로 클로닝하였다. DMD 유전자를 암호화하는 모든 DNA 서열은 코돈 최적화되고 CpG 고갈된다.
6.1.1. RGX-DYS1, RGX-DYS3 및 RGX-DYS5 이식유전자의 재조합 조작
간략하게, N-말단-ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT-C-말단(서열 번호 1의 아미노산 서열을 가짐)을 암호화하는 도 2에 나타낸 바와 같은 RGX-DYS1에서 마이크로디스트로핀 작제물의 인간 코돈 최적화 및 CpG 고갈 뉴클레오티드 서열을 GeneArt Gene Syntation(Invitrogen, Thermo Fisher, Waltham, MA)을 사용하여 합성했다. 원하는 C-말단을 하기 두 프라이머를 사용하여 부위 지정 돌연변이유발에 의해 제조하였다: 5': TGA CTC GAG AGG CCT AAT AAA GAG C(서열 번호 43), 3' CCT TGG AGA CTG TGG AGA GGT G(서열 번호 44). 작제물은 합성 근육 프로모터(예를 들어, SPc5-12; 서열 번호 39) 및 작은 폴리(A) 신호 서열(sm pA(서열 번호 42)을 포함하며 서열 번호 53의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
작제물 RGX-DYS3(도 2)을 CT 도메인의 작은 부분(48개 아미노산; 서열 번호 91)을 갖는 상기 상세히 나타낸 RGX-DYS1 작제물의 마이크로디스트로핀을 암호화하는 조작하였다(마이크로디스트로핀은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가짐). 이 작제물은 마이크로디스트로핀 코딩 서열의 5' 말단에 SPc5-12 프로모터, sm pA 폴리 A 서열 및 VH4 인트론을 포함한다. 이식유전자 작제물은 서열 번호 21의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
작제물 RGX-DYS5(도 2)를 마이크로디스트로핀 DYS5(서열 번호 79의 아미노산 서열)를 암호화하도록 조작하였고, 이는 C-말단 도메인이 절단되고 140개 아미노산 길이라는 것을 제외하면 DYS1 마이크로디스트로핀이다(서열 번호 83). 작제물은 SPc5-12 프로모터 및 sm pA 신호 서열을 포함하고 서열 번호 82의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
플라스미드 RGX-DYS1에서 DYS1의 긴 버전의 C-말단을 중간 길이 버전의 C-말단 테일로 대체하여 플라스미드 RGX-DYS5를 생성하였다. 간략하게 gBlock-DMD-1.5 테일을 EcoRV 및 NheI 부위가 측면에 있는 중간 버전의 C-말단 및 RGX-DYS1 플라스미드의 17 bp 중첩 서열을 함유하는 통합 DNA 기술로부터 합성하였다. 원천 플라스미드 RGX-DYS1을 제한 효소 NheI 및 EcoRV(New England Biolabs)로 소화시킨 후 gBlock-DMD1.5 테일과 인-퓨전(in-fusion) 결찰했다. 최종 플라스미드 RGX-DYS5를 효소 소화 및 후속 시퀀싱에 의해 확인하였다. RGX-DYS2 및 RGX-DYS4를 유사하게 작제하였으며 각각 RGX-DYS1과 동일한 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하고, RGX-DYS2는 프로모터 하류에 VH4 인트론을 함유하고 RGX-DYS4는 절단된 근육 특이적 프로모터를 갖는다.
작제물을 모두 ITR이 측면에 있도록 시스 플라스미드에 삽입하였다(서열 번호 82의 뉴클레오티드 서열). RGX-DYS1 카세트는 DYS1 마이크로디스트로핀을 암호화하는 서열 번호 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, RGX-DYS3 카세트는 DYS3 마이크로디스트로핀을 암호화하는 서열 번호 21의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, RGX-DYS5 카세트는 DYS5 마이크로디스트로핀을 암호화하는 서열 번호 81을 포함한다(또한 표 5 참고). 표 10은 RGX-DYS1(서열 번호 53), RGS-DYS3(서열 번호 54) 및 RGX-DYS5(서열 번호 82)의 인공 게놈의 뉴클레오티드 서열(소문자로 표시된 측면 ITR 서열 포함)을 제공한다.
단백질의 길이 및 발현을 C2C12 세포에서 상이한 플라스미드의 발현 및 웨스턴 블롯에 의한 세포 용해물 검정에 의해 확인하였다.
RGX-DYS5의 패키징 효율을 검사하기 위해, RGX-DYS5를 HEK293 세포를 사용하여 AAV8 벡터에 패키징하고, AAV8 패키징된 벡터 RGX-DYS5의 역가를 진탕 플라스크 배양 및 친화도 정제 후 결정했다. 평균 역가는 이러한 벤치탑 생산 실행에서의 AAV8 패키징된 RGX-DYS1보다 높았으며 AAV8 패키지 RGX-DYS3과 필적했다(데이터는 나타내지 않음).
6.2 실시예 2: mdx 마우스에서의 작제물 발현의 비교 연구
6.2.1 웨스턴 블롯, mRNA 발현 및 DNA 벡터 카피수에 의한 μ-Dys 발현 비교.
RGX-DYS1 실험과 관련하여 이 실시예에 기재된 데이터 및 샘플은 하기 섹션 6.5(개념 증명; 실시예 5)에 기재된 바와 같이 처리 후 수집하였다(AAV8-RGX-DYS1이 투약된 n=13마리 마우스). AAV8-RGX-DYS3 및 AAV8-RGX-DYS5 벡터의 생체내 시험을 13마리의 수컷 C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J(mdx) 마우스에서 수행했다. 모든 벡터는 2E14 vg/kg 투여량으로 꼬리 정맥 주사에 의해 5주령 mdx 마우스에 전신 전달하였다(그룹 1, AAV8-RGX-DYS3의 경우 n=5, 그룹 2, AAV8-RGX-DYS5의 경우 n=5; mdx 음성(투약 없음) 대조군, n=3). 투여일에 동물은 15.9 g 내지 22.0 g의 체중 범위였다. 벡터 투여 6주 후 혈청을 위해 혈액을 수집하고 동물을 안락사시켜 조직 수집을 위해 부검을 실시했다. 비복근(Gas), 전경골근(TA), 횡경막, 삼두근, 대퇴 사두근, 심장, 간 및 주요 기관을 포함한 주요 골격근을 수집하고 이소펜탄/액체 질소 이중조에서 급냉한 후 사전 냉각된 냉동관에 넣었다.
각 동물에 대해 체중을 주 2회 기록하였으며, 각 그룹의 평균 체중 변화를 계산했다. 한 마리를 제외하고 모든 동물이 예상된 바와 같이, 7주 기간에 걸쳐 체중이 증가했다.
RGX-DYS1 처리 마우스를 이용한 실험은 RGX-DYS3 및 RGX-DYS5 처리 마우스에 대한 실험과 상이한 시설에서 수행하였다.
처리된 mdx 마우스로부터 수집된 비복근으로부터의 마이크로디스트로핀 단백질 발현을 웨스턴 블롯에 의해 검사하였다. 간략하게, 20 내지 30 mg의 조직을 단백질 용해 완충액(15% SDS, 75 mM Tri-HCl pH6.8, 프로티나제 억제제, 20% 글리세롤, 5% 베타-머캅토에탄올)(비드 밀 균질화기 Bead Ruptor 12, SKU:19050A, OMNI International) 중 균질화했다. 균질화 후, 샘플을 실온에서 최고 속도로 5분 동안 회전침강시키고, 상청액으로 단백질 정량을 거쳤다. Qubit 단백질 검정 키트(Catalog # Q33211, ThermoFisher Scientific)를 사용하여 단백질 스톡 상청액을 정량했다. 스톡당 전체 단백질 농도를 계산한 다음, 20 μg의 단백질 스톡 상청액을 SDS-PAGE 겔 상으로 로딩했다. 웨스턴 블롯은 1:1000 희석도로 1차 항-디스트로핀 항체(MANEX1011B(1C7), Developmental Studies Hybridoma Bank)를 사용하여 수행했으며, 적용된 2차 항체는 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 대한 염소 항-마우스 IgG2a 접합체였다(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 62-6520). α1-액틴이 겔의 각 레인에서 로딩 대조군으로서 작용한다. 항-α1-액틴 블롯의 경우, 토끼 폴리클로날 항-α1-액틴 항체(PA5-78715, Thermo Fisher)를 1:10,000의 희석 인수로 사용하였고 2차 염소 항-토끼 항체(Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 31460)를 1:20,000으로 사용했다. ECL Prime 웨스턴 블로팅 검출 시약(제조업체의 지침에 따라, AMERSHAM, RPN2232)을 사용하여 단백질 신호를 검출하고 Image Lab 소프트웨어(Bio-Rad)에 의해 안내된 밀도측정에 의해 정량했다.
웨스턴 블롯 결과(도 3a)는 몇몇 관찰을 드러내었다: 첫째, 각 마이크로디스트로핀 단백질의 추정 크기는 겔에서의 그 관찰된 이동과 잘 일치하며, 예를 들어 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질은 148 kDa인 반면, RGX-DYS5 및 RGX-DYS3 단백질의 크기는 각각 142 kDa 및 132 kDa이었다. 둘째, 비복근 조직에 존재하는 단백질마다 밴드의 세기가 상이하였다. 더 긴 버전 마이크로디스트로핀인 RGX-DYS1 벡터가 가장 강력한 이식유전자 발현을 나타냈고, 중간 버전인 RGX-DYS5 및 더 짧은 버전인 RGX-DYS3이 그 뒤를 이었다(및 도 3a 및 3b). 이들 3가지 작제물 간의 마이크로디스트로핀 발현 수준의 차이는 AAV 벡터 게놈 수준의 변화 또는 상이한 길이의 마이크로디스트로핀 작제물의 단백질 안정성에 기인할 수 있다.
세포당 게놈 카피를 규명하기 위해, ddPCR을 수행하여 이들 조직에서 AAV-마이크로디스트로핀 벡터 게놈 카피수를 검사했으며, 이배체 세포당 특정 조직에서 전달된 벡터의 카피수는 다음과 같이 계산하였다: . 도 3c에 나타낸 바와 같이, RGX-DYS1 벡터가 전달된 조직은 실제로 RGX-DYS5(17±4 GC/세포) 및 RGX-DYS3(16±5 GC/세포) 벡터가 전달된 조직보다 높은 벡터 게놈 카피수(50±14 GC/세포)를 가졌다(값은 글루카곤 게놈 카피에 대해 정규화됨). 그런 다음 상대적 마이크로디스트로핀 발현을 벡터 카피수와 비교했다. 도 4에 나타낸 바와 같이, RGX-DYS1 처리 근육(1.33 ± 0.39) 및 RGX-DYS5 처리 근육(1.774 ± 0.40)에서의 상대적 마이크로디스트로핀의 발현은 모두 RGX-DYS3 처리 근육에 비해 유의하게 더 높았다(0.77 ± 0.22, p< 0.05, n = 3 내지 5). 이 데이터는 RGX-DYS1 및 RGX-DYS5 벡터에 의해 생성된 더 긴 버전의 마이크로디스트로핀(C-말단을 가짐)이 생체내 근육 세포에서 마이크로디스트로핀 단백질의 더 우수한 안정성을 제공하였음을 표시한다.
추가적으로, 처리 마우스와 비교하여 미처리 야생형 B6 및 mdx 마우스의 골격근에서 μ- 및 야생형(WT)-디스트로핀의 mRNA 발현을 ddPCR로 측정하였다. 전체 RNA를 RNeasy 섬유성 조직 미니 키트(REF 74704, Qiagen)를 사용하여 근육 조직으로부터 추출했다. cDNA를 RNAse 억제제가 포함된 고용량 cDNA 역전사 키트(Ref 4374966, Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 합성하였다. RNA 농도는 Nanodrop 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 마이크로디스트로핀, WT-디스트로핀 및 내인성 대조군 글리세르알데히드 3-포스포레이트 탈수소효소(GAPDH) mRNA의 카피수를 디지털 PCR(Naica Crystal 디지털 PCR 시스템, Stilla Technologies)을 사용하여 측정하였다. 마우스 WT-디스트로핀(mm01216951_m1, Thermo Fisher Scientific)(위의 섹션 6.5(실시예 5)의 생체분포 연구에도 기재됨) 및 마우스 GAPDH(mm99999915_g1, Thermo Fisher Scientific)에 대한 프라이머 및 탐침은 시판되었다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 나이브 B6 마우스의 상대적 WT-디스트로핀 전사체는 1±0.64였고, mdx 마우스의 WT-디스트로핀 mRNA 발현은 1.55 ± 0.77이었다(p = 0.15, n =4). 처리된 동물의 상대적 마이크로디스트로핀 mRNA는 하기와 같았다: RGX-DYS1 처리된 근육, 22.66 ± 11.6(p < 0.01, n =5); RGX-DYS5 처리, 16.83 ± 11.07(p = 0.06, n = 3) 및 RGX-DYS3 처리 근육, 11.87 ± 7.90(p< 0.05, n = 4). 이 데이터는 RGX-DYS1, RGX-DYS5 및 RGX-DYS3 그룹의 마이크로디스트로핀 벡터 전달이 모두 야생형 수준보다 훨씬 더 높은 마이크로디스트로핀 전사체를 생성함을 표시하였다. 또한, 마이크로디스트로핀 mRNA 카피수를 세포당 AAV 벡터 게놈 카피수에 대해 정규화하였고, WT-디스트로핀 mRNA를 GAPDH 정규화에 더해 세포당 게놈 카피수(2 카피/세포)에 대해 정규화하였다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 모든 그룹은 게놈 기준으로 본질적으로 유사한 수준의 mRNA 발현을 나타냈다(n= 3 내지 5, p>0.05). 이는 AAV-마이크로디스트로핀 이식유전자의 발현을 유도하는 근육 특이적 SPc5-12 프로모터가 마우스 골격근 세포에서 천연 디스트로핀 프로모터만큼 강력함을 표시하였다.
6.2.2 면역형광(IF) 염색 및 디스트로핀-관련 단백질 복합체(DAPC) 결합에 의한 마이크로디스트로핀 발현
다음으로, 면역형광(IF) 염색을 수행하여 상이한 그룹으로부터의 비복근에서 디스트로핀 및 디스트로브레빈, β-디스트로글리칸, 신트로핀 및 nNos를 포함하는 디스트로핀 관련 단백질 복합체의 발현을 검사하였다. 적용된 IF 염색 프로토콜 및 항체는 상기 섹션 6.2(실시예 2)에 이미 기재된 바와 같았다. 디스트로핀 단백질 및 검사된 DAPC 단백질은 모두 미처리 mdx 근육에 부재한 반면, 야생형 B6 근육막 상에서는 강력하게 존재했다. 모든 3개 처리 그룹에 있어서 마이크로디스트로핀 단백질은 거의 100% 근육 섬유 상에서 발현되었으며 상이한 처리 그룹 간에 구별이 불가능했다. 3개 처리 그룹은 관찰된 매우 유사한 패턴을 가지며 근육막 상에서 디스트로브레빈 발현의 회복을 나타내었다. β-디스트로글리칸 염색의 경우, AAV8-RGX-DYS1 처리 그룹의 근육이 더 균일하고 더 강렬한 β-디스트로글리칸 염색(발현)을 나타냈다(데이터는 나타내지 않음).
처리 그룹 사이에 더욱 극적인 차이가 신트로핀 염색에서 관찰되었다. 근육막 상에서 신트로핀의 발현은 더 긴 길이의 마이크로디스트로핀을 함유하는 AAV8-RGX-DYS1 그룹에서 훨씬 강화되었으며, RGX-DYS5 및 RGX-DYS3가 뒤따랐다(데이터는 나타내지 않음). 동일한 경향이 근육 용해물에 대한 웨스턴 블롯 분석에 추가로 실증되었다(도 5a). 신트로핀에 대한 웨스턴 블롯을 골격근 조직 용해물(각각 3개의 mdx 처리 및 비처리 그룹으로부터의 비복근 조직, 및 B6 마우스 그룹으로부터의 1개의 비복근 및 2개의 삼두근)에 대해 수행했다. 폴리클로날 항-신트로핀 항체(Abcam, ab11187)를 1:10,000으로 사용하였고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. α-액티닌에 대한 토끼 모노클로날 항체(ab68167, Abcam)를 1:5000 희석도로 적용했다. 2차 염소 항-토끼 항체(Thermo Fisher Scientific, Cat. No. A-10685)를 적용했다. WT 근육에서 신트로핀 발현 대 내인성 대조군 액티닌 발현의 비는 mdx 그룹(0.84±0.22)과 비교하여 4.56±0.76(n=3, 일원 ANOVA에 의한 p<0.001)이었다. AAV8-RGX-DYS1 및 AAV8-RGX-DYS5 그룹의 비는 각각 2.72 ± 0.97(n=3, mdx 그룹과 비교하여 p<0.05) 및 1.35 ± 0.03이었다(도 5b). 골격근의 신트로핀 발현 수준을 웨스턴 블롯을 통해 전체 근육막 추출물에 대해 추가로 검사하였다. 전체 골격근 단백질을 Mem-Per Plus 막 단백질 추출 키트(Cat# 89842, Thermo Fisher)를 사용하여 추출하였다(mdx 처리 및 비처리 그룹 각각으로부터의 비복근 조직, 및 B6 마우스 그룹으로부터의 대퇴 사두근). 20 μg의 전체 막 단백질을 각 레인에 로딩하였다(도 5c). 폴리클로날 항-신트로핀 항체(Abcam, ab11187)를 밤새 4℃에서 1:10,000 인큐베이션에 사용하였다. 로딩 대조군 폴리클로날 항-액틴(PA5-78715, Thermo Fisher)을 4℃에서 밤새 인큐베이션을 위해 1:10,000 희석도로 적용하였다. WT 근육이 가장 높은 신트로핀 발현 수준을 나타낸 전체 용해물 웨스턴 실험과 약간 상이하게, 도 5d에서 나타난 바와 같이, 전체 막 단백질 웨스턴 블롯은 RGX-DYS1 그룹(0.81±0.26, n=3)에서 가장 높은 상대적 신트로핀 발현을 나타냈고, B6_WT 그룹(0.6623±0.05, n=3), RGX-DYS3 그룹(0.59±0.08), mdx 그룹(0.32 ± 0.07, n=3)이 뒤따랐다. 이러한 결과는 마이크로디스트로핀 벡터에 의해 생성된 마이크로디스트로핀이 근육막 신트로핀 발현을 회복할 수 있고, 더 긴 버전의 RGX-DYS1이 더 짧은 버전의 RGX-DYS3보다 신트로핀을 근육막에 고정하는 능력이 더 우수함을 명확히 표시하였다.
nNOS 웨스턴 블롯을 근육막(비복근 조직/mdx 및 대퇴 사두근/B6 그룹)을 사용하여 유사하게 제조하였다. 전체 근육막 단백질을 Mem-Per Plus 막 단백질 추출 키트(Cat# 89842, Thermo Fisher)를 사용하여 추출했다. 20 μg의 전체 막 단백질을 SDS-PAGE 겔의 각 레인에 로딩했다. nNOS에 대한 1차 항체(SC-5302, Santa Cruz Biotechnology)는 1:500으로 사용하였고, 폴리클로날 항-액틴(PA5-78715, Thermo Fisher)은 1:10,000 희석도로 적용하였다. 2차 염소 항-마우스 IgG 항체, HRP(62-6520, ThermoFisher)를 적용했다. nNOS 발현과 관련하여, IF 염색 후 RGX-DYS1 그룹 이미지와 RGX-DYS3 그룹 이미지 사이에 눈에 띄는 차이를 관찰했다(도 6a). 그러나, 웨스턴 블롯 결과는 RGX-DYS1, RGX-DYS3 및 미처리 mdx 그룹 사이에 어떠한 유의차도 나타나지 않아서(도 6b-c), RGX-DYS1 벡터에 의한 nNOS의 회복이 낮음을 표시하였다.
mdx 마우스에서 RGX-DYS1, RGX-DYS3 및 RGX-DYS5 벡터의 전달은 모두 강력한 마이크로디스트로핀 발현 및 디스트로핀 관련 단백질 복합체(DAPC)의 회복을 초래했다. 더 긴 버전의 RGX-DYS1 벡터는 특히 신트로핀 및 β-디스트로글리칸에 대한 DAPC의 회복을 향상시켰다. RGX-DYS1 벡터에 의한 nNOS의 막 DAPC에 대한 회복 능력은 낮았지만 IF 염색 시 눈에 띄었다.
