TW202309293A - 用於治療肌縮蛋白症(dystrophinopathy)之微小肌縮蛋白基因療法給藥 - Google Patents

用於治療肌縮蛋白症(dystrophinopathy)之微小肌縮蛋白基因療法給藥 Download PDF

Info

Publication number
TW202309293A
TW202309293A TW111115911A TW111115911A TW202309293A TW 202309293 A TW202309293 A TW 202309293A TW 111115911 A TW111115911 A TW 111115911A TW 111115911 A TW111115911 A TW 111115911A TW 202309293 A TW202309293 A TW 202309293A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
aav
myosin
seq
pharmaceutical composition
muscle
Prior art date
Application number
TW111115911A
Other languages
English (en)
Inventor
奧利斐爾 達諾斯
金宣廷
尼可拉斯 巴斯
曄 劉
春平 喬
米歇爾 菲歇拉
希倫 帕托
Original Assignee
美商銳進科斯生物股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商銳進科斯生物股份有限公司 filed Critical 美商銳進科斯生物股份有限公司
Publication of TW202309293A publication Critical patent/TW202309293A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4707—Muscular dystrophy
    • C07K14/4708—Duchenne dystrophy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Abstract

本發明提供藉由給藥治療有效劑量之含有編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的重組腺相關病毒(rAAV)來治療或改善肌縮蛋白症(諸如杜興氏肌肉失養症及貝氏肌肉失養症)之症狀的方法。

