JP6042825B2 - 改変された形質導入プロファイルを有するウイルスベクターならびにその製造および使用の方法 - Google Patents

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Description

優先権の申立
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）の下で、その全内容が引用することにより本明細書の一部をなすものとする２０１１年２月１０日出願の米国仮特許出願第６１／４４１，４１１号の利益を主張する。
政府支援の明示
本発明の態様は、国立衛生研究所からの助成金第ＨＬ０８９２２１号の下で資金提供されたものである。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の改変されたカプシドタンパク質、ならびにそれを含むウイルスカプシドおよびウイルスベクターに関する。特に、本発明は、対象の１または複数の標的組織に関して所望の形質導入プロファイルを付与するためにウイルスベクター中に組み込まれ得る、改変されたＡＡＶカプシドタンパク質およびそれを含むカプシドに関する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いた臨床的遺伝子移入は、近年迅速に勢いが高まっている。作業台からベッドサイドへの（ｂｅｎｃｈ−ｔｏ−ｂｅｄｓｉｄｅ）進行中の転換は、複数の種にわたる多様な組織トロピズムを示す多用途のＡＡＶツールキットの利用可能性によって、幾分拍車がかかっている［１、２］。多数のＡＡＶ単離体のうち、ＡＡＶ９ベクターは、静脈内投与後に全身性の複数臓器形質導入プロファイルを示す［３］。心臓および肝臓における、ＡＡＶ９ベクターによって媒介される遺伝子発現の迅速な開始および高い導入遺伝子発現レベルが報告されている［４、５、６］。さらに、血管内投与後の、新生児マウスのニューロンおよび新生児イヌの骨格筋の、効率的な形質導入が観察されている［７、８］。これらの特質により、ＡＡＶ９は、リソソーム蓄積症などの全身性疾患における治療的遺伝子移入の実行可能な候補になっている。
逆説的ではあるが、広範囲の臨床的に適した適用が、複数臓器の遺伝子発現ではなく特定の組織での遺伝子発現を標的化するベクターから利益を受けている。例えば、心疾患または筋ジストロフィーの遺伝子療法は、心臓および／または骨格筋への効率的かつ選択的な遺伝子移入が可能なベクターによって促進される［６、８、９］。肝臓または骨格筋を標的化する治療アプローチは血友病性障害の治療に好ましく［１０］、一方で肺は、α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏症の遺伝子療法のための標的臓器とみなされている［１１、１２］。
本発明者は、例えば形質導入プロファイルに関して、所望の特徴を有する核酸送達ベクターに関する当該分野での必要性に取り組む。
一態様では、本発明は、カプシドタンパク質が、アミノ酸領域４９８〜５０４、５９０〜５９５および／または５８２〜５８７中の１または複数のアミノ酸における変異を含み、この１または複数の変異が、対照と比較して減少した肝臓形質導入の表現型を生じる、アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）またはクレードＦアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質（例えば、この１もしくは複数の変異を欠くＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質）を提供する。
さらなる態様では、本発明は、カプシドタンパク質が、アミノ酸領域４９８〜５０４、５９０〜５９５および／または５８２〜５８７中の１または複数のアミノ酸における変異を含み、この１もしくは複数の変異が、対照と比較して低下したグリカン結合親和性の表現型を生じる、アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）またはクレードＦアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質（例えば、この１もしくは複数の変異を欠くＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質）を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明のＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシド（例えばＡＡＶカプシド）を提供する。
さらに、本発明のウイルスカプシド（例えばＡＡＶカプシド）；および少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸、を含むウイルスベクターが本明細書中で提供され、この核酸は、ＡＡＶカプシドによってカプシド封入されている。
本発明は、薬学的に許容される担体中に本発明のウイルスベクターを含む組成物もまた提供する。
さらなる態様では、本発明は、細胞を本発明のウイルスベクターおよび／または本発明の組成物と接触させるステップを含む、細胞中に核酸を導入する方法を提供する。
また、本発明のウイルスベクターおよび／または本発明の組成物を対象に投与するステップを含む、対象（例えばヒト対象）に核酸を送達する方法が本明細書中で提供される。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下に示す発明の説明においてより詳細に扱われる。
ＡＡＶ９カプシドライブラリーの構造分析を示す図である。（Ａ）鋳型として機能するＡＶＶ８の結晶構造（ｐｄｂ ｉｄ：２ＱＡ０）と共にＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬを使用して得られたＡＡＶ９ ＶＰ３サブユニットモノマーの漫画表示。アミノ酸３９０〜６２７（ＶＰ１の番号付け）を含むＧＨループを赤色に着色する。（Ｂ）ＶＩＰＥＲｄｂでＴ＝１正二十面体対称座標を使用して生成された６０個のＶＰ３サブユニットを有するＡＡＶ９カプシドモデルの表面レンダリング。正二十面体五回ポアを取り囲み、三回対称軸で互いにかみ合った異なるＶＰ３サブユニット由来のＧＨループ領域を赤色で強調する。（Ｃ）赤色の球で示されるＡＡＶ９ライブラリー由来の４３個の代表的クローンの点変異を用いてＶＩＰＥＲｄｂで生成されたＡＡＶ９ ＶＰ３サブユニットトリマーの漫画。（Ｄ）外側のループ上にクラスター化した点変異（赤色の球）の大部分を示すカプシドトリマーの側面図（９０°回転）。（Ｅ）カプシドトリマー領域内の表面残基の球状ロードマップ投影。赤色で強調した残基は、カプシド表面上に主に位置する変更された残基を含む１０個のＡＡＶ９バリアントのサブセットを示す。 ＣＢＡ−ｌｕｃ導入遺伝子カセットをパッケージングするベクターの投与の４週間後の生きた動物の生物発光画像を示す図である。親ＡＡＶ９ベクターに対して（Ａ）変更されたおよび（Ｂ）変更されていない形質導入プロファイルを示すＡＡＶ９バリアントで処理したマウスのパネルが示される。画像（それぞれｎ＝３）を、ＣＣＤカメラを備えたＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａシステムを使用して１分間の露光で得た。尺度は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して決定した相対的光単位を示す。 種々の組織型；心臓、肝臓、骨格筋（腓腹筋）、肺および脳における注射の４週間後の、ルシフェラーゼ導入遺伝子発現レベル（Ａ）およびベクターゲノムコピー数（Ｂ）の定量を示す図である。欠損バリアント９．１１および９．４７（黒色のバー）は機能的サブタイプＩに分類され；肝臓脱標的化バリアント９．２４、９．４５および９．６１（白色のバー）は機能的サブタイプＩＩに分類され；ＡＡＶ９とほぼ類似したバリアント（灰色のバー）は機能的サブタイプＩＩＩに割り当てられる。ルシフェラーゼ発現レベルを、総組織タンパク質濃度に対して正規化し、データを相対的光単位として示す。ベクターゲノムコピー数を、ゲノムＤＮＡ １μｇ当たりに正規化する。全ての実験を三連で実施した。エラーバーは標準偏差を示す。 心臓（Ａ）および肝臓（Ｂ）におけるＡＡＶ９ベクターおよびＡＡＶ９．４５ベクター（５×１０１０ｖｇ／マウス）の静脈内投与後のルシフェラーゼ導入遺伝子発現レベルの時間経過を示す図である。