6.2.3 AAV8-RGX-DYS1 벡터에 의한 위성 세포의 형질도입 및 근이영양성 근육의 재생 완화
골격근 줄기 세포 또는 위성 세포(SC)는 일반적으로 휴지 상태이며 근섬유의 기저판과 근육속막 사이에 위치한다. 성장 동안 및 근육 손상 후, SC의 근원성 프로그램이 활성화되고 SC는 자가 재생되어 이의 풀을 유지하고/하거나 분화하여 근모세포 및 궁극적으로 근섬유를 형성한다. 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 분화된 근섬유의 형질도입을 위해 잘 알려져 있으므로 위성 세포도 AAV 벡터에 의해 형질도입할 수 있는지 조사했다. 위성 세포는 작고 세포질이 거의 없기 때문에 이러한 세포에서 이식유전자 발현을 연구하는 것은 기술적으로 어렵다. 본원에서는 RNAscope®를 적용하여 AAV가 위성 세포를 형질도입할 수 있는지 여부를 조사하였다. RNAscope®는 동시 신호 증폭 및 배경 노이즈 억제를 가능하게 하는 원 위치 혼성화(ISH) 기술로, 단일 세포 분해능으로 온전한 조직에서 직접 단일 분자 유전자 발현의 시각화를 허용한다. 미처리 mdx 마우스, RGX-DYS1 처리 mdx 마우스 및 야생형 C57BL/6 마우스의 골격근에서 3개의 마이크로디스트로핀 단백질(DYS1, DYS3 또는 DYS5) 및 Pax7 mRNA의 공동 편재. RNAscope® 다중화(multiplex) 형광 분석은 형광단 Opal 570(빨간색)으로 표지된 AAV 마이크로디스트로핀 탐침 및 형광단 Opal 520(녹색)으로 표지된 근육 위성 세포 마커 pax7과 함께 이용하였다. AAV 이식유전자 및 Pax7 mRNA 발현의 RNAscope® 다중화 형광 분석을 Advanced Cell Diagnostics Inc(Newark, CA)에서 수행하였다. 전체 RNA를 RNeasy® 섬유성 조직 미니 키트(Qiagen Cat. No. 74704)를 사용하여 골격근으로부터 추출하고, cDNA를 RNase 억제제를 포함하는 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems Cat. No. 4374966)를 사용하여 합성했다. 마이크로디스트로핀 mRNA 및 내인성 대조군 GAPDH mRNA의 절대적 카피수를 디지털 PCR(Naica Crystal 디지털 PCR 시스템, Stilla Technologies)을 이용하여 측정하였다. 마이크로디스트로핀에 대한 프라이머 및 탐침은 이전에 기재된 바와 동일하였다. 마우스 pax7 프라이머 및 탐침 세트(TaqMan™ MGB 탐침, Applied Biosystems Cat. No. 4316034)는 상업적으로 구입했다.
마이크로디스트로핀이 형질도입된 위성 세포를 계수하고, 위성 세포의 형질도입율을 계산하였다. AAV-마이크로디스트로핀이 형질도입된 골격근에서 위성 세포의 형질도입율은 23±1.5%였다(도 7a). 이는 AAV 벡터가 성숙 근섬유보다 훨씬 낮은 형질도입율이기는 하지만 근육 위성 세포를 형질도입할 수 있음을 표시하였다.
그런 다음 전체 pax7+ 위성 세포수를 RNAscope 이미지에서 계수하여 위성 세포수가 상이한 처리 그룹에서 유사한지 여부를 조사했다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, 미처리 mdx에서의 이미지당 pax7 양성 세포수는 39.12±15.14였고, 야생형 B6 마우스 및 DMD 벡터 처리 마우스에서의 양성 세포 계수는 11.87±3.23(8개 이미지를 계수함, 일원 ANOVA에 의해 p< 0.0001). 및 14.66 ± 5.91(12개의 이미지를 계수함, 일원 ANOVA에 의해 p< 0.0001)이었다. 미처리 mdx 근육의 위성 세포수 증가는 근위축성 근육의 재생 성질을 표시하였다. RGX-DYS1 벡터를 사용한 마이크로디스트로핀의 전달은 이러한 병리를 역전시키고 근육 재생을 경감시켰다.
RNAscope 기술 분석에 더하여, 전체 근육 RNA를 추출하고 cDNA 합성을 수행했다. 전체 RNA를 RNeasy® 섬유성 조직 미니 키트(Qiagen Cat. No. 74704)를 사용하여 골격근으로부터 추출하고, cDNA를 RNase 억제제를 포함하는 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems Cat. No. 4374966)를 사용하여 합성했다. 샘플로 마우스 pax7 특이적 프라이머 및 탐침 세트(각각 시판됨: mm01354484_m1 Pax7, Thermo Fisher Scientific; 및 TaqMan™ MGB 탐침, Applied Biosystems Cat. No. 4316034)를 사용하여 ddPCR 분석을 거쳤다. 마우스 GAPDH 프라이머 및 탐침 세트를 사용하여 RNA 및 cDNA 입력을 정규화했다. 마이크로디스트로핀 mRNA 및 내인성 대조군 GAPDH mRNA의 절대적 카피수를 디지털 PCR(Naica Crystal 디지털 PCR 시스템, Stilla Technologies)을 사용하여 측정하였다. pax7 mRNA 카피수 대 GAPDH mRNA 카피수의 비를 그룹 간에 비교했다(도 7c). 예상된 바와 같이, mdx 마우스에서 pax7 발현의 상대적 발현은 7.56 ± 3.14였으며, 이는 WT-B6 마우스보다 훨씬 더 높았다(1 ± 0.68, n=5, 일원 ANOVA에 의해 p<0.001). 3개의 상이한 마이크로디스트로핀 벡터 처리 그룹의 상대적 pax7 발현은 훨씬 감소되었다(RGX-DYS5의 경우 4.40 ± 1.50(n=3, p=0.06), RGX-DYS3 그룹의 경우 3.12 ± 0.74(n = 5, p < 0.01), RGX-DYS1의 경우 2.98 ± 0.68(n = 5, p< 0.01). Pax+ 위성 세포수는 mdx에서 상승하며 이는 이 이영양증 모델에서의 근육 변성 및 재생의 활성 주기와 일치한다. 마이크로디스트로핀 처리 mdx 마우스의 위성 세포에서 pax7 mRNA 발현의 감소는 본 발명의 마이크로디스트로핀 벡터가 근육 재생의 완화를 통해 근이영양성 근육의 위성 세포 과형성을 교정함을 표시한다.
DYS1 처리는 위성 세포 계수 및 Pax7 mRNA 발현 둘 모두에 의해 측정된 바와 같이 mdx에서 위성 세포 과형성을 유의하게 감소시킨다(도 7b 및 7c).
6.3 실시예 3 AAV9 대비 AAV8 RNA/DNA 연구 비교
AAV8 및 AAV9는 전신 전달을 통해 비인간 영장류(NHP)의 골격근 및 심장근에서 유사한 형질도입 효율을 갖는다(도 8a-8f). 고유한 바코드를 갖는 AAV8 및 AAV9 패키징 CAG-GFP 카세트를 개별적으로 제조하고 거의 동일한 농도로 다른 캡시드와 풀링하여 118개의 바코드화 AAV 라이브러리를 생성했다. 이 라이브러리(PAVE118)를 1.77e13 GC/kg의 용량으로 3마리의 시노몰구스 원숭이에 정맥내 투여하였다. 투약 3주 후 다양한 NHP 조직으로부터 단리된 DNA 및 RNA로 상대적 존재비에 대한 NGS 분석을 거쳤다. NHP의 골격근(각각 도 8a 및 b), 심장근(각각 도 8c 및 d) 및 간(각각 도 8e 및 f)에서 AAV8 및 AAV9 캡시드로부터의 DNA와 RNA 수준 사이에는 유의차가 없었다.
6.4 실시예 4 - 시험관내 연구(DMD 환자 유래 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC))
mdx/BL10은 DMD의 잘 확립된 쥣과 모델이지만, DMD를 갖는 환자의 주요 사망 원인인 심근병증이 나타나지 않거나 노화에 따른 경도 심실 확장으로 표현형이 제한된다(Yucel 등, 2018). 최근 간행물에서는 DMD 환자로부터의 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)가 확장성 심근병증을 모델링하기 위해 사용될 수 있음을 표시하였다(Laurila 등, 2016; Lin 등, 2015).
이 연구는 환자 유래 iPSC-CM을 사용하여 DMD의 시험관내 심장 모델을 확립하고 디스트로핀-결핍 인간 심근세포에서 RGX-DYS1의 생체활성을 평가할 수 있다. 유럽 유도된 만능 줄기 세포 은행(EBiSC)으로부터 얻은 DMD 환자 및 건강한 공여체로부터의 iPSC는 심근세포로 분화될 수 있다. 성숙 심근세포가 생성되면 DMD 및 건강한 대조군 인간 세포주의 기능적 표현형을 특성규명할 수 있다.
기능적 표현형이 확립되면 RGX-DYS1을 DMD iPSC-CM과 인큐베이션할 수 있다. RGX-DYS1 벡터(DNA) 및 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀을 각각 qPCR 및 면역세포화학에 의해 결정할 것이다. 또한 DMD 심근세포에서 RGX-DYS1의 이점을 평가하기 위해 심장 기능적 엔드포인트(즉, 임피던스, 전기적 활성 및 칼슘 처리)을 평가할 수 있다.
6.5 실시예 5 - 개념 증명 - mdx 마우스에서의 6주 연구
6.5.1 mdx 마우스에서의 6주 연구
mdx 마우스에서 AAV8-RGX-DYS1의 생체활성을 평가하기 위해, AAV8-RGX-DYS1을 5주령 mdx 수컷 마우스(C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J; 그룹당 n=13)에 0(비히클) 또는 2×1014 GC/kg 용량으로 정맥내 투여했다. 하기 매개변수 및 엔드포인트를 연구에 포함하였다: 사망률, 임상 관찰, 체중, 앞다리 그립 강도, 및 장지신근(EDL)에 대한 시험관내 힘. 부검 시(투약 6주 후), 조직 중량을 포함하여 조직의 육안 검사를 수행했다. 근육 조직을 근육 병리의 평가를 위해 별도로 수집했다. AAV8-RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현은 웨스턴 블롯 및 면역형광에 의해 평가하였고, RGX-DYS1 벡터 DNA 생체분포도 평가하였다. 마지막으로, DAPC 단백질의 발현 및 편재를 또한 면역형광을 사용하여 전경골근(TA) 및 횡경막 조직에서 평가했다.
AAV8-RGX-DYS1은 2Х1014 GC/kg에서 우수한 내약성을 보였다. AAV8-RGX-DYS1 관련 사망 또는 유해 임상 관찰은 없었다. 마우스 한 마리를 AAV8-RGX-DYS1 투여 3주 후 수두증으로 인해 안락사시켰다. 그러나 수두증은 mdx 마우스에서 흔히 나타나고 12주 약리 연구에서 비히클 대조군 mdx 마우스에서도 나타났으므로 이 발견은 시험 항목과 관련된 것으로 간주되지 않았다(Xu 등, 2015; 실시예 6).
mdx 마우스의 자연적 이력 데이터(Coley 등, 2016)와 일치하게, 비히클 대조군 mdx 마우스의 평균 체중은 연령 일치하는 과거 대조군(+11%)보다 유의하게 더 높았다. 또한, 절대적 및 정규화된 근육 조직 중량은 시험 시설(AGADA Biosciences)에서 야생형 과거 대조군 데이터(HCD)와 비교하여 유의하게 더 높았다(각각 +18% 내지 53%, +7% 내지 +36%). AAV8-RGX-DYS1 투여는 mdx 마우스의 체중을 감소시켰으나(약 13%), 이는 시험 시설의 과거 야생형 대조군 데이터와 필적했다. 이와 동시에, 모든 골격근(횡격막 포함)의 절대적 및 정규화된 중량은 비히클 대조군 mdx 마우스보다 낮았다(각각 -17% 내지 -29% 및 -4% 내지 -18%).
근육 기능을 제5주에 그립 강도에 의해 평가하였고, EDL 근육의 시험관내 힘을 부검 시(제6주) 평가하였다. 비히클 대조군 mdx 마우스는 연령 일치 과거 야생형 대조군 데이터와 비교하여 절대적 및 정규화된 앞다리 그립 강도의 유의한 감소를 나타내었다. AAV8-RGX-DYS1 투여는 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교하여 mdx 마우스에서 절대적 및 정규화된 앞다리 그립 강도를 증가시켰으며(각각 +14.5% 및 +33.7%), 이러한 데이터는 시험 시설에서의 과거 야생형 대조군 데이터와 필적했다. 도 9a-9d에 나타낸 바와 같이, 야생형 HCD와 비교하여 비히클 대조군 mdx 마우스에서 최대 및 비력 출력이 둘 다 유의하게 감소되었다. 대조적으로, mdx 마우스에 대한 AAV8-RGX-DYS1 투여는 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교하여 EDL 근육의 최대 및 비력 출력의 유의한 증가를 야기했다(각각 +21% 및 47.2%). 그립 강도를 결정하기 위해 마우스를 앞다리 와이어 그리드 상부에 살짝 올려 놓아서 앞발만 수평 막대 중 하나를 잡을 수 있도록 했다. 앞발 두 개가 동일한 막대를 잡고 몸통이 땅에 대해 수평이고 막대와 평행한지 확인한 후, 그립이 풀릴 때까지 그리드의 전체 길이를 따라 균일한 힘으로 마우스를 꾸준히 뒤로 당겼다. 적응 및 시험을 위해 연속 5일 동안 각 동물에 대해 5회 제대로 당긴다. 개별 마우스의 최대 강도 분석을 위해 단일 최고 기록 값(최대력)을 계산했다. 정규화된 강도(KGF/kg)를 체중에 기반하여 계산하였다. 시험관내 힘을 결정하기 위해 오른쪽 뒷다리의 EDL 근육을 각 마우스로부터 제거하여 25℃의 링거 용액(pH 7.4)을 함유하는 산소공급조(95% O2, 5% CO2)에 담갔다. 피로하지 않은 경련을 사용하여 근육을 힘 생성을 위한 최적 길이로 조정했다. 근육을 전극으로 자극하여 2분 휴식 간격에 의해 분리된 경직성 수축을 유도했다. 이후 경직이 발생할 때마다, 힘이 일반적으로 약 250 Hz에서 발생하는 안정기에 도달할 때까지 자극 주파수를 20, 30 또는 50 Hz 단계로 증가시켰다. 근육의 단면적을 근육 질량, 섬유 길이, 및 조직 밀도에 기반하여 측정하였다. 마지막으로 근육 비력(kN/m2)을 근육의 단면적에 기반하여 계산하였다.
AAV8-RGX-DYS1 투여가 근육 기능을 개선할 뿐만 아니라 mdx 마우스의 이영양증 표현형을 약화시키는지 여부를 검사하기 위해, 근육 병리(즉, 염증, 변성, 재생 및 중앙 유핵)을 AAV8-RGX-DYS1이 투여된 mdx 마우스에서 연구 종료(제6주) 시 TA 및 횡경막에서 검사하였다. 시험 시설(AGADA Biosciences) 조직 은행으로부터의 야생형 대조군 조직을 TA 근육에 대한 비교인자로 사용했고(n=2-3) 시험 시설로부터의 연령 일치 야생형 HCD를 횡경막에 대해 사용했다.
염증은 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 사용하여 검사했다. 근육의 재생 및 변성 섬유는 각각 배아 미오신 중쇄(eMHC) 및 IgM의 면역염색에 의해 결정하였다. 근육 재생의 또 다른 지표인 중앙 유핵도 H&E 염색에 의해 측정했다.
도 10a-10k에 나타낸 바와 같이, 이영양증 병리(염증, 변성, 재생)가 야생형 마우스와 비교하여 비히클 대조군 mdx 마우스의 TA 및 횡격막에서 명백하였다. 또한, 재생 섬유로 인식되는 중앙 유핵 섬유(CNF)는 비히클 대조군 mdx에서 과거 야생형 대조군 데이터보다 유의하게 더 높았다(TA: 야생형에서 2.92% 대 mdx에서 70.81%, 횡격막: 야생형에서 1.46% 대 mdx에서 41.63%). AAV8-RGX-DYS1 투여는 mdx 마우스의 이영양증 변화를 약화시켰다(도 10a-10k); 염증, 재생 및 변성의 상당한 감소가 TA 및 횡경막 조직 둘 모두에서 관찰되었으며, 이는 시험 시설에서의 야생형 HCD와 유사했다. AAV8-RGX-DYS1 투여는 또한 mdx 마우스의 TA(-18.4%) 및 횡격막(-48.9%)에서 CNF의 백분율을 유의하게 감소시켰지만, 두 조직 모두에서 CNF의 백분율은 과거 야생형 대조군 데이터보다 높았다(도 10a-10k). 이러한 관찰은 DMD 환자와 달리 AAV8-RGX-DYS1 투여 전 mdx 마우스에서 근육 세포 복제의 초기 시작(약 3주령) 및 mdx-BL10 배경 마우스의 우수한 재생 능력에 기인한 것일 수 있다(Turk 등, 2005).
mdx 마우스에서 AAV8-RGX-DYS1의 성공적인 형질도입을 확인하기 위해 RGX-DYS1 생체분포(벡터 DNA)를 ddPCR에 의해 검사하고, RGX-DYS1 마이크로디스트로핀(단백질)의 이식유전자 수준을 면역형광 및 웨스턴 블롯에 의해 결정했다. 디스트로핀 수준도 대조군으로서 측정하였다.