Description

用於治療肌縮蛋白症(DYSTROPHINOPATHY)之微小肌縮蛋白基因療法給藥
本發明係關於藉由給藥一定劑量之基因療法載體來治療肌縮蛋白症，諸如AAV基因療法載體，其中轉殖基因編碼微小肌縮蛋白。
一組稱為肌縮蛋白症之神經肌肉疾病係由 DMD基因突變引起。每種肌縮蛋白症具有不同表型，其中所有患者均罹患肌無力且最終罹患嚴重程度不等的心肌病。杜興氏肌肉失養症(DMD)為嚴重的、X性聯、進行性神經肌肉疾病，其影響約3,600至9,200名活男性新生兒中之一名。該病症係由消除肌縮蛋白蛋白質之表現的肌縮蛋白基因中之框移突變引起。因為缺乏肌縮蛋白蛋白質，骨胳肌肉及最終心臟及呼吸道肌肉(例如，肋間肌肉及隔膜)退化，從而引起過早死亡。進行性無力及肌肉萎縮始於兒童時期。受影響個體經歷呼吸困難、呼吸道感染及吞咽問題。幾乎所有DMD患者將罹患心肌病。因心臟受累加重之肺炎為最頻繁死亡原因，其通常在三十歲之前發生。
貝氏肌肉失養症(BMD)之症狀不如DMD嚴重，但仍會引起過早死亡。與DMD相比，BMD之特徵在於遲發性骨胳肌肉無力。雖然DMD患者在13歲之前依賴輪椅，但患有BMD之患者在16歲之後無法行走且需要輪椅。與DMD患者不同，BMD患者亦展現出頸部屈肌力量之保留。儘管骨胳肌肉受累較輕，但由DMD相關性擴張型心肌症(DCM)引起之心臟衰竭為常見發病原因及BMD中最常見死亡原因，其平均發生於40歲中期。
肌縮蛋白為由 DMD基因編碼之細胞質蛋白，且用於將細胞骨架肌動蛋白絲連接至膜蛋白。通常，主要位於骨骼及心臟肌肉中，較小量表現於大腦中之肌縮蛋白蛋白質藉由將收縮裝置之肌動蛋白連接至包圍各肌纖維之結締組織層而在肌纖維收縮期間充當減震器。在肌肉中，肌縮蛋白侷限於肌纖維膜之細胞質面處。
DMD基因為最大已知的人類基因。引起DMD或BMD之最常見突變為一或多個外顯子之較大缺失突變(60-70%)，但複製突變(5-10%)及單核苷酸變體(包括小缺失或插入、單鹼基變化及剪接位點變化，佔患有DMD之男性的約25-35%病原變異體及約患有BMD之10-20%男性)亦可產生病原肌縮蛋白變異體。在DMD中，突變通常引起框移，從而產生過早終止密碼子及截短、無功能或不穩定蛋白質。無意義點突變亦可產生具有相同結果之過早終止密碼子。雖然導致DMD之突變可影響任何外顯子，但外顯子2-20及45-55為用於大量缺失及重複突變之共同熱點。框內缺失導致不太嚴重之貝氏肌肉失養症(BMD)，其中患者表現截短之部分功能性肌縮蛋白。
全長肌縮蛋白為大(427 kDa)蛋白質，其包含多個益於其功能的亞域。此等亞域按胺基端朝向羧基端之順序包括N端肌動蛋白結合域、中央所謂的「桿狀」域、富含半胱胺酸之域及最後為羧基端域或區域。桿狀域由按以下順序之4個富含脯胺酸之鉸鏈域(簡稱為H)及24個血影蛋白樣重複區(簡稱為R)構成：第一鉸鏈域(H1)、3個血影蛋白樣重複區(R1、R2、R3)、第二鉸鏈域(H2)、16個更高血影蛋白樣重複區(R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19)、第三鉸鏈域(H3)、5個更高血影蛋白樣重複區(R20、R21、R22、R23、R24)及第四鉸鏈域(H4) (包括WW域)。在桿狀域之後為富含半胱胺酸之域及COOH (C)端(CT)域。
隨著使用腺相關病毒(AAV)介導之基因療法以可能治療各種罕見疾病的發展，希望且關注的是，AAV可用於治療DMD、BMD及不太嚴重的肌縮蛋白症。由於對AAV載體之有效負載尺寸的限制，注意力集中於產生微肌縮蛋白或小肌縮蛋白，消除非必需亞域同時維持全長蛋白質之至少一些功能的較小形式之肌縮蛋白。 mdx小鼠(DMD之動物模型)中之AAV介導之微小肌縮蛋白基因療法報導為展現出肌肉中之有效表現及改善之肌肉功能(參見例如Wang等人., J. Orthop. Res. 27:421 (2009))。
因此，此項技術中需要給藥治療有效治療或改善肌縮蛋白症，包括DMD或BMD之症狀，且較佳使對治療蛋白之免疫反應降至最低之劑量的編碼微小肌縮蛋白之AAV載體的方法。
本發明提供藉由給藥含有編碼微小肌縮蛋白之核酸基因體(由載體產生，其中如本文所用之「構築體」大體上描述形成微小肌縮蛋白之肌縮蛋白蛋白質次單元的排列，且可包括控制微小肌縮蛋白表現的調節元件，包括在用於產生重組AAV粒子之順式質體及封裝於AAV粒子中之重組基因體中)，諸如 圖 2中之彼等重組基因體的rAAV載體粒子來治療或改善肌縮蛋白症之症狀的方法。基於藥理學研究，例如如本文在實例6、7及8 (章節6.6、6.7及6.8，見下文)中所描述，本發明提供藉由給藥(包括周邊給藥，諸如靜脈內給藥)治療上有效劑量來治療有需要之個體的方法及編碼用於基因療法之微小肌縮蛋白蛋白質之基因構築體的用途。基於本文所描述之活體內藥理學研究，給藥本發明之微小肌縮蛋白基因療法的方法在給藥之後至少12週、26週或52週產生肌縮蛋白症疾病之症狀及生物標記物的改善，諸如肌酸激酶活性、腓肚肌病變、肌肉病變之T2-鬆弛時間、北極星移動評量表(NSAA)評分及活動性及肌肉力量、心臟功能及肺部功能之其他標記物。
本文所描述之實施例為治療個體之肌縮蛋白症的方法，其包含向該個體給藥包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物，其中該rAAV粒子包含編碼具有胺基端至羧基端之微小肌縮蛋白蛋白質的轉殖基因： ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT 其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域或結合β-肌萎縮蛋白聚糖之其至少一部分及CT為肌縮蛋白之C端區域的至少一部分，其中該部分包含α1-互生蛋白(syntrophin)結合位點及/或α-短肌營養蛋白(dystrobrevin)結合位點。在某些實施例中，該CT域包含以下或由以下組成：肌縮蛋白之C端的近端194個胺基酸(SEQ ID NO: 16之胺基酸序列)或編碼SEQ ID NO:92 (UniProtKB-P11532)之人類肌縮蛋白胺基酸殘基3361-3554之C端的至少近端部分或由外顯子70至74編碼之C端的至少近端部分及由外顯子75之核苷酸序列編碼之胺基酸序列的前36個胺基酸。或者，CT域經截短且包含α1-互生蛋白結合位點但不包含α-短肌營養蛋白結合位點，諸如SEQ ID NO: 83之胺基酸序列。構築體包括調節序列，諸如肌肉特異性啟動子序列，包括SPc5-12啟動子(SEQ ID NO:39)或可替代地，經截短SPc5-12啟動子(SEQ ID NO: 40)或SPc5-12啟動子變異體、突變體或其轉錄活性部分(諸如，經修飾Spc5-12啟動子Spc5v1 (SEQ ID NO:93)或Spc5v2 (SEQ ID NO:94))及聚腺苷酸化訊號序列，諸如小polyA訊號序列(SEQ ID NO:42)。特異性構築體包括RGX-DYS1及RGX-DYS5 (參見 圖 2)具有分別編碼SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:81之核苷酸序列，可操作地連接至調節序列及由AAV2 ITR序列側接的微小肌縮蛋白，其中包括重組基因體之全部構築體分別具有SEQ ID NO:53或82之核苷酸序列。含有重組基因體之rAAV粒子在實施例中為AAV8。舉例而言，rAAV粒子或基因療法載體為AAV8-RGX-DYS1 (重組AAV8，其包含具有核苷酸序列SEQ ID NO: 53之聚核苷酸)。
在某些實施例中，治療有效量之包含編碼本文所揭示之微小肌縮蛋白(在實施例中，包括AAV8-RGX-DYS1)之轉殖基因的rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/kg，包括1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量靜脈內或肌肉內給藥。在某些實施例中，治療有效量之包含編碼本文所揭示之微小肌縮蛋白(包括AAV8-RGX-DYS1)之轉殖基因的rAAV粒子係以1×10 14、1.1×10 14、1.2×10 14、1.3×10 14、1.4×10 14、1.5×10 14、1.6×10 14、1.7×10 14、1.8×10 14、1.9×10 14、2×10 14、2.1×10 14、2.2×10 14、2.3×10 14、2.4×10 14、2.5×10 14、2.6×10 14、2.7×10 14、2.8×10 14、2.9×10 14或3×10 14個基因體複本/kg之劑量靜脈內或肌肉內給藥。在某些實施例中，治療有效量之rAAV粒子(包括AAV8-RGX-DYS1)係以1×10 14個基因體複本/kg之劑量靜脈內給藥。在某些實施例中，治療有效量之rAAV粒子(包括AAV8-RGX-DYS1)係以2×10 14個基因體複本/kg之劑量靜脈內給藥。在另其他實施例中，治療有效量之rAAV粒子(包括AAV8-RGX-DYS1)係以3×10 14個基因體複本/kg之劑量靜脈內給藥。在實施例中，給藥治療劑之個體係在給藥具有編碼本文所揭示之微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV粒子之前、同時及/或之後，包括作為維持療法來預防性給藥免疫抑制劑。免疫抑制劑包括皮質類固醇、抗補體藥劑(諸如抗C3及C5抗體)、抗細胞介素藥劑(諸如抗細胞介素抗體，諸如抗IL-6及抗IL6R抗體、抗CD20抗體、抗C5與抗CD20抗體之組合)、雷帕黴素(rapamycin)或抗IgG療法，諸如裂解酶(imlifidase)。在實施例中，伴隨免疫抑制方案包括在給藥微小肌縮蛋白及視情況給藥口服西羅莫司(sirolimus)(亦稱為雷帕黴素；RAPAMUNE ®)之前及之後口服普賴蘇穠(prednisolone)之每日劑量及/或艾庫組單抗(eculizumab)(抗C5抗體；SOLIRIS ®)之劑量。
在某些實施例中，該醫藥學上可接受之載劑包含經改良達爾伯克磷酸鹽緩衝鹽水(modified Dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS)與蔗糖緩衝液，包含0.2 g/L氯化鉀、0.2 g/L磷酸二氫鉀、1.2 g/L無水磷酸氫二鈉、5.8 g/L氯化鈉、40 g/L蔗糖及0.01 g/L泊洛沙姆188，pH 7.4。
亦提供包含編碼本文所提供之微小肌縮蛋白之重組載體的醫藥組合物，包括具有醫藥學上可接受之賦形劑及針對任何肌縮蛋白症，諸如杜興氏肌肉失養症(DMD)及貝氏肌肉失養症(BMD)、X性聯擴張型心肌症以及DMD或BMD雌性載體之治療方法，其藉由向有需要之個體給藥本文所描述之基因療法載體(包括AAV8-RGX-DYS1)，包括在5×10 13至1×10 15個基因體複本/kg，包括1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量下靜脈內給藥。本發明提供藉由向有需要之個體給藥，藉由給藥含有本文所描述之轉殖基因或基因卡匣(包括AAV8-RGX-DYS1)的rAAV，以使得將微小肌縮蛋白遞送至肌肉(包括骨胳肌肉、心肌及/或平滑肌)來治療肌縮蛋白症，諸如杜興氏肌肉失養症(DMD)及貝氏肌肉失養症(BMD)，X性聯擴張型心肌症、改善其症狀或管理該等疾病的方法。在特定實施例中，rAAV全身性給藥，包括靜脈內或肌肉內。
亦提供降低有需要之個體之肌肉中的炎症或纖維化及/或肌肉退化之方法，其包含給藥一或多種所揭示之醫藥組合物。
本發明藉助於下文實例說明，其描述構築及產生微小肌縮蛋白載體及證實有效性之活體外及活體內分析。 3.1 本發明的實施例1.一種用於治療有需要之個體之肌縮蛋白症的方法，該方法包含向該個體給藥醫藥組合物，其包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑， 其中該rAAV粒子包含編碼微小肌縮蛋白蛋白質之轉殖基因，該微小肌縮蛋白蛋白質由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分，及 其中該治療有效量之該rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/kg之劑量靜脈內或肌肉內給藥。 2.如實施例1之方法，其中該CT包含以下或由以下組成：肌縮蛋白之C端的近端194個胺基酸或編碼SEQ ID NO:92 (UniProtKB-P11532)之人類肌縮蛋白胺基酸殘基3361-3554之C端的至少近端部分或由外顯子70至74編碼之C端的至少近端部分及由外顯子75之核苷酸序列編碼之胺基酸序列的前36個胺基酸。 3.如實施例1或2之方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列。 4.如實施例3之方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質係由SEQ ID NO: 20之核酸序列編碼。 5.如實施例1之方法，其中該CT包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:83之胺基酸序列或包含α1-互生蛋白結合位點但不包含短肌營養蛋白結合位點之胺基酸序列。 6.如實施例1或5之方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO:79之胺基酸序列。 7.如實施例6之方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質係由SEQ ID NO:81之核酸序列編碼。 8.如實施例1-7中任一項之方法，其中該轉殖基因進一步包含促進在肌肉中表現、可操作地連接至編碼微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的轉譯調節元件。 9.如實施例8之方法，其中該轉譯調節元件包含肌肉特異性啟動子。 10.如實施例9之方法，其中該肌肉特異性啟動子為骨骼、平滑或心肌特異性啟動子。 11.如實施例9或10中任一項之方法，其中該肌肉特異性啟動子為SPc5-12或其轉錄活性部分或突變體。 12.如實施例11之方法，其中該啟動子由SEQ ID NO: 39之核酸序列組成。 13.如實施例1-12中任一項之方法，其中該轉殖基因包含在編碼該微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的3'的聚腺苷酸化訊號。 14.如實施例1-13中任一項之方法，其中該轉殖基因包含在啟動子與微小肌縮蛋白編碼序列之間的內含子序列。 15.如實施例14之方法，其中該內含子序列為VH4內含子序列(SEQ ID NO:41) 16.如實施例1-4及8-13中任一項之方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 53之核酸序列。 17.如實施例1及5-13中任一項之方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 82之核酸序列。 18.如實施例1至17中任一項之方法，其中該rAAV粒子具有包含與SEQ ID NO:77具有至少95%一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白。 19.如實施例18之方法，其中該rAAV為AAV8血清型。 20.如實施例1-19中任一項之方法，其中該肌縮蛋白症為杜興氏肌肉失養症(DMD)、貝氏肌肉失養症(BMD)或X性聯擴張型心肌病變。 21.如實施例1-20中任一項之方法，其中該治療有效量之該rAAV粒子係以1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量給藥。 22.如實施例1-21中任一項之方法，其中該醫藥組合物經靜脈內給藥。 23.如實施例1-22中任一項之方法，其中截至給藥之後12週、24週、1年或2年，該個體之肌酸激酶活性相對於在該給藥之前的含量降低。 24.如實施例23之方法，其中肌酸激酶活性降低0.5倍至1.5倍。 25.如實施例23之方法，其中肌酸激酶活性降低為3000至10000個肌酸激酶單元/公升。 26.如實施例1-25中任一項之方法，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體之腓肚肌中之病變與在該給藥之前腓肚肌中之病變相比降低。 27.如實施例26之方法，其中使用磁共振成像(MRI)評定該個體之腓肚肌中之病變。 28.如實施例26-27中任一項之方法，其中在給藥之後腓肚肌中之病變與在該給藥之前該腓肚肌中之病變相比降低約3-10%。 29.如實施例1-28中任一項之方法，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體之腓肚肌體積與在該給藥之前腓肚肌體積相比降低。 30.如實施例29之方法，其中該腓肚肌體積降低20至100 mm 3。 31.如實施例1-30中任一項之方法，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，肌肉中之病變的T2-鬆弛時間與在該給藥之前該T2-鬆弛時間相比降低。 32.如實施例31之方法，其中該降低為2至8毫秒。 33.如實施例31-32中任一項之方法，其中肌肉中之病變為腓肚肌中之病變。 34.如實施例1-33中任一項之方法，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體展現出約-1至2之步態評分。 35.如實施例34之方法，其中截至給藥醫藥組合物之後12週，該個體展現出約1之步態評分。 36.如實施例1-35中任一項之方法，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，北極星移動評量表(NSAA)評分與在該給藥之前該NSAA評分相比增加。 37.如實施例36之方法，其中該增加為0至1、0至2或1至2。 38.如實施例1-37中任一項之方法，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體站立、跑步/步行一確定距離、爬一定數量的樓梯所花費的時間量降低。 39.如實施例38之方法，其中該確定距離為10公尺。 40.如實施例38-39中任一項之方法，其中該一定數量的樓梯為4階。 41.如實施例38-40中任一項之方法，其中站立所需時間量之降低與該給藥之前相比為至少5%、10%、20%或30%降低。 42.如實施例38-41中任一項之方法，其中跑步/步行一確定距離所花費的時間量降低與該給藥之前相比為至少5%、10%、20%或30%降低。 43.如實施例38-42中任一項之方法，其中爬一定數量的樓梯所花費的時間量降低與該給藥之前相比為至少5%、10%、20%或30%降低。 44.如實施例1-43中任一項之方法，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體展現出與在該給藥之前的心臟功能相比之心臟功能改善。 45.如實施例1-44中任一項之方法，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體展現出與在該給藥之前的肺部功能相比之肺部功能改善。 46.一種降低有需要之個體之肌肉中之炎症及/或纖維化的方法，其包含： 向該個體給藥包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物； 其中該rAAV粒子包含含有編碼微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的基因表現盒； 其中該微小肌縮蛋白蛋白質由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域，CT包含肌縮蛋白之全部C端或含有α1-互生蛋白結合位點及短肌營養蛋白結合位點之CT的一部分； 其中該治療有效量之該rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/公斤(GC/kg)之劑量靜脈內或肌肉內給藥；及 其中該給藥使得該微小肌縮蛋白蛋白質遞送至該個體之肌肉中。 47.一種降低有需要之個體之肌肉退化的方法，其包含： 向該個體給藥包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物； 其中該rAAV粒子包含含有編碼微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的基因表現盒， 其中該微小肌縮蛋白蛋白質包含或由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域，CT包含肌縮蛋白之全部C端或含有α1-互生蛋白結合位點及短肌營養蛋白結合位點之CT的一部分； 其中該治療有效量之該rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/公斤(GC/kg)之劑量靜脈內或肌肉內給藥；及 其中該給藥使得該微小肌縮蛋白蛋白質遞送至該個體之肌肉中。 48.如實施例46或47之方法，其中該肌肉為個體之隔膜。 49.一種改變有需要之個體之步態的方法，其包含： 向該個體給藥包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物， 其中該rAAV粒子包含含有編碼微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的基因表現盒； 其中該微小肌縮蛋白蛋白質包含或由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分， 其中該治療有效量之rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/公斤(GC/kg)之劑量靜脈內或肌肉內給藥；及 其中在該給藥之後12週時，該個體之該步態與在該給藥之前該個體之該步態相比得以改變。 50.如實施例49之方法，其中改變該步態包含增加平衡、改變步長、減少頭部移動或其組合。 51.如實施例46-50中任一項之方法，其中該CT包含以下或由以下組成：肌縮蛋白之C端的近端194個胺基酸或編碼SEQ ID NO:92 (UniProtKB-P11532)之人類肌縮蛋白胺基酸殘基3361-3554之C端的至少近端部分或由外顯子70至74編碼之C端的至少近端部分及由外顯子75之核苷酸序列編碼之胺基酸序列的前36個胺基酸。 52.如實施例46-51中任一項之方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列。 53.如實施例52之方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質係由SEQ ID NO: 20之核酸序列編碼。 54.如實施例46-53中任一項之方法，其中該CT包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:83之胺基酸序列或包含α1-互生蛋白結合位點但不包含短肌營養蛋白結合位點之胺基酸序列。 55.如實施例46-54中任一項之方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO:79之胺基酸序列。 56.如實施例55之方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質係由SEQ ID NO:81之核酸序列編碼。 57.如實施例46-56中任一項之方法，其中該轉殖基因進一步包含促進在肌肉中表現、可操作地連接至編碼微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的轉譯調節元件。 58.如實施例57之方法，其中該轉譯調節元件包含肌肉特異性啟動子。 59.如實施例58之方法，其中該肌肉特異性啟動子為骨骼、平滑或心肌特異性啟動子。 60.如實施例58或59中任一項之方法，其中該肌肉特異性啟動子為SPc5-12或其轉錄活性部分或突變體。 61.如實施例58之方法，其中該啟動子由SEQ ID NO: 39之核酸序列組成。 62.如實施例46-61中任一項之方法，其中該轉殖基因包含在編碼該微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的3'的聚腺苷酸化訊號。 63.如實施例46-62中任一項之方法，其中該轉殖基因包含在啟動子與微小肌縮蛋白編碼序列之間的內含子序列。 64.如實施例63之方法，其中該內含子序列為VH4內含子序列(SEQ ID NO:41) 65.如實施例46-64中任一項之方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 53之核酸序列。 66.如實施例46-65中任一項之方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 82之核酸序列。 67.如實施例46-66中任一項之方法，其中該rAAV粒子具有包含與SEQ ID NO:77具有至少95%一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白。 68.如實施例67之方法，其中該rAAV為AAV8血清型。 69.如實施例46-68中任一項之方法，其中該治療有效量之該rAAV粒子係以1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量給藥。 70.如實施例46-69中任一項之方法，其中該醫藥組合物經靜脈內給藥。 71.如實施例1至70中任一項之方法，其進一步包含在該給藥該AAV粒子之前、與其同時及/或之後向該個體預防性給藥免疫抑制劑療法。 72.如實施例71中任一項之方法，其中該免疫抑制劑療法為皮質類固醇、抗C5抗體、抗IL6或抗IL6R抗體及抗CD20抗體、抗C5及抗CD20抗體之組合、雷帕黴素、裂解酶(imlifidase)或其組合。 73.一種用於治療有需要之個體之肌縮蛋白症的醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑， 其中該rAAV粒子包含含有編碼微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的基因表現盒； 其中該微小肌縮蛋白蛋白質包含或由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分；及 其中該治療有效量之rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/kg之劑量靜脈內或肌肉內給藥。 74.如實施例73之組合物，其中該CT包含以下或由以下組成：肌縮蛋白之C端的近端194個胺基酸或編碼SEQ ID NO:92 (UniProtKB-P11532)之人類肌縮蛋白胺基酸殘基3361-3554之C端的至少近端部分或由外顯子70至74編碼之C端的至少近端部分及由外顯子75之核苷酸序列編碼之胺基酸序列的前36個胺基酸。 75.如實施例73或74之組合物，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列。 76.如實施例75之組合物，其中該微小肌縮蛋白蛋白質係由SEQ ID NO: 20之核酸序列編碼。 77.如實施例73之組合物，其中該CT包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:83之胺基酸序列或包含α1-互生蛋白結合位點但不包含短肌營養蛋白結合位點之胺基酸序列。 78.如實施例73或77之組合物，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO:79之胺基酸序列。 79.如實施例78之組合物，其中該微小肌縮蛋白蛋白質係由SEQ ID NO:81之核酸序列編碼。 80.如實施例73-79中任一項之組合物，其中該轉殖基因進一步包含促進在肌肉中表現、可操作地連接至編碼微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的轉譯調節元件。 81.如實施例80之組合物，其中該轉譯調節元件包含肌肉特異性啟動子。 82.如實施例81之組合物，其中該肌肉特異性啟動子為骨骼、平滑或心肌特異性啟動子。 83.如實施例81或82中任一項之組合物，其中該肌肉特異性啟動子為SPc5-12或其轉錄活性部分或突變體。 84.如實施例83之組合物，其中該啟動子由SEQ ID NO: 39之核酸序列組成。 85.如實施例73-84中任一項之組合物，其中該轉殖基因包含在編碼該微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的3'的聚腺苷酸化訊號。 86.如實施例73-85中任一項之組合物，其中該轉殖基因包含在啟動子與微小肌縮蛋白編碼序列之間的內含子序列。 87.如實施例86之組合物，其中該內含子序列為VH4內含子序列(SEQ ID NO:41) 88.如實施例73-76及80-85中任一項之組合物，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 53之核酸序列。 89.如實施例73及77-85中任一項之組合物，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 82之核酸序列。 90.如實施例73-89中任一項之組合物，其中該rAAV粒子具有包含與SEQ ID NO:77具有至少95%一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白。 91.如實施例90之組合物，其中該rAAV為AAV8血清型。 92.如實施例73-91中任一項之組合物，其中該肌縮蛋白症為杜興氏肌肉失養症(DMD)、貝氏肌肉失養症(BMD)或X性聯擴張型心肌病變。 93.如實施例73-92中任一項之組合物，其中該治療有效量之該rAAV粒子係以1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量給藥。 94.如實施例73-93中任一項之組合物，其中該醫藥組合物經靜脈內給藥。 95.如實施例73-94中任一項之組合物，其中截至給藥之後12週、24週、1年或2年，該個體之肌酸激酶活性相對於在該給藥之前的含量降低。 96.如實施例95之組合物，其中肌酸激酶活性降低0.5倍至1.5倍。 97.如實施例95之組合物，其中肌酸激酶活性降低為3000至10000個肌酸激酶單元/公升。 98.如實施例73-97中任一項之組合物，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體之腓肚肌中之病變與在該給藥之前腓肚肌中之病變相比降低。 99.如實施例98之組合物，其中使用磁共振成像(MRI)評定該個體之腓肚肌中之病變。 100.如實施例98-99中任一項之組合物，其中在給藥之後腓肚肌中之病變與在該給藥之前該腓肚肌中之病變相比降低約3-10%。 101.如實施例73-100中任一項之組合物，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體之腓肚肌體積與在該給藥之前腓肚肌體積相比降低。 102.如實施例101之組合物，其中該腓肚肌體積降低20至100 mm 3。 103.如實施例73-102中任一項之組合物，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，肌肉中之病變的T2-鬆弛時間與在該給藥之前該T2-鬆弛時間相比降低。 104.如實施例103之組合物，其中該降低為2至8毫秒。 105.如實施例103-104中任一項之組合物，其中肌肉中之病變為腓肚肌中之病變。 106.如實施例73-105中任一項之組合物，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體展現出約-1至2之步態評分。 107.如實施例106之組合物，其中截至給藥醫藥組合物之後12週，該個體展現出約1之步態評分。 108.如實施例73-107中任一項之組合物，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，北極星移動評量表(NSAA)評分與在該給藥之前該NSAA評分相比增加。 109.如實施例108之組合物，其中該增加為0至1、0至2或1至2。 110.如實施例73-109中任一項之組合物，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體站立、跑步/步行一確定距離、爬一定數量的樓梯所花費的時間量降低。 111.如實施例110之組合物，其中該確定距離為10公尺。 112.如實施例110-111中任一項之組合物，其中該一定數量的樓梯為4階。 113.如實施例110-112中任一項之組合物，其中站立所需時間量之降低與該給藥之前相比為至少5%、10%、20%或30%降低。 114.如實施例110-113中任一項之組合物，其中跑步/步行一確定距離所花費的時間量降低與該給藥之前相比為至少5%、10%、20%或30%降低。 115.如實施例110-114中任一項之組合物，其中爬一定數量的樓梯所花費的時間量降低與該給藥之前相比為至少5%、10%、20%或30%降低。 116.如實施例73-115中任一項之組合物，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體展現出與在該給藥之前的心臟功能相比之心臟功能改善。 117.如實施例73-116中任一項之組合物，其中截至給藥醫藥組合物之後12週、24週、1年或2年，該個體展現出與在該給藥之前的肺部功能相比之肺部功能改善。 118.如實施例73至117中任一項之組合物，其進一步包含在該給藥該AAV粒子之前、與其同時及/或之後向該個體預防性給藥免疫抑制劑療法。 119.如實施例118之組合物，其中該免疫抑制劑療法為皮質類固醇、抗C5抗體、抗IL6或抗IL6R抗體及抗CD20抗體、抗C5及抗CD20抗體之組合、雷帕黴素、裂解酶(imlifidase)或其組合。 120.如實施例1至119中任一項之方法或組合物，其中向該個體給藥預防性免疫抑制方案。 121.如實施例120之方法或組合物，其中該預防性免疫抑制方案包含(1)第1天至第8週之口服普賴蘇穠的每日劑量；(2)在給藥該rAAV之前及之後艾庫組單抗之輸注；及(3)第-7天至第8週之每日口服西羅莫司，其中第1天為rAAV給藥當天。 122.如實施例121之方法或組合物，其中口服普賴蘇穠係以1 mg/kg/天自第1天直至第8週結束給藥，其中第1天為rAAV給藥當天，且隨後若未鑑別出安全性問題，則自第9週至第10週將劑量降低至0.5 mg/kg/天，且隨後若未鑑別出安全性問題，則自第11週至第12週將劑量降低至0.25 mg/kg/天。 123.如實施例121或122之方法或組合物，其中藉由輸注給藥艾庫組單抗(1)對於體重為10至＜20 kg之個體，600 mg艾庫組單抗在第-9天、第-2天、第4天及第12天；(2)對於體重為20 kg至＜30 kg之個體，800 mg艾庫組單抗在第-16天、第-9天、第-2天及第12天；(3)對於體重為30 kg至＜40 kg之個體，900 mg艾庫組單抗在第-16天、第-9天、第-2天及第12天；及(4)對於體重為大於或等於40 kg之個體，1200 mg艾庫組單抗在第-30天、第-23天、第-16天、第-9天、第-2天及第12天，其中第1天為rAAV給藥當天。 124.如實施例121至123中任一項之組合物或方法，其中該西羅莫司係以3 mg/m 2在第-7天給藥，以1 mg/m 2/天之劑量第-6天至第8週之每日分成2個劑量，以實現8-12 ng/ml之目標血液含量，若安全性測試保持穩定，則在第9-10週使該劑量降低至0.5 mg/m 2/天，且安全性測試保持穩定，則在第11-12週使該劑量降低至0.25 mg/m 2/天。 125.一種醫藥組合物，其包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑， 其中該rAAV粒子包含編碼微小肌縮蛋白蛋白質之轉殖基因，該微小肌縮蛋白蛋白質由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分，及 其中該治療有效量之該rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/kg之劑量靜脈內或肌肉內給藥。 126.一種醫藥組合物，其包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑，其中該rAAV粒子包含編碼微小肌縮蛋白蛋白質之轉殖基因，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列。 127.一種醫藥組合物，其包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑，其中該rAAV粒子為AAV8粒子且包含具有SEQ ID NO: 53之核苷酸序列的人工基因體。 128.如實施例125至127之方法，其中該醫藥學上可接受之載劑包含經改良達爾伯克磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)與蔗糖緩衝液，包含0.2 g/L氯化鉀、0.2 g/L磷酸二氫鉀、1.2 g/L無水磷酸氫二鈉、5.8 g/L氯化鈉、40 g/L蔗糖及0.01 g/L泊洛沙姆188，pH 7.4。 129.一種治療有需要之個體之肌縮蛋白症的方法，其包含向該個體靜脈內給藥如實施例125至128中任一項之醫藥組合物。 130.如實施例129之方法，其中該肌縮蛋白症為杜興氏肌肉失養症(DMD)、貝氏肌肉失養症(BMD)或X性聯擴張型心肌病變。 131.如實施例129-130中任一項之方法，其中該治療有效量之rAAV粒子係以1×10 14、1.1×10 14、1.2×10 14、1.3×10 14、1.4×10 14、1.5×10 14、1.6×10 14、1.7×10 14、1.8×10 14、1.9×10 14、2×10 14、2.1×10 14、2.2×10 14、2.3×10 14、2.4×10 14、2.5×10 14、2.6×10 14、2.7×10 14、2.8×10 14、2.9×10 14或3×10 14個基因體複本/kg之劑量給藥。 132.如實施例129-130中任一項之方法，其中該治療有效量之rAAV粒子係以1×10 14個基因體複本/kg之劑量給藥。 133.如實施例129-130中任一項之方法，其中該治療有效量之rAAV粒子係以2×10 14個基因體複本/kg之劑量給藥。 134.如實施例129-130中任一項之方法，其中該治療有效量之rAAV粒子係以3×10 14個基因體複本/kg之劑量給藥。 135.一種用於在有需要之個體中治療肌縮蛋白症、降低肌肉中之炎症及/或纖維化、降低肌肉退化或改變步態的醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量之rAAV粒子及醫藥學上可接受之載劑： 其中該rAAV粒子包含人工基因體，其包含編碼微小肌縮蛋白蛋白質之轉殖基因，該微小肌縮蛋白蛋白質由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分，該轉殖基因可操作地連接至促進在肌肉中表現的調節元件且側接AAV ITR序列； 其中該治療有效量之該rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/公斤(GC/kg)之劑量靜脈內或肌肉內給藥；及 其中該給藥使得大於50 ng/mg微小肌縮蛋白蛋白質遞送至該個體之肌肉中。 136.一種治療有需要之個體之肌縮蛋白症、降低肌肉中之炎症及/或纖維化、降低肌肉退化或改變步態的方法，該方法包含： 向該個體給藥包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物， 其中該rAAV粒子包含人工基因體，其包含編碼微小肌縮蛋白蛋白質之轉殖基因，該微小肌縮蛋白蛋白質由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分，該轉殖基因可操作地連接至促進在肌肉中表現的調節元件且側接AAV ITR序列； 其中該治療有效量之該rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/公斤(GC/kg)之劑量靜脈內或肌肉內給藥；及 其中該給藥在該個體之肌肉中產生大於50 ng/mg微小肌縮蛋白蛋白質。 137.如實施例135或136之組合物或方法，其中該個體之肌肉中之微小肌縮蛋白量係在給藥之後5週、10週、12週、20週或26週藉由基於毛細管之西方分析方法量測。 138.如實施例135至137之組合物或方法，其中該CT包含以下或由以下組成：肌縮蛋白之C端的近端194個胺基酸或編碼SEQ ID NO:92 (UniProtKB-P11532)之人類肌縮蛋白胺基酸殘基3361-3554之C端的至少近端部分或由外顯子70至74編碼之C端的至少近端部分及由外顯子75之核苷酸序列編碼之胺基酸序列的前36個胺基酸。 139.如實施例135-138中任一項之組合物或方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列。 140.如實施例139之組合物或方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質係由SEQ ID NO: 20之核酸序列編碼。 141.如實施例135-137之組合物或方法，其中該CT包含以下或由以下組成：SEQ ID NO:83之胺基酸序列或包含α1-互生蛋白結合位點但不包含短肌營養蛋白結合位點之胺基酸序列。 142.如實施例135、136、137或141之組合物或方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO:79之胺基酸序列。 143.如實施例142之組合物或方法，其中該微小肌縮蛋白蛋白質係由SEQ ID NO:81之核酸序列編碼。 144.如實施例135-143中任一項之組合物或方法，其中該轉譯調節元件包含肌肉特異性啟動子。 145.如實施例144之組合物或方法，其中該肌肉特異性啟動子為骨骼、平滑或心肌特異性啟動子。 146.如實施例144或145中任一項之組合物或方法，其中該肌肉特異性啟動子為SPc5-12或其轉錄活性部分或突變體。 147.如實施例146之組合物或方法，其中該啟動子由SEQ ID NO: 39之核酸序列組成。 148.如實施例135-147中任一項之組合物或方法，其中該轉殖基因包含在編碼該微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的3'的聚腺苷酸化訊號。 149.如實施例135-148中任一項之組合物或方法，其中該轉殖基因包含在啟動子與微小肌縮蛋白編碼序列之間的內含子序列。 150.如實施例149之組合物或方法，其中該內含子序列為VH4內含子序列(SEQ ID NO:41) 151.如實施例135-140及144-150中任一項之組合物或方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 53之核酸序列。 152.如實施例135-137及141-150中任一項之組合物或方法，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 82之核酸序列。 153.如實施例135-152中任一項之組合物或方法，其中該rAAV粒子具有包含與SEQ ID NO:77具有至少95%一致性之胺基酸序列的衣殼蛋白。 154.如實施例153之組合物或方法，其中該rAAV為AAV8血清型。 155.如實施例135-154中任一項之組合物或方法，其中該肌縮蛋白症為杜興氏肌肉失養症(DMD)、貝氏肌肉失養症(BMD)或X性聯擴張型心肌病變。 156.如實施例135-155中任一項之組合物或方法，其中該治療有效量之該rAAV粒子係以1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量給藥。 157.如實施例135-156中任一項之組合物或方法，其中該醫藥組合物經靜脈內給藥。
提供給藥基因療法載體，尤其AAV載體之方法，該基因療法載體包含具有編碼微小肌縮蛋白蛋白質之轉殖基因的重組基因體(及用於產生具有重組基因體之rAAV的順式質體)，該微小肌縮蛋白蛋白質可操作地連接於例如在肌肉細胞中之表現的調節元件，用於治療肌縮蛋白症，包括(但不限於)杜興氏肌肉失養症(DMD)、貝氏肌肉失養症(BMD)及X性聯擴張型心肌症。由轉殖基因編碼之微小肌縮蛋白蛋白質由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分，且可包含以下或由以下組成：編碼SEQ ID NO:92 (UniProt-KB-P111532)之人類肌縮蛋白胺基酸殘基3361-3354之C端的至少近端部分，或SEQ ID NO: 16之胺基酸序列，或可替代地CT為包含SEQ ID NO: 83或由其組成之截短CT，且微小肌縮蛋白可具有SEQ ID NO:1(RGX-DYS1)或SEQ ID NO:79 (RGX-DYS5)之胺基酸序列。轉殖基因進一步包含調節序列，包括(例如)肌肉特異性啟動子，諸如SPc5-12 (SEQ ID NO:39)及聚腺苷酸化訊號，諸如小polyA訊號(SEQ ID NO: 42)。例如在 圖 2中描繪例示性構築體(包括順式質體及AAV基因體)且可具有(對於RGX-DYS1為SEQ ID NO:53且對於RGX-DYS5為SEQ ID NO:82)之核苷酸序列，且可包括ITR序列(包括AAV2 ITR序列，諸如存在於SEQ ID NO: 53及SEQ ID NO: 82之核苷酸序列中)。基因療法載體可為AAV8或AAV9血清型載體。在特定實施例中，基因療法載體為包含具有SEQ ID NO: 53 (RGX-DYS1)之核苷酸序列的人工基因體之AAV8，且可稱為AAV8-RGX-DYS1。
基於在 mdx小鼠中進行之藥理學研究(實例6、7及8，見下文)，用於周邊(包括靜脈內)給藥含有本文所描述之轉殖基因的rAAV (包括RGX-DYS1及RGX-DYS5) (在實施例中包括AAV8-RGX-DYS1)的治療上有效單次劑量係在5×10 13GC/kg至1×10 15GC/kg之間且包括在包括以下之範圍內之劑量：1×10 14、1.1×10 14、1.2×10 14、1.3×10 14、1.4×10 14、1.5×10 14、1.6×10 14、1.7×10 14、1.8×10 14、1.9×10 14、2×10 14、2.1×10 14、2.2×10 14、2.3×10 14、2.4×10 14、2.5×10 14、2.6×10 14、2.7×10 14、2.8×10 14、2.9×10 14或3×10 14GC/kg。給藥此類治療上有效劑量之包含本文所描述之轉殖基因的rAAV (包括AAV8-RGX-DYS1)引起肌縮蛋白症疾病之一或多種指標改善，諸如肌酸激酶活性降低、肌肉體積降低、肌肉病變、步態或可走動評分改善(諸如NSAA評分)或在給藥12週、26週、52週或更久內之強度或活動性之其他量度。
因此，本文提供及描述向包括人類個體之有需要之個體給藥rAAV，包括rAAV8，其包含含有編碼包括RGX-DYS1及RGX-DYS5構築體之微小肌縮蛋白之轉殖基因的重組基因體，其中該給藥係以在5×10 13GC/kg至1×10 15GC/kg之間的劑量且包括在包括1×10 14、1.1×10 14、1.2×10 14、1.3×10 14、1.4×10 14、1.5×10 14、1.6×10 14、1.7×10 14、1.8×10 14、1.9×10 14、2×10 14、2.1×10 14、2.2×10 14、2.3×10 14、2.4×10 14、2.5×10 14、2.6×10 14、2.7×10 14、2.8×10 14、2.9×10 14或3×10 14GC/kg之範圍內的劑量靜脈內或其他周邊給藥。亦提供針對周邊，包括靜脈內給藥本文所描述之編碼微小肌縮蛋白之rAAV的醫藥組合物。 5.1. 定義
術語「AAV」或「腺相關病毒」係指病毒之細小病毒科(Parvoviridae)屬內的依賴細小病毒(Depend parvovirus)。AAV可為衍生自天然存在之「野生型」病毒之AAV、衍生自已封裝至包含由天然存在之cap基因編碼之衣殼蛋白之衣殼中之rAAV基因體之AAV及/或已封裝至包含由非天然存在之衣殼cap基因編碼之衣殼蛋白之衣殼中之rAAV基因體。後者之實例包括rAAV，其具有衣殼蛋白質，該衣殼蛋白質具有經修飾序列及/或肽插入至天然產生之衣殼的胺基酸序列中。
術語「rAAV」係指「重組AAV」。在一些實施例中，重組AAV具有AAV基因體，其中部分或所有rep及cap基因已經異源序列置換。
術語「rep-cap輔助質體」係指提供病毒rep及cap基因功能且有助於由缺乏功能性rep及/或cap基因序列之rAAV基因體產生AAV的質體。
術語「cap基因」係指編碼形成或幫助形成病毒之衣殼包衣(capsid coat)的衣殼蛋白之核酸序列。對於AAV，衣殼蛋白可為VP1、VP2或VP3。
術語「rep基因」係指編碼複製及產生病毒所需的非結構蛋白之核酸序列。
術語「核酸」及「核苷酸序列」包括DNA分子(例如cDNA或基因體DNA)、RNA分子(例如mRNA)、DNA及RNA分子之組合或雜交DNA/RNA分子，及DNA或RNA分子之類似物。此類類似物可使用例如核苷酸類似物產生，其包括但不限於肌苷或三苯甲基化鹼基(tritylated base)。此類類似物亦可包含DNA或RNA分子，其包含對分子提供有益屬性，諸如核酸酶抗性或跨細胞膜能力之增加的經修飾之主鏈。核酸或核苷酸序列可為單股、雙股的，可含有單股及雙股部分，且可含有三股部分，但較佳為雙股DNA。
如本文所揭示之胺基酸殘基可藉由保守取代修飾以維持或大體上維持總體多肽結構及/或功能。如本文中所用，「保守性胺基酸取代」指示：疏水性胺基酸(亦即，Ala、Cys、Gly、Pro、Met、Val、lie及Leu)可經其他疏水性胺基酸取代；具有大型側鏈之疏水性胺基酸(亦即，Phe、Tyr及Trp)可經具有大型側鏈之其他疏水性胺基酸取代；具有帶正電側鏈之胺基酸(亦即，Arg、His及Lys)可經具有帶正電側鏈之其他胺基酸取代 ；具有帶負電側鏈之胺基酸(亦即，Asp及Glu)可經具有帶負電側鏈之其他胺基酸取代；及具有極性不帶電側鏈之胺基酸(亦即，Ser、Thr、Asn及Gln)可經具有極性不帶電側鏈之其他胺基酸取代。
術語「個體」、「宿主」及「患者」可互換使用。個體較佳為哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、犬、大鼠等)或靈長類動物(例如猴及人類)，最佳為人類。
術語「治療上功能性微小肌縮蛋白」意謂微小肌縮蛋白在本文章節5.4中所描述之治療效用的一或多個分析中或在本文章節5.5中所描述的治療方法之評估中展現出治療功效。
術語「個體」、「宿主」及「患者」可互換使用。個體較佳為哺乳動物，諸如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、犬、大鼠等)或靈長類動物(例如猴及人類)，最佳為人類。
術語「治療劑」係指可用於治療、處理或改善與疾病或病症相關之症狀的任何藥劑，其中該疾病或病症與待由轉殖基因提供之功能相關。「治療有效量」係指當向罹患其之個體給藥時，在目標疾病或病症之治療或管理中提供至少一種治療益處之藥劑的量(例如，由轉殖基因表現之產物的量)。此外，相對於本發明之藥劑的治療有效量意謂單獨藥劑之量，或當與其他療法組合時，該量在疾病或病症之治療或管理中提供至少一種治療效益。
術語「預防劑」係指可用於預防疾病或病症、降低疾病或病症之可能性、延緩或減緩疾病或病症之進展的任何藥劑，其中疾病或病症與由轉殖基因提供之功能相關。「預防有效量」係指當向傾向於其之個體給藥時，預防劑之量(例如由轉殖基因表現之產物的量)在預防或延遲目標疾病或病症中提供至少一種預防益處。預防有效量亦可指足以預防目標疾病或病症、降低目標疾病或病症之可能性或延遲目標疾病或病症之發生；或減緩目標疾病或病症之進展的藥劑之量；足以延遲或最小化目標疾病或病症之發作的量；或足以預防或延遲其復發或擴散的量。預防有效量亦可指足以預防或延遲目標疾病或病症之症狀惡化的藥劑之量。此外，相對於本發明之預防劑的預防有效量意指單獨的預防劑之量，或當與其他藥劑組合時，其在預防或延遲疾病或病症方面提供至少一種預防益處。
本發明之預防劑可給藥預先有傾向目標疾病或病症之個體。「易患」疾病或病症之個體為展現出與疾病或病症發展相關之症狀，或具有此類疾病或病症之基因組成、環境暴露或其他風險因素，但其中症狀尚未處於診斷為該疾病或病症之程度的個體。舉例而言，具有與缺失基因(由轉殖基因提供)相關之疾病家族病史的患者可限定為易患該疾病之患者。此外，在移除原發性腫瘤之後持續存在的具有休眠腫瘤之患者可限定為易患復發腫瘤之患者。
術語「CpG島」意謂意謂基因體中含有高頻率之CpG (例如C (胞嘧啶)鹼基，緊隨著G (鳥嘌呤)鹼基(CpG))的彼等獨特區域，因此CpG島之G+C含量顯著高於非島DNA之G+C含量。CpG島可藉由對核苷酸長度、核苷酸組合物及CpG二核苷酸之頻率的分析來鑑別。任何特定核苷酸序列或基因體中之CpG島含量可使用以下標準量測：基於區段中之Gs及Cs數目，大於100%之島大小、大於50.0%之GC百分比及大於0.6之觀測到的CG二核苷酸數目與預期數目的比率(大於0.6之Obs/Exp)。 Obs/Exp CpG = CpG數目* N數目/ (C數目*G數目) 其中N=序列長度。
各種軟體工具可用於此類計算，諸如www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi、www.cpgislands.usc.edu/、www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/ cpgplot/ index.html及www.bioinformatics.org /sms2/cpg_islands.html。(亦參見Gardiner-Garden及Frommer, J Mol Biol. 1987年7月20日;196(2):261-82; Li LC及Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 2002年11月;18(11):1427-31.)。在一個實施例中，用於鑑別CpG島之算法見於www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi。 5.2. 微小肌縮蛋白轉殖基因 5.2.1 由轉殖基因編碼之微小肌縮蛋白
對於本發明之方法，由本文所提供之轉殖基因編碼的為由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成的微小肌縮蛋白：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸之區域且CT為C端域(且包含含有α1-互生蛋白結合位點，包括SEQ ID NO:84之CT域之至少該部分)。 下表 1具有此等組分之胺基酸序列，特定言之來自全長人類DMD蛋白(UniProtDB-11532，其以引用的方式併入本文中)，且其由 表 3 及表 4中之核苷酸序列(包括野生型及密碼子最佳化序列)編碼。
為了解決通常為AAV載體之包裝限制，研發用於臨床用途之許多微小肌縮蛋白基因缺乏CT域。若干研究者已指示，DAPC甚至不需要C端域以便組裝或C端為非必需的[Crawford等人, J Cell Biol, 2000, 150(6):1399-1409；及Ramos, J.N等人. Molecular Therapy2019, 27(3):1-13]。然而，含有 mdx小鼠之骨胳肌肉中CT域之纏繞線圈模體之螺旋1的微小肌縮蛋白基因的過度表現增加募集α1-互生蛋白及α-短肌營養蛋白，其為DAP複合物之成員，充當募集至肌纖維膜之傳訊蛋白質的模組化接附子[Koo, T.等人., Delivery of AAV2/9-microdystrophin genes incorporating helix 1 of the coiled-coil motif in the C-terminal domain of dystrophin improves muscle pathology and restores the level of α1-syntrophin and α-dystrobrevin in skeletal muscles of mdxmice. Hum Gene Ther, 2011. 22(11): p. 1379-88]。與更短型式相比，微小肌縮蛋白之更長型式之過度表現亦改善 mdx小鼠中對延長感染誘導之肌肉損傷的肌肉抗性[Koo, T.等人. 2011，前述]。CT域確實在肌縮蛋白相關蛋白質複合物(DAPC)形成中起一定作用(參見 圖 1B)。
肌縮蛋白之CT域含有兩個多肽延伸段，其經預測形成α-螺旋捲曲螺旋線圈，類似於桿狀域中之α-螺旋捲曲螺旋線圈(參見藉由單一加下劃線指示之H1及藉由下表1中之SEQ ID 16中之雙重加下劃線指示之H2)。各捲曲線圈具有保守的重複七個(a、b、c、d、e、f、g) n，其類似於白胺酸在「d」位置處佔優勢之白胺酸拉鏈中的彼等。此域已命名為CC (捲曲線圈)域。肌縮蛋白之CC區域形成短肌營養蛋白之結合位點且可調節α1-互生蛋白與其他肌縮蛋白相關蛋白質之間的相互作用。
認為兩種互生蛋白同功型α1-互生蛋白及β1-互生蛋白經由肌縮蛋白外顯子73及74中之多於一個結合位點直接與肌縮蛋白相互作用(Yang等人, JBC 270(10):4975-8 (1995))。α1-及β1-互生蛋白分別結合至肌縮蛋白C端域，且據報導，α1-互生蛋白之結合位點至少存在於胺基酸殘基3447至3481內，同時已報導β1-互生蛋白存在於胺基酸殘基3495至3535內(如UniProtDB-11532 (SEQ ID NO:92)之DMD蛋白質中編號，亦參見表1，SEQ ID NO: 16，斜體)。α1- (α1-)互生蛋白及α-互生蛋白通篇可互換使用。
發現本文所揭示之微小肌縮蛋白結合至且募集nNOS，以及α-互生蛋白、α-短肌營養蛋白及β-肌萎縮蛋白聚糖。在包括與nNOS結合之微小肌縮蛋白之C端域的情形下結合至nNOS意謂在肌肉組織中表現之微小肌縮蛋白係藉由用適當抗體免疫染色來確定，以鑑別經轉導肌肉組織之切片中肌纖維膜中或其附近的α-互生蛋白、α-短肌營養蛋白及nNOS中之每一者。參見下文實例4及5。在某些實施例中，微小肌縮蛋白蛋白質具有與不含C端域(但另外具有作為參考微小肌縮蛋白蛋白質之相同胺基酸序列)之相當微小肌縮蛋白相比與α1-互生蛋白、β-互生蛋白及/或短肌營養蛋白之「結合增加」的C端域，意謂DAPC相較於不具有C端域之參考微小肌縮蛋白(但具有另外與微小肌縮蛋白相同之胺基酸序列)更穩定或錨定至肌纖維膜至更大程度，經藉由肌肉切片之免疫染色或針對一或多種DAPC組分(包括在用具有C端域之微小肌縮蛋白處理的mdx小鼠肌肉中之α1-互生蛋白、β-互生蛋白、α-短肌營養蛋白、β-肌萎縮蛋白聚糖或nNOS)之肌肉組織溶解物或肌肉膜製劑之西方墨點分析，藉由較大程度之一或多種DAPC組分確定，與經參考微小肌縮蛋白蛋白質處理之mdx小鼠肌肉相比(除不具有該C端域或具有接近該CR域之最少48個胺基酸外，具有相同序列及肌縮蛋白組分) (參見章節6.4及6.5中之實例4及5，見下文)。
在一些實施例中，包括肌縮蛋白之C端域的微小肌縮蛋白在C端域中包含α1-互生蛋白結合位點及/或短肌營養蛋白結合位點。在一些實施例中，包含α1-互生蛋白結合位點之C端域為經截短C端域。α1-互生蛋白結合位點部分地用於募集且經由α1-互生蛋白將nNOS錨定至肌纖維膜(參見 圖 1A及 1B)。
本文所描述之實施例可包含CT域之全部或一部分，其包含纏繞線圈模體之螺旋1。C端序列可由DMD基因之外顯子的編碼序列，特定言之外顯子70至74及外顯子75之一部分界定(特定言之，編碼由外顯子75或由人類DMD蛋白質之序列，例如UniProtKB-P11532 (SEQ ID NO:92)之序列編碼的胺基酸序列之前36個胺基酸的核苷酸序列(該CT為UniProtKB-P11532序列之胺基酸3361至3554)，或包含短肌營養蛋白結合位點及/或α1-互生蛋白或由其組成( 表 1中指示，SEQ ID NO: 16)。在某些實施例中，該CT域由組成或包含DMD蛋白質之194個C端胺基酸，例如UniProtKB-P11532 (SEQ ID NO:92)之胺基酸序列的殘基3361至3554，由外顯子70至74編碼之胺基酸及編碼 DMD 基因之外顯子75之核苷酸序列的前36個核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID NO: 16之胺基酸序列(參見 表 1)。舉例而言，RGX-DYS1 (亦為μDys-CT194)具有SEQ ID NO: 16之194胺基酸CT序列。
在其他實施例中，C端域之胺基酸序列經截斷且至少包含短肌營養蛋白及/或α1-互生蛋白之結合位點。在某些實施例中，截短C端域包含胺基酸序列MENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQ (α1-互生蛋白結合位點) (SEQ ID NO: 84)。在某些實施例中，截短C端域包含α1-互生蛋白結合位點，其中該結合位點具有胺基酸序列MENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQ (SEQ ID NO: 84)。在特定實施例中，該CT域序列具有SEQ ID NO: 83之胺基酸序列或UniProtKB-P11532人類DMD序列之胺基酸3361至3500 (稱為CT140或CT1.5)。舉例而言，RGX-DYS5 (μDys-CT140)具有含有胺基酸序列SEQ ID NO:83之CT域。在替代性實施例中，微小肌縮蛋白缺乏CT域(或包括CT域之最小48個胺基酸，稱為CT48，其為UniProtKB-P11532人類DMD序列之胺基酸3361至3408；SEQ ID NO: 91)且可具有如下排列之域：ABD1-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR，例如RGX-DYS3 (μDys-CT48) ( 圖 2；SEQ ID NO: 2)。在實施例中，微小肌縮蛋白，諸如RGX-DYS1具有之半衰期比微小肌縮蛋白，諸如RGS-DYS3大超過1.5倍、2倍、2.5倍或3倍，其中48個胺基酸之CT序列(SEQ ID NO: 91)如由組織培養物中之脈衝追蹤分析所確定，例如如本文實例11中所描述。
NH 2端及肌縮蛋白之桿狀結構域中的區域直接結合於但未交聯細胞骨架肌動蛋白。野生型肌縮蛋白之桿狀域由24個類似於血影蛋白之三螺旋重複區的重複單元構成。此重複單元占大部分肌縮蛋白蛋白質之多數且被認為給予分子類似於β-血影蛋白之可撓性棒狀結構。此等α-螺旋纏繞線圈重複區間雜有四個富含脯胺酸之鉸鏈區。在第24次重複結束為第四鉸鏈區，其由WW域緊隨[Blake, D等人, Function and Genetics of Dystrophin and Dystrophin-Related Proteins in Muscle. Physiol. Rev. 82: 291-329, 2002]。本文所揭示之微小肌縮蛋白不包括R4至R23，且僅包括4個鉸鏈區中之3個或其部分。在一些實施例中，無新穎胺基酸殘基或連接子引入至微小肌縮蛋白中。
在一些實施例中，微小肌縮蛋白包含H3 (例如，SEQ ID NO: 1、2或79)。在實施例中，H3可為自N端至C端，例如SEQ ID NO: 11之完全內源性H3域。換言之，一些微小肌縮蛋白實施例不含H3域之片段，而是含有整個H3域。在一些實施例中，R3域之C端胺基酸直接偶合(或共價鍵結至) H3域之N端胺基酸。在一些實施例中，耦接至H3域之N端胺基酸的R3域之C端胺基酸為Q。在一些實施例中，耦接至R3域之H3域的5'胺基酸為Q。
不受任一理論束縛，完整鉸鏈域可在任何微小肌縮蛋白中適當，以便在衍生之微小肌縮蛋白蛋白質上傳遞完全活性。肌縮蛋白鉸鏈片段已識別為具有富含脯胺酸之性質且可因此賦予蛋白質產物可撓性(Koenig及Kunkel, 265(6):4560-4566, 1990)。鉸鏈之一部分的任何缺失，尤其一或多個脯胺酸殘基之移除可降低其可撓性且因此藉由妨礙其與DAP複合物中之其他蛋白質之相互作用而降低其功效。
本文所揭示之微小肌縮蛋白包含野生型肌縮蛋白H4序列(其含有WW域)且包括CR域(其含有ZZ域，在SEQ ID NO: 15中由單下劃線表示(UniProtKB-P11532 aa 3307-3354))。WW域為見於若干傳訊及調節性分子中之蛋白質結合模組。WW域以類似於src同源-3 (SH3)域之方式結合至富含脯胺酸之受質。此區域介導β-肌萎縮蛋白聚糖與肌縮蛋白之間的相互作用，因為β-肌萎縮蛋白聚糖之細胞質域富含脯胺酸。WW域在鉸鏈4 (H4區域)中。CR域含有與α-輔肌動蛋白中之彼等類似且其可結合胞內Ca 2+的兩個EF-手模體。ZZ域含有多種保守半胱胺酸殘基，其經預測以形成諸如Zn 2+之二價金屬陽離子的配位位點。ZZ域類似於多種類型之鋅指且發現於細胞核及細胞質蛋白質兩者中。肌縮蛋白之ZZ域以Ca 2+依賴性方式結合至調鈣蛋白。因此，ZZ域可表示功能性調鈣蛋白結合位點且可對與其他肌縮蛋白相關蛋白質的調鈣蛋白結合具有影響。
微小肌縮蛋白實施例可進一步包含連接子(L1、L2、L3、L4、L4.1及/或L4.2)或其連接如下所示之域的部分：ABD1-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR-CT (例如，SEQ ID NO: 1、79或91)或ABD1-L1-H1-L2-R1-R2-L3-R3-H3-L4-R24-H4-CR (例如，SEQ ID NO: 2) L1可為可將ABD1耦接至H1之內源性連接子L1 (例如，SEQ ID NO: 4)。L2可為可使H1耦接至R1之內源性連接子L2 (例如，SEQ ID NO: 6)。L3可為可使R2耦接至R3之內源性連接子L3 (例如，SEQ ID NO: 9)。
L4亦可為可耦接H3及R24之內源性連接子。在一些實施例中，L4為在天然肌縮蛋白序列中在R24之前的3個胺基酸，例如TLE (SEQ ID NO: 12)。在其他實施例中，L4可為在天然肌縮蛋白序列中在R24之前(SEQ ID NO: 17)的4個胺基酸或在R24之前(SEQ ID NO: 18)的2個胺基酸。在其他實施例中，H3與R24之間不存在連接子L4或其他。在H3之5'端上，如上文所提及，不存在連接子，而是直接將R3耦接至H3，或可替代地H2。
未具體描述之微小肌縮蛋白其他域之上文所描述之組分可具有如下 表 1中所提供之胺基酸序列。本文所提供之域的胺基酸序列對應於UniProtKB-P11532 (DMD_HUMAN) (SEQ ID NO:92)之肌縮蛋白同功型，其以引用的方式併入本文中。其他實施例可包含來自此項技術中已知之天然產生之功能性肌縮蛋白同功型的域，諸如UniProtKB-A0A075B6G3 (A0A075B6G3_HUMAN)，(以引用之方式併入本文中)，其中例如R24具有在SEQ ID NO: 13之胺基酸3處取代Q之R。
額外實施例揭示於2020年11月27日申請之國際申請案PCT/US2020/062484中，該案特此以全文引用之方式併入。 表 1 ： 微小肌縮蛋白片段胺基酸序列
結構 SEQ  ID 序列
ABD1 3 MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLP
L1 4 QQVSIEAIQEVE
H1 5 MLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPED
L2 6 KSFGSSLME
R1 7 SEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHR
R2 8 VLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQD
L3 9 IL
R3 10 LKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQ
H3 11 QPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSSLMLEVP
L4 12 TLE
R24 13 RLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHE
H4 14 AHRDFGPASQHFLS TSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKL WW域由單加底線表示(UniProtKB-P11532 aa 3055-3088)
富含半胱胺酸之域(CR) 15 RRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAET AKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYC ZZ域由單加底線表示(UniProtKB-P11532 aa 3307-3354)
CR短 89 AKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYC
C端域(CT) (194 aa) 16 TPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQ HYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLES EERGELERILADLEEENRNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSP PEMMPTSPQSPR 纏繞線圈模體H1由單一下劃線表示；模體H2由雙下劃線表示；短肌營養蛋白結合側呈斜體。
最小/截短C端域(CT1.5) (140 aa) 83 TPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLES α1-互生蛋白結合位點呈斜體。
短C端域(48 aa) 91 TPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMET
L4 17 ETLE
L4 18 LE
最小α-互生蛋白結合位點 84 MENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQ
人類肌縮蛋白(UniProtKB-P11532) 92 MLWWEEVEDC YEREDVQKKT FTKWVNAQFS KFGKQHIENL FSDLQDGRRL LDLLEGLTGQ KLPKEKGSTR VHALNNVNKA LRVLQNNNVD LVNIGSTDIV DGNHKLTLGL IWNIILHWQV KNVMKNIMAG LQQTNSEKIL LSWVRQSTRN YPQVNVINFT TSWSDGLALN ALIHSHRPDL FDWNSVVCQQ SATQRLEHAF NIARYQLGIE KLLDPEDVDT TYPDKKSILM YITSLFQVLP QQVSIEAIQE VEMLPRPPKV TKEEHFQLHH QMHYSQQITV SLAQGYERTS SPKPRFKSYA YTQAAYVTTS DPTRSPFPSQ HLEAPEDKSF GSSLMESEVN LDRYQTALEE VLSWLLSAED TLQAQGEISN DVEVVKDQFH THEGYMMDLT AHQGRVGNIL QLGSKLIGTG KLSEDEETEV QEQMNLLNSR WECLRVASME KQSNLHRVLM DLQNQKLKEL NDWLTKTEER TRKMEEEPLG PDLEDLKRQV QQHKVLQEDL EQEQVRVNSL THMVVVVDES SGDHATAALE EQLKVLGDRW ANICRWTEDR WVLLQDILLK WQRLTEEQCL FSAWLSEKED AVNKIHTTGF KDQNEMLSSL QKLAVLKADL EKKKQSMGKL YSLKQDLLST LKNKSVTQKT EAWLDNFARC WDNLVQKLEK STAQISQAVT TTQPSLTQTT VMETVTTVTT REQILVKHAQ EELPPPPPQK KRQITVDSEI RKRLDVDITE LHSWITRSEA VLQSPEFAIF RKEGNFSDLK EKVNAIEREK AEKFRKLQDA SRSAQALVEQ MVNEGVNADS IKQASEQLNS RWIEFCQLLS ERLNWLEYQN NIIAFYNQLQ QLEQMTTTAE NWLKIQPTTP SEPTAIKSQL KICKDEVNRL SDLQPQIERL KIQSIALKEK GQGPMFLDAD FVAFTNHFKQ VFSDVQAREK ELQTIFDTLP PMRYQETMSA IRTWVQQSET KLSIPQLSVT DYEIMEQRLG ELQALQSSLQ EQQSGLYYLS TTVKEMSKKA PSEISRKYQS EFEEIEGRWK KLSSQLVEHC QKLEEQMNKL RKIQNHIQTL KKWMAEVDVF LKEEWPALGD SEILKKQLKQ CRLLVSDIQT IQPSLNSVNE GGQKIKNEAE PEFASRLETE LKELNTQWDH MCQQVYARKE ALKGGLEKTV SLQKDLSEMH EWMTQAEEEY LERDFEYKTP DELQKAVEEM KRAKEEAQQK EAKVKLLTES VNSVIAQAPP VAQEALKKEL ETLTTNYQWL CTRLNGKCKT LEEVWACWHE LLSYLEKANK WLNEVEFKLK TTENIPGGAE EISEVLDSLE NLMRHSEDNP NQIRILAQTL TDGGVMDELI NEELETFNSR WRELHEEAVR RQKLLEQSIQ SAQETEKSLH LIQESLTFID KQLAAYIADK VDAAQMPQEA QKIQSDLTSH EISLEEMKKH NQGKEAAQRV LSQIDVAQKK LQDVSMKFRL FQKPANFEQR LQESKMILDE VKMHLPALET KSVEQEVVQS QLNHCVNLYK SLSEVKSEVE MVIKTGRQIV QKKQTENPKE LDERVTALKL HYNELGAKVT ERKQQLEKCL KLSRKMRKEM NVLTEWLAAT DMELTKRSAV EGMPSNLDSE VAWGKATQKE IEKQKVHLKS ITEVGEALKT VLGKKETLVE DKLSLLNSNW IAVTSRAEEW LNLLLEYQKH METFDQNVDH ITKWIIQADT LLDESEKKKP QQKEDVLKRL KAELNDIRPK VDSTRDQAAN LMANRGDHCR KLVEPQISEL NHRFAAISHR IKTGKASIPL KELEQFNSDI QKLLEPLEAE IQQGVNLKEE DFNKDMNEDN EGTVKELLQR GDNLQQRITD ERKREEIKIK QQLLQTKHNA LKDLRSQRRK KALEISHQWY QYKRQADDLL KCLDDIEKKL ASLPEPRDER KIKEIDRELQ KKKEELNAVR RQAEGLSEDG AAMAVEPTQI QLSKRWREIE SKFAQFRRLN FAQIHTVREE TMMVMTEDMP LEISYVPSTY LTEITHVSQA LLEVEQLLNA PDLCAKDFED LFKQEESLKN IKDSLQQSSG RIDIIHSKKT AALQSATPVE RVKLQEALSQ LDFQWEKVNK MYKDRQGRFD RSVEKWRRFH YDIKIFNQWL TEAEQFLRKT QIPENWEHAK YKWYLKELQD GIGQRQTVVR TLNATGEEII QQSSKTDASI LQEKLGSLNL RWQEVCKQLS DRKKRLEEQK NILSEFQRDL NEFVLWLEEA DNIASIPLEP GKEQQLKEKL EQVKLLVEEL PLRQGILKQL NETGGPVLVS APISPEEQDK LENKLKQTNL QWIKVSRALP EKQGEIEAQI KDLGQLEKKL EDLEEQLNHL LLWLSPIRNQ LEIYNQPNQE GPFDVKETEI AVQAKQPDVE EILSKGQHLY KEKPATQPVK RKLEDLSSEW KAVNRLLQEL RAKQPDLAPG LTTIGASPTQ TVTLVTQPVV TKETAISKLE MPSSLMLEVP ALADFNRAWT ELTDWLSLLD QVIKSQRVMV GDLEDINEMI IKQKATMQDL EQRRPQLEEL ITAAQNLKNK TSNQEARTII TDRIERIQNQ WDEVQEHLQN RRQQLNEMLK DSTQWLEAKE EAEQVLGQAR AKLESWKEGP YTVDAIQKKI TETKQLAKDL RQWQTNVDVA NDLALKLLRD YSADDTRKVH MITENINASW RSIHKRVSER EAALEETHRL LQQFPLDLEK FLAWLTEAET TANVLQDATR KERLLEDSKG VKELMKQWQD LQGEIEAHTD VYHNLDENSQ KILRSLEGSD DAVLLQRRLD NMNFKWSELR KKSLNIRSHL EASSDQWKRL HLSLQELLVW LQLKDDELSR QAPIGGDFPA VQKQNDVHRA FKRELKTKEP VIMSTLETVR IFLTEQPLEG LEKLYQEPRE LPPEERAQNV TRLLRKQAEE VNTEWEKLNL HSADWQRKID ETLERLQELQ EATDELDLKL RQAEVIKGSW QPVGDLLIDS LQDHLEKVKA LRGEIAPLKE NVSHVNDLAR QLTTLGIQLS PYNLSTLEDL NTRWKLLQVA VEDRVRQLHE AHRDFGPASQ HFLSTSVQGP WERAISPNKV PYYINHETQT TCWDHPKMTE LYQSLADLNN VRFSAYRTAM KLRRLQKALC LDLLSLSAAC DALDQHNLKQ NDQPMDILQI INCLTTIYDR LEQEHNNLVN VPLCVDMCLN WLLNVYDTGR TGRIRVLSFK TGIISLCKAH LEDKYRYLFK QVASSTGFCD QRRLGLLLHD SIQIPRQLGE VASFGGSNIE PSVRSCFQFA NNKPEIEAAL FLDWMRLEPQ SMVWLPVLHR VAAAETAKHQ AKCNICKECP IIGFRYRSLK HFNYDICQSC FFSGRVAKGH KMHYPMVEYC TPTTSGEDVR DFAKVLKNKF RTKRYFAKHP RMGYLPVQTV LEGDNMETPV TLINFWPVDS APASSPQLSH DDTHSRIEHY ASRLAEMENS NGSYLNDSIS PNESIDDEHL LIQHYCQSLN QDSPLSQPRS PAQILISLES EERGELERIL ADLEEENRNL QAEYDRLKQQ HEHKGLSPLP SPPEMMPTSP QSPRDAELIA EAKLLRQHKG RLEARMQILE DHNKQLESQL HRLRQLLEQP QAEAKVNGTT VSSPSTSLQR SDSSQPMLLR VVGSQTSDSM GEEDLLSPPQ DTSTGLEEVM EQLNNSFPSS RGRNTPGKPM REDTM
本發明亦涵蓋此等序列之變異體，只要實質上維持各域及連接子之功能及/或實質上維持包含此類變異體之微小肌縮蛋白的治療功效即可。功能活性包括(1)結合至肌動蛋白、β-肌萎縮蛋白聚糖、α1-互生蛋白、α-短肌營養蛋白及nNOS中之一者、組合或所有者；(2)改善動物模型中(例如，在本文所描述之 mdx小鼠模型中)或人類個體中之肌肉功能；及/或(3)動物模型或人類患者中之心臟保護或改善心臟功能。特定言之，微小肌縮蛋白可包含由SEQ ID NO: 3組成之ABD或與SEQ ID NO: 3具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列；H1由SEQ ID NO: 5組成或與SEQ ID NO: 5具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列；R1由SEQ ID NO: 7組成或與SEQ ID NO: 7具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列；R2由SEQ ID NO: 8組成或與SEQ ID NO: 8具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列；H3由SEQ ID NO: 11組成或與SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列；R24由SEQ ID NO: 13組成或與SEQ ID NO: 13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列；H4由SEQ ID NO: 14組成或與SEQ ID NO: 14具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列；CR由SEQ ID NO: 15或90組成或與SEQ ID NO: 15或90具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列；CT由SEQ ID NO: 16或83組成或與SEQ ID NO: 16或83具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO: 84之CT。除前述以外，微小肌縮蛋白可在上文所描述之位置中包含連接子，其包含或由如下序列組成：L1由SEQ ID NO: 4組成或與SEQ ID NO: 4具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列；L2由SEQ ID NO: 6組成或與SEQ ID NO: 6具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列；L3由SEQ ID NO: 9組成或與SEQ ID NO: 9具有至少50%一致性的胺基酸序列或具有針對兩種L3殘基之保守取代的變異體；及L4由SEQ ID NO: 12、17或18組成或與SEQ ID NO: 12、17或18具有至少50%、至少75%序列一致性的胺基酸序列。
表 2提供根據本發明之微小肌縮蛋白實施例的胺基酸序列。亦預期，其他實施例為如SEQ ID NO: 1 (RGX-DYS1)、2 (RGX-DYS3)或79 (RGX-DYS5)所定義之微小肌縮蛋白的經取代變異體。舉例而言，可對SEQ ID NO: 1、2或79進行保守取代且實質上維持其功能活性。在實施例中，微小肌縮蛋白可與SEQ ID NO: 1、2或79之胺基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性且維持功能性微小肌縮蛋白活性，經例如下文章節5.4中所揭示之動物模型中之活體外分析或活體內分析中之一或多者所確定。本發明之RGX-DYS2及RGX-DYS4亦編碼包含SEQ ID NO: 1之微小肌縮蛋白蛋白質。 表 2 ： RGX-DYS 蛋白質之胺基酸序列
結構 SEQ ID NO: 胺基酸序列
DYS1 1 MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRL LDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIV DGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRN YPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAF NIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQE VEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYA YTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEE VLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNIL QLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLM DLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDL EQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDR WVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSL QKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARC WDNLVQKLEKSTAQISQQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAI SKLEMPSSLMLEVPTLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLL IDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTL EDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISP NKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQK ALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNN LVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRY LFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCF QFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICK ECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGE DVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWP VDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDD EHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLESEERGELERILADLEEEN RNLQAEYDRLKQQHEHKGLSPLPSPPEMMPTSPQSPR
DYS3 2 MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSSLMLEVPTLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMET
DYS5 79 MLWWEEVEDCYEREDVQKKTFTKWVNAQFSKFGKQHIENLFSDLQDGRRLLDLLEGLTGQKLPKEKGSTRVHALNNVNKALRVLQNNNVDLVNIGSTDIVDGNHKLTLGLIWNIILHWQVKNVMKNIMAGLQQTNSEKILLSWVRQSTRNYPQVNVINFTTSWSDGLALNALIHSHRPDLFDWNSVVCQQSATQRLEHAFNIARYQLGIEKLLDPEDVDTTYPDKKSILMYITSLFQVLPQQVSIEAIQEVEMLPRPPKVTKEEHFQLHHQMHYSQQITVSLAQGYERTSSPKPRFKSYAYTQAAYVTTSDPTRSPFPSQHLEAPEDKSFGSSLMESEVNLDRYQTALEEVLSWLLSAEDTLQAQGEISNDVEVVKDQFHTHEGYMMDLTAHQGRVGNILQLGSKLIGTGKLSEDEETEVQEQMNLLNSRWECLRVASMEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQVQQHKVLQEDLEQEQVRVNSLTHMVVVVDESSGDHATAALEEQLKVLGDRWANICRWTEDRWVLLQDILLKWQRLTEEQCLFSAWLSEKEDAVNKIHTTGFKDQNEMLSSLQKLAVLKADLEKKKQSMGKLYSLKQDLLSTLKNKSVTQKTEAWLDNFARCWDNLVQKLEKSTAQISQQPDLAPGLTTIGASPTQTVTLVTQPVVTKETAISKLEMPSSLMLEVPTLERLQELQEATDELDLKLRQAEVIKGSWQPVGDLLIDSLQDHLEKVKALRGEIAPLKENVSHVNDLARQLTTLGIQLSPYNLSTLEDLNTRWKLLQVAVEDRVRQLHEAHRDFGPASQHFLSTSVQGPWERAISPNKVPYYINHETQTTCWDHPKMTELYQSLADLNNVRFSAYRTAMKLRRLQKALCLDLLSLSAACDALDQHNLKQNDQPMDILQIINCLTTIYDRLEQEHNNLVNVPLCVDMCLNWLLNVYDTGRTGRIRVLSFKTGIISLCKAHLEDKYRYLFKQVASSTGFCDQRRLGLLLHDSIQIPRQLGEVASFGGSNIEPSVRSCFQFANNKPEIEAALFLDWMRLEPQSMVWLPVLHRVAAAETAKHQAKCNICKECPIIGFRYRSLKHFNYDICQSCFFSGRVAKGHKMHYPMVEYCTPTTSGEDVRDFAKVLKNKFRTKRYFAKHPRMGYLPVQTVLEGDNMETPVTLINFWPVDSAPASSPQLSHDDTHSRIEHYASRLAEMENSNGSYLNDSISPNESIDDEHLLIQHYCQSLNQDSPLSQPRSPAQILISLES
5.2.2 編碼微小肌縮蛋白之核酸組合物
本發明之另一態樣為包含編碼如本文所描述之微小肌縮蛋白之核苷酸序列的核酸。此類核酸包含編碼具有如下自N端至C端排列之域的微小肌縮蛋白之核苷酸序列：ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，如章節5.2.1中詳述，前述 。核苷酸序列可為編碼域之任何核苷酸序列。核苷酸序列可為密碼子最佳化及/或缺乏CpG島以供在適當情形下表現。在特定實施例中，核苷酸序列編碼具有SEQ ID NO: 1、2或79之胺基酸序列的微小肌縮蛋白。核苷酸序列可為編碼微小肌縮蛋白之任何序列，包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 79之微小肌縮蛋白，核苷酸序列可因密碼簡併而變化。 表 3 及 4提供編碼 DMD域之例示性核苷酸序列。 表 3提供組分之野生型 DMD核苷酸序列且 表 4提供本文中之構築體(轉殖基因、表現構築體、順式質體及重組AAV基因體)中所用之 DMD組件的核苷酸序列，包括如下已經密碼子最佳化及/或CpG島之CPG耗乏的序列： 表 3 ：肌縮蛋白片段核苷酸序列
結構 SEQ ID 核酸序列
ABD1 22 ATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAGAGGACTGTTATGAAAGAGAAGATGTTCAAAAGAAAACATTCACAAAATGGGTAAATGCACAATTTTCTAAGTTTGGGAAGCAGCATATTGAGAACCTCTTCAGTGACCTACAGGATGGGAGGCGCCTCCTAGACCTCCTCGAAGGCCTGACAGGGCAAAAACTGCCAAAAGAAAAAGGATCCACAAGAGTTCATGCCCTGAACAATGTCAACAAGGCACTGCGGGTTTTGCAGAACAATAATGTTGATTTAGTGAATATTGGAAGTACTGACATCGTAGATGGAAATCATAAACTGACTCTTGGTTTGATTTGGAATATAATCCTCCACTGGCAGGTCAAAAATGTAATGAAAAATATCATGGCTGGATTGCAACAAACCAACAGTGAAAAGATTCTCCTGAGCTGGGTCCGACAATCAACTCGTAATTATCCACAGGTTAATGTAATCAACTTCACCACCAGCTGGTCTGATGGCCTGGCTTTGAATGCTCTCATCCATAGTCATAGGCCAGACCTATTTGACTGGAATAGTGTGGTTTGCCAGCAGTCAGCCACACAACGACTGGAACATGCATTCAACATCGCCAGATATCAATTAGGCATAGAGAAACTACTCGATCCTGAAGATGTTGATACCACCTATCCAGATAAGAAGTCCATCTTAATGTACATCACATCACTCTTCCAAGTTTTGCCT
L1 23 CAACAAGTGAGCATTGAAGCCATCCAGGAAGTGGAA
H1 24 ATGTTGCCAAGGCCACCTAAAGTGACTAAAGAAGAACATTTTCAGTTACATCATCAAATGCACTATTCTCAACAGATCACGGTCAGTCTAGCACAGGGATATGAGAGAACTTCTTCCCCTAAGCCTCGATTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCTTATGTCACCACCTCTGACCCTACACGGAGCCCATTTCCTTCACAGCATTTGGAAGCTCCTGAAGAC
L2 25 AAGTCATTTGGCAGTTCATTGATGGAG
R1 26 AGTGAAGTAAACCTGGACCGTTATCAAACAGCTTTAGAAGAAGTATTATCGTGGCTTCTTTCTGCTGAGGACACATTGCAAGCACAAGGAGAGATTTCTAATGATGTGGAAGTGGTGAAAGACCAGTTTCATACTCATGAGGGGTACATGATGGATTTGACAGCCCATCAGGGCCGGGTTGGTAATATTCTACAATTGGGAAGTAAGCTGATTGGAACAGGAAAATTATCAGAAGATGAAGAAACTGAAGTACAAGAGCAGATGAATCTCCTAAATTCAAGATGGGAATGCCTCAGGGTAGCTAGCATGGAAAAACAAAGCAATTTACATAGA
R2 27 GTTTTAATGGATCTCCAGAATCAGAAACTGAAAGAGTTGAATGACTGGCTAACAAAAACAGAAGAAAGAACAAGGAAAATGGAGGAAGAGCCTCTTGGACCTGATCTTGAAGACCTAAAACGCCAAGTACAACAACATAAGGTGCTTCAAGAAGATCTAGAACAAGAACAAGTCAGGGTCAATTCTCTCACTCACATGGTGGTGGTAGTTGATGAATCTAGTGGAGATCACGCAACTGCTGCTTTGGAAGAACAACTTAAGGTATTGGGAGATCGATGGGCAAACATCTGTAGATGGACAGAAGACCGCTGGGTTCTTTTACAAGAC
L3 28 ATCCTT
R3 29 CTCAAATGGCAACGTCTTACTGAAGAACAGTGCCTTTTTAGTGCATGGCTTTCAGAAAAAGAAGATGCAGTGAACAAGATTCACACAACTGGCTTTAAAGATCAAAATGAAATGTTATCAAGTCTTCAAAAACTGGCCGTTTTAAAAGCGGATCTAGAAAAGAAAAAGCAATCCATGGGCAAACTGTATTCACTCAAACAAGATCTTCTTTCAACACTGAAGAATAAGTCAGTGACCCAGAAGACGGAAGCATGGCTGGATAACTTTGCCCGGTGTTGGGATAATTTAGTCCAAAAACTTGAAAAGAGTACAGCACAGATTTCACAG
L4.2 46 CAAACCCTTGAA
H3 30 CAGCCTGACCTAGCTCCTGGACTGACCACTATTGGAGCCTCTCCTACTCAGACTGTTACTCTGGTGACACAACCTGTGGTTACTAAGGAAACTGCCATCTCCAAACTAGAAATGCCATCTTCCTTGATGTTGGAGGTACCT
L4 31 ACCCTTGAA
R24 32 AGACTCCAACTTCAAGAGGCCACGGATGAGCTGGACCTCAAGCTGCGCCAAGCTGAGGTGATCAAGGGATCCTGGCAGCCCGTGGGCGATCTCCTCATTGACTCTCTCCAAGATCACCTCGAGAAAGTCAAGGCACTTCGAGGAGAAATTGCGCCTCTGAAAGAGAACGTGAGCCACGTCAATGACCTTGCTCGCCAGCTTACCACTTTGGGCATTCAGCTCTCACCGTATAACCTCAGCACTCTGGAAGACCTGAACACCAGATGGAAGCTTCTGCAGGTGGCCGTCGAGGACCGAGTCAGGCAGCTGCATGAA
H4 33 GCCCACAGGGACTTTGGTCCAGCATCTCAGCACTTTCTTTCCACGTCTGTCCAGGGTCCCTGGGAGAGAGCCATCTCGCCAAACAAAGTGCCCTACTATATCAACCACGAGACTCAAACAACTTGCTGGGACCATCCCAAAATGACAGAGCTCTACCAGTCTTTAGCTGACCTGAATAATGTCAGATTCTCAGCTTATAGGACTGCCATGAAACTC
富含半胱胺酸之域(CR) 34 CGAAGACTGCAGAAGGCCCTTTGCTTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGGGACGAACAGGGAGGATCCGTGTCCTGTCTTTTAAAACTGGCATCATTTCCCTGTGTAAAGCACATTTGGAAGACAAGTACAGATACCTTTTCAAGCAAGTGGCAAGTTCAACAGGATTTTGTGACCAGCGCAGGCTGGGCCTCCTTCTGCATGATTCTATCCAAATTCCAAGACAGTTGGGTGAAGTTGCATCCTTTGGGGGCAGTAACATTGAGCCAAGTGTCCGGAGCTGCTTCCAATTTGCTAATAATAAGCCAGAGATCGAAGCGGCCCTCTTCCTAGACTGGATGAGACTGGAACCCCAGTCCATGGTGTGGCTGCCCGTCCTGCACAGAGTGGCTGCTGCAGAAACTGCCAAGCATCAGGCCAAATGTAACATCTGCAAAGAGTGTCCAATCATTGGATTCAGGTACAGGAGTCTAAAGCACTTTAATTATGACATCTGCCAAAGCTGCTTTTTTTCTGGTCGAGTTGCAAAAGGCCATAAAATGCACTATCCCATGGTGGAATATTGC
CR短 47 gccaagcatcaggccaaatgtaacatctgcaaagagtgtccaatcattggattcaggtacaggagtctaaagcactttaattatgacatctgccaaagctgctttttttctggtcgagttgcaaaaggccataaaatgcactatcccatggtggaatattgc
C端(CT)域 35 ACTCCGACTACATCAGGAGAAGATGTTCGAGACTTTGCCAAGGTACTAAAAAACAAATTTCGAACCAAAAGGTATTTTGCGAAGCATCCCCGAATGGGCTACCTGCCAGTGCAGACTGTCTTAGAGGGGGACAACATGGAAACTCCCGTTACTCTGATCAACTTCTGGCCAGTAGATTCTGCGCCTGCCTCGTCCCCTCAGCTTTCACACGATGATACTCATTCACGCATTGAACATTATGCTAGCAGGCTAGCAGAAATGGAAAACAGCAATGGATCTTATCTAAATGATAGCATCTCTCCTAATGAGAGCATAGATGATGAACATTTGTTAATCCAGCATTACTGCCAAAGTTTGAACCAGGACTCCCCCCTGAGCCAGCCTCGTAGTCCTGCCCAGATCTTGATTTCCTTAGAGAGTGAGGAAAGAGGGGAGCTAGAGAGAATCCTAGCAGATCTTGAGGAAGAAAACAGGAATCTGCAAGCAGAATATGACCGTCTAAAGCAGCAGCACGAACATAAAGGCCTGTCCCCACTGCCGTCCCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCCCAGAGTCCCCGG
L4 36 GAGACCCTTGAA
L4 37 CTTGAA
表 4 ： RGX-DYS 片段核苷酸序列 ( 經密碼子最佳化及 CpG 耗乏
結構 SEQ ID 核酸序列
ABD 57 ATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCC
L1 58 CAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAG
H1 59 ATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGAC
L2 60 AAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAA
R1 61 TCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGA
R2 62 GTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGAC
L3 63 ATTCTG
R3 64 CTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAG
H3 65 CAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCC
L4 66 ACACTGGAA
L4.1 19 AGTGTG
L4.2 38 CAGACACTGGAA
R24 67 AGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAG
H4 68 GCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTC
富含半胱胺酸之域(CR) 69 AGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGC
CR短(DYS6) 90 GCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGC
 C端(CT)域 (DYS1；CT194 ) 70 ACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTGAGGAAAGGGGAGAGCTGGAAAGAATCCTGGCAGATCTTGAGGAAGAGAACAGAAACCTGCAGGCAGAGTATGACAGGCTCAAACAGCAGCATGAGCACAAGGGACTGAGCCCTCTGCCTTCTCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCACAGTCTCCAAGG TGATGA(終止密碼子帶下劃線)
截短C端(CT1.5) 域(DYS5；CT140) 80 ACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCT TGATGA(終止密碼子帶下劃線)
L4 71 GAAACACTGGAA或GAGACACTGGAA
L4 72 CTGGAA
在一些實施例中，此類組合物包含編碼由SEQ ID NO: 22或57組成或與SEQ ID NO: 22或57具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之ABD1的核酸序列；編碼由SEQ ID NO: 24或59組成或與SEQ ID NO: 24或59具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之H1的核酸序列；編碼由SEQ ID NO: 26或61組成或與SEQ ID NO: 26或61具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之R1的核酸序列；編碼由SEQ ID NO: 27或62組成或與SEQ ID NO: 27或62具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之R2的核酸序列；編碼由SEQ ID NO: 29或64組成或與SEQ ID NO: 29或64具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之R3的核酸序列；編碼由SEQ ID NO: 30或65組成或與SEQ ID NO: 30或65具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之H3的核酸序列；編碼由SEQ ID NO: 32或67組成或與SEQ ID NO: 32或67具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之R24的核酸序列；編碼由SEQ ID NO: 33或68組成或與SEQ ID NO: 33或68具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之H4的核酸序列；編碼由SEQ ID NO: 34、47或69組成或與SEQ ID NO: 34、47或69具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之CR的核酸序列；及/或編碼由SEQ ID NO: 35或70組成或與SEQ ID NO: 35或70具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之CT，編碼具有功能活性之微小肌縮蛋白的核酸序列。
在一些實施例中，此類組合物包含編碼由SEQ ID NO: 22或57組成或與SEQ ID NO: 22或57具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之ABD1的核酸序列，且編碼SEQ ID NO: 3之ABD1域；編碼由SEQ ID NO: 24或59組成或與SEQ ID NO: 24或59具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之H1的核酸序列，且編碼SEQ ID NO: 5之H1域；編碼由SEQ ID NO: 26或61組成或與SEQ ID NO: 26或61具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之R1的核酸序列，且編碼SEQ ID NO: 7之R1域；編碼由SEQ ID NO: 27或62組成或與SEQ ID NO: 27或62具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之R2的核酸序列，且編碼SEQ ID NO: 8之R2域；編碼由SEQ ID NO: 29或64組成或與SEQ ID NO: 29或64具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之R3的核酸序列，且編碼SEQ ID NO: 10之R3域；編碼由SEQ ID NO: 30或65組成或與SEQ ID NO: 30或65具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之H3的核酸序列，且編碼SEQ ID NO: 11之H3域；編碼由SEQ ID NO: 32或67組成或與SEQ ID NO: 32或67具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之R24的核酸序列，且編碼SEQ ID NO: 13之R24域；編碼由SEQ ID NO: 33或68組成或與SEQ ID NO: 33或68具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之H4的核酸序列，且編碼SEQ ID NO: 14之H4域；編碼由SEQ ID NO: 34、47或69組成或與SEQ ID NO: 34、47或69具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之CR的核酸序列，且編碼SEQ ID NO: 15或89之CR域；及/或編碼由SEQ ID NO: 35、70或80組成或與SEQ ID NO: 35、70或80具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之序列之CT的核酸序列，且編碼SEQ ID NO: 16或83之CT域。
除前述內容以外，核酸組合物可視情況包含編碼上文所描述之位置中之連接子的核苷酸序列，該等連接子包含以下序列或由以下序列組成：編碼由SEQ ID NO: 23或58組成或與SEQ ID NO: 23或58具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之序列之L1的核酸序列(例如編碼SEQ ID NO: 4之L1域)；編碼由SEQ ID NO: 25或60組成或與SEQ ID NO: 25或60具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之序列之L2的核酸序列(例如編碼SEQ ID NO: 6之L2域)；編碼由SEQ ID NO: 28或63組成或與SEQ ID NO: 28或63具有至少50%一致性之序列之L3，編碼SEQ ID NO: 9之L3域或針對兩種L3殘基具有保守性取代之變異體的核酸序列；及編碼由SEQ ID NO: 19、31、36、37、38、46或66組成或與SEQ ID NO: 19、31、36、37、38、46或66具有至少50%、至少75%序列一致性之序列之L4的核酸序列(例如編碼SEQ ID NO: 12、17或18之L4域或與L4殘基中之任一者具有保守性取代的變異體)。
在各種實施例中，核酸包含編碼具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 79之胺基酸序列之微小肌縮蛋白的核苷酸序列。在實施例中，核酸包含為SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21或SEQ ID NO: 81 (分別編碼SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 79之微小肌縮蛋白)之核苷酸序列。在各種實施例中，編碼微小肌縮蛋白之核苷酸序列可與SEQ ID NO: 20、21或83之核苷酸序列( 表 5)或其反向互補序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性且編碼治療上有效之微小肌縮蛋白。 表 5 ： RGX-DYS 核苷酸序列
結構 SEQ ID 核酸序列
DYS1 20 ATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCA GAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCA AGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTG CTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGG CAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGC TGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTG GATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCA CTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGA CCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAAC TACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACT GGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGA ACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTC AACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGA TGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCA GCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAG GTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCA GCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCC AGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCC TACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATT TCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCC TGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAA GTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGA AATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGG GCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTG CAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGA GACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTC TGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATG GACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGAC AGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGG AAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTT GAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGT GGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGA AGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGA TGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGA ACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACA AGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTG CAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCAT GGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACA AGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGC TGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCA GCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACAC AGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATC AGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGA AAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGA GACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTC ATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGA GATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGAC AGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTT GAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAG AGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGC ACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCT AACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGA TCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATG TCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAA GCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGA CCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCA TCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAAT CTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAA TGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGA CAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATAC CTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCT GGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAG TGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTT CAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTG GATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAG TGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAA GAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTA TGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACA AAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAA GATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAG ATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGC TTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCA GTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCA CAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCA ATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGAT GAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCC ACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTG AGGAAAGGGGAGAGCTGGAAAGAATCCTGGCAGATCTTGAGGAAGAGAAC AGAAACCTGCAGGCAGAGTATGACAGGCTCAAACAGCAGCATGAGCACAA GGGACTGAGCCCTCTGCCTTCTCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCAC AGTCTCCAAGGTGATGA
DYS3 21 ATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCA GAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCA AGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTG CTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGG CAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGC TGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTG GATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCA CTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGA CCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAAC TACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACT GGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGA ACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTC AACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGA TGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCA GCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAG GTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCA GCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCC AGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCC TACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATT TCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCC TGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAA GTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGA AATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGG GCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTG CAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGA GACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTC TGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATG GACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGAC AGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGG AAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTT GAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGT GGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGA AGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGA TGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGA ACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACA AGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTG CAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCAT GGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACA AGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGC TGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCA GCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACAC AGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATC AGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGA AAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGA GACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTC ATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGA GATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGAC AGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTT GAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAG AGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGC ACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCT AACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGA TCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATG TCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAA GCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGA CCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCA TCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAAT CTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAA TGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGA CAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATAC CTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCT GGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAG TGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTT CAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTG GATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAG TGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAA GAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTA TGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACA AAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAA GATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAG ATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGC TTGAGGGTGACAACATGGAAACC
DYS5 81 ATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAGCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTTGATGA
5.2.2.1 密碼子最佳化及 CpG 耗乏
在一個態樣中，編碼微小肌縮蛋白盒之核苷酸序列係藉由密碼子最佳化及CpG二核苷酸及CpG島耗乏來修飾。針對微小肌縮蛋白轉殖基因之免疫反應為人類臨床應用問題，經在第一杜興氏肌肉失養症(DMD)基因療法臨床試驗及犬模型中之若干腺相關病毒(AAV)-微小肌縮蛋白基因療法中所證明[Mendell, J.R.,等人., Dystrophin immunity in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med, 2010. 363(15): p. 1429-37;及Kornegay, J.N.,等人., Widespread muscle expression of an AAV9 human mini-dystrophin vector after intravenous injection in neonatal dystrophin-deficient dogs. Mol Ther, 2010. 18(8): p. 1501-8]。
可藉由減少AAV基因體中之CpG二核苷酸之數目來抑制AAV引導之免疫反應[Faust, S.M.,等人., CpG-depleted adeno-associated virus vectors evade immune detection. J Clin Invest, 2013. 123(7): p. 2994-3001]。在將轉殖基因識別為非自我時，耗乏CpG模體之轉殖基因序列可削弱TLR9在先天性免疫之活化中之作用，且因此提供穩定及延長的轉殖基因表現。[亦參見Wang, D., P.W.L. Tai及G. Gao, Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(5): p. 358-378.；及Rabinowitz, J., Y.K. Chan及R.J. Samulski, Adeno-associated Virus (AAV) versus Immune Response. Viruses, 2019. 11(2)]。在實施例中，微小肌縮蛋白盒用CpG耗乏進行人類密碼子最佳化。經密碼子最佳化及CpG耗乏之核苷酸序列可藉由此項技術中已知之任何方法設計，包括例如藉由利用GeneOptimizer (Waltham, MA USA)之Thermo Fisher Scientific GeneArt基因合成工具。本文所描述之核苷酸序列SEQ ID NO: 20、21、57-72、80、81及101-103表示經密碼子最佳化及CPG耗乏之序列。
提供具有數目減少之CpG二核苷酸序列的微小肌縮蛋白轉殖基因，且因此具有數目減少之CpG島。在某些實施例中，微小肌縮蛋白核苷酸序列具有少於兩(2)個CpG島，或一(1)個CpG島或零(0)個CpG島。在實施例中，提供如藉由相較於具有超過2個CpG島之微小肌縮蛋白轉殖基因的抗藥物抗體效價所量測，具有少於2或1個CpG島、或0個具有降低之免疫原性的微小肌縮蛋白轉殖基因。在某些實施例中，基本上由SEQ ID NO: 20、21或81組成之微小肌縮蛋白核苷酸序列具有零(0)個CpG島。在其他實施例中，基本上由可操作地連接至啟動子之微小肌縮蛋白基因組成的微小肌縮蛋白轉殖基因核苷酸序列具有小於兩(2)個CpG島，其中該微小肌縮蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 20、21或81組成。在另其他實施例中，基本上由可操作地連接至啟動子之微小肌縮蛋白基因組成的微小肌縮蛋白轉殖基因核苷酸序列具有一(1)個CpG島，其中微小肌縮蛋白編碼序列由SEQ ID NO: 20、21或81組成。 5.3. 基因卡匣及調節元件
本發明之另一態樣係關於核酸表現卡匣，其包含經設計以賦予或增強微小肌縮蛋白之表現的調節元件。本發明另外涉及工程化調節元件，包括啟動子元件，且視情況強化子元件及/或內含子，以增強或促進轉殖基因表現。在一些實施例中，rAAV載體亦包括熟習此項技術者已知之此類調節控制元件，以影響由個體之目標細胞內之核酸(轉殖基因)編碼的RNA及/或蛋白質產物之表現。調節控制元件且可為組織特異性的，亦即僅在目標細胞/組織中具有活性(或實質上更具活性或明顯更具活性)。 5.3.1 啟動子 5.3.1.1 組織特異性啟動子
在特定實施例中，AAV載體之表現卡匣包含調節序列，諸如啟動子，其可操作地連接至允許在目標組織中表現之轉殖基因。啟動子可為肌肉啟動子。在某些實施例中，啟動子為肌肉特異性啟動子。片語「肌肉特異性」、「肌肉選擇性」或「肌肉引導」係指由於該等元件與肌肉細胞之胞內環境的相互作用而具有適應其在肌肉細胞或組織中之活性的核酸元件。此類肌肉細胞可包括肌細胞、肌管、心肌細胞及其類似物。包括具有不同特性之肌細胞的特殊形式，諸如心臟、骨骼及平滑肌細胞。各種治療劑可得益於轉殖基因之肌肉特異性表現。特定言之，治療遞送至肌肉細胞之多種形式的肌肉萎縮症且能夠實現肌肉細胞之高轉導效率的基因療法具有導引轉殖基因在大部分需要轉殖基因之細胞中表現的附加益處。心臟組織亦將得益於轉殖基因之肌肉引導表現。肌肉特異性啟動子可以可操作地連接至本發明之轉殖基因。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子選自存在於Pitx3之眼部形式的內含子1內之SPc5-12啟動子(SEQ ID NO: 39)、肌肉肌酸激酶肌凝蛋白輕鏈(MLC)啟動子、肌凝蛋白重鏈(MHC)啟動子、結蛋白啟動子(SEQ ID NO: 119)、MHCK7啟動子(SEQ ID NO: 120)、CK6啟動子、CK8啟動子(SEQ ID NO: 115)、MCK啟動子(或其截短形式) (SEQ ID NO: 121)、α肌動蛋白啟動子、β肌動蛋白啟動子、γ肌動蛋白啟動子、E-syn啟動子、肌鈣蛋白C啟動子、肌鈣蛋白I啟動子、myoD基因家族啟動子或肌肉選擇性啟動子。
合成啟動子c5-12 (Li, X.等人. Nature Biotechnology第17卷, 第241-245頁, MARCH 1999)，稱為SPc5-12啟動子，已顯示具有細胞類型受限表現，尤其肌肉細胞特異性表現。長度低於350 bp時，SPc5-12啟動子之長度小於大部分內源性啟動子，此在編碼治療蛋白之核酸的長度相對較長時可為有利的。
為了進一步降低載體之長度，調節元件可以為本文所描述之啟動子中之任一者的降低或縮短形式(在本文中稱為「最小啟動子」)。最小啟動子至少包含全長形式之轉錄活性域且因此仍能夠驅動表現。舉例而言，在一些實施例中，AAV載體可包含可操作地連接至治療性蛋白質轉殖基因之肌肉特異性啟動子，例如最小SPc5-12啟動子(例如，SEQ ID NO: 40)之轉錄活性域。在實施例中，治療性蛋白質為如本文所描述之微小肌縮蛋白。本發明之最小啟動子可含有或可不含有有助於以組織特異性方式調節表現的啟動子序列之部分。
因此，在實施例中，提供具有SPc5-12啟動子(SEQ ID NO: 39)或SPc5-12啟動子變異體、突變體或其片段之基因療法盒。舉例而言，RGX-DYS1及RGX-DYS5 ( 圖 2)具有Spc5-12啟動子。此等啟動子之序列提供於 表 6中。
在一些範疇內，提供經改變或突變之經修飾SPc5-12啟動子。突變體SPc5-12啟動子可包含SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94之核酸序列。此等獨特SPc5-12啟動子序列促進肌肉特異性表現且可增加由完整基因體產生之蛋白殼的產率。因此，在實施例中，提供包含突變體SPc5-12啟動子(SEQ ID NO:93或94)之基因療法載體。
在一些態樣中，提供SEQ ID NO:93之變異體。在一些態樣中，所揭示之核酸可包含與SEQ ID NO:93具有至少80%序列一致性，且在某些實施例中，與SEQ ID NO:93之核苷酸121-129及197-209具有100%序列一致性的核苷酸序列。在一些態樣中，所揭示之核酸可包含與SEQ ID NO:93具有至少85、90、95或100%序列一致性，且在一些實施例中，與SEQ ID NO:93之核苷酸121-129及197-209具有100%序列一致性的核苷酸序列。SEQ ID NO:93之變異體可為SEQ ID NO:93之序列但具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70核酸取代。在一些態樣中，變異體中之任一者相比於SEQ ID NO: 93之核苷酸121-129及197-209保持100%序列一致性且保留肌肉特異性啟動子活性。在一些態樣中，提供SEQ ID NO:94之變異體。在一些態樣中，所揭示之核酸可包含具有肌肉特異性啟動子活性、與SEQ ID NO:94具有至少80%序列一致性且在一些實施例中，與SEQ ID NO:94之核苷酸113-131及191-212具有100%序列一致性之核苷酸序列。在一些態樣中，所揭示之核酸可包含具有肌肉特異性啟動子活性、與SEQ ID NO:94具有至少85、90、95或100%序列一致性且在一些實施例中，與SEQ ID NO:94之核苷酸113-131及191-212具有100%序列一致性之核苷酸序列。SEQ ID NO:94之變異體可為具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70個核酸取代之SEQ ID NO:94的序列。在一些態樣中，變異體中之任一者相比於SEQ ID NO:94之核苷酸113-131及191-212保持100%序列一致性且保留肌肉特異性啟動子活性。
可替代地，啟動子可為組成型啟動子，例如CB7啟動子。額外啟動子包括：巨細胞病毒(CMV)啟動子、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子、MMT啟動子、EF-1α啟動子(SEQ ID NO:54)、UB6啟動子、雞β-肌動蛋白啟動子、CAG啟動子(SEQ ID NO:52)、RPE65啟動子、視蛋白啟動子、TBG (甲狀腺素-結合球蛋白)啟動子、APOA2啟動子、SERPINA1 (hAAT)啟動子或MIR122啟動子。在一些實施例中，特別是在可能需要關閉轉殖基因表現之情況下，使用誘導性啟動子，例如低氧誘導性或雷帕黴素誘導性啟動子。 表 6 ：啟動子序列
啟動子 SEQ ID 核酸序列
SPc5-12 39 GGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGC
minSPc5-12 40 GAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAG
CK8 51 CCACTACGGGTTTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCACTACGGGTTTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCACTACGGGTTTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCCTGCATGCGAAGATCTTCGAACAAGGCTGTGGGGGACTGAGGGCAGGCTGTAACAGGCTTGGGGGCCAGGGCTTATACGTGCCTGGGACTCCCAAAGTATTACTGTTCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCAGCGTCGA
CAG 52 GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAG
mU1a 53 ATGGAGGCGGTACTATGTAGATGAGAATTCAGGAGCAAACTGGGAAAAGCAACTGCTTCCAAATATTTGTGATTTTTACAGTGTAGTTTTGGAAAAACTCTTAGCCTACCAATTCTTCTAAGTGTTTTAAAATGTGGGAGCCAGTACACATGAAGTTATAGAGTGTTTTAATGAGGCTTAAATATTTACCGTAACTATGAAATGCTACGCATATCATGCTGTTCAGGCTCCGTGGCCACGCAACTCATACT
EF-1α 54 GGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG
人類肌間絲蛋白 75 CTGCAGACATGCTTGCTGCCTGCCCTGGCGTGCCCTGGCGAGGCTTGCCGTCACAGGACCCCCGCTGGCTGACTCAGGGGCGCAGGCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCGCCCCCACGGCCACGGGCCCTTTCCTGGCAGGACAGCGGGATCTTGCAGCTGTCAGGGGAGGGGATGACGGGGGACTGATGTCAGGAGGGGATACAAATAGTGCCGAACAAGGACCGGATTAGATCTACC
MHCK7 76 AAGCTTGCAT GTCTAAGCTA GACCCTTCAG ATTAAAAATA ACTGAGGTAA GGGCCTGGGT AGGGGAGGTG GTGTGAGACG CTCCTGTCTC TCCTCTATCT GCCCATCGGC CCTTTGGGGA GGAGGAATGT GCCCAAGGAC TAAAAAAAGG CCATGGAGCC AGAGGGGCGA GGGCAACAGA CCTTTCATGG GCAAACCTTG GGGCCCTGCT GTCTAGCATG CCCCACTACG GGTCTAGGCT GCCCATGTAA GGAGGCAAGG CCTGGGGACA CCCGAGATGC CTGGTTATAA TTAACCCAGA CATGTGGCTG CCCCCCCCCC CCCAACACCT GCTGCCTCTA AAAATAACCC TGTCCCTGGT GGATCCCCTG CATGCGAAGA TCTTCGAACA AGGCTGTGGG GGACTGAGGG CAGGCTGTAA CAGGCTTGGG GGCCAGGGCT TATACGTGCC TGGGACTCCC AAAGTATTAC TGTTCCATGT TCCCGGCGAA GGGCCAGCTG TCCCCCGCCA GCTAGACTCA GCACTTAGTT TAGGAACCAG TGAGCAAGTC AGCCCTTGGG GCAGCCCATA CAAGGCCATG GGGCTGGGCA AGCTGCACGC CTGGGTCCGG GGTGGGCACG GTGCCCGGGC AACGAGCTGA AAGCTCATCT GCTCTCAGGG GCCCCTCCCT GGGGACAGCC CCTCCTGGCT AGTCACACCC TGTAGGCTCC TCTATATAAC CCAGGGGCAC AGGGGCTGCC CTCATTCTAC CACCACCTCC ACAGCACAGA CAGACACTCA GGAGCAGCCA GC
截短MCK 86 CCACTACGGG TCTAGGCTGC CCATGTAAGG AGGCAAGGCC TGGGGACACC CGAGATGCCT GGTTATAATT AACCCCAACA CCTGCTGCCC CCCCCCCCCC AACACCTGCT GCCTGAGCCT      GAGCGGTTAC CCCACCCCGG TGCCTGGGTC TTAGGCTCTG TACACCATGG AGGAGAAGCT CGCTCTAAAA ATAACCCTGT CCCTGGTGGA TCCACTACGG GTCTATGCTG CCCATGTAAG      GAGGCAAGGC CTGGGGACAC CCGAGATGCC TGGTTATAAT TAACCCCAAC ACCTGCTGCC CCCCCCCCCC CAACACCTGC TGCCTGAGCC TGAGCGGTTA CCCCACCCCG GTGCCTGGGT      CTTAGGCTCT GTACACCATG GAGGAGAAGC TCGCTCTAAA AATAACCCTG TCCCTGGTGG ACCACTACGG GTCTAGGCTG CCCATGTAAG GAGGCAAGGC CTGGGGACAC CCGAGATGCC      TGGTTATAAT TAACCCCAAC ACCTGCTGCC CCCCCCCCCC AACACCTGCT GCCTGAGCCT GAGCGGTTAC CCCACCCCGG TGCCTGGGTC TTAGGCTCTG TACACCATGG AGGAGAAGCT      CGCTCTAAAA ATAACCCTGT CCCTGGTCCT CCCTGGGGAC AGCCCCTCCT GGCTAGTCAC ACCCTGTAGG CTCCTCTATA TAACCCAGGG GCACAGGGGC TGCCCCCGGG TCAC
Spc型式1 (Spc5-12之(Spc5v1)突變體) 93 AGAGGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCCATATTTGGCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCTAAAAATAACTCCGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCGgAA
Spc型式2 (Spc5-12之(Spc5v2)突變體) 94 GGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACGGACACCCAAATATGGCGACGGGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGC
在某些實施例中，啟動子為CNS特異性啟動子。舉例而言，表現卡匣可包含選自由以下基因中分離之啟動子的啟動子：神經元特異性烯醇酶(NSE)、任何神經元啟動子，諸如多巴胺-1受體或多巴胺-2受體之啟動子、突觸蛋白啟動子、CB7啟動子(雞β-肌動蛋白啟動子及CMV強化子)、RSV啟動子、GFAP啟動子(膠質原纖維酸性蛋白)、MBP啟動子(髓磷脂鹼性蛋白)、MMT啟動子、EF-1α、U86啟動子、RPE65啟動子或視蛋白啟動子、誘導性啟動子，例如低氧誘導性啟動子及藥物誘導性啟動子，諸如由雷帕黴素及相關藥劑誘導之啟動子。
在其他實施例中，表現卡匣可包含多個啟動子，其可以串聯方式置放於包含微小肌縮蛋白轉殖基因之表現卡匣中。因此，可利用串聯或雜交啟動子以便增強對多個組織類型之表現及/或直接表現(參見例如，2019年8月15日公開之PCT國際公開案第WO2019154939A1號，以引用之方式併入本文中)及特定言之，如2020年7月24日申請之PCT國際申請案第PCT/US2020/043578號中所揭示之LMTP6、LMTP13、LMTP14、LMTP15、LMTP18、LMTP19或LMTP20，以引用的方式併入本文中)。 5.3.2 內含子
某些基因表現盒進一步包括內含子，例如在微小肌縮蛋白編碼序列之5'，其可增強適當剪接且因此微小肌縮蛋白表現。因此，在一些實施例中，內含子耦合至編碼微小肌縮蛋白蛋白質之序列的5'端。特定言之，內含子核苷酸序列可連接至連接至肌動蛋白-結合域之核苷酸序列。在其他實施例中，內含子之長度低於100個核苷酸。
在實施例中，內含子為VH4內含子。VH4內含子核酸可包含如下 表 7中所示之SEQ ID NO: 41。 表 7 ：不同內含子之核苷酸序列
結構 SEQ ID 序列
VH4內含子 41 GTGAGTATCTCAGGGATCCAGACATGGGGATATGGGAGGTGCCTCTGATC CCAGGGCTCACTGTGGGTCTCTCTGTTCACAG
嵌合內含子 75 GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG
SV40內含子 76 GTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAG
在其他實施例中，內含子為衍生自人類β-血球蛋白及Ig重鏈之嵌合內含子(亦稱為β-血球蛋白剪接供體/免疫球蛋白重鏈剪接受體內含子或β-血球蛋白/IgG嵌合內含子) ( 表 7，SEQ ID NO: 75)。可利用熟習此項技術者熟知之其他內含子，諸如雞β-肌動蛋白內含子、小鼠細小病毒(MVM)內含子、人因IX內含子(例如，FIX截短內含子1)、β-血球蛋白剪接供體/免疫球蛋白重鏈、腺病毒剪接供體/免疫球蛋白剪接受體內含子、SV40後期剪接供體/剪接受體(19S/16S)內含子( 表 7，SEQ ID NO: 76)。 5.3.3 其他調節元件 5.3.3.1 polyA
本發明之另一態樣係關於表現卡匣，其包含在微小肌縮蛋白轉殖基因之編碼區下游的聚腺苷酸化(polyA)位點。對轉錄終止及導引polyA尾部之合成的任何polyA位點均適合用於本發明之AAV載體中。例示性polyA訊號衍生自(但不限於)以下：SV40晚期基因、兔β-血球蛋白基因、牛生長激素(BPH)基因、人類生長激素(hGH)基因及合成性polyA (SPA)位點。在一個實施例中，polyA訊號包含如 表 8中所示之SEQ ID NO: 42。 表 8 ： polyA 訊號之核苷酸序列
結構 SEQ ID 序列
polyA 42 AGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTG
5.3.4 病毒載體
根據本發明之微小肌縮蛋白轉殖基因可包括於AAV載體中用於向人類個體給藥基因療法。在一些實施例中，重組AAV (rAAV)載體可包含AAV病毒衣殼及病毒或人工基因體，其包含側接有AAV反向末端重複序列(ITR)之表現卡匣，其中該表現卡匣包含可操作地連接至一或多個調節序列之微小肌縮蛋白轉殖基因，該一或多個調節序列控制轉殖基因在人類肌肉或CNS細胞中之表現以表現且遞送該微小肌縮蛋白。所提供之方法適用於產生任何經分離重組AAV粒子以遞送本文所描述之微小肌縮蛋白，用於產生包含編碼微小肌縮蛋白之任何經分離重組AAV粒子的組合物，或在用於治療有需要之個體之能用微小肌縮蛋白治療的疾病或病症的方法中，該方法包含給藥編碼本文所描述之微小肌縮蛋白的任何經分離重組AAV粒子。因此，rAAV可具有此項技術中已知之任何血清型、變異體、修飾、雜交或其衍生物或其任何組合(共同稱為「血清型」)。在特定實施例中，AAV血清型具有針對肌肉組織之趨向性。且在其他實施例中，AAV血清型對肝臟具有趨向性，在此情況下，經AAV轉導之肝臟細胞形成微小肌縮蛋白分泌細胞之儲存物，從而使微小肌縮蛋白分泌至循環中。
在一些實施例中，rAAV粒子具有來自AAV8或AAV9血清型之衣殼蛋白。本文中提供具有AAV8衣殼之rAAV粒子中之RGX-DYS1構築體(重組AAV基因體，包括具有SEQ ID NO: 53之核苷酸序列的多核苷酸)及具有AAV9衣殼之rAAV粒子中之RGX-DYS1構築體(重組AAV基因體)。亦提供具有AAV8衣殼之rAAV粒子中之RGX-DYS5構築體(重組AAV基因體，包括具有SEQ ID NO: 82之核苷酸序列的多核苷酸)及具有AAV9衣殼之rAAV粒子中之RGX-DYS5構築體(重組AAV基因體)。在一些實施例中，rAAV粒子包含來自選自由以下組成之群的AAV衣殼血清型之衣殼蛋白：AAV7、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu31、AAV.hu32、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB及AAV.7m8。在一些實施例中，rAAV粒子包含與AAV8或AAV9，諸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu31、AAV.hu32及AAV.hu37具有較高序列同源性之衣殼蛋白。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV1或其衍生物、修飾或假型之AAV衣殼血清型。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV4或其衍生物、修飾或假型之AAV衣殼血清型。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV5或其衍生物、修飾或假型之AAV衣殼血清型。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV8或其衍生物、修飾或假型之AAV衣殼血清型。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV9或其衍生物、修飾或假型之AAV衣殼血清型。
在一些實施例中，rAAV粒子包含呈AAV8或AAV9衣殼蛋白質之衍生物、修飾或假型之衣殼蛋白質。在一些實施例中，rAAV粒子包含與AAV8衣殼蛋白之VP1、VP2及/或VP3序列(VP3之胺基酸序列為SEQ ID NO: 77)具有至少80%或更多一致性 ，例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致性之AAV8衣殼蛋白的衣殼蛋白。在一些實施例中，rAAV粒子包含呈AAV9衣殼蛋白質(胺基酸序列SEQ ID NO: 78)之衍生物、修飾或假型之衣殼蛋白質。在一些實施例中，rAAV粒子包含與AAV9衣殼蛋白之VP1、VP2及/或VP3序列具有至少80%或更多一致性，例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5 %等，亦即至多100%一致性之AAV8衣殼蛋白的衣殼蛋白。
在一些實施例中，rAAV粒子包含與AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu31、AAV.hu32、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB或AAV.7m8衣殼蛋白之VP1、VP2及/或VP3序列具有至少80%或更多一致性，例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致性之衣殼蛋白。在一些實施例中，rAAV粒子包含與AAV衣殼蛋白之VP1、VP2及/或VP3序列具有至少80%或更多一致性，例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致性之衣殼蛋白，該AAV衣殼蛋白與AAV8或AAV9，諸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu31、AAV.hu32及AAV.hu37具有較高序列同源性。
或者，rAAV粒子具有選自以下之血清型的衣殼蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其衍生物、修飾或假型。在一些實施例中，rAAV粒子包含與例如選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其衍生物、修飾或假型之AAV衣殼血清型的VP1、VP2及/或VP3序列具有至少80%或更多一致性，例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致性的衣殼蛋白。
舉例而言，rAAV粒子之群體可包含兩個或更多個血清型，例如包含以下中之兩者或更多者的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV粒子，或其兩者或更多者之組合。
在一些實施例中，rAAV粒子包含Anc80或Anc80L65之衣殼，如Zinn等人, 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068中所描述，其以全文引用的方式併入本文中。在某些實施例中，rAAV粒子包含具有以下胺基酸插入中之一者的衣殼：LGETTRP (SEQ ID NO:87)或LALGETTRP (SEQ ID NO:88)，如美國專利第9,193,956；9458517及9,587,282號及美國專利申請公開案第2016/0376323號中所描述，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV.7m8之衣殼，如美國專利第9,193,956號；第9,458,517號；及第9,587,282號及美國專利申請公開案第2016/0376323號中所述，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含美國專利第9,585,971號，諸如AAVPHP.B中所揭示之任何AAV衣殼。在一些實施例中，rAAV粒子包含美國專利第9,840,719號及WO 2015/013313中所揭示之任何AAV衣殼，諸如AAV.Rh74及RHM4-1，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含WO 2014/172669中所揭示之任何AAV衣殼，諸如AAV rh.74，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含如Georgiadis等人, 2016, Gene Therapy 23: 857-862及Georgiadis等人, 2018, Gene Therapy 25: 450中所描述之AAV2/5之衣殼，該等文獻中之每一者以全文引用之方式併入。在一些實施例中，rAAV粒子包含WO 2017/070491中所揭示之任何AAV衣殼，諸如AAV2tYF，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含如Puzzo等人, 2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418中所描述之AAVLK03或AAV3B之衣殼，該文獻以全文引用之方式併入。在一些實施例中，rAAV粒子包含美國專利第8,628,966號、US 8,927,514、US 9,923,120及WO 2016/049230中所揭示之任何AAV衣殼，諸如HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15或HSC16，其中之每一者以全文引用之方式併入。
在一些實施例中，rAAV粒子包含揭示於以下專利及專利申請案中之任一者中的AAV衣殼，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中：美國專利第7,282,199號；第7,906,111號；第8,524,446號；第8,999,678號；第8,628,966號；第8,927,514號；第8,734,809號；第US 9,284,357號；第9,409,953號；第9,169,299號；第9,193,956號；第9458517號；及第9,587,282號；美國專利申請公開案第2015/0374803號；第2015/0126588號；第2017/0067908號；第2013/0224836號；第2016/0215024號；第2017/0051257號；及國際專利申請案第PCT/US2015/034799號；第PCT/EP2015/053335號。在一些實施例中，rAAV粒子具有與以下專利及專利申請案(其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)中之任一者中所揭示之AAV衣殼之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更高一致(例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致)的衣殼蛋白：美國專利第7,282,199號、第7,906,111號、第8,524,446號、第8,999,678號、第8,628,966號、第8,927,514號、第8,734,809號；第US 9,284,357號、第9,409,953號、第9,169,299號、第9,193,956號、第9458517號及第9,587,282；美國專利申請公開案第2015/0374803號、第2015/0126588號、第2017/0067908號、第2013/0224836號、第2016/0215024號、第2017/0051257號；及國際專利申請案第PCT/US2015/034799號、第PCT/EP2015/053335號。
在一些實施例中，rAAV粒子具有國際申請公開案第WO 2003/052051號(參見例如´051之SEQ ID NO: 2)、第WO 2005/033321號(參見例如´321之SEQ ID NO: 123及88)、第WO 03/042397號(參見例如´397之SEQ ID NO: 2、81、85及97)、第WO 2006/068888號(參見例如 ´888之SEQ ID NO: 1及3-6)、第WO 2006/110689號(參見例如´689之SEQ ID NO: 5-38)、第WO2009/104964號(參見例如´964之SEQ ID NO: 1-5、7、9、20、22、24及31)、第WO 2010/127097號(參見例如´097之SEQ ID NO: 5-38)及第WO 2015/191508號(參見例如´508之SEQ ID NO: 80-294))及美國申請出版案第20150023924號(參見例如´924之SEQ ID NO: 1、5-10)中所揭示之衣殼蛋白，該等專利之內容各自以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子與以下中所揭示之AAV衣殼之VP1、VP2及/或VP3序列具有至少80%或更多一致性，例如85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致性的衣殼蛋白：國際申請公開案第WO 2003/052051號(參見例如，´051之SEQ ID NO: 2)、第WO 2005/033321號(參見例如，´321之SEQ ID NO: 123及88)、第WO 03/042397號(參見例如，´397之SEQ ID NO: 2、81、85及97)、第WO 2006/068888號(參見例如，´888之SEQ ID NO: 1及3-6)、第WO 2006/110689號(參見例如，´689之SEQ ID NO: 5-38)、WO2009/104964 (參見例如，964之SEQ ID NO: 1-5、7、9、20、22、24及31)、W0 2010/127097 (參見例如，´097之SEQ ID NO: 5-38)及第WO 2015/191508號(參見例如，´508之SEQ ID NO: 80-294)及美國申請出版案第20150023924號(參見例如，´924之SEQ ID NO: 1、5-10)。
例如在以下中教示基於AAV之病毒載體之核酸序列及製備重組AAV與AAV衣殼之方法：美國專利第7,282,199號、第7,906,111號、第8,524,446號、第8,999,678號、第8,628,966號、第8,927,514號、第8,734,809號、第US 9,284,357號、第9,409,953號、第9,169,299號、第9,193,956號、第9458517號及第9,587,282號；美國專利申請公開案第2015/0374803號、第2015/0126588號、第2017/0067908號、第2013/0224836號、第2016/0215024號、第2017/0051257號；國際專利申請案第PCT/US2015/034799號、第PCT/EP2015/053335號、第WO 2003/052051號、第WO 2005/033321號、第WO 03/042397號、第WO 2006/068888號、第WO 2006/110689號、第WO2009/104964號、第W0 2010/127097號及第WO 2015/191508號；及美國申請公開案第20150023924號。
在額外實施例中，rAAV粒子包含假型AAV衣殼。在一些實施例中，假型AAV衣殼為rAAV2/8或rAAV2/9假型AAV衣殼。用於製造及使用假型rAAV粒子之方法為此項技術中已知的(參見例如Duan等人, J. Virol., 75:7662-7671 (2001)；Halbert等人, J. Virol., 74:1524-1532 (2000)；Zolotukhin等人, Methods 28:158-167 (2002)；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001))。
在某些實施例中，可使用單股AAV (ssAAV)。在某些實施例中，可使用自身互補型載體，例如scAAV (參見例如Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82，McCarty等人, 2001, Gene Therapy, 第8卷, 第16期, 第1248-1254頁；及美國專利第6,596,535號；第7,125,717號；及第7,456,683號，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)。
在額外實施例中，rAAV粒子包含鑲嵌型衣殼。鑲嵌型AAV粒子包括來自不同AAV血清型之病毒衣殼蛋白之混合物。在一些實施例中，rAAV粒子包含含有選自以下之血清型之衣殼蛋白質的鑲嵌型衣殼：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。
在一些實施例中，rAAV粒子包含含有選自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8及AAVrh.10之血清型之衣殼蛋白質的鑲嵌型衣殼。
在額外實施例中，rAAV粒子包含假型化rAAV粒子。在一些實施例中，假型rAAV粒子包含(a)包含AAV ITR之核酸載體及(b)包含衍生自AAVx (例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10 AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16)之衣殼蛋白的衣殼。在額外實施例中，rAAV粒子包含含有選自以下之AAV血清型之衣殼蛋白質的假型rAAV粒子：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu31、AAV.hu32、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。在額外實施例中，rAAV粒子包含含有AAV8衣殼蛋白質之假型化rAAV粒子。在額外實施例中，rAAV粒子包含含有AAV9衣殼蛋白質之假型化rAAV粒子。在一些實施例中，假型化rAAV8或rAAV9粒子為rAAV2/8或rAAV2/9假型化粒子。用於製造及使用假型rAAV粒子之方法為此項技術中已知的(參見例如Duan等人, J. Virol., 75:7662-7671 (2001)；Halbert等人, J. Virol., 74:1524-1532 (2000)；Zolotukhin等人, Methods 28:158-167 (2002)；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001))。
在額外實施例中，rAAV粒子包含含有兩個或更多個AAV衣殼血清型之衣殼蛋白質嵌合體之衣殼。在其他實施例中，衣殼蛋白為2個或更多個來自選自以下之AAV血清型之AAV衣殼蛋白的嵌合體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。在其他實施例中，衣殼蛋白為選自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8及AAVrh.10之AAV血清型的2種或更多種AAV衣殼蛋白之嵌合體。
在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV8衣殼蛋白質之AAV衣殼蛋白嵌合體及一或多個來自選自以下之AAV血清型之AAV衣殼蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV8衣殼蛋白質及選自以下之AAV血清型的一或多個AAV衣殼蛋白的AAV衣殼蛋白嵌合體：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAVrh.8及AAVrh.10。
在一些實施例中，rAAV粒子包含一或多個選自以下之AAV衣殼血清型之AAV9衣殼蛋白衣殼蛋白的AAV衣殼蛋白嵌合體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。
在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV-9衣殼蛋白質與選自以下之一或多種AAV衣殼血清型之衣殼蛋白質的AAV衣殼蛋白嵌合體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8及AAVrh.10。
在一些實施例中，rAAV粒子包含分枝系A、B、E或F AAV衣殼蛋白。在一些實施例中，rAAV粒子包含分枝系F AAV衣殼蛋白。在一些實施例中，rAAV粒子包含分枝系E AAV衣殼蛋白。
下表 9提供針對AAV8、AAV9、AAV.rh74、AAV.hu31、AAV.hu32及AAV.hu37衣殼蛋白質之胺基酸序列及AAV2 5'及3' ITR之核酸序列的實例。 表 9 ： AAV ITR 及衣殼序列
結構 SEQ ID 序列
5'-ITR 73 CGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGT GAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT    Rep蛋白質結合位點(rps)係帶下劃線的。
3'-ITR 74 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGT GAGCGAGCGAGCGCGCAG    Rep蛋白質結合位點(rps)係帶下劃線的。
AAV8衣殼 77 MAADGYLPDW LEDNLSEGIR EWWALKPGAP KPKANQQKQD DGRGLVLPGY KYLGPFNGLD KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLQAGDNPY LRYNHADAEF QERLQEDTSF GGNLGRAVFQ AKKRVLEPLG LVEEGAKTAP GKKRPVEPSP QRSPDSSTGI GKKGQQPARK RLNFGQTGDS ESVPDPQPLG EPPAAPSGVG PNTMAAGGGA PMADNNEGAD GVGSSSGNWH CDSTWLGDRV ITTSTRTWAL PTYNNHLYKQ ISNGTSGGAT NDNTYFGYST PWGYFDFNRF HCHFSPRDWQ RLINNNWGFR PKRLSFKLFN IQVKEVTQNE GTKTIANNLT STIQVFTDSE YQLPYVLGSA HQGCLPPFPA DVFMIPQYGY LTLNNGSQAV GRSSFYCLEY FPSQMLRTGN NFQFTYTFED VPFHSSYAHS QSLDRLMNPL IDQYLYYLSR TQTTGGTANT QTLGFSQGGP NTMANQAKNW LPGPCYRQQR VSTTTGQNNN SNFAWTAGTK YHLNGRNSLA NPGIAMATHK DDEERFFPSN GILIFGKQNA ARDNADYSDV MLTSEEEIKT TNPVATEEYG IVADNLQQQN TAPQIGTVNS QGALPGMVWQ NRDVYLQGPI WAKIPHTDGN FHPSPLMGGF GLKHPPPQIL IKNTPVPADP PTTFNQSKLN SFITQYSTGQ VSVEIEWELQ KENSKRWNPE IQYTSNYYKS TSVDFAVNTE  GVYSEPRPIG TRYLTRNL