１週目（灰色のバー）、２週目（白色のバー）および４週目（暗灰色のバー）に決定したルシフェラーゼ発現レベルを、総組織タンパク質濃度に対して正規化し、データを相対的光単位として示す。全ての実験を三連で実施した。エラーバーは標準偏差を示す。 心臓（Ａ）および肝臓（Ｂ）におけるルシフェラーゼ導入遺伝子発現レベルに対するベクター用量の影響を示す図である。親ＡＡＶ９ベクターおよびＡＡＶ９．４５ベクターを、低い（１×１０１０ｖｇ／マウス）、中程度の（５×１０１０ｖｇ／マウス）および高い（１×１０１１ｖｇ／マウス）用量で静脈内投与した。ルシフェラーゼ発現アッセイを、投与の２週間後に実施し、総組織タンパク質濃度に対して正規化した。データを相対的光単位として示し、全ての実験を三連で実施した。エラーバーは標準偏差を示す。 心臓および肝臓における親ＡＡＶ９およびバリアントの形質導入プロファイルの比較を示す図である。ルシフェラーゼ発現レベル（Ａ）およびベクターゲノムコピー数（Ｂ）についての心臓対肝臓比を、平均値から導出した。バリアント９．４５（白色のバー）は、高い心臓対肝臓発現およびｖｇ比を実証し、対応して高い肝臓脱標的化効率を実証する。バリアント９．６８は、親ＡＡＶ９ベクターよりも低い心臓対肝臓比を示し、従って、優先的な肝臓形質導入を示す。（Ｃ）ＣＢＡ−ｔｄＴｏｍａｔｏカセットをパッケージングするＡＡＶ９ベクターまたはＡＡＶ９．４５ベクターを注射したマウス由来の心臓、肝臓および骨格筋（腓腹筋）の組織切片の蛍光顕微鏡写真。画像は、Ｈａｍａｍａｔｓｕデジタルカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して、２０×（肝臓）または１０×（心臓および骨格筋）の拡大率で得た。未処置のマウス由来の組織切片を対照として示す。全ての実験を二連で実施した。 ＡＡＶ９肝臓トロピズムに関与する残基の推定クラスターを示す図である。ＡＡＶ９カプシドトリマー領域内の表面残基の球状ロードマップ投影を、本明細書中に記載されるように創出した。赤色で強調した重要な残基には、それぞれ異なるサブタイプに分類される変異に由来する、Ｎ４９８、Ｗ５０３（９．４５／９．６１、９．２４）；Ｑ５９０Ｌ（９．１１）およびＰ５０４（９．６８）が含まれる。このクラスターの残基の操作は、ＡＡＶ９肝臓トロピズムを変更し、ＡＡＶ９カプシド表面上の部分的受容体フットプリントを構成し得る。 ＡＡＶ９ならびに各機能的サブタイプＡＡＶ９．４７（Ｉ）、ＡＡＶ９．４５（ＩＩ）およびＡＡＶ９．６８（ＩＩＩ）由来の代表的バリアントの血液循環プロファイルを示す図である。血液中のベクターゲノムコピー数を、ＣＢＡ−ｌｕｃカセットをパッケージングするＡＡＶ９および関連のバリアントの粒子１×１０１０を静脈内投与した後の異なる時間間隔で決定した。注射１時間後、２４時間後および４８時間後に、１０μｌの全血をヘパリン化キャピラリーチューブ中に尾静脈から収集し、ウイルスＤＮＡをｑＰＣＲによって定量した。ベクターゲノムコピー数を、全血１ｍＬ当たりに正規化する。全ての実験を三連で実施した。エラーバーは標準偏差を示す。 Ｌｅｃ２細胞表面上のＡＡＶ９変異体の結合曲線を示す図である。（Ａ）ＡＡＶ９対９．２４。（Ｂ）ＡＡＶ９対９．４５。（Ｃ）ＡＡＶ９対９．６１。（Ｄ）ＡＡＶ９対９．９８。 Ｌｅｃ２細胞表面上のＡＡＶ９変異体の結合能を示す図である。
本発明は、本発明の代表的実施形態が示された添付の図面を参照してここに記載される。しかし本発明は、異なる形態で具体化してもよく、本明細書中に示される実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的かつ完全となり、本発明の範囲を当業者に完全に伝達するように提供されるものである。
特に規定しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で発明の説明において使用される術語は、特定の実施形態だけを記載することを目的としており、本発明を限定することを意図しない。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
発明の説明および添付の特許請求の範囲におけるＡＡＶカプシドタンパク質中の全てのアミノ酸位置の指定は、ＡＡＶ９のＶＰ１カプシドサブユニットの番号付けに対してのものである（ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号ＡＹ５３０５７９．１；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号ＡＡＳ９９２６４．１）。ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子中に挿入される場合、本明細書中に記載される改変が、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３カプシドサブユニット中に改変を生じ得ることが、当業者に理解される。あるいは、これらのカプシドサブユニットは、独立して発現されて、カプシドサブユニットのうち１つまたは２つ（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１＋ＶＰ２、ＶＰ１＋ＶＰ３またはＶＰ２＋ＶＰ３）中でのみ改変を達成できる。ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列は以下に提供される。アミノ酸４９８〜５０４、５８２〜５８７および５９０〜５９５は大文字で示される。
1 maadgylpdw lednlsegir ewwalkpgap qpkanqqhqd narglvlpgy kylgpgngld
61 kgepvnaada aalehdkayd qqlkagdnpy lkynhadaef qerlkedtsf ggnlgravfq
121 akkrlleplg lveeaaktap gkkrpveqsp qepdssagig ksgaqpakkr lnfgqtgdte
181 svpdpqpige ppaapsgvgs ltmasgggap vadnnegadg vgsssgnwhc dsqwlgdrvi
241 ttstrtwalp tynnhlykqi snstsggssn dnayfgystp wgyfdfnrfh chfsprdwqr
301 linnnwgfrp krlnfklfni qvkevtdnng vktiannlts tvqvftdsdy qlpyvlgsah
361 egclppfpad vfmipqygyl tlndgsqavg rssfycleyf psqmlrtgnn fqfsyefenv
421 pfhssyahsq sldrlmnpli dqylyylskt ingsgqnqqt lkfsvagpsn mavqgrnyip
481 gpsyrqqrvs ttvtqnnNSE FAWPgasswa lngrnslmnp gpamashkeg edrffplsgs
541 lifgkqgtgr dnvdadkvmi tneeeikttn pvatesygqv aTNHQSAqaQ AQTGWvqnqg
601 ilpgmvwqdr dvylqgpiwa kiphtdgnfh psplmggfgm khpppqilik ntpvpadppt
661 afnkdklnsf itqystgqvs veiewelqke nskrwnpeiq ytsnyyksnn vefavntegv
721 yseprpigtr yltrnl
定義
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も同様に含むことが意図される。
さらに、用語「約」は、本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度などの量などの測定可能な値をいう場合、特定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％またはさらには±０．１％の変動を包含することを意味する。
また、本明細書中で使用する場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうち１つまたは複数の、任意のおよび全ての可能な組み合わせ、ならびに代替として解釈される場合（「または」）には、組み合わせの欠如をいい、かつこれらを包含する。
文脈が他を示さない限り、本明細書中に記載される本発明の種々の特徴が任意の組み合わせで使用され得ることが、具体的に意図される。
さらに、本発明は、本明細書中に示される本発明のいくつかの実施形態、任意の特徴または特徴の組み合わせが排除または割愛できることも企図している。