벡터 DNA 수준을 모든 조직(간, 심장, 횡경막, TA, EDL 및 삼두근)에서 ddPCR에 의해 정량하였으며 모든 AAV8-RGX-DYS1 투여 동물로부터 수집하였다(도 11a 및 11b)). 간이 가장 높은 벡터 DNA 수준을 가진 반면 조직 수준은 필적했다. 비히클 대조군 mdx 마우스에서, 다른 모든 근육의 간 및 각 근육 그룹에 대해 선택된 몇몇 동물 조직을 분석하여 벡터 DNA 수준이 부재하거나 정량 하한(LLOQ)(약 0.08 gc/dg)에 가까움을 확인했다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 단백질을 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스로부터 수집된 횡경막, 비복근 및 TA 근육으로부터 추출하였다. 샘플의 마이크로디스트로핀 수준을 BL10 마우스 및 독일 쇼트헤어 포인터 근이영양증(GSHPMD) 개 근육 용해물의 혼합물로부터 디스트로핀을 측정하여 유도된 표준 곡선에 기반하여 정상 디스트로핀%로서 계산하였다. AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스는 디스트로핀%로 보고된 AAV8-RGX-DYS1 마이크로디스트로핀의 발현을 횡격막에서 159.5%, 비복근에서 191.8%, 및 TA 근육에서 225.2%로 나타내었다(도 12). 횡경막, 비복근 및 TA 근육에서의 AAV8-RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현은 제6주에 모든 근육 조직에 걸쳐 벡터 DNA의 광범위한 분포와 일치했다.
근섬유에서 AAV8-RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현을 추가로 확인하기 위해 면역형광을 TA 및 횡격막에서 수행했다. 투여 6주 후, 비히클 대조군 mdx 마우스는 체세포 복귀 근섬유가 거의 없는 것을 제외하고는 TA 및 횡격막에서 디스트로핀 양성 섬유가 없었다(즉, 근육속막에서 디스트로핀 발현 없음). 대조적으로, AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스는 TA(96%) 및 횡경막(89.1%) 근육 조직의 근육속막에서 강력하고 정확한 마이크로디스트로핀 발현을 나타냈다(도 13a-13c); 이러한 결과는 야생형 대조군의 결과와 유사했다. 이전에 보고된 바와 같이, 균일한 디스트로핀 발현이 근섬유 회전율을 안정화하고 이영양증 근육의 병리를 약화시키기 위해 필요하다(van Westering 등, 2020).
디스트로핀 결핍은 근육의 반복적인 수축 및 이완 동안 근육 온전성 및 세포 신호전달을 유지하는 것을 담당하는 전체 DAPC의 분해를 초래한다(Sancar 등, 2011; Duan 등, 2018). 따라서 디스트로핀의 부재 및 DAPC의 탈안정화가 근육 손상에 대한 민감성을 증가시키고 세포내 칼슘 유입을 축적하여 중증 이영양증 표현형을 야기하는 것으로 생각된다(Cirak 등, 2012).
AAV8-RGX-DYS1 투여가 DAPC 단백질의 안정화를 또한 회복할 수 있는지 평가하기 위해 항-α1-신트로핀, 디스트로브레빈, nNOS-1 및 β-디스트로글리칸을 사용하여 TA 및 횡격막 근육에서 면역형광을 수행했다(도 14).
비히클 대조군 mdx 마우스는 야생형 대조군과 비교하여 TA 및 횡경막의 근육 섬유의 근육속막에서 무시할 수 있는/검출할 수 없는 DAPC 단백질을 나타내었다. AAV8-RGX-DYS1 투여는 두 조직 모두에서 α1-신트로핀(TA에서 9/10 및 횡격막에서 10/10) 및 디스트로브레빈(TA에서 8/10 및 횡격막에서 10/10)의 근육속막 발현을 완전 회복시켰다. 더 중요하게는 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스의 α1-신트로핀 및 디스트로브레빈 발현이 둘 모두 항-디스트로핀 염색과 공동 편재된 것으로 나타났으며 야생형 마우스와 유사하였다. 이러한 결과는 이전에 보고된 바와 같이(Constantin 등, 2014; Koo 등, 2011) RGX-DYS1 마이크로디스트로핀의 C-말단 도메인(CT194)이 α-디스트로브레빈 및 α-신트로핀을 모집할 수 있음을 실증했다. 근육속막에서의 β-디스트로글리칸 존재가 또한 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교하여 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스에서 회복되었다. 그러나 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스는 야생형과 비교될 때 TA에서 넓은 영역의 강력한 발현(6/10) 및 낮은 발현(4/10)을 나타냈다. AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스의 횡경막 조직에서도 유사한 패턴이 주지되었다. AAV8-RGX-DYS1 투여는 근육속막에서 nNOS 존재를 완전 회복시키는 것으로 보이지 않았지만 nNOS는 TA 및 횡경막의 근육속막에서 그리고 비히클 대조군 mdx 마우스보다 높은 수준으로 검출 가능하였다. 종합하면, AAV8-RGX-DYS1 투여가 TA 및 횡경막 근육의 근육속막에서 CT에 특이적인 단백질을 포함하여 DAPC 단백질의 발현을 증가시켜, 근육 섬유의 구조적 온전성 개선을 제시하였다.
6.6. 실시예 6: mdx 마우스에서의 12주 약리 연구
6.6.1 mdx 마우스에서의 12주 연구
단일 IV 주사 후 mdx 마우스에서 AAV8-RGX-DYS1의 약리를 평가했다.
mdx 수컷 마우스 그룹(그룹당 n=10)에 0(비히클), 3Х1013, 1Х1014, 3Х1014, 또는 5×10 14 GC/kg(최대 실행 가능 용량)으로 AAV8-RGX-DYS1의 단일 IV 주사를 투여했다. 추가 그룹의 야생형 마우스(C57BL/10ScSn)를 대조군으로서 포함하였다. 하기 매개변수 및 엔드포인트가 포함되었다: 사망률, 임상 관찰, 체중, 생체내 근육 기능(그립 강도, 자동화 보행 분석), 바이오마커(T2-MRI 영상화 및 혈청으로부터의 CK), AAV8-RGX-DYS1 생체분포(벡터 DNA), RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현(단백질), 육안 검사, 조직 중량 및 정자생성을 포함하는 조직병리. 생체내 엔드포인트(그립 강도, 운동 보행 분석 및 T2-MRI 영상화)을 제6주 및 제12주에 수행했다. 추가 시점(제9주)을 추가하여 그립 강도 측정을 수행하였다. CK 분석을 위한 혈청은 생체내 엔드포인트를 검사한 후 제7주 및 최종 부검 시 수집하였다. AAV8-RGX-DYS1 투여 12주 후, 동물을 희생시키고 최종 부검을 수행하였다.
AAV8-RGX-DYS1은 5Х1014 GC/kg 용량까지 우수한 내약성을 보였고, AAV8-RGX-DYS1 관련 사망률은 없었다. 비히클 대조군의 수컷 1마리, 3Х1013 GC/kg을 투여한 수컷 2마리 및 1Х1014 GC/kg AAV8-RGX-DYS1을 투여한 수컷 1마리로 구성된 수두증으로 인한 4건의 조기 사망이 있었다. 그러나 수두증이 mdx 마우스 표현형과 관련되므로(Xu 등, 2015) 이 발견은 시험 항목과 관련된 것으로 간주되지 않았다. 연구 기간 동안 AAV8-RGX-DYS1 관련 임상 관찰은 없었다.
미세 운동 운동학적 보행 분석(생체내 기능적 시험)
미세 운동 운동학적 분석을 AAV8-RGX-DYS1의 기능적 효과를 실증하기 위해 사용하였다. 간략하게, 마우스의 움직임을 고속 카메라(300 프레임/초)를 사용하여 아래, 오른쪽, 및 왼쪽의 3개의 상이한 뷰로부터 포착하였다. 그런 다음 걷기 모드를 사용하는 고정밀 운동학적 분석 방법(MotoRater, TSE Systems, Homburg, Germany)을 사용하여 미세 운동 기술 및 보행 특성을 평가했다. 미세 운동 운동학적 분석을 사용하여 비히클 대조군 mdx 마우스가 관찰될 때, 표현형은 야생형 마우스와 비교하여 증가된 엉덩이, 무릎 및 발목 신장뿐만 아니라 증가된 전반적 엉덩이 높이 및 감소된 앞다리 발가락 제거로 관찰되는 하체 자세와 관련된다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 비히클 대조군 mdx 마우스에서 운동학적 매개변수를 하나의 단일 점수로 조합한 전반적 보행 점수는 제6주에 야생형 마우스보다 유의하게 더 높았으며(야생형에서 0.77 대 비히클 대조군 mdx에서 3.84), 제12주에 비히클 대조군 mdx 마우스와 야생형 마우스 사이에 더 명확한 차이가 주지되었다(야생형에서 -0.77 대 비히클 대조군 mdx에서 4.25). 제6주(11-12주령)에, AAV8-RGX-DYS1의 효과는 1×1014 GC/kg 및 3×1014 GC/kg의 용량에서 두드러졌다; 5×1014 GC/kg의 AAV8-RGX-DYS1 용량에서 전반적 보행 점수는 야생형에서와 유사했다. 제12주(17-18주령)에, AAV8-RGX-DYS1 용량 ≥ 1 x 1014 GC/kg에서의 전반적 보행 점수는 유의하게 개선되었으며 야생형 수준에 대해 정규화되었다(야생형에서 -0.77 대 각각 1Х1014, 3Х1014, 5Х1014 GC/kg에서 0.76, 0.57 및 0.30).
T2-자기 공명 영상화(바이오마커)
DMD 환자의 경우 근육 MRI는 근육 손상 및 염증을 평가하는 강력한 도구로서 떠오르고 있다(Forbes 등, 2020). 이 연구에서는 비복근 병변(고강도) 및 비병변(정상적으로 나타나는 근육)의 비복근 부피, 고강도 병변%, 및 T2-이완 시간을 평가하기 위해 투약 6주 및 12주 후 T2 매핑 MRI를 수행했다(도 16a-16e). 비복근 부피(두 다리를 조합)는 보상성 비대로 인해 제6주 및 제12주에서 둘 모두 야생형 마우스와 비교하여 비히클 대조군 mdx 마우스에서 유의하게 증가했다. 제6주에 AAV8-RGX-DYS1 투여는 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교하여 3x1014 및 5x1014 GC/kg의 용량에서 비복근 부피를 감소시켰다. 제12주에, 비복근 부피에서 AAV8-RGX-DYS1의 용량-반응 생체활성은 3×1014 및 5×1014 GC/kg의 용량으로 AAV8-RGX-DYS1이 투여된 mdx 마우스에서 명확하게 관찰되었다.
근육 부종의 지표인 고강도 병변을 양쪽 다리의 자동화 역치 분석에 기반하여 정량하였다. 제6주 및 제12주에 야생형 대조군과 비교될 때 비히클 대조군 mdx에서 증가된 고강도 병변(병변%로 나타냄)이 명확하게 관찰되었다. 제6주에 감소된 병변이 이미 3Х1013 GC/kg의 AAV8-RGX-DYS1 용량에서 명백했고 1×1014, 3×1014, 및 5×1014 GC/kg의 용량에서 유의하게 개선되었다. 제12주에 1×1014, 3×1014, 및 5×1014 GC/kg의 용량으로 AAV8-RGX-DYS1이 투여된 mdx 마우스에서 명확한 차이가 주지되었으며 야생형과 필적했다.
T2 시간은 일반적으로 물 환경 변화와 관련된 병리적 과정, 예컨대 부종, 염증 및 어느 정도의 섬유증 형성에서 증가된다(Hogrel 등, 2016; Wokke 등, 2016). 따라서, T2-이완 시간을 고강도 병변 및 정상으로 나타나는 비복근(비병변) 둘 모두에 대해 평가하였다(도 16d 및 e). 야생형 동물의 이미지에서는 병변이 관찰되지 않았으나, 도 16a에서 보고된 작은 백분율은 배경 수준으로 간주되어야 한다. 야생형과 비교될 때 두 시점(제6주 및 제12주)에서 모두 비히클 대조군 mdx 마우스에서 증가된 T2-이완 시간이 관찰되었다. AAV8-RGX-DYS1 투여는 1×1014, 3×1014, 및 5×1014 GC/kg의 용량에서 mdx 마우스의 T2-이완 시간을 유의하게 감소시켰고, 이들 시간은 제6주 및 제12주에 야생형과 필적했다. 따라서, AAV8-RGX-DYS1-투여 마우스에서, T2-이완 시간은 제12주까지 >1×1014 GC/kg 용량에서 야생형 동물과 필적했다.
AAV8-RGX-DYS1-투여 마우스에서, T2-이완 시간은 제12주까지 >1×1014 GC/kg의 용량에서 야생형 동물과 필적했다.
그립 강도(생체내 기능적 시험)
제6주 및 제9주의 그립 강도 측정은 mdx 마우스와 야생형 마우스 사이의 차이를 명확하게 드러내지 않았다(도 17). 제12주에, 비히클 대조군 mdx와 야생형 마우스 사이의 그립 강도에 있어 최소 차이가 통계적 유의성을 갖지 않고 주지되었다. 3×1014 및 5×1014 GC/kg의 용량으로 AAV8-RGX-DYS1이 투여된 mdx 마우스의 그립 강도는 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교될 때 유의하게 증가되었다. 이러한 일관되지 않은 관찰은 설치류의 그립 강도 시험이 운동 기능 이외의 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있다는 사실에 기인할 수 있다(Maurissen 등, 2003; Nagaraju 등, 2008).
크레아틴 키나제
예상된 바와 같이, 평균 CK 수준은 제7주 및 제12주에 각각 야생형 대조군과 비교하여 비히클 대조군 mdx 마우스에서 21배 및 30배 더 컸다. AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서, CK 수준은 >1×1014 GC/kg 용량에서 감소되어, >3×1014 GC/kg 용량에서 유의성에 도달했다(도 18).
RGX-DYS1 생체분포(벡터 DNA)
DNA 벡터 생체분포를 qPCR 방법을 사용하여 평가하였다. AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스로부터의 비복근, 횡격막, 심장 및 간 조직은 연구 종료 시(제12주) 높은 수준의 벡터 DNA를 가졌다. 모든 AAV8-RGX-DYS1 처리 마우스의 검사된 조직에서 벡터 DNA 수준의 용량 비례 증가 경향이 관찰되었지만, 유의성에 도달하지 못했다(도 19). 간은 모든 AAV8-RGX-DYS1 투여 마우스의 근육 조직과 비교하여 더 높은 벡터 DNA 수준을 가졌다. 야생형 BL10 마우스 및 mdx 비히클 대조군 마우스로부터 수집된 조직은 정량 한계 미만(BQL) = 50 카피/μg DNA) 또는 검출 한계(LOD) = 11.96 카피/μg DNA)의 벡터 DNA 수준을 나타내었다.
RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현(단백질)
mdx 마우스에서 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현을 검사하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했다.
제12주에 1×1014, 3×1014, 및 5×1014 GC/kg의 용량으로 AAV8-RGX-DYS1이 투여된 mdx 마우스는 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교될 때 모든 3개 근육(비복근, 횡경막 및 심장)에서 유의하게 더 높은 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현을 나타냈다(p< 0.05 - 0.001). 가장 낮은 AAV8-RGX-DYS1 용량(3×1013 GC/kg)에서, RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 수준은 비히클 대조군 mdx 마우스보다 높았지만 유의하지는 않았다.
모든 AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서, 심장 조직의 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀의 발현은 비복근 및 횡격막과 비교될 때 더 높았던 반면, 비복근 및 횡격막에서의 발현은 일반적으로 필적했다(도 20a 및 20b). 야생형 마우스에서의 디스트로핀 단백질 발현과 비교하여, 3×1014 및 5×1014 GC/kg으로 AAV8-RGX-DYS1을 수여받은 mdx 마우스는 비복근, 횡격막, 및 심장에서 유의하게 더 높은 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현을 나타내었다.
전반적으로, AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스로부터의 근육에서 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질의 존재는 벡터 DNA 수준의 검출과 일치했다. 모든 근육에 걸친 RGX-DYS1 벡터 DNA 수준이 각 용량 그룹에서 필적하였다는 사실에도 불구하고, 심장 조직의 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀은 비복근 및 횡경막과 비교될 때 일반적으로 더 높았으며, 비복근 및 횡경막에서의 발현은 일반적으로 필적했다.
연구에서, mdx 마우스에 대한 AAV8-RGX-DYS1의 IV 투여 후 최소 유효 용량은 미세 운동 운동학적 보행 분석에 의해 측정된 바와 같은 근육 기능의 유의한 개선 및 MRI에 의해 측정된 바와 같은 근육 보존의 개선에 기반하여 현재 1×1014 GC/kg인 것으로 간주된다.
6.7 실시예 7: mdx 마우스에서의 26주 약리 연구
단일 IV 주사 후 mdx 마우스에서 RGX-DYS1의 장기 생체활성을 평가하였다.
수컷 mdx 마우스 그룹(그룹당 n=10)에 0(비히클), 3×1013, 1×1014, 3×1014, 또는 5×1014 GC/kg으로 RGX-DYS1의 단일 IV 주사를 투여했다. 추가 그룹의 야생형 마우스(C57BL/10ScSn)를 대조군으로서 포함하였다. 동물을 투약 26주 후 안락사시켰다. 하기 매개변수 및 엔드포인트를 포함하였다: 사망률, 임상 관찰, 주간 체중, 생체내 근육 기능(제6주, 제9주, 제17주 및 제26주의 그립 강도; 제9주, 제17주 및 제26주의 자동화 보행 분석), 바이오마커(제6주, 제17주, 제26주의 T2-MRI 영상화, 및 제17주 및 제26주의 혈청으로부터의 CK), 생체분포(벡터 DNA), 이식유전자 발현(단백질), 육안 검사, 조직 중량, 그리고 정자생성 및 근육 병리를 포함하는 조직병리.
단일 IV 주사 후 mdx 마우스에서 RGX-DYS1의 장기 유효성 및 관련 DMD 모델에서 RGX-DYS1의 장기 독성을 또한 연구하였다.
mdx 수컷 마우스 그룹(시점당 그룹당 n=10)에 0(비히클), 3×1013, 1×1014, 3×1014, 또는 5×1014 GC/kg으로 RGX-DYS1의 단일 IV 주사를 투여했다. 야생형 마우스(C57BL/10ScSn)의 추가 그룹을 대조군으로서 포함하였다. 투약 26주 후 동물을 희생시켰다. 하기 매개변수 및 엔드포인트를 포함하였다: 사망률, 임상 관찰, 그립 강도, 보행 분석, MRI, 크레아틴 키나제(CK) 분석, 주간 체중, 육안 검사, 조직 중량 및 정자생성을 포함하는 조직병리.
도 21은 연구에서 나타난 체중의 결과를 나타낸다. 더 낮은 평균 체중이 ≥3×1014 GC/kg으로 투약된 mdx 마우스에서 관찰되었다. 야생형 마우스와 비히클 대조군 mdx 마우스 사이에는 통계적 차이가 있으며 최대 13주 동안 mdx 마우스에서 더 높은 체중이 관찰되었다. 수두증에 의해 유발된 유전자 치료법 RGX-DYS1을 통해 전달된 인간 마이크로디스트로핀 단백질이 투약된 각 마우스 그룹에서 26주 희생 전 사망이 관찰되었다.