AAV9衣殼 78 MAADGYLPDW LEDNLSEGIR EWWALKPGAP QPKANQQHQD NARGLVLPGY KYLGPGNGLD KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLKAGDNPY LKYNHADAEF QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ AKKRLLEPLG LVEEAAKTAP GKKRPVEQSP QEPDSSAGIG KSGAQPAKKR LNFGQTGDTE SVPDPQPIGE PPAAPSGVGS LTMASGGGAP VADNNEGADG VGSSSGNWHC DSQWLGDRVI TTSTRTWALP TYNNHLYKQI SNSTSGGSSN DNAYFGYSTP WGYFDFNRFH CHFSPRDWQR LINNNWGFRP KRLNFKLFNI QVKEVTDNNG VKTIANNLTS TVQVFTDSDY QLPYVLGSAH EGCLPPFPAD VFMIPQYGYL TLNDGSQAVG RSSFYCLEYF PSQMLRTGNN FQFSYEFENV PFHSSYAHSQ SLDRLMNPLI DQYLYYLSKT INGSGQNQQT LKFSVAGPSN MAVQGRNYIP GPSYRQQRVS TTVTQNNNSE FAWPGASSWA LNGRNSLMNP GPAMASHKEG EDRFFPLSGS LIFGKQGTGR DNVDADKVMI TNEEEIKTTN PVATESYGQV ATNHQSAQAQ AQTGWVQNQG ILPGMVWQDR DVYLQGPIWA KIPHTDGNFH PSPLMGGFGM KHPPPQILIK NTPVPADPPT AFNKDKLNSF ITQYSTGQVS VEIEWELQKE NSKRWNPEIQ YTSNYYKSNN VEFAVNTEGV  YSEPRPIGTR YLTRNL
hu.37衣殼 48 MAADGYLPDW LEDNLSEGIR EWWDLKPGAP KPKANQQKQD DGRGLVLPGY KYLGPFNGLD KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLKAGDNPY LRYNHADAEF QERLQEDTSF GGNLGRAVFQ AKKRVLEPLG LVEEAAKTAP GKKRPVEPSP QRSPDSSTGI GKKGQQPAKK RLNFGQTGDS ESVPDPQPIG EPPAGPSGLG SGTMAAGGGA PMADNNEGAD GVGSSSGNWH CDSTWLGDRV ITTSTRTWAL PTYNNHLYKQ ISNGTSGGST NDNTYFGYST PWGYFDFNRF HCHFSPRDWQ RLINNNWGFR PKRLSFKLFN IQVKEVTQNE GTKTIANNLT STIQVFTDSE YQLPYVLGSA HQGCLPPFPA DVFMIPQYGY LTLNNGSQAV GRSSFYCLEY FPSQMLRTGN NFEFSYTFED VPFHSSYAHS QSLDRLMNPL IDQYLYYLSR TQSTGGTQGT QQLLFSQAGP ANMSAQAKNW LPGPCYRQQR VSTTLSQNNN SNFAWTGATK YHLNGRDSLV NPGVAMATHK DDEERFFPSS GVLMFGKQGA GRDNVDYSSV MLTSEEEIKT TNPVATEQYG VVADNLQQTN TGPIVGNVNS QGALPGMVWQ NRDVYLQGPI WAKIPHTDGN FHPSPLMGGF GLKHPPPQIL IKNTPVPADP PTTFSQAKLA SFITQYSTGQ VSVEIEWELQ KENSKRWNPE IQYTSNYYKS TNVDFAVNTE GTYSEPRPIG TRYLTRNL
hu.31衣殼 49 MAADGYLPDW LEDTLSEGIR QWWKLKPGPP PPKPAERHKD DSRGLVLPGY KYLGPGNGLD KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLKAGDNPY LKYNHADAEF QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ AKKRLLEPLG LVEEAAKTAP GKKRPVEQSP QEPDSSAGIG KSGSQPAKKK LNFGQTGDTE SVPDPQPIGE PPAAPSGVGS LTMASGGGAP VADNNEGADG VGSSSGNWHC DSQWLGDRVI TTSTRTWALP TYNNHLYKQI SNSTSGGSSN DNAYFGYSTP WGYFDFNRFH CHFSPRDWQR LINNNWGFRP KRLNFKLFNI QVKEVTDNNG VKTIANNLTS TVQVFTDSDY QLPYVLGSAH EGCLPPFPAD VFMIPQYGYL TLNDGGQAVG RSSFYCLEYF PSQMLRTGNN FQFSYEFENV PFHSSYAHSQ SLDRLMNPLI DQYLYYLSKT INGSGQNQQT LKFSVAGPSN MAVQGRNYIP GPSYRQQRVS TTVTQNNNSE FAWPGASSWA LNGRNSLMNP GPAMASHKEG EDRFFPLSGS LIFGKQGTGR DNVDADKVMI TNEEEIKTTN PVATESYGQV ATNHQSAQAQ AQTGWVQNQG ILPGMVWQDR DVYLQGPIWA KIPHTDGNFH PSPLMGGFGM KHPPPQILIK NTPVPADPPT AFNKDKLNSF ITQYSTGQVS VEIEWELQKE NSKRWNPEIQ YTSNYYKSNN VEFAVSTEGV YSEPRPIGTR YLTRNL
hu.32衣殼 50 MAADGYLPDW LEDTLSEGIR QWWKLKPGPP PPKPAERHKD DSRGLVLPGY KYLGPGNGLD KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLKAGDNPY LKYNHADAEF QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ AKKRLLEPLG LVEEAAKTAP GKKRPVEQSP QEPDSSAGIG KSGSQPAKKK LNFGQTGDTE SVPDPGQPIG EPPAAPSGVG SLTMASGGGA PVADNNEGAD GVGSSSGNWH CDSQWLGDRV ITTSTRTWAL PTYNNHLYKQ ISNSTSGGSS NDNAYFGYST PWGYFDFNRF HCHFSPRDWQ RLINNNWGFR PKRLNFKLFN IQVKEVTDNN GVKTIANNLT STVQVFTDSD YQLPYVLGSA HEGCLPPFPA DVFMIPQYGY LTLNDGSQAV GRSSFYCLEY FPSQMLRTGN NFQFSYEFEN VPFHSSYAHS QSLDRLMNPL IDQYLYYLSK TINGSGQNQQ TLKFSVAGPS NMAVQGRNYI PGPSYRQQRV STTVTQNNNS EFAWPGASSW ALNGRNSLMN PGPAMASHKE GEDRFFPLSG SLIFGKQGTG RDNVDADKVM ITNEEEIKTT NPVATESYGQ VATNHQSAQA QAQTGWVQNQ GILPGMVWQD RDVYLQGPIW AKIPHTDGNF HPSPLMGGFG MKHPPPQILI KNTPVPADPP TAFNKDKLNS FITQYSTGQV SVEIEWELQK ENSKRWNPEI QYTSNYYKSN NVEFAVNTEG VYSEPRPIGT RYLTRNL
Rh.74型式1 45 MAADGYLPD WLEDNLSEG IREWWDLKP GAPKPKANQ QKQDNGRGL VLPGYKYLG PFNGLDKGE PVNAADAAA LEHDKAYDQ QLQAGDNPY LRYNHADAE FQERLQEDT SFGGNLGRA VFQAKKRVL EPLGLVESP VKTAPGKKR PVEPSPQRS PDSSTGIGK KGQQPAKKR LNFGQTGDS ESVPDPQPI GEPPAGPSG LGSGTMAAG GGAPMADNN EGADGVGSS SGNWHCDST WLGDRVITT STRTWALPT YNNHLYKQI SNGTSGGST NDNTYFGYS TPWGYFDFN RFHCHFSPR DWQRLINNN WGFRPKRLN FKLFNIQVK EVTQNEGTK TIANNLTST IQVFTDSEY QLPYVLGSA HQGCLPPFP ADVFMIPQY GYLTLNNGS QAVGRSSFY CLEYFPSQM LRTGNNFEF SYNFEDVPF HSSYAHSQS LDRLMNPLI DQYLYYLSR TQSTGGTAG TQQLLFSQA GPNNMSAQA KNWLPGPCY RQQRVSTTL SQNNNSNFA WTGATKYHL NGRDSLVNP GVAMATHKD DEERFFPSS GVLMFGKQG AGKDNVDYS SVMLTSEEE IKTTNPVAT EQYGVVADN LQQQNAAPI VGAVNSQGA LPGMVWQNR DVYLQGPIW AKIPHTDGN FHPSPLMGG FGLKHPPPQ ILIKNTPVP ADPPTTFNQ AKLASFITQ YSTGQVSVE IEWELQKEN SKRWNPEIQ YTSNYYKST NVDFAVNTE GTYSEPRPI GTRYLTRNL
Rh.74型式2 85 MAADGYLPD WLEDNLSEG IREWWDLKP GAPKPKANQ QKQDNGRGL VLPGYKYLG PFNGLDKGE PVNAADAAA LEHDKAYDQ QLQAGDNPY LRYNHADAE FQERLQEDT SFGGNLGRA VFQAKKRVL EPLGLVESP VKTAPGKKR PVEPSPQRS PDSSTGIGK KGQQPAKKR LNFGQTGDS ESVPDPQPI GEPPAAPSG VGPNTMAAG GGAPMADNN EGADGVGSS SGNWHCDST WLGDRVITT STRTWALPT YNNHLYKQI SNGTSGGST NDNTYFGYS TPWGYFDFN RFHCHFSPR DWQRLINNN WGFRPKRLN FKLFNIQVK EVTQNEGTK TIANNLTST IQVFTDSEY QLPYVLGSA HQGCLPPFP ADVFMIPQY GYLTLNNGS QAVGRSSFY CLEYFPSQM LRTGNNFEF SYNFEDVPF HSSYAHSQS LDRLMNPLI DQYLYYLSR TQSTGGTAG TQQLLFSQA GPNNMSAQA KNWLPGPCY RQQRVSTTL SQNNNSNFA WTGATKYHL NGRDSLVNP GVAMATHKD DEERFFPSS GVLMFGKQG AGKDNVDYS SVMLTSEEE IKTTNPVAT EQYGVVADN LQQQNAAPI VGAVNSQGA LPGMVWQNR DVYLQGPIW AKIPHTDGN FHPSPLMGG FGLKHPPPQ ILIKNTPVP ADPPTTFNQ AKLASFITQ YSTGQVSVE IEWELQKEN SKRWNPEIQ YTSNYYKST NVDFAVNTE GTYSEPRPI GTRYLTRNL
所提供之方法適合於在製造編碼轉殖基因之重組AAV中使用。在某些實施例中，轉殖基因為如本文所描述之微小肌縮蛋白。在一些實施例中，rAAV基因體(或順式質體)包含以下組分：(1)側接表現卡匣之AAV反向末端重複；(2)調節性控制元件，諸如a)啟動子/增強子，b) poly A訊號，及c)視情況內含子；及(3)編碼所描述之轉殖基因的核酸序列。在特定實施例中，本文所描述之構築體(順式質體或重組AAV基因體序列)包含以下組分：(1)側接表現卡匣之AAV2或AAV8反向末端重複(ITR)；(2)控制元件，其包括肌肉特異性SPc5-12啟動子及小poly A訊號；及(3)提供(例如，編碼)編碼如本文所描述之微小肌縮蛋白之核酸，包括RGX-DYS1轉殖基因(SEQ ID NO:20)或RGX-DYS5轉殖基因(SEQ ID NO:81)之微小肌縮蛋白編碼序列的轉殖基因。在特定實施例中，本文所描述之構築體(順式質體或重組AAV基因體)包含以下組分：(1)側接表現卡匣之AAV2或AAV8 ITR；(2)控制元件，其包括a)肌肉特異性SPc5-12啟動子，b)小poly A訊號；及(3)微小肌縮蛋白卡匣，其包括自N端至C端：ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT的至少該部分，包括具有SEQ ID NO:16或83之胺基酸序列的CT。在特定實施例中，本文所描述之構築體包含以下組分：(1)側接表現卡匣之AAV2或AAV8 ITR；(2)控制元件，其包括a)肌肉特異性SPc5-12啟動子，b)內含子(例如，VH4)及c)小poly A訊號；及(3)微小肌縮蛋白卡匣，其包括自N端至C端ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中該CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT的至少該部分，包括具有SEQ ID NO:16或83之胺基酸序列的CT，ABD1直接耦接至VH4。
在特定實施例中，本文所描述之構築體包含以下組分：(1)側接表現卡匣之AAV2 ITR；(2)控制元件，其包括肌肉特異性SPc5-12啟動子，及b)小poly A訊號；及(3)編碼具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列的RGX-DYS1微小肌縮蛋白之核酸，包括由SEQ ID NO:20之核苷酸序列編碼。在特定實施例中，本文所描述之構築體包含以下組分：(1)側接表現卡匣之AAV2 ITR；(2)控制元件，其包括肌肉特異性SPc5-12啟動子，及b)小poly A訊號；及(3)編碼具有SEQ ID NO:79之胺基酸序列的RXG-DYS5微小肌縮蛋白之核酸，包括由SEQ ID NO:81之核苷酸序列編碼。在一些實施例中，包含側接微小肌縮蛋白表現卡匣之AAV ITR的本文所描述之構築體的長度可在4000個核苷酸及5000個核苷酸之間，該表現卡匣包括自N端至C端ABD1-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR-CT，其中該CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT的至少該部分，包括具有SEQ ID NO:16或83之胺基酸序列的CT。在一些實施例中，此類構築體(包括ITR序列之重組AAV基因體)長度低於4900個核苷酸、4800個核苷酸、4700個核苷酸、4600個核苷酸、4500個核苷酸、4400個核苷酸或4300個核苷酸。
本發明之一些核酸實施例包含編碼包含下 表 10中所提供之SEQ ID NO: 53、55或82之核苷酸序列或由其組成之微小肌縮蛋白的rAAV載體(順式質體或重組AAV基因體)。在各種實施例中，rAAV載體包含與SEQ ID NO: 53、55或82之核苷酸序列或其反向互補序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的核苷酸序列且編碼適用於在中表現治療上有效之微小肌縮蛋白的rAAV載體。在實施例中，具有SEQ ID NO: 53、55或82之核苷酸序列的構築體位於重組rAAV8或rAAV9粒子中。在實施例中，重組AAV載體或粒子為AAV8-RGX-DYS1。 表 10 ： RGX-DYS 卡匣及基因體核苷酸序列
結構 SEQ ID 核酸序列
編碼RGX-DYS1 (完整基因體SPc5-12至polyA，包括介入序列及側接ITR)    編碼μDys-CT194    4734bp ITR 以小寫字母展示 53 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctCTAGAGGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCGgAATTCGCCACCATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAGCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTGAGGAAAGGGGAGAGCTGGAAAGAATCCTGGCAGATCTTGAGGAAGAGAACAGAAACCTGCAGGCAGAGTATGACAGGCTCAAACAGCAGCATGAGCACAAGGGACTGAGCCCTCTGCCTTCTCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCACAGTCTCCAAGGTGATGACTCGAGAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
編碼RGX-DYS3 (完整基因體SPc5-12至polyA，包括介入序列且側接ITR序列)    編碼μDys-CT48    4364 bp    ITR 以小寫字母展示 55 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctCTAGAGGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGGTGAGTATCTCAGGGATCCAGACATGGGGATATGGGAGGTGCCTCTGATCCCAGGGCTCACTGTGGGTCTCTCTGTTCACAGGAATTCGCCACCATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAGCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCTGATGAGTCGACAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG GCTAGCTGCGGCCGCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
編碼RGX-DYS5 (完整基因體SPc5-12至polyA，包括具有側接ITR序列之介入序列)    編碼μDys-CT140    4560bp    ITR 以小寫字母展示 82 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctCTAGAGGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCGGAATTCGCCACCATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAGCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTTGATGAGTCGACAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCTAGCTGCGGCCGCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
編碼RGX-DYS1    (完整基因體SPc5-12v1至polyA，包括介入序列且側接ITR序列) ITR 以小寫字母展示 95 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctCTAGAAGAGGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCCATATTTGGCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCTAAAAATAACTCCGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCGgAAGgAATTCGCCACCATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAGCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTGAGGAAAGGGGAGAGCTGGAAAGAATCCTGGCAGATCTTGAGGAAGAGAACAGAAACCTGCAGGCAGAGTATGACAGGCTCAAACAGCAGCATGAGCACAAGGGACTGAGCCCTCTGCCTTCTCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCACAGTCTCCAAGGTGATGACTCGAGAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
編碼RGX-DYS1       (完整基因體SPc5-12v2至polyA，包括介入序列且側接ITR序列) ITR 以小寫字母展示 96 ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctCATATGcagggtaatggggatcctCTAGAGGCCGTCCGCCCTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACGGACACCCAAATATGGCGACGGGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCGgAATTCGCCACCATGCTTTGGTGGGAAGAGGTGGAAGATTGCTATGAGAGGGAAGATGTGCAGAAGAAAACCTTCACCAAATGGGTCAATGCCCAGTTCAGCAAGTTTGGCAAGCAGCACATTGAGAACCTGTTCAGTGACCTGCAGGATGGCAGAAGGCTGCTGGATCTGCTGGAAGGCCTGACAGGCCAGAAGCTGCCTAAAGAGAAGGGCAGCACAAGAGTGCATGCCCTGAACAATGTGAACAAGGCCCTGAGAGTGCTGCAGAACAACAATGTGGACCTGGTCAATATTGGCAGCACAGACATTGTGGATGGCAACCACAAGCTGACCCTGGGCCTGATCTGGAACATCATCCTGCACTGGCAAGTGAAGAATGTGATGAAGAACATCATGGCTGGCCTGCAGCAGACCAACTCTGAGAAGATCCTGCTGAGCTGGGTCAGACAGAGCACCAGAAACTACCCTCAAGTGAATGTGATCAACTTCACCACCTCTTGGAGTGATGGACTGGCCCTGAATGCCCTGATCCACAGCCACAGACCTGACCTGTTTGACTGGAACTCTGTTGTGTGCCAGCAGTCTGCCACACAGAGACTGGAACATGCCTTCAACATTGCCAGATACCAGCTGGGAATTGAGAAACTGCTGGACCCTGAGGATGTGGACACCACCTATCCTGACAAGAAATCCATCCTCATGTACATCACCAGCCTGTTCCAGGTGCTGCCCCAGCAAGTGTCCATTGAGGCCATTCAAGAGGTTGAGATGCTGCCCAGACCTCCTAAAGTGACCAAAGAGGAACACTTCCAGCTGCACCACCAGATGCACTACTCTCAGCAGATCACAGTGTCTCTGGCCCAGGGATATGAGAGAACAAGCAGCCCCAAGCCTAGGTTCAAGAGCTATGCCTACACACAGGCTGCCTATGTGACCACATCTGACCCCACAAGAAGCCCATTTCCAAGCCAGCATCTGGAAGCCCCTGAGGACAAGAGCTTTGGCAGCAGCCTGATGGAATCTGAAGTGAACCTGGATAGATACCAGACAGCCCTGGAAGAAGTGCTGTCCTGGCTGCTGTCTGCTGAGGATACACTGCAGGCTCAGGGTGAAATCAGCAATGATGTGGAAGTGGTCAAGGACCAGTTTCACACCCATGAGGGCTACATGATGGACCTGACAGCCCACCAGGGCAGAGTGGGAAATATCCTGCAGCTGGGCTCCAAGCTGATTGGCACAGGCAAGCTGTCTGAGGATGAAGAGACAGAGGTGCAAGAGCAGATGAACCTGCTGAACAGCAGATGGGAGTGTCTGAGAGTGGCCAGCATGGAAAAGCAGAGCAACCTGCACAGAGTGCTCATGGACCTGCAGAATCAGAAACTGAAAGAACTGAATGACTGGCTGACCAAGACAGAAGAAAGGACTAGGAAGATGGAAGAGGAACCTCTGGGACCAGACCTGGAAGATCTGAAAAGACAGGTGCAGCAGCATAAGGTGCTGCAAGAGGACCTTGAGCAAGAGCAAGTCAGAGTGAACAGCCTGACACACATGGTGGTGGTTGTGGATGAGTCCTCTGGGGATCATGCCACAGCTGCTCTGGAAGAACAGCTGAAGGTGCTGGGAGACAGATGGGCCAACATCTGTAGGTGGACAGAGGATAGATGGGTGCTGCTCCAGGACATTCTGCTGAAGTGGCAGAGACTGACAGAGGAACAGTGCCTGTTTTCTGCCTGGCTCTCTGAGAAAGAGGATGCTGTCAACAAGATCCATACCACAGGCTTCAAGGATCAGAATGAGATGCTCAGCTCCCTGCAGAAACTGGCTGTGCTGAAGGCTGACCTGGAAAAGAAAAAGCAGTCCATGGGCAAGCTCTACAGCCTGAAGCAGGACCTGCTGTCTACCCTGAAGAACAAGTCTGTGACCCAGAAAACTGAGGCCTGGCTGGACAACTTTGCTAGATGCTGGGACAACCTGGTGCAGAAGCTGGAAAAGTCTACAGCCCAGATCAGCCAGCAACCTGATCTTGCCCCTGGCCTGACCACAATTGGAGCCTCTCCAACACAGACTGTGACCCTGGTTACCCAGCCAGTGGTCACCAAAGAGACAGCCATCAGCAAACTGGAAATGCCCAGCTCTCTGATGCTGGAAGTCCCCACACTGGAAAGGCTGCAAGAACTTCAAGAGGCCACAGATGAGCTGGACCTGAAGCTGAGACAGGCTGAAGTGATCAAAGGCAGCTGGCAGCCAGTTGGGGACCTGCTCATTGATAGCCTGCAGGACCATCTGGAAAAAGTGAAAGCCCTGAGGGGAGAGATTGCCCCTCTGAAAGAAAATGTGTCCCATGTGAATGACCTGGCCAGACAGCTGACCACACTGGGAATCCAGCTGAGCCCCTACAACCTGAGCACCCTTGAGGACCTGAACACCAGGTGGAAGCTCCTCCAGGTGGCAGTGGAAGATAGAGTCAGGCAGCTGCATGAGGCCCACAGAGATTTTGGACCAGCCAGCCAGCACTTTCTGTCTACCTCTGTGCAAGGCCCCTGGGAGAGAGCTATCTCTCCTAACAAGGTGCCCTACTACATCAACCATGAGACACAGACCACCTGTTGGGATCACCCCAAGATGACAGAGCTGTACCAGAGTCTGGCAGACCTCAACAATGTCAGATTCAGTGCCTACAGGACTGCCATGAAGCTCAGAAGGCTCCAGAAAGCTCTGTGCCTGGACCTGCTTTCCCTGAGTGCAGCTTGTGATGCCCTGGACCAGCACAATCTGAAGCAGAATGACCAGCCTATGGACATCCTCCAGATCATCAACTGCCTCACCACCATCTATGATAGGCTGGAACAAGAGCACAACAATCTGGTCAATGTGCCCCTGTGTGTGGACATGTGCCTGAATTGGCTGCTGAATGTGTATGACACAGGCAGAACAGGCAGGATCAGAGTCCTGTCCTTCAAGACAGGCATCATCTCCCTGTGCAAAGCCCACTTGGAGGACAAGTACAGATACCTGTTCAAGCAAGTGGCCTCCAGCACAGGCTTTTGTGACCAGAGAAGGCTGGGCCTGCTCCTGCATGACAGCATTCAGATCCCTAGACAGCTGGGAGAAGTGGCTTCCTTTGGAGGCAGCAATATTGAGCCATCAGTCAGGTCCTGTTTTCAGTTTGCCAACAACAAGCCTGAGATTGAGGCTGCCCTGTTCCTGGACTGGATGAGACTTGAGCCTCAGAGCATGGTCTGGCTGCCTGTGCTTCATAGAGTGGCTGCTGCTGAGACTGCCAAGCACCAGGCCAAGTGCAACATCTGCAAAGAGTGCCCCATCATTGGCTTCAGATACAGATCCCTGAAGCACTTCAACTATGATATCTGCCAGAGCTGCTTCTTTAGTGGCAGGGTTGCCAAGGGCCACAAAATGCACTACCCCATGGTGGAATACTGCACCCCAACAACCTCTGGGGAAGATGTTAGAGACTTTGCCAAGGTGCTGAAAAACAAGTTCAGGACCAAGAGATACTTTGCTAAGCACCCCAGAATGGGCTACCTGCCTGTCCAGACAGTGCTTGAGGGTGACAACATGGAAACCCCTGTGACACTGATCAATTTCTGGCCAGTGGACTCTGCCCCTGCCTCAAGTCCACAGCTGTCCCATGATGACACCCACAGCAGAATTGAGCACTATGCCTCCAGACTGGCAGAGATGGAAAACAGCAATGGCAGCTACCTGAATGATAGCATCAGCCCCAATGAGAGCATTGATGATGAGCATCTGCTGATCCAGCACTACTGTCAGTCCCTGAACCAGGACTCTCCACTGAGCCAGCCTAGAAGCCCTGCTCAGATCCTGATCAGCCTTGAGTCTGAGGAAAGGGGAGAGCTGGAAAGAATCCTGGCAGATCTTGAGGAAGAGAACAGAAACCTGCAGGCAGAGTATGACAGGCTCAAACAGCAGCATGAGCACAAGGGACTGAGCCCTCTGCCTTCTCCTCCTGAAATGATGCCCACCTCTCCACAGTCTCCAAGGTGATGACTCGAGAGGCCTAATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGCCAGGGTAATGGGCTAGCTGCGGCCGCaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
5.3.5 製備 rAAV 粒子之方法
本發明之另一態樣涉及製成本文所揭示之分子。在一些實施例中，根據本發明之分子係藉由以下製備：提供包含編碼本文中之衣殼蛋白分子中之任一者之核酸序列的核苷酸；且使用封裝細胞系統製備具有由衣殼蛋白組成之衣殼塗層的對應rAAV粒子。此類衣殼蛋白質描述於章節5.3.4中，見上文。在一些實施例中，核酸序列編碼本文所描述之衣殼蛋白分子之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%或95%，較佳96%、97%、98%、99%或99.9%一致性的序列，且保留(或實質上保留)來自異源蛋白或其結構域之衣殼蛋白及插入肽的生物功能。在一些實施例中，核酸編碼與AAV8衣殼蛋白之序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%或95%，較佳96%、97%、98%、99%或99.9%一致性，同時保持(或實質上保持) AAV8衣殼蛋白及插入肽之生物功能的序列。
衣殼蛋白、包衣及rAAV粒子可藉由此項技術中已知之技術產生。在一些實施例中，病毒基因體包含至少一個反向末端重複序列以允許封裝至載體中。在一些實施例中，病毒基因體進一步包含cap基因及/或rep基因用於cap基因之表現及剪接。在某些實施例中，cap及rep基因由封裝細胞提供且不存在於病毒基因體中。
在一些實施例中，編碼工程化衣殼蛋白之核酸 經選殖至AAV Rep-Cap質體中代替現存衣殼基因。當一起引入宿主細胞中時，此質體幫助將rAAV基因體封裝至作為衣殼包衣的工程化衣殼蛋白中。封裝細胞可為具有促進AAV基因體複製、衣殼組裝及封裝所必需之基因的任何細胞型。
許多基於細胞培養物之系統為此項技術中已知用於產生rAAV粒子，其中任一者可用於實踐本文所揭示之方法。基於細胞培養物之系統包括轉染、穩定細胞株產生及感染性雜交病毒產生系統，其包括(但不限於)腺病毒-AAV雜交物、疱疹病毒-AAV雜交物及桿狀病毒-AAV雜交物。用於產生rAAV病毒粒子之rAAV產生培養物需要：(1)適合之宿主細胞，包括(例如)人類衍生之細胞株、哺乳動物細胞株或昆蟲衍生之細胞株；(2)適合之輔助病毒功能，其由野生型或突變體腺病毒(諸如熱敏腺病毒)、疱疹病毒、桿狀病毒或提供輔助細胞功能之質體構築體提供；(3) AAV rep及cap基因及基因產物；(4)由AAV ITR序列及視情況調節元件側接之轉殖基因(諸如治療性轉殖基因)；及(5)適合之培養基及培養基組分(養分)以支持細胞生長/存活及rAAV產生。
宿主細胞之非限制性實例包括：A549、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、HEK293及其衍生物(HEK293T細胞、HEK293F細胞)、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、初級成纖維細胞、肝細胞、成肌細胞、CHO細胞及CHO衍生之細胞或昆蟲衍生之細胞株，諸如SF-9 (例如，在桿狀病毒產生系統之情況下)。關於綜述，參見Aponte-Ubillus等人, 2018, Appl. Microbiol. Biotechnol. 102:1045-1054，其關於製造技術之全文以引用之方式併入本文中。
在一個態樣中，本文提供一種產生rAAV粒子的方法，其包含：(a)提供包含昆蟲細胞之細胞培養物；(b)向細胞中引入一或多個編碼以下中之至少一者的桿狀病毒載體：i.待封裝之rAAV基因體，ii.足以封裝之AAV rep蛋白質，及iii.足以封裝之AAV cap蛋白質；(c)添加至細胞培養物充足養分且在允許產生rAAV粒子之條件下維持該細胞培養物。在一些實施例中，該方法包含使用編碼rep及cap基因之第一桿狀病毒載體及編碼rAAV基因體之第二桿狀病毒載體。在一些實施例中，該方法包含使用編碼rAAV基因體之桿狀病毒及表現rep及cap基因之昆蟲細胞。在一些實施例中，該方法包含使用編碼rep及cap基因及rAAV基因體之桿狀病毒載體。在一些實施例中，昆蟲細胞為Sf-9細胞。在一些實施例中，昆蟲細胞為包含一或多個編碼rep及cap基因之穩定整合之異源性聚核苷酸的Sf-9細胞。
在一些實施例中，本文所揭示之方法使用桿狀病毒產生系統。在一些實施例中，桿狀病毒產生系統使用編碼rep及cap基因之第一桿狀病毒及編碼rAAV基因體之第二桿狀病毒。在一些實施例中，桿狀病毒產生系統使用編碼rAAV基因體之桿狀病毒及表現rep及cap基因之宿主細胞。在一些實施例中，桿狀病毒產生系統使用編碼rep及cap基因及rAAV基因體之桿狀病毒。在一些實施例中，桿狀病毒產生系統使用昆蟲細胞，諸如Sf-9細胞。
熟習此項技術者瞭解，藉以AAV rep及cap基因、AAV輔助基因(例如，腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因及VA基因)及rAAV基因體(包含一或多個藉由反向末端重複(ITR)側接之相關基因)之許多方法可引入至細胞中以產生或封裝rAAV。片語「腺病毒輔助功能」係指在細胞(RNA或蛋白質形式)中表現使得AAV在細胞中有效生長的多種病毒輔助基因。熟習此項技術者應瞭解，輔助病毒，包括腺病毒及單純疱疹病毒(HSV)，促進AAV複製且已鑑別提供必要功能之某些基因，例如輔助可誘導有助於此類AAV基因表現及複製之細胞環境的變化。在本文所揭示之方法的一些實施例中，AAV rep及cap基因、輔助基因及rAAV基因體藉由一或多種轉染編碼AAV rep及cap基因、輔助基因及rAAV基因體之質體載體引入至細胞中。在本文所揭示之方法的一些實施例中，AAV rep及cap基因、輔助基因及rAAV基因體可藉由用病毒載體轉導引入至細胞中，該等病毒載體例如編碼AAV rep及cap基因、輔助基因及rAAV基因體之rHSV載體。在本文所揭示之方法的一些實施例中，AAV rep及cap基因、輔助基因及rAAV基因體中之一或多者藉由用rHSV載體轉導引入至細胞中。在一些實施例中，rHSV載體編碼AAV rep及cap基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼rAAV基因體。在一些實施例中，rHSV載體編碼AAV rep及cap基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助基因及rAAV基因體。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助基因及AAV rep及cap基因。
在一個態樣中，本文提供一種產生rAAV粒子之方法，其包含(a)提供包含宿主細胞之細胞培養物；(b)向細胞中引入一或多個編碼以下中之至少一者的rHSV載體：i.待封裝之rAAV基因體，ii.用於封裝rAAV粒子所需的輔助功能，iii.足以封裝之AAV rep蛋白質，及iv.足以封裝之AAV cap蛋白質；(c)添加至細胞培養物充足養分且在允許產生rAAV粒子之條件下維持該細胞培養物。在一些實施例中，rHSV載體編碼AAV rep及cap基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助功能。在一些實施例中，rHSV載體包含一或多個編碼輔助功能之內源性基因。在一些實施例中，rHSV載體包含一或多個編碼輔助功能之異質性基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼rAAV基因體。在一些實施例中，rHSV載體編碼AAV rep及cap基因。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助功能及rAAV基因體。在一些實施例中，rHSV載體編碼輔助功能及AAV rep及cap基因。在一些實施例中，細胞包含一或多個編碼rep及cap基因之經穩定整合之異源聚核苷酸。
在一個態樣中，本文提供一種產生rAAV粒子之方法，其包含(a)提供包含哺乳動物細胞之細胞培養物；(b)向細胞中引入一或多個編碼以下中之至少一者的聚核苷酸：i.待封裝之rAAV基因體(包括例如具有SEQ ID NO: 53之核苷酸序列的重組AAV基因體)，ii.用於封裝rAAV粒子所需的輔助功能，iii.足以封裝之AAV rep蛋白質，及iv.足以封裝之AAV cap蛋白質；(c)添加至細胞培養物充足養分且在允許產生rAAV粒子之條件下維持該細胞培養物。在一些實施例中，輔助功能係由腺病毒基因編碼。在一些實施例中，哺乳動物細胞包含一或多個編碼rep及cap基因之經穩定整合之異源聚核苷酸。
產生編碼AAV rep及cap基因、輔助基因及/或rAAV基因體之質體或病毒載體的分子生物學技術為此項技術中通常已知的。在一些實施例中，AAV rep及cap基因由一個質體載體編碼。在一些實施例中，AAV輔助基因(例如，腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因及VA基因)由一個質體載體編碼。在一些實施例中，E1a基因或E1b基因由宿主細胞穩定地表現，且剩餘AAV輔助基因藉由一個病毒載體轉染而引入至細胞中。在一些實施例中，E1a基因及E1b基因由宿主細胞穩定地表現，且E4基因、E2a基因及VA基因藉由一個質體載體轉染而引入至細胞中。在一些實施例中，一或多個輔助基因由宿主細胞穩定地表現，且藉由一個質體載體轉染將一或多個輔助基因引入細胞中。在一些實施例中，輔助基因由宿主細胞穩定地表現。在一些實施例中，AAV rep及cap基因由一個病毒載體編碼。在一些實施例中，AAV輔助基因(例如，腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因及VA基因)由一個病毒載體編碼。在一些實施例中，E1a基因或E1b基因由宿主細胞穩定地表現，且剩餘AAV輔助基因藉由一個病毒載體轉染而引入至細胞中。在一些實施例中，E1a基因及E1b基因由宿主細胞穩定地表現，且E4基因、E2a基因及VA基因藉由一個病毒載體轉染而引入至細胞中。在一些實施例中，一或多個輔助基因由宿主細胞穩定地表現，且藉由一個病毒載體轉染將一或多個輔助基因引入細胞中。在一些實施例中，AAV rep及cap基因、用於封裝所需之腺病毒輔助功能及待封裝之rAAV基因體藉由經一或多個聚核苷酸，例如載體轉染而引入至細胞中。在一些實施例中，本文所揭示之方法包含用三種聚核苷酸之混合物轉染細胞：一種編碼cap及rep基因、一種編碼封裝所需之腺病毒輔助功能(例如，腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因及VA基因)及一種編碼待包裝之rAAV基因體。在一些實施例中，AAV cap基因為AAV8或AAV9 cap基因。在一些實施例中，AAV cap基因為AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB或AAV.7m8 cap基因。在一些實施例中，AAV cap基因編碼與AAV8或AAV9，諸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1及AAV.hu37具有較高序列同源性的衣殼蛋白。在一些實施例中，待封裝之編碼rAAV基因體的載體包含側接有AAV ITR之相關基因。在一些實施例中，AAV ITR來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型。
載體之任何組合可用於將AAV rep及cap基因、AAV輔助基因及rAAV基因體引入其中產生或封裝rAAV粒子之細胞。在本文所揭示之方法的一些實施例中，可使用編碼rAAV基因體之第一質體載體，該rAAV基因體包含由AAV反向末端重複序列(ITR)側接之相關基因、編碼AAV rep及cap基因之第二載體及編碼輔助基因之第三載體。在一些實施例中，三種載體之混合物共轉染至細胞中。在一些實施例中，轉染及感染之組合藉由使用質體載體以及病毒載體兩者來使用。
在一些實施例中，rep及cap基因及AAV輔助基因中之一或多者由細胞組成性表現且不需要轉染或轉導至細胞中。在一些實施例中，細胞組成性表現rep及/或cap基因。在一些實施例中，細胞組成性表現一或多個AAV輔助基因。在一些實施例中，細胞組成性表現E1a。在一些實施例中，細胞包含編碼rAAV基因體之穩定的轉殖基因。
在一些實施例中，AAV rep、 cap及輔助基因(例如，Ela基因、E1b基因、E4基因、E2a基因或VA基因)可具有任何AAV血清型。類似地，AAV ITR亦可具有任何AAV血清型。舉例而言，在一些實施例中，AAV ITR來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型(例如，具有來自超過一個血清型之序列的雜交血清型)。在一些實施例中，AAV cap基因來自AAV8或AAV9 cap基因。在一些實施例中，AAV cap基因來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16、AAV.rh74、AAV.hu31、AAV.hu32或AAV.hu37或其他AAV血清型(例如，具有來自超過一個血清型之序列的雜交血清型)。在一些實施例中，用於產生rAAV粒子之AAV rep及cap基因來自不同血清型。舉例而言， rep基因來自AAV2，而 cap基因來自AAV8。在另一實例中， rep基因來自AAV2，而 cap基因來自AAV9。
在一些實施例中，rep基因來自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15及AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型(例如，具有來自超過一個血清型之序列的雜交血清型)。在其他實施例中， rep及 cap基因來自相同血清型。在其他實施例中， rep及 cap基因來自相同血清型，且 rep基因包含至少一個經修飾之蛋白質域或經修飾之啟動子域。在某些實施例中，至少一個經修飾之域包含與衣殼血清型不同之血清型的核苷酸序列。 rep基因內經修飾之域可為由不同血清型之片段組成的雜交核苷酸序列。
雜交 rep基因提供改善之rAAV粒子的封裝效率，包括封裝包含超過4 kb、超過4.1 kb、超過4.2 kB、超過4.3 kb、超過4.4 kB、超過4.5 kb或超過4.6 kb之微小肌縮蛋白轉殖基因的病毒基因體。AAV rep基因由核酸序列組成，該等核酸序列編碼複製及產生病毒所需的非結構蛋白。 rep基因之轉錄自p5或p19啟動子起始，以分別產生兩個大型(Rep78及Rep68)及兩個小型(Rep52及Rep40)非結構性Rep蛋白質。另外，Rep78/68域含有鑑別ITR內之特異性ITR序列的DNA結合域。所有四個Rep蛋白質具有在基因體複製及/或衣殼化中起作用之共同解螺旋酶及ATP酶域(Maurer AC, 2020, DOI: 10.1089/hum.2020.069)。 cap基因之轉錄由p40啟動子引發，該序列在 rep基因之C端內，且已表明 rep基因中之其他元件可誘導p40啟動子活性。p40啟動子域包括轉錄因子結合元件EF1A、MLTF及ATF、Fos/Jun結合元件(AP-1)、Sp1樣元件(Sp1及GGT)及TATA元件(Pereira及Muzyczka, Journal of Virology, 1997年6月, 71(6):4300-4309)。在一些實施例中， rep基因包含經修飾之p40啟動子。在一些實施例中，p40啟動子在EF1A結合元件、MLTF結合元件、ATF結合元件、Fos/Jun結合元件(AP-1)、Sp1樣元件(Sp1或GGT)或TATA元件中之任一者或多者處經修飾。在其他實施例中， rep基因具有血清型1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、rh8、rh10、rh20、rh39、rh.74、RHM4-1或hu37，且p40啟動子域之部分或元件經修飾成血清型2。在其他實施例中， rep基因具有血清型8或9，且p40啟動子域之部分或元件經修飾成血清型2。
ITR含有A及A'互補序列、B及B'互補序列及C及C'互補序列；且D序列與ssDNA基因體相鄰。ITR之互補序列藉由自黏接形成髮夾結構(Berns KI. The Unusual Properties of the AAV Inverted Terminal Repeat. Hum Gene Ther2020)。D序列含有Rep結合元件(RBE)及末端解析度位點(TRS)，其共同構成AAV複製起點。ITR亦需要作為複製後基因體衣殼化之封裝訊號。在一些實施例中，ITR序列及 cap基因來自相同血清型，不同之處在於A及A'互補序列、B及B'互補序列、C及C'互補序列或D序列中之一或多者可經修飾以含有與衣殼不同之血清型的序列。在一些實施例中，經修飾之ITR序列來自與rep基因相同的血清型。在其他實施例中，ITR序列及 cap基因來自不同血清型，不同之處在於選自A及A'互補序列、B及B'互補序列、C及C'互補序列或D序列之ITR序列中的一或多者來自與衣殼之相同血清型( cap基因)，且ITR序列中之一或多者來自與 rep基因相同之血清型。
在一些實施例中，rep及cap基因來自相同血清型，且rep基因包含經修飾之Rep78域、DNA結合域、核酸內切酶域、ATP酶域、解螺旋酶域、p5啟動子域、Rep68域、p5啟動子域、Rep52域、p19啟動子域、Rep40域或p40啟動子域。在其他實施例中，rep及cap基因來自相同血清型，且rep基因包含至少一個來自不同血清型之蛋白質域或啟動子域。在一個實施例中，rAAV包含側接AAV2 ITR序列之轉殖基因、AAV8 cap及雜交AAV2/8 rep。在另一個實施例中，AAV2/8 rep包含血清型8 rep，但p40啟動子域或其一部分來自血清型2 rep。在其他實施例中，AAV2/8 rep包含血清型2 rep，但p40啟動子域或其一部分來自血清型8 rep。在一些實施例中，可利用超過兩種血清型來構築雜交 rep/ cap質體。
此項技術中已知之任何適合方法均可用於根據本文所揭示之方法轉染細胞，該細胞可用於產生rAAV粒子。在一些實施例中，本文所揭示之方法包含使用基於化學之轉染方法轉染細胞。在一些實施例中，基於化學之轉染方法使用磷酸鈣、高度分支化有機化合物(樹枝狀聚合物)、陽離子聚合物(例如，DEAE聚葡萄糖或聚乙烯亞胺(PEI))、脂質體轉染。在一些實施例中，基於化學之轉染方法使用陽離子聚合物(例如，DEAE聚葡萄糖或聚乙烯亞胺(PEI))。在一些實施例中，基於化學之轉染方法使用聚乙烯亞胺(PEI)。在一些實施例中，基於化學之轉染方法使用DEAE聚葡萄糖。在一些實施例中，基於化學之轉染方法使用磷酸鈣。
標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉化(例如，電穿孔、脂質體轉染)。酶促反應及純化技術可根據製造商之說明書或如此項技術中通常所為或如本文所描述執行。前述技術及程序一般可根據在本領域中熟知及如在本說明書通篇中所引用及論述的各種一般及更特定參考文獻中所描述的習知方法執行。參見例如Sambrook等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其出於任何目的以引用的方式併入本文中。除非提供具體定義，否則本文所描述之結合分析化學、合成有機化學以及醫學及醫藥化學所用之命名法及該等學科之實驗程序及技術為此項技術中眾所周知且常用的彼等命名法以及程序及技術。標準技術可用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞以及患者治療。
基於AAV之病毒載體之核酸序列及製成重組AAV及AAV衣殼之方法教示於例如US 7,282,199；US 7,790,449；US 8,318,480；US 8,962,332；及PCT/EP2014/076466中，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
提供用於產生含有編碼如本文所揭示之微小肌縮蛋白之構築體(基因體)之rAAV粒子的宿主細胞株，包括SEQ ID NO: 53或82之構築體(RGX-DYS1或RGX-DYS5)。
在較佳實施例中，rAAV提供可用於治療性及預防性應用之轉殖基因遞送載體，如下文更詳細地論述。 5.4. 治療性效用
提供針對治療功效分析如本文所揭示之編碼微小肌縮蛋白之構築體(包括重組基因療法載體及重組AAV基因體)之方法。方法包括如本文所描述之動物模型中之活體外及活體內測試或使用此項技術中已知用於測試微小肌縮蛋白之活性及功效的任何其他方法。 5.4.1 活體外分析 5.4.1.1 肌肉細胞之活體外感染系統
提供測試本文所揭示之重組載體，例如rAAV粒子之感染性的方法。舉例而言，可在C2C12肌母細胞中測試重組基因療法載體在肌肉細胞中之感染性。可利用若干肌肉或心臟細胞株，包括(但不限於)T0034 (人類)、L6 (大鼠)、MM14 (小鼠)、P19 (小鼠)、G-7 (小鼠)、G-8 (小鼠)、QM7 (鵪鶉)、H9c2(2-1) (大鼠)、Hs 74.Ht (人類)及Hs 171.Ht (人類)細胞株。載體複本數可使用聚合酶鏈反應技術評估且微小肌縮蛋白表現量可藉由量測細胞中微小肌縮蛋白mRNA之含量來測試。 5.4.2 動物模型
含有如本文所描述之編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的病毒載體之功效可藉由向動物模型給藥以替代突變肌縮蛋白來測試，例如藉由使用 mdx小鼠及/或黃金擷取肌肉萎縮症(GRMD)模型且評估轉殖基因表現之生物分佈、表現及治療效果。治療作用可例如藉由評估接受微小肌縮蛋白轉殖基因之動物的肌肉強度變化來評估。使用較大哺乳動物以及非哺乳動物脊椎動物及無脊椎動物之動物模型亦可用於評估本文所描述之載體的臨床前治療功效。因此，提供用於治療性給藥之組合物及方法，該等組合物及方法以根據本文所揭示之用於評定治療功效之方法證明有效之量包含一定劑量的本文所揭示之微小肌縮蛋白編碼載體。 5.4.2.1 鼠類模型
可在DMD鼠類模型中評定基因療法載體之功效。 mdx小鼠模型(Yucel, N.,等人, Humanizing the mdxmouse model of DMD: the long and the short of it, Regenerative Medicine 第3卷, 文號: 4 (2018))攜載外顯子23中之無意義突變，從而引起提前終止密碼子及截短蛋白質( mdx)。 Mdx小鼠之丙酮酸激酶活性的血液含量比同窩對照高3倍。如同人類DMD疾病， mdx骨骼肌肉展現出活動性肌纖維壞死、細胞浸潤、廣泛範圍之肌纖維尺寸及大量居中成核再生肌纖維。此表型在隔膜中增強，其經歷進行性退化及肌纖維損失，引起肌肉等角強度降低約5倍。後肢肌肉之壞死及再生在約3至4週齡時達至峰值，但其後平穩。在 mdx小鼠及與其他小鼠背景雜交之 mdx小鼠中(例如DBA/2J)，觀測到心臟射出分率輕度但顯著降低(Van Westering, Molecules 2015, 20, 8823-8855)。此類具有心臟功能性缺陷之DMD模型小鼠可用於評定本文所描述之基因療法載體之心臟保護作用或心臟功能之改善或維持或心臟功能異常之減弱。本文中之實例5至8詳述 mdx小鼠模型以評估編碼微小肌縮蛋白之基因療法載體的用途。
額外 mdx小鼠模型：已產生不同基因背景中之許多替代性型式，包括 mdx2cv、 mdx3cv、 mdx4cv及 mdx5cv細胞株(C57BL/6遺傳背景)。此等模型藉由用N-乙基-N-亞硝基脲(化學誘變劑)處理小鼠而產生。各菌株攜帶不同點突變。總體而言， mdxcv模型中疾病表型之呈現與 mdx小鼠相比幾乎無差異。額外小鼠模型已藉由產生使 mdx細胞株與各種基因敲除小鼠模型(例如 Myod1 -/-、 α- 整聯蛋白 7 -/-、 α- 地賓丁 -/-及 抗肌萎縮蛋白相關蛋白 -/-)雜交。當前用於研究DMD之所有小鼠模型已詳細地由Yucel, N.,等人, Humanizing the mdxmouse model of DMD: the long and the short of it, npj Regenerative Medicine 第3卷, 文號: 4 (2018)描述，其以引用的方式併入本文中。 心臟功能
對心臟功能之功效評估可在包括 mdx小鼠之小鼠中量測。為量測血壓(BP)，在36.5-37.58℃下使用1.5%異氟烷在恆定監測麻醉平面及維持體溫之情況下鎮靜小鼠。心跳速率維持在450-550心跳/min。BP封套置放於尾部周圍，且尾部隨後置放於感測器總成中，以在麻醉期間進行非侵入性BP監測。進行十個連續BP量測。使用分析軟體對尾部BP (包括收縮壓、舒張壓及平均壓力)進行定性及定量量測。參見例如Wehling-Henricks等人, Human Molecular Genetics, 2005, 第14卷, 第14期; Uaesoontrachoon等人, Human Molecular Genetics, 2014, 第23卷, 第12期。
為監測喚醒、自由移動小鼠中之ECG波高度及持續時間，使用無線電遙測裝置。在麻醉小鼠之腹腔中植入傳輸器單元，且將兩條電導線固定在心臟尖部附近，且以引線II方向固定在右肩峰附近。將小鼠單獨圈養在連接至電腦系統之天線接收器上方的籠子中用於資料記錄。在每小時10秒內收集未過濾ECG資料持續35天。丟棄前7天資料以允許自手術程序恢復且確保麻醉之任何作用已消退。用DSI分析包(ART 3.01及Physiostat 4.01)分析資料波形及參數且編譯量測且求平均值，以確定心跳速率、ECG波高度及間隔持續時間。原始ECG波形由兩個獨立觀測者掃描心律不齊。
進行Picro-Sirius紅色染色以量測試驗小鼠心臟中之纖維化程度。簡言之，在試驗結束時，在安樂死之後直接移除心臟肌肉且固定於10%福馬林中以供稍後處理。將心臟切片且將石蠟切片在二甲苯中脫蠟，接著用Weigert蘇木精進行核染色8分鐘。隨後將其洗滌且隨後用Picro-Sirius紅色(0.5 g天狼星紅色F3B，苦味酸飽和水溶液)再染色30分鐘。將切片清除三次二甲苯變化且安裝在Permount中。使用Eclipse E800 (Nikon, Japan)顯微鏡獲取五個隨機數位影像，且使用影像J (NIH)進行盲法分析。當動物安樂死時，經由心臟穿刺獲取血液樣品，且所收集的血清用於量測肌肉CK含量。 5.4.2.2 犬科動物
大多數犬科動物研究在黃金擷取肌肉萎縮症(GRMD)模型中進行(Korneygay, J.N.,等人, The golden retriever model of Duchenne muscular dystrophy. Skelet Muscle. 2017; 7: 9，其以全文引用的方式併入本文中)。具有GRMD之犬罹患進行性致命疾病，其患有骨胳及心肌表型及選擇性肌肉受累，即一種更接近DMD之嚴重表型。GRMD狗攜帶導致外顯子跳躍及框外DMD轉錄物的單核苷酸變化。狗中之表現型特徵包括血清CK升高、EMG上之CRD及分組之肌纖維壞死及再生之組織病理學證據。在GRMD中，常常觀測到表型變化，如在人類中。GRMD狗出現反常性肌肉肥大，其似乎在受影響狗之表型中起一定作用，步態僵硬，關節運動範圍減小及牙關緊閉為共同特徵。評估疾病進展之客觀生物標記物包括強直彎曲、脛跗骨關節角、離心收縮減量%、最大髖關節屈曲角度、骨盆盆角、顱縫匠肌外周及股四頭肌體重。 5.5. 治療方法
提供治療人類個體之方法，其患有任何肌肉萎縮症疾病，該疾病可藉由提供功能性肌縮蛋白治療。DMD為此類疾病中最常見的，但可給藥表現本文所提供之微小肌縮蛋白的基因療法載體以治療貝氏肌肉失養症(BMD)、肌緊張性肌肉萎縮症(Steinert疾病)、臉肩胛肱骨疾病(FSHD)、肢帶型肌肉萎縮症、X性聯擴張型心肌症或眼咽肌肉萎縮症。本發明之微小肌縮蛋白可為本文所描述之任何微小肌縮蛋白，包括具有以N端至C端順序之域的彼等：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT為包含α1-互生蛋白結合位點之肌縮蛋白之C端區的至少一部分，在某些實施例中SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:83。在實施例中，微小肌縮蛋白具有SEQ ID No: 1、2或79之胺基酸序列。編碼微小肌縮蛋白之載體包括具有SEQ ID NO: 20、21或81之核酸序列的彼等載體，在某些實施例中，其可操作地連接至組成型肌肉特異性(包括骨胳、平滑肌及心肌特異性)表現或CNS特異性表現之調節元件，及其他調節元件，諸如poly A位點。此類核酸可在rAAV基因體之情況下，例如側接ITR序列，尤其AAV2 ITR序列。在某些實施例中，該等方法及組合物包含向有需要之個體給藥rAAV，其包含具有核酸序列SEQ ID NO: 53、55或82之構築體(重組基因體)。在實施例中，構築體或重組基因體在rAAV8或rAAV9粒子中。在實施例中，重組AAV為AABV8-RGX-DYS1。在實施例中，患者已經診斷患有DMD及/或具有與DMD相關之症狀。
基於小鼠中之藥理學研究，參見本文中之實例6、7及8 (章節6.6、6.7及6.8，見下文)，提供治療患有能夠用功能性肌縮蛋白，諸如DMD或BMD治療之肌縮蛋白症之人類患者的方法，其藉由以5×10 13至1×10 15GC/kg之劑量，包括1×10 14GC/kg或2×10 14GC/kg之劑量周邊，包括靜脈內給藥rAAV粒子，包括rAAV8或rAAV9粒子，其含有編碼本文所描述之微小肌縮蛋白的重組基因體(例如，AAV8-RGX-DYS1)。劑量可在1×10 8個載體基因體複本/公斤(GC/kg)至1×10 15GC/kg範圍內。在一些實施例中，劑量可為3×10 13、1×10 14、3×10 14、5×10 14GC/kg。在一些實施例中，劑量可為1×10 14、1.1×10 14、1.2×10 14、1.3×10 14、1.4×10 14、1.5×10 14、1.6×10 14、1.7×10 14、1.8×10 14、1.9×10 14、2×10 14、2.1×10 14、2.2×10 14、2.3×10 14、2.4×10 14、2.5×10 14、2.6×10 14、2.7×10 14、2.8×10 14、2.9×10 14或3×10 14GC/kg。治療有效劑量以單一劑量形式給藥且可靜脈內或肌肉內給藥。或者，可在治療方案過程期間(亦即，數天、數週、數月等)給藥多次劑量。
劑量為治療上有效的，其可在給藥之後的適當時間，包括12週、26週、52週或更長時間評估，且包括評定以改善或減輕如此項技術中已知及本文中詳述之肌縮蛋白症之症狀及/或生物標記物。本文描述用於遞送編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的重組載體。此類載體應對人類肌肉細胞(包括骨胳肌肉、平滑肌及/或心肌肌肉)具有向性，且可包括非複製rAAV，尤其攜帶AAV8衣殼之rAAV。重組載體，包括具有RGX-DYS1或RGX-DYS5之重組構築體或基因體之載體(參見 圖 2)(包括AAV8或AAV9重組載體，例如AAV8-RGX-DYS1)可以任何方式給藥，使得重組載體較佳藉由將重組載體引入血流中，包括靜脈內給藥而進入肌肉組織或CNS。
給藥此類基因療法之個體可為對基因療法介導之微小肌縮蛋白遞送至肌肉起反應的個體。在特定實施例中，該等方法涵蓋治療已經診斷患有DMD或其他肌肉萎縮症疾病，諸如貝氏肌肉失養症(BMD)、肌緊張性肌肉萎縮症(Steinert疾病)、臉肩胛肱骨疾病(FSHD)、肢帶型肌肉萎縮症、X性聯擴張型心肌症或眼咽肌肉萎縮症，或具有一或多種與其相關之症狀，且鑑別為對經微小肌縮蛋白治療起反應或視為針對用基因介導之微小肌縮蛋白遞送治療之良好候選者的患者。在特定實施例中，患者先前已用合成型式之肌縮蛋白治療且已發現對肌縮蛋白之一或多種合成型式有反應。為確定反應性，肌縮蛋白之合成型式(例如，人類細胞培養、生物反應器等中產生的)可直接向個體給藥。
任何此類重組載體之治療有效劑量應以使得重組載體較佳藉由引入重組載體至血流中來進入肌肉(例如，骨胳肌肉或心肌肌肉)的任何方式給藥。在特定實施例中，載體係皮下、肌肉內或靜脈內給藥。肌肉內、皮下或靜脈內給藥應引起可溶性轉殖基因產物在肌肉(包括骨胳肌肉、心肌及/或平滑肌)之細胞中表現。轉殖基因產物之表現引起轉殖基因產物在肌肉中之遞送及維持。或者，該遞送可引起微小肌縮蛋白在肝臟中之基因療法遞送及表現，且隨後經由血流將可溶性微小肌縮蛋白產物攜帶至其可賦予其治療作用的肌肉。
給藥本文所描述之基因療法載體，包括AAV8-RGX-DYS1，在個體之組織中產生微小肌縮蛋白表現，包括肌肉組織，包括例如給藥之後1週、2週、3週、4週、5週、10週、12週、20週或26週內。肌肉組織中微小肌縮蛋白之量可藉由此項技術中已知之任何方法量測，包括基於毛細管之西方免疫分析，例如如本文實例12 (及實例8中所示)中所描述。在實施例中，給藥基因療法在給藥編碼基因療法載體之微小肌縮蛋白的個體肌肉中，包括在給藥之後5週、6週、10週、12週、20週或26週內產生大於10 ng/mg、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125或150 ng/mg微小肌縮蛋白蛋白質。劑量可以5×10 13GC/kg至1×10 15GC/kg，包括1×10 14GC/kg或2×10 14GC/kg靜脈內給藥。
適用於靜脈內、肌肉內、皮下或肝給藥之醫藥組合物包含含有編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的重組載體於包含生理學上相容之水性緩衝液的調配緩衝液中的懸浮液。調配物緩衝液可包含多醣、界面活性劑、聚合物或油中之一或多者。所揭示之醫藥組合物可包含微小肌縮蛋白中之任一者，尤其包含編碼本文所揭示之微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV載體且可用於所揭示之方法中。
舉例而言，包含rAAV之醫藥組合物，包括包含編碼RGX-DYS1之轉殖基因的rAAV8，包括具有SEQ ID NO:53之核苷酸序列的RGX-DYS1重組基因體，可用於所揭示之方法中。在一些實施例中，醫藥組合物可包含含有載體(編碼微小肌縮蛋白之重組AAV基因體)之重組腺相關病毒血清型8 (AAV8)。含有編碼本文所揭示之微小肌縮蛋白，包括RGX-DYS1及RGX-DYS5，且在實施例中AAV8-RGX-DYS1，之重組基因體的rAAV粒子可在經改良達爾伯克磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)與蔗糖緩衝液中調配，該DPBS與蔗糖緩衝液包含0.2 g/L氯化鉀、0.2 g/L磷酸二氫鉀、1.2 g/L無水磷酸氫二鈉、5.8 g/L氯化鈉、40 g/L蔗糖及0.01 g/L泊洛沙姆188，pH 7.4。醫藥組合物可以冷凍懸浮液形式供應於無菌單用途小瓶中以用於靜脈內(IV)給藥。在一些實施例中，醫藥組合物可填充至藉由無乳膠橡膠塞及彈開式鋁密封件密封之Crystal Zenith® (CZ)小瓶中。在一些實施例中，醫藥組合物可呈一種組態可獲得：在10 mL小瓶中5.0 mL可遞送體積。
在實施例中，給藥治療劑，諸如AAV8-RGX-DYS1 (或其他編碼本文所揭示之載體的微小肌縮蛋白)進行免疫抑制劑預防。參見例如Chu及Ng, Frontiers in Immunology,12:, 文章658038 (2021年4月)，其以全文引用之方式併入本文中)。在實施例中，在基因療法遞送(包括RGX-DYS1)之前至少1天開始，及至多1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週，給藥皮質類固醇(諸如普賴松(prednisone)、普賴蘇穠(prednisolone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)或倍他米松(betamethasone))。包括該時間段之每日給藥且在實施例中包括皮質類固醇給藥，包括與基因療法給藥同時且隨後在實施例中繼續給藥，包括每日給藥，持續至多1週、2週、3週、4週、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或至多一年，其中皮質類固醇之劑量可保持恆定或可隨時間推移遞減至零。在某些實施例中，患者在基因療法遞送之前進行口服皮質類固醇，諸如普賴松或普賴蘇穠(以例如0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1 mg/kg、1.5 mg/kg劑量之劑量)持續12週，且隨後在相同劑量下繼續一年或劑量在4週、8週或12週內遞減。在實施例中，給藥預防性免疫抑制劑方案，另外在第-1天(AAV8-RGX-DYS1給藥前一天)至第8週結束時，給藥個體之基線糖皮質激素劑量1 mg/kg/天，若在第8週不存在安全性問題，則在第9週至第10週給藥0.5 mg/kg/天，且若在第10週不存在安全性問題，則給藥0.25 mg/kg/天，且若在第12週不存在安全性問題，則不給藥額外普賴蘇穠。在實施例中，總每日類固醇劑量(基線方案劑量及免疫抑制劑劑量)不超過等效於60 mg/天之劑量。患者亦可在基因療法給藥當天(包括2小時或1小時內)用乙醯胺苯酚及H1-抗組織胺劑進行預處理。第0天為基因療法給藥當天。
或者或除皮質類固醇預防之外，患者可預防性地給藥非類固醇免疫抑制劑。免疫抑制劑可在給藥基因療法，例如AAV8-RGX-DYS1，之前、同時及/或之後給藥，舉例而言，基因療法遞送之前至少1天及至多1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週或12週，包括在基因療法遞送之前定期進行及/或在基因療法遞送之後給藥，例如持續至多1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或12個月或甚至無限期作為維持療法。此類免疫抑制劑包括(但不限於)環孢靈(cyclosporine)、雷帕黴素(rapamycin)、抗細胞介素抗體治療，諸如抗IL-6或IL-6受體抗體，諸如賽他利單抗(satralizumab)、賽瑞單抗(sarilumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、克拉紮珠單抗(clazakizumab)、思魯庫單抗(sirukumab)、奧諾奇單抗(olokizumab)、吉瑞利單抗(gerilimzumab)及托西利單抗(tocilizumab)；或抗補體抗體，包括抗C5抗體，諸如(但不限於)艾庫組單抗(eculizumab)、拉瓦利單抗(ravulizumab)或齊多魯單抗(tsidolumab)或抗C3抗體，諸如NGM621。可使用之其他免疫抑制劑包括例如抗CD20抗體，諸如利妥昔單抗(rituximab) (包括其生物類似形式，諸如魯替單抗-abbs及利妥昔單抗-arrx)及阿托珠單抗(obinutuzumab)及抗TNF-α抗體，諸如(但不限於)依那西普(etanercept)、阿達木單抗(adalimumab)、英利昔單抗(infliximab)、達利珠單抗(daclizumab)或戈利木單抗(golimumab)。在一個實施例中，預防性方案為抗CD-20抗體與抗C5抗體之組合，例如利妥昔單抗與艾庫組單抗或拉瓦利單抗之組合。在一個實施例中，利妥昔單抗與艾庫組單抗或拉瓦利單抗之組合在基因療法給藥之後給藥。其他預防劑包括裂解酶(imlifidase)。在實施例中，與微小肌縮蛋白療法組合提供的為在給藥含有微小肌縮蛋白轉殖基因之AAV載體之前且隨後在給藥之後第12天給藥艾庫組單抗的抗補體(抗C5)免疫抑制性方案。視個體之體重而定，藉由IV輸注給藥艾庫組單抗。對於10 kg至低於20 kg之個體，在第-9天、第-2天、第4天及第12天時給藥600 mg之劑量；對於20 kg至低於30 kg之個體，在第-16天、第-9天、第-2天及第12天時給藥800 mg之劑量；對於30 kg至低於40 kg之個體，在第-16天、第-9天、第-2天及第12天時給藥900 mg之劑量；且對於超過40 kg之個體，在第-30天、第-23天、第-16天、第-9天、第-2天及第12天時給藥1200 mg之劑量，其中第0天為給藥微小肌縮蛋白基因療法當天。
在其他實施例中，基因療法給藥與給藥西羅莫司(亦稱為雷帕黴素)之免疫抑制方案組合，其藉由阻斷胞內傳訊及代謝途徑來抑制細胞介素對啟動子T細胞擴增及成熟之能力。在實施例中，基因療法給藥與口服西羅莫司組合給藥，其中在第-7天以起始劑量3 mg/m 2，隨後在第-6天至第8天，口服西羅莫司1 mg/m 2/天分成每日兩次(BID)給藥，其中使用層析分析，目標血液含量為8-12 mg/ml。可在第-2天、第2天、第6天、第12天及第14天，且隨後視需要進行粗略監測(第0天為基因療法給藥當天)。若肝功能測試、血小板及任何其他相關安全性實驗室量測保持穩定，則在第9至10週，西羅莫司之每日劑量減小50% (至0.5 mg/m 2/天)，且若肝功能測試、血小板及任何其他相關安全實驗室量測保持穩定，則在第11週至第12週，可使西羅莫司之每日劑量降低50% (至0.25 mg/m 2/天)，且隨後若肝功能測試，血小板及任何其他相關安全實驗室量測保持穩定，則可在第12週之後中斷西羅莫司給藥。在實施例中，聯合基因療法給藥之免疫抑制性方案可為如上文所詳述之普賴蘇穠給藥方案及/或艾庫組單抗給藥方案及/或西羅莫司給藥方案之組合。一般而言，患者將用預防性免疫抑制劑預處理，且免疫抑制劑療法可在基因療法給藥之後繼續，包括數天、數週、數月或數年。
本文所提供之基因療法載體可與用於肌肉萎縮症之其他治療組合給藥，包括皮質類固醇、β阻斷劑及ACE抑制劑。
如本文所描述之基因療法給藥可引起與肌肉萎縮症相關之疾病參數及/或症狀的改善，包括(但不限於)肌肉力量增加或降低之減緩、肌肉退化速率或程度改善或減緩、炎症、纖維化、肌肉病變及下文論述之其他臨床終點。
所揭示之治療方法可產生指示本文所描述之治療功效的許多終點之一。在一些實施例中，在給藥包含編碼所揭示之微小肌縮蛋白中之一者的轉殖基因之rAAV粒子之後6週、12週、24週、30週、36週、42週、48週、1年、2年、3年、4年或5年可監測終點。
在一些實施例中，肌酸激酶活性可用作用於治療及給藥本文所揭示之方法的治療功效之終點。在該給藥之前，肌酸激酶活性可相對於(肌酸激酶活性之)含量在個體中降低。在一些實施例中，相對於治療之前個體之(肌酸激酶活性之)含量或相對於未經治療之患有肌縮蛋白症之個體之(肌酸激酶活性之)含量，個體之肌酸激酶活性可降低(例如在自然史研究中鑑定之參考含量)。在給藥具有編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之後在人類個體中量測之肌酸激酶活性可為對照值，該對照值可為在給藥之前該個體中之肌酸激酶活性、具有尚未治療之肌縮蛋白症之個體中之肌酸激酶活性、在標準中不具有肌縮蛋白症、肌酸激酶活性之個體中之肌酸激酶活性。
在一些實施例中，本發明提供治療肌縮蛋白症，包括DMD及BMD之方法，其藉由以本文所揭示之劑量，包括5×10 13個基因體複本/kg至1×10 15個基因體複本/kg，包括1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量周邊，包括靜脈內給藥含有本文所揭示之微小肌縮蛋白重組基因體的rAAV載體，包括AAV8-RGX-DYS1，其中該肌酸激酶活性在給藥該rAAV治療劑之後至少12週、26週或52週降低.5倍至1.5倍。在一些實施例中，相較於對照或在給藥治療劑之前在個體中量測到的量值，肌酸激酶活性降低可為1000至10,000個單位/公升。在一些實施例中，在給藥終點之後1000、2000、3000、4000或5000個單位/公升之量指示減少。
在一些實施例中，腓肚肌(或其他肌肉)病變減少可以用作本文所揭示之治療及給藥方法之治療功效的終點量度。腓肚肌中之病變可相對於在該給藥具有編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之前(腓肚肌中之病變)的含量在該個體中降低。在一些實施例中，相對於具有肌縮蛋白症之未經治療之個體中之(腓肚肌中之病變)的含量，腓肚肌中之病變可在個體中減少。可進行腓肚肌中之病變與標準物的比較，其中標準為表示不具有肌縮蛋白症之個體中之病變，或具有肌縮蛋白症之未經治療之個體中之病變的數目或數目組。因此，在一些實施例中，可進行在給藥rAAV與編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因之後腓肚肌中之病變與對照個體的比較。對照物可為在給藥之前的個體之腓肚肌病變、在具有尚未治療之肌縮蛋白症之個體中腓肚肌之病變、不具有肌縮蛋白症之個體之腓肚肌中之病變或在標準中腓肚肌中之病變。
在一些實施例中，使用磁共振成像(MRI)評定該個體之腓肚肌中之病變。MRI可為用於設想肌肉、韌帶及肌腱之良好工具，因此，肌肉病症可使用MRI偵測及/或表徵。在一些實施例中，本發明提供治療肌縮蛋白症，包括DMD及BMD之方法，其藉由以本文所揭示之劑量，包括5×10 13個基因體複本/kg至1×10 15個基因體複本/kg，包括1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量周邊，包括靜脈內給藥含有本文所揭示之微小肌縮蛋白構築體的rAAV載體，包括AAV8-RGX-DYS1，從而引起在給藥之後腓肚肌中之病變與對照相比，例如與該給藥之前個體之腓肚肌中之病變相比降低約1-100%、2-50%或3-10%。舉例而言，用具有編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因之rAAV治療的個體之病變相較於對照可減少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50%或更高。
在一些實施例中，腓肚肌體積(或任何其他肌肉之肌肉體積)可用作治療功效之終點。在該給藥具有編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因(例如，AAV8-RGX-DYS1)的rAAV之前，腓肚肌體積在個體中可相對於(腓肚肌體積之)含量降低。在一些實施例中，相對於未患肌縮蛋白症之個體之(腓肚肌體積之含量)，該個體之腓肚肌體積可降低。在一些實施例中，相對於具有肌縮蛋白症之未經治療之個體(腓肚肌體積)的含量，該個體之腓肚肌體積可降低。可進行腓肚肌體積與標準物的比較，其中標準為表示不具有肌縮蛋白症之個體中之體積，或具有肌縮蛋白症之未經治療之個體中之體積的數目或數目組。因此，在一些實施例中，可進行在給藥rAAV與編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因之後腓肚肌體積與對照之比較。對照物可為在給藥之前個體之腓肚肌體積、在具有尚未治療之肌縮蛋白症之個體中腓肚肌體積、不具有肌縮蛋白症之個體之腓肚肌體積或在標準中腓肚肌體積。
在一些實施例中，個體之腓肚肌體積可使用MRI評估。在一些實施例中，本發明提供治療肌縮蛋白症，包括DMD及BMD之方法，其藉由以本文所揭示之劑量，包括5×10 13個基因體複本/kg至1×10 15個基因體複本/kg，包括1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量周邊，包括靜脈內給藥含有本文所揭示之微小肌縮蛋白構築體的rAAV載體，包括AAV8-RGX-DYS1，從而引起腓肚肌體積與對照相比，例如與該給藥之前腓肚肌體積相比降低約1-100%、2-50%或3-20%。在一些實施例中，給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之後，腓肚肌體積之下降相較於對照可為約2-400 mm 3、5-200 mm 3或20-100 mm 3。舉例而言，用具有編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因之rAAV治療的個體與對照相比可具有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150 mm 3或更大的腓肚肌體積減少。
在一些實施例中，肌肉脂肪分數可用作給藥本文所揭示之rAAV微小肌縮蛋白編碼治療劑之方法的治療功效的終點。肌肉可為骨盆帶及大腿肌肉(臀大肌、大內收肌、股直肌、股外側肌、股內側肌、股二頭肌、半腱肌及股薄肌)。在給藥具有如本文所揭示之編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之前，該個體之肌肉脂肪分數相對於(肌肉脂肪分數之)含量可減少。在一些實施例中，該個體之肌肉之脂肪分數可相對於具有肌縮蛋白症之未經治療之個體中之(肌肉脂肪分數之)含量降低。可進行肌肉脂肪分數與標準物的比較，其中標準為表示不具有肌縮蛋白症之個體中之肌肉脂肪分數的量或百分比，或具有肌縮蛋白症之未經治療之個體中之量或百分比的數目或數目組。因此，在一些實施例中，可進行在給藥rAAV與編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因之後肌肉脂肪分數與對照之比較。對照物可為在給藥之前的個體之肌肉脂肪分數、在具有尚未治療之肌縮蛋白症之個體中肌肉脂肪分數、不具有肌縮蛋白症之個體之肌肉脂肪分數或標準之肌肉脂肪分數。
在一些實施例中，使用磁共振成像(MRI)評定該個體之肌肉脂肪分數。在一些實施例中，本發明提供治療肌縮蛋白症，包括DMD及BMD之方法，其藉由以本文所揭示之劑量，包括5×10 13個基因體複本/kg至1×10 15個基因體複本/kg，包括1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg及3×10 14個基因體複本/kg個基因體複本/kg之劑量周邊，包括靜脈內給藥含有本文所揭示之微小肌縮蛋白構築體的rAAV載體，包括AAV8-RGX-DYS1，從而引起在給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之後肌肉脂肪分數與對照相比，例如與該給藥之前個體之肌肉脂肪分數相比降低約1-100%、2-50%或3-10%。舉例而言，用具有編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因之rAAV治療的個體與對照相比可具有肌肉脂肪分數之1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50%或更大降低。
在一些實施例中，肌肉病變之T2鬆弛時間可用作用於治療之終點。肌肉可為任何肌肉，例如腓腸肌。該個體中之肌肉病變之T2鬆弛時間可相對於在該給藥rAAV與編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因之前的含量(肌肉病變之T2鬆弛時間)降低。在一些實施例中，該個體之肌肉病變之T2鬆弛時間可相對於不具有肌縮蛋白症之個體中之(肌肉病變之T2鬆弛時間)含量降低。在一些實施例中，個體中肌肉病變之T2鬆弛時間可相對於具有肌縮蛋白症之未經治療之個體中肌肉病變之T2鬆弛時間的含量降低。可進行肌肉病變之T2鬆弛時間與標準物的比較，其中標準為表示不具有肌縮蛋白症之個體中之肌肉病變之T2鬆弛時間，或具有肌縮蛋白症之未經治療之個體中之肌肉病變之T2鬆弛時間的數目或數目組。因此，在一些實施例中，可進行在給藥rAAV與編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因之後肌肉病變之T2鬆弛時間與對照之比較。對照物可為在給藥之前該個體之肌肉病變之T2鬆弛時間、在具有尚未治療之肌縮蛋白症之個體中肌肉病變之T2鬆弛時間、不具有肌縮蛋白症之個體之肌肉病變之T2鬆弛時間或在標準中肌肉病變之T2鬆弛時間。
在一些實施例中，使用磁共振成像(MRI)評估個體之肌肉病變的T2鬆弛時間。在一些實施例中，在給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之後肌肉病變之T2鬆弛時間可與對照相比，例如與該給藥之前肌肉病變之T2鬆弛時間相比降低約1-100%、5-50%或10-30%。在一些實施例中，本發明提供治療肌縮蛋白症，包括DMD及BMD之方法，其藉由以本文所揭示之劑量，包括5×10 13個基因體複本/kg至1×10 15個基因體複本/kg，包括1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg及3×10 14個基因體複本/kg之劑量周邊，包括靜脈內給藥含有本文所揭示之微小肌縮蛋白構築體的rAAV載體，包括AAV8-RGX-DYS1，從而引起在給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之後肌肉病變之T2鬆弛時間與對照相比可降低約1-500毫秒(ms)、1-400 ms、1-300 ms、1-200 ms、1-100 ms、1-50 ms、1-25 ms、1-10 ms。在一些實施例中，給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之後肌肉病變之T2鬆弛時間的降低可為約2至8 ms。舉例而言，經具有編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV處理之個體可具有相較於對照肌肉病變之T2鬆弛時間降低2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或更多ms。
在一些實施例中，步態評分可用作治療終點。在給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之後，步態評分可為約-1至2。在一些實施例中，在給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之後，步態評分可為約1。
在一些實施例中，北極星移動評量表(NSAA)可用作治療終點。可比較經治療之個體的NSAA與在給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之前的NSAA。所治療之個體的NSAA可與未患肌縮蛋白症之個體的NSAA相比較。所治療之個體的NSAA可與具有肌縮蛋白症的未經治療之個體相比較。所治療之個體的NSAA可與標準物相比，其中該標準物為表示在未患肌縮蛋白症之個體的NSAA或具有肌縮蛋白症之未經治療之個體的NSAA之分數或分數集。
在一些實施例中，用rAAV治療之個體的NSAA包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因，其與該給藥之前的NSAA分數相比或與上文所描述之NSAA比較中的任一者相比增加。在一些實施例中，增量可為0至1、0至2或1至2。
在一些實施例中，使用於NSAA中之17個項目中之任一者可用作個別治療終點。舉例而言，以下中之任一者可為用於治療之終點：站立、步行、從椅子上站起來、單腿站立(右)、單腿站立(左)、爬箱台階(右腿先)、爬箱台階(左腿先)、下箱台階(右腿先)、下箱台階(左腿先)、躺坐、起身、抬起頭、腳跟站立、跳、跳右腿、跳左腿、跑(10m)。此等評估中之每一者為此項技術中所熟知。在給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之後，可見此等終點中之一或多者的改善。熟習此項技術者應理解視為改善之內容。舉例而言，在一些實施例中，可實現用包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV治療之個體站立、跑步/步行一確定距離及/或爬一定數量的樓梯所花費的時間量的減少。
包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的個體給藥rAAV之時間量相較於對照(例如在給藥rAAV之前個體所花費的時間量)可減少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50%或更高。在一些實施例中，所確定之跑步及/或步行距離可為10公尺。
與對照相比，例如在給藥rAAV之前個體所花費之時間量，給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之個體所花費之時間量的減少可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50%或更高。
相比於對照，例如在給藥rAAV之前個體所花費之時間量，給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因之rAAV的個體爬一定數量的樓梯所花費的時間量的減少可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50%或更高。在一些實施例中，一定數量的樓梯可為(但不限於) 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些實施例中，調查表可用作用於治療之終點。舉例而言，兒科結果資料收集儀器(PODCI)調查表可用以定量個體在用包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV治療前後的功能性能力。 5.5.1 心臟輸出
儘管骨胳肌肉症狀視為DMD之限定特徵，但患者最常死亡或心臟衰竭。DMD患者由於心肌細胞中不存在肌縮蛋白而罹患擴張型心肌症(DCM)，該心肌細胞為收縮功能所需。此引起胞外鈣之流入、觸發蛋白酶活化、心肌細胞死亡、組織壞死及炎症，最終引起脂肪及纖維化之積累。此過程首先影響左心室(LV)，其負責將血液抽汲至大部分身體且較厚且因此經歷較大工作負荷。萎縮性心肌細胞展現出條紋損耗、液胞化、碎片化及核退化。功能性地，萎縮及疤痕導致LV之結構不穩定性及失能，最終發展為普通DCM。DMD可與各種ECG變化相關，如竇狀心動過速、晝夜節律指數降低、心跳速率變化性降低、短PR時間間隔、右心室肥大、S-T區段抑鬱症及長時間QTc。