例えば、特定のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択できることを本明細書が示す場合をさらに説明するために、この言葉は、各々のこのような下位の組み合わせが本明細書中に明示的に示されるかのように、例えばＡ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみなどの、これらの１もしくは複数のアミノ酸の任意のサブセットからアミノ酸を選択できることもまた示す。さらに、かかる言葉は、１つまたは複数の特定されたアミノ酸が放棄され得ることもまた示す。例えば、特定の実施形態では、各かかる可能な放棄が明示的に示されるかのように、アミノ酸は、Ａ、ＧまたはＩではなく；Ａではなく；ＧまたはＶではない、など。
本明細書中で使用する場合、用語「低下する（ｒｅｄｕｃｅ／ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低下」および類似の用語は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上の減少を意味する。
本明細書中で使用する場合、用語「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ／ｅｎｈａｎｃｅｓ）」「増強」および類似の用語は、少なくとも約１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の増加を示す。
用語「パルボウイルス」は、本明細書中で使用する場合、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスが含まれるＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科を包含する。自律的パルボウイルスには、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属、Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ属、Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ属、Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ属およびＣｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ属のメンバーが含まれる。例示的な自律的パルボウイルスには、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、および現在公知のまたは後に発見される任意の他の自律的パルボウイルスが含まれるが、これらに限定されない。他の自律的パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。
本明細書中で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）には、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３型ＡＡＶ（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、クレードＦ ＡＡＶ（表１）、および現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。多数の比較的新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（例えば、Ｇａｏら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１〜６３８８頁；Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５〜３８３頁；および表１を参照のこと）。
ＡＡＶおよび自律的パルボウイルスの種々の血清型のゲノム配列、ならびにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびカプシドサブユニットの配列が、当該分野で公知である。かかる配列は、文献中またはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースなどの公的データベース中で見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照のこと。その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。例えば以下もまた参照のこと：Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５頁；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３頁；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９頁；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９頁；Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４頁；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８頁；Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１頁；Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４頁；Ｍｏｒｉｓら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３−：３７５〜３８３頁；国際特許公開公報ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０およびＷＯ９８／１１２４４；ならびに米国特許第６，１５６，３０３号；これらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。表１もまた参照のこと。
自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２巻、第６９章および第７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）中により詳細に記載されている。ＡＡＶ２（Ｘｉｅら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５〜１０頁）、ＡＡＶ４（Ｐａｄｒｏｎら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７〜５８頁）、ＡＡＶ５（Ｗａｌｔｅｒｓら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３３６１〜７１頁）およびＣＰＶ（Ｘｉｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７〜５２０頁およびＴｓａｏら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６〜６４頁）の結晶構造の説明もまた参照のこと。
用語「トロピズム」とは、本明細書中で使用する場合、特定の細胞または組織へのウイルスの優先的または選択的な侵入、任意選択的に、その後の、例えば組換えウイルスについて細胞中でのウイルスゲノムが保有する１もしくは複数の配列の発現（例えば、転写および任意選択的に、翻訳）、対象の異種ヌクレオチド配列の発現をいう。当業者は、ウイルスゲノムからの異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは他の方法で調節される核酸配列について、トランス作用因子の非存在下では開始されない場合があることを理解するであろう。ｒＡＡＶゲノムの場合、ウイルスゲノムからの遺伝子発現は、安定に組み込まれたプロウイルスから、非組み込みエピソームから、ならびに細胞内でウイルスが取り得る任意の他の形態からであり得る。