제17주에 근육 병변의 발생률을 평가하기 위한 근육의 대표적 이미지를 T2-자기 공명 영상화를 사용하여 촬영했다(도 22). 병변을 비히클 처리, 3x1013 GC/Kg 및 1x1014 GC/kg을 수여받은 마우스에서 화살표로 나타낸다. 3x1014 또는 5x1014 GC/kg의 RGX-DYS1 용량을 수여받은 마우스에서는 병변이 없거나 적어도 병변이 크게 감소했다. 제26주에 T2-자기 공명 영상화를 사용하여 근육의 대표적 이미지를 다시 촬영했다(도 23). 병변을 비히클 처리, 3x1013 GC/Kg 및 1x1014 GC/kg을 수여받은 마우스에서 화살표로 나타낸다. 3x1014 또는 5x1014 GC/kg의 AAV8-RGX-DYS1 용량을 수여받은 마우스에서는 병변이 없거나 적어도 병변이 크게 감소했다.
도 24a 및 24b는 또한 비복근 부피(a) 및 관찰된 고강도 병변의 변화(병변(%))(b)를 나타내는 제6주, 제17주, 및 제26주의 MRI 결과 분석을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성: **** p < 0.0001, 야생형 비히클 대비(반복 측정(RM) 양방향 분산 분석(ANOVA), 시닥 사후 분석); * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, mdx 비히클 대비(혼합 효과 모델 ANOVA, 던넷 사후 분석). 비히클 대조군 마우스와 비교하여, RGX-DYS1을 사용한 처리는 모든 시점에서 근육 부피 및 병변의 감소를 초래했다. RGX-DYS1의 고용량이 저용량보다 더 우수하게 작용했다.
도 25a 및 25b는 제6주, 제17주 및 제26주의 T2 시간-병변(%)(a) 및 T2 시간-비병변(%)(b)을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성: ** p < 0.01, **** p < 0.0001, 야생형 비히클 대비(반복 측정(RM) 양방향 분산 분석(ANOVA), 시닥 사후 분석); * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, 대 mdx 비히클(혼합 효과 모델 ANOVA, 던넷 사후 분석). 일반적으로, RGX-DYS1의 고용량(3x1014 또는 5x1014 GC/kg)이 비히클 대조군 마우스에 비해 더 우수한 결과를 제공했다.
보행 분석을 제6주, 제17주, 제26주에 수행하였다. 도 26에 나타낸 바와 같이, 미세 운동 운동학적 보행 분석의 명확한 차이가 제9주에 비히클 대조군 mdx 마우스와 야생형 대조군 사이에 관찰되었으며 다른 모든 시점에서도 계속되었다. 제9주에, 비히클 대조군과 비교하여 전반적 보행 점수의 용량 관련 개선이 ≥ 3×1013 GC/kg 용량에서 RGX-DYS1 투여 mdx 마우스에서 나타났다; ≥ 3 x 1014 GC/kg 용량에서의 보행 점수는 야생형 마우스에서와 유사했다(도 26). 제17주에는 ≥ 3×1014 GC/kg의 용량에서 보행 점수가 개선되었다. 제26주에 보행 점수의 개선은 1×1014 GC/kg에서 관찰되었고 ≥3×1014 GC/kg에서 더욱 명백하였다.
DMD 환자의 경우 CK는 진단적 가치를 갖는, 정상 범위와 비교하여 현저히 상승된다. 또한 최대 혈청 CK 활성은 일반적으로 DMD에서 2 내지 5세에 관찰되며 질환이 진행됨에 따라 점진적으로 감소한다(Kim 등, Ann. Rehabil. Med. 41:306-312 (2017)). 도 27은 AAV8-RGX-DYS1로 처리한 경우, CK 농도가 비히클 처리 대조군과 비교하여 유의하게 감소되었음을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계적 유의성: **** p < 0.0001, 야생형 비히클 대비(반복 측정(RM) 양방향 분산 분석(ANOVA), 시닥 사후 분석); *** p < 0.001, **** p < 0.0001, mdx 비히클 대비(혼합 효과 모델 ANOVA, 던넷 사후 분석). 고용량(3x1014 또는 5x1014 GC/kg) 처리 마우스에서, CK 농도는 야생형 대조군 마우스에서와 유사했다.
도 28은 제9주, 제17주 및 제26주의 상이한 마우스 그룹의 그립 강도를 나타낸다. 비히클 대조군 mdx의 그립 강도는 야생형과 비교될 때 차이를 드러내지 않았다.
이영양증 병리에 대한 RGX-DYS1 효과를 평가하기 위해 연구 종료(32-33주령) 시 근육 조직(횡경막, 심장 및 비복근)을 수집하여 분석했다. 세포외 기질의 섬유증(콜라겐 축적)은 DMD의 특징이다(Kharraz 등, 2014). 특히, mdx 마우스의 횡격막은 심각한 영향을 받고 진행성 근육 섬유 변성 및 그에 수반되는 결합 조직 침윤을 갖는 DMD 병리와 더 가까이 유사하다(Lynch 등, 1997; Swiderski and Lynch, 2021). 예상된 바와 같이, 비히클 대조군 mdx 마우스는 Masson 삼색 염색에 의해 측정된 바와 같이, 야생형 대조군과 비교될 때 횡격막에서 증가된 양의 섬유증을 나타냈다(도 29a). 주목할 점은 축적된 섬유증이 비히클 대조군 mdx 마우스의 비복근 및 심장에서 관찰되었지만 이전에 보고된 바와 같이(Coley 등, 2016; Shin 등, 2011) 횡경막과 비교하여 상대적으로 매우 낮았다(횡경막에서의 16.8%와 비교하여 골격근 및 심장근에서는 3% 미만). mdx 마우스에서의 RGX-DYS1 투여는 검사한 모든 근육 조직에서 섬유증 양의 감소를 야기했다(p>0.05). 또한, 횡경막의 섬유증 양이 ≥ 1×1014 GC/kg의 용량에서 유의하게 감소되었다(p< 0.05).
야생형 대조군과 비교될 때 비히클 대조군 mdx 마우스의 횡경막(도 29b 및 e) 및 비복근(도 29f)에서 증가된 염증이 두드러졌다. 비히클 mdx 마우스를 포함한 모든 동물의 심장에서는 염증이 명백하지 않았다(도 29d). AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서, 대조군 비히클 mdx 마우스와 비교될 때 ≥ 1 x 1014 GC/kg에서 횡격막 및 비복근의 염증성 세포 수가 유의하게 감소했다.
또한, 이영양증 병리(재생, 변성, 섬유증 및 중앙화된 핵)를 정성 평가(수동 채점)에 의해 3개의 근육 조직에서 평가했다. 하기 수동 채점 척도를 사용하였다: 0(정상), 1(최소), 2(경도), 3(현저함), 및 4(중증).
예상된 바와 같이, 횡경막 근육의 이영양증 병리는 야생형 대조군(정상)과 비교하여 비히클 대조군 mdx 마우스(현저함 내지 중증)에서 명백했다. AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서, 비히클 대조군 mdx 마우스(현저함 내지 중증)와 비교하여 ≥1 x 1014 GC/kg에서 재생(경도 내지 최소) 및 변성(정상 내지 현저함)의 감소가 관찰되었다. 섬유증(최소 내지 현저함) 및 중앙화된 핵(경도 내지 현저함)에 대한 중증도 점수는 비히클 대조군 mdx 마우스(현저함 내지 중증)와 비교될 때 ≥3 x 1014 GC/kg에서 감소되었다.
심장에서는 야생형 대조군과 비교하여 비히클 대조군 mdx 마우스(최소 내지 현저함)에서 이영양증 병리가 관찰되었다. ≥ 3 x 1013 GC/kg(정상 내지 경도)에서 AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스의 재생 감소가 관찰되었다. 3×1013 GC/kg에서 변성 및 섬유증에 대한 중증도 점수가 감소되었다(최소); 이 효과는 비히클 대조군 mdx 마우스(최소 내지 현저함)와 비교될 때 1×1014 및 3×1014 GC/kg(정상)에서 더 분명했다. 비히클 대조군 mdx 마우스(경도 내지 현저함)와 비교될 때 중앙화된 핵의 중증도 점수는 1×1014 및 3×1014 GC/kg(최소)에서 AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서도 감소되었다. 5×1014 GC/kg에서 AAV8-RGX-DYS1 mdx 마우스의 변성 및 중앙화된 핵에 대한 중증도 점수는 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교하여 유의하게 감소되지 않았다(최소 내지 현저함).
비복근의 이영양증 특징이 야생형 대조군과 비교하여 비히클 대조군 mdx 마우스(최소 내지 중증)에서 나타났다. 5×1014 GC/kg(현저함)에서의 한 마리의 마우스를 제외하고, 비히클 대조군 mdx 마우스(최소 내지 현저함)와 비교하여 ≥ 3×1013 GC/kg(정상 내지 경도)에서 AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스의 재생 및 중앙화된 핵이 완화되었다. 변성의 감소는 3×1013 GC/kg(최소 내지 경도)에서 관찰되었으며, AAV8-RGX-DYS1 효과는 ≥ 1×1014 GC/kg(정상 내지 경도)에서 더욱 두드러졌다; 이들 그룹(≥ 1 x 1014 GC/kg)의 4마리 mdx 마우스 중 3마리는 변성이 없었다. 섬유증의 중증도 점수의 감소가 ≥ 3×1013 GC/kg(최소)에서 관찰되었으며 ≥ 3×1014 GC/kg(정상 내지 경도)에서 더욱 분명했다; 4마리 mdx 마우스 중 3마리는 3×1014 및 5×1014 GC/kg에서 섬유증을 갖지 않았다.
연구 종료 시(AAV8-RGX-DYS1 투여 26주 후), qPCR 방법을 사용하여 벡터 생체분포(도 30) 및 전통적 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질(도 31) 분석을 위해 근육 조직을 수집하였다. 연구 종료 시 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스로부터의 비복근, 횡격막 및 심장 조직에서 벡터 DNA 수준은 검출 가능한 채 유지되었다. 모든 AAV8-RGX-DYS1 투여 마우스의 검사된 조직에서 벡터 DNA 수준의 용량 비례적 증가 경향이 관찰되었다(도 30). 간은 모든 AAV8-RGX-DYS1 투여 마우스에서 근육 조직과 비교하여 더 높은 벡터 DNA 수준을 가졌다.
12주 약리 mdx 마우스 연구와 유사하게, 야생형 마우스로부터의 횡격막, 비복근 및 심장근에서 마우스 전장 디스트로핀 단백질 수준을 검출하였다. mdx 비히클 대조군 마우스는 세 근육 모두에서 어떠한 명백한 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 및 디스트로핀 단백질 밴드도 나타내지 않았지만, mdx 비히클 대조군 마우스로부터는 미량의 디스트로핀%가 보고되었으며, 이는 밀도측정 분석에 의해 포착된 배경 면역블롯 신호의 결과일 수 있다.
투여 26주 후, AAV8-RGX-DYS1을 ≥ 1×1014 GC/kg으로 투여한 mdx 마우스에서 측정된 모든 근육은 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교될 때 지속되고 상당히 더 높은 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 발현을 나타냈다; 그러나 횡격막에서의 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현의 증가는 1×1014 GC/kg에서 통계적 유의성에 도달하지 못했다(도 31). 3×1013 GC/kg에서, 3개 근육 모두에서 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 발현은 비히클 대조군 mdx 마우스보다 높았지만, 그 증가는 통계적 유의성에 도달하지 못했다. AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스로부터의 각 근육에서 지속적인 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 발현은 벡터 DNA와 함께 용량 의존적 방식의 경향을 보였다. 각 용량 그룹의 근육에 걸쳐 벡터 DNA 수준이 유사함에도 불구하고, 비복근 및 횡경막 근육과 비교될 때 심장근의 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 발현이 더 높았다.
근섬유에서 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 발현을 추가로 평가하기 위해, 횡격막에서 항-디스트로핀/마이크로디스트로핀과 항-메로신(근육 섬유의 마커)의 공동 면역형광을 수행했다(도 32a). 투여 26주 후, 비히클 대조군 mdx 마우스는 야생형 대조군과 비교하여 극소수의 체세포 복귀 근섬유(1% 미만)를 제외하고는 횡격막에 디스트로핀 양성 섬유를 갖지 않았다(즉, 근육속막에서 디스트로핀 발현 없음).
AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서, AAV8-RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 양성 근섬유의 유의한 증가(p<0.001)가 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교하여 1x1014 GC/kg(57%)에서 mdx 마우스에서 관찰되었다. 더욱이, 최고 용량의 AAV8-RGX-DYS1은 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 양성 근섬유 집단의 거의 완전한 형질도입을 달성했다(각각 3×1014 및 5×1014 GC/kg에서 95.6% 및 98.0%). 또한, 메로신에 대한 공동면역형광은 디스트로핀/마이크로디스트로핀 발현이 근육속막에 제한됨을 드러내었다.
상보적 엔드포인트으로서, 디스트로핀/마이크로디스트로핀의 세기를 횡격막 조직에서 측정했다(도 32c). 디스트로핀/마이크로디스트로핀 염색 세기는 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스에서 용량 의존적 방식으로 유의하게 증가되었다. 이 데이터는웨스턴 블롯 결과와 일치하게, RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 수준이 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스에서도 용량 의존적으로 증가됨을 표시하였다(도 31). 전반적으로, 마이크로디스트로핀 양성 섬유 수 및 마이크로디스트로핀 염색 세기의 명백한 증가는 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교하여 ≥1 x 1014 GC/kg에서 AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서 분명하다.
mdx 마우스에서 수행된 이 장기 연구는 6주 및 12주 약리 연구에서 관찰된 근육 기능 및 이영양증 병리에 대한 RGX-DYS1 효과가 투약 후 26주 지속됨을 실증했다. 이러한 결과와 일치하게, AAV8-RGX-DYS1의 단일 투여 후 벡터 DNA 및 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 수준이 보존되었다.
요약하면, 26주 연구 결과는 수두증으로 인한 7건의 mdx조기 사망 및 호흡 문제로 인한 1건의 mdx 조기 사망을 나타낸다(각각 3x1013, 1×1014, 3×1014 및 5×1014 GC/kg AAV8-RGX-DYS1에서 2, 1, 3, 2마리 mdx 마우스). ≥3×1014 GC/kg에서 더 낮은 체중이 관찰되었다. ≥ 1×1014 GC/kg에서 유의한 개선이 나타났다(고강도, 병변의 T2 시간). 보행 분석은 제26주에 ≥ 1×1014 GC/kg에서 개선, 및 ≥ 3×1014 GC/kg에서 유의한 개선을 나타내었다. CK 분석은 3×1013에서 감소 및 ≥ 3×1014 GC/kg에서 유의한 감소를 나타내었다. 그립 강도에서는 야생형 대조군과 비히클 대조군 mdx 간에 명확한 차이가 없었다. 근육 병리는 AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서 섬유증이 ≥ 1 x 1014 GC/kg(횡경막 및 심장)에서 유의하게 감소되고 염증/변성/재생이 1 x 1014 GC/kg부터 감소됨을 나타내었다. 근육 병리 데이터에 기반하여 1×1014 GC/kg이 MED임을 확인하였다.
6.8: 실시예 8: mdx 마우스에서의 6주 약리 연구
이 연구의 목적은 단일 IV 주사 후 mdx 마우스에서 AAV8-RGX-DYS1의 약리를 평가하는 것이었다. mdx 수컷 마우스 그룹(그룹당 n=5)에 0(비히클), 3×1013, 1×1014 또는 3×1014 GC/kg으로 AAV8-RGX-DYS1의 단일 IV 주사를 투여하였다. 야생형 마우스(C57BL/10ScSn)의 추가 그룹에 대조군으로서 단일 IV 주사를 통해 비히클을 수여하였다. 하기 매개변수 및 엔드포인트를 포함하였다: 사망률, 임상 관찰, 체중, TD-NMR(시간 도메인 핵 자기 공명)에 의한 전신 조성(지방, 제지방 및 액체 저류), 시험관내 근육 기능(비력 및 편심성 수축), RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현(단백질) 및 육안 검사. AAV8-RGX-DYS1 투여 6주 후 동물을 희생시켰다.
투여된 최고 용량(3Х1014 GC/kg)까지 AAV8-RGX-DYS1-관련 사망률 또는 임상 징후는 관찰되지 않았다. AAV8-RGX-DYS1 투여 5주 후 2마리 mdx 마우스를 수두증으로 인해 안락사시켰다. 그러나 수두증은 mdx 마우스에서 흔히 나타나고 12주 약리 연구에서 비히클 대조군 mdx 마우스에서도 나타났으므로 이 발견은 시험 항목과 관련된 것으로 간주되지 않았다.
연구 동안 확인된 평균 체중에서는 야생형 마우스와 mdx 마우스 간에 명확한 차이가 없었다. AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스에서 모든 그룹의 평균 체중은 비히클 대조군 mdx 마우스와 상이하지 않았으며 TD-NMR에 의해 측정된 바와 같은 신체 조성의 차이도 검출되지 않았다.
RGX-DYS1이 mdx 마우스에 기능적 이점을 제공하는지 여부를 평가하기 위해, 근육의 최대력 생성 능력(비력) 및 부상에 저항하는 근육의 능력(편심성 수축)을 투약 6주 후 측정했다(도 33a-33b 및 34a-34b). 상보적 엔드포인트으로서 횡경막 및 EDL의 회복 점수를 계산하였다. 회복 점수는 정상 마우스와 mdx 마우스 사이의 상대적 결핍 정도를 표시한다-이는 개입에 의해 회복된 결핍의 백분율을 제공한다. 회복 점수는 0%(중재가 효과가 없을 때) 내지 100%("치료받은" 표본이 "정상" 표본과 동일한 매개변수 값을 표시할 때) 범위이다.
근육 단면적에 대해 정규화된 횡경막 비력은 야생형 대조군과 비교하여 비히클 대조군 mdx 마우스에서 유의하게 더 낮았다(약 -44%). 도 33a에 나타낸 바와 같이, AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스에서 비력의 용량 의존적 개선이 관찰되었다. 비히클 대조군 mdx와 비교하여 ≥ 1 x 1014 GC/kg에서 비력의 유의한 증가(p<0.05)가 관찰되었다. AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스에서 비력의 회복 점수의 용량 의존적 증가가 관찰되었다(표 11에 나타낸 바와 같이, 각각 3×1013, 1×1014 및 3×1014 GC/kg에서 26%, 70% 및 82%).
이영양증 근육은 편심성 수축에 의해 유도된 손상에 더 민감하고 반복적인 스트레스 후 힘 생성의 손실을 나타낸다(Petrof 등, 1993). 예상된 바와 같이, 비히클 대조군 mdx 마우스는 야생형 대조군과 비교하여 5회 연속 편심성 수축 후 훨씬 더 큰 힘 손실을 가졌다(비히클 대조군 mdx의 15% 손실 대 야생형의 단지 2% 손실). AAV8-RGX-DYS1 투여는 대조군 비히클 mdx 마우스와 비교될 때 1x1014 및 3x1014 GC/kg의 용량에서 수축 유도 손상에 대한 횡경막 근육의 상당한 보호를 초래했다(각각 6.2% 및 3.9% 손실). 1x1014 및 3x1014 GC/kg에서 AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서의 편심성 수축력의 회복 점수는 각각 59% 및 82%였다(도 33b).