本文提供之基因療法治療(包括用AAV8-RGX-DYS1給藥)可減緩或遏止DMD及其他肌縮蛋白症之進展，尤其減少心臟功能障礙之進展或減弱心臟功能異常及/或維持或改善心臟功能。可藉由使用連續心電圖及連續非侵入性成像研究(例如，超音波心動描記術或心臟磁共振成像(CMR))對適合於試驗群體之年齡及疾病階段的心臟參與或心臟衰竭之病徵及症狀進行週期性評估來監測功效。CMR可用於監測用力肺活量(FVC)、用力呼氣量(FEV1)、最大吸氣壓力(MIP)、最大呼氣壓力(MEP)、峰值呼氣流量(PEF)、峰值咳嗽流量、左心室射出分率(LVEF)、左心室收縮分率(LVFS)、炎症及纖維化相對於基線之變化。ECG可用於監測傳導異常及心律不整。特定言之，ECG可用於評估PR間隔、V1中之R波、V6中之Q波、心室再極化、下部及/或上部側壁中之QS波、右側集束分支中之傳導干擾、QT C及QRS之正規化。
因此，提供重組AAV組合物，包括包含基因表現卡匣及病毒載體之組合物，該組合物包含編碼本文所揭示之微小肌縮蛋白蛋白質(包括AAV8-RGX-DYS1)的核酸，及給藥改善或維持心臟功能或減緩心臟功能損失之彼等組合物的方法，例如藉由防止如藉由連續心電圖所量測之LVEF降低45%以下及/或正規化功能(LVFS ≥ 28%)降低的方法，及/或連續非侵入性成像研究(例如，超音波心動描記術或心臟磁共振成像(CMR))。量測結果可與未經處理之對照物或在用核酸組合物治療之前的個體相比。或者，本文所描述之核酸組合物及給藥核酸組合物之方法引起心臟功能之改善或心臟功能之損失之減少，經藉由監測用力肺活量(FVC)、用力呼氣量(FEV1)、最大吸氣壓力(MIP)、最大呼氣壓力(MEP)、峰值呼氣流量(PEF)、峰值咳嗽流量、左心室射出分率(LVEF)、左心室收縮分率(LVFS)、炎症及纖維化相對於基線之變化所評定。ECG可用於監測傳導異常及心律不整。特定言之，ECG可用於評估PR間隔、V1中之R波、V6中之Q波、心室再極化、下部及/或上部側壁中之QS波、右側集束分支中之傳導干擾、QT C及QRS之正規化。
在一些實施例中，心臟功能及/或肺部功能可用作評估給藥之治療功效的終點。心臟功能及/或肺部功能可改善或增加該個體相對於在該給藥之前(心臟功能及/或肺部功能之)含量。在一些實施例中，心臟功能及/或肺部功能可改善或增加該個體相對於不具有肌縮蛋白症之個體(心臟功能及/或肺部功能)的含量。在一些實施例中，心臟功能及/或肺部功能可降低該個體之相對於具有肌縮蛋白症之未經治療之個體(心臟功能及/或肺部功能)的含量。可進行心臟功能及/或肺部功能與標準物的比較，其中標準為表示不具有肌縮蛋白症之個體中之心臟功能及/或肺部功能，或具有肌縮蛋白症之未經治療之個體中之心臟功能及/或肺部功能的數目或數目組。因此，在一些實施例中，可進行在給藥rAAV與編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因之後心臟功能及/或肺部功能與對照之比較。對照物可為在給藥之前該個體之心臟功能及/或肺部功能、在具有尚未治療之肌縮蛋白症之個體之心臟功能及/或肺部功能、不具有肌縮蛋白症之個體之心臟功能及/或肺部功能或在標準中之心臟功能及/或肺部功能。
在一些實施例中，心臟功能及/或肺部功能之改善或增加相較於對照，例如與在給藥包含編碼微小肌縮蛋白之轉殖基因的rAAV之前之個體相比為1至100%。在一些實施例中，可使用阻抗、電活性及鈣處置來量測心臟功能。 5.5.2 中樞神經系統
具有DMD之患者的一部分亦可患有癲癇症、學習及認知損傷、閱讀障礙、神經發育病症(諸如注意力不足過動症(ADHD))、自閉症及/或精神病症，諸如強迫症、焦慮症或睡眠失調。
本文所揭示之基因療法治療之目標可為改善認知功能或緩解癲癇症及/或精神病症之症狀。可藉由對適合於試驗群體之年齡及疾病階段的行為及認知功能之週期性評估及/或藉由量化及限定癲癇事件來評定功效。
因此，提供重組AAV組合物及給藥微小肌縮蛋白基因療法組合物之方法，該等組合物改善認知功能、降低癲癇發生率或嚴重程度、緩解ADHD之症狀、強迫症、焦慮症及/或睡眠障礙。 5.5.3 患者主要終點
可在所治療之個體之臨床評估中評定包括劑量之組合物及本文所描述之方法的組合物之功效。患者主要終點可包括監測用力肺活量(FVC)、用力呼氣量(FEV1)、最大吸氣壓力(MIP)、最大呼氣壓力(MEP)、峰值呼氣流量(PEF)、峰值咳嗽流量、左心室射出分率(LVEF)、左心室收縮分率(LVFS)相對於基線的變化、NSAA相對於基線的變化、上肢性能(PUL)評分相對於基線的變化及布魯克上肢量表評分(布魯克評分)相對於基線的變化、握力相對於基線的變化、捏力相對於基線的變化、MRI心臟纖維化評分之變化、藉由MRI評定之上臂(bicep)肌肉脂肪及纖維化變化、使用測力計之腿力量的量測、6分鐘步行測試、10分鐘步行測試、步行分析-步行之3D錄音、經由免疫染色切片部分之可定量成像的肌營養相關蛋白膜染色變化及藉由量測(經由肌肉切片)纖維尺寸及新生兒肌凝蛋白陽性之組合再生纖維之變化。參見例如Mazzone E等人, North Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders 20 (2010) 712-716.; Abdelrahim Abdrabou Sadek,等人, Evaluation of cardiac functions in children with Duchenne Muscular Dystrophy: A prospective case-control study. Electron Physician (2017)11月; 9(11): 5732-5739; Magrath, P.等人, Cardiac MRI biomarkers for Duchenne muscular dystrophy. BIOMARKERS IN MEDICINE (2018) 第12卷, 第11期.; Pane, M.等人, Upper limb function in Duchenne muscular dystrophy: 24 month longitudinal data. PLoS One. 2018年6月20日;13(6):e0199223。 6. 實例 6.1 實例 1 - 構築 用於 插入順式質體 之 微小肌縮蛋白 (DMD) 基因表現卡匣 .
DMD構築體編碼具有核心主鏈之微小肌縮蛋白：5' (N端)- ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-3' (C端) ( 圖 2)，但其不同之處在於C端(CT)之存在及長度。由RGX-DYS1編碼之微小肌縮蛋白具有野生型DMD蛋白質C-端域(SEQ ID NO: 16)之近端194個胺基酸作為C端，該RGX-DYS3編碼微小肌縮蛋白具有不含功能性互生蛋白或α-短肌營養蛋白結合域之較短C端(SEQ ID NO: 91之48個胺基酸)，且RGX-DYS5編碼具有C端域之140個胺基酸(SEQ ID NO:83)之微小肌縮蛋白，其含有α1-互生蛋白結合位點但不具有短肌營養蛋白結合位點(參見 圖 1A及 1B)。構築體包括Spc5-12啟動子(SEQ ID NO:39)及smPA調節序列，且RGX-DYS3包括VH4內含子序列(SEQ ID NO:41)。將所有選殖入側接ITR之順式質體中。編碼 DMD基因之所有DNA序列經密碼子最佳化且CpG耗乏。 6.1.1. RGX-DYS1 、 RGX-DYS3 及 RGX-DYS5 轉殖基因之重組工程化
簡言之，如 圖 2中所繪示之編碼N端-ABD1-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT-C端(具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列)的RGX-DYS1中之微小肌縮蛋白構築體的經人類密碼子最佳化及CPG耗乏之核苷酸序列使用GeneArt基因合成(Invitrogen, Thermo Fisher, Waltham, MA)進行合成。所需C端藉由定點突變誘發使用以下兩種引子製備：5'：TGA CTC GAG AGG CCT AAT AAA GAG C (SEQ ID NO: 43)，3'：CCT TGG AGA CTG TGG AGA GGT G (SEQ ID NO: 44)。構築體包括合成性肌肉啟動子(例如SPc5-12；SEQ ID NO:39)及小poly(A)訊號序列(sm pA (SEQ ID NO:42)且具有SEQ ID NO:53之核苷酸序列。
構築體RGX-DYS3 ( 圖 2)經工程化以用CT域之(具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的微小肌縮蛋白)的小部分(48個胺基酸；SEQ ID NO: 91)編碼上文詳述之RGX-DYS1構築體之微小肌縮蛋白。此構築體包括在微小肌縮蛋白編碼序列之5'端處之SPc5-12啟動子sm pA poly A序列及VH4內含子。轉殖基因構築體具有SEQ ID NO: 21之核苷酸序列。
構築體RGX-DYS5 ( 圖 2)經工程化以編碼微小肌縮蛋白DYS5 (SEQ ID NO: 79之胺基酸序列)，其為DYS1微小肌縮蛋白，不同之處在於C端域為截短型且長度為140個胺基酸(SEQ ID NO: 83)。構築體包括SPc5-12啟動子及sm pA訊號序列且具有SEQ ID NO: 82之核苷酸序列。
質體RGX-DYS5藉由用C端尾部之中間長度版本替換質體RGX-DYS1中之DYS1之C端的長版本產生。簡言之，gBlock-DMD-1.5尾部由含有側接有EcoRV及NheI位點之C端之中間版本及RGX-DYS1質體之重疊序列的17 bp的整合DNA技術合成。源質體RGX-DYS1用限制酶NheI及EcoRV (New England Biolabs)消化，且隨後與gBlock-DMD1.5尾部進行融合連接。最終質體RGX-DYS5藉由酶消化及後續定序確認。類似地構築RGX-DYS2及RGX-DYS4，各自編碼與RGX-DYS1相同之微小肌縮蛋白蛋白質，其中RGX-DYS2含有在啟動子下游之VH4內含子而RGX-DYS4具有截短型肌肉特異性啟動子。
將構築體全部插入至 cis質體中，使得其經定位側接有ITR (SEQ ID NO. 82之核苷酸序列)。RGX-DYS1卡匣包含編碼DYS1微小肌縮蛋白之SEQ ID NO: 20的核苷酸序列，該RGX-DYS3卡匣包含編碼DYS3微小肌縮蛋白之SEQ ID NO: 21之核苷酸序列且RGX-DYS5卡匣包含編碼DYS5微小肌縮蛋白之SEQ ID NO:81之核苷酸序列(亦參見 表 5)。 表 10提供RGX-DYS1 (SEQ ID NO: 53)、RGS-DYS3 (SEQ ID NO: 54)及RGX-DYS5 (SEQ ID NO 82)之人工基因體(包括側接ITR序列，用小寫字母指示)的核苷酸序列。
藉由不同質體在C2C12細胞中之表現及藉由西方墨點分析細胞裂解物來證實蛋白質之長度及表現。
為了檢驗RGX-DYS5之封裝效率，使用HEK293細胞將RGX-DYS5封裝至AAV8載體中，且在震盪燒瓶培養及親和力純化之後確定AAV8封裝之載體RGX-DYS5的效價。平均效價高於AAV8封裝之RGX-DYS1且與AAV8封裝之RGX-DYS3在此等實驗台產生運作中相當(資料未顯示。) 6.2 實例 2 ： mdx 小鼠中之構築體表現的比較研究 6.2.1 西方墨點法 、 mRNA 表現及 DNA 載體複本數之 µ-Dys 表現比較 .
在如章節6.5 (概念驗證；實例5)見下文(用AAV8-RGX-DYS1給藥之n=13隻小鼠)中所描述處理後收集與RGX-DYS1實驗相關之此實例中所描述之資料及樣品。AAV8-RGX-DYS3及AAV8-RGX-DYS5載體之活體內測試在13隻雄性C57BL/10ScSn-Dmd mdx/J ( mdx)小鼠中進行。藉由以2E14 vg/kg劑量(n=5對於第1組，AAV8-RGX-DYS3；n=5對於第2組，AAV8-RGX-DYS5；n=3， mdx陰性(無給藥)對照)尾部靜脈注射將所有載體全身性遞送至5週齡 mdx小鼠中。動物在給藥日之重量在15.9 g至22.0 g範圍內。在載體給藥後6週，針對血清收集血液，且使動物安樂死且進行屍體解剖以收集組織。收集包括腓肚肌(氣體)、脛骨前肌(TA)、隔膜、三頭肌、四頭肌、心臟、肝臟以及主要器官的主要骨骼肌肉且將其快速冷凍於異戊烷/液氮雙浴中且置放於預冷卻的冷凍管中。
各動物之體重每週記錄兩次，且計算各組之體重的平均變化。除一隻動物以外，所有動物在7週時段內如預期體重增加。
在與經RGX-DYS3及RGX-DYS5處理之小鼠之實驗不同的設施進行經RGX-DYS1處理之小鼠的實驗。
藉由西方墨點法檢驗自經治療 mdx小鼠中收集之來自腓肚肌之微小肌縮蛋白蛋白質表現。簡言之，20至30 mg組織在蛋白質溶解緩衝液(15%SDS，75mM Tri-HCl pH6.8，蛋白酶抑制劑，20%丙三醇，5% β-巰基乙醇) (砂磨機均質器珠粒Ruptor 12，SKU：19050A，OMNI International)中均質化。均質化之後，樣品在室溫下以最高速度短暫離心5分鐘，且使上清液經受蛋白質定量。使用Qubit蛋白質分析套組(Catalog # Q33211, ThermoFisher Scientific)定量蛋白質儲備上清液。計算每一儲備液之總蛋白質濃度，隨後將20 μg蛋白質儲備上清液負載至SDS-PAGE凝膠上。使用初級抗肌縮蛋白抗體(MANEX1011B(1C7)，Developmental Studies Hybridoma Bank)以1:1000稀釋度進行西方墨點法，且所施用之二級抗體為與辣根過氧化酶(HRP) (賽默飛世爾科技，目錄號62-6520)之山羊抗小鼠IgG2a共軛物。α1-肌動蛋白充當各凝膠色帶之內參考物。對於抗-α1-肌動蛋白墨點，以1:10,000之稀釋因子使用兔多株抗-α1-肌動蛋白抗體(PA5-78715，Thermo Fisher)且以1:20,000使用二級山羊抗兔抗體(Thermo Fisher Scientific，目錄號31460)。使用ECL Prime西方墨點法偵測試劑(根據製造商說明書；AMERSHAM，RPN2232)偵測蛋白質訊號，且藉由Image Lab軟體(Bio-Rad)指導之密度測定法定量。
西方墨點法結果( 圖 3A)揭露若干觀測結果：第一，各微小肌縮蛋白蛋白質之所估計尺寸很好地對應於其在凝膠上觀測到之遷移，例如RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質為148 kDa，而RGX-DYS5及RGX-DYS3蛋白質之尺寸分別為142 kDa及132 kDa。第二，對於存在於腓肚肌組織中之各蛋白質，帶之強度不同。較長型式之微小肌縮蛋白RGX-DYS1載體展現出最強轉殖基因表現，接著中間型式RGX-DYS5及較短型式RGX-DYS3 (及 圖 3A及 3B)。彼等三個構築體中微小肌縮蛋白表現量之差異可歸因於不同長度之微小肌縮蛋白構築體之AAV載體基因體含量或蛋白質穩定性的變化。
為了闡明每個細胞之基因體複本，進行ddPCR以檢驗彼等組織中之AAV-微小肌縮蛋白載體基因體複本數，其中根據二倍體細胞之特異性組織中之所遞送載體的複本數計算如下：
Figure 02_image001
。如 圖 3C中所顯示，與RGX-DYS5 (17± 4 GC/細胞)及RGX-DYS3 (16 ± 5 GC/細胞)載體-遞送之組織(值相對於升糖素基因體複本標準化)相比該RGX-DYS1載體遞送之組織實際上具有更高載體基因體複本數(50±14 GC/細胞)。隨後將相對微小肌縮蛋白表現與載體複本數進行比較。如 圖 4中所繪示，RGX-DYS1-處理之肌肉(1.33 ± 0.39)及RGX-DYS5-處理之肌肉(1.774 ± 0.40)中之相對微小肌縮蛋白的表現均顯著高於RGX-DYS3-處理之肌肉(0.77 ± 0.22，p＜ 0.05，n =3至5)。此資料表明由RGX-DYS1及RGX-DYS5載體產生之微小肌縮蛋白之較長型式(具有C端)使得微小肌縮蛋白之穩定性在活體內在肌肉細胞中更好。
另外，用ddPCR量測與經處理小鼠相比未處理野生型B6及 mdx小鼠中之骨胳肌肉之µ-及野生型(WT)-肌縮蛋白的mRNA表現。使用RNeasy Fibrous組織迷你套組(REF 74704，Qiagen)自肌肉組織中提取總RNA。使用具有RNAse抑制劑(Ref 4374966，Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific)之高容量cDNA反轉錄套組來合成cDNA。使用Nanodrop分光光度計來量測RNA濃度。使用數位PCR (Naica Crystal Digital PCR系統，Stilla technologies)來量測微小肌縮蛋白、WT-肌縮蛋白及內源性對照甘油醛3-磷酸鹽去氫酶(GAPDH) mRNA之複本數。針對小鼠WT-肌縮蛋白(mm01216951_m1，Thermo Fisher Scientific)之引子及探針(亦描述於上文章節6.5 (實例5)之生物分佈研究中)及小鼠GAPDH (mm99999915_g1，Thermo Fisher Scientific)為可商購的。如 圖 4A中所繪示，未處理B6小鼠中之相對WT-肌縮蛋白轉錄物為1±0.64，且 mdx小鼠中之WT-肌縮蛋白mRNA表現為1.55 ± 0.77 (p = 0.15，n =4)。經處理動物中之相對微小肌縮蛋白mRNA如下：RGX-DYS1處理之肌肉，22.66 ± 11.6 (p ＜ 0.01，n =5)；RGX-DYS5-處理，16.83 ± 11.07 (p = 0.06，n = 3)及RGX-DYS3處理之肌肉，11.87 ± 7.90 (p＜ 0.05，n = 4)。此資料表明，與野生型含量相比，在RGX-DYS1、RGX-DYS5及RGX-DYS3組中遞送微小肌縮蛋白載體均產生高得多的微小肌縮蛋白轉錄物。此外，微小肌縮蛋白mRNA複本數標準化至AAV載體基因體複本數/細胞，且除GAPDH標準化之外，WT-肌縮蛋白mRNA標準化至基因體複本數/細胞(2個複本/細胞)。如 圖 4B中所繪示，所有組在每個基因體基礎上展現出基本上類似的mRNA表現量基因體(n= 3至5，p＞0.05)。此表明驅動AAV微小肌縮蛋白轉殖基因表現之肌肉特異性SPc5-12啟動子與小鼠骨胳肌肉細胞中之天然肌縮蛋白啟動子一樣有效。 6.2.2 免疫螢光 (IF) 染色及肌縮蛋白 - 相關蛋白質複合物 (DAPC) 結合之 微小肌縮蛋白表現
隨後，進行免疫螢光(IF)染色以檢驗肌縮蛋白及肌縮蛋白相關蛋白複合物之表現，包括來自不同組之腓肚肌上的短肌營養蛋白、β-肌萎縮蛋白聚糖、互生蛋白及nNos。所應用之IF染色方案及抗體如上文章節6.2 (實例2)中所描述。肌縮蛋白蛋白質及所檢驗DAPC蛋白質均不存在於未經治療 mdx肌肉中，同時其強烈存在於野生型B6肌肉膜上。對於所有三個處理組，微小肌縮蛋白表現於接近100%肌纖維上且其在不同處理組中不可區分。三個處理組顯示在肌肉膜上短肌營養蛋白表現之恢復，觀察到之模式極類似。對於β-肌萎縮蛋白聚糖染色，AAV8-RGX-DYS1處理組中之肌肉展現出更均勻且更強烈β-肌萎縮蛋白聚糖染色(表現) (資料未展示)。
在互生蛋白染色中觀測到處理組中之差異更顯著。肌肉膜上之互生蛋白的表現在含有更長長度之微小肌縮蛋白，接著RGX-DYS5及RGX-DYS3的AAV8-RGX-DYS1組中大大增加(資料未展示)。藉由西方墨點分析對肌肉溶解物之相同趨勢進一步證實( 圖 5A)。在骨胳肌肉組織溶解物上進行針對互生蛋白之西方墨點法(腓肚肌組織來自：3個來自 mdx處理及未處理組中之每一者，及一個腓肚肌及兩個三頭肌來自B6小鼠組)。在1:10,000下使用多株抗互生蛋白抗體(Abcam，ab11187)，在室溫下培育1小時。以1:5000稀釋度施用針對α-輔肌動蛋白(ab68167，Abcam)之兔單株。施用二級山羊抗兔抗體(Thermo Fisher Scientific，目錄號A-10685)。與 mdx組相比(0.84±0.22)，WT肌肉中之互生蛋白表現與內源性對照輔肌動蛋白表現之比率為4.56± 0.76 (n=3，p ＜0.001藉由單向ANOVA)。AAV8-RGX-DYS1及AAV8-RGX-DYS5組中之比率分別為2.72 ± 0.97 ( n=3，p ＜ 0.05，與 mdx組相比)及1.35 ± 0.03 ( 圖 5B)。藉由西方墨點法另外檢測全部肌肉膜提取物上骨胳肌肉中之互生蛋白表現量。使用Mem-Per加膜蛋白提取套組(目錄號89842，Thermo Fisher)提取總骨胳肌肉蛋白質(腓肚肌組織來自 mdx處理及未處理組中之每一者，且四頭肌來自B6小鼠組)。將20 μg總膜蛋白裝載至各色帶中( 圖 5C)。在4℃下以1:10,000培育隔夜使用多株抗互生蛋白抗體(Abcam，ab11187)。在4℃下將裝載對照多株抗肌動蛋白(PA5-78715，Thermo Fisher)以1:10,000稀釋度隔夜培育施用。與整個溶解物西方實驗稍微不同，其中WT肌肉展現出最高互生蛋白表現量，總膜蛋白西方墨點法在RGX-DYS1組中展現出最高相對互生蛋白表現(0.81±0.26，n=3)，接著為B6_WT組(0.6623±0.05，n=3)、RGX-DYS3組(0.59±0.08)及 mdx組(0.32 ± 0.07，n=3)，如 圖 5D中所見。此等結果清楚地指示微小肌縮蛋白載體產生之微小肌縮蛋白能夠恢復肌肉膜互生蛋白表現，且與更短型式之RGX-DYS3相比，更長型式之RGX-DYS1具有將互生蛋白錨定至肌肉膜之優良能力。
使用肌肉膜(腓肚肌組織/ mdx及四頭肌/B6組)類似地製備nNOS西方墨點。使用Mem-Per Plus膜蛋白提取套組(目錄號89842，Thermo Fisher)提取總肌肉膜蛋白。將20 μg總膜蛋白裝載至SDS-PAGE凝膠之各色帶中。以1:500使用針對nNOS (SC-5302，Santa Cruz Biotechnology)之初級抗體，且以1:10,000稀釋度施用多株抗肌動蛋白(PA5-78715，Thermo Fisher)。施用二級山羊抗小鼠IgG抗體HRP (62-6520，ThermoFisher)。關於nNOS表現，吾人觀測到在IF染色之後RGX-DYS1與RGX-DYS3組影像之間的可辨差異( 圖 6A)。然而，西方墨點法結果在RGX-DYS1、RGX-DYS3及未處理 mdx組( 圖 6B-C)中未揭露任何顯著差異，表明RGX-DYS1載體對nNOS之恢復較低。
總體而言，在 mdx小鼠中遞送RGX-DYS1、RGX-DYS3及RGX-DYS5載體皆引起穩固的微小肌縮蛋白表現及肌縮蛋白相關蛋白複合物之恢復(DAPC)。較長型式之RGX-DYS1載體增強DAPC之恢復，尤其對於互生蛋白及β-肌萎縮蛋白聚糖而言。nNOS藉由RGX-DYS1載體恢復至膜DAPC之能力較低但在IF染色之後可見。 6.2.3 衛星細胞之轉導及減輕 AAV8-RGX-DYS1 載體 對 肌肉營養不良型肌肉之再生
骨胳肌肉幹細胞或衛星細胞(SC)正常靜止且位於肌纖維之基礎層與肌膜之間。在生長期間及在肌肉損傷之後，活化SC之肌原性程式，且SC自我更新以維持其池及/或分化以形成肌母細胞且最終肌纖維。熟知腺相關病毒(AAV)載體用於轉導分化肌纖維，因此吾等研究衛星細胞是否亦可由AAV載體轉導。衛星細胞較小且有極少細胞質，因此在此等細胞中研究轉殖基因表現在技術上具有挑戰性。此處，應用RNAscope®來調查AAV是否可轉導衛星細胞。RNAscope®係能夠同時進行訊號放大及背景雜訊抑制之原位雜交(ISH)技術，其允許以單細胞解析度觀測完整組織中之單一分子基因表現。在未處理 mdx小鼠、經RGX- DYS1處理之 mdx小鼠及野生型C57BL/6小鼠之骨胳肌肉中，三種微小肌縮蛋白蛋白質(DYS1、DYS3或DYS5)及Pax7 mRNA之共定位。使用經螢光團，Opal 570 (紅色)標記之AAV微小肌縮蛋白探針及經螢光團，Opal 520 (綠色)標記之肌肉衛星細胞標記物pax7使用RNAscope®多重螢光分析。在Advanced Cell Diagnostics公司(Newark，CA)中進行AAV轉殖基因及Pax7 mRNA表現之RNAscope®多重螢光分析。使用RNeasy®纖維性組織迷你套組(Qiagen目錄號74704)自骨骼肌中提取總RNA，且使用具有RNase抑制劑之高容量cDNA反轉錄套組(所應用之生物系統目錄號4374966)合成cDNA。使用數位PCR (Naica Crystal Digital PCR系統，Stilla technologies)來量測微小肌縮蛋白mRNA及內源性對照GAPDH mRNA之絕對複本數。針對微小肌縮蛋白之引子及探針與先前所描述相同。小鼠pax7引子及探針集(TaqMan ™ MGB探針，所應用之生物系統目錄號4316034)在商業上購買。
對微小肌縮蛋白轉導之衛星細胞進行計數，且計算衛星細胞轉導速率。在AAV-微小肌縮蛋白轉導之骨骼肌中，衛星細胞之轉導速率為23±1.5% ( 圖 7A)。儘管轉導速率比成熟肌纖維低得多，但此所指示的AAV載體能夠轉導肌肉衛星細胞。
隨後在RNAscope影像中對總pax7+衛星細胞數目進行計數以調查不同處理組中之衛星細胞數目是否類似。如 圖 7B中所繪示，未處理 mdx中之pax7陽性細胞計數/圖像為39.12±15.14，且野生型B6小鼠及DMD載體處理之小鼠中之陽性細胞計數分別為11.87± 3.23 (對8個影像進行計數，p＜ 0.0001，藉由單向ANOVA)及14.66 ± 5.91 (對12個影像進行計數，p＜ 0.0001，藉由單向ANOVA)。未處理 mdx肌肉中之衛星細胞數目的增加指示肌肉營養不良型肌肉之再生性質。遞送具有RGX-DYS1載體之微小肌縮蛋白逆轉此病理學且緩解肌肉再生。
除RNAscope技術分析之外，吾等提取總肌肉RNA且進行cDNA合成。使用RNeasy®纖維性組織迷你套組(Qiagen目錄號74704)自骨骼肌中提取總RNA，且使用具有RNase抑制劑之高容量cDNA反轉錄套組(所應用之生物系統目錄號4374966)合成cDNA。使用小鼠pax7特異性引子及探針集(可商購的：分別為mm01354484_m1 Pax7，Thermo Fisher Scientific；及TaqMan ™ MGB探針來自所應用之生物系統目錄號4316034)使樣品經受ddPCR分析。使用小鼠GAPDH引子及探針集使RNA及cDNA輸入歸一化。使用數位PCR (Naica Crystal Digital PCR系統，Stilla technologies)來量測微小肌縮蛋白mRNA及內源性對照GAPDH mRNA之絕對複本數。在各組之間比較pax7 mRNA複本數與GAPDH mRNA複本數之比率( 圖 7C)。如所預期， mdx小鼠中之pax7表現之相對表現為7.56 ± 3.14，其比WT-B6小鼠高得多(1 ± 0.68，n=5，p＜0.001藉由單向ANOVA)。三種不同微小肌縮蛋白載體處理組中之相對pax7表現大大降低(4.40 ± 1.50對於RGX-DYS5 (n=3，p=0.06)，3.12 ± 0.74對於RGX-DYS3組(n = 5，p ＜ 0.01)，2.98 ± 0.68對於RGX-DYS1 (n = 5，p＜ 0.01)。Pax+衛星細胞計數在 mdx中升高，與此營養不良模型之肌肉退化及再生的活性循環一致。經微小肌縮蛋白處理之 mdx小鼠之衛星細胞中之pax7 mRNA表現降低指示，本發明微小肌縮蛋白載體經由改善肌肉再生校正肌肉營養不良型肌肉中之衛星細胞增生。
DYS1處理顯著降低 mdx中之衛星細胞增生，經藉由衛星細胞計算及Pax7 mRNA表現二者所量測( 圖 7B及 7C)。 6.3 實例 3 ： 與 AAV9 RNA/DNA 研究相比之 AAV8AAV8及AAV9經由全身遞送在非人類靈長類動物(NHP)之骨骼及心臟肌肉中具有類似轉導效率( 圖 8A-8F)。將具有獨特條碼的CAG-GFP盒個別地產生AAV8及AAV9且與其他衣殼以約相等的濃度彙集在一起，以產生118個帶條碼的AAV庫。將此庫(PAVE118)以1.77e13 GC/kg之劑量靜脈內給藥三個食蟹獼猴。對在給藥後3週自各種NHP組織分離之DNA及RNA進行相對豐度之NGS分析。來自NHP之骨胳肌肉(分別為 圖 8A 及 B)、心肌(分別為 圖 8C 及 D)及肝臟(分別為 圖 8E 及 F)中之AAV8及AAV9衣殼的DNA及RNA含量之間無顯著差異。 6.4 實例 4 - 活體外研究 (DMD 患者衍生之經誘導之多能幹細胞 (iPSC))
儘管 mdx/BL10為DMD之公認鼠類模型，但未展現出心肌病，一種患有DMD之患者的主要死亡原因，或表現型限於老化後的輕度心室擴張(Yucel等人, 2018)。近期公開案表明來自DMD患者之iPSC衍生之心肌細胞(iPSC-CM)可用於模型化擴張型心肌症(Laurila等人, 2016; Lin等人, 2015)。
此研究可使用患者衍生之iPSC-CM創建DMD之活體外心臟模型且評估肌縮蛋白缺乏型人類心肌細胞中RGX-DYS1之生物活性。可將來自由歐洲誘導之多能幹細胞庫(EBiSC)獲得之DMD患者的iPSC及健康供體分化成心肌細胞。一旦產生成熟心肌細胞，則可表徵DMD及健康對照人類細胞株之功能表型。
在建立功能性表型後，可將RGX-DYS1與DMD iPSC-CM一起培育。RGX-DYS1載體(DNA)及RGX-DYS1微小肌縮蛋白將分別藉由qPCR及免疫細胞化學確定。另外，為了評估DMD心肌細胞中之RGX-DYS1之益處，可評估心臟功能性終點(亦即阻抗、電活性及鈣處理)。 6.5 實例 5 - mdx 小鼠中之概念驗證 -6 週 研究 6.5.1 mdx 小鼠中之 6 週研究
為了評估 mdx小鼠中之AAV8-RGX-DYS1之生物活性，以0 (媒劑)或2×10 14GC/kg之劑量經靜脈內向5週齡 mdx雄性小鼠(C57BL/10ScSn-Dmd mdx/J；n=13/組)給藥AAV8-RGX-DYS1。以下參數及端點包括於此研究中：死亡率、臨床觀測結果、體重、前肢握力及伸趾長肌(EDL)之體外力。屍體剖檢(給藥後6週)時，對組織進行總體檢查，包括組織重量。單獨收集肌肉組織以評估肌肉病變。藉由西方墨點法及免疫螢光評估AAV8-RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現，且亦評定RGX-DYS1載體DNA生物分佈。最後，亦使用免疫螢光在脛骨前肌(TA)及隔膜組織中評估DAPC蛋白質之表現及定位。
在2×10 14GC/kg下AAV8-RGX-DYS1具有良好耐受性。不存在AAV8-RGX-DYS1相關死亡率或不利的臨床觀測。在AAV8-RGX-DYS1給藥之後3週一隻小鼠由於腦積水安樂死。然而，此發現不被視為與測試物相關，因為腦積水在 mdx小鼠中通常可見且亦見於12週藥理學研究中之媒劑對照 mdx小鼠中(Xu等人, 2015；實例6)
與 mdx小鼠之天然病史資料一致(Coley等人，2016)，媒劑對照 mdx小鼠中之平均體重與年齡匹配之歷史對照組相比顯著較高(+11%)。此外，絕對及標準化肌肉組織重量與測試設施(AGADA Biosciences)處之野生型歷史對照資料(HCD)相比顯著更高(分別為+18%至53%，+7%至+36%)。AAV8-RGX-DYS1給藥在 mdx小鼠中降低體重(-13%)，但此與測試設施之歷史野生型對照資料相當。伴隨此情況，所有骨骼肌肉(包括該隔膜)之絕對及標準化重量低於媒劑對照 mdx小鼠(分別為-17%至-29%及-4%至-18%)。
在第5週時藉由握力評估肌肉功能，且在屍體剖檢(第6週)時評估EDL肌肉之體外力。媒劑對照 mdx小鼠展現出絕對及標準化前肢握力相比於年齡匹配之歷史野生型對照資料顯著降低。AAV8-RGX-DYS1給藥相比於媒劑對照 mdx小鼠(分別為+14.5%及+33.7%)增加 mdx小鼠之絕對及標準化前肢握力，且此等資料與測試設施之歷史野生型對照資料相當。如 圖 9A-9D中所示，相比於野生型HCD，媒劑對照 mdx小鼠中最大力及比力輸出均顯著降低。相比之下，與媒劑對照 mdx小鼠(分別為+21%及47.2%)相比，向 mdx小鼠給藥AAV8-RGX-DYS1引起EDL肌肉之最大力及比力輸出顯著增加。為確定握力，將小鼠平緩地置放於前肢線柵格之頂部上，以使得僅允許其前爪抓握橫條中之一者。在確保兩隻前爪抓住相同的桿且軀幹與地面水平且平行於桿之後，將小鼠以均勻的力沿著網格的整個長度穩定地向後拉，直至鬆開抓握。在連續五天內對各動物進行5次良好的拉動，用於環境適應及測試。計算單個最佳記錄值(最大力)以分析單個小鼠之最大強度。基於體重計算標準化強度(KGF/kg)。為確定體外力，自各小鼠中移除右後肢之EDL肌肉且浸沒於在25℃下含有林格氏溶液(pH 7.4)之含氧浴(95% O2，5% CO2)中。使用不疲乏的抽搐，將肌肉調節至力產生之最佳長度。用電極刺激肌肉以引起強直收縮，且以2分鐘之休息間隔分開。藉由各後續破傷風，刺激頻率在20、30或50Hz之步驟中增加，直至力達到平穩段，其通常在約250Hz下發生。肌肉之截面積係基於肌肉質量、纖維長度及組織密度來量測。最後，基於肌肉之橫截面積計算肌肉比力(kN/m2)。
為了檢查AAV8-RGX-DYS1給藥不僅改善肌肉功能，而且減弱 mdx小鼠之營養不良型表型，在研究結束時(第6週)在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中在TA及隔膜中檢驗肌肉病變(亦即，炎症、退化、再生及中央成核)。使用來自測試設施(AGADA生物科學)組織庫之野生型對照組織(n=2-3)作為TA肌肉之比較物且來自測試設施之年齡匹配之野生型HCD用於隔膜。
使用蘇木精及曙紅(H&E)染色檢測炎症。肌肉中之再生及退化纖維分別藉由胚胎肌凝蛋白重鏈(eMHC)及IgM之免疫染色確定。亦藉由H&E染色量測中央成核，肌肉再生之另一指示物。
如 圖 10A-10K中所示，與野生型小鼠相比，在媒劑對照 mdx小鼠之TA及隔膜中營養不良型病理學(炎症、退化症、再生)為顯而易見的。另外，媒劑對照 mdx中之鑑別為再生纖維之中央成核纖維(CNF)顯著高於歷史野生型對照資料(TA：野生型中之2.92%相對於 mdx中之70.81%；隔膜：野生型中之1.46%相對於 mdx中之41.63%)。AAV8-RGX-DYS1給藥減輕 mdx小鼠中之營養不良型變化( 圖 10A-10K)；在TA及隔膜組織兩者中觀測到炎症、再生及退化症之顯著降低，其在測試設備中類似於野生型HCD。AAV8-RGX-DYS1給藥亦顯著降低 mdx小鼠中之TA (-18.4%)及隔膜(-48.9%)中之CNF百分比，但兩種組織中之CNF百分比高於歷史野生型對照資料( 圖 10A-10K)。此等觀測結果可能歸因於在AAV8-RGX-DYS1給藥之前 mdx小鼠中之肌肉細胞複製之早期發作(約3週齡)及 mdx-BL10背景小鼠之極佳再生能力，不同於DMD患者(Turk等人, 2005)。
為了證實 mdx小鼠中AAV8-RGX-DYS1成功轉導，藉由ddPCR檢測RGX-DYS1生物分佈(載體DNA)，且藉由免疫螢光及西方墨點法確定RGX-DYS1微小肌縮蛋白(蛋白質)之轉殖基因含量。肌縮蛋白含量亦量測為對照。
載體DNA含量可藉由所有組織(肝臟、心臟、隔膜、TA、EDL及三頭肌)中之ddPCR定量且自所有給藥AAV8-RGX-DYS1之動物中收集( 圖 11A 及 11B))。肝臟具有最高載體DNA含量，而組織含量相當。在媒劑對照 mdx小鼠中，分析所有其他肌肉中之肝臟及各肌肉組之幾個所選擇之動物組織以證實載體DNA含量不存在或接近於定量下限(LLOQ) (~0.08 gc/dg)。
對於西方墨點分析，蛋白質自由給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdxmice中收集之隔膜、腓肚肌及TA肌肉中提取。樣品中微小肌縮蛋白之含量基於衍生自來自BL10小鼠與德國短毛指示犬肌肉萎縮症(GSHPMD)犬肌肉溶解物之混合物之肌縮蛋白的標準曲線計算為正常肌縮蛋白之百分比。AAV8-RGX-DYS1給藥之 mdx小鼠展示AAV8-RGX-DYS1微小肌縮蛋白之表現，報導為肌縮蛋白百分比，隔膜中為159.5%，腓肚肌中為191.8%且TA肌肉中為225.2% ( 圖 12)。在隔膜、腓肚肌及TA肌肉中之AAV8-RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現與第6週時所有肌肉組織之載體DNA之廣泛分佈一致。
為了進一步證實肌纖維中之AAV8-RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現，在TA及隔膜中進行免疫螢光。給藥後六週，媒劑對照 mdx小鼠在TA及隔膜中不具有肌縮蛋白陽性纖維(亦即，在肌纖維膜下無肌縮蛋白表現)，除了極少數的體細胞回復肌纖維。相比之下，給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠在TA (96%)及隔膜(89.1%)肌肉組織之肌纖維膜處展現出穩固及恰當的微小肌縮蛋白表現( 圖 13A-13C)；此等結果與野生型對照類似。如先前所報導，需要均勻的肌縮蛋白表現來穩定肌纖維轉換且減弱營養不良型肌肉之病理學(van Westering等人, 2020)。
肌縮蛋白缺乏引起整個DAPC之分解，此造成在肌肉之反覆收縮及鬆弛期間維持肌肉完整性及細胞傳訊(Sancar等人, 2011；Duan等人, 2018)。因此，認為不存在肌縮蛋白及DAPC不穩定會增加對肌肉損傷之易感性且累積胞內鈣離子流入，引起嚴重營養不良型表現型(Cirak等人, 2012)。
為了評估AAV8-RGX-DYS1給藥是否亦可恢復DAPC蛋白質之穩定性，在具有抗α1-互生蛋白、短肌營養蛋白、nNOS-1及ß-肌萎縮蛋白聚糖之TA及隔膜肌肉中進行免疫螢光( 圖 14)。
媒劑對照 mdx小鼠與野生型對照相比在TA及隔膜中肌纖維之肌纖維膜中展示可忽略/不可偵測DAPC蛋白質。AAV8-RGX-DYS1給藥在兩種組織中完全恢復α1-互生蛋白(TA中為9/10及隔膜中為10/10)及短肌營養蛋白(TA中為8/10及隔膜中為10/10)之肌病變表現。更重要的是，給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中之α1-互生蛋白及短肌營養蛋白兩者表現似乎與抗肌縮蛋白染色共定位且與野生型小鼠類似。此等結果證實，RGX-DYS1微小肌縮蛋白之C端域(CT194)可募集α-短肌營養蛋白及α-互生蛋白，如先前報導(Constantin等人., 2014; Koo等人., 2011)。與媒劑對照 mdx小鼠相比，在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，肌纖維膜處之ß-肌萎縮蛋白聚糖存在亦得以恢復。然而，與野生型相比，給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠在TA中展現出大面積穩固表現(6/10)及低表現(4/10)。亦在來自給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠之隔膜組織中注意到類似圖案。AAV8-RGX-DYS1給藥似乎不會在肌纖維膜下完全恢復nNOS存在，但在TA及隔膜之肌纖維膜附近可偵測到nNOS，且含量高於媒劑對照 mdx小鼠。綜合而言，AAV8-RGX-DYS1給藥增加了DAPC蛋白質(包括對CT域具有特異性之彼等蛋白質)在TA及隔膜肌肉之肌纖維膜下的表現，表明肌纖維之結構完整性得到改善。 6.6. 實例 6 ： mdx 小鼠中之 12 週藥理學研究 6.6.1 mdx 小鼠中之 12 週研究
評價在單次IV注射後 mdx小鼠中AAV8-RGX-DYS1之藥理學。
以0 (媒劑)、3×10 13、1×10 14、3×10 14或5×10 14GC/kg (最大可行劑量)向 mdx雄性小鼠組(n=10隻/組)給藥單次IV注射液AAV8-RGX-DYS1。包括另一組野生型小鼠(C57BL/10ScSn)作為對照。包括以下參數及終點：死亡率、臨床觀測結果、體重、活體內肌肉功能(握力、自動化步態分析)、生物標記物(T2-MRI成像及來自血清之CK)、AAV8-RGX-DYS1生物分佈(載體DNA)、RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現(蛋白質)、總體檢查、組織重量及病理組織學，包括精子形成。在第6週及第12週進行活體內終點(握力、運動步態分析及T2-MRI成像)。添加額外時間點(第9週)以進行握力量測。在檢查活體內終點之後第7週收集用於CK分析之血清，且進行最終屍檢。AAV8-RGX-DYS1給藥之後12週，殺死動物且進行最終屍檢。
AAV8-RGX-DYS1在至多5×10 14GC/kg劑量下具有良好耐受性，且不存在AAV8-RGX-DYS1相關死亡率。存在歸因於腦積水之四隻過早死亡，由媒劑對照組中之一隻雄性組成，給藥3×10 13GC/kg之兩隻雄性及給藥1×10 14GC/kg AAV8-RGX-DYS1之一隻雄性。然而，此發現不視為測試物相關，因為腦積水與 mdx小鼠表現型相關(Xu等人, 2015)。在研究時間段期間不存在AAV8-RGX-DYS1相關臨床觀測結果。 精細運動步態分析 ( 活體內功能測試 )
精細運動步態分析用於證實AAV8-RGX-DYS1之功能性效應。簡言之，使用來自三個不同視圖之高速攝影機(300框/s)自下方、右側及左側捕獲小鼠之移動。隨後使用高精度動態分析方法(MotoRater；TSE Systems，Homburg，Germany)使用步行模式評定精細運動技能及步態特性。當使用精細運動動態分析觀測到媒劑對照 mdx小鼠時，表型與下部身體姿勢相關，其經觀測為相比於野生型小鼠，髖部、膝部及腳踝延伸增加以及整體髖部高度增加及前肢腳趾清除減少。
如 圖 15中所示，在媒劑對照 mdx小鼠中將動態參數組合成一個單次評分的總體步態評分在第6週時顯著高於野生型小鼠(野生型中之0.77相對於媒劑對照 mdx中之3.84)，及第12週時在媒劑對照 mdx小鼠及野生型小鼠之間注意到更清晰差異(野生型中之-0.77相對於媒劑對照 mdx中之4.25)。在第6週(11-12週齡)，AAV8-RGX-DYS1之作用在1×10 14GC/kg及3×10 14GC/kg之劑量下為顯著的；在5×10 14GC/kg之AAV8-RGX-DYS1劑量下之總體步態評分與野生型類似。在第12週(17-18週齡)，在≥ 1×10 14GC/kg之AAV8-RGX-DYS1劑量下之總體步態評分顯著改善且相對於野生型含量標準化(野生型中之-0.77相對於0.76、0.57及0.30，分別在1×10 14、3×10 14、5×10 14GC/kg下)。 T2- 磁共振成像 ( 生物標記物 )
在DMD患者中，肌肉MRI正在成為評定肌肉損傷及炎症之有力工具(Forbes等人, 2020)。在此研究中，在給藥後6週及12週進行T2映射MRI，以評估腓肚肌體積、高強度病變百分比及腓肚肌病變(高強度)及非病變(正常外觀肌肉)之T2鬆弛期間( 圖 16A-16E)。歸因於補償性肥大，在第6週及第12週時間點，相比於野生型小鼠，在媒劑對照 mdx小鼠中，腓肚肌體積(雙腿併攏)顯著增加。在第6週，與媒劑對照 mdx小鼠相比，AAV8-RGX-DYS1給藥在3×10 14及5×10 14GC/kg劑量下減少腓肚肌體積。在第12週時，在以3×10 14及5×10 14GC/kg之劑量給藥AAV8-RGX-DYS1的 mdx小鼠中清晰觀測到腓肚肌體積中之AAV8-RGX-DYS1之劑量。
作為肌肉水腫標記物之高強度病變基於自雙腿之自動化閥值分析定量。在第6週及第12週與野生型對照相比時，在媒劑對照 mdx中明顯觀測到增加之高強度病變(表示為病變%)。在第6週，病變降低在3×10 13GC/kg之AAV8-RGX-DYS1劑量下已顯而易見，且在1×10 14、3×10 14及5×10 14GC/kg之劑量下顯著改善。在第12週，注意到以1×10 14、3×10 14及5×10 14GC/kg之劑量給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中之明顯差異，且與野生型相當。
T2時間通常在涉及水環境變化(諸如，水腫、炎症)及一定程度上纖維化形成之病理性過程中增加(Hogrel等人, 2016; Wokke等人, 2016)。因此，評定高強度病變與正常出現之腓肚肌(非病變)的T2鬆弛時間( 圖 16 D及 E)。儘管在野生型動物之影像中未觀測到病變，但 圖 16A中報導之較小百分比應被視為背景位準。當相比於野生型時，在兩個時間點(第6週及第12週)媒劑對照 mdx小鼠中觀測到增加之T2鬆弛時間。AAV8-RGX-DYS1給藥在 mdx小鼠中以1×10 14、3×10 14及5×10 14GC/kg之劑量顯著降低T2鬆弛時間，且此等時間與第6週及第12週之野生型相當。因此，在給藥AAV8-RGX-DYS1之小鼠中，第12週以＞1×10 14GC/kg之劑量使T2鬆弛時間與野生型動物相當。
在給藥AAV8-RGX-DYS1之小鼠中，第12週以＞1×10 14GC/kg之劑量使T2鬆弛時間與野生型動物相當。 握力 ( 活體內功能測試 )
在第6週及第9週之握力量測並未明確地揭露媒劑對照 mdx小鼠與野生型小鼠之間的差異( 圖 17)。在第12週，注意到媒劑對照 mdx與野生型小鼠之間的握力差異最小而無統計顯著性。當與媒劑對照 mdx小鼠相比時，以3×10 14及5×10 14GC/kg之劑量給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠的握力顯著增加。此等不一致觀測結果很可能歸因於嚙齒動物中之握力測試可受除運動功能以外之各種因素影響的事實(Maurissen等人, 2003; Nagaraju等人, 2008)。 肌酸激酶
如所預期，相比於第7週及第12週之野生型對照，媒劑對照 mdx小鼠中平均CK含量分別大21倍及30倍。在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，CK含量以＞1×10 14GC/kg之劑量降低，在＞3×10 14GC/kg之劑量下達到顯著性( 圖 18)。 RGX-DYS1 生物分佈 ( 載體 DNA)
使用qPCR方法評估DNA載體生物分佈。來自給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠的腓肚肌、隔膜、心臟及肝臟組織在研究結束(第12週)時具有高含量之載體DNA。觀測到所有經AAV8-RGX-DYS1處理之小鼠的檢驗組織中載體DNA含量之劑量-比例增加的趨勢，儘管未達到顯著性( 圖 19)。與所有給藥AAV8-RGX-DYS1之小鼠的肌肉組織相比，肝臟具有更高的載體DNA含量。自野生型BL10小鼠及 mdx媒劑對照小鼠中收集之組織展現出在低於定量極限(BQL = 50個複本/µg DNA)或偵測極限(LOD = 11.96個複本/µg DNA)下之載體DNA含量。 RGX-DYS1 微小肌縮蛋白表現 ( 蛋白質 )
為檢驗 mdx小鼠中RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現，進行西方墨點分析。
在第12週，當相比於媒劑對照 mdx小鼠(p ＜ 0.05 - 0.001)時，以1×10 14、3×10 14及5×10 14GC/kg之劑量給藥AAV8-RGX-DYS1的 mdx小鼠在所有三種肌肉(腓肚肌、隔膜及心臟)中展現出顯著較高的RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現。在最低AAV8-RGX-DYS1劑量(3×10 13GC/kg)下，RGX-DYS1微小肌縮蛋白含量高於媒劑對照 mdx小鼠但不顯著。
在所有給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，當相比於腓肚肌及隔膜時，心臟組織中RGX-DYS1微小肌縮蛋白之表現較高，而腓肚肌及隔膜中之表現通常為類似的( 圖 20A及 20B)。與野生型小鼠之肌縮蛋白蛋白質表現相比，接受3×10 14及5×10 14GC/kg之AAV8-RGX-DYS1的 mdx小鼠顯示在腓肚肌、隔膜及心臟中顯著較高的RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現。
總體而言，來自給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠之肌肉中存在RGX-DYS1微小肌縮蛋白與偵測載體DNA含量一致。儘管在各劑量組中所有肌肉之間RGX-DYS1載體DNA含量相當的事實，但當相比於腓肚肌及隔膜時，心臟組織中之RGX-DYS1微小肌縮蛋白通常較高，而在腓肚肌及隔膜中之表現一般相當。
在此研究中，基於如藉由精細運動動態分析所量測之肌肉功能的顯著改善及如藉由MRI所量測之肌肉保存改善，向 mdx小鼠IV給藥AAV8-RGX-DYS1後之最低有效劑量當前被視為1×10 14GC/kg。 6.7 實例 7 ： mdx 小鼠中之 26週藥理學研究
評估在單次IV注射之後 mdx小鼠中RGX-DYS1之長期生物活性。
以0 (媒劑)、3×10 13、1×10 14、3×10 14或5×10 14GC/kg向雄性 mdx小鼠組(n=10隻/組)給藥單次IV注射液RGX- DYS1。包括另一組野生型小鼠(C57BL/10ScSn)作為對照。動物在給藥後26週時安樂死。包括以下參數及終點：死亡率、臨床觀測結果、每週體重、活體內肌肉功能(第6、9、17及26週時之握力、第9、17及26週時之自動化步態分析)、生物標記物(第6、17及26週時之T2-MRI成像及第17及26週時之來自血清之CK)、生物分佈(載體DNA)、轉殖基因表現(蛋白質)、總體檢查、組織重量及病理組織學，包括精子形成及肌肉病理學。
亦研究在單次IV注射之後 mdx小鼠中RGX- DYS1之長期功效及DMD之相關模型中RGX- DYS1之長期毒性。
在0 (媒劑)、3×10 13、1×10 14、3×10 14或5×10 14GC/kg下 mdx雄性小鼠組(每時間點n=10隻/組)給藥單次IV注射液RGX- DYS1。包括另一組野生型小鼠(C57BL/10ScSn)作為對照。動物在給藥後26週殺死。以下參數及終點包括：死亡率、臨床觀測結果、握力、步態分析、MRI、肌酸激酶(CK)分析、每週體重、總體檢查、組織重量及組織病理學，包括精子形成。
圖 21展示研究中所見之體重的結果。在以≥3×10 14GC/kg給藥之 mdx小鼠中觀測到較低平均體重。野生型小鼠與媒劑對照 mdx小鼠之間存在統計學差異，在 mdx小鼠中觀測到體重高達13週。在用經由基因療法遞送之人類微小肌縮蛋白(由腦積水引起之RGX-DYS1)給藥之各小鼠組中觀測到在26週處死之前的死亡。
在第17週時，使用T2磁共振成像獲取評估肌肉病變發生率之肌肉代表性影像( 圖 22)。以3×10 13GC/Kg及1×10 14GC/kg接受媒劑處理之小鼠中之病變用箭頭展示。在接受3×10 14或5×10 14GC/kg之RGX- DYS1劑量之小鼠中未見到病變或至少極大地減少之病變。在第26週，再次使用T2磁共振成像獲取肌肉之代表性影像( 圖 23)。以3×10 13GC/Kg及1×10 14GC/kg接受媒劑處理之小鼠中之病變用箭頭展示。在接受3×10 14或5×10 14GC/kg之AAV8-RGX-DYS1劑量之小鼠中未見到病變或至少極大地減少之病變。
圖 24A及 24B亦展示在6週、17週及26週時對MRI結果之分析，其展示腓肚肌體積(A)及所觀測到之高強度病變變化(病變(%)) (B)。資料以平均值±SEM呈現。統計顯著性：**** p ＜ 0.0001，相對於野生型媒劑(重複量測(RM)雙向變異數分析(ANOVA)，Sidak事後分析)；* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001，**** p ＜ 0.0001，相對於 mdx媒劑(混合效應模型ANOVA，鄧奈特事後分析)。與媒劑對照小鼠相比，用RGX- DYS1處理引起在所有時間點肌肉體積及病變之減少。較高劑量之RGX- DYS1比更低劑量作用更佳。
圖 25A及 25B展示6週、17週及26週之T2時間病變(%) (A)及T2時間非病變(%) (B)。資料以平均值±SEM呈現。統計顯著性：** p ＜ 0.01，**** p ＜ 0.0001，相對於野生型媒劑(重複量測(RM)雙向變異數分析(ANOVA)，Sidak事後分析)；* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001，**** p ＜ 0.0001，相對於mdx媒劑(混合效應模型ANOVA，鄧奈特事後分析)。一般而言，與媒劑對照小鼠相比，更高劑量(3×10 14或5×10 14GC/kg)之RGX- DYS1提供較佳結果。
在第6週、第17週及第26週進行步態分析。如 圖 26中所繪示，在第9週之媒劑對照mdx小鼠與野生型對照之間觀測到精細運動動態步態分析之明確差異且在所有其他時間點繼續。在第9週，與媒劑對照相比，總體步態評分之劑量相關改善展現於以≥ 3×10 13GC/kg之劑量給藥RGX- DYS1之 mdx小鼠中；以≥ 3×10 14GC/kg之劑量步態評分與野生型小鼠之評分類似( 圖 26) 。在第17週，在≥3×10 14GC/kg之劑量下，步態評分存在改善。在第26週，在1×10 14GC/kg下觀測到步態評分之改善且在＞3×10 14GC/kg下更明顯。
在患有DMD之患者中，與正常範圍相比，CK顯著升高，該正常範圍具有診斷值。此外，最大血清CK活性通常在DMD中2歲至5歲觀測到，且隨著疾病進展而逐漸降低。Kim等人, Ann. Rehabil. Med. 41:306-312 (2017)。 圖 27展示用AAV8-RGX-DYS1處理，與媒劑處理之對照相比CK濃度顯著降低。資料以平均值±SEM呈現。統計顯著性：**** p ＜ 0.0001，相對於野生型媒劑(重複量測(RM)雙向變異數分析(ANOVA)，Sidak事後分析)；*** p ＜ 0.001，**** p ＜ 0.0001，相對於 mdx媒劑(混合效應模型ANOVA，鄧奈特事後分析)。在高劑量(3×10 14或5×10 14GC/kg)處理之小鼠中，CK濃度類似於野生型對照小鼠之CK濃度。
圖 28展示在第9週、第17週及第26週不同小鼠組中之握力。媒劑對照 mdx中之握力在與野生型相比時未展現出差異。
為了評估對營養不良型病理學之RGX-DYS1作用，收集肌肉組織(隔膜、心臟及腓肚肌)且在研究結束(32-33週齡)時分析。細胞外基質中纖維化(膠原蛋白累積)為DMD之標誌(Kharraz等人, 2014)。特定言之， mdx小鼠中之隔膜受嚴重影響且更緊密類似於DMD病理學，具有進行性肌肉纖維退化及伴隨結締組織浸潤(Lynch等人, 1997; Swiderski及Lynch, 2021)。如所預期，媒劑對照 mdx小鼠在隔膜中展現出增加之纖維化量( 圖 29A)與野生型對照相比時，經藉由梅森氏三色染色所量測。值得注意的是，在媒劑對照 mdx小鼠之腓肚肌及心臟中觀測到累積纖維化，但與隔膜相比相對極低(在骨骼肌及心肌中低於3%，與隔膜中16.8%相比)，如先前報導(Coley等人, 2016; Shin等人, 2011)。 mdx小鼠給藥RGX-DYS1引起所檢測之所有肌肉組織中纖維化量的減少(p＞0.05)。此外，隔膜中纖維化之量以≥ 1×10 14GC/kg之劑量顯著降低(p＜ 0.05)。
當與野生型對照相比時，媒劑對照 mdx小鼠之隔膜( 圖 29 B及 E)及腓肚肌( 圖 29F)中之增加之炎症為突出的。任何動物(包括媒劑 mdx小鼠)中心臟中炎症不明顯( 圖 29D)。在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，當與對照媒劑 mdx小鼠相比時，在≥ 1×10 14GC/kg下之隔膜及腓肚肌中之發炎細胞數目顯著降低。
另外，在三個肌肉組織中藉由定性評定(人工地評分)評估營養不良型病理學(再生、變性、纖維化及中央核)。使用以下手動評分量表：0 (正常)、1 (最小)、2 (輕度)、3 (明顯)及4 (重度)。
如所預期，相比於野生型對照(正常)，隔膜肌肉之營養不良型病理學在媒劑對照 mdx小鼠中明顯(明顯至重度)。在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，相比於媒劑對照 mdx小鼠(明顯至重度)，在≥1×10 14GC/kg下觀測到再生降低(輕度至最小)及退化(正常至明顯)。當與媒劑對照 mdx小鼠(明顯至重度)相比時，纖維化(最低至明顯)及中央核(輕度至明顯)之嚴重程度評分在≥3×10 14GC/kg下降低。
在心臟病中，相比於野生型對照，在媒劑對照 mdx小鼠中觀測到營養不良型病理學(最低至明顯)。在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中在≥ 3×10 13GC/kg下觀測到再生減少(正常至輕度)。在3×10 13GC/kg下之退化及纖維化之嚴重程度分數減少(最小)；當相比於媒劑對照 mdx小鼠(最小至明顯)時，此作用在1×1014及3×10 14GC/kg (正常)下更明顯。當相比於媒劑對照 mdx小鼠(輕度至明顯)時，在1×10 14及3×10 14GC/kg (最小)之給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，中央核之嚴重程度分數亦降低。相比於媒劑對照 mdx小鼠，AAV8-RGX-DYS1 mdx小鼠中5×10 14GC/kg之退化及中央核的嚴重程度分數未顯著降低(最小至明顯)。
在媒劑對照 mdx小鼠(最小至重度)中展現出腓肚肌之營養不良型特徵，相比於野生型對照。除5×10 14GC/kg下之一隻小鼠(明顯)之外，與媒劑對照 mdx小鼠(最小至明顯)相比，在≥ 3×10 13GC/kg下給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中(正常至輕度)再生及中央核得以改善。在3×10 13GC/kg (最小至輕度)下觀測到退化之降低，其中AAV8-RGX-DYS1作用在≥ 1×10 14GC/kg下(正常至輕度)更突出；此等組中四個 mdx小鼠中的三個(≥ 1×10 14GC/kg)沒有退化。在≥ 3×10 13GC/kg (最小)下觀測到纖維化嚴重程度評分之降低，且在≥ 3×10 14GC/kg (正常至輕度)下更明顯；四個 mdx小鼠中之三個在3×10 14及5×10 14GC/kg下不具有纖維化。
在研究結束時(AAV8-RGX-DYS1給藥後26週)，收集肌肉組織以使用qPCR方法分析載體生物分佈 ( 圖 30)及使用傳統西方墨點分析用於RGX-DYS1微小肌縮蛋白 ( 圖 31)。載體DNA含量在研究結束時在來自給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠之腓肚肌、隔膜及心臟組織中保持可偵測到。觀測到所有給藥AAV8-RGX-DYS1之小鼠的檢測組織中載體DNA含量之劑量-比例增加的趨勢( 圖 30)。與所有給藥AAV8-RGX-DYS1之小鼠的肌肉組織相比，肝臟具有更高的載體DNA含量。
類似於12週藥理學 mdx小鼠研究，在來自野生型小鼠之隔膜、腓肚肌及心臟肌肉中偵測到小鼠全長肌縮蛋白蛋白質含量。 mdx媒劑對照小鼠在全部三種肌肉中均未展現出任何明顯的RGX-DYS1微小肌縮蛋白及肌縮蛋白蛋白質條帶，但報導 mdx媒劑對照小鼠之痕量百分比肌縮蛋白，其可為藉由密度計分析捕獲之背景免疫墨點訊號的結果。
在給藥後26週，在以≥ 1×10 14GC/kg給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中量測之所有肌肉顯示與媒劑對照 mdx小鼠相比時，持續且顯著更高的RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質表現；然而，隔膜中RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現之增加在1×10 14GC/kg下未達至統計顯著性( 圖 31)。在3×10 13GC/kg下，全部三種肌肉中之RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質表現高於媒劑對照 mdx小鼠，但增加未達至統計顯著性。在來自給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠的各肌肉中，持續RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質表現傾向於以劑量依賴型方式之載體DNA。儘管在各劑量組中之肌肉中的載體DNA含量類似，但當相比於腓肚肌及隔膜肌肉時，心肌中之RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質表現較高。
為進一步評估肌纖維中之RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質表現，進行隔膜中之抗肌縮蛋白/微小肌縮蛋白及抗板素(肌纖維標記物)的共免疫螢光( 圖 32A)。在給藥後二十六(26)週，媒劑對照 mdx小鼠與野生型對照相比在隔膜中除了極少數體細胞回復肌纖維(低於1%)以外不具有肌縮蛋白陽性纖維(亦即，在肌纖維膜處無肌縮蛋白表現)。
在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，相比於媒劑對照 mdx小鼠，在 mdx小鼠中在1×10 14GC/kg (57%)下觀測到AAV8-RGX-DYS1微小肌縮蛋白陽性肌纖維顯著增加(p＜0.001)。此外，最高劑量之AAV8-RGX-DYS1實現RGX-DYS1微小肌縮蛋白陽性肌纖維群體接近完全轉導(分別為在3×10 14及5×10 14GC/kg下之95.6%及98.0%)。此外，板素之共免疫螢光揭露肌縮蛋白/微小肌縮蛋白表現限於肌纖維膜。
作為互補終點，在隔膜組織中量測肌縮蛋白/微小肌縮蛋白之強度( 圖 32C)。肌縮蛋白/微小肌縮蛋白染色強度在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中以劑量依賴型方式顯著增加。此資料表明與西方墨點法結果一致，在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中亦以劑量依賴性方式增加RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質含量( 圖 31)。總體而言，微小肌縮蛋白陽性纖維之數量明顯增加及微小肌縮蛋白染色強度相比於媒劑對照 mdx小鼠在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中在≥1×10 14GC/kg下顯而易見。
在 mdx小鼠中進行的此長期研究已顯示，在6週及12週藥理學研究中觀測到的RGX-DYS1對肌肉功能及營養不良型病理學的影響持續給藥後26週。與此等結果一致，在單次給藥AAV8-RGX-DYS1之後保存載體DNA及RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質含量。
總體而言，26週研究之結果展示歸因於腦積水之7隻 mdx早期死亡及歸因於呼吸問題之1隻 mdx早期死亡(在3×10 13、1×10 14、3×10 14及5×10 14GC/kg AAV8-RGX-DYS1下分別為2、1、3、2隻 mdx小鼠)。在≥3×10 14GC/kg下觀測到較低體重。在≥ 1×10 14GC/kg (高強度，病變T2時間)下見到顯著改善。步態分析展示在≥ 1×10 14GC/kg下之改善及在26週時≥ 3×10 14GC/kg下之顯著改善。CK分析展示3×10 13下之減少及≥ 3×10 14GC/kg下之顯著減少。握力在野生型對照與媒劑對照 mdx之間不存在明顯差異。肌肉病理學展示在≥ 1×10 14GC/kg (隔膜及心臟)下纖維化顯著減少，且在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中炎症/變性/再生在1×10 14GC/kg下減少。據證實，基於肌肉病理學資料，1×10 14GC/kg為MED。 6.8 ： 實例 8 ： mdx 小鼠中之 6 週藥理學研究
此研究目標為在單次IV注射之後評估 mdx小鼠中AAV8-RGX-DYS1之藥理學。在0 (媒劑)、3×10 13、1×10 14或3×10 14GC/kg下向 mdx雄性小鼠組(n=5隻/組)給藥單次靜脈內注射液AAV8-RGX-DYS1。另一組野生型小鼠(C57BL/10ScSn)經由單次IV注射接受媒劑作為對照。包括以下參數及端點：死亡率、臨床觀測結果、體重、藉由TD-NMR (時域核磁共振)之全身組成(脂肪、瘦體質及自由流體)、體外肌肉功能(比力及離心收縮)、RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現(蛋白質)及總體檢查。動物在給藥AAV8-RGX-DYS1後6週處死。
未觀測到直至所給藥之最高劑量(3×10 14GC/kg)的AAV8-RGX-DYS1相關死亡率或臨床徵象。在AAV8-RGX-DYS1給藥之後5週，兩隻 mdx小鼠歸因於腦積水而處死。然而，此發現不被視為與測試物相關，因為腦積水在 mdx小鼠中通常可見且亦見於12週藥理學研究中之媒劑對照 mdx小鼠中。
在研究期間發現的野生型小鼠或 mdx小鼠之間無明顯差異。在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，所有組中之平均體重與媒劑對照 mdx小鼠不同，且未偵測到如藉由TD-NMR所量測之身體組成。
為了評估RGX-DYS1是否向 mdx小鼠提供功能性益處，在給藥後6週時量測肌肉之最大力量輸出能力(比力)及肌肉對抗損傷能力(偏心收縮)( 圖 33A-33B 及 34A-34B)。作為互補終點，計算隔膜及EDL中之恢復得分。恢復分數指示正常與 mdx小鼠之間的相對缺陷程度，其提供已藉由干預恢復之缺陷百分比。恢復分數在0% (當干預無效應時)至100% (當「經處理之」樣本顯示與「正常」樣本相同的參數值時)範圍內。
在隔膜比力中，相比於野生型對照(-44%)，針對肌肉橫截面積標準化之媒劑對照 mdx小鼠顯著較低。如 圖 33A中所繪示，在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中觀測到比力之劑量依賴性改善。與媒劑對照 mdx相比，在≥ 1×10 14GC/kg下觀測到比力之顯著增加(p＜0.05)。在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中觀測到比力之恢復評分的劑量依賴性增加(在3×10 13、1×10 14及3×10 14GC/kg下分別為26%、70%及82%，如 表 11中所示)。 表 11：恢復評分(救援%)
隔膜 RGX-DYS1恢復評分   
劑量(GC/kg) 3×10 13GC/kg 1×10 14GC/kg 3×10 14GC/kg
比力 26% 70% 82%
偏心力 無救援 59% 82%
恢復百分比：100 x [( mdx處理值- mdx值)/(野生型值- mdx值)]
營養不良型肌肉更容易受到偏心收縮所誘發之損傷，且在重複壓力之後展現出力產生損失(Petrof等人, 1993)。正如所料，媒劑對照 mdx小鼠相較於野生型對照在5個連續偏心收縮之後具有顯著更大的力損失(媒劑對照 mdx之15%損失相較於野生型之僅2%損失)。AAV8-RGX-DYS1給藥在與對照媒劑 mdx小鼠(分別為6.2%及3.9%損失)相比時引起隔膜肌肉在1×10 14及3×10 14GC/kg劑量下對收縮誘發之損傷的顯著保護。在1×10 14及3×10 14GC/kg下給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中離心收縮力之恢復分數分別為59%及82%( 圖 33B)。
如 圖 34A中所示，相比於野生型對照(-17%)，在媒劑對照 mdx小鼠中EDL中之比力亦顯著降低(p＜0.05)。在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，在1×10 14GC/kg下偵測到EDL中之比力(p＞0.05)增加，且當相比於媒劑對照 mdx小鼠時，在3×10 14GC/kg下更明顯。在1×10 14及3×10 14GC/kg下給藥AAV8-RGX-DYS1之mdx小鼠中比力之恢復分數分別為47%及137% ( 表 12)。 表 12 ：恢復評分(救援%)
EDL RGX-DYS1恢復評分   
劑量(GC/kg) 3×10 13GC/kg 1×10 14GC/kg 3×10 14GC/kg
比力 無救援 47% 137%
偏心力 42% 91% 169%
恢復百分比：100 x [( mdx處理值- mdx值)/(野生型值- mdx值)]
此外，媒劑對照 mdx小鼠與野生型對照相比具有顯著更多的力損失( 圖 34B：媒劑對照 mdx中之30%損失相對於野生型中之11.7%損失)。AAV8-RGX-DYS1給藥在與對照媒劑 mdx小鼠(分別為17.4 %及6.8%損失)相比時引起EDL肌肉在1×10 14及3×10 14GC/kg劑量下對收縮誘發之損傷的保護。此外，偏心收縮之恢復評分顯示在所有給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中之劑量依賴性增加(在3×10 13、1×10 14及3×10 14GC/kg下分別為42%、91%及169%)。
在研究結束時，收集隔膜及TA肌肉用於評估肌肉病理學。根據H&E染色影像量測發炎細胞之數目。
在媒劑對照 mdx小鼠中，相比於野生型對照，隔膜及TA中發炎細胞數目顯著增加(p＜0.05)( 圖 35A及 35B)。在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，當與媒劑對照 mdx小鼠(隔膜中之-22%至-34%及TA中之-17.5%至-22%)相比時，隔膜中≥ 3×10 13GC/kg下及TA中≥ 1×10 14GC/kg下之發炎細胞的數目顯著降低(p＜0.05)。
除檢查來自隔膜及TA之發炎性細胞之外，針對退化、再生、纖維化及中央核進行定性評估(人工地評分)。使用以下手動評分量表：0 (正常)、1 (最小)、2 (輕度)、3 (明顯)及4 (重度)。
相比於野生型對照(正常至輕度)，在媒劑對照 mdx小鼠(最小至重度)中觀測到隔膜肌肉之營養不良型病理學——再生、退化及纖維化。另外，在媒劑對照 mdx小鼠(輕度至明顯)中TA肌肉中觀測到除退化之外的營養不良型特徵，相比於野生型對照(正常至輕度)。值得注意的是，在任何動物，包括媒劑對照 mdx小鼠中未觀測到TA之退化。
在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，與媒劑對照 mdx小鼠(輕度至重度)相比，隔膜及TA中≥ 1×10 14GC/kg下(正常至輕度)之再生嚴重程度評分降低。在隔膜中以1×10 14GC/kg (最小至輕度)改善退化。與媒劑對照 mdx小鼠(輕度至重度)相比，在隔膜及TA中觀測到纖維化嚴重程度評分在≥ 3×10 13(最小至明顯)及≥1×10 14GC/kg (最小至輕度)下降低。在媒劑對照 mdx小鼠中觀測到隔膜(最小至輕度)及TA(輕度)中之中央核；在隔膜中在3×10 14GC/kg下未觀測到改變；且在此劑量下，TA中之嚴重程度評分相較於媒劑對照 mdx小鼠略微降低(最小至輕度)。
AAV8-RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質含量在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中使用具有單株抗體NCL-DYSB (來自Leica Biosystems之純系34C5)之基於毛細管之西方免疫分析(參見實例12)進行量測，該單株抗體鑑別RGX-DYS1微小肌縮蛋白，而非全長小鼠肌縮蛋白(針對人類肌縮蛋白，其對應於胺基酸321至494 (外顯子8-14))。如實例12中所描述進行分析。在第6週，所有野生型及媒劑對照 mdx小鼠未展現出隔膜、腓肚肌及心臟肌肉中可定量的RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質表現。所有給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠展示所有三種肌肉中之劑量依賴性可定量RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質含量。在所有劑量下，在心肌肌肉中偵測到高於隔膜及腓肚肌之含量的RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質。在1×10 14GC/kg下，RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質表現比3×10 13GC/kg高7.3倍(隔膜)、7.4倍(腓肚肌)及1.8倍(心肌)。在3×10 14GC/kg下，RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質表現比1×10 14GC/kg高2.4倍(隔膜)、1.5倍(腓肚肌)及1.9倍(心肌)( 圖 36)。
為進一步證實肌纖維中之RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現，在隔膜及TA中進行共免疫螢光(板素/肌縮蛋白)(資料未展示)。媒劑對照 mdx小鼠在隔膜及TA中無肌縮蛋白陽性纖維(亦即，在肌纖維膜處無肌縮蛋白表現)。相比之下，在以≥ 1×10 14GC/kg給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中觀測到適當定位於TA及隔膜肌肉之肌纖維膜下的RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現增加。
概言之， mdx小鼠中之AAV8-RGX-DYS1的單次劑量提供肌肉功能(比力及偏心收縮)之顯著改善及≥ 1×10 14GC/kg下之營養不良型肌肉病理學之降低。另外，在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中觀測到劑量依賴性增加之微小肌縮蛋白蛋白質表現。因此，基於此研究中產生之資料，將最低有效劑量(MED)視為1×10 14GC/kg。 6.9 藥理學研究之總結及結論
使用 mdx小鼠(DMD之生物學相關模型)進行一系列活體內藥理學研究。此DMD鼠類模型( mdx)表現出許多具有DMD之臨床及病理性表現人類經歷(Rodrigues等人, 2016)。
當向 mdx小鼠靜脈內給藥AAV8-RGX-DYS1時，肌肉功能改善(在2×10 14GC/kg下之握力及體外力量測值；在≥ 1×10 14GC/kg下之步態分析)給藥後6週顯而易見。此外，經藉由自動化步態分析證明，在第≥1×10 14GC/kg劑量下在給藥後12週時，RGX-DYS1對肌肉功能之影響更顯著。用T2-MRI之營養不良型病變之評定顯示≥1×10 14GC/kg劑量下之改善，且在此等劑量下與野生型含量相當。
AAV8-RGX-DYS1給藥以2×10 14GC/kg之劑量顯著減少 mdx小鼠之營養不良型病理學(炎症、退化及再生)，且將在6或26週後進一步評定以進一步表徵劑量關係。此等RGX-DYS1對肌肉功能、生物標記物及病理學之影響與RGX-DYS1微小肌縮蛋白及載體DNA之含量增加相關。在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中，在給藥後6週之後，已經以2×10 14GC/kg之劑量觀測到骨骼肌中之RGX-DYS1微小肌縮蛋白及RGX-DYS1載體DNA的高含量。此外，在給藥後12週之後，在骨骼及心肌肌肉中觀測到高度持續的RGX-DYS1微小肌縮蛋白及載體DNA含量。
在AAV8-RGX-DYS1給藥之後藉由免疫螢光對RGX-DYS1微小肌縮蛋白之額外檢查確認類似於野生型之TA及隔膜肌肉之肌纖維膜下RGX-DYS1微小肌縮蛋白之穩固且正確的定位。需要均勻的肌縮蛋白表現來穩定肌纖維轉換且減弱營養不良型肌肉之病理學(van Westering等人, 2020)。除了RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現之外，其他肌縮蛋白相關之蛋白質亦得以恢復且恰當地表現於TA及隔膜肌肉之肌纖維膜下，表明肌肉中改善之結構完整性。
總體而言，DMD疾病之相關動物模型中之AAV8-RGX-DYS1的單次劑量已提供肌肉功能、與肌肉損傷相關之生物標記物、營養不良型肌肉病理學及其他肌縮蛋白相關蛋白質之顯著益處。在1×10 14GC/kg之AAV8-RGX-DYS1劑量，經藉由精細運動動態步態分析所量測之肌肉功能顯著改善及如在12週研究中藉由MRI所量測之肌肉保存改善。在2×10 14GC/kg之AAV8-RGX-DYS1劑量下，在6週POC研究中，除了顯著改善肌肉功能之外，亦顯著改善營養不良型病理學及DAPC蛋白質表現。此外，在≥1×10 14GC/kg劑量之骨骼及心臟肌肉中觀測到高含量載體DNA及增加之RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質表現。因此，向 mdx小鼠(DMD疾病之鼠類模型)靜脈內給藥AAV8-RGX-DYS1後的最小有效劑量目前視為1×10 14GC/kg。 6.10 實例 9 ： 小鼠之毒理學研究
AAV8-RGX-DYS1之毒性已在12週及26週之藥理學研究(非GLP)中在 mdx小鼠中進行評估。 6.10.1 12 週 mdx 小鼠毒理學研究
如上文在關於藥理學研究之 mdx小鼠中的12週研究中所描述，將同一研究方案用於毒性研究(本文實例4)。以0 (媒劑)、3×10 13、1×10 14、3×10 14或5×10 14GC/kg向 mdx雄性小鼠組(n=10隻/組)給藥單次IV注射液AAV8-RGX-DYS1。包括另一組野生型小鼠(C57BL/10ScSn)作為對照。動物在給藥AAV8-RGX-DYS1後12週處死。以下參數及終點包括：死亡率、臨床觀測結果、體重、總體檢查、組織重量及組織病理學，包括精子形成。
在所有劑量組中平均體重隨研究時間而增加。相比於第3週開始媒劑對照 mdx小鼠，給藥＞3×10 14GC/kg之AAV8-RGX-DYS1劑量的 mdx小鼠之平均體重顯著降低。儘管其體重低於野生型，但差異最小(低於10%)，其中在兩個高劑量(3×10 14及5×10 14GC/kg)下野生型小鼠與給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠之間無統計學差異。
屍體剖檢時，收集腦、垂體腺、脊髓(頸椎、胸椎及腰椎)、腎上腺、腎臟、肝臟、肺、下頜及腸系膜淋巴結、胰臟、脾臟、胸腺、前列腺、精囊腺、睪丸及附睾，且用顯微鏡檢測。向雄性 mdx小鼠給藥單次IV劑量之AAV8-RGX-DYS1(至多5×10 14GC/kg)不與所檢測組織(包括男性生殖器官)中之任何剖檢病變、器官重量差異或顯微鏡發現相關。
因此，當向 mdx小鼠之組給藥AAV8-RGX-DYS1時，未觀測到不良作用含量(NOAEL)為5×10 14GC/kg，所測試之最高劑量。 6.10.2. mdx 小鼠中 26 週毒理學研究
結合26週本文實例7中所描述之 mdx小鼠藥理學研究進行毒理學研究。在0 (媒劑)、3×10 13、1×10 14、3×10 14或5×10 14GC/kg下向 mdx雄性小鼠組(每時間點n=10隻/組)給藥單次IV注射液AAV8-RGX-DYS1。包括另一組野生型小鼠(C57BL/10ScSn)作為對照。在給藥後26週處死動物。以下參數及終點包括：死亡率、臨床觀測結果、每週體重、總體檢查、組織重量及組織病理學，包括精子形成。死亡率及體重之結果呈現於 圖 21中。 6.11 實例 10 - 臨床試驗方案 6.11.1 研究基本原理：
杜興氏肌肉失養症(DMD)為一種引起進行性肌無力之肌肉萎縮症X性聯形式，其通常引起青年期死亡。DMD影響全世界約3,600至9,300名男性新生兒中之1名(Mah等人, 2014)。該疾病由DMD基因突變引起，DMD基因突變位於X染色體上且編碼經由肌肉細胞膜上之DAPC為骨骼及心肌纖維提供結構穩定性的蛋白質(肌縮蛋白)(Hoffman等人, 1987)。具有DMD基因突變之患者缺乏功能性肌縮蛋白可降低肌肉細胞之質膜穩定性。膜不穩定引起機械特性及異常傳訊改變，其促進膜脆弱性、壞死、炎症及進行性肌肉萎縮(Evans等人, 2009)。
AAV8-RGX-DYS1為重組腺相關病毒類型8，其含有經設計以自肌肉特異性啟動子表現微小肌縮蛋白之人類微小肌縮蛋白表現卡匣，且可能預防DMD患者之肌肉退化，與DMD突變無關。 6.11.2 劑量：
1×10 14或2×10 14GC/kg身體質量之AAV8-RGX-DYS1劑量將以單次IV劑量給藥。 6.11.3. 研究設計：
此為首次在人類、多中心、1/2期、不可控、開放標記、單次劑量遞增及劑量擴增研究中，用於評估在52週研究期間至少6名具有DMD之流動男性參與者中之2個劑量含量之AAV8-RGX-DYS1的安全性、耐受性、PD (RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現量)、PK (載體濃度)及初步臨床功效。安全性將為主要焦點，其中次要焦點在於RGX-DYS1微小肌縮蛋白之表現量。至少6名參與者將入選以接受單次劑量之AAV8-RGX-DYS1。參與者將在給出書面知情同意書時入選且將僅在完成所有預處理篩選及基線評定之後接受干預。
在此試驗中，兩組將分析自試驗、外部獨立資料監測委員會(IDMC)及舉辦者內部安全委員會(ISC)累積之資料。IDMC之主要作用為以週期性時間間隔評估安全性。ISC之主要作用為在進行中的基礎上監測安全性。
將對於第一組以1×10 14GC/kg給藥兩個參與者組，且隨後對於第二組以2×10 14GC/kg給藥。各劑量組中之第一參與者必須稱重低於或等於20 kg以接受AAV8-RGX-DYS1，各劑量組中之第二參與者必須稱重低於或等於30 kg，且各劑量組中之第三參與者必須稱重低於或等於40 kg。開始於劑量遞增階段，前三個符合條件的參與者將依序分配給組1以接受以1×10 14GC/kg體重之劑量的AAV8-RGX-DYS1之單次靜脈內輸注。且給藥將錯開至少4週。將在參與者中之每一者已完成4週隨訪之後藉由ISC審查安全性資料。在第三參與者在給藥後4週之後且已由IDMC及ISC審查安全性資料之後，後續參與者可同時給藥。該ISC將在審查各參與者安全性資料之後給出建議。若ISC推薦繼續，則下一個參與者將被給藥。
在第1組中第三次給藥參與者在給藥後4週之後，累積安全性資料將由IDMC審查。若IDMC認為在此較低劑量下可接受的安全性，則接下來的3個符合條件的參與者將依序分配給第2組以接受以2×10 14GC/kg體重之劑量的AAV8-RGX-DYS1之單次IV劑量輸注。另外，可在組1平行擴展時登記多達6個額外符合條件的參與者。組2內前3名參與者之給藥將以交錯方式進行，相隔至少4週。如針對第1組所描述，將進行由ISC及IDMC之安全性資料審查，包括在第2組劑量水準下對多達6名額外符合條件之參與者進行擴展登記之考慮因素。
在各參與者已完成AAV8-RGX-DYS1給藥後12週之後，將在各給藥組之前三個參與者之肌肉切片中確定RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現量，且將藉由功能性測試評估參與者之臨床功效。
在第12週完成後，將在給藥AAV8-RGX-DYS1之後52週繼續評定參與者之安全性及功效。在研究結束時，將邀請所有參與者參與長期後續研究。
將使用經驗證之結果量測(McDonald等人, 2013; McDonald等人, 2018; Mutoni等人, 2019)，包括北極星移動評量表(NSAA)線性分數評定參與者在整個52週追蹤期中之能走動功能、定時任務及強度。將量測其他功效結果，包括站立時間(TTSTAND)、跑步/步行10米時間(TTRW)、爬四階樓梯時間(TTCLIMB)、肌檢測；以及使用MRI成像、心臟及肺部功能、肌酸激酶含量及患者報導結果評定肌肉。
樣品大小及功率計算：至少6名參與者將入選以分析AAV8-RGX-DYS1之安全性及耐受性且探究AAV8-RGX-DYS1對生物標記及臨床功效終點之效應。樣品大小並不基於任何統計調整。
統計方法：所有資料將使用描述性統計概述。分類變數將使用頻率及百分比分析，且連續變數將使用描述性統計(未缺失觀測結果之數目、平均值、標準偏差、中值、最小值及最大值)概述。個體清單及圖形顯示器將視需要呈現。 6.11.4 合格準則：
此研究中之參與者將為患有基於臨床表現之DMD診斷的男性；家族病史(若適用)；且由用於藉由免疫螢光或西方墨點法(例如，經本文所描述之基於毛細管之西方免疫分析或證明與DMD一致之突變的基因分型)進行肌縮蛋白分析的骨胳肌肉切片證實。參與者必須能夠在無輔助性裝置之情況下步行至少100公尺，且能夠在≥3及＜9秒中自仰臥起立(站立時間測試[TTSTAND])。 6.11.5 包括
在適用時，在任何研究相關程序之前，男性參與者父母或法定監護人已提供書面知情同意書及健康保險流通與責任法案(HIPAA)授權；將要求參與者根據當地要求提供書面或口頭詢問。
參與者必須為至少4歲且小於12歲。
參與者具有DMD之先前診斷，如定義為：展示肌縮蛋白缺乏之骨胳肌肉活檢之肌縮蛋白免疫螢光及/或西方墨點分析(例如基於毛細管之西方免疫分析)，及與典型DMD或DMD基因內之可鑑別突變一致的臨床圖片(一或多個外顯子之缺失/重複)，其中閱讀框架可預測為「無框架」，且臨床圖像與典型DMD一致，或完整DMD基因定序顯示預期排除肌縮蛋白蛋白質之產生的改變(點突變、複製、其他) (亦即，無意義突變、引起下游終止密碼子之缺失/重複)，其中臨床圖像與典型DMD一致。
參與者能夠在無輔助性裝置之情況下獨立地行走100米，經在篩選訪問時評定。
參與者能夠在輔助之情況下完成≥3及＜9秒，經在篩選訪問時評估。
在調查員觀點，臨床實驗室測試結果，包括肝功能及腎功能，在篩選訪問時處於正常範圍內，或若異常，則為臨床上不顯著的。
在篩選訪問時提供記錄，即參與者具有2次劑量之麻疹、流行性腮腺炎、風疹及水痘疫苗，具有或不具有免疫之血清證據。
參與者已服用穩定日劑量之全身性糖皮質激素，≥0.5 mg/kg/天普賴松或普賴蘇穠或≥0.75 mg/kg/天地夫可特持續在篩選訪問之前至少12週。
參與者及父母/監護人願意且能夠遵守安排問診、研究介入給藥計劃及研究程序。 6.11.6 排除
若以下中之一或多者為真，則排除患者：
參與者具有嚴重或不穩定的醫學或心理病症，其在PI觀點中將損害個體之安全性或成功參與研究或解釋研究結果。
參與者具有症狀性心肌症之證據。
參與者具有在研究者觀點中排除參與研究之嚴重行為或認知問題；
參與者在血清中具有可偵測之AAV8總結合抗體；
參與者患有可影響功能測試之任何未癒合損傷或手術(例如，NSAA)。
參與者在其壽命內接受任何研究性或商業基因治療產品。
參與者具有人類免疫缺乏病毒(HIV)或B型肝炎或C型肝炎病毒感染之病史，或B型肝炎(B型肝炎表面抗原、B型肝炎表面抗原、B型肝炎核心抗體[IgG])或C型肝炎(C型肝炎抗體或HCV RNA)或HIV抗體之陽性篩選測試。
參與者為臨床現場雇員之一級家庭成員或參與研究實施之任何其他個人。
參與者當前服用任何其他研究性干預或在計劃第1天干預之前3個月內已服用任何其他研究性干預。 6.11.7 研究目標及終點 表 13
類型 目標 終點
主要
安全性 為了評估以1 × 10 14GC/kg體重或2 × 10 14GC/kg體重之單次IV劑量形式在患有DMD之流動男生中給藥的AAV8-RGX-DYS1之安全性及耐受性 • AE及SAE • 生命體徵、體檢、臨床實驗室測試、12導聯心電圖、2D超音波心動描記術、對AAV8載體之免疫反應
二級
類型 目標 終點
藥力學(PD) 為了研究對以1 × 10 14GC/kg體重或2 × 10 14GC/kg體重之單次IV劑量形式在患有DMD之流動男生中給藥的AAV8-RGX-DYS1之肌肉中之微小肌縮蛋白表現量的影響 在基線及第12週RGX-DYS1微小肌縮蛋白的定量：在來自各給藥組的前三個參與者中的二頭肌肌肉切片中確定的RGX-DYS1微小肌縮蛋白表現量
藥物動力學(PK)及載體外殼 為了評估以1 × 10 14GC/kg體重或2 × 10 14GC/kg體重之單次IV劑量形式在患有DMD之流動男生中給藥的AAV8-RGX-DYS1之單劑量PK及載體排出 給藥後24小時、第1週、第2週、第4週、第12週及第6及12個月以及評估時間點之肌肉的血液及尿液。
臨床功效 為了評估以1 × 10 14GC/kg體重或2 × 10 14GC/kg體重之單次IV劑量形式在患有DMD之流動男生中給藥的AAV8-RGX-DYS1之臨床功效 以下終點之縱向軌跡及自基線至第12週及第6、9及12個月評定時間點之變化： • NSAA線性分數(主要功效結果量測)及NSAA之原始總分數 • TTSTAND速度(上升/秒) • TTCLIMB速度(任務/秒) • 完成10公尺之TTRW速度(公尺/秒) • 來自手持式肌檢測之參數 • 來自POSNA PODCI之參數 • 來自Peds QL神經肌肉核心ADL及FIM之參數
類型 目標 終點
臨床功效    以下終點之縱向軌跡：
        