本明細書中で使用する場合、「全身性トロピズム」および「全身性形質導入」（および同等の用語）は、本発明のウイルスカプシドまたはウイルスベクターが、身体中の組織（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓および／または膵臓）に対して、それぞれトロピズムを示すことまたはそれらの組織を形質導入することを示す。本発明の実施形態では、筋組織（例えば、骨格筋、横隔膜筋および心筋）の全身性形質導入が観察される。他の実施形態では、骨格筋組織の全身性形質導入が達成される。例えば、特定の実施形態では、身体中の本質的に全ての骨格筋が形質導入される（しかし、形質導入の効率は筋の型によって異なり得る）。特定の実施形態では、四肢筋、心筋および横隔膜筋の全身性形質導入が達成される。任意選択的に、ウイルスカプシドまたはウイルスベクターは、全身性経路（例えば、静脈内、関節内またはリンパ内などの全身性経路）を介して投与される。あるいは、他の実施形態では、カプシドまたはウイルスベクターは、局所送達される（例えば、足蹠に、筋内、皮内、皮下、外用）。
特に示さない限り、「効率的な形質導入」もしくは「効率的なトロピズム」または同様の用語は、適切な対照を参照することで決定され得る（例えば、対照のそれぞれ形質導入またはトロピズムの、少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％またはそれ以上）。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、骨格筋、心筋、横隔膜筋、膵臓（β島細胞を含む）、脾臓、胃腸管（例えば、上皮および／または平滑筋）、中枢神経系の細胞、肺、関節細胞および／または腎臓を効率的に形質導入するまたはそれらに対する効率的なトロピズムを有する。適切な対照は、所望のトロピズムプロファイルを含む種々の因子に依存する。例えば、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９は、骨格筋、心筋および横隔膜筋の形質導入において高度に効率的であるが、高い効率で肝臓を形質導入するという不利益もまた有する。従って、本発明は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９の骨格筋、心筋および／または横隔膜筋の効率的な形質導入を実証するが、肝臓に対するかなり低い形質導入効率を有する本発明のウイルスベクターを同定するために実施され得る。さらに、対象のトロピズムプロファイルは、複数の標的組織に対するトロピズムを反映し得るので、適切なベクターはいくつかの交換条件を提示し得ることが理解される。説明するために、本発明のウイルスベクターは、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋の形質導入においてネイティブのＡＡＶ８またはＡＡＶ９よりも効率が低い場合があるが、肝臓の低レベルの形質導入に起因して、それにも関わらず非常に望ましい場合がある。
同様に、ウイルスが標識組織について「効率的に形質導入しない」もしくは「効率的なトロピズムを有さない」または同様の用語であるか否かを、適切な対照を参照して決定することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓、腎臓、生殖腺および／または生殖細胞について、効率的に形質導入しない（即ち、効率的なトロピズムを有さない）。特定の実施形態では、１もしくは複数の組織（例えば肝臓）の望ましくない形質導入は、適切な対照と比較して、所望の１もしくは複数の標的組織（例えば、骨格筋、横隔膜筋、心筋および／または中枢神経系の細胞）の形質導入レベルの２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下である。
本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、特に示さない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、代表的実施形態では、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡ配列である。
本明細書中で使用する場合、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分、例えば、そのポリヌクレオチドと一般的には関連して見出される細胞もしくはウイルスの構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的実施形態では、「単離された」ヌクレオチドは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれ以上富化されている。
同様に、「単離された」ポリペプチドとは、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分、例えば、そのポリペプチドと一般的には関連して見出される細胞もしくはウイルスの構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。代表的実施形態では、「単離された」ポリペプチドは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれ以上富化されている。
本明細書中で使用する場合、ウイルスベクターを「単離する」もしくは「精製する」（または文法的等価物）とは、そのウイルスベクターが、出発材料中の他の成分の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されることを意味する。代表的実施形態では、「単離された」または「精製された」ウイルスベクターは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれ以上富化されている。
「治療的ポリペプチド」は、細胞または対象中のタンパク質の非存在または欠損から生じる症状を緩和、低下、予防、遅延および／または安定化できるポリペプチド、ならびに／あるいは抗がん効果または移植生存率における改善などの利益を他の方法で対象に付与するポリペプチドである。
用語「治療する（ｔｒｅａｔ／ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「〜の治療」（およびその文法的な変形）は、対象の状態の重症度が低下され、少なくとも部分的に改善または安定化されること、および／あるいは少なくとも１つの臨床症状における幾分かの緩和、軽減、減少または安定化が達成されること、および／あるいは疾患または障害の進行の遅延が存在することを意味する。
用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ／ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防」（およびその文法的な変形）とは、対象における１もしくは複数の疾患、障害および／または臨床症状の発症の予防および／または遅延、ならびに／あるいは本発明の方法の非存在下で生じるものと比較した、１もしくは複数の疾患、障害および／または臨床症状の発症の重症度における低下をいう。予防は、１もしくは複数の疾患、障害および／または臨床症状の完全な非存在のように、完全であり得る。予防は部分的でもあり得、その結果、対象における１もしくは複数の疾患、障害および／または臨床症状の出現ならびに／あるいは発症の重症度は、本発明の非存在下で生じるものよりも低くなる。
「治療有効」または「有効」量は、本明細書中で使用する場合、いくらかの改善または利益を対象に提供するのに充分な量である。代替的に述べると、「治療有効」または「有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状におけるいくらかの緩和、軽減、減少または安定化を提供する量である。いくらかの利益が対象に提供される限り、治療効果は完全である必要も治癒的である必要もないことを、当業者は理解するであろう。
「予防有効」量は、本明細書中で使用する場合、対象における疾患、障害および／または臨床症状の発症を予防および／または遅延するのに充分な量、ならびに／あるいは本発明の方法の非存在下で生じるものと比較して、対象における疾患、障害および／または臨床症状の発症の重症度を低下および／または遅延させるのに充分な量である。いくらかの利益が対象に提供される限り、予防のレベルが完全である必要がないことを、当業者は理解するであろう。
用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸」は、本明細書中で互換的に使用され、ウイルス中に天然に存在しない配列をいう。一般に、異種核酸は、対象のポリペプチドまたは非翻訳ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームを含む（例えば、細胞または対象への送達のため）。