도 34a에 나타낸 바와 같이, EDL의 비력은 또한 야생형 대조군(약 17%)과 비교하여 비히클 대조군 mdx 마우스에서 유의하게 감소되었다(p<0.05). AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서, 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교될 때 EDL의 비력의 증가(p>0.05)가 1x1014 GC/kg에서 검출되었으며, 3x1014 GC/kg에서 더 분명했다. 1x1014 및 3x1014 GC/kg에서 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스의 비력의 회복 점수는 각각 47% 및 137%였다(표 12).
더욱이, 비히클 대조군 mdx 마우스는 야생형 대조군과 비교하여 유의하게 더 많은 힘 손실을 가졌다(도 34b: 비히클 대조군 mdx의 30% 손실 대 야생형의 11.7% 손실). AAV8-RGX-DYS1 투여는 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교될 때 1x1014 및 3x1014 GC/kg의 용량에서 수축 유도 손상으로부터 EDL 근육의 보호를 초래했다(각각 17.4% 및 6.8% 손실). 또한, 편심성 수축의 회복 점수는 모든 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스에서 용량 의존적 증가를 나타냈다(각각 3x1013, 1x1014 및 3x1014 GC/kg에서 42%, 91% 및 169%).
연구 종료 시, 근육 병리 평가를 위해 횡격막과 TA 근육을 수집했다. H&E 염색 이미지로부터 염증성 세포수를 측정하였다.
비히클 대조군 mdx 마우스에서, 야생형 대조군과 비교하여 횡격막 및 TA에서 염증성 세포수가 유의하게 증가되었다(p<0.05)(도 35a 및 35b). AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서는 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교될 때 ≥ 3x1013 GC/kg으로 횡경막에서 및 ≥ 1x1014 GC/kg으로 TA에서 염증성 세포수가 유의하게 감소했다(p<0.05)(횡경막에서 -22%에서 -34%로, TA에서 -17.5%에서 -22%로).
횡격막 및 TA의 염증성 세포 검사와 함께 변성, 재생, 섬유증 및 중앙화된 핵에 대한 정성 평가(수동 채점)를 수행했다: 하기 수동 채점 척도를 사용하였다: 0(정상), 1(최소), 2(경도), 3(현저함), 및 4(중증).
횡경막 근육의 이영양증 병리-재생, 변성, 및 섬유증이 야생형 대조군(정상 내지 경도)과 비교하여 비히클 대조군 mdx 마우스(최소 내지 중증)에서 관찰되었다. 또한, 변성을 제외한 이영양증 특징이 야생형 대조군(정상 내지 경도)과 비교하여 비히클 대조군 mdx 마우스(경도 내지 현저함)의 TA 근육에서 관찰되었다. 주목할 점은 TA의 변성이 비히클 대조군 mdx 마우스를 포함한 어떤 동물에서도 관찰되지 않았다는 것이다.
AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서, 재생에 대한 중증도 점수는 비히클 대조군 mdx 마우스(경도 내지 중증)와 비교하여 ≥ 1 x 1014 GC/kg(정상 내지 경도)에서 횡격막 및 TA에서 감소되었다. 변성은 1x1014 GC/kg(최소 내지 경도)에서 횡격막에서 완화되었다. 비히클 대조군 mdx 마우스(경도 내지 중증)와 비교하여 ≥ 3x1013(최소 내지 현저함) 및 ≥1x1014 GC/kg(최소 내지 경도)에서 횡격막 및 TA에서 섬유증에 대한 중증도 점수의 감소가 관찰되었다. 비히클 대조군 mdx 마우스에서 횡격막(최소 내지 경도) 및 TA(경도)의 중앙화된 핵이 관찰되었다; 3x1014 GC/kg에서 횡격막에서는 변화가 관찰되지 않았다; 이 용량에서 TA의 중증도 점수는 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교하여 약간 감소되었다(최소 내지 경도).
AAV8-RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 수준을 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀을 인식하지만, 전장 마우스 디스트로핀은 인식하지 않는(아미노산 321 내지 494(엑손 8-14)에 해당하는 인간 디스트로핀에 대해 유도됨) 모노클로날 항체 NCL-DYSB(Leica Biosystems의 클론 34C5)를 사용하여 모세관 기반 서부 면역검정(실시예 12 참고)을 사용하여 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스에서 측정하였다. 검정을 실시예 12에 기재된 바와 같이 수행하였다. 제6주에 모든 야생형 및 비히클 대조군 mdx 마우스는 횡경막, 비복근 및 심장근에서 정량 가능한 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 발현을 나타내지 않았다. 모든 AAV8-RGX-DYS1 투여 mdx 마우스는 세 근육 모두에서 용량 의존적인 정량 가능한 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 수준을 나타내었다. 모든 용량 수준에서 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질은 횡경막 및 비복근보다 심장근에서 더 높은 수준으로 검출되었다. 1x1014 GC/kg에서, RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 발현은 3×1013 GC/kg보다 7.3배(횡격막), 7.4배(비복근), 1.8배(심근) 더 높았다. 3x1014 GC/kg에서, RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 발현은 1x1014 GC/kg보다 2.4배(횡경막), 1.5배(비복근) 및 1.9배(심장근) 더 높았다(도 36).
근섬유에서 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현을 추가로 확인하기 위해 횡경막 및 TA에서 공동 면역형광(메로신/디스트로핀)을 수행했다(데이터는 나타내지 않음). 비히클 대조군 mdx 마우스는 횡경막 및 TA에서 디스트로핀 양성 섬유를 갖지 않았다(즉, 근육속막에서 디스트로핀 발현이 없음). 대조적으로, ≥ 1 x 1014 GC/kg에서 AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서는 TA 및 횡경막 근육의 근육속막에 정확히 편재된 증가된 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현이 관찰되었다.
요약하면, mdx 마우스에서 AAV8-RGX-DYS1의 단일 용량은 ≥ 1 x 1014 GC/kg에서 근육 기능(비력 및 편심성 수축)의 현저한 개선 및 이영양증 근육 병리의 감소를 제공했다. 또한, AAV8-RGX-DYS1이 투여된 mdx 마우스에서 마이크로디스트로핀 단백질 발현의 용량 의존적 증가가 관찰되었다. 따라서 이 연구에서 생성된 데이터에 기반하여 최소 유효 용량(MED)은 1x1014 GC/kg으로 간주되었다.
6.9 약리 연구의 요약 및 결론
일련의 생체내 약리 연구를 DMD에 대한 생물학적 관련 모델인 mdx 마우스를 사용하여 수행하였다. 이 DMD 쥣과 모델(mdx)은 인간이 DMD로 경험하는 많은 임상적 및 병리적 징후를 나타낸다(Rodrigues 등, 2016).
AAV8-RGX-DYS1이 mdx 마우스에 정맥내 투여되었을 때, 투약 6주 후 근육 기능의 개선(2x1014 GC/kg에서 그립 강도 및 시험관내 힘 측정; ≥ 1x1014 GC/kg에서 보행 분석)이 분명했다. 더욱이, 자동화 보행 분석에 의해 실증된 바와 같이, 근육 기능에 대한 RGX-DYS1의 효과는 ≥1x1014 GC/kg 용량에서 투약 12주 후 더욱 두드러졌다. T2-MRI를 사용한 이영양증 병변의 평가는 ≥1x1014 GC/kg의 용량에서 개선을 나타내었으며 이러한 용량에서 야생형 수준과 필적했다.
AAV8-RGX-DYS1 투여는 2Х1014 GC/kg의 용량으로 mdx 마우스에서 이영양증 병리(염증, 변성 및 재생)를 유의하게 감소시켰으며 용량-관계를 추가 특성규명하기 위해 6주 또는 26주 후에 추가로 평가될 것이다. 근육 기능, 바이오마커 및 병리에 대한 이러한 RGX-DYS1 효과는 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 및 벡터 DNA의 증가된 수준과 관련되었다. AAV8-RGX-DYS1-투여 mdx 마우스에서, 골격근에서 높은 수준의 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 및 RGX-DYS1 벡터 DNA는 투약 6주 후에 2x1014 GC/kg의 용량에서 이미 관찰되었다. 또한, 투약 12주 후 골격근 및 심장근에서 고도로 지속되는 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 및 벡터 DNA 수준이 관찰되었다.
AAV8-RGX-DYS1 투여 후 면역형광에 의한 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀의 추가 검사는 야생형과 유사한 TA 및 횡경막 근육의 근육속막에서 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀의 강력하고 정확한 편재를 확인하였다. 근섬유 회전율을 안정화하고 이영양증 근육의 병리를 약화시키기 위해서는 균일한 디스트로핀 발현이 필요하다(van Westering 등, 2020). RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현 외에도 다른 디스트로핀 관련 단백질도 복원되고 TA 및 횡경막 근육의 근육속막에서 정확히 발현되어 근육에서 개선된 구조적 온전성을 제시하였다.
요약하면, DMD 질환의 관련 동물 모델에서 AAV8-RGX-DYS1의 단일 용량은 근육 기능, 근육 손상과 관련된 바이오마커, 이영양증 근육 병리 및 다른 디스트로핀 관련 단백질에 놀라운 이점을 제공했다. AAV8-RGX-DYS1 용량 ≥ 1x1014 GC/kg에서 12주 연구에서 미세 운동 운동학적 보행 분석에 의해 측정된 바와 같은 근육 기능의 유의한 개선 및 MRI에 의해 측정된 바와 같은 근육 보존의 개선이 있었다. 6주 POC 연구에서 2x1014 GC/kg의 AAV8-RGX-DYS1 용량에서 근육 기능의 유의한 개선에 더하여 이영양증 병리 및 DAPC 단백질 발현의 유의한 개선이 있었다. 더욱이, 높은 수준의 벡터 DNA 및 증가된 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 단백질 발현이 ≥1x1014 GC/kg 용량에서 골격근 및 심장근에서 관찰되었다. 따라서, DMD 질환의 쥣과 모델인 mdx 마우스에 대한 AAV8-RGX-DYS1의 IV 투여 후 최소 유효 용량은 현재 1x1014 GC/kg인 것으로 간주된다.
6.10 실시예 9: 마우스에서의 독성학 연구
AAV8-RGX-DYS1의 독성을 mdx 마우스에서 12주 및 26주 약리 연구(비-GLP) 둘 모두에서 평가하였다.
6.10.1 12주 mdx 마우스 독성학 연구
약리 연구를 위한 mdx 마우스에서의 12주 연구에서 위에서 기재된 바와 같이, 동일한 연구 프로토콜을 독성 연구를 위해 사용했다(본원의 실시예 4). mdx 수컷 마우스 그룹(그룹당 n=10)에 0(비히클), 3Х1013, 1×1014, 3×1014, 또는 5×1014 GC/kg으로 AAV8-RGX-DYS1의 단일 IV 주사를 투여했다. 야생형 마우스(C57BL/10ScSn)의 추가 그룹을 대조군으로서 포함하였다. AAV8-RGX-DYS1 투여 12주 후 동물을 희생시켰다. 하기 매개변수 및 엔드포인트를 포함하였다: 사망률, 임상 관찰, 체중, 육안 검사, 조직 중량 및 정자생성을 포함하는 조직병리.
모든 용량 그룹에서 연구 시간에 걸쳐 평균 체중이 증가했다. >3 x 1014 GC/kg의 AAV8-RGX-DYS1 용량이 투여된 mdx 마우스의 평균 체중은 제3주부터 비히클 대조군 mdx 마우스와 비교하여 유의하게 감소했다. 이의 체중은 야생형보다 낮았지만, 야생형 마우스와 2개의 고용량(3x1014 및 5×1014 GC/kg)으로 AAV8-RGX-DYS1이 투여된 mdx 마우스 간 최소였고(10% 미만) 통계적 차이를 갖지 않았다.
부검 시 뇌, 뇌하수체, 척수(경부, 흉부, 요추), 부신, 신장, 간, 폐, 하악 및 장간막 림프절, 췌장, 비장, 가슴샘, 전립샘, 정낭샘, 고환 및 부고환을 수집하여 현미경으로 검사했다. 최대 5x1014 GC/kg의 수컷 mdx 마우스에 대한 AAV8-RGX-DYS1의 단일 IV 용량 투여는 수컷 생식 기관을 포함하여 검사된 조직에서 어떠한 육안 병변, 기관 중량 차이 또는 현미경 소견과도 관련되지 않았다.
따라서 AAV8-RGX-DYS1을 mdx 마우스 그룹에 투여했을 때, 유해-효과-비-관찰 수준(NOAEL)은 시험된 최고 용량인 5x1014 GC/kg이었다.
6.10.2. mdx 마우스에서의 26주 독성학 연구
본원에서 실시예 7에 기재된 mdx 마우스 약리 연구에서 26주와 관련하여 독성학 연구를 수행하였다. mdx 수컷 마우스 그룹(시점당 그룹당 n=10)에 0(비히클), 3×1013, 1×1014, 3×1014, 또는 5×1014 GC/kg로 AAV8-RGX-DYS1의 단일 IV 주사를 투여했다. 야생형 마우스(C57BL/10ScSn)의 추가 그룹을 대조군으로서 포함하였다. 투약 26주 후 동물을 희생시켰다. 하기 매개변수 및 엔드포인트를 포함하였다: 사망률, 임상 관찰, 주간 체중, 육안 검사, 조직 중량 및 정자생성을 포함하는 조직병리. 사망률 및 체중에 대한 결과를 도 21에 제시한다.
6.11 실시예 10 - 임상 시험 프로토콜
6.11.1 연구 근거:
뒤시엔느 근이영양증(DMD)은 진행성 근육 약화여 초래하며 일반적으로 젊은 성인기에 사망에 이르는 X-연관 근이영양증의 한 형태이다. DMD는 대략 전세계 출생 남성 3,600 내지 9,300명 중 1명에게 영향을 미친다(Mah 등, 2014). 이 질환은 X 염색체에 위치하며 근육 세포막 상의 DAPC를 통해 골격 및 심장근 섬유에 구조적 안정성을 제공하는 단백질(디스트로핀)을 코딩하는, DMD 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다(Hoffman 등, 1987). DMD 유전자 돌연변이를 갖는 환자에서 기능적 디스트로핀의 부재는 근육 세포의 원형질막 안정성을 감소시킨다. 막 탈안정화는 변경된 기계적 특성 및 비정상적인 신호전달을 초래하며, 이는 막 취약성, 괴사, 염증 및 진행성 근육 소모에 기여한다(Evans 등, 2009).
AAV8-RGX-DYS1은 근육 특이적 프로모터로부터 마이크로디스트로핀을 발현하고 DMD 돌연변이와 관계없이 DMD를 갖는 환자의 근육 변성을 잠재적으로 방지하도록 설계된 인간 마이크로디스트로핀 발현 카세트를 함유하는 재조합 아데노 관련 바이러스 유형 8이다.
6.11.2 용량:
1Х1014 또는 2Х1014 GC/kg 체질량의 AAV8-RGX-DYS1 용량을 단일 IV 용량으로서 투여할 것이다.
6.11.3. 연구 설계:
이는 52주 연구 기간 과정에 걸쳐 DMD를 갖는 적어도 6명의 이동 가능한 남성 참가자에서 AAV8-RGX-DYS1의 2개 용량 수준의 안전성, 내약성, PD(RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현 수준), PK(벡터 농도) 및 예비 임상적 유효성을 평가하기 위한 인간 최초, 다기관, 1/2상, 비대조, 공개-표지, 단회 용량 증량 및 용량 확장 연구이다. 안전성이 주요 초점이 될 것이며, RGX-DYS1 마이크로디스트로핀의 발현 수준에 2차 초점일 것이다. 단일 용량 수준에서 AAV8-RGX-DYS1을 수여받기 위해 적어도 6명의 참가자가 등록할 것이다. 참가자는 사전 서면 동의가 제공되는 시점에 등록할 것이며 모든 전처리 스크리닝 및 기준선 평가의 완료 후에만 개입을 수여받을 것이다.
이번 시험에서, 외부 독립 데이터 모니터링 위원회(IDMC) 및 의뢰자의 내부 안전성 위원회(ISC)의 2개 그룹이 시험으로부터 축적된 데이터를 평가할 것이다. IDMC의 주요 역할은 주기적 간격으로 안전성을 평가하는 것이다. ISC의 주요 역할은 지속적 기준으로 안전성을 모니터링하는 것이다.
두 참가자 코호트에 첫 번째 코호트는 1x1014 GC/kg을 투약하고 두 번째 코호트는 2x1014 GC/kg을 투약할 것이다. 각 용량 코호트의 첫 번째 참가자는 AAV8-RGX-DYS1을 수여받기 위해 체중이 20 kg 이하여야 하고, 각 용량 코호트의 두 번째 참가자는 체중이 30 kg 이하여야 하며, 각 용량 코호트의 세 번째 참가자는 체중이 40 kg 이하여야 한다. 용량 증량상과 함께 시작하여, 처음 3명의 적격 참가자는 1x1014 GC/kg 체중의 용량으로 AAV8-RGX-DYS1의 단일 IV 주입을 수여받도록 코호트 1에 순차적으로 배정할 것이며 투약은 적어도 4주 간격을 둘 것이다. 안전성 데이터는 각 참가자가 4주 추적을 완료한 후 ISC에 의해 검토될 것이다. 세 번째 참가자를 투약 후 4주 동안 추적하고 IDMC 및 ISC에 의해 안전성 데이터를 검토한 후 후속 참가자에게 병렬로 투약할 수 있다. ISC는 각 참가자의 안전성 데이터 검토 후 권장사항을 제시할 것이다. ISC가 지속을 권장하는 경우 다음 참가자에게 투약할 것이다.
코호트 1의 세 번째 투약 참가자를 투약 후 4주 동안 추적한 후, 누적 안전성 데이터는 IDMC에 의해 검토할 것이다. IDMC가 이 낮은 용량에서 안전성이 허용 가능한 것으로 고려하는 경우, 다음 3명의 적격 참가자는 2x1014 GC/kg 체중의 용량으로 AAV8-RGX-DYS1의 단일 IV 용량 주입을 수여받도록 코호트 2에 순차적으로 배정할 것이다. 또한 최대 6명의 추가 적격 참가자가 병렬로 코호트 1의 확장에 등록할 수 있다. 코호트 2 내 처음 3명의 참가자에 대한 투약은 적어도 4주 떨어져 간격을 두는 방식으로 진행할 것이다. ISC 및 IDMC에 의한 안전성 데이터 검토는 코호트 2 용량 수준에서 최대 6명의 추가 적격 참가자의 확장 등록에 대한 고려를 포함하여, 코호트 1에 대해 기재된 바와 같이 진행할 것이다.
각 참가자가 AAV8-RGX-DYS1 투약 후 12주를 완료한 후, RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 발현 수준을 각 투약 코호트의 처음 3명의 참가자에 대한 근육 생검에서 결정할 것이며, 참가자를 기능 시험에 의해 임상적 유효성에 대해 평가할 것이다.
12주 완료 후 참가자는 AAV8-RGX-DYS1의 투여 후 52주 동안 안전성 및 유효성에 대해 계속 평가할 것이다. 연구 종료 시, 모든 참가자를 장기 후속 연구에 참가하도록 초대할 것이다.