        
      • 基線處、6個月及12個月之骨胳肌肉MRI成像的參數
        
   為了評估以1 × 10 14GC/kg體重或2 × 10 14GC/kg體重之單次IV劑量形式在患有DMD之流動男生中給藥的AAV8-RGX-DYS1之臨床功效 • 來自基線及第12個月時之心臟MRI的參數
      • 在基線、第6個月及第12個月之肺部功能測試的參數
6.11.9 生物分析方法 肌肉活檢體 - RGX-DYS1 微小肌縮蛋白分佈
免疫組織化學分析及西方墨點(例如，經本文所描述之基於毛細管之西方免疫分析)將用於偵測表現RGX-DYS1微小肌縮蛋白之纖維及其定位。 免疫原性分析 抗 -AAV8 抗體分析
將證實利用Mesoscale平台之基於電化學發光之分析法以偵測血清中AAV8之總抗體，且其將用於監測AAV8-RGX-DYS1之潛在免疫反應。此分析將不用以確定參與研究之個體適用性。驗證另一分析以基於抗AAV8抗體狀態鑑別符合條件的個體。 ELISPOT
將研發干擾素γ ELISPOT分析以偵測針對RGX- 202之潛在細胞反應，針對AAV8衣殼蛋白質或RGX-DYS1微小肌縮蛋白。 RGX-DYS1 載體分析 載體排出
將開發量測血液(或血清)及尿液中之RGX-DYS1的qPCR分析以量測給藥之後RGX-DYS1載體之排出。 肌肉切片中之生物分佈
將開發量測肌肉活體組織切片中之RGX-DYS1載體DNA的qPCR分析以量測給藥之後目標組織之載體生物分佈。 6.11.10 與免疫抑制性療法組合
在一些態樣中，本文所描述之方案可與免疫抑制性療法組合。方案中使用的載體有可能可引起炎症，因此在基因療法可能適用之前、期間或之後給藥免疫抑制，諸如消炎。 類固醇
臨床試驗已監測肝臟酶含量作為T細胞反應之生物標記物，使用用類固醇藥物之免疫抑制以對抗反應。AAV載體與腺病毒及慢病毒載體相比至少高效地誘導CD8+ T細胞，且觀測到T細胞反應在整個研究中為可變的，指示其他因素(例如，血清型、載體設計、劑量、給藥途徑、製造)可能在起作用(Shirley等人, 2020)。
與長期類固醇用途相關之副作用不同，包括(但不限於)肌肉骨胳、胃腸道、代謝、神經及內分泌病症。亦可出現過敏性反應(例如，過敏性、過敏反應)。然而，類固醇目前廣泛用於全身性、肝臟及眼部AAV基因療法以抵消炎症及抗病毒CD8+ T細胞反應(Shirley等人, 2020)。
可給藥預防性IS方案以減輕對AAV8-RGX-DYS1之潛在免疫反應。
在第1天，可向參與者之基線糖皮質激素添加日劑量之口服普賴蘇穠，其目標為若不存在安全性問題，則在第12週之後恢復參與者基線糖皮質激素方案。額外口服普賴蘇穠給藥方案/逐步逐漸減小可如下：第1天至第8週結束：1 mg/kg/天。若在第8週時不存在安全性問題，則基於參與者之臨床狀態(包括病史、體檢及實驗室測試)之綜述，口服普賴蘇穠劑量可在第9週-第10週降低至：0.5 mg/kg/天。若在第10週時不存在安全性問題，則基於參與者臨床狀態(包括病史、體檢及實驗室測試)之綜述，口服普賴蘇穠劑量可在第11週至第12週降低至：0.25 mg/kg/天。若在第12週時不存在安全性問題，則基於參與者臨床狀態(包括病史、體檢及實驗室測試)之綜述，參與者基線糖皮質激素方案可根據研究者判斷恢復研究之剩餘部分。若在前12週內出現安全問題，則在返回至基線糖皮質激素方案之前，接觸醫學監測者且IS方案根據具體情況評估修改。注意：參與者在初始時間接受高劑量週末類固醇方案，應繼續其週末方案以及上文詳述之每天額外口服普賴蘇穠方案/逐步逐漸減少。參與者每日總類固醇劑量(基線方案+研究規定的額外口服普賴蘇穠)不超過等效於60 mg普賴松之劑量。 艾庫組單抗
DMD患者之兩個AAV介導之基因療法研究已報導與補體病症一致之AE，包括與aHUS相關之AE。
艾庫組單抗為以高親和力特異性結合至補體蛋白C5之長效人源化單株抗體(SOLIRIS處方資訊，2020)。其抑制C5裂解成C5a及C5b，阻止產生末端補體複合物C5b-9。艾庫組單抗抑制患有aHUS之患者的終端補體介導之血栓性微血管病(SOLIRIS Prescribing Information, 2020; Legendre等人, 2013)。為了減輕C5補體活化及隨後補體介導之AE，可在AAV8-RGX-DYS1給藥之前開始且在AAV8-RGX-DYS1給藥之後第12天結束向研究參與者預防性地給藥艾庫組單抗。艾庫組單抗先前已在以上提及之AAV基因療法研究中用於DMD患者，作為補體介導之不良反應的治療及預防(Pfizer press release, 2020; Solid Biosciences press release, 2020)。
艾庫組單抗經由重力饋料、注射型泵或輸注泵以IV輸注形式在兒科患者中經1至4小時給藥。劑量視參與者之重量而定( 表 14)。艾庫組單抗誘導及維持劑量之指定時序為確保在AAV8-RGX-DYS1給藥後第5天至第8天時艾庫組單抗之峰值含量，其為與來自由AAV9基因療法之其IGNITE DMD研究中之Solid Bioscience報導的臨床資料之峰值補體活性相關的時間範圍。若在艾庫組單抗輸注期間發生任何不良反應，則可由調查員酌情處理減緩或停止輸注。在輸注完成輸注相關之反應的病徵或症狀之後，將監測參與者至少1小時。在第12天給藥艾庫組單抗之後，可定期監測補體水平，以便在需要進一步干預時作出臨床決策。 表 14 ： 艾庫組單抗給藥時程
參與者體重 劑量 相對於第1 天AAV8-RGX-DYS1 劑量之給藥日 劑量總數目
10 kg - ＜20 kg 600 mg 第-9天、第-2天、第4天、第12天 4
20 kg - ＜30 kg 800 mg 第-16天、第-9天、第-2天、第12天 4
30 kg - ＜40 kg 900 mg 第-16天、第-9天、第-2天、第12天 4
≥40 kg 1200 mg 第-30天、第-23天、第-16天、第-9天、第-2天、第12天 6
如aHUS單臂前瞻性試驗(≥20%)中所報導，與艾庫組單抗相關之不良反應為頭痛、腹瀉、高血壓、上呼吸道感染、腹痛、嘔吐、鼻咽炎、貧血、咳嗽、周邊水腫、噁心、泌尿道感染及發熱。危及生命且致命的腦膜炎球菌感染已出現在用艾庫組單抗治療之患者中，且若未在早期辨識及治療，則會變得快速危及生命或致命(SOLIRIS Prescribing Information, 2020)。 腦膜炎球菌疫苗
危及生命且致命的腦膜炎球菌感染已出現在用艾庫組單抗治療之患者中，且若未在早期辨識及治療，則會變得快速危及生命或致命(SOLIRIS Prescribing Information, 2020)。
無需對照護者提供先前腦膜炎球菌疫苗接種之資料的參與者進行再接種。對於需要腦膜炎球菌疫苗之參與者，亦即先前尚未經疫苗接種或無法提供已經疫苗接種之資料的彼等參與者，腦膜炎球菌疫苗之過程經肌肉內給藥--根據特異性產物標籤、兒童年齡及服用補體抑制劑(諸如艾庫組單抗)之兒童的局部疫苗接種實踐，腦膜炎球菌共軛物或MenACWY疫苗，或血清群B腦膜炎球菌或MenB疫苗(例如，根據美國疾病控制與預防中心免疫實踐諮詢委員會)。疫苗療程必須在艾庫組單抗給藥開始之前至少2週完成。
疫苗接種減少，但不消除腦膜炎球菌感染之風險(SOLIRIS Prescribing Information, 2020)。必須監測參與者之腦膜炎球菌感染之早期徵象且若懷疑感染，則立即評估該參與者。艾庫組單抗必須在治療嚴重腦膜炎球菌感染之任何參與者中中斷。
疫苗副作用通常是輕度的，包括注射部位反應(發紅、疼痛或酸痛)、發熱或發冷、肌肉或關節痛、頭痛、疲勞以及噁心或腹瀉。在罕見情形下，過敏性反應 西羅莫司
具有西羅莫司之組合免疫抑制已包括於許多AAV基因療法研究中，以使針對AAV及/或轉殖基因之免疫反應對安全性及功效之影響降至最低，且似乎為安全及良好耐受的。亦稱為雷帕黴素之西羅莫司藉由阻斷細胞內傳訊及代謝路徑來抑制細胞介素促進T細胞擴增及成熟之能力。其亦常用於移植後免疫抑制(Zhao等人, 2016)。最後，非臨床及臨床研究表明，西羅莫司可提供調節性T細胞(Treg)之相對避開，其可允許在不反彈免疫反應之情況下戒斷藥物(Hendrikx等人, 2009; Ma等人, 2009; Mingozzi等人, 2007; Singh等人, 2014)。
以高於安慰劑所報導之發生率報導之西羅莫司最常見(≥20%)不良反應包括周邊水腫、高脂質血症、肌酐增加、便秘、腹痛、頭痛、疼痛及關節痛(RAPAMUNE® Prescribing Information, 2021)。免疫抑制療法一般可使得對機會性感染及可能發展淋巴瘤及其他惡性疾病之易感性增加(參考方框警告；RAPAMUNE® Prescribing Information, 2021)。
口服西羅莫司給藥方案將如下：第-7天：3 mg/m2西羅莫司之起始劑量。第-6天至第8週：使用層析分析，每日兩次(BID)分開西羅莫司1 mg/m2/天，其中目標血液含量為8-12 ng/mL。粗略監測將在研究第-2天、第2天、第6天、第12天(若需要)及第14天進行，且隨後視需要(PRN)直至第8週。第9-10週：若肝功能測試(LFT)、血小板及任何其他相關安全實驗室保持穩定，則將西羅莫司劑量降低50%。第11-12週：若LFT、血小板及任何其他相關安全實驗室保持穩定，則將西羅莫司劑量再降低50%。在第12週之後：若LFT、血小板及任何其他相關安全性實驗室保持穩定，則中斷西羅莫司。
一旦調節西羅莫司維持劑量，參與者便應在利用濃度監測之進一步劑量調節之前繼續新維持劑量至少4天，除非安全性問題要求緊急調節劑量。在任何天給藥的最大西羅莫司劑量不應超過40 mg。
接受免疫抑制劑(包括西羅莫司)之患者的機會性感染(包括多瘤病毒感染)的風險增加。免疫抑制患者中之多瘤病毒感染可能具有嚴重且有時致命的結果。此等症狀包括多瘤病毒相關腎病(PVAN)，主要歸因於BK病毒感染，及已在接受西羅莫司之患者中觀測到的約翰坎甯安(JC)病毒相關的進行性多病灶腦白質病(PML)。密切監測西羅莫司粗略持續免疫抑制過程之持續時間，且發起適當的劑量調節。 磺胺甲基異㗁唑及甲氧苄啶
可定期量測病毒基因體之巨細胞病毒(CMV)及埃-巴二氏病毒(EBV) PCR測試，且以5 mg/kg之劑量開始於第-7天，可一週(例如，星期一、星期三、星期五)給予卡氏肺孢子蟲肺炎(PCP)與產物磺胺甲基異㗁唑及甲氧苄啶(BACTRIM TM處方資訊，2021；SEPTRA處方資訊，2006)組合預防3次，且繼續直至西羅莫司中斷。對於患有磺酸過敏之參與者而言，替代藥劑可包括潘他米丁、氨苯碸及阿托喹酮。 6.12 實例 11 - 微小肌縮蛋白穩定性研究
此研究顯示藉由組織培養物中之脈衝追蹤分析量測的微小肌縮蛋白蛋白質之穩定性。
AAV介導之基因療法代表最有前景的DMD治療性策略之一。由於AAV載體之封裝能力有限，必須截短肌縮蛋白編碼序列以產生微小肌縮蛋白。肌縮蛋白之內部或末端缺失可導致不穩定的蛋白質，因為桿及鉸鏈重複連接中的摺疊改變，或與肌縮蛋白相關蛋白複合物(DAPC)的次最佳相互作用，引起膜複合物更不穩定。已設計具有增加長度之羧基末端(CT)域之微小肌縮蛋白，且其穩定性已在具有兩種不同脈衝追蹤分析之組織培養物中量測。
評估三種編碼不同長度CT之微小肌縮蛋白構築體：構築體RGX-DYS1 (編碼µDys-CT194)、構築體RGX-DYS5 (編碼µDys-CT140)及構築體RGX-DYS3 (編碼µDys-CT48)。因此，此等構築體分別編碼具有CT域之194個胺基酸、140個胺基酸及48個胺基酸的微小肌縮蛋白蛋白質(參見 圖 2及 表 10)。含有RGX-DYS1基因體之AAV8與含有RGX-DYS5基因體或RGX-DYS3基因體之AAV8相比可在 mdx小鼠之骨胳肌肉中產生更高的微小肌縮蛋白含量。在當前研究中，經由用編碼Halo-RGX-DYS1及Halo-RGX-DYS3融合蛋白質之質體轉染小鼠C2C12成肌細胞，接著進行螢光脈衝追蹤研究來探索微小肌縮蛋白穩定性。動力學成像及自動影像分析用於追蹤Halo-µDys融合蛋白質螢光訊號隨時間推移之衰變及半衰期之計算。HaloTag技術允許HaloTag融合蛋白質共價結合至特異性小分子配位體，其可攜帶螢光基團。因此，特異性標記之HaloTag-融合蛋白質可在細胞中偵測且藉由螢光定量全細胞成像或SDS-PAGE中之蛋白帶活體外觀測。此方法藉由隨後用過量非螢光配位體阻斷而適合於脈衝-追蹤技術。簡言之，藉由JaneliaFluor549 Halotag配位體標記蛋白質，隨後經過量非螢光競爭性配位體阻斷。動力成像藉由指數衰減建模且由半衰期(t 1/2)表示( 圖 37A)。螢光凝膠成像亦藉由比較時間點之間的衰減建模，從而計算半衰期(t 1/2)( 圖 37B)。
結果指示，Halo-RGX-DYS1之半衰期比Halo-RGX-DYS3高1.8倍，指示對微小肌縮蛋白穩定性之CT貢獻(脈衝追蹤)。如藉由蛋白質凝膠螢光所量測，Halo-RGX-DYS1之半衰期確定為Halo-RGX-DYS3之半衰期的三倍。
同時，環己醯亞胺追蹤用於確定不同CT長度之微小肌縮蛋白蛋白質的周轉率。經修飾之HEK293細胞經編碼RGX-DYS1 (µDys-CT194)、RGX-DYS5 (µDys-CT140)及RGX-DYS3 (µDys-CT48)之質體轉染，用環己醯亞胺停止轉譯，且使用基於抗肌縮蛋白抗體之流動式細胞測量術分析在各種時間點下量測微小肌縮蛋白含量。繪製隨時間變化之標準化強度，且將資料擬合至指數衰減曲線以計算半衰期( 圖 37C)。
量測在HEK293細胞中由RGX-DYS1編碼之微小肌縮蛋白的半衰期比由RGX-DYS5編碼之微小肌縮蛋白的半衰期高1.5倍，且比由RGX-DYS3編碼之微小肌縮蛋白的半衰期高2.1倍，經藉由環己醯亞胺-追蹤分析量測(圖38C)。為解密影響蛋白質穩定性之因素，由RGX-DYS1及RGX-DYS3自BV/Sf9表現系統編碼之純化重組蛋白質之特徵進一步在於用於熔融溫度量測之差示掃描螢光測定法(DSF)及蛋白酶K消化之連續稀釋以用於蛋白酶抗性測試。資料展示對於由RGX-DYS1及RGX-DYS3編碼之經純化微小肌縮蛋白，熔融溫度及蛋白酶抗性為相同的。此表明由RGX-DYS1 (µDys-CT194)編碼之微小肌縮蛋白中之較長CT域呈現的穩定性增加可經由與細胞搭配物相互作用發生，諸如已知在CT域組裝之肌縮蛋白相關蛋白複合體(DAPC)之成員。此類相互作用在僅含有純化µDys蛋白質之試管中在熔融溫度及蛋白酶抗性量測值下損失。
總之，使用Halo Tag動力學成像及環己醯亞胺追蹤流式細胞測量術藉由螢光脈衝追蹤量測細胞培養物中之微小肌縮蛋白蛋白質的半衰期。資料表明微小肌縮蛋白之延長的CT域可使蛋白質半衰期延長約2倍，且可改進此等新穎微小肌縮蛋白蛋白質之治療益處。 6.13 實 例 12 ： 用於定量肌縮蛋白及微小肌縮蛋白之基於毛細管之西方方法
已研發出一種藉由基於毛細管之西方免疫分析方法對肌縮蛋白(Dys)及微小肌縮蛋白(µDys)進行定量的方法以支持RGX-DYS1基因療法之臨床評估。
AAV8-RGX-DYS1為血清型8之重組腺相關病毒(AAV8)，其具有經最佳化人類微小肌縮蛋白轉殖基因及經設計以增加肌肉表現之啟動子(SPc5-12)。對給予AAV8-RGX-DYS1之個體中骨骼及心臟肌肉中之µDys含量的定量為理解基因療法之治療作用的重要因素。
開發及驗證利用JESS自動化(藉由ProteinSimple)之基於毛細管之西方方法，以在來自不同物種之組織溶胞物中在大校準範圍內量化µDys及Dys兩者。自動化JESS系統提供優於傳統西方墨點法之優點，諸如快速運行時間、無墨點法、對內參考物進行多工及使用極低量樣品(更少100倍)及抗體(更少500倍)。
重組µDys蛋白質(RGX-DYS1)在哺乳動物細胞中產生且分離為允許直接定量RGX-DYS1轉殖基因產物之參考標準。猴方法中之µDys蛋白質之校準曲線範圍為4.0- 200 ng/mg且小鼠方法中為5.0-160 ng/mg。根據FDA之生物分析方法驗證導引中概述之原理，在小鼠及猴組織中驗證該等方法。猴組織方法之敏感性展現為4.0 ng之µDys/mg總組織溶胞物，總體準確性及精確度在±30%內，且小鼠組織方法為5.0 ng之µDys/mg總組織溶胞物，精確度及精確度在±20%內。猴組織中之肌縮蛋白偵測特異性亦由各種可商購抗體證實。總體而言，結果顯示基於毛細管之西方方法具有敏感性、特異性且穩固性。該等分析成功地用於量測µDys含量以支援各種臨床前研究，諸如實例8中所描述之研究。簡言之，藉由將冷凍組織切成若干片(各自約20-30mg)，將其放入基於珠粒之組織均質器以及溶解緩衝液來製備小鼠肌肉組織溶胞物樣品。量測組織溶胞物之總蛋白質濃度。隨後，已知量之重組μDys外加至初始小鼠組織溶解物中。在毛細管中使用JESS儀器對規定量之總蛋白質進行大小分離，之後與對Dys (且亦識別μDys)具有特異性之初級小鼠單株抗體(NCL-DYSB)及對α-輔肌動蛋白具有特異性之兔多株抗體(內參考物)一起培育。隨後添加二級抗小鼠HRP共軛之抗體及抗兔NIR (近紅外)抗體，且最後添加流明諾/過氧化酶用於偵測特異性複合物。在多個暴露時間偵測所產生之訊號(化學螢光[HRP]及螢光[NIR])且藉由Compass軟體(ProteinSimple)自動定量。化學發光及NIR訊號顯示為電泳圖或虛擬西方墨點樣影像。電泳圖顯示沿著毛細管之長度偵測到之強度(每秒)及自動偵測到之峰，其藉由計算樣品中存在之特定分析物(Dys、μDys及α-輔肌動蛋白)的量直接成比例之曲線下面積(AUC) (Compass)。隨後在SoftMax Pro軟體(版本7.0)中用具有1/Y^2加權函數之4-PL曲線擬合分析標準化值或μDys AUC資料。最終濃度以μDys/mg之總組織溶解物蛋白質濃度的ng形式(ng/mg蛋白質)報導，如 圖 36中。 參考文獻Adams ME, Kramarcy N, Krall SP, Rossi SG, Rotundo RL, Sealock R, Froehner SC. Absence of alpha-syntrophin leads to structurally aberrant neuromuscular synapses deficient in utrophin. J Cell Biol. 2000 Sep 18;150(6):1385-98. doi: 10.1083/jcb.150.6.1385。 Ahi YS, Mittal SK. Components of Adenovirus Genome Packaging. Front Microbiol. 2016 Sep 23;7:1503. doi: 10.3389/fmicb.2016.01503。 Athanasopoulos T, Foster H, Foster K, Dickson G. Codon optimization of the microdystrophin gene for Duchene muscular dystrophy gene therapy. Methods Mol Biol. 2011;709:21-37. doi: 10.1007/978-1-61737-982-6_2。 Banks GB, Judge LM, Allen JM, Chamberlain JS. The polyproline site in hinge 2 influences the functional capacity of truncated dystrophins. PLoS Genet. 2010;6(5):e1000958. Published 2010 May 20. doi:10.1371/journal.pgen.1000958 Beekman C, Janson AA, Baghat A, van Deutekom JC, Datson NA. Use of capillary Western immunoassay (Wes) for quantification of dystrophin levels in skeletal muscle of healthy controls and individuals with Becker and Duchenne muscular dystrophy. PLoS One. 2018;13(4):e0195850. Published 2018 Apr 11. doi:10.1371/journal.pone.0195850 Binks M. Parent Project Muscular Dystrophy Annual Conference 2019 BioNews.  Translarna (ataluren). Muscular Dystrophy News Today。 https://musculardystrophynews.com/translarna-ataluren/  Updated November 26, 2019. Accessed February 5, 2020。 BioNews.  Vyondys 53 (golodirsen) Muscular Dystrophy News Today。 https://musculardystrophynews.com/golodirsen-srp-4053/ Updated December 13, Birnkrant DJ, Bushby K, Bann CM,等人. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: respiratory, cardiac, bone health, and orthopaedic management. Lancet Neurol. 2018;17(4):347-361. doi:10.1016/S1474-4422(18)30025-5 Brooke MH, Fenichel GM, Griggs RC,等人. Duchenne muscular dystrophy: patterns of clinical progression and effects of supportive therapy. Neurology. 1989;39(4):475-481. doi:10.1212/wnl.39.4.475 Bulfield G, Siller WG, Wight PA, Moore KJ. X chromosome-linked muscular dystrophy ( mdx) in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984;81(4):1189-1192. doi:10.1073/pnas.81.4.1189 Bushby K, Finkel R, Birnkrant DJ,等人. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 2010;9(1):77-93. doi:10.1016/S1474-4422(09)70271-6 Chan S, Head SI, Morley JW. Branched fibers in dystrophic mdxmuscle are associated with a loss of force following lengthening contractions. Am J Physiol Cell Physiol. 2007;293(3):C985- C992. doi:10.1152/ajpcell.00128.2007 Chroboczek J, Bieber F, Jacrot B. The sequence of the genome of adenovirus type 5 and its comparison with the genome of adenovirus type 2. Virology. 1992;186(1):280-285. doi:10.1016/0042-6822(92)90082-z Cirak S, Feng L, Anthony K,等人. Restoration of the dystrophin-associated glycoprotein complex after exon skipping therapy in Duchenne muscular dystrophy. Mol Ther. 2012;20(2):462-467. doi:10.1038/mt.2011.248 Coley WD, Bogdanik L, Vila MC,等人. Effect of genetic background on the dystrophic phenotype in mdxmice. Hum Mol Genet. 2016;25(1):130-145. doi:10.1093/hmg/ddv460 CureDuchenne: What is Duchenne? https://www.cureduchenne.org/about/what-is-duchenne/ Accessed 15 March 2020。 Datson NA, Bijl S, Janson A,等人. Using a State-of-the-Art Toolbox to Evaluate Molecular and Functional Readouts of Antisense Oligonucleotide-Induced Exon Skipping in mdxMice. Nucleic Acid Ther. 2020;30(1):50-65. doi:10.1089/nat.2019.0824 Donovan-Banfield I, Turnell AS, Hiscox JA, Leppard KN, Matthews DA. Deep splicing plasticity of the human adenovirus type 5 transcriptome drives virus evolution. Commun Biol. 2020;3(1):124. Published 2020 Mar 13. doi:10.1038/s42003-020-0849-9 Dowling P, Gargan S, Murphy S,等人. The Dystrophin Node as Integrator of Cytoskeletal Organization, Lateral Force Transmission, Fiber Stability and Cellular Signaling in Skeletal Muscle. Proteomes. 2021;9(1):9. Published 2021 Feb 2. doi:10.3390/proteomes9010009 Duan D, Goemans N, Takeda S, Mercuri E, Aartsma-Rus A. Duchenne muscular dystrophy. Nat Rev Dis Primers. 2021;7(1):13. Published 2021 Feb 18. doi:10.1038/s41572-021-00248-3 Ehmsen J, Poon E, Davies K. The dystrophin-associated protein complex. J Cell Sci. 2002;115(Pt 14):2801-2803。 Emery AEH. Duchenne Muscular Dystrophy. (1993) Oxford University Press, Oxford。 Evans NP, Misyak SA, Robertson JL, Bassaganya-Riera J, Grange RW. Immune-mediated mechanisms potentially regulate the disease time-course of duchenne muscular dystrophy and provide targets for therapeutic intervention. PM R. 2009;1(8):755-768. doi:10.1016/j.pmrj.2009.04.010 Falzarano MS, Scotton C, Passarelli C, Ferlini A. Duchenne Muscular Dystrophy: From Diagnosis to Therapy. Molecules. 2015;20(10):18168-18184. Published 2015 Oct 7. doi:10.3390/molecules201018168 Faust SM, Bell P, Cutler BJ,等人. CpG-depleted adeno-associated virus vectors evade immune detection. J Clin Invest. 2013;123(7):2994-3001. doi:10.1172/JCI68205 Ferlini A, Flanigan KM, Lochmuller H, Muntoni F, Hoen PA, McNally E. 204th ENMC International Workshop on Biomarkers in Duchenne Muscular Dystrophy 24-26 January 2014。 Forbes SC, Arora H, Willcocks RJ,等人. Upper and Lower Extremities in Duchenne Muscular Dystrophy Evaluated with Quantitative MRI and Proton MR Spectroscopy in a Multicenter Cohort. Radiology. 2020;295(3):616-625. doi:10.1148/radiol.2020192210 Gao GP, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(18):11854-11859. doi:10.1073/pnas.182412299 Grady RM, Grange RW, Lau KS,等人. Role for alpha-dystrobrevin in the pathogenesis of dystrophin-dependent muscular dystrophies. Nat Cell Biol. 1999;1(4):215-220. doi:10.1038/12034 Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol. 1977;36(1):59-74. doi:10.1099/0022-1317-36- 1-59 Granchelli JA, Pollina C, Hudecki MS. Pre-clinical screening of drugs using the mdxmouse. Neuromuscul Disord. 2000;10(4-5):235-239. doi:10.1016/s0960-8966(99)00126-1 Hathout Y, Marathi RL, Rayavarapu S,等人. Discovery of serum protein biomarkers in the mdxmouse model and cross-species comparison to Duchenne muscular dystrophy patients. Hum Mol Genet. 2014;23(24):6458-6469. doi:10.1093/hmg/ddu366 Heier CR, Guerron AD, Korotcov A,等人. Non-invasive MRI and spectroscopy of mdxmice reveal temporal changes in dystrophic muscle imaging and in energy deficits. PLoS One. 2014;9(11):e112477. Published 2014 Nov 12. doi:10.1371/journal.pone.0112477 Hoffman EP, Brown RH Jr, Kunkel LM. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 1987;51(6):919-928. doi:10.1016/0092-8674(87)90579-4 Hoffman EP, Brown RH Jr, Kunkel LM. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 1987;51(6):919-928. doi:10.1016/0092-8674(87)90579-4 Hoffman EP. Pharmacotherapy of Duchenne Muscular Dystrophy. Handb Exp Pharmacol. 2020;261:25-37. doi:10.1007/164_2019_256 Hogrel JY, Wary C, Moraux A,等人. Longitudinal functional and NMR assessment of upper limbs in Duchenne muscular dystrophy. Neurology. 2016;86(11):1022-1030. doi:10.1212/WNL.0000000000002464 Hordeaux J, Hinderer C, Goode T,等人. Toxicology Study of Intra-Cisterna Magna Adeno- Associated Virus 9 Expressing Human Alpha-L-Iduronidase in Rhesus Macaques. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018;10:79-88. Published 2018 Jul 14. doi:10.1016/j.omtm.2018.06.003 Hosaka Y, Yokota T, Miyagoe-Suzuki Y,等人. Alpha1-syntrophin-deficient skeletal muscle exhibits hypertrophy and aberrant formation of neuromuscular junctions during regeneration. J Cell Biol. 2002;158(6):1097-1107. doi:10.1083/jcb.200204076 Jiang H, Couto LB, Patarroyo-White S,等人. Effects of transient immunosuppression on adenoassociated, virus-mediated, liver-directed gene transfer in rhesus macaques and implications for human gene therapy. Blood. 2006;108(10):3321-3328. doi:10.1182/blood-2006- 04-017913 Kieny P, Chollet S, Delalande P,等人. Evolution of life expectancy of patients with Duchenne muscular dystrophy at AFM Yolaine de Kepper centre between 1981 and 2011. Ann Phys Rehabil Med. 2013;56(6):443-454. doi:10.1016/j.rehab.2013.06.002 Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ, Monaco AP, Feener C, Kunkel LM. Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell. 1987;50(3):509-517. doi:10.1016/0092-8674(87)90504-6 Koo T, Malerba A, Athanasopoulos T,等人. Delivery of AAV2/9-microdystrophin genes incorporating helix 1 of the coiled-coil motif in the C-terminal domain of dystrophin improves muscle pathology and restores the level of α1-syntrophin and α-dystrobrevin in skeletal muscles of mdxmice. Hum Gene Ther. 2011;22(11):1379-1388. doi:10.1089/hum.2011.020 Laurila E, Ahola A, Hyttinen J, Aalto-Setälä K. Methods for in vitro functional analysis of iPSC derived cardiomyocytes - Special focus on analyzing the mechanical beating behavior. Biochim Biophys Acta. 2016;1863(7 Pt B):1864-1872. doi:10.1016/j.bbamcr.2015.12.013 Le Guiner C, Servais L, Montus M,等人. Long-term microdystrophin gene therapy is effective in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 2017;8:16105. Published 2017 Jul 25. doi:10.1038/ncomms16105 Li X, Eastman EM, Schwartz RJ, Draghia-Akli R. Synthetic muscle promoters: activities exceeding naturally occurring regulatory sequences. Nat Biotechnol. 1999;17(3):241-245. doi:10.1038/6981 Lim KR, Maruyama R, Yokota T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 2017;11:533-545. Published 2017 Feb 28. doi:10.2147/DDDT.S97635 Lin B, Li Y, Han L,等人. Modeling and study of the mechanism of dilated cardiomyopathy using induced pluripotent stem cells derived from individuals with Duchenne muscular dystrophy. Dis Model Mech. 2015;8(5):457-466. doi:10.1242/dmm.019505 Mah JK, Korngut L, Dykeman J, Day L, Pringsheim T, Jette N. A systematic review and meta- analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 2014;24(6):482-491. doi:10.1016/j.nmd.2014.03.008 Manno CS, Pierce GF, Arruda VR,等人. Successful transduction of liver in hemophilia by AAV- Factor IX and limitations imposed by the host immune response [published correction appears in Nat Med. 2006 May;12(5):592. Rasko, John [corrected to Rasko, John JE]; Rustagi, Pradip K [added]]. Nat Med. 2006;12(3):342-347. doi:10.1038/nm1358 Matthews DJ, James KA, Miller LA,等人. Use of corticosteroids in a population-based cohort of boys with duchenne and becker muscular dystrophy. J Child Neurol. 2010;25(11):1319-1324. doi:10.1177/0883073810362762 Maurissen JP, Marable BR, Andrus AK, Stebbins KE. Factors affecting grip strength testing. Neurotoxicol Teratol. 2003;25(5):543-553. doi:10.1016/s0892-0362(03)00073-4 McDonald CM, Henricson EK, Abresch RT,等人. Long-term effects of glucocorticoids on function, quality of life, and survival in patients with Duchenne muscular dystrophy: a prospective cohort study. Lancet. 2018;391(10119):451-461. doi:10.1016/S0140-6736(17)32160-8 McDonald CM, Henricson EK, Abresch RT,等人. The cooperative international neuromuscular research group Duchenne natural history study--a longitudinal investigation in the era of glucocorticoid therapy: design of protocol and the methods used. Muscle Nerve. 2013;48(1):32- 54. doi:10.1002/mus.23807 Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT. A method for the routine assessment of fore- and hindlimb grip strength of rats and mice. Neurobehav Toxicol. 1979;1(3):233-236。 Moens P, Baatsen PH, Maréchal G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdxmice to damage induced by contractions with stretch. J Muscle Res Cell Motil. 1993 Aug;14(4):446-51. doi: 10.1007/BF00121296. PMID: 7693747。 Moorwood C, Liu M, Tian Z, Barton ER. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. J Vis Exp. 2013;(71):e50036. Published 2013 Jan 31. doi:10.3791/50036 Muntoni F, Domingos J, Manzur AY,等人. Categorising trajectories and individual item changes of the North Star Ambulatory Assessment in patients with Duchenne muscular dystrophy. PLoS One. 2019;14(9):e0221097. Published 2019 Sep 3. doi:10.1371/journal.pone.0221097 Nagaraju K, Willmann R; TREAT-NMD Network and the Wellstone Muscular Dystrophy Cooperative Research Network. Developing standard procedures for murine and canine efficacy studies of DMD therapeutics: report of two expert workshops on "Pre-clinical testing for Duchenne dystrophy": Washington DC, October 27th-28th 2007 and Zürich, June 30th-July 1st 2008. Neuromuscul Disord. 2009;19(7):502-506. doi:10.1016/j.nmd.2009.05.003 Ozawa E, Hagiwara Y, Yoshida M. Creatine kinase, cell membrane and Duchenne muscular dystrophy. Mol Cell Biochem. 1999;190(1-2):143-151。 Pratt SJP, Xu S, Mullins RJ, Lovering RM. Temporal changes in magnetic resonance imaging in the mdxmouse. BMC Res Notes. 2013;6:262. Published 2013 Jul 9. doi:10.1186/1756-0500-6-262 Preisig DF, Kulic L, Krüger M,等人. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 2016;311:340-353. doi:10.1016/j.bbr.2016.04.044 Rodrigues M, Echigoya Y, Fukada SI, Yokota T. Current Translational Research and Murine Models For Duchenne Muscular Dystrophy. J Neuromuscul Dis. 2016;3(1):29-48. doi:10.3233/JND-150113 Ropars J, Gravot F, Ben Salem D, Rousseau F, Brochard S, Pons C. Muscle MRI: A biomarker of disease severity in Duchenne muscular dystrophy? A systematic review. Neurology. 2020;94(3):117-133. doi:10.1212/WNL.0000000000008811 Sadoulet-Puccio HM, Rajala M, Kunkel LM. Dystrobrevin and dystrophin: an interaction through coiled-coil motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(23):12413-12418.doi:10.1073/pnas.94.23.12413 Sancar F, Touroutine D, Gao S,等人. The dystrophin-associated protein complex maintains muscle excitability by regulating Ca(2+)-dependent K(+) (BK) channel localization. J Biol Chem. 2011;286(38):33501-33510. doi:10.1074/jbc.M111.227678 Scallan CD, Jiang H, Liu T,等人. Human immunoglobulin inhibits liver transduction by AAV vectors at low AAV2 neutralizing titers in SCID mice. Blood. 2006;107(5):1810-1817. doi:10.1182/blood-2005-08-3229 Sicinski P, Geng Y, Ryder-Cook AS, Barnard EA, Darlison MG, Barnard PJ. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdxmouse: a point mutation. Science. 1989;244(4912):1578- 1580. doi:10.1126/science.2662404 Smith JP, Hicks PS, Ortiz LR, Martinez MJ, Mandler RN. Quantitative measurement of muscle strength in the mouse. J Neurosci Methods. 1995;62(1-2):15-19. doi:10.1016/0165-0270(95)00049-6 Turk R, Sterrenburg E, de Meijer EJ, van Ommen GJ, den Dunnen JT, 't Hoen PA. Muscle regeneration in dystrophin-deficient mdxmice studied by gene expression profiling. BMC Genomics. 2005;6:98. Published 2005 Jul 13. doi:10.1186/1471-2164-6-98 Uaesoontrachoon K, Srinivassane S, Warford J,等人. Orthogonal analysis of dystrophin protein and mRNA as a surrogate outcome for drug development. Biomark Med. 2019;13(14):1209- 1225. doi:10.2217/bmm-2019-0242 van Westering TLE, Lomonosova Y, Coenen-Stass AML,等人. Uniform sarcolemmal dystrophin expression is required to prevent extracellular microRNA release and improve dystrophic pathology. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2020;11(2):578-593. doi:10.1002/jcsm.12506 Vandeputte C, Taymans JM, Casteels C,等人. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neurosci. 2010;11:92. Published 2010 Aug 9. doi:10.1186/1471-2202-11-92 Wang B, Li J, Xiao X. Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdxmouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(25):13714-13719. doi:10.1073/pnas.240335297 Wokke BH, Van Den Bergen JC, Hooijmans MT, Verschuuren JJ, Niks EH, Kan HE. T2 relaxation times are increased in Skeletal muscle of DMD but not BMD patients. Muscle Nerve. 2016;53(1):38-43. doi:10.1002/mus.24679 Ropars J, Gravot F, Ben Salem D, Rousseau F, Brochard S, Pons C. Muscle MRI: A biomarker of disease severity in Duchenne muscular dystrophy? A systematic review. Neurology. 2020;94(3):117-133. doi:10.1212/WNL.0000000000008811 Sadoulet-Puccio HM, Rajala M, Kunkel LM. Dystrobrevin and dystrophin: an interaction through coiled-coil motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(23):12413-12418. doi:10.1073/pnas.94.23.12413 Sancar F, Touroutine D, Gao S,等人. The dystrophin-associated protein complex maintains muscle excitability by regulating Ca(2+)-dependent K(+) (BK) channel localization. J Biol Chem. 2011;286(38):33501-33510. doi:10.1074/jbc.M111.227678 Scallan CD, Jiang H, Liu T,等人. Human immunoglobulin inhibits liver transduction by AAV vectors at low AAV2 neutralizing titers in SCID mice. Blood. 2006;107(5):1810-1817. doi:10.1182/blood-2005-08-3229 Sicinski P, Geng Y, Ryder-Cook AS, Barnard EA, Darlison MG, Barnard PJ. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdxmouse: a point mutation. Science. 1989;244(4912):1578- 1580. doi:10.1126/science.2662404 Smith JP, Hicks PS, Ortiz LR, Martinez MJ, Mandler RN. Quantitative measurement of muscle strength in the mouse. J Neurosci Methods. 1995;62(1-2):15-19. doi:10.1016/0165-0270(95)00049-6 Turk R, Sterrenburg E, de Meijer EJ, van Ommen GJ, den Dunnen JT, 't Hoen PA. Muscle regeneration in dystrophin-deficient mdxmice studied by gene expression profiling. BMC Genomics. 2005;6:98. Published 2005 Jul 13. doi:10.1186/1471-2164-6-98 Uaesoontrachoon K, Srinivassane S, Warford J,等人. Orthogonal analysis of dystrophin protein and mRNA as a surrogate outcome for drug development. Biomark Med. 2019;13(14):1209- 1225. doi:10.2217/bmm-2019-0242 van Westering TLE, Lomonosova Y, Coenen-Stass AML,等人. Uniform sarcolemmal dystrophin expression is required to prevent extracellular microRNA release and improve dystrophic pathology. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2020;11(2):578-593. doi:10.1002/jcsm.12506 Vandeputte C, Taymans JM, Casteels C,等人. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neurosci. 2010;11:92. Published 2010 Aug 9. doi:10.1186/1471-2202-11-92 Wang B, Li J, Xiao X. Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdxmouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(25):13714-13719. doi:10.1073/pnas.240335297 Wokke BH, Van Den Bergen JC, Hooijmans MT, Verschuuren JJ, Niks EH, Kan HE. T2 relaxation times are increased in Skeletal muscle of DMD but not BMD patients. Muscle Nerve.2016;53(1):38-43. doi:10.1002/mus.24679
儘管本發明參考其特定實施例詳細描述，但應理解功能上等效之變化在本發明之範疇內。實際上，根據前述說明及隨附圖式，除本文所展示及描述之修改以外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言亦會變得顯而易見。該等修正欲在隨附申請專利範圍之範疇內。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文所描述之本發明特定實施例的許多等效物。該等等效物欲由隨附申請專利範圍所涵蓋。
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案在本文中以引用之方式併入本說明書中，程度如同各個別公開案、專利或專利申請案專門且單獨地指示為以全文引用之方式併入本文中一般。
本文中之論述提供先前技術問題之性質的較佳理解，且不應以任何方式解釋為承認先前技術，本文中任何參考文獻之引用亦不應解釋為承認此類參考文獻構成本申請案之「先前技術」。
本文中包括所引用之專利申請案及公開案之所有參考文獻均以其全文且出於所有目的以引用的方式併入本文中，在程度上與如同各個別公開案或專利或專利申請案特定地且單獨地經指示出於所有目的以全文引用的方式併入本文中相同。如熟習此項技術者顯而易見，在不背離本申請案之精神及範疇的情況下可對本發明進行多種修改及改變。本文所描述之具體實施例僅以實例方式提供，且本發明僅由所附申請專利範圍之各項以及該申請專利範圍所授權之等效物的全部範疇限制。
圖 1A-1B.展示在以下之間相互作用的肌纖維膜圖示： (A)RGX-DYS1微小肌縮蛋白(其具有含有短肌營養蛋白及α1-互生蛋白結合位點(以及β1-互生蛋白結合位點)之C端域，及 (B)野生型肌縮蛋白蛋白質及與肌動蛋白細胞骨架之肌縮蛋白-相關蛋白複合物(DAPC)。據設想，具有至少短肌營養蛋白及α1-互生蛋白結合位點之RGX-DYS1將部分募集且經由α1-互生蛋白使nNOS錨定至肌纖維膜。Syn：互生蛋白；Dbr：短肌營養蛋白；CR：富含半胱胺酸之域；nNOS：神經元氧化氮合成酶；DG：肌萎縮蛋白聚糖；H：鉸鏈；R：血影蛋白樣重複區；SG：肌聚糖。
圖 2.繪示用於產生AAV重組基因體之基因療法之順式質體中的載體基因表現盒，另外稱為微小肌縮蛋白構築體或轉殖基因。列出各組分之DNA長度及各構築體之完整轉殖基因。SPc5-12：合成肌肉特異性啟動子；CT1.5：含有CT域之140個胺基酸(SEQ ID NO: 83)的截短/最低CT域，包括α1-互生蛋白結合位點但不包括短肌營養蛋白結合位點；VH4：人類免疫球蛋白重鏈可變區內含子；ABD：肌動蛋白結合域；H：鉸鏈；R：桿狀；CR：富含半胱胺酸之域；CT：C端域；smPA：小polyA；ABD：肌動蛋白結合域1 (ABD1)。
圖 3A-3D：針對自AAV-微小肌縮蛋白載體注射之腓肚肌組織中提取的肌縮蛋白之西方墨點法。色帶1至4 =來自AAV8-RGX-DYS1-注射 mdx小鼠之蛋白質樣品，色帶5至8 =來自AAV8-RGX-DYS5注射 mdx小鼠之蛋白質樣品及色帶9至12 =來自AAV8-RGX-DYS3注射 mdx小鼠之蛋白質樣品。α1-肌動蛋白充當各色帶之內參考物。 Mdx(色帶13)指示未注射 mdx小鼠。對於肌縮蛋白墨點，使用小鼠抗肌縮蛋白單株抗體(1:100稀釋)。對於抗-α1-肌動蛋白墨點，以1:10,000之稀釋因子使用多株抗體，且以1:20,000使用二級(抗兔)抗體。在蛋白質樣品之西方墨點分析上之微小肌縮蛋白條帶的定量( B)，藉由ddPCR之腓肚肌中之AAV-µ-Dys載體複本數( C)及藉由AAV-µ-Dys載體複本數標準化之微小肌縮蛋白蛋白質條帶的定量( D)。* p＜ 0.05；** P ＜ 0.01；***P＜0001。
圖 4A-4B：骨骼肌(腓肚肌)中之微小肌縮蛋白及野生型(WT)肌縮蛋白之mRNA表現。自骨骼肌中提取總RNA且合成cDNA。使用數位PCR (Naica Crystal Digital PCR系統，Stilla technologies)來量測微小肌縮蛋白、WT-肌縮蛋白及內源性對照甘油醛3-磷酸鹽去氫酶(GAPDH) mRNA之複本數。 A.相對微小或WT-肌縮蛋白mRNA表現藉由GAPDH標準化。B6-WT骨胳肌肉中之WT-肌縮蛋白與GAPDH之比率被視為1。 B.單細胞中之相對微小肌縮蛋白或野生型肌縮蛋白mRNA表現。藉由GAPDH標準化微小肌縮蛋白或野生型肌縮蛋白mRNA表現複本數及基因體複本數/細胞。
圖 5A-5D：骨骼肌中之α-互生蛋白表現。自 mdx小鼠中提取腓肚肌且小鼠如所描述處理：Bl6 (未處理野生型小鼠)；RGX-DYS1 (小鼠ID 3553及小鼠ID 3588)；RGX-DYS3 (小鼠ID 5及小鼠ID 7)及RGX-DYS5 (小鼠ID 9及小鼠ID 11)。 A.針對來自肌肉組織溶解物之互生蛋白的西方墨點法。 B.西方墨點帶之定量。*，p＜ 0.05；***，p ＜ 0.0001。 C.針對來自總肌肉膜蛋白之互生蛋白的西方墨點法。 D.西方墨點帶之定量。
圖 6A-6C：骨骼肌中之nNOS表現。 A.針對nNOS之免疫螢光染色。 B.針對nNOS之西方墨點法。 C.西方墨點帶之定量。
圖 7A-7C：衛星細胞之轉導及藉由編碼微小肌縮蛋白基因之AAV載體改善細胞再生。A.  AAV-DMD轉導之衛星細胞的百分比。B.  RNAscope®影像中之總衛星細胞計數。C.來自不同組之骨骼肌中之Pax7 mRNA表現藉由ddPCR揭露。針對微小肌縮蛋白之引子及探針與先前所描述相同。B6-WT骨胳肌肉中之pax7與GAPDH之比率被視為1。**，p＜ 0.01；***，p ＜ 0.001；****，p＜0.0001，與未處理 mdx小鼠相比。
圖 8A-8F展示NHP中AAV8及AAV9之生物分佈及轉殖基因表現的比較。將具有獨特條碼的CAG-GFP盒個別地產生AAV8及AAV9且與其他衣殼以約相等的濃度彙集在一起，以產生118個帶條碼的AAV庫。將此庫(PAVE118)以1.77e13 GC/kg之劑量靜脈內給藥三個食蟹獼猴。對在給藥後3週自各種NHP組織分離之DNA及RNA進行相對豐度之下一代序列(NGS)分析。來自非人類靈長類動物之骨胳肌肉(分別為 A 及 B)、心肌(分別為 C 及 D)及肝臟(分別為 E 及 F)中之AAV8及AAV9衣殼的DNA及RNA含量之間無顯著差異。
圖 9A-9D：EDL肌肉之握力及體外壓力。AAV8-RGX-DYS1給藥改善 mdx小鼠中之肌肉功能。(A及B)量測第5週時之握力。( A)最大力及( B)由各小鼠之體重計算的標準化前肢值。( C及 D).在第6週時進行EDL肌肉之體外力。EDL肌肉之( C)絕對前肢及( D)比力，其藉由標準化由肌肉之橫截面積產生之最大力來進行。野生型(WT)資料來自測試設備中之年齡匹配的HCD。*** p＜0.001相對於野生型HCD資料；*** p＜0.001相對於媒劑對照 mdx；使用斯圖登氏t檢驗。資料以平均值±SEM呈現。
圖 10A-10K： mdx媒劑對照小鼠及給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠之肌肉病理學。AAV8-RGX-DYS1給藥減輕 mdx小鼠中之骨胳肌肉炎症、退化症及再生。( A-C)基於H&E染色評定炎症。黃色虛線表示組織內之發炎病灶區域。量測TA (B)及隔膜( C)中之炎症百分比。( D-F)藉由抗eMHC染色(再生標記物)檢測TA及隔膜中之再生纖維；紅色虛線表示退化區域之面積。在TA ( E)及隔膜( F)上對陽性纖維進行計數且以mm 2(纖維/mm 2)相對於該部分之總面積標準化。( G-I)藉由抗IgM染色檢測TA及隔膜中之退化纖維；紅色虛線表示退化區域之面積。在TA ( H)及隔膜( I)上對陽性纖維進行計數且以mm 2(纖維/mm 2)相對於該部分之總面積標準化。( J 及 K)在TA ( J)及隔膜( K)組織切片之五個隨機的區域上進行中央成核百分比(%)。在各區域中，對中央成核纖維及總纖維進行計數且計算一定百分比之中央成核纖維(CNF)。TA及隔膜在20X下具有縮放區域之所有代表性影像(條=200µm)。自測試設施組織庫染色TA肌肉(n=3)之年齡匹配的BL10野生型對照。對於隔膜，使用年齡匹配的BL10野生型HCD。*** p＜0.001相對於野生型HCD資料；* p＜0.05，*** p＜0.001相對於媒劑對照 mdx；使用斯圖登氏t檢驗。資料以平均值±SEM呈現。
圖 11A-11B：以2×10 14GC/kg之劑量 mdx小鼠中之RGX-DYS1載體DNA生物分佈。藉由ddPCR分析自給藥AAV8-RGX-DYS1組(n=12)中收集之組織及自媒劑對照組(n =11)中之肝臟。自給藥AAV8-RGX-DYS1組中收集之所有組織比估計之定量下限(LLOQ) (約0.08 GC/dg)高2-4 log且來自媒劑對照組之肝臟樣品約在LLOQ下。載體基因體複本資料呈現於GC/dg ( A)及GC/µg DNA ( B)中。EDL：伸趾長肌肌肉；TA：脛骨前肌。資料以平均值±SEM呈現。
圖 12：如藉由西方墨點法所量測，來自給藥RGX-DYS1 mdx小鼠之隔膜、腓肚肌及TA肌肉中之RGX-DYS1微小肌縮蛋白含量。條形圖展示平均百分比肌縮蛋白+ S.D.，其基於由BL10野生型小鼠與德國短毛指示犬肌肉萎縮症(GSHPMD)犬肌肉溶解物之混合物製成的標準曲線，n = 10/組織。
圖 13A-13C ：藉由免疫螢光之RGX-DYS1微小肌縮蛋白轉殖基因表現。 A.在媒劑或AAV8-RGX-DYS1給藥之後6週在TA及隔膜中進行微小肌縮蛋白/肌縮蛋白之免疫螢光。AAV8-RGX-DYS1給藥分別產生位於TA ( B)及隔膜( C)中具有微小肌縮蛋白之膜的96 %纖維及89.1%纖維。TA及隔膜在20X下具有縮放區域之所有代表性影像(條=200µm)。自測試設施組織庫染色TA肌肉(n=3)之年齡匹配的BL10野生型對照。對於隔膜，使用來自測試設備之年齡匹配的BL10野生型HCD。*** p＜0.001相對於野生型；* p＜0.05，*** p＜0.001相對於媒劑對照 mdx；使用斯圖登氏t檢驗。資料以平均值±SEM呈現。
圖 14 ：藉由免疫螢光之肌縮蛋白相關蛋白複合物(DAPC)。DAPC蛋白質：在TA組織中藉由免疫螢光量測具有肌縮蛋白之α1-互生蛋白、短肌營養蛋白、nNOS-1及ß-肌萎縮蛋白聚糖。AAV8-RGX-DYS1給藥恢復用RGX-DYS1微小肌縮蛋白-陽性纖維定位之互生蛋白及短肌營養蛋白表現；ß-肌萎縮蛋白聚糖表現部分恢復。nNOS表現可在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中偵測到且高於媒劑對照 mdx小鼠，但不如野生型穩定。TA在20X下具有縮放區域之所有代表性影像(條=100µm)。在各組中，星形指示相同纖維。自測試設施組織庫染色TA肌肉(n=5)之年齡匹配的BL10野生型對照。
圖 15 ：來自精細運動步態分析之步態總分數。在向 mdx小鼠AAV8-RGX-DYS1給藥(n=8-10/組)之後6週及12週進行自動化步態分析。在整體步態評分中，在給藥後6週觀測到明顯 mdx小鼠模型作用，且在給藥後12週觀測到甚至更大。在第12週，整體步態評分在以1×10 14、3×10 14及5×1014 GC/kg之劑量給藥AAV8-RGX-DYS1的mdx小鼠中顯著改善。資料以平均值±SEM呈現。統計顯著性：* p ＜ 0.05，*** p ＜ 0.001，相對於野生型媒劑(RM二因子變異數分析(ANOVA)，Sidak事後分析)；* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，相對於 mdx媒劑(混合效應模型ANOVA，鄧奈特事後分析)。
圖 16A-16E ：T2-磁共振成像.在向 mdx小鼠(n=8-10/組)給藥媒劑或AAV8-RGX-DYS1之後6及12週進行T2稱重之MRI。(A)呈現代表性影像。高強度病變由黃色箭頭(6週)及紅色箭頭(12週)指示。量測(B)腓肚肌體積(mm3) (C)腓肚肌高訊號百分比(%)，在腓肚肌病變及非病變(E)中使用自動化閥值分析(D) T2-鬆弛時間(毫秒，ms)量測獲得。所有資料均獲自組合之兩側。資料以平均值±SEM呈現。統計顯著性：* p ＜ 0.05，*** p ＜ 0.001，相對於野生型媒劑(RM二因子變異數分析，Sidak事後分析)；** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001，**** p ＜ 0.0001，相對於 mdx媒劑(混合效應模型ANOVA，鄧奈特事後分析)。
圖 17：在第6週、第9週及第12週時之握力(相對於體重標準化)。在以指定劑量給藥媒劑或AAV8-RGX-DYS1給藥(n=8-10/組)之後6、9及12週進行握力。在給藥後6及9週未觀測到明顯 mdx小鼠模型效應。給藥後12週，注意到野生型與 mdx小鼠之間的差異，但無統計顯著性。在第12週，當相比於媒劑對照 mdx小鼠時，以3×10 14及5×10 14GC/kg之劑量給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中的握力顯著提高。資料以平均值±SEM呈現。統計顯著性：* p ＜ 0.05，*** p ＜ 0.001相對於 mdx媒劑對照(混合效應模型ANOVA，鄧奈特事後分析)。
圖 18 ：在第7週及第12週時之肌酸激酶濃度。在向 mdx小鼠(n=8-10/組)給藥媒劑或AAV8-RGX-DYS1之後7及12週進行血清之CK分析。資料以平均值±SEM呈現。統計顯著性**** p ＜ 0.0001，相對於野生型(RM二因子變異數分析，Sidak事後分析)；* p ＜ 0.05，**** p ＜ 0.0001相對於 mdx媒劑對照(混合效應模型ANOVA，鄧奈特事後分析)。
圖 19 ：BL10野生型及 mdx小鼠之肝臟及肌肉組織中之載體DNA生物分佈(給藥媒劑或AAV8-RGX-DYS1)。條形圖顯示平均值+ S.D.，其中每組n=5/組織。自BL10野生型小鼠及 mdx媒劑對照小鼠中收集之組織展現出在低於定量極限(BQL = 50個複本/µg DNA)或偵測極限(LOD = 11.96個複本/µg DNA)下之載體DNA含量。
圖 20A-20B ：腓肚肌、隔膜及心臟中之RGX-DYS1微小肌縮蛋白/肌縮蛋白蛋白質表現。( A).條形圖展示平均肌縮蛋白百分比+ S.E，其基於由BL10小鼠與GSHPMD犬肌肉溶解物之混合物製成的標準曲線。BL10野生型(n = 10)； mdx媒劑對照(n = 9)；AAV8-RGX-DYS1 mdx(n = 8 - 10/劑量組)。**** p＜0.0001相對於野生型；* p＜0.05，**** p＜0.0001，相對於媒劑對照mdx小鼠( B)該隔膜中之RGX-DYS1微小肌縮蛋白/肌縮蛋白蛋白質的代表性西方墨點法。固體盒：野生型肌縮蛋白之預期分子位置；虛線框：進行血清之RGX-DYS1微小肌縮蛋白影像分析的預期分子位置。
圖 21展示來自用不同濃度之RGX-DYS1處理之26週研究之小鼠的體重。
圖 22展示T2-磁共振成像。展示來自用不同濃度之RGX-DYS1處理的26週研究之第17週之小鼠MRI的代表性影像。
圖 23展示T2-磁共振成像。展示來自用不同濃度之RGX-DYS1處理的26週研究之第26週之小鼠MRI的代表性影像。
圖 24A-24B展示腓肚肌( A)體積及( B)病變之MRI結果。資料以平均值±SEM呈現。統計顯著性：**** p ＜ 0.0001，相對於野生型媒劑(重複量測(RM)雙向變異數分析(ANOVA)，Sidak事後分析)；* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001，**** p ＜ 0.0001，相對於 mdx媒劑(混合效應模型ANOVA，鄧奈特事後分析)。
圖 25A-25B展示( A) T2時間-病變(%)及( B) T2時間非病變(%)之MRI結果。資料以平均值±SEM呈現。統計顯著性：** p ＜ 0.01，**** p ＜ 0.0001，相對於野生型媒劑(重複量測(RM)雙向變異數分析(ANOVA)，Sidak事後分析)；* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001，**** p ＜ 0.0001，相對於 mdx媒劑(混合效應模型ANOVA，鄧奈特事後分析)。
圖 26提供在向 mdx小鼠給藥AAV8-RGX-DYS1之後6週、17週及26週時之步態總分數。在整體步態評分中，在所有時間點觀測到明顯 mdx小鼠模型效應。資料以平均值±SEM呈現。統計顯著性：* p ＜ 0.05，*** p ＜ 0.001，相對於野生型媒劑(重複量測(RM)雙向變異數分析(ANOVA)，Sidak事後分析)；* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，相對於 mdx媒劑(混合效應模型ANOVA，鄧奈特事後分析)。
圖 27展示在對照小鼠或經不同濃度之RGX- DYS1處理之小鼠中12週、18週及27週時之肌酸激酶濃度的實例。資料以平均值±SEM呈現。統計顯著性：**** p ＜ 0.0001，相對於野生型媒劑(重複量測(RM)雙向變異數分析(ANOVA)，Sidak事後分析)；*** p ＜ 0.001，**** p ＜ 0.0001，相對於 mdx媒劑(混合效應模型ANOVA，鄧奈特事後分析)。
圖 28展示關於在9週、17週及26週時針對處理組中之體重標準化之握力的例示性資料。
圖 29A-29F展示給藥RGX- DYS1之 mdx小鼠中之纖維化及炎症。( A)呈現該隔膜之代表性梅森氏三色染色法及其定量( C)。另外，在隔膜及心臟中量測纖維化( C及 D)。在該隔膜( B)及其定量( E)中發炎細胞之代表性H&E影像。亦在腓肚肌( F)中評估發炎細胞之數目。資料呈現為倍數變化(相對於野生型)。使用4-5隻動物/組。* p ＜ 0.05，相對於野生型；* p ＜ 0.05，相對於 mdx媒劑對照。
圖 30展示BL10野生型及 mdx小鼠之肝臟及肌肉組織中之載體DNA生物分佈(給藥媒劑或RGX- DYS1)。條形圖顯示平均值+ SD，其中每組n=5/組織。自野生型小鼠及 mdx媒劑對照小鼠中收集之組織展示在低於定量含量(BQL)=50個複本或LOD=11.96個複本下之載體DNA含量。在平均值計算中，假定所有載體DNA含量＜定量限制(LOQ) (50個複本)為零。
圖 31展示在給藥AAV8-RGX-DYS1之 mdx小鼠中之腓肚肌、隔膜及心臟中之RGX- DYS1微小肌縮蛋白/肌縮蛋白蛋白質表現。條形圖展示平均百分比肌縮蛋白+SEM，其基於由野生型小鼠與德國短毛指示犬肌肉萎縮症(GSHPMD)犬肌肉溶解物之混合物製成的標準曲線，n = 7 - 10/組。為了比較給藥RGX-DYS1 mdx與媒劑 mdx組，克拉斯卡-瓦立斯測試鄧恩事後分析多重比較測試用於腓肚肌，及單向ANOVA接著用於多重比較之鄧尼特事後分析調節用於隔膜及心臟。在a p ＜ 0.002及b p ＜ 0.001 (給藥AAV8-RGX-DYS1 mdx相對於媒劑對照 mdx小鼠)下發現統計顯著性。
圖 32A-32C展示藉由免疫螢光之RGX- DYS1微小肌縮蛋白表現。( A)在媒劑或RGX- DYS1給藥之後26週在隔膜組織中進行具有分區蛋白(Merosin)(肌纖維標記物)之微小肌縮蛋白/肌縮蛋白之免疫螢光。量測肌縮蛋白/微小肌縮蛋白纖維之百分比( B)及在肌纖維膜處之肌縮蛋白/微小肌縮蛋白強度( C)。在20X下具有縮放區域之所有代表性影像(條=200µm)。*** p＜0.001，* *** p＜0.0001相對於野生型；** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001，相對於媒劑對照 mdx。資料係以平均值±SD呈現。
圖 33A-33B展示AAV8-RGX-DYS1給藥顯著增加比力且改善該隔膜肌肉抵抗損傷之能力。( A)藉由使由肌肉產生之最大B力相對於其橫截面積標準化來計算該隔膜肌肉之比力(N/cm2)。圖中之粉紅圓圈及箭頭表示預期強度值內之離群值。( B)使自野生型或 mdx小鼠中分離之隔膜肌肉經受5次偏心收縮(ecc)，且在各收縮時量測之力表示為在第一收縮期間產生之力的百分比。資料呈現為平均值± SD。**** p ＜ 0.0001，相對於野生型；* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，*** p ＜ 0.001，**** p ＜ 0.0001，相對於 mdx媒劑對照。
圖 34A-34B展示AAV8-RGX- DYS1給藥增加比力且改善該EDL肌肉抵抗損傷之能力。( A)藉由使由肌肉產生之最大力相對於其橫截面積標準化來計算該隔膜肌肉之比力(N/cm2)。( B)使自野生型或mdx小鼠中分離之EDL肌肉經受5次偏心收縮(ecc)，且在各收縮時量測之力表示為在第一收縮期間產生之力的百分比。資料呈現為平均值± SD。* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，相對於野生型；* p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01，相對於 mdx媒劑對照。
圖 35A-35B展示在給藥RGX-DYS1之 mdx小鼠中觀測到炎症顯著降低。對隔膜( A)及TA ( B)之完整切片中之發炎細胞數目進行計數且呈現為倍數變化(相對於野生型)。使用野生型及媒劑對照 mdx小鼠(n = 4-5/劑量組)及給藥RGX- DYS1之 mdx小鼠(n = 4-5/劑量組)。統計顯著性：* p ＜ 0.05，相對於野生型；* p ＜ 0.05，相對於 mdx媒劑對照。
圖 36展示自野生型及 mdx小鼠中收集之隔膜、腓肚肌及心臟肌肉中第6週時RGX-DYS1微小肌縮蛋白蛋白質表現。藉由基於毛細管之西方免疫分析量測組織中之蛋白質含量。條形圖展示微小肌縮蛋白平均百分比±SEM。野生型小鼠(n = 3)及媒劑對照 mdx小鼠(n = 5)並未展現出任何可定量RGX- DYS1微小肌縮蛋白蛋白質含量，且所有低於定量含量(BLQ)值(＜定量含量(LOQ )為5 ng/mg蛋白質)在平均值計算中視為零；給藥RGX- DYS1之 mdx小鼠(n = 4-5/劑量組)。
圖 37A-37C繪示RGX-DYS1 (μDys-CT194)與RGX-DYS3 (μDys-CT48)相比之微小肌縮蛋白穩定性，經藉由根據活細胞螢光脈衝追蹤成像( A)、蛋白質凝膠螢光( B)及環己醯亞胺追蹤( C)方法之半衰期確定所量測。 