本明細書中で使用する場合、用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」とは、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子をいう。あるいは、いくつかの文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡ単独をいうために使用され得る。
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（即ち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは一般に、ウイルスを生成するためにシスの１もしくは複数の末端反復（１もしくは複数のＴＲ）のみを必要とする。全ての他のウイルス配列は免除でき、トランスで供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７頁）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大化するように、１つまたは複数のＴＲ配列を保持するだけである。構造タンパク質および非構造タンパク質をコードする配列は、トランスで提供され得る（例えば、プラスミドなどのベクターから、またはその配列をパッケージング細胞中に安定に組み込むことによる）。本発明のいくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、典型的にはベクターゲノムの５’末端および３’末端に存在し、異種核酸に隣接するがそれらと連続している必要はない少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）、任意選択的に、２つのＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含む。ＴＲは、互いに同じでも異なってもよい。
用語「末端反復」または「ＴＲ」には、ヘアピン構造を形成し、逆位末端反復として機能する（即ち、例えば複製、ウイルスパッケージング、組み込みおよび／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を媒介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列が含まれる。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲであり得る。例えば、非ＡＡＶ ＴＲ配列、例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ−１９）または任意の他の適切なウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製起点として機能するＳＶ４０ヘアピン）のＴＲ配列がＴＲとして使用され得、これは、短縮、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変され得る。さらに、ＴＲは、例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第５，４７８，７４５号に記載された「ダブル−Ｄ配列」などのように、部分的に合成でも完全に合成でもよい。
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、クレードＦが含まれるがこれらに限定されない任意のＡＡＶ、または現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶに由来し得る（例えば、表１を参照のこと）。末端反復が、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を媒介する限り、ＡＡＶ末端反復はネイティブ末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブＡＡＶ ＴＲ配列は、挿入、欠失、短縮および／またはミスセンス変異によって変更されていてもよい）。
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏら、（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９頁に記載されるように、「標的化された」ウイルスベクター（例えば、指向性トロピズムを有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（即ち、ウイルスＴＲおよびウイルスカプシドが異なるパルボウイルスに由来するもの）であり得る。
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報ＷＯ０１／９２５５１（その開示は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されるように、二重鎖パルボウイルス粒子であり得る。従って、いくつかの実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムが、本発明のウイルスカプシド中にパッケージングされ得る。
さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含み得る。
本明細書中で使用する場合、用語「アミノ酸」は、任意の天然に存在するアミノ酸、その改変形態および合成アミノ酸を包含する。
天然に存在する左旋性（Ｌ−）アミノ酸を表２に示す。あるいは、アミノ酸は、改変されたアミノ酸残基であり得（非限定的な例を表３に示す）、および／または翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化（ｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ））によって改変されたアミノ酸であり得る。
さらに、天然に存在しないアミノ酸は、例えばＷａｎｇら Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５〜４９頁（２００６））によって記載されるような「非天然」アミノ酸であり得る。これらの非天然アミノ酸は、対象の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結するために有利に使用され得る。
改変されたＡＡＶカプシドタンパク質ならびにそれを含むウイルスカプシドおよびウイルスベクター。
本発明は、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶ）のカプシドタンパク質における改変が、改変されたＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスベクターに、肝臓の形質導入の低下が含まれるがこれに限定されない１つまたは複数の所望の特性を付与できるという、予想外の発見に基づいている。従って、本発明は、従来のＡＡＶベクターに関連する制限のいくつかに取り組むものである。例えば、ＡＡＶ８ベクターおよびｒＡＡＶ９ベクターに基づくベクターは、内皮細胞障壁を容易に横切るので、全身性核酸送達には魅力的である；しかし、ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９の全身性投与では、殆どのベクターが肝臓に送達されるという結果をまねき、それにより、骨格筋などの他の重要な標的組織の形質導入が低下する。
従って、いくつかの実施形態では、本発明は、カプシドタンパク質が、アミノ酸領域４９８〜５０４、５９０〜５９５および／または５８２〜５８７、包括的（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けに従う）中の１つまたは複数のアミノ酸における変異を含み、この１もしくは複数の変異が、適切な対照（例えば、野生型ＶＰ１カプシドタンパク質であり得るがこれに限定されない、この１もしくは複数の変異を欠くＡＡＶ９またはクレードＦのＶＰ１カプシドタンパク質）と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を生じる、アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）またはクレードＦ ＡＡＶ（表１）カプシドタンパク質を提供する。