참가자를 북극성 이동 평가(NSAA) 선형 점수를 포함하는 검증된 결과 측정(McDonald 등, 2013; McDonald 등, 2018; Mutoni 등, 2019)을 사용하여 52주 추적 기간에 걸쳐 보행 기능, 시간 제한 작업 및 강도에 대해 평가할 것이다. 서는 데 걸리는 시간(TTSTAND), 10미터 뛰는/걷는 데 걸리는 시간(TTRW), 4개 계단을 올라가는 데 걸리는 시간(TTCLIMB), 근측정법을 포함하는 추가 유효성 결과뿐만 아니라 MRI 영상화, 심장 및 폐 기능, 크레아틴 키나제 수준, 환자 보고 결과를 사용한 근육 평가를 측정할 것이다.
샘플 크기 및 검정력 계산: AAV8-RGX-DYS1의 안전성 및 내약성을 평가하고 바이오마커 및 임상적 유효성 엔드포인트에 대한 AAV8-RGX-DYS1의 효과를 탐색하기 위해 적어도 6명의 참가자가 등록할 것이다. 표본 크기는 임의의 통계적 근거에 기반하지 않는다.
통계적 방법: 모든 데이터는 기술 통계를 사용하여 요약할 것이다. 범주형 변수는 빈도 및 백분율을 사용하여 분석할 것이며, 연속형 변수는 기술 통계(비누락 관찰수, 평균, 표준 편차, 중앙값, 최소 및 최대)를 사용하여 요약할 것이다. 대상체 목록 및 그래픽 디스플레이를 적절하게 제시할 것이다.
6.11.4 적격성 기준:
이 연구의 참가자는 임상적 발현; 해당되는 경우 가족력에 기반하여 DMD 진단을 받고; 면역형광 또는 웨스턴 블롯, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 모세관 기반 웨스턴 면역검정에 의한 디스트로핀 분석을 위한 골격근 생검, 또는 DMD와 일치하는 돌연변이를 실증하는 유전형 분석에 의해 확인된 남성일 것이다. 참가자는 보조 장치 없이 적어도 100미터를 걸을 수 있어야 하며 ≥3초 및 <9초 내에 누운 상태에서 일어설 수 있어야 한다(일어서는 데 걸리는 시간 시험[TTSTAND]).
6.11.5 포함
남성 참가자의 부모(들) 또는 법적 보호자(들)가 임의의 연구 관련 절차 전에, 사전 서면 동의서 및 해당되는 경우 건강 보험 이동성 및 책임법(HIPAA) 승인을 제공했다; 참가자는 현지 요구사항에 따라 서면 또는 구두 동의를 제공하도록 요청받을 것이다.
참가자가 적어도 4세 및 12세 미만이어야 한다.
참가자가 다음과 같이 정의되는, DMD의 이전 진단을 갖는다: 디스트로핀 결핍을 나타내는 골격근 생검의 디스트로핀 면역형광 및/또는 웨스턴 블롯 분석(예를 들어, 모세관 기반 웨스턴 면역검정) 및 전형적인 DMD와 일치하는 임상상 또는 DMD 유전자 내의 확인 가능한 돌연변이(하나 이상의 엑손의 결실/중복)로서, 판독 프레임이 '프레임 밖'으로 예측될 수 있는, 돌연변이, 및 전형적인 DMD와 일치하는 임상상, 또는 전형적인 DMD와 일치하는 임상상을 갖고, 디스트로핀 단백질의 제조를 배제할 것으로 예상되는(즉, 논센스 돌연변이, 하류 정지 코돈을 야기하는 결실/중복) 변경(점 돌연변이, 복제 등)을 나타내는 전체 DMD 유전자 시퀀싱.
참가자가 스크리닝 방문에서 평가된 바와 같이 보조 장치 없이 독립적으로 100 m를 걸을 수 있다.
참가자가 스크리닝 방문에서 평가된 바와 같이 ≥3초 및 <9초 내에 보조 없이 TTSTAND를 완료할 수 있다.
간 및 신장 기능을 포함하는 임상 실험실 시험 결과가 스크리닝 방문 시 정상 범위 내에 있거나, 비정상적인 경우 연구자의 의견으로는 임상적으로 유의하지 않다.
참가자가 혈청학적 면역성의 증거를 갖거나 갖지 않고 2개 용량의 홍역, 볼거리, 풍진 및 수두 백신을 받았다는 문서를 스크리닝 방문 시 제공한다.
참가자가 스크리닝 방문 전 적어도 12주 동안 안정적인 일일 용량의 전신 글루코코르티코이드 ≥0.5 mg/kg/일 프레드니손 또는 프레드니솔론 또는 ≥0.75 mg/kg/일 데플라자코트를 복용해왔다.
참가자 및 부모(들)/보호자(들)가 예정된 방문, 연구 개입 투여 계획 및 연구 절차를 준수할 의지와 능력이 있다.
6.11.6 제외
하기 중 하나 이상에 해당되는 경우 환자는 제외된다:
참가자가 PI의 의견으로는 대상체의 안전성 또는 성공적인 연구 참가 또는 연구 결과의 해석을 위태롭게 할 심각하거나 불안정한 의학적 또는 정신적 병태를 갖는다.
참가자가 증상성 심근병증의 증거를 갖는다.
참가자가 연구자의 의견으로는 연구 참가를 배제하는 심각한 행동 또는 인지 문제를 갖는다.
참가자가 혈청에서 검출 가능한 AAV8 전체 결합 항체를 갖는다;
참가자가 기능 시험(예를 들어, NSAA)에 영향을 미칠 수 있는 임의의 치유되지 않은 부상 또는 수술을 갖는다.
참가자가 평생 동안 임의의 연구용 또는 상업용 유전자 치료법 생성물을 수여받았다.
참가자가 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 또는 C형 간염 바이러스 감염 이력, 또는 B형 간염(B형 간염 표면 항원, B 형 간염 표면 항체, B형 간염 코어 항체[IgG]) 또는 C형 간염(C형 간염 항체 또는 HCV RNA) 또는 HIV 항체에 대한 양성 스크리닝 시험을 갖는다.
참가자가 임상 현장 직원 또는 연구 수행에 관여된 임의의 다른 개인의 1차 가족 구성원이다.
참가자가 현재 다른 연구 개입을 복용 중이거나 예정된 제1일 개입 전 3개월 이내에 임의의 다른 연구 개입을 복용했다.
6.11.7 연구 목적 및 엔드포인트
6.11.9 생물분석적 접근
근육 생검 - RGX-DYS1 마이크로디스트로핀 분포
면역조직화학 검정 및 웨스턴 블롯(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 모세관 기반 웨스턴 면역검정)을 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀을 발현하는 섬유 및 그 편재를 검출하기 위해 사용할 것이다.
면역원성 검정
항-AAV8 항체 검정
Mesoscale 플랫폼을 이용하는 전기화학발광 기반 검정을 혈청 내 AAV8에 대한 전체 항체를 검출하기 위해 검증할 것이며 AAV8-RGX-DYS1에 대한 잠재적 면역 반응을 모니터링하기 위해 사용할 것이다. 이 검정은 연구 등록에 대한 대상체의 적격성을 결정하기 위해서는 사용하지 않을 것이다. 항-AAV8 항체 상태에 기반하여 적격 대상체를 확인하기 위해 별도의 검증을 검증하고 있다.
ELISPOT
AAV8 캡시드 단백질 또는 RGX-DYS1 마이크로디스트로핀에 대해 유도된, RGX-202에 대한 잠재적 세포 반응을 검출하기 위해 인터페론 감마 ELISPOT 검정을 개발할 것이다.
RGX-DYS1 벡터 검정
벡터 흘림
투여 후 RGX-DYS1 벡터의 흘림을 측정하기 위해 혈액(또는 혈청) 및 소변 내 RGX-DYS1을 측정하는 qPCR 검정을 개발할 것이다.
근육 생검에서의 생체분포
근육 생검에서 RGX-DYS1 벡터 DNA를 측정하는 qPCR 검정을 투여 후 표적 조직에 대한 벡터 생체분포를 측정하기 위해 개발할 것이다.
6.11.10 면역억제 치료법과의 조합
일부 측면에서, 본원에 기재된 프로토콜을 면역억제 치료법과 조합할 수 있다. 프로토콜에서 사용된 벡터가 염증을 초래할 수 있으므로 유전자 치료법 전에, 동안에 또는 후에 면역억제제, 예컨대 항염증제를 투여하는 것이 유용할 수 있다.
스테로이드
임상 시험으로 반응에 대응하기 위해 스테로이드 약물을 사용한 면역억제를 사용하여 T 세포 반응의 바이오마커로서 간 효소 수준을 모니터링했다. AAV 벡터는 아데노바이러스 및 렌티바이러스 벡터와 비교하여 CD8+ T 세포를 유도하는 데 있어서 가장 덜 효율적이었으며, T 세포 반응은 연구에 걸쳐 가변적인 것으로 관찰되어서, 다른 요인(예를 들어, 혈청형, 벡터 설계, 용량, 투여 경로, 제조)이 관여할 수 있음을 표시하였다(Shirley 등, 2020).
장기간 스테로이드 사용과 관련된 부작용은 근골격, 위장관, 대사, 신경 및 내분비 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않고 다양하다. 알레르기 반응(예를 들어, 과민증, 아나필락시스)도 발생할 수 있다. 그럼에도 불구하고 스테로이드는 현재 염증 및 항바이러스 CD8+ T 세포 반응을 상쇄하기 위해 전신, 간 및 안구 AAV 유전자 치료법에서 널리 사용된다(Shirley 등, 2020).
AAV8-RGX-DYS1에 대한 잠재적 면역 반응을 경감시키기 위해 예방적 IS 요법을 투여할 수 있다.
제1일에 경구 프레드니솔론의 일일 용량을 참가자의 기준선 글루코코르티코이드에 추가할 수 있으며, 목표는 안전성 우려사항이 없는 경우 제12주 후에 참가자의 기준선 글루코코르티코이드 요법을 재개하는 것이다. 추가적인 경구 프레드니솔론 투약 요법/단계적 감량은 하기와 같을 수 있다: 제1일부터 제8주 말까지: 1 mg/kg/일. 이력, 신체 검사, 및 실험실 시험을 포함하는 참가자의 임상 상태 검토에 기반하여 제8주에 안전성 우려사항이 없는 경우, 경구 프레드니솔론 용량을 제9주 내지 제10주에 0.5 mg/kg/일로 낮출 수 있다. 이력, 신체 검사, 및 실험실 시험을 포함하는 참가자의 임상 상태 검토에 기반하여 제10주에 안전성 우려사항이 없는 경우, 경구 프레드니솔론 용량을 제11주 내지 제12주에 0.25 mg/kg/일로 낮출 수 있다. 이력, 신체 검사, 및 실험실 시험을 포함하는 참가자의 임상 상태 검토에 기반하여 제12주에 안전성 우려사항이 없는 경우, 나머지 연구 동안 연구자의 재량에 따라 참가자의 기준선 글루코코르티코이드 요법을 재개할 수 있다. 처음 12주 내에 안전성 우려사항이 발생하는 경우, 의료 모니터에 연락하여 기준선 글루코코르티코이드 요법으로 돌아가기 전에 사례별 기준으로 IS 요법을 변형에 대해 평가한다. 참고: 기준선에서 주말에 고용량 스테로이드 요법을 받는 참가자는 위에서 상세히 나타낸 일일 추가 경구 프레드니솔론 요법/단계적 감량과 함께 이의 주말 요법을 계속해야 한다. 참가자의 일일 총 스테로이드 용량(기준선 요법 + 연구에서 처방한 추가 경구 프레드니솔론)은 프레드니손 60 mg에 해당하는 용량을 초과해서는 안 된다.
에쿨리주맙
DMD를 갖는 환자에서 2개의 AAV 매개 유전자 치료법 연구는 aHUS와 관련된 것을 포함하여 보체 장애와 일치하는 AE를 보고하였다.
에쿨리주맙은 보체 단백질 C5에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 장기 작용 인간화 모노클로날 항체이다(SOLIRIS 처방 정보, 2020). 이는 C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 억제하여 말단 보체 복합체 C5b-9의 생성을 방지한다. 에쿨리주맙은 aHUS를 갖는 환자에서 말단 보체 매개 혈전성 미세혈관병증을 억제한다(SOLIRIS 처방 정보, 2020; Legendre 등, 2013). C5 보체 활성화 및 그에 따른 보체 매개 AE를 경감시키기 위해, 연구 참가자에게 AAV8-RGX-DYS1 투여 전에 시작하여 AAV8-RGX-DYS1 투여 12일 후에 종료되는 에쿨리주맙을 예방적으로 투여할 수 있다. 에쿨리주맙은 위에서 언급된 AAV 유전자 치료법 연구에서 이전에 DMD 환자에게 보체 매개 유해 반응에 대한 치료 및 예방 둘 모두로서 사용되었다(Pfizer 보도 자료, 2020; Solid Biosciences 보도 자료, 2020).
에쿨리주맙은 소아 환자에서 중력 공급, 주사기형 펌프 또는 주입 펌프를 통해 1 내지 4시간에 걸쳐 IV 주입으로서 투여한다. 투여량은 참가자의 체중에 의존한다(표 14). 에쿨리주맙 유도 및 유지 용량의 지정된 시점은 AAV8-RGX-DYS1 투여 약 5-8일 후 에쿨리주맙의 최고 수준을 보장하는 것으로, 이는 AAV9 유전자 치료법의 IGNITE DMD 연구에서 Solid Bioscience에 의해 보고된 임상 데이터로부터의 최고 보체 활성과 관련된 시간 프레임이다. 에쿨리주맙 주입 동안 임의의 유해 반응이 발생하는 경우, 연구자의 재량에 따라 주입을 늦추거나 정지할 수 있다. 주입 관련 반응의 징후 또는 증상에 대해서는 주입 완료 후 적어도 1시간 동안 참가자를 모니터링해야 한다. 추가 개입이 필요한 경우 임상적 의사결정을 내릴 수 있도록 제12일 에쿨리주맙 투약 후 보체 수준을 정기적으로 모니터링할 수 있다.
aHUS 단일 아암 전향적 시험(≥20%)에서 보고된 바와 같이 에쿨리주맙과 관련된 유해 반응은 두통, 설사, 고혈압, 상기도 감염, 복통, 구토, 비인두염, 빈혈, 기침, 말초 부종, 메스꺼움, 요로 감염, 및 발열이다. 에쿨리주맙으로 치료받은 환자에서 생명을 위협하는 치명적 수막구균 감염이 발생했으며, 초기에 인지하고 치료하지 않는 경우 빠르게 생명을 위협하거나 치명적이 될 수 있다(SOLIRIS 처방 정보, 2020).
수막구균 백신
에쿨리주맙으로 치료받은 환자에서 생명을 위협하는 치명적 수막구균 감염이 발생했으며, 초기에 인지하고 치료하지 않는 경우 빠르게 생명을 위협하거나 치명적이 될 수 있다(SOLIRIS 처방 정보, 2020).
간병인이 이전 수막구균 예방접종 문서를 제공한 참가자는 재백신접종을 받을 필요가 없다. 수막구균 백신이 필요한 참가자, 즉 이전에 백신접종을 받지 않았거나 백신접종을 받았다는 문서를 제공할 수 없는 참가자의 경우, 수막구균 백신 과정-수막구균 접합체 또는 MenACWY 백신, 또는 혈청군 B 수막구균 또는 MenB 백신을 근육내 투여한다. 특정 제품 표지, 어린이의 연령, 그리고 보체 억제제, 예컨대 에쿨리주맙을 복용하는 어린이의 현지 백신접종 관행에 따라(예를 들어, 미국 질환 통제 예방 센터 면역화 시행 자문위원회에 따라) 투여한다. 백신 과정은 에쿨리주맙 투여 시작의 적어도 2주 전에 완료되어야 한다.
백신접종은 수막구균 감염 위험을 감소시키지만 제거하지 않는다(SOLIRIS 처방 정보, 2020). 참가자는 수막구균 감염의 초기 징후를 모니터링하고 감염이 의심되는 경우 즉시 평가해야 한다. 심각한 수막구균 감염에 대해 치료받는 모든 참가자는 에쿨리주맙을 중단해야 한다.
백신 부작용은 전형적으로 주사 부위 반응(발적, 통증 또는 쓰라림), 발열 또는 오한, 근육통 또는 관절통, 두통, 피로, 및 메스꺼움 또는 설사를 포함하여 경도이다. 아나필락시스 반응은 드물다.
시롤리무스
AAV 및/또는 이식유전자에 대한 면역 반응이 안전성 및 유효성 둘 모두에 미치는 영향을 최소화하기 위해 시롤리무스와의 조합 면역억제가 여러 AAV 유전자 치료법 연구에 포함되었으며 안전하고 내약성이 우수한 것으로 보인다. 라파마이신으로도 알려진 시롤리무스는 세포내 신호전달 및 대사 경로를 차단함으로써 T 세포 확장 및 성숙을 촉진하는 사이토카인의 능력을 억제한다. 이는 또한 이식 후 면역억제에서도 일반적으로 사용된다(Zhao 등, 2016). 마지막으로, 비임상 및 임상 연구는 시롤리무스가 조절 T 세포(Treg)의 상대적 절약을 제공할 수 있음을 제시하며, 이는 반동 면역 반응 없이 약물의 중단을 허용할 수 있다(Hendrikx 등, 2009; Ma 등, 2009; Mingozzi 등, 2007; Singh 등, 2014).
위약에 대해 보고된 것보다 높은 발생률로 시롤리무스에 대해 보고된 가장 흔한(≥20%) 유해 반응은 말초 부종, 고지혈증, 증가된 크레아티닌, 변비, 복통, 두통, 통증 및 관절통을 포함한다(RAPAMUNE® 처방 정보, 2021). 일반적으로 면역억제 치료법은 기회 감염에 대한 증가된 감수성 그리고 림프종 및 다른 악성종양의 발생 가능성을 초래할 수 있다(경고 박스 참조, RAPAMUNE® 처방 정보, 2021).
경구 시롤리무스 투약 요법은 하기와 같을 것이다: 제-7일: 3 mg/m2 시롤리무스의 로딩 용량. 제-6일 내지 제8주: 시롤리무스 1 mg/m2/일을 1일 2회(BID)로 나누어 투약하고 표적 혈액 수준은 크로마토그래피 검정을 사용하여 8-12 ng/mL임. 저점 모니터링은 연구 제-2일, 제2일, 제6일, 제12일(필요한 경우), 및 제14일 그리고 제8주까지 필요에 따라(PRN) 실시할 것이다. 제9주-제10주: 간 기능 시험(LFT), 혈소판 및 임의의 다른 관련 안전성 실험실이 안정적으로 유지되는 경우, 시롤리무스 용량을 50% 줄인다. 제11주-제12주: LFT, 혈소판 및 임의의 다른 관련 안전성 실험실이 안정적으로 유지되는 경우, 시롤리무스 용량을 다시 50% 줄인다. 제12주 후: LFT, 혈소판 및 임의의 다른 관련 안전성 실험실이 안정적으로 유지되는 경우, 시롤리무스를 중단한다.