          <![CDATA[<110>  美商銳進科斯生物股份有限公司(REGENXBIO Inc.)]]>
          <![CDATA[<120>  用於治療肌縮蛋白症(DYSTROPHINOPATHY)之微小肌縮蛋白基因療法給藥 ]]>
          <![CDATA[<130>  38013.0022P1]]>
          <![CDATA[<150>  63/319363]]>
          <![CDATA[<151>  2022-03-13]]>
          <![CDATA[<150>  63/314436]]>
          <![CDATA[<151>  2022-02-27]]>
          <![CDATA[<150>  63/245909]]>
          <![CDATA[<151>  2021-09-19]]>
          <![CDATA[<150>  63/180064]]>
          <![CDATA[<151>  2021-04-26]]>
          <![CDATA[<160>  94    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  1337]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys1]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val 
          1               5                   10                  15      
          Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe 
                      20                  25                  30          
          Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp 
                      100                 105                 110         
          Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met 
                  115                 120                 125             
          Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His 
                          165                 170                 175     
          Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala 
                      180                 185                 190         
          Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly 
                  195                 200                 205             
          Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg 
                          245                 250                 255     
          Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met 
                      260                 265                 270         
          His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg 
                  275                 280                 285             
          Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala 
              290                 295                 300                 
          Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln 
          305                 310                 315                 320 
          His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu 
                          325                 330                 335     
          Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu 
                      340                 345                 350         
          Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile 
                  355                 360                 365             
          Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly 
              370                 375                 380                 
          Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu 
                          405                 410                 415     
          Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu 
                      420                 425                 430         
          Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val 
                  435                 440                 445             
          Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu 
              450                 455                 460                 
          Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu 
                          485                 490                 495     
          Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His 
                      500                 505                 510         
          Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala 
                  515                 520                 525             
          Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys 
              530                 535                 540                 
          Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys 
          545                 550                 555                 560 
          Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser 
                          565                 570                 575     
          Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp 
                      580                 585                 590         
          Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala 
                  595                 600                 605             
          Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys 
              610                 615                 620                 
          Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln 
                          645                 650                 655     
          Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Gln Pro Asp Leu Ala 
                      660                 665                 670         
          Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr Leu 
                  675                 680                 685             
          Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu Glu 
              690                 695                 700                 
          Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Thr Leu Glu Arg Leu Gln 
          705                 710                 715                 720 
          Glu Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala 
                          725                 730                 735     
          Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp 
                      740                 745                 750         
          Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile 
                  755                 760                 765             
          Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln 
              770                 775                 780                 
          Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu 
          785                 790                 795                 800 
          Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp 
                          805                 810                 815     
          Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser 
                      820                 825                 830         
          Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile 
                  835                 840                 845             
          Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr Gln Thr Thr 
              850                 855                 860                 
          Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp 
          865                 870                 875                 880 
          Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg 
                          885                 890                 895     
          Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ser Ala Ala 
                      900                 905                 910         
          Cys Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met 
                  915                 920                 925             
          Asp Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu 
              930                 935                 940                 
          Glu Gln Glu His Asn Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met 
          945                 950                 955                 960 
          Cys Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Arg 
                          965                 970                 975     
          Ile Arg Val Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala 
                      980                 985                 990         
          His Leu Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr  Leu Phe Lys Gln Val  Ala Ser Ser 
                  995                 1000                 1005             
          Thr Gly  Phe Cys Asp Gln Arg  Arg Leu Gly Leu Leu  Leu His Asp 
              1010                 1015                 1020             
          Ser Ile  Gln Ile Pro Arg Gln  Leu Gly Glu Val Ala  Ser Phe Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Gly Ser  Asn Ile Glu Pro Ser  Val Arg Ser Cys Phe  Gln Phe Ala 
              1040                 1045                 1050             
          Asn Asn  Lys Pro Glu Ile Glu  Ala Ala Leu Phe Leu  Asp Trp Met 
              1055                 1060                 1065             
          Arg Leu  Glu Pro Gln Ser Met  Val Trp Leu Pro Val  Leu His Arg 
              1070                 1075                 1080             
          Val Ala  Ala Ala Glu Thr Ala  Lys His Gln Ala Lys  Cys Asn Ile 
              1085                 1090                 1095             
          Cys Lys  Glu Cys Pro Ile Ile  Gly Phe Arg Tyr Arg  Ser Leu Lys 
              1100                 1105                 1110             
          His Phe  Asn Tyr Asp Ile Cys  Gln Ser Cys Phe Phe  Ser Gly Arg 
              1115                 1120                 1125             
          Val Ala  Lys Gly His Lys Met  His Tyr Pro Met Val  Glu Tyr Cys 
              1130                 1135                 1140             
          Thr Pro  Thr Thr Ser Gly Glu  Asp Val Arg Asp Phe  Ala Lys Val 
              1145                 1150                 1155             
          Leu Lys  Asn Lys Phe Arg Thr  Lys Arg Tyr Phe Ala  Lys His Pro 
              1160                 1165                 1170             
          Arg Met  Gly Tyr Leu Pro Val  Gln Thr Val Leu Glu  Gly Asp Asn 
              1175                 1180                 1185             
          Met Glu  Thr Pro Val Thr Leu  Ile Asn Phe Trp Pro  Val Asp Ser 
              1190                 1195                 1200             
          Ala Pro  Ala Ser Ser Pro Gln  Leu Ser His Asp Asp  Thr His Ser 
              1205                 1210                 1215             
          Arg Ile  Glu His Tyr Ala Ser  Arg Leu Ala Glu Met  Glu Asn Ser 
              1220                 1225                 1230             
          Asn Gly  Ser Tyr Leu Asn Asp  Ser Ile Ser Pro Asn  Glu Ser Ile 
              1235                 1240                 1245             
          Asp Asp  Glu His Leu Leu Ile  Gln His Tyr Cys Gln  Ser Leu Asn 
              1250                 1255                 1260             
          Gln Asp  Ser Pro Leu Ser Gln  Pro Arg Ser Pro Ala  Gln Ile Leu 
              1265                 1270                 1275             
          Ile Ser  Leu Glu Ser Glu Glu  Arg Gly Glu Leu Glu  Arg Ile Leu 
              1280                 1285                 1290             
          Ala Asp  Leu Glu Glu Glu Asn  Arg Asn Leu Gln Ala  Glu Tyr Asp 
              1295                 1300                 1305             
          Arg Leu  Lys Gln Gln His Glu  His Lys Gly Leu Ser  Pro Leu Pro 
              1310                 1315                 1320             
          Ser Pro  Pro Glu Met Met Pro  Thr Ser Pro Gln Ser  Pro Arg 
              1325                 1330                 1335         
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  1191]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys3]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val 
          1               5                   10                  15      
          Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe 
                      20                  25                  30          
          Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp 
                      100                 105                 110         
          Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met 
                  115                 120                 125             
          Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His 
                          165                 170                 175     
          Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala 
                      180                 185                 190         
          Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly 
                  195                 200                 205             
          Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg 
                          245                 250                 255     
          Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met 
                      260                 265                 270         
          His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg 
                  275                 280                 285             
          Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala 
              290                 295                 300                 
          Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln 
          305                 310                 315                 320 
          His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu 
                          325                 330                 335     
          Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu 
                      340                 345                 350         
          Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile 
                  355                 360                 365             
          Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly 
              370                 375                 380                 
          Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu 
                          405                 410                 415     
          Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu 
                      420                 425                 430         
          Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val 
                  435                 440                 445             
          Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu 
              450                 455                 460                 
          Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu 
                          485                 490                 495     
          Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His 
                      500                 505                 510         
          Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala 
                  515                 520                 525             
          Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys 
              530                 535                 540                 
          Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys 
          545                 550                 555                 560 
          Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser 
                          565                 570                 575     
          Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp 
                      580                 585                 590         
          Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala 
                  595                 600                 605             
          Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys 
              610                 615                 620                 
          Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln 
                          645                 650                 655     
          Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Gln Pro Asp Leu Ala 
                      660                 665                 670         
          Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr Leu 
                  675                 680                 685             
          Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu Glu 
              690                 695                 700                 
          Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Thr Leu Glu Arg Leu Gln 
          705                 710                 715                 720 
          Glu Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala 
                          725                 730                 735     
          Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp 
                      740                 745                 750         
          Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile 
                  755                 760                 765             
          Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln 
              770                 775                 780                 
          Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu 
          785                 790                 795                 800 
          Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp 
                          805                 810                 815     
          Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser 
                      820                 825                 830         
          Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile 
                  835                 840                 845             
          Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr Gln Thr Thr 
              850                 855                 860                 
          Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp 
          865                 870                 875                 880 
          Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg 
                          885                 890                 895     
          Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ser Ala Ala 
                      900                 905                 910         
          Cys Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met 
                  915                 920                 925             
          Asp Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu 
              930                 935                 940                 
          Glu Gln Glu His Asn Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met 
          945                 950                 955                 960 
          Cys Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Arg 
                          965                 970                 975     
          Ile Arg Val Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala 
                      980                 985                 990         
          His Leu Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr  Leu Phe Lys Gln Val  Ala Ser Ser 
                  995                 1000                 1005             
          Thr Gly  Phe Cys Asp Gln Arg  Arg Leu Gly Leu Leu  Leu His Asp 
              1010                 1015                 1020             
          Ser Ile  Gln Ile Pro Arg Gln  Leu Gly Glu Val Ala  Ser Phe Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Gly Ser  Asn Ile Glu Pro Ser  Val Arg Ser Cys Phe  Gln Phe Ala 
              1040                 1045                 1050             
          Asn Asn  Lys Pro Glu Ile Glu  Ala Ala Leu Phe Leu  Asp Trp Met 
              1055                 1060                 1065             
          Arg Leu  Glu Pro Gln Ser Met  Val Trp Leu Pro Val  Leu His Arg 
              1070                 1075                 1080             
          Val Ala  Ala Ala Glu Thr Ala  Lys His Gln Ala Lys  Cys Asn Ile 
              1085                 1090                 1095             
          Cys Lys  Glu Cys Pro Ile Ile  Gly Phe Arg Tyr Arg  Ser Leu Lys 
              1100                 1105                 1110             
          His Phe  Asn Tyr Asp Ile Cys  Gln Ser Cys Phe Phe  Ser Gly Arg 
              1115                 1120                 1125             
          Val Ala  Lys Gly His Lys Met  His Tyr Pro Met Val  Glu Tyr Cys 
              1130                 1135                 1140             
          Thr Pro  Thr Thr Ser Gly Glu  Asp Val Arg Asp Phe  Ala Lys Val 
              1145                 1150                 1155             
          Leu Lys  Asn Lys Phe Arg Thr  Lys Arg Tyr Phe Ala  Lys His Pro 
              1160                 1165                 1170             
          Arg Met  Gly Tyr Leu Pro Val  Gln Thr Val Leu Glu  Gly Asp Asn 
              1175                 1180                 1185             
          Met Glu  Thr 
              1190     
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  240]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築]]>體；微小肌縮蛋白片段
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val 
          1               5                   10                  15      
          Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe 
                      20                  25                  30          
          Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp 
                      100                 105                 110         
          Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met 
                  115                 120                 125             
          Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His 
                          165                 170                 175     
          Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala 
                      180                 185                 190         
          Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly 
                  195                 200                 205             
          Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro 
          225                 230                 235                 240 
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  75]]>
          <![CDATA[<212>  PR]]>T
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Met Leu Pro Arg Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu 
          1               5                   10                  15      
          His His Gln Met His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln 
                      20                  25                  30          
          Gly Tyr Glu Arg Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala 
                  35                  40                  45              
          Tyr Thr Gln Ala Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro 
              50                  55                  60                  
          Phe Pro Ser Gln His Leu Glu Ala Pro Glu Asp 
          65                  70                  75  
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly 
                  35                  40                  45              
          Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu 
              50                  55                  60                  
          Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu 
                          85                  90                  95      
          Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  109]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Val Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp 
          1               5                   10                  15      
          Leu Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu 
                      20                  25                  30          
          Gly Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val 
                  35                  40                  45              
          Leu Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr 
              50                  55                  60                  
          His Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile 
                          85                  90                  95      
          Cys Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp 
                      100                 105                 
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  2]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Ile Leu 
          1       
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  109]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Leu Lys Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ser Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe 
                      20                  25                  30          
          Lys Asp Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu 
                  35                  40                  45              
          Lys Ala Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Lys Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Thr Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln 
                      100                 105                 
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  47]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Gln Pro Asp Leu Ala Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr 
          1               5                   10                  15      
          Gln Thr Val Thr Leu Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Lys Leu Glu Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro 
                  35                  40                  45          
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  3]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Thr Leu Glu 
          1           
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  106]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Arg Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu 
                      20                  25                  30          
          Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu 
              50                  55                  60                  
          Ala Arg Gln Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Leu Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val Ala 
                          85                  90                  95      
          Val Glu Asp Arg Val Arg Gln Leu His Glu 
                      100                 105     
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  72]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile Asn His Glu Thr Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro Lys Met 
                  35                  40                  45              
          Thr Glu Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Ala Tyr Arg Thr Ala Met Lys Leu 
          65                  70          
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  248]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ser Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro 
                      20                  25                  30          
          Met Asp Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg 
                  35                  40                  45              
          Leu Glu Gln Glu His Asn Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp 
              50                  55                  60                  
          Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Ile Arg Val Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys 
                          85                  90                  95      
          Ala His Leu Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Gln Val Ala Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Thr Gly Phe Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu Leu Leu His Asp 
                  115                 120                 125             
          Ser Ile Gln Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val Ala Ser Phe Gly Gly 
              130                 135                 140                 
          Ser Asn Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu 
                          165                 170                 175     
          Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val Ala Ala Ala 
                      180                 185                 190         
          Glu Thr Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu Cys Pro 
                  195                 200                 205             
          Ile Ile Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His Phe Asn Tyr Asp Ile 
              210                 215                 220                 
          Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys Gly His Lys Met 
          225                 230                 235                 240 
          His Tyr Pro Met Val Glu Tyr Cys 
                          245             
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  194]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Thr Pro Thr Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Asn Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg Met 
                      20                  25                  30          
          Gly Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr 
                  35                  40                  45              
          Pro Val Thr Leu Ile Asn Phe Trp Pro Val Asp Ser Ala Pro Ala Ser 
              50                  55                  60                  
          Ser Pro Gln Leu Ser His Asp Asp Thr His Ser Arg Ile Glu His Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Ser Arg Leu Ala Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Asn 
                          85                  90                  95      
          Asp Ser Ile Ser Pro Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu His Leu Leu Ile 
                      100                 105                 110         
          Gln His Tyr Cys Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser Pro Leu Ser Gln Pro 
                  115                 120                 125             
          Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu Glu Ser Glu Glu Arg Gly 
              130                 135                 140                 
          Glu Leu Glu Arg Ile Leu Ala Asp Leu Glu Glu Glu Asn Arg Asn Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys Gln Gln His Glu His Lys Gly Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Pro Leu Pro Ser Pro Pro Glu Met Met Pro Thr Ser Pro Gln Ser 
                      180                 185                 190         
          Pro Arg 
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Glu Thr Leu Glu 
          1               
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  2]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Leu Glu 
          1       
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          agtgtg                                                                   6
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  4017]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys1]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          atgctttggt gggaagaggt ggaagattgc tatgagaggg aagatgtgca gaagaaaacc       60
          ttcaccaaat gggtcaatgc ccagttcagc aagtttggca agcagcacat tgagaacctg      120
          ttcagtgacc tgcaggatgg cagaaggctg ctggatctgc tggaaggcct gacaggccag      180
          aagctgccta aagagaaggg cagcacaaga gtgcatgccc tgaacaatgt gaacaaggcc      240
          ctgagagtgc tgcagaacaa caatgtggac ctggtcaata ttggcagcac agacattgtg      300
          gatggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaaca tcatcctgca ctggcaagtg      360
          aagaatgtga tgaagaacat catggctggc ctgcagcaga ccaactctga gaagatcctg      420
          ctgagctggg tcagacagag caccagaaac taccctcaag tgaatgtgat caacttcacc      480
          acctcttgga gtgatggact ggccctgaat gccctgatcc acagccacag acctgacctg      540
          tttgactgga actctgttgt gtgccagcag tctgccacac agagactgga acatgccttc      600
          aacattgcca gataccagct gggaattgag aaactgctgg accctgagga tgtggacacc      660
          acctatcctg acaagaaatc catcctcatg tacatcacca gcctgttcca ggtgctgccc      720
          cagcaagtgt ccattgaggc cattcaagag gttgagatgc tgcccagacc tcctaaagtg      780
          accaaagagg aacacttcca gctgcaccac cagatgcact actctcagca gatcacagtg      840
          tctctggccc agggatatga gagaacaagc agccccaagc ctaggttcaa gagctatgcc      900
          tacacacagg ctgcctatgt gaccacatct gaccccacaa gaagcccatt tccaagccag      960
          catctggaag cccctgagga caagagcttt ggcagcagcc tgatggaatc tgaagtgaac     1020
          ctggatagat accagacagc cctggaagaa gtgctgtcct ggctgctgtc tgctgaggat     1080
          acactgcagg ctcagggtga aatcagcaat gatgtggaag tggtcaagga ccagtttcac     1140
          acccatgagg gctacatgat ggacctgaca gcccaccagg gcagagtggg aaatatcctg     1200
          cagctgggct ccaagctgat tggcacaggc aagctgtctg aggatgaaga gacagaggtg     1260
          caagagcaga tgaacctgct gaacagcaga tgggagtgtc tgagagtggc cagcatggaa     1320
          aagcagagca acctgcacag agtgctcatg gacctgcaga atcagaaact gaaagaactg     1380
          aatgactggc tgaccaagac agaagaaagg actaggaaga tggaagagga acctctggga     1440
          ccagacctgg aagatctgaa aagacaggtg cagcagcata aggtgctgca agaggacctt     1500
          gagcaagagc aagtcagagt gaacagcctg acacacatgg tggtggttgt ggatgagtcc     1560
          tctggggatc atgccacagc tgctctggaa gaacagctga aggtgctggg agacagatgg     1620
          gccaacatct gtaggtggac agaggataga tgggtgctgc tccaggacat tctgctgaag     1680
          tggcagagac tgacagagga acagtgcctg ttttctgcct ggctctctga gaaagaggat     1740
          gctgtcaaca agatccatac cacaggcttc aaggatcaga atgagatgct cagctccctg     1800
          cagaaactgg ctgtgctgaa ggctgacctg gaaaagaaaa agcagtccat gggcaagctc     1860
          tacagcctga agcaggacct gctgtctacc ctgaagaaca agtctgtgac ccagaaaact     1920
          gaggcctggc tggacaactt tgctagatgc tgggacaacc tggtgcagaa gctggaaaag     1980
          tctacagccc agatcagcca gcaacctgat cttgcccctg gcctgaccac aattggagcc     2040
          tctccaacac agactgtgac cctggttacc cagccagtgg tcaccaaaga gacagccatc     2100
          agcaaactgg aaatgcccag ctctctgatg ctggaagtcc ccacactgga aaggctgcaa     2160
          gaacttcaag aggccacaga tgagctggac ctgaagctga gacaggctga agtgatcaaa     2220
          ggcagctggc agccagttgg ggacctgctc attgatagcc tgcaggacca tctggaaaaa     2280
          gtgaaagccc tgaggggaga gattgcccct ctgaaagaaa atgtgtccca tgtgaatgac     2340
          ctggccagac agctgaccac actgggaatc cagctgagcc cctacaacct gagcaccctt     2400
          gaggacctga acaccaggtg gaagctcctc caggtggcag tggaagatag agtcaggcag     2460
          ctgcatgagg cccacagaga ttttggacca gccagccagc actttctgtc tacctctgtg     2520
          caaggcccct gggagagagc tatctctcct aacaaggtgc cctactacat caaccatgag     2580
          acacagacca cctgttggga tcaccccaag atgacagagc tgtaccagag tctggcagac     2640
          ctcaacaatg tcagattcag tgcctacagg actgccatga agctcagaag gctccagaaa     2700
          gctctgtgcc tggacctgct ttccctgagt gcagcttgtg atgccctgga ccagcacaat     2760
          ctgaagcaga atgaccagcc tatggacatc ctccagatca tcaactgcct caccaccatc     2820
          tatgataggc tggaacaaga gcacaacaat ctggtcaatg tgcccctgtg tgtggacatg     2880
          tgcctgaatt ggctgctgaa tgtgtatgac acaggcagaa caggcaggat cagagtcctg     2940
          tccttcaaga caggcatcat ctccctgtgc aaagcccact tggaggacaa gtacagatac     3000
          ctgttcaagc aagtggcctc cagcacaggc ttttgtgacc agagaaggct gggcctgctc     3060
          ctgcatgaca gcattcagat ccctagacag ctgggagaag tggcttcctt tggaggcagc     3120
          aatattgagc catcagtcag gtcctgtttt cagtttgcca acaacaagcc tgagattgag     3180
          gctgccctgt tcctggactg gatgagactt gagcctcaga gcatggtctg gctgcctgtg     3240
          cttcatagag tggctgctgc tgagactgcc aagcaccagg ccaagtgcaa catctgcaaa     3300
          gagtgcccca tcattggctt cagatacaga tccctgaagc acttcaacta tgatatctgc     3360
          cagagctgct tctttagtgg cagggttgcc aagggccaca aaatgcacta ccccatggtg     3420
          gaatactgca ccccaacaac ctctggggaa gatgttagag actttgccaa ggtgctgaaa     3480
          aacaagttca ggaccaagag atactttgct aagcacccca gaatgggcta cctgcctgtc     3540
          cagacagtgc ttgagggtga caacatggaa acccctgtga cactgatcaa tttctggcca     3600
          gtggactctg cccctgcctc aagtccacag ctgtcccatg atgacaccca cagcagaatt     3660
          gagcactatg cctccagact ggcagagatg gaaaacagca atggcagcta cctgaatgat     3720
          agcatcagcc ccaatgagag cattgatgat gagcatctgc tgatccagca ctactgtcag     3780
          tccctgaacc aggactctcc actgagccag cctagaagcc ctgctcagat cctgatcagc     3840
          cttgagtctg aggaaagggg agagctggaa agaatcctgg cagatcttga ggaagagaac     3900
          agaaacctgc aggcagagta tgacaggctc aaacagcagc atgagcacaa gggactgagc     3960
          cctctgcctt ctcctcctga aatgatgccc acctctccac agtctccaag gtgatga        4017
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211> ]]> 3573
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys3]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          atgctttggt gggaagaggt ggaagattgc tatgagaggg aagatgtgca gaagaaaacc       60
          ttcaccaaat gggtcaatgc ccagttcagc aagtttggca agcagcacat tgagaacctg      120
          ttcagtgacc tgcaggatgg cagaaggctg ctggatctgc tggaaggcct gacaggccag      180
          aagctgccta aagagaaggg cagcacaaga gtgcatgccc tgaacaatgt gaacaaggcc      240
          ctgagagtgc tgcagaacaa caatgtggac ctggtcaata ttggcagcac agacattgtg      300
          gatggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaaca tcatcctgca ctggcaagtg      360
          aagaatgtga tgaagaacat catggctggc ctgcagcaga ccaactctga gaagatcctg      420
          ctgagctggg tcagacagag caccagaaac taccctcaag tgaatgtgat caacttcacc      480
          acctcttgga gtgatggact ggccctgaat gccctgatcc acagccacag acctgacctg      540
          tttgactgga actctgttgt gtgccagcag tctgccacac agagactgga acatgccttc      600
          aacattgcca gataccagct gggaattgag aaactgctgg accctgagga tgtggacacc      660
          acctatcctg acaagaaatc catcctcatg tacatcacca gcctgttcca ggtgctgccc      720
          cagcaagtgt ccattgaggc cattcaagag gttgagatgc tgcccagacc tcctaaagtg      780
          accaaagagg aacacttcca gctgcaccac cagatgcact actctcagca gatcacagtg      840
          tctctggccc agggatatga gagaacaagc agccccaagc ctaggttcaa gagctatgcc      900
          tacacacagg ctgcctatgt gaccacatct gaccccacaa gaagcccatt tccaagccag      960
          catctggaag cccctgagga caagagcttt ggcagcagcc tgatggaatc tgaagtgaac     1020
          ctggatagat accagacagc cctggaagaa gtgctgtcct ggctgctgtc tgctgaggat     1080
          acactgcagg ctcagggtga aatcagcaat gatgtggaag tggtcaagga ccagtttcac     1140
          acccatgagg gctacatgat ggacctgaca gcccaccagg gcagagtggg aaatatcctg     1200
          cagctgggct ccaagctgat tggcacaggc aagctgtctg aggatgaaga gacagaggtg     1260
          caagagcaga tgaacctgct gaacagcaga tgggagtgtc tgagagtggc cagcatggaa     1320
          aagcagagca acctgcacag agtgctcatg gacctgcaga atcagaaact gaaagaactg     1380
          aatgactggc tgaccaagac agaagaaagg actaggaaga tggaagagga acctctggga     1440
          ccagacctgg aagatctgaa aagacaggtg cagcagcata aggtgctgca agaggacctt     1500
          gagcaagagc aagtcagagt gaacagcctg acacacatgg tggtggttgt ggatgagtcc     1560
          tctggggatc atgccacagc tgctctggaa gaacagctga aggtgctggg agacagatgg     1620
          gccaacatct gtaggtggac agaggataga tgggtgctgc tccaggacat tctgctgaag     1680
          tggcagagac tgacagagga acagtgcctg ttttctgcct ggctctctga gaaagaggat     1740
          gctgtcaaca agatccatac cacaggcttc aaggatcaga atgagatgct cagctccctg     1800
          cagaaactgg ctgtgctgaa ggctgacctg gaaaagaaaa agcagtccat gggcaagctc     1860
          tacagcctga agcaggacct gctgtctacc ctgaagaaca agtctgtgac ccagaaaact     1920
          gaggcctggc tggacaactt tgctagatgc tgggacaacc tggtgcagaa gctggaaaag     1980
          tctacagccc agatcagcca gcaacctgat cttgcccctg gcctgaccac aattggagcc     2040
          tctccaacac agactgtgac cctggttacc cagccagtgg tcaccaaaga gacagccatc     2100
          agcaaactgg aaatgcccag ctctctgatg ctggaagtcc ccacactgga aaggctgcaa     2160
          gaacttcaag aggccacaga tgagctggac ctgaagctga gacaggctga agtgatcaaa     2220
          ggcagctggc agccagttgg ggacctgctc attgatagcc tgcaggacca tctggaaaaa     2280
          gtgaaagccc tgaggggaga gattgcccct ctgaaagaaa atgtgtccca tgtgaatgac     2340
          ctggccagac agctgaccac actgggaatc cagctgagcc cctacaacct gagcaccctt     2400
          gaggacctga acaccaggtg gaagctcctc caggtggcag tggaagatag agtcaggcag     2460
          ctgcatgagg cccacagaga ttttggacca gccagccagc actttctgtc tacctctgtg     2520
          caaggcccct gggagagagc tatctctcct aacaaggtgc cctactacat caaccatgag     2580
          acacagacca cctgttggga tcaccccaag atgacagagc tgtaccagag tctggcagac     2640
          ctcaacaatg tcagattcag tgcctacagg actgccatga agctcagaag gctccagaaa     2700
          gctctgtgcc tggacctgct ttccctgagt gcagcttgtg atgccctgga ccagcacaat     2760
          ctgaagcaga atgaccagcc tatggacatc ctccagatca tcaactgcct caccaccatc     2820
          tatgataggc tggaacaaga gcacaacaat ctggtcaatg tgcccctgtg tgtggacatg     2880
          tgcctgaatt ggctgctgaa tgtgtatgac acaggcagaa caggcaggat cagagtcctg     2940
          tccttcaaga caggcatcat ctccctgtgc aaagcccact tggaggacaa gtacagatac     3000
          ctgttcaagc aagtggcctc cagcacaggc ttttgtgacc agagaaggct gggcctgctc     3060
          ctgcatgaca gcattcagat ccctagacag ctgggagaag tggcttcctt tggaggcagc     3120
          aatattgagc catcagtcag gtcctgtttt cagtttgcca acaacaagcc tgagattgag     3180
          gctgccctgt tcctggactg gatgagactt gagcctcaga gcatggtctg gctgcctgtg     3240
          cttcatagag tggctgctgc tgagactgcc aagcaccagg ccaagtgcaa catctgcaaa     3300
          gagtgcccca tcattggctt cagatacaga tccctgaagc acttcaacta tgatatctgc     3360
          cagagctgct tctttagtgg cagggttgcc aagggccaca aaatgcacta ccccatggtg     3420
          gaatactgca ccccaacaac ctctggggaa gatgttagag actttgccaa ggtgctgaaa     3480
          aacaagttca ggaccaagag atactttgct aagcacccca gaatgggcta cctgcctgtc     3540
          cagacagtgc ttgagggtga caacatggaa acc                                  3573
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  720]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          atgctttggt gggaagaagt agaggactgt tatgaaagag aagatgttca aaagaaaaca       60
          ttcacaaaat gggtaaatgc acaattttct aagtttggga agcagcatat tgagaacctc      120
          ttcagtgacc tacaggatgg gaggcgcctc ctagacctcc tcgaaggcct gacagggcaa      180
          aaactgccaa aagaaaaagg atccacaaga gttcatgccc tgaacaatgt caacaaggca      240
          ctgcgggttt tgcagaacaa taatgttgat ttagtgaata ttggaagtac tgacatcgta      300
          gatggaaatc ataaactgac tcttggtttg atttggaata taatcctcca ctggcaggtc      360
          aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaacaaa ccaacagtga aaagattctc      420
          ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc      480
          accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta      540
          tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc      600
          aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga tgttgatacc      660
          acctatccag ataagaagtc catcttaatg tacatcacat cactcttcca agttttgcct      720
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          caacaagtga gcattgaagc catccaggaa gtggaa                                 36
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  225]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          atgttgccaa ggccacctaa agtgactaaa gaagaacatt ttcagttaca tcatcaaatg       60
          cactattctc aacagatcac ggtcagtcta gcacagggat atgagagaac ttcttcccct      120
          aagcctcgat tcaagagcta tgcctacaca caggctgctt atgtcaccac ctctgaccct      180
          acacggagcc catttccttc acagcatttg gaagctcctg aagac                      225
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212]]>>  DNA]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt;  人工序列]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt;  25]]&gt;
          <br/><![CDATA[aagtcatttg gcagttcatt gatggag                                           27
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  333]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          agtgaagtaa acctggaccg ttatcaaaca gctttagaag aagtattatc gtggcttctt       60
          tctgctgagg acacattgca agcacaagga gagatttcta atgatgtgga agtggtgaaa      120
          gaccagtttc atactcatga ggggtacatg atggatttga cagcccatca gggccgggtt      180
          ggtaatattc tacaattggg aagtaagctg attggaacag gaaaattatc agaagatgaa      240
          gaaactgaag tacaagagca gatgaatctc ctaaattcaa gatgggaatg cctcagggta      300
          gctagcatgg aaaaacaaag caatttacat aga                                   333
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  327]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          gttttaatgg atctccagaa tcagaaactg aaagagttga atgactggct aacaaaaaca       60
          gaagaaagaa caaggaaaat ggaggaagag cctcttggac ctgatcttga agacctaaaa      120
          cgccaagtac aacaacataa ggtgcttcaa gaagatctag aacaagaaca agtcagggtc      180
          aattctctca ctcacatggt ggtggtagtt gatgaatcta gtggagatca cgcaactgct      240
          gctttggaag aacaacttaa ggtattggga gatcgatggg caaacatctg tagatggaca      300
          gaagaccgct gggttctttt acaagac                                          327
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          atcctt                                                                   6
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  327]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          ctcaaatggc aacgtcttac tgaagaacag tgccttttta gtgcatggct ttcagaaaaa       60
          gaagatgcag tgaacaagat tcacacaact ggctttaaag atcaaaatga aatgttatca      120
          agtcttcaaa aactggccgt tttaaaagcg gatctagaaa agaaaaagca atccatgggc      180
          aaactgtatt cactcaaaca agatcttctt tcaacactga agaataagtc agtgacccag      240
          aagacggaag catggctgga taactttgcc cggtgttggg ataatttagt ccaaaaactt      300
          gaaaagagta cagcacagat ttcacag                                          327
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  141]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>構築體；微小肌縮蛋白片段
          <![CDATA[<400>  30]]>
          cagcctgacc tagctcctgg actgaccact attggagcct ctcctactca gactgttact       60
          ctggtgacac aacctgtggt tactaaggaa actgccatct ccaaactaga aatgccatct      120
          tccttgatgt tggaggtacc t                                                141
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          acccttgaa                                                                9
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  315]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          agactccaac ttcaagaggc cacggatgag ctggacctca agctgcgcca agctgaggtg       60
          atcaagggat cctggcagcc cgtgggcgat ctcctcattg actctctcca agatcacctc      120
          gagaaagtca aggcacttcg aggagaaatt gcgcctctga aagagaacgt gagccacgtc      180
          aatgaccttg ctcgccagct taccactttg ggcattcagc tctcaccgta taacctcagc      240
          actctggaag acctgaacac cagatggaag cttctgcagg tggccgtcga ggaccgagtc      300
          aggcagctgc atgaa                                                       315
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  216]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序]]>列
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          gcccacaggg actttggtcc agcatctcag cactttcttt ccacgtctgt ccagggtccc       60
          tgggagagag ccatctcgcc aaacaaagtg ccctactata tcaaccacga gactcaaaca      120
          acttgctggg accatcccaa aatgacagag ctctaccagt ctttagctga cctgaataat      180
          gtcagattct cagcttatag gactgccatg aaactc                                216
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  744]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          cgaagactgc agaaggccct ttgcttggat ctcttgagcc tgtcagctgc atgtgatgcc       60
          ttggaccagc acaacctcaa gcaaaatgac cagcccatgg atatcctgca gattattaat      120
          tgtttgacca ctatttatga ccgcctggag caagagcaca acaatttggt caacgtccct      180
          ctctgcgtgg atatgtgtct gaactggctg ctgaatgttt atgatacggg acgaacaggg      240
          aggatccgtg tcctgtcttt taaaactggc atcatttccc tgtgtaaagc acatttggaa      300
          gacaagtaca gatacctttt caagcaagtg gcaagttcaa caggattttg tgaccagcgc      360
          aggctgggcc tccttctgca tgattctatc caaattccaa gacagttggg tgaagttgca      420
          tcctttgggg gcagtaacat tgagccaagt gtccggagct gcttccaatt tgctaataat      480
          aagccagaga tcgaagcggc cctcttccta gactggatga gactggaacc ccagtccatg      540
          gtgtggctgc ccgtcctgca cagagtggct gctgcagaaa ctgccaagca tcaggccaaa      600
          tgtaacatct gcaaagagtg tccaatcatt ggattcaggt acaggagtct aaagcacttt      660
          aattatgaca tctgccaaag ctgctttttt tctggtcgag ttgcaaaagg ccataaaatg      720
          cactatccca tggtggaata ttgc                                             744
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  582]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          actccgacta catcaggaga agatgttcga gactttgcca aggtactaaa aaacaaattt       60
          cgaaccaaaa ggtattttgc gaagcatccc cgaatgggct acctgccagt gcagactgtc      120
          ttagaggggg acaacatgga aactcccgtt actctgatca acttctggcc agtagattct      180
          gcgcctgcct cgtcccctca gctttcacac gatgatactc attcacgcat tgaacattat      240
          gctagcaggc tagcagaaat ggaaaacagc aatggatctt atctaaatga tagcatctct      300
          cctaatgaga gcatagatga tgaacatttg ttaatccagc attactgcca aagtttgaac      360
          caggactccc ccctgagcca gcctcgtagt cctgcccaga tcttgatttc cttagagagt      420
          gaggaaagag gggagctaga gagaatccta gcagatcttg aggaagaaaa caggaatctg      480
          caagcagaat atgaccgtct aaagcagcag cacgaacata aaggcctgtc cccactgccg      540
          tcccctcctg aaatgatgcc cacctctccc cagagtcccc gg                         582
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          gagacccttg aa                                                           12
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋]]>白片段
          <![CDATA[<400>  37]]>
          cttgaa                                                                   6
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          cagacactgg aa                                                           12
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  328]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；spc5-12啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          ggccgtccgc cctcggcacc atcctcacga cacccaaata tggcgacggg tgaggaatgg       60
          tggggagtta tttttagagc ggtgaggaag gtgggcaggc agcaggtgtt ggcgctctaa      120
          aaataactcc cgggagttat ttttagagcg gaggaatggt ggacacccaa atatggcgac      180
          ggttcctcac ccgtcgccat atttgggtgt ccgccctcgg ccggggccgc attcctgggg      240
          gccgggcggt gctcccgccc gcctcgataa aaggctccgg ggccggcggc ggcccacgag      300
          ctacccggag gagcgggagg cgccaagc                                         328
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  174]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg tcgccatatt tgggtgtccg       60
          ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct cccgcccgcc tcgataaaag      120
          gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag cgggaggcgc caag            174
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  82]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；內含子]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          gtgagtatct cagggatcca gacatgggga tatgggaggt gcctctgatc ccagggctca       60
          ctgtgggtct ctctgttcac ag                                                82
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  50]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；polyA]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          aggcctaata aagagctcag atgcatcgat cagagtgtgt tggttttttg                  50
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；引子]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          tgactcgaga ggcctaataa agagc                                             25
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；引子]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          ccttggagac tgtggagagg tg                                                22
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  738]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；AAV載體]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 
                          165                 170                 175     
          Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro 
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly 
                  195                 200                 205             
          Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 
              210                 215                 220                 
          Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 
                          245                 250                 255     
          Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 
                      260                 265                 270         
          Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 
                  275                 280                 285             
          Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 
              290                 295                 300                 
          Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 
                          325                 330                 335     
          Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 
                  355                 360                 365             
          Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr 
                          405                 410                 415     
          Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 
                      420                 425                 430         
          Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu 
              450                 455                 460                 
          Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 
                          485                 490                 495     
          Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His 
                      500                 505                 510         
          Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr 
                  515                 520                 525             
          His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met 
              530                 535                 540                 
          Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val 
          545                 550                 555                 560 
          Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 
                          565                 570                 575     
          Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala 
                      580                 585                 590         
          Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 
                  595                 600                 605             
          Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 
              610                 615                 620                 
          Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 
                          645                 650                 655     
          Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe 
                      660                 665                 670         
          Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 
                  675                 680                 685             
          Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 
              690                 695                 700                 
          Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 
          705                 710                 715                 720 
          Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 
                          725                 730                 735     
          Asn Leu 
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          caaacccttg aa                                                           12
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  162]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；微小肌縮蛋白片段]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          gccaagcatc aggccaaatg taacatctgc aaagagtgtc caatcattgg attcaggtac       60
          aggagtctaa agcactttaa ttatgacatc tgccaaagct gctttttttc tggtcgagtt      120
          gcaaaaggcc ataaaatgca ctatcccatg gtggaatatt gc                         162
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  738]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；衣殼]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 
                          165                 170                 175     
          Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro 
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly 
                  195                 200                 205             
          Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 
              210                 215                 220                 
          Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 
                          245                 250                 255     
          Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 
                      260                 265                 270         
          Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 
                  275                 280                 285             
          Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 
              290                 295                 300                 
          Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 
                          325                 330                 335     
          Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 
                  355                 360                 365             
          Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr 
                          405                 410                 415     
          Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 
                      420                 425                 430         
          Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Gln Gly Thr Gln Gln Leu Leu 
              450                 455                 460                 
          Phe Ser Gln Ala Gly Pro Ala Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 
                          485                 490                 495     
          Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His 
                      500                 505                 510         
          Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr 
                  515                 520                 525             
          His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met 
              530                 535                 540                 
          Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Arg Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val 
          545                 550                 555                 560 
          Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 
                          565                 570                 575     
          Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Thr Asn Thr Gly 
                      580                 585                 590         
          Pro Ile Val Gly Asn Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 
                  595                 600                 605             
          Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 
              610                 615                 620                 
          Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 
                          645                 650                 655     
          Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Ser Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe 
                      660                 665                 670         
          Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 
                  675                 680                 685             
          Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 
              690                 695                 700                 
          Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 
          705                 710                 715                 720 
          Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 
                          725                 730                 735     
          Asn Leu 
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  736]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；衣殼]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Gly Ser Gln Pro Ala Lys Lys Lys Leu Asn Phe Gly Gln Thr 
                          165                 170                 175     
          Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 
                      180                 185                 190         
          Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 
                  195                 200                 205             
          Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 
              210                 215                 220                 
          Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 
                          245                 250                 255     
          Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 
                      260                 265                 270         
          Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 
                  275                 280                 285             
          Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 
              290                 295                 300                 
          Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 
                          325                 330                 335     
          Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 
                      340                 345                 350         
          Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 
                  355                 360                 365             
          Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 
              370                 375                 380                 
          Gly Gly Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 
                          405                 410                 415     
          Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 
                      420                 425                 430         
          Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 
              450                 455                 460                 
          Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 
                      500                 505                 510         
          Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 
                  515                 520                 525             
          Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 
              530                 535                 540                 
          Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 
                          565                 570                 575     
          Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 
                      580                 585                 590         
          Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 
                  595                 600                 605             
          Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 
              610                 615                 620                 
          Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 
          625                 630                 635                 640 
          Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 
                          645                 650                 655     
          Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 
                      660                 665                 670         
          Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 
                  675                 680                 685             
          Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 
              690                 695                 700                 
          Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Ser Thr Glu Gly Val 
          705                 710                 715                 720 
          Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 
                          725                 730                 735     
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  737]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；衣殼]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Gly Ser Gln Pro Ala Lys Lys Lys Leu Asn Phe Gly Gln Thr 
                          165                 170                 175     
          Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gly Gln Pro Ile Gly Glu Pro 
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly 
                  195                 200                 205             
          Gly Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 
              210                 215                 220                 
          Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 
                          245                 250                 255     
          Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp 
                      260                 265                 270         
          Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 
                  275                 280                 285             
          Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 
              290                 295                 300                 
          Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala 
                          325                 330                 335     
          Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe 
                  355                 360                 365             
          Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 
              370                 375                 380                 
          Asp Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr 
                          405                 410                 415     
          Glu Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 
                      420                 425                 430         
          Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe 
              450                 455                 460                 
          Ser Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu 
                      500                 505                 510         
          Asn Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His 
                  515                 520                 525             
          Lys Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe 
              530                 535                 540                 
          Gly Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met 
          545                 550                 555                 560 
          Ile Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu 
                          565                 570                 575     
          Ser Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala 
                      580                 585                 590         
          Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp 
                  595                 600                 605             
          Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro 
              610                 615                 620                 
          His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly 
          625                 630                 635                 640 
          Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro 
                          645                 650                 655     
          Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile 
                      660                 665                 670         
          Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu 
                  675                 680                 685             
          Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser 
              690                 695                 700                 
          Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly 
          705                 710                 715                 720 
          Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn 
                          725                 730                 735     
          Leu 
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  865]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          ccactacggg tttaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct       60
          ggttataatt aacccagaca tgtggctgcc cccccccccc ccaacacctg ctgcctctaa      120
          aaataaccct gtccctggtg gatcccacta cgggtttagg ctgcccatgt aaggaggcaa      180
          ggcctgggga cacccgagat gcctggttat aattaaccca gacatgtggc tgcccccccc      240
          ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct ggtggatccc actacgggtt      300
          taggctgccc atgtaaggag gcaaggcctg gggacacccg agatgcctgg ttataattaa      360
          cccagacatg tggctgcccc cccccccccc aacacctgct gcctctaaaa ataaccctgt      420
          ccctggtgga tcccctgcat gcgaagatct tcgaacaagg ctgtggggga ctgagggcag      480
          gctgtaacag gcttgggggc cagggcttat acgtgcctgg gactcccaaa gtattactgt      540
          tccatgttcc cggcgaaggg ccagctgtcc cccgccagct agactcagca cttagtttag      600
          gaaccagtga gcaagtcagc ccttggggca gcccatacaa ggccatgggg ctgggcaagc      660
          tgcacgcctg ggtccggggt gggcacggtg cccgggcaac gagctgaaag ctcatctgct      720
          ctcaggggcc cctccctggg gacagcccct cctggctagt cacaccctgt aggctcctct      780
          atataaccca ggggcacagg ggctgccctc attctaccac cacctccaca gcacagacag      840
          acactcagga gccagccagc gtcga                                            865
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  1725]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc       60
          catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca      120
          acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga      180
          ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc      240
          aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct      300
          ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat      360
          tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct      420
          cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga      480
          tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg      540
          gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc      600
          cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg      660
          gagtcgctgc gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc      720
          cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc      780
          cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa      840
          gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg      900
          tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct      960
          gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg     1020
          gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt     1080
          gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc     1140
          cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg     1200
          gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg     1260
          ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg     1320
          gctgtcgagg cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc     1380
          agggacttcc tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc     1440
          cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg     1500
          gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc     1560
          ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga     1620
          ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc     1680
          tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaag                     1725
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  251]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          atggaggcgg tactatgtag atgagaattc aggagcaaac tgggaaaagc aactgcttcc       60
          aaatatttgt gatttttaca gtgtagtttt ggaaaaactc ttagcctacc aattcttcta      120
          agtgttttaa aatgtgggag ccagtacaca tgaagttata gagtgtttta atgaggctta      180
          aatatttacc gtaactatga aatgctacgc atatcatgct gttcaggctc cgtggccacg      240
          caactcatac t                                                           251
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  212]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa       60
          cgggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc      120
          gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc      180
          tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac ag                                    212
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  4364]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys3卡匣]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt       60
          ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact      120
          aggggttcct catatgcagg gtaatgggga tcctctagag gccgtccgcc ctcggcacca      180
          tcctcacgac acccaaatat ggcgacgggt gaggaatggt ggggagttat ttttagagcg      240
          gtgaggaagg tgggcaggca gcaggtgttg gcgctctaaa aataactccc gggagttatt      300
          tttagagcgg aggaatggtg gacacccaaa tatggcgacg gttcctcacc cgtcgccata      360
          tttgggtgtc cgccctcggc cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg      420
          cctcgataaa aggctccggg gccggcggcg gcccacgagc tacccggagg agcgggaggc      480
          gccaaggtga gtatctcagg gatccagaca tggggatatg ggaggtgcct ctgatcccag      540
          ggctcactgt gggtctctct gttcacagga attcgccacc atgctttggt gggaagaggt      600
          ggaagattgc tatgagaggg aagatgtgca gaagaaaacc ttcaccaaat gggtcaatgc      660
          ccagttcagc aagtttggca agcagcacat tgagaacctg ttcagtgacc tgcaggatgg      720
          cagaaggctg ctggatctgc tggaaggcct gacaggccag aagctgccta aagagaaggg      780
          cagcacaaga gtgcatgccc tgaacaatgt gaacaaggcc ctgagagtgc tgcagaacaa      840
          caatgtggac ctggtcaata ttggcagcac agacattgtg gatggcaacc acaagctgac      900
          cctgggcctg atctggaaca tcatcctgca ctggcaagtg aagaatgtga tgaagaacat      960
          catggctggc ctgcagcaga ccaactctga gaagatcctg ctgagctggg tcagacagag     1020
          caccagaaac taccctcaag tgaatgtgat caacttcacc acctcttgga gtgatggact     1080
          ggccctgaat gccctgatcc acagccacag acctgacctg tttgactgga actctgttgt     1140
          gtgccagcag tctgccacac agagactgga acatgccttc aacattgcca gataccagct     1200
          gggaattgag aaactgctgg accctgagga tgtggacacc acctatcctg acaagaaatc     1260
          catcctcatg tacatcacca gcctgttcca ggtgctgccc cagcaagtgt ccattgaggc     1320
          cattcaagag gttgagatgc tgcccagacc tcctaaagtg accaaagagg aacacttcca     1380
          gctgcaccac cagatgcact actctcagca gatcacagtg tctctggccc agggatatga     1440
          gagaacaagc agccccaagc ctaggttcaa gagctatgcc tacacacagg ctgcctatgt     1500
          gaccacatct gaccccacaa gaagcccatt tccaagccag catctggaag cccctgagga     1560
          caagagcttt ggcagcagcc tgatggaatc tgaagtgaac ctggatagat accagacagc     1620
          cctggaagaa gtgctgtcct ggctgctgtc tgctgaggat acactgcagg ctcagggtga     1680
          aatcagcaat gatgtggaag tggtcaagga ccagtttcac acccatgagg gctacatgat     1740
          ggacctgaca gcccaccagg gcagagtggg aaatatcctg cagctgggct ccaagctgat     1800
          tggcacaggc aagctgtctg aggatgaaga gacagaggtg caagagcaga tgaacctgct     1860
          gaacagcaga tgggagtgtc tgagagtggc cagcatggaa aagcagagca acctgcacag     1920
          agtgctcatg gacctgcaga atcagaaact gaaagaactg aatgactggc tgaccaagac     1980
          agaagaaagg actaggaaga tggaagagga acctctggga ccagacctgg aagatctgaa     2040
          aagacaggtg cagcagcata aggtgctgca agaggacctt gagcaagagc aagtcagagt     2100
          gaacagcctg acacacatgg tggtggttgt ggatgagtcc tctggggatc atgccacagc     2160
          tgctctggaa gaacagctga aggtgctggg agacagatgg gccaacatct gtaggtggac     2220
          agaggataga tgggtgctgc tccaggacat tctgctgaag tggcagagac tgacagagga     2280
          acagtgcctg ttttctgcct ggctctctga gaaagaggat gctgtcaaca agatccatac     2340
          cacaggcttc aaggatcaga atgagatgct cagctccctg cagaaactgg ctgtgctgaa     2400
          ggctgacctg gaaaagaaaa agcagtccat gggcaagctc tacagcctga agcaggacct     2460
          gctgtctacc ctgaagaaca agtctgtgac ccagaaaact gaggcctggc tggacaactt     2520
          tgctagatgc tgggacaacc tggtgcagaa gctggaaaag tctacagccc agatcagcca     2580
          gcaacctgat cttgcccctg gcctgaccac aattggagcc tctccaacac agactgtgac     2640
          cctggttacc cagccagtgg tcaccaaaga gacagccatc agcaaactgg aaatgcccag     2700
          ctctctgatg ctggaagtcc ccacactgga aaggctgcaa gaacttcaag aggccacaga     2760
          tgagctggac ctgaagctga gacaggctga agtgatcaaa ggcagctggc agccagttgg     2820
          ggacctgctc attgatagcc tgcaggacca tctggaaaaa gtgaaagccc tgaggggaga     2880
          gattgcccct ctgaaagaaa atgtgtccca tgtgaatgac ctggccagac agctgaccac     2940
          actgggaatc cagctgagcc cctacaacct gagcaccctt gaggacctga acaccaggtg     3000
          gaagctcctc caggtggcag tggaagatag agtcaggcag ctgcatgagg cccacagaga     3060
          ttttggacca gccagccagc actttctgtc tacctctgtg caaggcccct gggagagagc     3120
          tatctctcct aacaaggtgc cctactacat caaccatgag acacagacca cctgttggga     3180
          tcaccccaag atgacagagc tgtaccagag tctggcagac ctcaacaatg tcagattcag     3240
          tgcctacagg actgccatga agctcagaag gctccagaaa gctctgtgcc tggacctgct     3300
          ttccctgagt gcagcttgtg atgccctgga ccagcacaat ctgaagcaga atgaccagcc     3360
          tatggacatc ctccagatca tcaactgcct caccaccatc tatgataggc tggaacaaga     3420
          gcacaacaat ctggtcaatg tgcccctgtg tgtggacatg tgcctgaatt ggctgctgaa     3480
          tgtgtatgac acaggcagaa caggcaggat cagagtcctg tccttcaaga caggcatcat     3540
          ctccctgtgc aaagcccact tggaggacaa gtacagatac ctgttcaagc aagtggcctc     3600
          cagcacaggc ttttgtgacc agagaaggct gggcctgctc ctgcatgaca gcattcagat     3660
          ccctagacag ctgggagaag tggcttcctt tggaggcagc aatattgagc catcagtcag     3720
          gtcctgtttt cagtttgcca acaacaagcc tgagattgag gctgccctgt tcctggactg     3780
          gatgagactt gagcctcaga gcatggtctg gctgcctgtg cttcatagag tggctgctgc     3840
          tgagactgcc aagcaccagg ccaagtgcaa catctgcaaa gagtgcccca tcattggctt     3900
          cagatacaga tccctgaagc acttcaacta tgatatctgc cagagctgct tctttagtgg     3960
          cagggttgcc aagggccaca aaatgcacta ccccatggtg gaatactgca ccccaacaac     4020
          ctctggggaa gatgttagag actttgccaa ggtgctgaaa aacaagttca ggaccaagag     4080
          atactttgct aagcacccca gaatgggcta cctgcctgtc cagacagtgc ttgagggtga     4140
          caacatggaa acctgatgag tcgacaggcc taataaagag ctcagatgca tcgatcagag     4200
          tgtgttggtt ttttgtgtgg ctagctgcgg ccgcaggaac ccctagtgat ggagttggcc     4260
          actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc     4320
          ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcag                      4364
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；啟動子]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa可為任何胺基酸]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          Xaa Xaa Xaa Xaa 
          1               
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  720]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          atgctttggt gggaagaggt ggaagattgc tatgagaggg aagatgtgca gaagaaaacc       60
          ttcaccaaat gggtcaatgc ccagttcagc aagtttggca agcagcacat tgagaacctg      120
          ttcagtgacc tgcaggatgg cagaaggctg ctggatctgc tggaaggcct gacaggccag      180
          aagctgccta aagagaaggg cagcacaaga gtgcatgccc tgaacaatgt gaacaaggcc      240
          ctgagagtgc tgcagaacaa caatgtggac ctggtcaata ttggcagcac agacattgtg      300
          gatggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaaca tcatcctgca ctggcaagtg      360
          aagaatgtga tgaagaacat catggctggc ctgcagcaga ccaactctga gaagatcctg      420
          ctgagctggg tcagacagag caccagaaac taccctcaag tgaatgtgat caacttcacc      480
          acctcttgga gtgatggact ggccctgaat gccctgatcc acagccacag acctgacctg      540
          tttgactgga actctgttgt gtgccagcag tctgccacac agagactgga acatgccttc      600
          aacattgcca gataccagct gggaattgag aaactgctgg accctgagga tgtggacacc      660
          acctatcctg acaagaaatc catcctcatg tacatcacca gcctgttcca ggtgctgccc      720
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          cagcaagtgt ccattgaggc cattcaagag gttgag                                 36
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  225]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          atgctgccca gacctcctaa agtgaccaaa gaggaacact tccagctgca ccaccagatg       60
          cactactctc agcagatcac agtgtctctg gcccagggat atgagagaac aagcagcccc      120
          aagcctaggt tcaagagcta tgcctacaca caggctgcct atgtgaccac atctgacccc      180
          acaagaagcc catttccaag ccagcatctg gaagcccctg aggac                      225
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          aagagctttg gcagcagcct gatggaa                                           27
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  333]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          tctgaagtga acctggatag ataccagaca gccctggaag aagtgctgtc ctggctgctg       60
          tctgctgagg atacactgca ggctcagggt gaaatcagca atgatgtgga agtggtcaag      120
          gaccagtttc acacccatga gggctacatg atggacctga cagcccacca gggcagagtg      180
          ggaaatatcc tgcagctggg ctccaagctg attggcacag gcaagctgtc tgaggatgaa      240
          gagacagagg tgcaagagca gatgaacctg ctgaacagca gatgggagtg tctgagagtg      300
          gccagcatgg aaaagcagag caacctgcac aga                                   333
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  327]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>]]>  合成構築體；RGX-Dys片段
          <![CDATA[<400>  62]]>
          gtgctcatgg acctgcagaa tcagaaactg aaagaactga atgactggct gaccaagaca       60
          gaagaaagga ctaggaagat ggaagaggaa cctctgggac cagacctgga agatctgaaa      120
          agacaggtgc agcagcataa ggtgctgcaa gaggaccttg agcaagagca agtcagagtg      180
          aacagcctga cacacatggt ggtggttgtg gatgagtcct ctggggatca tgccacagct      240
          gctctggaag aacagctgaa ggtgctggga gacagatggg ccaacatctg taggtggaca      300
          gaggatagat gggtgctgct ccaggac                                          327
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          attctg                                                                   6
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  327]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          ctgaagtggc agagactgac agaggaacag tgcctgtttt ctgcctggct ctctgagaaa       60
          gaggatgctg tcaacaagat ccataccaca ggcttcaagg atcagaatga gatgctcagc      120
          tccctgcaga aactggctgt gctgaaggct gacctggaaa agaaaaagca gtccatgggc      180
          aagctctaca gcctgaagca ggacctgctg tctaccctga agaacaagtc tgtgacccag      240
          aaaactgagg cctggctgga caactttgct agatgctggg acaacctggt gcagaagctg      300
          gaaaagtcta cagcccagat cagccag                                          327
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  141]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          caacctgatc ttgcccctgg cctgaccaca attggagcct ctccaacaca gactgtgacc       60
          ctggttaccc agccagtggt caccaaagag acagccatca gcaaactgga aatgcccagc      120
          tctctgatgc tggaagtccc c                                                141
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          acactggaa                                                                9
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  318]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          aggctgcaag aacttcaaga ggccacagat gagctggacc tgaagctgag acaggctgaa       60
          gtgatcaaag gcagctggca gccagttggg gacctgctca ttgatagcct gcaggaccat      120
          ctggaaaaag tgaaagccct gaggggagag attgcccctc tgaaagaaaa tgtgtcccat      180
          gtgaatgacc tggccagaca gctgaccaca ctgggaatcc agctgagccc ctacaacctg      240
          agcacccttg aggacctgaa caccaggtgg aagctcctcc aggtggcagt ggaagataga      300
          gtcaggcagc tgcatgag                                                    318
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  216]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          gcccacagag attttggacc agccagccag cactttctgt ctacctctgt gcaaggcccc       60
          tgggagagag ctatctctcc taacaaggtg ccctactaca tcaaccatga gacacagacc      120
          acctgttggg atcaccccaa gatgacagag ctgtaccaga gtctggcaga cctcaacaat      180
          gtcagattca gtgcctacag gactgccatg aagctc                                216
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  744]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          agaaggctcc agaaagctct gtgcctggac ctgctttccc tgagtgcagc ttgtgatgcc       60
          ctggaccagc acaatctgaa gcagaatgac cagcctatgg acatcctcca gatcatcaac      120
          tgcctcacca ccatctatga taggctggaa caagagcaca acaatctggt caatgtgccc      180
          ctgtgtgtgg acatgtgcct gaattggctg ctgaatgtgt atgacacagg cagaacaggc      240
          aggatcagag tcctgtcctt caagacaggc atcatctccc tgtgcaaagc ccacttggag      300
          gacaagtaca gatacctgtt caagcaagtg gcctccagca caggcttttg tgaccagaga      360
          aggctgggcc tgctcctgca tgacagcatt cagatcccta gacagctggg agaagtggct      420
          tcctttggag gcagcaatat tgagccatca gtcaggtcct gttttcagtt tgccaacaac      480
          aagcctgaga ttgaggctgc cctgttcctg gactggatga gacttgagcc tcagagcatg      540
          gtctggctgc ctgtgcttca tagagtggct gctgctgaga ctgccaagca ccaggccaag      600
          tgcaacatct gcaaagagtg ccccatcatt ggcttcagat acagatccct gaagcacttc      660
          aactatgata tctgccagag ctgcttcttt agtggcaggg ttgccaaggg ccacaaaatg      720
          cactacccca tggtggaata ctgc                                             744
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<211>  588]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          accccaacaa cctctgggga agatgttaga gactttgcca aggtgctgaa aaacaagttc       60
          aggaccaaga gatactttgc taagcacccc agaatgggct acctgcctgt ccagacagtg      120
          cttgagggtg acaacatgga aacccctgtg acactgatca atttctggcc agtggactct      180
          gcccctgcct caagtccaca gctgtcccat gatgacaccc acagcagaat tgagcactat      240
          gcctccagac tggcagagat ggaaaacagc aatggcagct acctgaatga tagcatcagc      300
          cccaatgaga gcattgatga tgagcatctg ctgatccagc actactgtca gtccctgaac      360
          caggactctc cactgagcca gcctagaagc cctgctcaga tcctgatcag ccttgagtct      420
          gaggaaaggg gagagctgga aagaatcctg gcagatcttg aggaagagaa cagaaacctg      480
          caggcagagt atgacaggct caaacagcag catgagcaca agggactgag ccctctgcct      540
          tctcctcctg aaatgatgcc cacctctcca cagtctccaa ggtgatga                   588
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  n可為A或G]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  n為a、c、g或t]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          ganacactgg aa                                                           12
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          ctggaa                                                                   6
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<211>  129]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；ITR]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          cgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg       60
          gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta      120
          ggggttcct                                                              129
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  130]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；ITR]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg       60
          ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc      120
          gagcgcgcag                                                             130
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  240]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；人類肌間絲蛋白]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          ctgcagacat gcttgctgcc tgccctggcg tgccctggcg aggcttgccg tcacaggacc       60
          cccgctggct gactcagggg cgcaggctct tgcgggggag ctggcctccc gcccccacgg      120
          ccacgggccc tttcctggca ggacagcggg atcttgcagc tgtcagggga ggggatgacg      180
          ggggactgat gtcaggaggg gatacaaata gtgccgaaca aggaccggat tagatctacc      240
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  792]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；MHCK7]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          aagcttgcat gtctaagcta gacccttcag attaaaaata actgaggtaa gggcctgggt       60
          aggggaggtg gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga      120
          ggaggaatgt gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga      180
          cctttcatgg gcaaaccttg gggccctgct gtctagcatg ccccactacg ggtctaggct      240
          gcccatgtaa ggaggcaagg cctggggaca cccgagatgc ctggttataa ttaacccaga      300
          catgtggctg cccccccccc cccaacacct gctgcctcta aaaataaccc tgtccctggt      360
          ggatcccctg catgcgaaga tcttcgaaca aggctgtggg ggactgaggg caggctgtaa      420
          caggcttggg ggccagggct tatacgtgcc tgggactccc aaagtattac tgttccatgt      480
          tcccggcgaa gggccagctg tcccccgcca gctagactca gcacttagtt taggaaccag      540
          tgagcaagtc agcccttggg gcagcccata caaggccatg gggctgggca agctgcacgc      600
          ctgggtccgg ggtgggcacg gtgcccgggc aacgagctga aagctcatct gctctcaggg      660
          gcccctccct ggggacagcc cctcctggct agtcacaccc tgtaggctcc tctatataac      720
          ccaggggcac aggggctgcc ctcattctac caccacctcc acagcacaga cagacactca      780
          ggagcagcca gc                                                          792
          <![CDATA[<210>  77]]>
          <![CDATA[<211>  738]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；AAV8衣殼]]>
          <![CDATA[<400>  77]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 
                          165                 170                 175     
          Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly 
                  195                 200                 205             
          Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 
              210                 215                 220                 
          Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 
                          245                 250                 255     
          Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp 
                      260                 265                 270         
          Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 
                  275                 280                 285             
          Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 
              290                 295                 300                 
          Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 
                          325                 330                 335     
          Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 
                  355                 360                 365             
          Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr 
                          405                 410                 415     
          Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 
                      420                 425                 430         
          Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly 
              450                 455                 460                 
          Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly 
                          485                 490                 495     
          Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His 
                      500                 505                 510         
          Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr 
                  515                 520                 525             
          His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile 
              530                 535                 540                 
          Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val 
          545                 550                 555                 560 
          Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 
                          565                 570                 575     
          Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala 
                      580                 585                 590         
          Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 
                  595                 600                 605             
          Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 
              610                 615                 620                 
          Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 
                          645                 650                 655     
          Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe 
                      660                 665                 670         
          Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 
                  675                 680                 685             
          Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 
              690                 695                 700                 
          Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 
          705                 710                 715                 720 
          Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 
                          725                 730                 735     
          Asn Leu 
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<211>  736]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；AAV9衣殼]]>
          <![CDATA[<400>  78]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 
                          165                 170                 175     
          Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 
                      180                 185                 190         
          Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 
                  195                 200                 205             
          Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 
              210                 215                 220                 
          Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 
                          245                 250                 255     
          Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 
                      260                 265                 270         
          Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 
                  275                 280                 285             
          Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 
              290                 295                 300                 
          Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 
                          325                 330                 335     
          Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 
                      340                 345                 350         
          Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 
                  355                 360                 365             
          Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 
              370                 375                 380                 
          Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 
                          405                 410                 415     
          Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 
                      420                 425                 430         
          Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 
              450                 455                 460                 
          Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 
                      500                 505                 510         
          Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 
                  515                 520                 525             
          Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 
              530                 535                 540                 
          Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 
                          565                 570                 575     
          Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 
                      580                 585                 590         
          Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 
                  595                 600                 605             
          Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 
              610                 615                 620                 
          Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 
          625                 630                 635                 640 
          Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 
                          645                 650                 655     
          Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 
                      660                 665                 670         
          Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 
                  675                 680                 685             
          Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 
              690                 695                 700                 
          Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 
          705                 710                 715                 720 
          Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 
                          725                 730                 735     
          <![CDATA[<210>  79]]>
          <![CDATA[<211>  1283]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys5]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val 
          1               5                   10                  15      
          Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe 
                      20                  25                  30          
          Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp 
                      100                 105                 110         
          Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met 
                  115                 120                 125             
          Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His 
                          165                 170                 175     
          Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala 
                      180                 185                 190         
          Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly 
                  195                 200                 205             
          Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg 
                          245                 250                 255     
          Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met 
                      260                 265                 270         
          His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg 
                  275                 280                 285             
          Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala 
              290                 295                 300                 
          Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln 
          305                 310                 315                 320 
          His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu 
                          325                 330                 335     
          Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu 
                      340                 345                 350         
          Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile 
                  355                 360                 365             
          Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly 
              370                 375                 380                 
          Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu 
                          405                 410                 415     
          Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu 
                      420                 425                 430         
          Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val 
                  435                 440                 445             
          Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu 
              450                 455                 460                 
          Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu 
                          485                 490                 495     
          Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His 
                      500                 505                 510         
          Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala 
                  515                 520                 525             
          Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys 
              530                 535                 540                 
          Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys 
          545                 550                 555                 560 
          Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser 
                          565                 570                 575     
          Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp 
                      580                 585                 590         
          Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala 
                  595                 600                 605             
          Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys 
              610                 615                 620                 
          Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln 
                          645                 650                 655     
          Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Gln Pro Asp Leu Ala 
                      660                 665                 670         
          Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr Leu 
                  675                 680                 685             
          Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu Glu 
              690                 695                 700                 
          Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Thr Leu Glu Arg Leu Gln 
          705                 710                 715                 720 
          Glu Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala 
                          725                 730                 735     
          Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp 
                      740                 745                 750         
          Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile 
                  755                 760                 765             
          Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln 
              770                 775                 780                 
          Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu 
          785                 790                 795                 800 
          Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp 
                          805                 810                 815     
          Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser 
                      820                 825                 830         
          Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile 
                  835                 840                 845             
          Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr Gln Thr Thr 
              850                 855                 860                 
          Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp 
          865                 870                 875                 880 
          Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg 
                          885                 890                 895     
          Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ser Ala Ala 
                      900                 905                 910         
          Cys Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met 
                  915                 920                 925             
          Asp Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu 
              930                 935                 940                 
          Glu Gln Glu His Asn Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met 
          945                 950                 955                 960 
          Cys Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Arg 
                          965                 970                 975     
          Ile Arg Val Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala 
                      980                 985                 990         
          His Leu Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr  Leu Phe Lys Gln Val  Ala Ser Ser 
                  995                 1000                 1005             
          Thr Gly  Phe Cys Asp Gln Arg  Arg Leu Gly Leu Leu  Leu His Asp 
              1010                 1015                 1020             
          Ser Ile  Gln Ile Pro Arg Gln  Leu Gly Glu Val Ala  Ser Phe Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Gly Ser  Asn Ile Glu Pro Ser  Val Arg Ser Cys Phe  Gln Phe Ala 
              1040                 1045                 1050             
          Asn Asn  Lys Pro Glu Ile Glu  Ala Ala Leu Phe Leu  Asp Trp Met 
              1055                 1060                 1065             
          Arg Leu  Glu Pro Gln Ser Met  Val Trp Leu Pro Val  Leu His Arg 
              1070                 1075                 1080             
          Val Ala  Ala Ala Glu Thr Ala  Lys His Gln Ala Lys  Cys Asn Ile 
              1085                 1090                 1095             
          Cys Lys  Glu Cys Pro Ile Ile  Gly Phe Arg Tyr Arg  Ser Leu Lys 
              1100                 1105                 1110             
          His Phe  Asn Tyr Asp Ile Cys  Gln Ser Cys Phe Phe  Ser Gly Arg 
              1115                 1120                 1125             
          Val Ala  Lys Gly His Lys Met  His Tyr Pro Met Val  Glu Tyr Cys 
              1130                 1135                 1140             
          Thr Pro  Thr Thr Ser Gly Glu  Asp Val Arg Asp Phe  Ala Lys Val 
              1145                 1150                 1155             
          Leu Lys  Asn Lys Phe Arg Thr  Lys Arg Tyr Phe Ala  Lys His Pro 
              1160                 1165                 1170             
          Arg Met  Gly Tyr Leu Pro Val  Gln Thr Val Leu Glu  Gly Asp Asn 
              1175                 1180                 1185             
          Met Glu  Thr Pro Val Thr Leu  Ile Asn Phe Trp Pro  Val Asp Ser 
              1190                 1195                 1200             
          Ala Pro  Ala Ser Ser Pro Gln  Leu Ser His Asp Asp  Thr His Ser 
              1205                 1210                 1215             
          Arg Ile  Glu His Tyr Ala Ser  Arg Leu Ala Glu Met  Glu Asn Ser 
              1220                 1225                 1230             
          Asn Gly  Ser Tyr Leu Asn Asp  Ser Ile Ser Pro Asn  Glu Ser Ile 
              1235                 1240                 1245             
          Asp Asp  Glu His Leu Leu Ile  Gln His Tyr Cys Gln  Ser Leu Asn 
              1250                 1255                 1260             
          Gln Asp  Ser Pro Leu Ser Gln  Pro Arg Ser Pro Ala  Gln Ile Leu 
              1265                 1270                 1275             
          Ile Ser  Leu Glu Ser 
              1280             
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  426]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  80]]>
          accccaacaa cctctgggga agatgttaga gactttgcca aggtgctgaa aaacaagttc       60
          aggaccaaga gatactttgc taagcacccc agaatgggct acctgcctgt ccagacagtg      120
          cttgagggtg acaacatgga aacccctgtg acactgatca atttctggcc agtggactct      180
          gcccctgcct caagtccaca gctgtcccat gatgacaccc acagcagaat tgagcactat      240
          gcctccagac tggcagagat ggaaaacagc aatggcagct acctgaatga tagcatcagc      300
          cccaatgaga gcattgatga tgagcatctg ctgatccagc actactgtca gtccctgaac      360
          caggactctc cactgagcca gcctagaagc cctgctcaga tcctgatcag ccttgagtct      420
          tgatga                                                                 426
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  3855]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys5]]>
          <![CDATA[<400>  81]]>
          atgctttggt gggaagaggt ggaagattgc tatgagaggg aagatgtgca gaagaaaacc       60
          ttcaccaaat gggtcaatgc ccagttcagc aagtttggca agcagcacat tgagaacctg      120
          ttcagtgacc tgcaggatgg cagaaggctg ctggatctgc tggaaggcct gacaggccag      180
          aagctgccta aagagaaggg cagcacaaga gtgcatgccc tgaacaatgt gaacaaggcc      240
          ctgagagtgc tgcagaacaa caatgtggac ctggtcaata ttggcagcac agacattgtg      300
          gatggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaaca tcatcctgca ctggcaagtg      360
          aagaatgtga tgaagaacat catggctggc ctgcagcaga ccaactctga gaagatcctg      420
          ctgagctggg tcagacagag caccagaaac taccctcaag tgaatgtgat caacttcacc      480
          acctcttgga gtgatggact ggccctgaat gccctgatcc acagccacag acctgacctg      540
          tttgactgga actctgttgt gtgccagcag tctgccacac agagactgga acatgccttc      600
          aacattgcca gataccagct gggaattgag aaactgctgg accctgagga tgtggacacc      660
          acctatcctg acaagaaatc catcctcatg tacatcacca gcctgttcca ggtgctgccc      720
          cagcaagtgt ccattgaggc cattcaagag gttgagatgc tgcccagacc tcctaaagtg      780
          accaaagagg aacacttcca gctgcaccac cagatgcact actctcagca gatcacagtg      840
          tctctggccc agggatatga gagaacaagc agccccaagc ctaggttcaa gagctatgcc      900
          tacacacagg ctgcctatgt gaccacatct gaccccacaa gaagcccatt tccaagccag      960
          catctggaag cccctgagga caagagcttt ggcagcagcc tgatggaatc tgaagtgaac     1020
          ctggatagat accagacagc cctggaagaa gtgctgtcct ggctgctgtc tgctgaggat     1080
          acactgcagg ctcagggtga aatcagcaat gatgtggaag tggtcaagga ccagtttcac     1140
          acccatgagg gctacatgat ggacctgaca gcccaccagg gcagagtggg aaatatcctg     1200
          cagctgggct ccaagctgat tggcacaggc aagctgtctg aggatgaaga gacagaggtg     1260
          caagagcaga tgaacctgct gaacagcaga tgggagtgtc tgagagtggc cagcatggaa     1320
          aagcagagca acctgcacag agtgctcatg gacctgcaga atcagaaact gaaagaactg     1380
          aatgactggc tgaccaagac agaagaaagg actaggaaga tggaagagga acctctggga     1440
          ccagacctgg aagatctgaa aagacaggtg cagcagcata aggtgctgca agaggacctt     1500
          gagcaagagc aagtcagagt gaacagcctg acacacatgg tggtggttgt ggatgagtcc     1560
          tctggggatc atgccacagc tgctctggaa gaacagctga aggtgctggg agacagatgg     1620
          gccaacatct gtaggtggac agaggataga tgggtgctgc tccaggacat tctgctgaag     1680
          tggcagagac tgacagagga acagtgcctg ttttctgcct ggctctctga gaaagaggat     1740
          gctgtcaaca agatccatac cacaggcttc aaggatcaga atgagatgct cagctccctg     1800
          cagaaactgg ctgtgctgaa ggctgacctg gaaaagaaaa agcagtccat gggcaagctc     1860
          tacagcctga agcaggacct gctgtctacc ctgaagaaca agtctgtgac ccagaaaact     1920
          gaggcctggc tggacaactt tgctagatgc tgggacaacc tggtgcagaa gctggaaaag     1980
          tctacagccc agatcagcca gcaacctgat cttgcccctg gcctgaccac aattggagcc     2040
          tctccaacac agactgtgac cctggttacc cagccagtgg tcaccaaaga gacagccatc     2100
          agcaaactgg aaatgcccag ctctctgatg ctggaagtcc ccacactgga aaggctgcaa     2160
          gaacttcaag aggccacaga tgagctggac ctgaagctga gacaggctga agtgatcaaa     2220
          ggcagctggc agccagttgg ggacctgctc attgatagcc tgcaggacca tctggaaaaa     2280
          gtgaaagccc tgaggggaga gattgcccct ctgaaagaaa atgtgtccca tgtgaatgac     2340
          ctggccagac agctgaccac actgggaatc cagctgagcc cctacaacct gagcaccctt     2400
          gaggacctga acaccaggtg gaagctcctc caggtggcag tggaagatag agtcaggcag     2460
          ctgcatgagg cccacagaga ttttggacca gccagccagc actttctgtc tacctctgtg     2520
          caaggcccct gggagagagc tatctctcct aacaaggtgc cctactacat caaccatgag     2580
          acacagacca cctgttggga tcaccccaag atgacagagc tgtaccagag tctggcagac     2640
          ctcaacaatg tcagattcag tgcctacagg actgccatga agctcagaag gctccagaaa     2700
          gctctgtgcc tggacctgct ttccctgagt gcagcttgtg atgccctgga ccagcacaat     2760
          ctgaagcaga atgaccagcc tatggacatc ctccagatca tcaactgcct caccaccatc     2820
          tatgataggc tggaacaaga gcacaacaat ctggtcaatg tgcccctgtg tgtggacatg     2880
          tgcctgaatt ggctgctgaa tgtgtatgac acaggcagaa caggcaggat cagagtcctg     2940
          tccttcaaga caggcatcat ctccctgtgc aaagcccact tggaggacaa gtacagatac     3000
          ctgttcaagc aagtggcctc cagcacaggc ttttgtgacc agagaaggct gggcctgctc     3060
          ctgcatgaca gcattcagat ccctagacag ctgggagaag tggcttcctt tggaggcagc     3120
          aatattgagc catcagtcag gtcctgtttt cagtttgcca acaacaagcc tgagattgag     3180
          gctgccctgt tcctggactg gatgagactt gagcctcaga gcatggtctg gctgcctgtg     3240
          cttcatagag tggctgctgc tgagactgcc aagcaccagg ccaagtgcaa catctgcaaa     3300
          gagtgcccca tcattggctt cagatacaga tccctgaagc acttcaacta tgatatctgc     3360
          cagagctgct tctttagtgg cagggttgcc aagggccaca aaatgcacta ccccatggtg     3420
          gaatactgca ccccaacaac ctctggggaa gatgttagag actttgccaa ggtgctgaaa     3480
          aacaagttca ggaccaagag atactttgct aagcacccca gaatgggcta cctgcctgtc     3540
          cagacagtgc ttgagggtga caacatggaa acccctgtga cactgatcaa tttctggcca     3600
          gtggactctg cccctgcctc aagtccacag ctgtcccatg atgacaccca cagcagaatt     3660
          gagcactatg cctccagact ggcagagatg gaaaacagca atggcagcta cctgaatgat     3720
          agcatcagcc ccaatgagag cattgatgat gagcatctgc tgatccagca ctactgtcag     3780
          tccctgaacc aggactctcc actgagccag cctagaagcc ctgctcagat cctgatcagc     3840
          cttgagtctt gatga                                                      3855
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<211>  4560]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys5卡匣]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt       60
          ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact      120
          aggggttcct catatgcagg gtaatgggga tcctctagag gccgtccgcc ctcggcacca      180
          tcctcacgac acccaaatat ggcgacgggt gaggaatggt ggggagttat ttttagagcg      240
          gtgaggaagg tgggcaggca gcaggtgttg gcgctctaaa aataactccc gggagttatt      300
          tttagagcgg aggaatggtg gacacccaaa tatggcgacg gttcctcacc cgtcgccata      360
          tttgggtgtc cgccctcggc cggggccgca ttcctggggg ccgggcggtg ctcccgcccg      420
          cctcgataaa aggctccggg gccggcggcg gcccacgagc tacccggagg agcgggaggc      480
          gccaagcgga attcgccacc atgctttggt gggaagaggt ggaagattgc tatgagaggg      540
          aagatgtgca gaagaaaacc ttcaccaaat gggtcaatgc ccagttcagc aagtttggca      600
          agcagcacat tgagaacctg ttcagtgacc tgcaggatgg cagaaggctg ctggatctgc      660
          tggaaggcct gacaggccag aagctgccta aagagaaggg cagcacaaga gtgcatgccc      720
          tgaacaatgt gaacaaggcc ctgagagtgc tgcagaacaa caatgtggac ctggtcaata      780
          ttggcagcac agacattgtg gatggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaaca      840
          tcatcctgca ctggcaagtg aagaatgtga tgaagaacat catggctggc ctgcagcaga      900
          ccaactctga gaagatcctg ctgagctggg tcagacagag caccagaaac taccctcaag      960
          tgaatgtgat caacttcacc acctcttgga gtgatggact ggccctgaat gccctgatcc     1020
          acagccacag acctgacctg tttgactgga actctgttgt gtgccagcag tctgccacac     1080
          agagactgga acatgccttc aacattgcca gataccagct gggaattgag aaactgctgg     1140
          accctgagga tgtggacacc acctatcctg acaagaaatc catcctcatg tacatcacca     1200
          gcctgttcca ggtgctgccc cagcaagtgt ccattgaggc cattcaagag gttgagatgc     1260
          tgcccagacc tcctaaagtg accaaagagg aacacttcca gctgcaccac cagatgcact     1320
          actctcagca gatcacagtg tctctggccc agggatatga gagaacaagc agccccaagc     1380
          ctaggttcaa gagctatgcc tacacacagg ctgcctatgt gaccacatct gaccccacaa     1440
          gaagcccatt tccaagccag catctggaag cccctgagga caagagcttt ggcagcagcc     1500
          tgatggaatc tgaagtgaac ctggatagat accagacagc cctggaagaa gtgctgtcct     1560
          ggctgctgtc tgctgaggat acactgcagg ctcagggtga aatcagcaat gatgtggaag     1620
          tggtcaagga ccagtttcac acccatgagg gctacatgat ggacctgaca gcccaccagg     1680
          gcagagtggg aaatatcctg cagctgggct ccaagctgat tggcacaggc aagctgtctg     1740
          aggatgaaga gacagaggtg caagagcaga tgaacctgct gaacagcaga tgggagtgtc     1800
          tgagagtggc cagcatggaa aagcagagca acctgcacag agtgctcatg gacctgcaga     1860
          atcagaaact gaaagaactg aatgactggc tgaccaagac agaagaaagg actaggaaga     1920
          tggaagagga acctctggga ccagacctgg aagatctgaa aagacaggtg cagcagcata     1980
          aggtgctgca agaggacctt gagcaagagc aagtcagagt gaacagcctg acacacatgg     2040
          tggtggttgt ggatgagtcc tctggggatc atgccacagc tgctctggaa gaacagctga     2100
          aggtgctggg agacagatgg gccaacatct gtaggtggac agaggataga tgggtgctgc     2160
          tccaggacat tctgctgaag tggcagagac tgacagagga acagtgcctg ttttctgcct     2220
          ggctctctga gaaagaggat gctgtcaaca agatccatac cacaggcttc aaggatcaga     2280
          atgagatgct cagctccctg cagaaactgg ctgtgctgaa ggctgacctg gaaaagaaaa     2340
          agcagtccat gggcaagctc tacagcctga agcaggacct gctgtctacc ctgaagaaca     2400
          agtctgtgac ccagaaaact gaggcctggc tggacaactt tgctagatgc tgggacaacc     2460
          tggtgcagaa gctggaaaag tctacagccc agatcagcca gcaacctgat cttgcccctg     2520
          gcctgaccac aattggagcc tctccaacac agactgtgac cctggttacc cagccagtgg     2580
          tcaccaaaga gacagccatc agcaaactgg aaatgcccag ctctctgatg ctggaagtcc     2640
          ccacactgga aaggctgcaa gaacttcaag aggccacaga tgagctggac ctgaagctga     2700
          gacaggctga agtgatcaaa ggcagctggc agccagttgg ggacctgctc attgatagcc     2760
          tgcaggacca tctggaaaaa gtgaaagccc tgaggggaga gattgcccct ctgaaagaaa     2820
          atgtgtccca tgtgaatgac ctggccagac agctgaccac actgggaatc cagctgagcc     2880
          cctacaacct gagcaccctt gaggacctga acaccaggtg gaagctcctc caggtggcag     2940
          tggaagatag agtcaggcag ctgcatgagg cccacagaga ttttggacca gccagccagc     3000
          actttctgtc tacctctgtg caaggcccct gggagagagc tatctctcct aacaaggtgc     3060
          cctactacat caaccatgag acacagacca cctgttggga tcaccccaag atgacagagc     3120
          tgtaccagag tctggcagac ctcaacaatg tcagattcag tgcctacagg actgccatga     3180
          agctcagaag gctccagaaa gctctgtgcc tggacctgct ttccctgagt gcagcttgtg     3240
          atgccctgga ccagcacaat ctgaagcaga atgaccagcc tatggacatc ctccagatca     3300
          tcaactgcct caccaccatc tatgataggc tggaacaaga gcacaacaat ctggtcaatg     3360
          tgcccctgtg tgtggacatg tgcctgaatt ggctgctgaa tgtgtatgac acaggcagaa     3420
          caggcaggat cagagtcctg tccttcaaga caggcatcat ctccctgtgc aaagcccact     3480
          tggaggacaa gtacagatac ctgttcaagc aagtggcctc cagcacaggc ttttgtgacc     3540
          agagaaggct gggcctgctc ctgcatgaca gcattcagat ccctagacag ctgggagaag     3600
          tggcttcctt tggaggcagc aatattgagc catcagtcag gtcctgtttt cagtttgcca     3660
          acaacaagcc tgagattgag gctgccctgt tcctggactg gatgagactt gagcctcaga     3720
          gcatggtctg gctgcctgtg cttcatagag tggctgctgc tgagactgcc aagcaccagg     3780
          ccaagtgcaa catctgcaaa gagtgcccca tcattggctt cagatacaga tccctgaagc     3840
          acttcaacta tgatatctgc cagagctgct tctttagtgg cagggttgcc aagggccaca     3900
          aaatgcacta ccccatggtg gaatactgca ccccaacaac ctctggggaa gatgttagag     3960
          actttgccaa ggtgctgaaa aacaagttca ggaccaagag atactttgct aagcacccca     4020
          gaatgggcta cctgcctgtc cagacagtgc ttgagggtga caacatggaa acccctgtga     4080
          cactgatcaa tttctggcca gtggactctg cccctgcctc aagtccacag ctgtcccatg     4140
          atgacaccca cagcagaatt gagcactatg cctccagact ggcagagatg gaaaacagca     4200
          atggcagcta cctgaatgat agcatcagcc ccaatgagag cattgatgat gagcatctgc     4260
          tgatccagca ctactgtcag tccctgaacc aggactctcc actgagccag cctagaagcc     4320
          ctgctcagat cctgatcagc cttgagtctt gatgagtcga caggcctaat aaagagctca     4380
          gatgcatcga tcagagtgtg ttggtttttt gtgtggctag ctgcggccgc aggaacccct     4440
          agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc     4500
          aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag     4560
          <![CDATA[<210>  83]]>
          <![CDATA[<211>  140]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<40]]>0>  83]]&gt;
          <br/>
          <br/><![CDATA[Thr Pro Thr Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Asn Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg Met 
                      20                  25                  30          
          Gly Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr 
                  35                  40                  45              
          Pro Val Thr Leu Ile Asn Phe Trp Pro Val Asp Ser Ala Pro Ala Ser 
              50                  55                  60                  
          Ser Pro Gln Leu Ser His Asp Asp Thr His Ser Arg Ile Glu His Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Ser Arg Leu Ala Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Asn 
                          85                  90                  95      
          Asp Ser Ile Ser Pro Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu His Leu Leu Ile 
                      100                 105                 110         
          Gln His Tyr Cys Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser Pro Leu Ser Gln Pro 
                  115                 120                 125             
          Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu Glu Ser 
              130                 135                 140 
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<211>  35]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  84]]>
          Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ile Ser Pro Asn 
          1               5                   10                  15      
          Glu Ser Ile Asp Asp Glu His Leu Leu Ile Gln His Tyr Cys Gln Ser 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Gln 
                  35  
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  738]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；AAV載體]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 
                          85                  90                  95      
          Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 
                          165                 170                 175     
          Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro 
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly 
                  195                 200                 205             
          Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 
              210                 215                 220                 
          Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 
                          245                 250                 255     
          Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp 
                      260                 265                 270         
          Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 
                  275                 280                 285             
          Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 
              290                 295                 300                 
          Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 
                          325                 330                 335     
          Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 
                  355                 360                 365             
          Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr 
                          405                 410                 415     
          Asn Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 
                      420                 425                 430         
          Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu 
              450                 455                 460                 
          Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser 
                          485                 490                 495     
          Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His 
                      500                 505                 510         
          Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr 
                  515                 520                 525             
          His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met 
              530                 535                 540                 
          Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val 
          545                 550                 555                 560 
          Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 
                          565                 570                 575     
          Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala 
                      580                 585                 590         
          Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 
                  595                 600                 605             
          Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 
              610                 615                 620                 
          Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 
                          645                 650                 655     
          Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe 
                      660                 665                 670         
          Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 
                  675                 680                 685             
          Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 
              690                 695                 700                 
          Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 
          705                 710                 715                 720 
          Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 
                          725                 730                 735     
          Asn Leu 
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  714]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  86]]>
          ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct       60
          ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct      120
          gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct      180
          cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtgga tccactacgg gtctatgctg cccatgtaag      240
          gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taaccccaac acctgctgcc      300
          cccccccccc caacacctgc tgcctgagcc tgagcggtta ccccaccccg gtgcctgggt      360
          cttaggctct gtacaccatg gaggagaagc tcgctctaaa aataaccctg tccctggtgg      420
          accactacgg gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc      480
          tggttataat taaccccaac acctgctgcc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct      540
          gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct      600
          cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtcct ccctggggac agcccctcct ggctagtcac      660
          accctgtagg ctcctctata taacccaggg gcacaggggc tgcccccggg tcac            714
          <![CDATA[<210> ]]> 87
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；衣殼蛋白]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；衣殼蛋白]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<211>  54]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu Cys Pro Ile Ile 
          1               5                   10                  15      
          Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His Phe Asn Tyr Asp Ile Cys Gln 
                      20                  25                  30          
          Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys Gly His Lys Met His Tyr 
                  35                  40                  45              
          Pro Met Val Glu Tyr Cys 
              50                  
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  162]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  90]]>
          gccaagcacc aggccaagtg caacatctgc aaagagtgcc ccatcattgg cttcagatac       60
          agatccctga agcacttcaa ctatgatatc tgccagagct gcttctttag tggcagggtt      120
          gccaagggcc acaaaatgca ctaccccatg gtggaatact gc                         162
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  48]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；RGX-Dys片段]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
          Thr Pro Thr Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Asn Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg Met 
                      20                  25                  30          
          Gly Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr 
                  35                  40                  45              
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  3685]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
          Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val 
          1               5                   10                  15      
          Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe 
                      20                  25                  30          
          Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp 
                      100                 105                 110         
          Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met 
                  115                 120                 125             
          Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val 
              130                 135                 140                 
          Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His 
                          165                 170                 175     
          Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala 
                      180                 185                 190         
          Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly 
                  195                 200                 205             
          Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg 
                          245                 250                 255     
          Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met 
                      260                 265                 270         
          His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg 
                  275                 280                 285             
          Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala 
              290                 295                 300                 
          Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln 
          305                 310                 315                 320 
          His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu 
                          325                 330                 335     
          Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu 
                      340                 345                 350         
          Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile 
                  355                 360                 365             
          Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly 
              370                 375                 380                 
          Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu 
                          405                 410                 415     
          Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu 
                      420                 425                 430         
          Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val 
                  435                 440                 445             
          Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu 
              450                 455                 460                 
          Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu 
                          485                 490                 495     
          Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His 
                      500                 505                 510         
          Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala 
                  515                 520                 525             
          Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys 
              530                 535                 540                 
          Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys 
          545                 550                 555                 560 
          Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser 
                          565                 570                 575     
          Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp 
                      580                 585                 590         
          Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala 
                  595                 600                 605             
          Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys 
              610                 615                 620                 
          Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln 
                          645                 650                 655     
          Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Ala Val Thr Thr Thr 
                      660                 665                 670         
          Gln Pro Ser Leu Thr Gln Thr Thr Val Met Glu Thr Val Thr Thr Val 
                  675                 680                 685             
          Thr Thr Arg Glu Gln Ile Leu Val Lys His Ala Gln Glu Glu Leu Pro 
              690                 695                 700                 
          Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Arg Gln Ile Thr Val Asp Ser Glu Ile 
          705                 710                 715                 720 
          Arg Lys Arg Leu Asp Val Asp Ile Thr Glu Leu His Ser Trp Ile Thr 
                          725                 730                 735     
          Arg Ser Glu Ala Val Leu Gln Ser Pro Glu Phe Ala Ile Phe Arg Lys 
                      740                 745                 750         
          Glu Gly Asn Phe Ser Asp Leu Lys Glu Lys Val Asn Ala Ile Glu Arg 
                  755                 760                 765             
          Glu Lys Ala Glu Lys Phe Arg Lys Leu Gln Asp Ala Ser Arg Ser Ala 
              770                 775                 780                 
          Gln Ala Leu Val Glu Gln Met Val Asn Glu Gly Val Asn Ala Asp Ser 
          785                 790                 795                 800 
          Ile Lys Gln Ala Ser Glu Gln Leu Asn Ser Arg Trp Ile Glu Phe Cys 
                          805                 810                 815     
          Gln Leu Leu Ser Glu Arg Leu Asn Trp Leu Glu Tyr Gln Asn Asn Ile 
                      820                 825                 830         
          Ile Ala Phe Tyr Asn Gln Leu Gln Gln Leu Glu Gln Met Thr Thr Thr 
                  835                 840                 845             
          Ala Glu Asn Trp Leu Lys Ile Gln Pro Thr Thr Pro Ser Glu Pro Thr 
              850                 855                 860                 
          Ala Ile Lys Ser Gln Leu Lys Ile Cys Lys Asp Glu Val Asn Arg Leu 
          865                 870                 875                 880 
          Ser Asp Leu Gln Pro Gln Ile Glu Arg Leu Lys Ile Gln Ser Ile Ala 
                          885                 890                 895     
          Leu Lys Glu Lys Gly Gln Gly Pro Met Phe Leu Asp Ala Asp Phe Val 
                      900                 905                 910         
          Ala Phe Thr Asn His Phe Lys Gln Val Phe Ser Asp Val Gln Ala Arg 
                  915                 920                 925             
          Glu Lys Glu Leu Gln Thr Ile Phe Asp Thr Leu Pro Pro Met Arg Tyr 
              930                 935                 940                 
          Gln Glu Thr Met Ser Ala Ile Arg Thr Trp Val Gln Gln Ser Glu Thr 
          945                 950                 955                 960 
          Lys Leu Ser Ile Pro Gln Leu Ser Val Thr Asp Tyr Glu Ile Met Glu 
                          965                 970                 975     
          Gln Arg Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Gln Ser Ser Leu Gln Glu Gln 
                      980                 985                 990         
          Gln Ser Gly Leu Tyr Tyr Leu Ser  Thr Thr Val Lys Glu  Met Ser Lys 
                  995                 1000                 1005             
          Lys Ala  Pro Ser Glu Ile Ser  Arg Lys Tyr Gln Ser  Glu Phe Glu 
              1010                 1015                 1020             
          Glu Ile  Glu Gly Arg Trp Lys  Lys Leu Ser Ser Gln  Leu Val Glu 
              1025                 1030                 1035             
          His Cys  Gln Lys Leu Glu Glu  Gln Met Asn Lys Leu  Arg Lys Ile 
              1040                 1045                 1050             
          Gln Asn  His Ile Gln Thr Leu  Lys Lys Trp Met Ala  Glu Val Asp 
              1055                 1060                 1065             
          Val Phe  Leu Lys Glu Glu Trp  Pro Ala Leu Gly Asp  Ser Glu Ile 
              1070                 1075                 1080             
          Leu Lys  Lys Gln Leu Lys Gln  Cys Arg Leu Leu Val  Ser Asp Ile 
              1085                 1090                 1095             
          Gln Thr  Ile Gln Pro Ser Leu  Asn Ser Val Asn Glu  Gly Gly Gln 
              1100                 1105                 1110             
          Lys Ile  Lys Asn Glu Ala Glu  Pro Glu Phe Ala Ser  Arg Leu Glu 
              1115                 1120                 1125             
          Thr Glu  Leu Lys Glu Leu Asn  Thr Gln Trp Asp His  Met Cys Gln 
              1130                 1135                 1140             
          Gln Val  Tyr Ala Arg Lys Glu  Ala Leu Lys Gly Gly  Leu Glu Lys 
              1145                 1150                 1155             
          Thr Val  Ser Leu Gln Lys Asp  Leu Ser Glu Met His  Glu Trp Met 
              1160                 1165                 1170             
          Thr Gln  Ala Glu Glu Glu Tyr  Leu Glu Arg Asp Phe  Glu Tyr Lys 
              1175                 1180                 1185             
          Thr Pro  Asp Glu Leu Gln Lys  Ala Val Glu Glu Met  Lys Arg Ala 
              1190                 1195                 1200             
          Lys Glu  Glu Ala Gln Gln Lys  Glu Ala Lys Val Lys  Leu Leu Thr 
              1205                 1210                 1215             
          Glu Ser  Val Asn Ser Val Ile  Ala Gln Ala Pro Pro  Val Ala Gln 
              1220                 1225                 1230             
          Glu Ala  Leu Lys Lys Glu Leu  Glu Thr Leu Thr Thr  Asn Tyr Gln 
              1235                 1240                 1245             
          Trp Leu  Cys Thr Arg Leu Asn  Gly Lys Cys Lys Thr  Leu Glu Glu 
              1250                 1255                 1260             
          Val Trp  Ala Cys Trp His Glu  Leu Leu Ser Tyr Leu  Glu Lys Ala 
              1265                 1270                 1275             
          Asn Lys  Trp Leu Asn Glu Val  Glu Phe Lys Leu Lys  Thr Thr Glu 
              1280                 1285                 1290             
          Asn Ile  Pro Gly Gly Ala Glu  Glu Ile Ser Glu Val  Leu Asp Ser 
              1295                 1300                 1305             
          Leu Glu  Asn Leu Met Arg His  Ser Glu Asp Asn Pro  Asn Gln Ile 
              1310                 1315                 1320             
          Arg Ile  Leu Ala Gln Thr Leu  Thr Asp Gly Gly Val  Met Asp Glu 
              1325                 1330                 1335             
          Leu Ile  Asn Glu Glu Leu Glu  Thr Phe Asn Ser Arg  Trp Arg Glu 
              1340                 1345                 1350             
          Leu His  Glu Glu Ala Val Arg  Arg Gln Lys Leu Leu  Glu Gln Ser 
              1355                 1360                 1365             
          Ile Gln  Ser Ala Gln Glu Thr  Glu Lys Ser Leu His  Leu Ile Gln 
              1370                 1375                 1380             
          Glu Ser  Leu Thr Phe Ile Asp  Lys Gln Leu Ala Ala  Tyr Ile Ala 
              1385                 1390                 1395             
          Asp Lys  Val Asp Ala Ala Gln  Met Pro Gln Glu Ala  Gln Lys Ile 
              1400                 1405                 1410             
          Gln Ser  Asp Leu Thr Ser His  Glu Ile Ser Leu Glu  Glu Met Lys 
              1415                 1420                 1425             
          Lys His  Asn Gln Gly Lys Glu  Ala Ala Gln Arg Val  Leu Ser Gln 
              1430                 1435                 1440             
          Ile Asp  Val Ala Gln Lys Lys  Leu Gln Asp Val Ser  Met Lys Phe 
              1445                 1450                 1455             
          Arg Leu  Phe Gln Lys Pro Ala  Asn Phe Glu Gln Arg  Leu Gln Glu 
              1460                 1465                 1470             
          Ser Lys  Met Ile Leu Asp Glu  Val Lys Met His Leu  Pro Ala Leu 
              1475                 1480                 1485             
          Glu Thr  Lys Ser Val Glu Gln  Glu Val Val Gln Ser  Gln Leu Asn 
              1490                 1495                 1500             
          His Cys  Val Asn Leu Tyr Lys  Ser Leu Ser Glu Val  Lys Ser Glu 
              1505                 1510                 1515             
          Val Glu  Met Val Ile Lys Thr  Gly Arg Gln Ile Val  Gln Lys Lys 
              1520                 1525                 1530             
          Gln Thr  Glu Asn Pro Lys Glu  Leu Asp Glu Arg Val  Thr Ala Leu 
              1535                 1540                 1545             
          Lys Leu  His Tyr Asn Glu Leu  Gly Ala Lys Val Thr  Glu Arg Lys 
              1550                 1555                 1560             
          Gln Gln  Leu Glu Lys Cys Leu  Lys Leu Ser Arg Lys  Met Arg Lys 
              1565                 1570                 1575             
          Glu Met  Asn Val Leu Thr Glu  Trp Leu Ala Ala Thr  Asp Met Glu 
              1580                 1585                 1590             
          Leu Thr  Lys Arg Ser Ala Val  Glu Gly Met Pro Ser  Asn Leu Asp 
              1595                 1600                 1605             
          Ser Glu  Val Ala Trp Gly Lys  Ala Thr Gln Lys Glu  Ile Glu Lys 
              1610                 1615                 1620             
          Gln Lys  Val His Leu Lys Ser  Ile Thr Glu Val Gly  Glu Ala Leu 
              1625                 1630                 1635             
          Lys Thr  Val Leu Gly Lys Lys  Glu Thr Leu Val Glu  Asp Lys Leu 
              1640                 1645                 1650             
          Ser Leu  Leu Asn Ser Asn Trp  Ile Ala Val Thr Ser  Arg Ala Glu 
              1655                 1660                 1665             
          Glu Trp  Leu Asn Leu Leu Leu  Glu Tyr Gln Lys His  Met Glu Thr 
              1670                 1675                 1680             
          Phe Asp  Gln Asn Val Asp His  Ile Thr Lys Trp Ile  Ile Gln Ala 
              1685                 1690                 1695             
          Asp Thr  Leu Leu Asp Glu Ser  Glu Lys Lys Lys Pro  Gln Gln Lys 
              1700                 1705                 1710             
          Glu Asp  Val Leu Lys Arg Leu  Lys Ala Glu Leu Asn  Asp Ile Arg 
              1715                 1720                 1725             
          Pro Lys  Val Asp Ser Thr Arg  Asp Gln Ala Ala Asn  Leu Met Ala 
              1730                 1735                 1740             
          Asn Arg  Gly Asp His Cys Arg  Lys Leu Val Glu Pro  Gln Ile Ser 
              1745                 1750                 1755             
          Glu Leu  Asn His Arg Phe Ala  Ala Ile Ser His Arg  Ile Lys Thr 
              1760                 1765                 1770             
          Gly Lys  Ala Ser Ile Pro Leu  Lys Glu Leu Glu Gln  Phe Asn Ser 
              1775                 1780                 1785             
          Asp Ile  Gln Lys Leu Leu Glu  Pro Leu Glu Ala Glu  Ile Gln Gln 
              1790                 1795                 1800             
          Gly Val  Asn Leu Lys Glu Glu  Asp Phe Asn Lys Asp  Met Asn Glu 
              1805                 1810                 1815             
          Asp Asn  Glu Gly Thr Val Lys  Glu Leu Leu Gln Arg  Gly Asp Asn 
              1820                 1825                 1830             
          Leu Gln  Gln Arg Ile Thr Asp  Glu Arg Lys Arg Glu  Glu Ile Lys 
              1835                 1840                 1845             
          Ile Lys  Gln Gln Leu Leu Gln  Thr Lys His Asn Ala  Leu Lys Asp 
              1850                 1855                 1860             
          Leu Arg  Ser Gln Arg Arg Lys  Lys Ala Leu Glu Ile  Ser His Gln 
              1865                 1870                 1875             
          Trp Tyr  Gln Tyr Lys Arg Gln  Ala Asp Asp Leu Leu  Lys Cys Leu 
              1880                 1885                 1890             
          Asp Asp  Ile Glu Lys Lys Leu  Ala Ser Leu Pro Glu  Pro Arg Asp 
              1895                 1900                 1905             
          Glu Arg  Lys Ile Lys Glu Ile  Asp Arg Glu Leu Gln  Lys Lys Lys 
              1910                 1915                 1920             
          Glu Glu  Leu Asn Ala Val Arg  Arg Gln Ala Glu Gly  Leu Ser Glu 
              1925                 1930                 1935             
          Asp Gly  Ala Ala Met Ala Val  Glu Pro Thr Gln Ile  Gln Leu Ser 
              1940                 1945                 1950             
          Lys Arg  Trp Arg Glu Ile Glu  Ser Lys Phe Ala Gln  Phe Arg Arg 
              1955                 1960                 1965             
          Leu Asn  Phe Ala Gln Ile His  Thr Val Arg Glu Glu  Thr Met Met 
              1970                 1975                 1980             
          Val Met  Thr Glu Asp Met Pro  Leu Glu Ile Ser Tyr  Val Pro Ser 
              1985                 1990                 1995             
          Thr Tyr  Leu Thr Glu Ile Thr  His Val Ser Gln Ala  Leu Leu Glu 
              2000                 2005                 2010             
          Val Glu  Gln Leu Leu Asn Ala  Pro Asp Leu Cys Ala  Lys Asp Phe 
              2015                 2020                 2025             
          Glu Asp  Leu Phe Lys Gln Glu  Glu Ser Leu Lys Asn  Ile Lys Asp 
              2030                 2035                 2040             
          Ser Leu  Gln Gln Ser Ser Gly  Arg Ile Asp Ile Ile  His Ser Lys 
              2045                 2050                 2055             
          Lys Thr  Ala Ala Leu Gln Ser  Ala Thr Pro Val Glu  Arg Val Lys 
              2060                 2065                 2070             
          Leu Gln  Glu Ala Leu Ser Gln  Leu Asp Phe Gln Trp  Glu Lys Val 
              2075                 2080                 2085             
          Asn Lys  Met Tyr Lys Asp Arg  Gln Gly Arg Phe Asp  Arg Ser Val 
              2090                 2095                 2100             
          Glu Lys  Trp Arg Arg Phe His  Tyr Asp Ile Lys Ile  Phe Asn Gln 
              2105                 2110                 2115             
          Trp Leu  Thr Glu Ala Glu Gln  Phe Leu Arg Lys Thr  Gln Ile Pro 
              2120                 2125                 2130             
          Glu Asn  Trp Glu His Ala Lys  Tyr Lys Trp Tyr Leu  Lys Glu Leu 
              2135                 2140                 2145             
          Gln Asp  Gly Ile Gly Gln Arg  Gln Thr Val Val Arg  Thr Leu Asn 
              2150                 2155                 2160             
          Ala Thr  Gly Glu Glu Ile Ile  Gln Gln Ser Ser Lys  Thr Asp Ala 
              2165                 2170                 2175             
          Ser Ile  Leu Gln Glu Lys Leu  Gly Ser Leu Asn Leu  Arg Trp Gln 
              2180                 2185                 2190             
          Glu Val  Cys Lys Gln Leu Ser  Asp Arg Lys Lys Arg  Leu Glu Glu 
              2195                 2200                 2205             
          Gln Lys  Asn Ile Leu Ser Glu  Phe Gln Arg Asp Leu  Asn Glu Phe 
              2210                 2215                 2220             
          Val Leu  Trp Leu Glu Glu Ala  Asp Asn Ile Ala Ser  Ile Pro Leu 
              2225                 2230                 2235             
          Glu Pro  Gly Lys Glu Gln Gln  Leu Lys Glu Lys Leu  Glu Gln Val 
              2240                 2245                 2250             
          Lys Leu  Leu Val Glu Glu Leu  Pro Leu Arg Gln Gly  Ile Leu Lys 
              2255                 2260                 2265             
          Gln Leu  Asn Glu Thr Gly Gly  Pro Val Leu Val Ser  Ala Pro Ile 
              2270                 2275                 2280             
          Ser Pro  Glu Glu Gln Asp Lys  Leu Glu Asn Lys Leu  Lys Gln Thr 
              2285                 2290                 2295             
          Asn Leu  Gln Trp Ile Lys Val  Ser Arg Ala Leu Pro  Glu Lys Gln 
              2300                 2305                 2310             
          Gly Glu  Ile Glu Ala Gln Ile  Lys Asp Leu Gly Gln  Leu Glu Lys 
              2315                 2320                 2325             
          Lys Leu  Glu Asp Leu Glu Glu  Gln Leu Asn His Leu  Leu Leu Trp 
              2330                 2335                 2340             
          Leu Ser  Pro Ile Arg Asn Gln  Leu Glu Ile Tyr Asn  Gln Pro Asn 
              2345                 2350                 2355             
          Gln Glu  Gly Pro Phe Asp Val  Lys Glu Thr Glu Ile  Ala Val Gln 
              2360                 2365                 2370             
          Ala Lys  Gln Pro Asp Val Glu  Glu Ile Leu Ser Lys  Gly Gln His 
              2375                 2380                 2385             
          Leu Tyr  Lys Glu Lys Pro Ala  Thr Gln Pro Val Lys  Arg Lys Leu 
              2390                 2395                 2400             
          Glu Asp  Leu Ser Ser Glu Trp  Lys Ala Val Asn Arg  Leu Leu Gln 
              2405                 2410                 2415             
          Glu Leu  Arg Ala Lys Gln Pro  Asp Leu Ala Pro Gly  Leu Thr Thr 
              2420                 2425                 2430             
          Ile Gly  Ala Ser Pro Thr Gln  Thr Val Thr Leu Val  Thr Gln Pro 
              2435                 2440                 2445             
          Val Val  Thr Lys Glu Thr Ala  Ile Ser Lys Leu Glu  Met Pro Ser 
              2450                 2455                 2460             
          Ser Leu  Met Leu Glu Val Pro  Ala Leu Ala Asp Phe  Asn Arg Ala 
              2465                 2470                 2475             
          Trp Thr  Glu Leu Thr Asp Trp  Leu Ser Leu Leu Asp  Gln Val Ile 
              2480                 2485                 2490             
          Lys Ser  Gln Arg Val Met Val  Gly Asp Leu Glu Asp  Ile Asn Glu 
              2495                 2500                 2505             
          Met Ile  Ile Lys Gln Lys Ala  Thr Met Gln Asp Leu  Glu Gln Arg 
              2510                 2515                 2520             
          Arg Pro  Gln Leu Glu Glu Leu  Ile Thr Ala Ala Gln  Asn Leu Lys 
              2525                 2530                 2535             
          Asn Lys  Thr Ser Asn Gln Glu  Ala Arg Thr Ile Ile  Thr Asp Arg 
              2540                 2545                 2550             
          Ile Glu  Arg Ile Gln Asn Gln  Trp Asp Glu Val Gln  Glu His Leu 
              2555                 2560                 2565             
          Gln Asn  Arg Arg Gln Gln Leu  Asn Glu Met Leu Lys  Asp Ser Thr 
              2570                 2575                 2580             
          Gln Trp  Leu Glu Ala Lys Glu  Glu Ala Glu Gln Val  Leu Gly Gln 
              2585                 2590                 2595             
          Ala Arg  Ala Lys Leu Glu Ser  Trp Lys Glu Gly Pro  Tyr Thr Val 
              2600                 2605                 2610             
          Asp Ala  Ile Gln Lys Lys Ile  Thr Glu Thr Lys Gln  Leu Ala Lys 
              2615                 2620                 2625             
          Asp Leu  Arg Gln Trp Gln Thr  Asn Val Asp Val Ala  Asn Asp Leu 
              2630                 2635                 2640             
          Ala Leu  Lys Leu Leu Arg Asp  Tyr Ser Ala Asp Asp  Thr Arg Lys 
              2645                 2650                 2655             
          Val His  Met Ile Thr Glu Asn  Ile Asn Ala Ser Trp  Arg Ser Ile 
              2660                 2665                 2670             
          His Lys  Arg Val Ser Glu Arg  Glu Ala Ala Leu Glu  Glu Thr His 
              2675                 2680                 2685             
          Arg Leu  Leu Gln Gln Phe Pro  Leu Asp Leu Glu Lys  Phe Leu Ala 
              2690                 2695                 2700             
          Trp Leu  Thr Glu Ala Glu Thr  Thr Ala Asn Val Leu  Gln Asp Ala 
              2705                 2710                 2715             
          Thr Arg  Lys Glu Arg Leu Leu  Glu Asp Ser Lys Gly  Val Lys Glu 
              2720                 2725                 2730             
          Leu Met  Lys Gln Trp Gln Asp  Leu Gln Gly Glu Ile  Glu Ala His 
              2735                 2740                 2745             
          Thr Asp  Val Tyr His Asn Leu  Asp Glu Asn Ser Gln  Lys Ile Leu 
              2750                 2755                 2760             
          Arg Ser  Leu Glu Gly Ser Asp  Asp Ala Val Leu Leu  Gln Arg Arg 
              2765                 2770                 2775             
          Leu Asp  Asn Met Asn Phe Lys  Trp Ser Glu Leu Arg  Lys Lys Ser 
              2780                 2785                 2790             
          Leu Asn  Ile Arg Ser His Leu  Glu Ala Ser Ser Asp  Gln Trp Lys 
              2795                 2800                 2805             
          Arg Leu  His Leu Ser Leu Gln  Glu Leu Leu Val Trp  Leu Gln Leu 
              2810                 2815                 2820             
          Lys Asp  Asp Glu Leu Ser Arg  Gln Ala Pro Ile Gly  Gly Asp Phe 
              2825                 2830                 2835             
          Pro Ala  Val Gln Lys Gln Asn  Asp Val His Arg Ala  Phe Lys Arg 
              2840                 2845                 2850             
          Glu Leu  Lys Thr Lys Glu Pro  Val Ile Met Ser Thr  Leu Glu Thr 
              2855                 2860                 2865             
          Val Arg  Ile Phe Leu Thr Glu  Gln Pro Leu Glu Gly  Leu Glu Lys 
              2870                 2875                 2880             
          Leu Tyr  Gln Glu Pro Arg Glu  Leu Pro Pro Glu Glu  Arg Ala Gln 
              2885                 2890                 2895             
          Asn Val  Thr Arg Leu Leu Arg  Lys Gln Ala Glu Glu  Val Asn Thr 
              2900                 2905                 2910             
          Glu Trp  Glu Lys Leu Asn Leu  His Ser Ala Asp Trp  Gln Arg Lys 
              2915                 2920                 2925             
          Ile Asp  Glu Thr Leu Glu Arg  Leu Gln Glu Leu Gln  Glu Ala Thr 
              2930                 2935                 2940             
          Asp Glu  Leu Asp Leu Lys Leu  Arg Gln Ala Glu Val  Ile Lys Gly 
              2945                 2950                 2955             
          Ser Trp  Gln Pro Val Gly Asp  Leu Leu Ile Asp Ser  Leu Gln Asp 
              2960                 2965                 2970             
          His Leu  Glu Lys Val Lys Ala  Leu Arg Gly Glu Ile  Ala Pro Leu 
              2975                 2980                 2985             
          Lys Glu  Asn Val Ser His Val  Asn Asp Leu Ala Arg  Gln Leu Thr 
              2990                 2995                 3000             
          Thr Leu  Gly Ile Gln Leu Ser  Pro Tyr Asn Leu Ser  Thr Leu Glu 
              3005                 3010                 3015             
          Asp Leu  Asn Thr Arg Trp Lys  Leu Leu Gln Val Ala  Val Glu Asp 
              3020                 3025                 3030             
          Arg Val  Arg Gln Leu His Glu  Ala His Arg Asp Phe  Gly Pro Ala 
              3035                 3040                 3045             
          Ser Gln  His Phe Leu Ser Thr  Ser Val Gln Gly Pro  Trp Glu Arg 
              3050                 3055                 3060             
          Ala Ile  Ser Pro Asn Lys Val  Pro Tyr Tyr Ile Asn  His Glu Thr 
              3065                 3070                 3075             
          Gln Thr  Thr Cys Trp Asp His  Pro Lys Met Thr Glu  Leu Tyr Gln 
              3080                 3085                 3090             
          Ser Leu  Ala Asp Leu Asn Asn  Val Arg Phe Ser Ala  Tyr Arg Thr 
              3095                 3100                 3105             
          Ala Met  Lys Leu Arg Arg Leu  Gln Lys Ala Leu Cys  Leu Asp Leu 
              3110                 3115                 3120             
          Leu Ser  Leu Ser Ala Ala Cys  Asp Ala Leu Asp Gln  His Asn Leu 
              3125                 3130                 3135             
          Lys Gln  Asn Asp Gln Pro Met  Asp Ile Leu Gln Ile  Ile Asn Cys 
              3140                 3145                 3150             
          Leu Thr  Thr Ile Tyr Asp Arg  Leu Glu Gln Glu His  Asn Asn Leu 
              3155                 3160                 3165             
          Val Asn  Val Pro Leu Cys Val  Asp Met Cys Leu Asn  Trp Leu Leu 
              3170                 3175                 3180             
          Asn Val  Tyr Asp Thr Gly Arg  Thr Gly Arg Ile Arg  Val Leu Ser 
              3185                 3190                 3195             
          Phe Lys  Thr Gly Ile Ile Ser  Leu Cys Lys Ala His  Leu Glu Asp 
              3200                 3205                 3210             
          Lys Tyr  Arg Tyr Leu Phe Lys  Gln Val Ala Ser Ser  Thr Gly Phe 
              3215                 3220                 3225             
          Cys Asp  Gln Arg Arg Leu Gly  Leu Leu Leu His Asp  Ser Ile Gln 
              3230                 3235                 3240             
          Ile Pro  Arg Gln Leu Gly Glu  Val Ala Ser Phe Gly  Gly Ser Asn 
              3245                 3250                 3255             
          Ile Glu  Pro Ser Val Arg Ser  Cys Phe Gln Phe Ala  Asn Asn Lys 
              3260                 3265                 3270             
          Pro Glu  Ile Glu Ala Ala Leu  Phe Leu Asp Trp Met  Arg Leu Glu 
              3275                 3280                 3285             
          Pro Gln  Ser Met Val Trp Leu  Pro Val Leu His Arg  Val Ala Ala 
              3290                 3295                 3300             
          Ala Glu  Thr Ala Lys His Gln  Ala Lys Cys Asn Ile  Cys Lys Glu 
              3305                 3310                 3315             
          Cys Pro  Ile Ile Gly Phe Arg  Tyr Arg Ser Leu Lys  His Phe Asn 
              3320                 3325                 3330             
          Tyr Asp  Ile Cys Gln Ser Cys  Phe Phe Ser Gly Arg  Val Ala Lys 
              3335                 3340                 3345             
          Gly His  Lys Met His Tyr Pro  Met Val Glu Tyr Cys  Thr Pro Thr 
              3350                 3355                 3360             
          Thr Ser  Gly Glu Asp Val Arg  Asp Phe Ala Lys Val  Leu Lys Asn 
              3365                 3370                 3375             
          Lys Phe  Arg Thr Lys Arg Tyr  Phe Ala Lys His Pro  Arg Met Gly 
              3380                 3385                 3390             
          Tyr Leu  Pro Val Gln Thr Val  Leu Glu Gly Asp Asn  Met Glu Thr 
              3395                 3400                 3405             
          Pro Val  Thr Leu Ile Asn Phe  Trp Pro Val Asp Ser  Ala Pro Ala 
              3410                 3415                 3420             
          Ser Ser  Pro Gln Leu Ser His  Asp Asp Thr His Ser  Arg Ile Glu 
              3425                 3430                 3435             
          His Tyr  Ala Ser Arg Leu Ala  Glu Met Glu Asn Ser  Asn Gly Ser 
              3440                 3445                 3450             
          Tyr Leu  Asn Asp Ser Ile Ser  Pro Asn Glu Ser Ile  Asp Asp Glu 
              3455                 3460                 3465             
          His Leu  Leu Ile Gln His Tyr  Cys Gln Ser Leu Asn  Gln Asp Ser 
              3470                 3475                 3480             
          Pro Leu  Ser Gln Pro Arg Ser  Pro Ala Gln Ile Leu  Ile Ser Leu 
              3485                 3490                 3495             
          Glu Ser  Glu Glu Arg Gly Glu  Leu Glu Arg Ile Leu  Ala Asp Leu 
              3500                 3505                 3510             
          Glu Glu  Glu Asn Arg Asn Leu  Gln Ala Glu Tyr Asp  Arg Leu Lys 
              3515                 3520                 3525             
          Gln Gln  His Glu His Lys Gly  Leu Ser Pro Leu Pro  Ser Pro Pro 
              3530                 3535                 3540             
          Glu Met  Met Pro Thr Ser Pro  Gln Ser Pro Arg Asp  Ala Glu Leu 
              3545                 3550                 3555             
          Ile Ala  Glu Ala Lys Leu Leu  Arg Gln His Lys Gly  Arg Leu Glu 
              3560                 3565                 3570             
          Ala Arg  Met Gln Ile Leu Glu  Asp His Asn Lys Gln  Leu Glu Ser 
              3575                 3580                 3585             
          Gln Leu  His Arg Leu Arg Gln  Leu Leu Glu Gln Pro  Gln Ala Glu 
              3590                 3595                 3600             
          Ala Lys  Val Asn Gly Thr Thr  Val Ser Ser Pro Ser  Thr Ser Leu 
              3605                 3610                 3615             
          Gln Arg  Ser Asp Ser Ser Gln  Pro Met Leu Leu Arg  Val Val Gly 
              3620                 3625                 3630             
          Ser Gln  Thr Ser Asp Ser Met  Gly Glu Glu Asp Leu  Leu Ser Pro 
              3635                 3640                 3645             
          Pro Gln  Asp Thr Ser Thr Gly  Leu Glu Glu Val Met  Glu Gln Leu 
              3650                 3655                 3660             
          Asn Asn  Ser Phe Pro Ser Ser  Arg Gly Arg Asn Thr  Pro Gly Lys 
              3665                 3670                 3675             
          Pro Met  Arg Glu Asp Thr Met  
              3680                 3685 
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  335]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；突變體spc5-12啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
          agaggccgtc cgccctcggc accatcctca cgacacccaa atatggcgac gggtgaggaa       60
          tggtggggag ttatttttag agcggtgagg aaggtgggca ggcagcaggt gttggcgctc      120
          catatttggc gggagttatt tttagagcgg aggaatggtg gacacccaaa tatggcgacg      180
          gttcctcacc cgtcgctaaa aataactccg tgtccgccct cggccggggc cgcattcctg      240
          ggggccgggc ggtgctcccg cccgcctcga taaaaggctc cggggccggc ggcggcccac      300
          gagctacccg gaggagcggg aggcgccaag cggaa                                 335
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<211>  328]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體；突變體spc5-12啟動子]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
          ggccgtccgc cctcggcacc atcctcacga cacccaaata tggcgacggg tgaggaatgg       60
          tggggagtta tttttagagc ggtgaggaag gtgggcaggc agcaggtgtt gggggagtta      120
          tttttagagc ggggagttat ttttagagcg gaggaatggt ggacacccaa atatggcgac      180
          ggttcctcac ggacacccaa atatggcgac gggccctcgg ccggggccgc attcctgggg      240
          gccgggcggt gctcccgccc gcctcgataa aaggctccgg ggccggcggc ggcccacgag      300
          ctacccggag gagcgggagg cgccaagc                                         328
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086
Figure 12_A0101_SEQ_0087
Figure 12_A0101_SEQ_0088
Figure 12_A0101_SEQ_0089
Figure 12_A0101_SEQ_0090
Figure 12_A0101_SEQ_0091
Figure 12_A0101_SEQ_0092
Figure 12_A0101_SEQ_0093
Figure 12_A0101_SEQ_0094
Figure 12_A0101_SEQ_0095
Figure 12_A0101_SEQ_0096
Figure 12_A0101_SEQ_0097
Figure 12_A0101_SEQ_0098
Figure 12_A0101_SEQ_0099
Figure 12_A0101_SEQ_0100
Figure 12_A0101_SEQ_0101
Figure 12_A0101_SEQ_0102
Figure 12_A0101_SEQ_0103
Figure 12_A0101_SEQ_0104
Figure 12_A0101_SEQ_0105
Figure 12_A0101_SEQ_0106
Figure 12_A0101_SEQ_0107
Figure 12_A0101_SEQ_0108
Figure 12_A0101_SEQ_0109
Figure 12_A0101_SEQ_0110
Figure 12_A0101_SEQ_0111
Figure 12_A0101_SEQ_0112
Figure 12_A0101_SEQ_0113
Figure 12_A0101_SEQ_0114
Figure 12_A0101_SEQ_0115
Figure 12_A0101_SEQ_0116
Figure 12_A0101_SEQ_0117
Figure 12_A0101_SEQ_0118
Figure 12_A0101_SEQ_0119