本明細書中で使用する場合、アミノ酸配列における「変異」または「改変」には、そのそれぞれに１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ以上のアミノ酸が関与し得る、置換、挿入および／または欠失が含まれる。特定の実施形態では、改変は置換である。例えば、いくつかの実施形態では、当業者に公知のように、１つのＡＡＶ由来の等価な領域由来の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ以上のアミノ酸が、ネイティブＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸位置に、あるいは別のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質の対応する位置中に置換され得る。しかし、本発明の改変されたウイルスカプシドは、１つのＡＡＶカプシド由来のアミノ酸が別のＡＡＶカプシドに置換されたＡＡＶカプシドに限定されず、置換および／または挿入されたアミノ酸は、任意の供給源由来であり得、さらに、天然に存在するまたは部分的もしくは完全に合成であり得る。
本発明の改変されたカプシドタンパク質、ウイルスカプシドおよびウイルスベクターは、そのネイティブ状態（即ち、変異体ではない）の特定の位置に示されたアミノ酸を有するカプシドタンパク質、カプシドおよびウイルスベクターを排除することが、当業者により理解されよう。
本明細書中で記載する場合、多数のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列が、当該分野で公知である。従って、ネイティブＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸位置４９８〜５０４、５９０〜５９５および／または５８２〜５８７（包括的）に「対応する」アミノ酸は、任意の他のＡＡＶについて容易に決定できる（例えば、配列アラインメントを使用して）。
本発明は、本発明の改変されたカプシドタンパク質が、現在公知のまたは後に発見される任意のＡＡＶのカプシドタンパク質を改変することによって生成され得ることを企図している。さらに、改変されるＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、表１に示されるＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａもしくは３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１カプシドタンパク質あるいは任意のＡＡＶ）であり得るがそれらに限定されない。当業者は、ＡＡＶカプシドタンパク質に対する種々の操作が当該分野で公知であり、本発明が天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質の改変に限定されないことを理解するであろう。例えば、改変されるカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶ（例えば、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０および／またはＡＡＶ１１あるいは現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶに由来する）と比較して、既に変更を有していてもよい。かかるＡＡＶカプシドタンパク質もまた、本発明の範囲内である。
特定の実施形態では、本発明は、Ｗ５９５における変異、Ｑ５９２における変異、Ｗ５０３における変異、Ｎ４９８における変異、Ｅ５００における変異（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けに従う）およびそれらの任意の組み合わせを含む、本質的にこれらからなる、またはこれらからなるＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質を提供し、この変異は、対照と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を生じる。本発明はさらに、Ｎ４９８、Ｓ４９９、Ｅ５００、Ｆ５０１、Ａ５０２、Ｗ５０３、Ｐ５０４、Ｔ５８２、Ｎ５８３、Ｈ５８４、Ｑ５８５、Ｓ５８６、Ａ５８７、Ｑ５９０、Ａ５９１、Ｑ５９２、Ｔ５９３、Ｇ５９４、Ｗ５９５における変異単一または変異の任意の組み合わせを含む、本質的にこれらからなる、またはこれらからなるＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。Ｎ４９８、Ｓ４９９、Ｅ５００、Ｆ５０１、Ａ５０２、Ｗ５０３、Ｐ５０４、Ｔ５８２、Ｎ５８３、Ｈ５８４、Ｑ５８５、Ｓ５８６、Ａ５８７、Ｑ５９０、Ａ５９１、Ｑ５９２、Ｔ５９３、Ｇ５９４、Ｗ５９５における変異は、任意の他のアミノ酸による置換であり得る。本明細書中で使用する場合、用語「アミノ酸」は、任意の天然に存在するアミノ酸、その改変形態および合成アミノ酸を包含する。
天然に存在する左旋性（Ｌ−）アミノ酸を表２に示す。あるいは、アミノ酸は、改変されたアミノ酸残基であり得（非限定的な例を表３に示す）、および／または翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化（sulfatation））によって改変されたアミノ酸であり得る。
さらに、天然に存在しないアミノ酸は、例えばＷａｎｇら Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５〜４９頁（２００６））によって記載されるような「非天然」アミノ酸であり得る。
特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、Ｗ５９５Ｃ変異、Ｑ５９２Ｌ変異、Ｗ５０３Ｒ変異、Ｎ４９８Ｙ変異、Ｅ５００Ｄ変異およびそれらの任意の組み合わせを含み得、本質的にこれらからなり得、またはこれらからなり得、この変異は、対照と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を生じる。これらの特定の変異は例示的であること、およびこれらの位置におけるアミノ酸が、例えば表２および３に示されるような任意の他のアミノ酸で置換され得、得られたカプシドタンパク質が、対照と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を有することを理解すべきである。
さらなる実施形態では、本発明は、Ｗ５９５Ｃ変異（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付け）を含む、本質的にこれからなる、またはこれからなるＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質を提供し、この変異は、対照と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を生じる。
Ｑ５９２Ｌ変異（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付け）を含むＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質もまた本明細書中で提供され、この変異は、対照と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を生じる。
本発明はさらに、Ｗ５０３Ｒ変異（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付け）を含む、本質的にこれからなる、またはこれからなるＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質を提供し、この変異は、対照と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を生じる。