시롤리무스 유지 용량이 조정되면 참가자는 안전성 우려사항으로 긴급 용량 조정이 필요하지 않는 한, 농도 모니터링을 통해 추가 투여량 조정 전 적어도 4일 동안 새로운 유지 용량을 계속해야 한다. 하루에 투여되는 최대 시롤리무스 용량은 40 mg을 초과해서는 안 된다.
시롤리무스를 포함하여 면역억제제를 수여받는 환자는 폴리오마 바이러스 감염을 포함한 기회감염에 대한 위험이 증가된다. 면역억제된 환자의 폴리오마 바이러스 감염은 심각하고 때때로 치명적인 결과를 가질 수 있다. 이는 주로 BK 바이러스 감염으로 인한 폴리오마 바이러스 관련 신장병증(PVAN) 및 시롤리무스를 수여받은 환자에서 관찰된 존 커닝햄(JC) 바이러스 관련 진행성 다초점 백질뇌병증(PML)을 포함한다. 면역억제 과정의 지속시간 동안 시롤리무스 저점을 면밀히 모니터링하고 적절한 용량 조정을 일으킨다.
설파메톡사졸 및 트리메토프림
바이러스 게놈에 대한 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 엡스타인-바 바이러스(EBV) PCR 시험을 정기적으로 측정할 수 있으며, 조합 제품 설파메톡사졸 및 트리메토프림(BACTRIM™ 처방 정보, 2021; SEPTRA 처방 정보, 2006)을 사용하여 폐포자충 폐렴(PCP) 예방을 제-7일에 시작하여 시롤리무스 중단까지 계속해서 5 mg/kg의 용량으로 주 3회(예를 들어, 월요일, 수요일, 금요일) 제공할 수 있다. 설파 알레르기를 갖는 참가자의 경우 대안적 약제는 펜타미딘, 답손, 및 아토바쿠온을 포함할 수 있다.
6.12 실시예 11 - 마이크로디스트로핀 안정성 연구
이 연구는 조직 배양에서 펄스 추적 검정에 의해 측정된 마이크로디스트로핀 단백질의 안정성을 나타낸다.
AAV 매개 유전자 치료법은 DMD에 대한 가장 유망한 치료 전략 중 하나를 나타낸다. AAV 벡터의 제한된 패키징 능력으로 인해 디스트로핀 코딩 서열은 마이크로디스트로핀을 제조하기 위해 절단해야 한다. 디스트로핀의 내부 또는 말단 결실은 막대 및 힌지 반복부 접합부의 변경된 폴딩 또는 디스트로핀 관련 단백질 복합체(DAPC)와의 최적 미만 상호작용으로 인해 불안정한 단백질을 야기하여 더 불안정한 막 복합체를 생성할 수 있다. 마이크로디스트로핀은 카복실 말단(CT) 도메인의 길이가 증가하도록 설계하였으며 이의 안정성은 2개의 상이한 펄스 추적 검정을 사용하여 조직 배양에서 측정하였다.
상이한 길이의 CT를 암호화하는 3개의 마이크로디스트로핀 작제물을 평가하였다: RGX-DYS1 작제물(μDys-CT194 암호화), RGX-DYS5 작제물(μDys-CT140 암호화) 및 RGX-DYS3 작제물(μDys-CT48 암호화). 따라서, 이들 작제물은 각각 CT 도메인의 194개 아미노산, 140개 아미노산 및 48개 아미노산을 갖는 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화한다(도 2 및 표 10 참고). RGX-DYS1 게놈을 함유하는 AAV8은 RGX-DYS5 게놈 또는 RGX-DYS3 게놈을 함유하는 AAV8과 비교하여 mdx 마우스의 골격근에서 더 높은 마이크로디스트로핀 수준을 생성할 수 있다. 현재 연구에서, 할로-RGX-DYS1 및 할로-RGX-DYS3 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드로 마우스 C2C12 근모세포를 형질감염시킨 후 형광 펄스 추적 연구를 통해 마이크로디스트로핀 안정성을 탐색했다. 동역학적 영상화 및 자동화 이미지 분석을 시간 경과에 따른 할로-μDys 융합 단백질 형광 신호의 붕괴를 추적하고 반감기를 계산하기 위해 이용했다. HaloTag 기술은 HaloTag 융합 단백질이 형광기를 운반할 수 있는 특정 소분자 리간드에 공유 결합하도록 허용한다. 따라서 특이적으로 표지된 HaloTag 융합 단백질을 세포에서 검출하고 전체 세포 영상화 또는 SDS-PAGE에서 단백질 밴드의 형광 정량에 의해 시험관내 관찰할 수 있다. 이 방법을 이후에 과량의 비형광 리간드로 차단함으로써 펄스 추적 기술에 적용하였다. 간략하게, 단백질을 JaneliaFluor549 Halotag 리간드에 의해 표지한 다음 과량의 비형광 경쟁적 리간드에 의해 차단하였다. 동역학적 영상화를 지수 붕괴에 의해 모델링하고 반감기(t1/2)에 의해 나타내었다(도 37a). 형광 겔 영상화를 또한 시점 간 붕괴를 비교하고 반감기(t1/2)를 계산함으로써 모델링하였다(도 37b).
결과는 할로-RGX-DYS1의 반감기가 할로-RGX-DYS3보다 1.8배 더 높음을 표시하여, 마이크로디스트로핀 안정성(펄스 추적)에 대한 CT 기여를 표시하였다. 단백질 겔 형광에 의해 측정된 바와 같이, 할로-RGX-DYS1의 반감기 결정은 할로-RGX-DYS3의 반감기의 3배였다.
병렬로, 사이클로헥시미드 추적을 사용하여 상이한 길이의 CT를 갖는 마이크로디스트로핀 단백질의 회전율을 결정했다. 변형된 HEK293 세포를 RGX-DYS1(μDys-CT194), RGX-DYS5(μDys-CT140) 및 RGX-DYS3(μDys-CT48)을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시키고, 시클로헥시미드로 번역을 중단하고, 마이크로디스트로핀 수준을 항-디스트로핀 항체 기반 유세포 측정 검정을 사용하여 다양한 시점에 측정했다. 정규화된 세기를 시간의 함수로서 도시하고 데이터를 지수 붕괴 곡선에 피팅하여 반감기를 계산했다(도 37c).
사이클로헥시미드 추적 검정(도 38c)에 의해 측정된 바와 같이, HEK293 세포에서 RGX-DYS1에 의해 암호화된 마이크로디스트로핀의 반감기는 RGX-DYS5에 의해 암호화된 마이크로디스트로핀보다 1.5배 더 높고, RGX-DYS3에 의해 암호화된 마이크로디스트로핀보다 2.1배 더 높은 것으로 측정되었다. 단백질 안정성에 영향을 미치는 요인을 해석하기 위해, BV/Sf9 발현 시스템으로부터 RGX-DYS1 및 RGX-DYS3에 의해 암호화된 정제된 재조합 단백질을 용융 온도 측정을 위한 시차 주사 형광측정(DSF) 및 프로테아제 저항성 시험을 위한 프로티나제 K 소화의 연속 희석에 의해 추가 특성규명했다. 데이터는 용융 온도 및 프로테아제 저항성이 RGX-DYS1 및 RGX-DYS3에 의해 암호화된 정제된 마이크로디스트로핀에 대해 동일함을 나타내었다. 이는 RGX-DYS1에 의해 암호화된 마이크로디스트로핀(μDys-CT194)의 더 긴 CT 도메인에 의해 제공되는 증가된 안정성이 CT 도메인에서 조립되는 것으로 알려진 세포성 파트너, 예컨대 디스트로핀 관련 단백질 복합체(DAPC)의 구성원과의 상호작용을 통해 발생할 수 있음을 표시한다. 이러한 상호작용은 용융점 및 프로테아제 저항성 측정에서 정제된 μDys 단백질만을 함유한 시험관에서 소실되었다.
결론적으로, 마이크로디스트로핀 단백질의 반감기를 사이클로헥시미드 추적 유세포 측정 및 할로 태그 동역학적 영상화를 사용하는 형광 펄스 추적에 의해 세포 배양에서 측정하였다. 데이터는 마이크로디스트로핀의 연장된 CT 도메인이 단백질 반감기를 약 2배 증가시킬 수 있고 이들 신규한 마이크로디스트로핀 단백질의 치료적 이점을 개선할 수 있음을 표시한다.
6.13 실시예 12: 디스트로핀 및 마이크로디스트로핀의 정량을 위한 모세관 기반 웨스턴 방법
RGX-DYS1 유전자 치료법의 임상적 평가를 지원하기 위해 모세관 기반 웨스턴 면역검정 방법에 의한 디스트로핀(Dys) 및 마이크로디스트로핀(μDys)의 정량 방법을 개발하였다.
AAV8-RGX-DYS1은 최적화된 인간 마이크로디스트로핀 이식유전자 및 근육내 발현을 증가시키도록 설계된 프로모터(SPc5-12)를 포함하는 혈청형 8의 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV8)이다. AAV8-RGX-DYS1이 투약된 대상체의 골격근 및 심장근의 μDys 수준 정량은 유전자 치료법의 치료 효과를 이해하기 위한 중요한 요소이다.
JESS 자동화(ProteinSimple 제공)를 이용하는 모세관 기반 웨스턴 방법을 개발하고 다양한 종으로부터의 조직 용해물에서 넓은 검정 범위에 걸쳐 μDys 및 Dys를 둘 모두 정량하기 위해 검증하였다. 자동화된 JESS 시스템은 전통적 웨스턴 블롯에 비해 장점, 예컨대 빠른 실행 시간, 블로팅 없음, 로딩 대조군에 대한 다중화, 매우 적은 양의 샘플(100배 더 적음) 및 항체(500배 더 적음) 사용을 제공한다.
재조합 μDys 단백질(RGX-DYS1)을 포유동물 세포에서 생성하였으며 RGX-DYS1 이식유전자 생성물의 직접적 정량을 허용하는 참조 표준물질로서 단리하였다. μDys 단백질의 검량선 범위는 원숭이 방법에서 4.0-200 ng/mg, 및 마우스 방법에서 5.0-160 ng/mg이었다. 이 방법을 FDA의 생체분석 방법 검증 지침에 개략된 원칙에 따라 마우스 및 원숭이 조직에서 검증하였다. 원숭이 조직 방법의 민감도는 ±30% 이내의 전체 정확도 및 정밀도로 4.0 ng의 μDys/mg 전체 조직 용해물로 실증되었으며, 마우스 조직 방법은 ±20% 이내의 정확도 및 정밀도로 5.0 ng의 μDys/mg 전체 조직 용해물로 실증되었다. 원숭이 조직에서 디스트로핀 검출에 대한 특이성을 또한 다양한 시판 항체에 의해 확인하였다. 전반적으로 결과는 모세관 기반 웨스턴 방법이 민감하고 특이적이며 강력함을 나타낸다. 이 검정은 다양한 전임상 연구, 예컨대 실시예 8에 기재된 연구를 뒷받침하는 μDys 수준을 측정하기 위해 성공적으로 사용되었다. 간략하게, 냉동 조직을 여러 조각으로 절단하고(각각 대략 20-30 mg), 이를 용해 완충액을 포함하여 비드 기반 조직 균질기에 넣어 마우스 근육 조직 용해물 샘플을 제조하였다. 조직 용해물의 전체 단백질 농도를 측정했다. 그런 다음 알려진 양의 재조합 μDys를 나이브 마우스 조직 용해물에 스파이크첨가한다. 정의된 양의 전체 단백질을 JESS 기기를 사용하여 모세관에서 크기-분리한 후 Dys에 특이적인(또한 μDys를 인식하는) 1차 마우스 모노클로날 항체(NCL-DYSB) 및 알파-액티닌(로딩 대조군)에 특이적인 토끼 폴리클로날 항체와 인큐베이션한다. 그 다음 2차 항-마우스 HRP-접합 항체 및 항-토끼-NIR(근적외선) 항체를 첨가하고 마지막으로 특정 복합체의 검출을 위해 루미놀/과산화효소를 첨가했다. 생성된 신호(화학발광[HRP] 및 형광[NIR])를 여러 노출 시간에서 검출하였으며 Compass 소프트웨어(ProteinSimple)에 의해 자동으로 정량하였다. 화학발광 및 NIR 신호는 전기영동도로서 또는 가상 웨스턴 블롯 유사 이미지로서 표시되었다. 전기영동도는 모세관의 길이에 따라 검출된 세기(초당) 및 샘플에 존재하는 특정 분석물질(Dys, μDys 및 알파-액티닌)의 양에 정비례하는 곡선 아래 면적(AUC)(나침반)의 계산에 의해 정량되는(Compass) 피크를 자동으로 검출한다. 그런 다음 정규화된 값 또는 μDys AUC 데이터를 SoftMax Pro 소프트웨어(버전 7.0)에서 1/Y^2 가중 함수로 4-PL 곡선 피팅으로 분석했다. 최종 농도는 도 36에서와 같이 ng μDys/mg 전체 조직 용해물 단백질 농도(ng/mg 단백질)로 보고하였다.
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본 발명이 이의 특정 구현예를 참조하여 상세하게 기재되었지만, 기능적으로 동등한 변화도 본 발명의 범위 내에 있음이 이해될 것이다. 실제로, 본원에 나타내고 기재된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 균등부를 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등부는 하기 청구범위에 포괄되는 것으로 의도된다.
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SEQUENCE LISTING <110> REGENXBIO Inc. <120> Microdystrophin Gene Therapy Administration for Treatment of Dystrophinopathies <130> 38013.0022P1 <150> 63/319363 <151> 2022-03-13 <150> 63/314436 <151> 2022-02-27 <150> 63/245909 <151> 2021-09-19 <150> 63/180064 <151> 2021-04-26 <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1337 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; RGX-Dys1 <400> 1 Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val 1 5 10 15 Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe 20 25 30 Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg 35 40 45 Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys 50 55 60 Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala 65 70 75 80 Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser 85 90 95 Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp 100 105 110 Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met 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aaactgctgg accctgagga tgtggacacc acctatcctg acaagaaatc 1260 catcctcatg tacatcacca gcctgttcca ggtgctgccc cagcaagtgt ccattgaggc 1320 cattcaagag gttgagatgc tgcccagacc tcctaaagtg accaaagagg aacacttcca 1380 gctgcaccac cagatgcact actctcagca gatcacagtg tctctggccc agggatatga 1440 gagaacaagc agccccaagc ctaggttcaa gagctatgcc tacacacagg ctgcctatgt 1500 gaccacatct gaccccacaa gaagcccatt tccaagccag catctggaag cccctgagga 1560 caagagcttt ggcagcagcc tgatggaatc tgaagtgaac ctggatagat accagacagc 1620 cctggaagaa gtgctgtcct ggctgctgtc tgctgaggat acactgcagg ctcagggtga 1680 aatcagcaat gatgtggaag tggtcaagga ccagtttcac acccatgagg gctacatgat 1740 ggacctgaca gcccaccagg gcagagtggg aaatatcctg cagctgggct ccaagctgat 1800 tggcacaggc aagctgtctg aggatgaaga gacagaggtg caagagcaga tgaacctgct 1860 gaacagcaga tgggagtgtc tgagagtggc cagcatggaa aagcagagca acctgcacag 1920 agtgctcatg gacctgcaga atcagaaact gaaagaactg aatgactggc tgaccaagac 1980 agaagaaagg actaggaaga tggaagagga acctctggga ccagacctgg aagatctgaa 2040 aagacaggtg 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cagtttgcca acaacaagcc tgagattgag gctgccctgt tcctggactg 3780 gatgagactt gagcctcaga gcatggtctg gctgcctgtg cttcatagag tggctgctgc 3840 tgagactgcc aagcaccagg ccaagtgcaa catctgcaaa gagtgcccca tcattggctt 3900 cagatacaga tccctgaagc acttcaacta tgatatctgc cagagctgct tctttagtgg 3960 cagggttgcc aagggccaca aaatgcacta ccccatggtg gaatactgca ccccaacaac 4020 ctctggggaa gatgttagag actttgccaa ggtgctgaaa aacaagttca ggaccaagag 4080 atactttgct aagcacccca gaatgggcta cctgcctgtc cagacagtgc ttgagggtga 4140 caacatggaa acctgatgag tcgacaggcc taataaagag ctcagatgca tcgatcagag 4200 tgtgttggtt ttttgtgtgg ctagctgcgg ccgcaggaac ccctagtgat ggagttggcc 4260 actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc 4320 ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcag 4364 <210> 56 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; promoter <220> <221> misc <222> (1)..(4) <223> Xaa can be any amino acid <400> 56 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 57 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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1660 1665 Glu Trp Leu Asn Leu Leu Leu Glu Tyr Gln Lys His Met Glu Thr 1670 1675 1680 Phe Asp Gln Asn Val Asp His Ile Thr Lys Trp Ile Ile Gln Ala 1685 1690 1695 Asp Thr Leu Leu Asp Glu Ser Glu Lys Lys Lys Pro Gln Gln Lys 1700 1705 1710 Glu Asp Val Leu Lys Arg Leu Lys Ala Glu Leu Asn Asp Ile Arg 1715 1720 1725 Pro Lys Val Asp Ser Thr Arg Asp Gln Ala Ala Asn Leu Met Ala 1730 1735 1740 Asn Arg Gly Asp His Cys Arg Lys Leu Val Glu Pro Gln Ile Ser 1745 1750 1755 Glu Leu Asn His Arg Phe Ala Ala Ile Ser His Arg Ile Lys Thr 1760 1765 1770 Gly Lys Ala Ser Ile Pro Leu Lys Glu Leu Glu Gln Phe Asn Ser 1775 1780 1785 Asp Ile Gln Lys Leu Leu Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ile Gln Gln 1790 1795 1800 Gly Val Asn Leu Lys Glu Glu Asp Phe Asn Lys Asp Met Asn Glu 1805 1810 1815 Asp Asn Glu Gly Thr Val Lys Glu Leu Leu Gln Arg Gly Asp Asn 1820 1825 1830 Leu Gln Gln Arg Ile Thr Asp Glu Arg Lys Arg Glu Glu Ile Lys 1835 1840 1845 Ile Lys Gln Gln Leu Leu Gln Thr Lys His Asn Ala Leu Lys Asp 1850 1855 1860 Leu Arg Ser Gln Arg Arg Lys Lys Ala Leu Glu Ile Ser His Gln 1865 1870 1875 Trp Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Ala Asp Asp Leu Leu Lys Cys Leu 1880 1885 1890 Asp Asp Ile Glu Lys Lys Leu Ala Ser Leu Pro Glu Pro Arg Asp 1895 1900 1905 Glu Arg Lys Ile Lys Glu Ile Asp Arg Glu Leu Gln Lys Lys Lys 1910 1915 1920 Glu Glu Leu Asn Ala Val Arg Arg Gln Ala Glu Gly Leu Ser Glu 1925 1930 1935 Asp Gly Ala Ala Met Ala Val Glu Pro Thr Gln Ile Gln Leu Ser 1940 1945 1950 Lys Arg Trp Arg Glu Ile Glu Ser Lys Phe Ala Gln Phe Arg Arg 1955 1960 1965 Leu Asn Phe Ala Gln Ile His Thr Val Arg Glu Glu Thr Met Met 1970 1975 1980 Val Met Thr Glu Asp Met Pro Leu Glu Ile Ser Tyr Val Pro Ser 1985 1990 1995 Thr Tyr Leu Thr Glu Ile Thr His Val Ser Gln Ala Leu Leu Glu 2000 2005 2010 Val Glu Gln Leu Leu Asn Ala Pro Asp Leu Cys Ala Lys Asp Phe 2015 2020 2025 Glu Asp Leu Phe Lys Gln Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ile Lys Asp 2030 2035 2040 Ser Leu Gln Gln Ser Ser Gly Arg Ile Asp Ile Ile His Ser Lys 2045 2050 2055 Lys Thr Ala Ala Leu Gln Ser Ala Thr Pro Val Glu Arg Val Lys 2060 2065 2070 Leu Gln Glu Ala Leu Ser Gln Leu Asp Phe Gln Trp Glu Lys Val 2075 2080 2085 Asn Lys Met Tyr Lys Asp Arg Gln Gly Arg Phe Asp Arg Ser Val 2090 2095 2100 Glu Lys Trp Arg Arg Phe His Tyr Asp Ile Lys Ile Phe Asn Gln 2105 2110 2115 Trp Leu Thr Glu Ala Glu Gln Phe Leu Arg Lys Thr Gln Ile Pro 2120 2125 2130 Glu Asn Trp Glu His Ala Lys Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Leu 2135 2140 2145 Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg Gln Thr Val Val Arg Thr Leu Asn 2150 2155 2160 Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile Gln Gln Ser Ser Lys Thr Asp Ala 2165 2170 2175 Ser Ile Leu Gln Glu Lys Leu Gly Ser Leu Asn Leu Arg Trp Gln 2180 2185 2190 Glu Val Cys Lys Gln Leu Ser Asp Arg Lys Lys Arg Leu Glu Glu 2195 2200 2205 Gln Lys Asn Ile Leu Ser Glu Phe Gln Arg Asp Leu Asn Glu Phe 2210 2215 2220 Val Leu Trp Leu Glu Glu Ala Asp Asn Ile Ala Ser Ile Pro Leu 2225 2230 2235 Glu Pro Gly Lys Glu Gln Gln Leu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Val 2240 2245 2250 Lys Leu Leu Val Glu Glu Leu Pro Leu Arg Gln Gly Ile Leu Lys 2255 2260 2265 Gln Leu Asn Glu Thr Gly Gly Pro Val Leu Val Ser Ala Pro Ile 2270 2275 2280 Ser Pro Glu Glu Gln Asp Lys Leu Glu Asn Lys Leu Lys Gln Thr 2285 2290 2295 Asn Leu Gln Trp Ile Lys Val Ser Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gln 2300 2305 2310 Gly Glu Ile Glu Ala Gln Ile Lys Asp Leu Gly Gln Leu Glu Lys 2315 2320 2325 Lys Leu Glu Asp Leu Glu Glu Gln Leu Asn His Leu Leu Leu Trp 2330 2335 2340 Leu Ser Pro Ile Arg Asn Gln Leu Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Asn 2345 2350 2355 Gln Glu Gly Pro Phe Asp Val Lys Glu Thr Glu Ile Ala Val Gln 2360 2365 2370 Ala Lys Gln Pro Asp Val Glu Glu Ile Leu Ser Lys Gly Gln His 2375 2380 2385 Leu Tyr Lys Glu Lys Pro Ala Thr Gln Pro Val Lys Arg Lys Leu 2390 2395 2400 Glu Asp Leu Ser Ser Glu Trp Lys Ala Val Asn Arg Leu Leu Gln 2405 2410 2415 Glu Leu Arg Ala Lys Gln Pro Asp Leu Ala Pro Gly Leu Thr Thr 2420 2425 2430 Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr Leu Val Thr Gln Pro 2435 2440 2445 Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu Glu Met Pro Ser 2450 2455 2460 Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Ala Leu Ala Asp Phe Asn Arg Ala 2465 2470 2475 Trp Thr Glu Leu Thr Asp Trp Leu Ser Leu Leu Asp Gln Val Ile 2480 2485 2490 Lys Ser Gln Arg Val Met Val Gly Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu 2495 2500 2505 Met Ile Ile Lys Gln Lys Ala Thr Met Gln Asp Leu Glu Gln Arg 2510 2515 2520 Arg Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys 2525 2530 2535 Asn Lys Thr Ser Asn Gln Glu Ala Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg 2540 2545 2550 Ile Glu Arg Ile Gln Asn Gln Trp Asp Glu Val Gln Glu His Leu 2555 2560 2565 Gln Asn Arg Arg Gln Gln Leu Asn Glu Met Leu Lys Asp Ser Thr 2570 2575 2580 Gln Trp Leu Glu Ala Lys Glu Glu Ala Glu Gln Val Leu Gly Gln 2585 2590 2595 Ala Arg Ala Lys Leu Glu Ser Trp Lys Glu Gly Pro Tyr Thr Val 2600 2605 2610 Asp Ala Ile Gln Lys Lys Ile Thr Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys 2615 2620 2625 Asp Leu Arg Gln