Claims (31)

  1. 一種用於治療有需要之個體之肌縮蛋白症的醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑， 其中該rAAV粒子包含人工基因體，其包含編碼微小肌縮蛋白蛋白質之轉殖基因，該微小肌縮蛋白蛋白質由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分，該轉殖基因可操作地連接至促進在肌肉中表現的調節元件且側接AAV ITR序列；及 其中該治療有效量之該rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/kg之劑量靜脈內或肌肉內給藥。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該CT包含以下或由以下組成：肌縮蛋白之C端的近端194個胺基酸或編碼SEQ ID NO:92 (UniProtKB-P11532)之人類肌縮蛋白胺基酸殘基3361-3554之C端的至少近端部分或由外顯子70至74編碼之C端的至少近端部分及由外顯子75之核苷酸序列編碼之胺基酸序列的前36個胺基酸。
  3. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列。
  4. 如請求項3之醫藥組合物，其中該微小肌縮蛋白蛋白質係由SEQ ID NO: 20之核苷酸序列編碼。
  5. 如請求項1之醫藥組合物，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO: 79之胺基酸序列。
  6. 如請求項5之醫藥組合物，其中該微小肌縮蛋白蛋白質係由SEQ ID NO: 81之核苷酸序列編碼。
  7. 如請求項1至6中任一項之醫藥組合物，其中該肌肉特異性啟動子為SPc5-12或其轉錄活性部分或突變體。
  8. 如請求項7之醫藥組合物，其中該啟動子由SEQ ID NO: 39之核酸序列組成。
  9. 如請求項1至8中任一項之醫藥組合物，其中該轉殖基因包含在編碼該微小肌縮蛋白蛋白質之核酸序列的3'的聚腺苷酸化訊號。
  10. 如請求項1至9中任一項之醫藥組合物，其中該人工基因體包含SEQ ID NO: 53之核酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之醫藥組合物，其中該rAAV為AAV8血清型。
  12. 如請求項1至11中任一項之醫藥組合物，其中該肌縮蛋白症為杜興氏肌肉失養症(DMD)、貝氏肌肉失養症(BMD)或X性聯擴張型心肌病變。
  13. 如請求項1至12中任一項之醫藥組合物，其中該治療有效量之該rAAV粒子係以1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量靜脈內給藥。
  14. 如請求項1至12中任一項之醫藥組合物，其中該rAAV粒子為AAV8-RGX-DYS1且係以1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量靜脈內給藥。
  15. 如請求項1至14中任一項之醫藥組合物，其中截至該給藥之後12週、24週、1年或2年， a.該個體中之肌酸激酶活性相對於在該給藥之前的含量在該個體中降低0.5倍至1.5倍； b.該個體之腓肚肌中之病變與在該給藥之前該腓肚肌中之該等病變相比降低3-10%，經藉由磁共振成像(MRI)所評定； c.該個體之腓肚肌體積與在該給藥之前該腓肚肌體積相比降低20至100 mm 3； d.該個體之腓肚肌中之病變的T2-鬆弛時間與在該給藥之前該T2-鬆弛時間相比降低2至8毫秒； e.該個體展現出約-1至2之步態評分； f.該個體之北極星移動評量表(NSAA)評分與在該給藥之前該NSAA評分相比增加0至1、0至2或1至2； g.該個體站立、跑步/步行10公尺及/或爬4階樓梯所花費的時間量降低至少5%、10%、20%或30%； h.該個體展現出與在該給藥之前的心臟功能相比之心臟功能改善；及/或 i.該個體展現出與在該給藥之前的心臟功能相比之肺部功能改善。
  16. 一種用於降低有需要之個體之肌肉中之炎症及/或纖維化的醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑， 其中該rAAV粒子包含人工基因體，其包含編碼微小肌縮蛋白蛋白質之轉殖基因，該微小肌縮蛋白蛋白質由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分，該轉殖基因可操作地連接至促進在肌肉中表現的調節元件且側接AAV ITR序列； 其中該治療有效量之該rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/公斤(GC/kg)之劑量靜脈內或肌肉內給藥；及 其中該給藥使得該微小肌縮蛋白蛋白質遞送至該個體之該肌肉中。
  17. 一種用於降低有需要之個體之肌肉退化的醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑， 其中該rAAV粒子包含人工基因體，其包含編碼微小肌縮蛋白蛋白質之轉殖基因，該微小肌縮蛋白蛋白質由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分，該轉殖基因可操作地連接至促進在肌肉中表現的調節元件且側接AAV ITR序列； 其中該治療有效量之該rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/公斤(GC/kg)之劑量靜脈內或肌肉內給藥，及 其中該給藥使得該微小肌縮蛋白蛋白質遞送至該個體之該肌肉中。
  18. 一種用於改變有需要之個體之步態的醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑， 其中該rAAV粒子包含人工基因體，其包含編碼微小肌縮蛋白蛋白質之轉殖基因，該微小肌縮蛋白蛋白質由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分，該轉殖基因可操作地連接至促進在肌肉中表現的調節元件且側接AAV ITR序列； 其中該治療有效量之rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/公斤(GC/kg)之劑量靜脈內或肌肉內給藥；及 其中在該給藥之後12週時，該個體之該步態與在該給藥之前該個體之該步態相比得以改變。
  19. 一種用於在有需要之個體中治療肌縮蛋白症、降低肌肉中之炎症及/或纖維化、降低肌肉退化或改變步態的醫藥組合物，該醫藥組合物包含治療有效量之rAAV粒子及醫藥學上可接受之載劑： 其中該rAAV粒子包含人工基因體，其包含編碼微小肌縮蛋白蛋白質之轉殖基因，該微小肌縮蛋白蛋白質由自胺基端至羧基端排列之肌縮蛋白域組成：ABD-H1-R1-R2-R3-H3-R24-H4-CR-CT，其中ABD為肌縮蛋白之肌動蛋白結合域，H1為肌縮蛋白之鉸鏈1區域，R1為肌縮蛋白之血影蛋白1區域，R2為肌縮蛋白之血影蛋白2區域，R3為肌縮蛋白之血影蛋白3區域，H3為肌縮蛋白之鉸鏈3區域，R24為肌縮蛋白之血影蛋白24區域，H4為肌縮蛋白之鉸鏈4區域，CR為肌縮蛋白之富含半胱胺酸區域及CT包含含有α1-互生蛋白結合位點之CT之至少一部分，該轉殖基因可操作地連接至促進在肌肉中表現的調節元件且側接AAV ITR序列； 其中該治療有效量之該rAAV粒子係以5×10 13至1×10 15個基因體複本/公斤(GC/kg)之劑量靜脈內或肌肉內給藥；及 其中在該給藥之後12週時，該給藥在該個體之肌肉組織中產生大於50 ng/mg微小肌縮蛋白蛋白質，經藉由基於毛細管之西方分析所確定。
  20. 如請求項16至19中任一項之醫藥組合物，其中該CT包含以下或由以下組成：肌縮蛋白之C端的近端194個胺基酸或編碼SEQ ID NO:92 (UniProtKB-P11532)之人類肌縮蛋白胺基酸殘基3361-3554之C端的至少近端部分或由外顯子70至74編碼之C端的至少近端部分及由外顯子75之核苷酸序列編碼之胺基酸序列的前36個胺基酸。
  21. 如請求項16至20中任一項之醫藥組合物，其中該微小肌縮蛋白蛋白質具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列。
  22. 如請求項21之醫藥組合物，其中該微小肌縮蛋白蛋白質係由SEQ ID NO: 20之核酸序列編碼。
  23. 如請求項22之醫藥組合物，其中該轉譯調節元件包含肌肉特異性啟動子。
  24. 如請求項23之醫藥組合物，其中該啟動子由SEQ ID NO: 39之核酸序列組成。
  25. 如請求項16至24中任一項之醫藥組合物，其中該人工基因體包含SEQ ID NO: 53之核苷酸序列。
  26. 如請求項16至25中任一項之醫藥組合物，其中該rAAV為AAV8血清型。
  27. 如請求項16至26中任一項之醫藥組合物，其中該治療有效量之該rAAV粒子係以1×10 14個基因體複本/kg、2×10 14個基因體複本/kg或3×10 14個基因體複本/kg之劑量靜脈內給藥。
  28. 如請求項1至27中任一項之醫藥組合物，其進一步包含在該給藥該AAV粒子之前、與其同時及/或之後向該個體預防性給藥免疫抑制劑療法。
  29. 如請求項28之醫藥組合物，其中該免疫抑制劑療法為普賴蘇穠(prednisolone)、艾庫組單抗(eculizumab)或西羅莫司(sirolimus)或其組合。
  30. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之重組腺相關載體(rAAV)粒子及醫藥學上可接受之載劑，其中該rAAV粒子為重組AAV8，其包含含有SEQ ID NO: 53之核苷酸序列的人工基因體。
  31. 如請求項30之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之載劑包含經改良達爾伯克磷酸鹽緩衝鹽水(modified Dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS)與蔗糖緩衝液，包含0.2 g/L氯化鉀、0.2 g/L磷酸二氫鉀、1.2 g/L無水磷酸氫二鈉、5.8 g/L氯化鈉、40 g/L蔗糖及0.01 g/L泊洛沙姆188，pH 7.4。
TW111115911A 2021-04-26 2022-04-26 用於治療肌縮蛋白症(dystrophinopathy)之微小肌縮蛋白基因療法給藥 TW202309293A (zh)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163180064P 2021-04-26 2021-04-26
US63/180,064 2021-04-26
US202163245909P 2021-09-19 2021-09-19
US63/245,909 2021-09-19
US202263314436P 2022-02-27 2022-02-27
US63/314,436 2022-02-27
US202263319363P 2022-03-13 2022-03-13
US63/319,363 2022-03-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202309293A true TW202309293A (zh) 2023-03-01

Family

ID=81654620

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111115911A TW202309293A (zh) 2021-04-26 2022-04-26 用於治療肌縮蛋白症(dystrophinopathy)之微小肌縮蛋白基因療法給藥

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4329821A1 (zh)
JP (1) JP2024517143A (zh)
KR (1) KR20240004564A (zh)
BR (1) BR112023021999A2 (zh)
CA (1) CA3216744A1 (zh)
IL (1) IL307902A (zh)
TW (1) TW202309293A (zh)
WO (1) WO2022232141A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202346590A (zh) * 2022-03-13 2023-12-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 經修飾之肌肉特異性啟動子

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU781958C (en) 1999-08-09 2006-03-30 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms intrastrand base pairs
NZ532635A (en) 2001-11-13 2007-05-31 Univ Pennsylvania A method of identifying unknown adeno-associated virus (AAV) sequences and a kit for the method
PT1453547T (pt) 2001-12-17 2016-12-28 Univ Pennsylvania Sequências do vírus adeno-associado (aav) do serotipo 8, vetores contendo as mesmas, e utilizações destas
ES2648241T3 (es) 2003-09-30 2017-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos
US7183969B2 (en) 2004-12-22 2007-02-27 Raytheon Company System and technique for calibrating radar arrays
ES2525067T3 (es) 2005-04-07 2014-12-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Método de incremento de la función de un vector de AAV
JP4495210B2 (ja) 2005-06-09 2010-06-30 パナソニック株式会社 振幅誤差補償装置及び直交度誤差補償装置
WO2008088895A2 (en) * 2007-01-18 2008-07-24 University Of Missouri-Columbia Synthetic mini/micro-dystrophin genes to restore nnos to the sarcolemma
US8642314B2 (en) 2008-02-19 2014-02-04 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) B.V. Optimization of expression of parvoviral rep and cap proteins in insect cells
PL2425000T3 (pl) 2009-04-30 2019-08-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Kompozycje do kierowania komórek przewodzących do dróg oddechowych zawierające konstrukty wirusów związanych z adenowirusami
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
US8927514B2 (en) 2010-04-30 2015-01-06 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment
US8628966B2 (en) 2010-04-30 2014-01-14 City Of Hope CD34-derived recombinant adeno-associated vectors for stem cell transduction and systemic therapeutic gene transfer
WO2012057363A1 (ja) 2010-10-27 2012-05-03 学校法人自治医科大学 神経系細胞への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン
US9409953B2 (en) 2011-02-10 2016-08-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Viral vectors with modified transduction profiles and methods of making and using the same
PL3254703T3 (pl) 2011-04-22 2020-10-05 The Regents Of The University Of California Wiriony wirusa towarzyszącego adenowirusom z różnymi kapsydami i sposoby ich zastosowania
EP3795581A3 (en) 2011-08-24 2021-06-09 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University New avv capsid proteins for nucleic acid transfer
JP6385920B2 (ja) 2012-05-09 2018-09-05 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティー アデノ随伴ウイルスプラスミド及びベクター
AU2014244167A1 (en) 2013-03-13 2015-10-08 The Children's Hospital Of Philadelphia Adeno-associated virus vectors and methods of use thereof
KR102268473B1 (ko) 2013-04-20 2021-06-25 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 엑손 2-표적 U7snRNA 폴리뉴클레오티드 작제물의 재조합형 아데노 부속 바이러스 전달
WO2015013313A2 (en) 2013-07-22 2015-01-29 The Children's Hospital Of Philadelphia Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues
WO2015038958A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 California Institute Of Technology Selective recovery
HUE052676T2 (hu) 2013-10-11 2021-05-28 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Eljárások õsi vírusszekvenciák elõrejelzésére és alkalmazásaik
US10746742B2 (en) 2014-04-25 2020-08-18 Oregon Health & Science University Methods of viral neutralizing antibody epitope mapping
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
ES2856090T3 (es) 2014-09-24 2021-09-27 Hope City Variantes de vectores de virus adenoasociados para la edición genómica de alta eficacia y sus métodos
SG11201705324UA (en) * 2015-01-16 2017-07-28 Univ Washington Novel micro-dystrophins and related methods of use
GB201507842D0 (en) * 2015-05-07 2015-06-17 New Royal Holloway & Bedford Production of large-sized microdystrophins in an AAV-based vector configuration
JP6665466B2 (ja) 2015-09-26 2020-03-13 日亜化学工業株式会社 半導体発光素子及びその製造方法
WO2017070491A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Applied Genetic Technologies Corporation Ophthalmic formulations
CA3086942A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Genethon Hybrid regulatory elements
US20230270886A1 (en) * 2019-11-28 2023-08-31 Regenxbio Inc. Microdystrophin gene therapy constructs and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024517143A (ja) 2024-04-19
CA3216744A1 (en) 2022-11-03
BR112023021999A2 (pt) 2023-12-26
EP4329821A1 (en) 2024-03-06
WO2022232141A1 (en) 2022-11-03
KR20240004564A (ko) 2024-01-11
IL307902A (en) 2023-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230270886A1 (en) Microdystrophin gene therapy constructs and uses thereof
US10286085B2 (en) Compositions and methods for treatment of muscular dystrophy
US10301367B2 (en) Compositions and methods for treatment of muscular dystrophy
US20210340565A1 (en) Methods and pharmaceutical composition for the treatment and the prevention of cardiomyopathy due to energy failure
JP5575486B2 (ja) 筋鞘にｎＮＯＳを回復させる合成ミニ／ミクロジストロフィン遺伝子
RU2764919C2 (ru) Оптимизированные гены и экспрессионные кассеты cln1, и их применение
TW202309293A (zh) 用於治療肌縮蛋白症(dystrophinopathy)之微小肌縮蛋白基因療法給藥
EP4337267A1 (en) Treatment of duchenne muscular dystrophy and combinations thereof
TW202206447A (zh) 具血影蛋白(spectrin)融合結構域之微型化肌肉萎縮蛋白及其用途
IL293334A (en) Gene therapy constructs with microdystrophin and their uses
AU2022313258A1 (en) Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease
WO2023212643A1 (en) Method for expressing a muscle-specific gene and cassettes for same
WO2024020574A2 (en) Auf1 gene therapy for limb girdle muscular dystrophy
NZ710497B2 (en) Methods and pharmaceutical composition for the treatment and the prevention of cardiomyopathy due to energy failure
Steffen et al. Duchenne and Becker Muscular Dystrophies