さらなる実施形態では、本発明は、Ｎ４９８Ｙ変異（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付け）を含む、本質的にこれからなる、またはこれからなるＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質を提供し、この変異は、対照と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を生じる。いくつかの実施形態では、このＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質はさらに、Ｌ６０２Ｆ変異（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付け）を含み得、本質的にこれからなり得、またはこれからなり得る。
Ｎ４９８Ｉ変異（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付け）を含む、本質的にこれからなる、またはこれからなるＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質も本明細書中でさらに提供され、この変異は、対照と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を生じる。
本発明のさらなる実施形態には、Ｐ４６８Ｔ変異（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付け）を含む、本質的にこれからなる、またはこれからなるＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパクが含まれ、この変異は、対照と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を生じる。このＡＡＶ９またはクレードＦカプシドタンパク質はさらに、Ｅ５００Ｄ変異（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付け）を含み得、本質的にこれからなり得、またはこれからなり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される特定の変異したＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質は、中枢神経系（ＣＮＳ）への対象の異種ヌクレオチド配列の直接的送達のためのウイルスベクターで使用され得る。これらの変異したカプシドタンパク質の特定の例には、本明細書中の表５中に規定されたバリアント９．２４、９．４５および９．４７が含まれる。これらの変異体を用いた研究により、脳中に直接注射した場合に、これらの変異を有するウイルス粒子が、親粒子または対照粒子（即ち、これらの変異を欠く粒子）と同様に感染性であることが実証された。しかし、親粒子は脳から漏れ出し、肝臓に送達され得る。対照的に、本明細書中に記載されるバリアント９．２４、９．４５または９．４７である変異したカプシドタンパク質を含む粒子は、親粒子と同じ様式で肝臓に送達されることはない。他のＡＡＶ血清型における等価なアミノ酸残基における変異は、本発明のウイルスベクターにおいて使用され得るカプシドタンパク質を生成するために、本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。例えば、表８は、本発明に従うカプシドタンパク質（例えば、対照と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を有する）を生成するために変異され得ると同定された他のＡＡＶ血清型中の対応するアミノ酸残基と共に、ＡＡＶバリアント９．２４、９．４５および９．４７のカプシドタンパク質中の変異を示す。本発明が、所望の表現型を有するＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶ以外の血清型のこれらの変異したカプシドタンパク質を含むことは、当業者に充分理解され、本明細書中に提供される教示に従って、および当該分野で公知のように、他のＡＡＶ血清型のかかる変異体を生成し、試験し、および使用することは、充分に当業者の技術範囲内である。
上記特定の実施形態では留意したように、記載された変異は、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質中に存在し得る。等価なアミノ酸が他のＡＡＶ血清型中に存在し、本発明が、かかる等価なアミノ酸位置において本発明の１もしくは複数の変異を含む、本質的にこれらからなる、またはこれらからなるかかる他のＡＡＶ血清型を包含することは、当業者に周知であり、この１もしくは複数の変異は、対照と比較して減少した肝臓形質導入および／または低下したグリカン結合親和性の表現型を生じる。
本発明のいくつかの実施形態では、変異または改変されるＡＡＶカプシドタンパク質は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００９／１０８２７４号に記載された変更されたＨＩループを有するＡＡＶであり得、および／または精製を促進するためにポリＨｉｓ配列を含むように改変されたＡＡＶであり得る。別の例示的な例において、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質は、挿入または置換としてそこに組み込まれたペプチド標的化配列を有し得る。さらに、ＡＡＶカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質中に置換されたおよび／または挿入された別のＡＡＶ由来の大きいドメインを含み得る。
従って、特定の実施形態では、改変されるＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶに由来し得るが、カプシドタンパク質中に挿入および／または置換されたならびに／あるいは１つまたは複数のアミノ酸の欠失によって変更された、１つまたは複数の外来配列（例えば、ネイティブウイルスにとって外因性である）をさらに含み得る。
従って、特定のＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、表１に示されたＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０もしくはＡＡＶ１１カプシドタンパク質、または任意のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質など）に本明細書中で言及する場合、ネイティブカプシドタンパク質ならびに本発明の改変以外の変更を有するカプシドタンパク質を包含する意図である。かかる変更には、置換、挿入および／または欠失が含まれる。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、そこに挿入された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０の、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満または７０未満のアミノ酸を含む（本発明の挿入以外に）。本発明の実施形態では、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０の、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満または７０未満のアミノ酸置換を含む（本発明に従うアミノ酸置換以外に）。本発明の実施形態では、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０の、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満または７０未満のアミノ酸の欠失（本発明のアミノ酸欠失以外に）を含む。
従って、例えば用語「ＡＡＶ９カプシドタンパク質」には、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質配列を有するＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号ＡＹ５３０５７９（Ｈｕ１４）；ＡＹ５３０５９６（Ｈｕ３１）；ＡＹ５３０５９７（Ｈｕ３２）を参照のこと）、ならびにネイティブＡＡＶ９またはＨｕ．３１もしくはＨｕ．３２カプシドタンパク質配列中に置換、挿入および／または欠失（上記段落に記載したもの）を含むものが含まれる。