Trp Gln Thr Asn Val Asp Val Ala Asn Asp Leu 2630 2635 2640 Ala Leu Lys Leu Leu Arg Asp Tyr Ser Ala Asp Asp Thr Arg Lys 2645 2650 2655 Val His Met Ile Thr Glu Asn Ile Asn Ala Ser Trp Arg Ser Ile 2660 2665 2670 His Lys Arg Val Ser Glu Arg Glu Ala Ala Leu Glu Glu Thr His 2675 2680 2685 Arg Leu Leu Gln Gln Phe Pro Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala 2690 2695 2700 Trp Leu Thr Glu Ala Glu Thr Thr Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala 2705 2710 2715 Thr Arg Lys Glu Arg Leu Leu Glu Asp Ser Lys Gly Val Lys Glu 2720 2725 2730 Leu Met Lys Gln Trp Gln Asp Leu Gln Gly Glu Ile Glu Ala His 2735 2740 2745 Thr Asp Val Tyr His Asn Leu Asp Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu 2750 2755 2760 Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg 2765 2770 2775 Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser 2780 2785 2790 Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu Ala Ser Ser Asp Gln Trp Lys 2795 2800 2805 Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu 2810 2815 2820 Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile Gly Gly Asp Phe 2825 2830 2835 Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala Phe Lys Arg 2840 2845 2850 Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr 2855 2860 2865 Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys 2870 2875 2880 Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln 2885 2890 2895 Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr 2900 2905 2910 Glu Trp Glu Lys Leu Asn Leu His Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys 2915 2920 2925 Ile Asp Glu Thr Leu Glu Arg Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr 2930 2935 2940 Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly 2945 2950 2955 Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp 2960 2965 2970 His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu 2975 2980 2985 Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr 2990 2995 3000 Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu 3005 3010 3015 Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp 3020 3025 3030 Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala 3035 3040 3045 Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg 3050 3055 3060 Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr 3065 3070 3075 Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln 3080 3085 3090 Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr 3095 3100 3105 Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu 3110 3115 3120 Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu 3125 3130 3135 Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys 3140 3145 3150 Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu Glu Gln Glu His Asn Asn Leu 3155 3160 3165 Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu 3170 3175 3180 Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Arg Ile Arg Val Leu Ser 3185 3190 3195 Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala His Leu Glu Asp 3200 3205 3210 Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Gln Val Ala Ser Ser Thr Gly Phe 3215 3220 3225 Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu Leu Leu His Asp Ser Ile Gln 3230 3235 3240 Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn 3245 3250 3255 Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys 3260 3265 3270 Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu 3275 3280 3285 Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val Ala Ala 3290 3295 3300 Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu 3305 3310 3315 Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His Phe Asn 3320 3325 3330 Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys 3335 3340 3345 Gly His Lys Met His Tyr Pro Met Val Glu Tyr Cys Thr Pro Thr 3350 3355 3360 Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn 3365 3370 3375 Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg Met Gly 3380 3385 3390 Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr 3395 3400 3405 Pro Val Thr Leu Ile Asn Phe Trp Pro Val Asp Ser Ala Pro Ala 3410 3415 3420 Ser Ser Pro Gln Leu Ser His Asp Asp Thr His Ser Arg Ile Glu 3425 3430 3435 His Tyr Ala Ser Arg Leu Ala Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser 3440 3445 3450 Tyr Leu Asn Asp Ser Ile Ser Pro Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu 3455 3460 3465 His Leu Leu Ile Gln His Tyr Cys Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser 3470 3475 3480 Pro Leu Ser Gln Pro Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu 3485 3490 3495 Glu Ser Glu Glu Arg Gly Glu Leu Glu Arg Ile Leu Ala Asp Leu 3500 3505 3510 Glu Glu Glu Asn Arg Asn Leu Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys 3515 3520 3525 Gln Gln His Glu His Lys Gly Leu Ser Pro Leu Pro Ser Pro Pro 3530 3535 3540 Glu Met Met Pro Thr Ser Pro Gln Ser Pro Arg Asp Ala Glu Leu 3545 3550 3555 Ile Ala Glu Ala Lys Leu Leu Arg Gln His Lys Gly Arg Leu Glu 3560 3565 3570 Ala Arg Met Gln Ile Leu Glu Asp His Asn Lys Gln Leu Glu Ser 3575 3580 3585 Gln Leu His Arg Leu Arg Gln Leu Leu Glu Gln Pro Gln Ala Glu 3590 3595 3600 Ala Lys Val Asn Gly Thr Thr Val Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu 3605 3610 3615 Gln Arg Ser Asp Ser Ser Gln Pro Met Leu Leu Arg Val Val Gly 3620 3625 3630 Ser Gln Thr Ser Asp Ser Met Gly Glu Glu Asp Leu Leu Ser Pro 3635 3640 3645 Pro Gln Asp Thr Ser Thr Gly Leu Glu Glu Val Met Glu Gln Leu 3650 3655 3660 Asn Asn Ser Phe Pro Ser Ser Arg Gly Arg Asn Thr Pro Gly Lys 3665 3670 3675 Pro Met Arg Glu Asp Thr Met 3680 3685 <210> 93 <211> 335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; mutant spc5-12 promoter <400> 93 agaggccgtc cgccctcggc accatcctca cgacacccaa atatggcgac gggtgaggaa 60 tggtggggag ttatttttag agcggtgagg aaggtgggca ggcagcaggt gttggcgctc 120 catatttggc gggagttatt tttagagcgg aggaatggtg gacacccaaa tatggcgacg 180 gttcctcacc cgtcgctaaa aataactccg tgtccgccct cggccggggc cgcattcctg 240 ggggccgggc ggtgctcccg cccgcctcga taaaaggctc cggggccggc ggcggcccac 300 gagctacccg gaggagcggg aggcgccaag cggaa 335 <210> 94 <211> 328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; mutant spc5-12 promoter <400> 94 ggccgtccgc cctcggcacc atcctcacga cacccaaata tggcgacggg tgaggaatgg 60 tggggagtta tttttagagc ggtgaggaag gtgggcaggc agcaggtgtt gggggagtta 120 tttttagagc ggggagttat ttttagagcg gaggaatggt ggacacccaa atatggcgac 180 ggttcctcac ggacacccaa atatggcgac gggccctcgg ccggggccgc attcctgggg 240 gccgggcggt gctcccgccc gcctcgataa aaggctccgg ggccggcggc ggcccacgag 300 ctacccggag gagcgggagg cgccaagc 328

Claims (31)

  1. 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스트로핀병증의 치료에서 사용하기 위한 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물이 치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고,
    rAAV 입자는 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성된 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 인공 게놈을 포함하고, ABD는 디스트로핀의 액틴 결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 근육에서 발현을 촉진하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결되고 AAV ITR 서열이 측면에 있는, α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하며;
    rAAV 입자의 치료 유효량은 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되는, 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, CT가 디스트로핀의 C-말단의 근위 194개 아미노산 또는 적어도 서열 번호 92(UniProtKB-P11532)의 인간 디스트로핀 아미노산 잔기 3361-3554를 암호화하는 C-말단의 근위 부분 또는 적어도 엑손 70 내지 74에 의해 암호화된 C-말단의 근위 부분 및 엑손 75의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열의 처음 36개 아미노산을 포함하거나 이로 구성된, 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 20의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 79의 아미노산 서열을 갖는, 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 81의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 약학 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 특이적 프로모터가 SPc5-12 또는 이의 전사 활성 부분 또는 돌연변이체인, 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 프로모터가 서열 번호 39의 핵산 서열로 구성된, 약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이식유전자가 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 3'의 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 약학 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 게놈이 서열 번호 53의 핵산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 AAV8 혈청형인, 약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 디스트로핀병증이 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근이영양증(BMD) 또는 X-연관 확장성 심근병증인, 약학 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자의 치료 유효량이 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 투여되는, 약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자가 AAV8-RGX-DYS1이고, 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 투여되는, 약학 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 후 12주, 24주, 1년 또는 2년까지, 다음과 같은, 약학 조성물:
    a. 대상체의 크레아틴 키나제 활성이 상기 투여 전 수준 대비 대상체에서 0.5배 내지 1.5배 감소되고;
    b. 자기 공명 영상화(MRI)에 의해 평가되는 대상체의 비복근 병변이 상기 투여 전 비복근 병변과 비교하여 3-10% 감소했고;
    c. 대상체의 비복근 부피가 상기 투여 전 비복근 부피와 비교하여 20 내지 100 mm3 감소했고;
    d. 대상체의 비복근 병변의 T2-이완 시간이 상기 투여 전 T2-이완 시간과 비교하여 2 내지 8밀리초 감소했고;
    e. 대상체가 약 -1 내지 2의 보행 점수를 나타냈고;
    f. 대상체에 대한 북극성 이동 평가(NSAA) 점수가 상기 투여 전 NSAA 점수와 비교하여 0에서 1까지, 0에서 2까지, 또는 1에서 2까지로 증가했고;
    g. 대상체가 일어서는 데, 10미터를 뛰는/걷는 데, 및/또는 4개 계단을 올라가는 데 걸리는 시간의 양이 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30% 감소했고;
    h. 대상체가 상기 투여 전 심장 기능과 비교하여 개선된 심장 기능을 나타냈고/냈거나;
    i. 대상체가 상기 투여 전 심장 기능과 비교하여 개선된 폐 기능을 나타냈음.
  16. 염증 및/또는 섬유증 감소를 필요로 하는 대상체의 근육에서 염증 및/또는 섬유증을 감소시키기 위한 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물이 치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고,
    rAAV 입자는 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성된 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 인공 게놈을 포함하고, ABD는 디스트로핀의 액틴 결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 근육에서 발현을 촉진하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결되고 AAV ITR 서열이 측면에 있는, α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하고;
    rAAV 입자의 치료 유효량은 킬로그램당 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피(GC/kg)의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되고;
    투여는 대상체의 근육에 대한 마이크로디스트로핀 단백질의 전달을 초래하는, 약학 조성물.
  17. 근육 변성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 근육 변성을 감소시키는 데 사용하기 위한 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물이 치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고,
    rAAV 입자가 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성된 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 인공 게놈을 포함하고, ABD는 디스트로핀의 액틴-결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 근육에서 발현을 촉진하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결되고 AAV ITR 서열이 측면에 있는, α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하고;
    rAAV 입자의 치료 유효량은 킬로그램당 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피(GC/kg)의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되고,
    투여는 대상체의 근육에 대한 마이크로디스트로핀 단백질의 전달을 초래하는, 약학 조성물.
  18. 보행 변경을 필요로 하는 대상체에서 보행을 변경하는 데 사용하기 위한 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물이 치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고,
    rAAV 입자는 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성된 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 인공 게놈을 포함하고, ABD는 디스트로핀의 액틴-결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 근육에서 발현을 촉진하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결되고 AAV ITR 서열이 측면에 있는, α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하고;
    rAAV 입자의 치료 유효량은 킬로그램당 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피(GC/kg)의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되고;
    대상체의 보행은 상기 투여 전 대상체의 보행과 비교하여 상기 투여 12주 후 변경되는, 약학 조성물.
  19. 치료를 필요로 하는 대상체에서 디스트로핀병증 치료, 근육의 염증 및/또는 섬유증 감소, 근육 변성 감소 또는 보행 변경에서 사용하기 위한 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물이 치료 유효량의 arAAV 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고,
    rAAV 입자는 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 디스트로핀 도메인: ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT로 구성된 마이크로디스트로핀 단백질을 암호화하는 이식유전자를 포함하는 인공 게놈을 포함하고, ABD는 디스트로핀의 액틴-결합 도메인이고, H1은 디스트로핀의 힌지 1 영역이고, R1은 디스트로핀의 스펙트린 1 영역이고, R2는 디스트로핀의 스펙트린 2 영역이고, R3은 디스트로핀의 스펙트린 3 영역이고, H3은 디스트로핀의 힌지 3 영역이고, R24는 디스트로핀의 스펙트린 24 영역이고, H4는 디스트로핀의 힌지 4 영역이고, CR은 디스트로핀의 시스테인 풍부 영역이고, CT는 근육에서 발현을 촉진하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결되고 AAV ITR 서열이 측면에 있는, α1-신트로핀 결합 부위를 포함하는 CT의 적어도 일부를 포함하고;
    rAAV 입자의 치료 유효량은 킬로그램당 5x1013 내지 1x1015 게놈 카피(GC/kg)의 용량으로 정맥내 또는 근육내 투여되고;
    투여는 모세관 기반 웨스턴 검정에 의해 결정된 바와 같이 상기 투여 12주 후 대상체의 근육 조직에서 50 ng/mg 초과의 마이크로디스트로핀 단백질을 생성하는, 약학 조성물.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, CT가 디스트로핀의 C-말단의 근위 194개 아미노산 또는 적어도 서열 번호 92(UniProtKB-P11532)의 인간 디스트로핀 아미노산 잔기 3361-3554을 암호화하는 C-말단의 근위 부분 또는 적어도 엑손 70 내지 74에 의해 암호화된 C-말단의 근위 부분 및 엑손 75의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열의 처음 36개 아미노산을 포함하거나 이로 구성된, 약학 조성물.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는, 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 마이크로디스트로핀 단백질이 서열 번호 20의 핵산 서열에 의해 암호화된, 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 전사 조절 요소가 근육 특이적 프로모터를 포함하는, 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 프로모터가 서열 번호 39의 핵산 서열로 구성된, 약학 조성물.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 게놈이 서열 번호 53의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 약학 조성물.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 AAV8 혈청형인, 약학 조성물.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 입자의 치료 유효량이 1x1014 게놈 카피/kg, 2x1014 게놈 카피/kg 또는 3x1014 게놈 카피/kg의 용량으로 정맥내 투여되는, 약학 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 입자의 상기 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 상기 대상체에 면역억제 치료법을 예방적으로 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 면역억제 치료법이 프레드니솔론, 에쿨리주맙 또는 시롤리무스, 또는 이의 조합인, 약학 조성물.
  30. 치료 유효량의 재조합 아데노 관련 벡터(rAAV) 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로서, rAAV 입자가 서열 번호 53의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인공 게놈을 포함하는 재조합 AAV8인, 약학 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체가 0.2 g/L 염화칼륨, 0.2 g/L 일염기성 인산칼륨, 1.2 g/L 이염기성 인산나트륨 무수물, 5.8 g/L 염화나트륨, 40 g/L 수크로스 및 0.01 g/L 폴록사머 188, pH 7.4를 포함하는 수크로스 완충액을 포함하는 변형된 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS)를 포함하는, 약학 조성물.
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