用語「クレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質」には、例えば表１に示されるようなクレードＦ ＡＡＶのネイティブカプシドタンパク質配列を有するＡＡＶカプシドタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号ＡＹ５３０５７９を参照のこと）ならびにネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質配列中に置換、挿入および／または欠失（上記段落に記載したもの）を含むものが含まれる。
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列を有する、あるいはネイティブＡＡＶカプシドタンパク質配列と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似または同一なアミノ酸配列を有する。例えば、特定の実施形態では、「ＡＡＶ９」カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質配列、ならびにネイティブＡＡＶ９カプシドタンパク質配列と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似または同一な配列を包含する。さらなる例として、特定の実施形態では、「クレードＦ」カプシドタンパク質は、クレードＦ ＡＡＶのネイティブカプシドタンパク質配列（表１を参照のこと）ならびにクレードＦ ＡＡＶのネイティブカプシドタンパク質配列と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似または同一な配列を包含する。
２つ以上のアミノ酸配列間の配列類似性または同一性を決定する方法は、当該分野で公知である。配列類似性または同一性は、当該分野で公知の標準的な技術を使用して決定され得、この技術には、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４頁（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、および／またはＤｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５頁（１９８４）に記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、ならびに検査。
別の適切なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０）およびＫａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７頁（１９９３）に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：４６０〜４８０頁（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、任意選択的に、デフォルト値に設定されるいくつかの検索パラメータを使用する。これらのパラメータは、ダイナミックな値であり、特定の配列の組成および対象の配列がそれに対して検索されている特定のデータベースの構成に依存して、プログラム自体によって設定される。しかし、これらの値は、感度を増加させるために調整され得る。
さらに、さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁に報告されるｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴである。
本発明の代表的実施形態では、改変は、ネイティブＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸４９８〜５０４位、５９０〜５９５位および／または５８２〜５８７位（包括的）（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けを使用する）の領域中で、あるいは他のＡＡＶの対応する位置、即ち、任意の他のＡＡＶ血清型のネイティブカプシドタンパク質のアミノ酸４９８〜５０４位、５９０〜５９５位および／または５８２〜５８７位（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付け）に対応するアミノ酸において、なされる。ネイティブＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質の４９８〜５０４位、５９０〜５９５位および／または５８２〜５８７位「に対応する」他のＡＡＶ血清型または改変されたＡＡＶカプシド中のアミノ酸位置は、当業者に明らかであり、配列アラインメント技術（例えば、ＷＯ２００６／０６６０６６の図７を参照のこと）および／または結晶構造解析（Ｐａｄｒｏｎら、（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７〜５８頁）を使用して容易に決定され得る。
さらなる実施形態では、本発明の変異または改変は、全ての下流の配列の位置がシフトするような挿入および／または欠失を既に含むＡＡＶカプシドタンパク質中に導入され得る。この状況において、ＡＡＶ９カプシドタンパク質中のアミノ酸４９８〜５０４位、５９０〜５９５位および／または５８２〜５８７位に対応するアミノ酸位置はなおも、当業者が容易に同定可能である。
本発明の実施形態では、本発明のＡＡＶベクターによる、心筋および／または骨格筋の形質導入（個々の骨格筋、複数の骨格筋または全範囲の骨格筋に基づいて決定される）は、肝臓における形質導入レベルよりも少なくとも約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍またはそれより高い。いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶベクターによる、心筋および／または骨格筋の形質導入（個々の骨格筋、複数の骨格筋または全範囲の骨格筋に基づいて決定される）は、肝臓における形質導入レベルよりも少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％またはそれより高い。
本発明は、本発明の改変されたＡＡＶカプシドタンパク質を含む、本質的にこれからなる、またはこれからなるウイルスカプシドもまた提供する。特定の実施形態では、ウイルスカプシドは、さらに自律的パルボウイルスカプシドまたはディペンドウイルスカプシドであり得るパルボウイルスカプシドである。任意選択的に、ウイルスカプシドはＡＡＶカプシドである。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、表１に示されるＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１または任意の他のＡＡＶであるか、あるいは１つまたは複数の挿入、置換および／または欠失により上述のいずれかから誘導される。
改変されたウイルスカプシドは、例えば米国特許第５，８６３，５４１号に記載された「カプシドビヒクル」として使用され得る。改変されたウイルスカプシドによってパッケージングされ得、細胞中に移入され得る分子には、異種ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、有機小分子、金属またはそれらの組み合わせが含まれる。
異種分子は、ＡＡＶ感染において天然には見出されない分子、例えば、野生型ＡＡＶゲノムによってコードされない分子として規定される。さらに、治療的に有用な分子は、宿主標的細胞中への分子の移入のために、キメラウイルスカプシドの外側と会合し得る。かかる会合した分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、有機小分子、金属、炭水化物、脂質および／またはポリペプチドが含まれ得る。本発明の１実施形態では、治療的に有用な分子は、カプシドタンパク質に共有結合される（即ち、コンジュゲート化または化学的にカップリングされる）。分子を共有結合する方法は、当業者に公知である。
本発明の改変されたウイルスカプシドはまた、新規カプシド構造に対する抗体を惹起するのに用途を見出す。さらなる代替として、外因性アミノ酸配列は、細胞への抗原提示のために、例えば、外因性アミノ酸配列に対する免疫応答を生じるために対象に投与するために、改変されたウイルスカプシド中に挿入され得る。
他の実施形態では、ウイルスカプシドは、対象のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする核酸を送達するウイルスベクターの投与の前および／または同時に（例えば、互いに数分以内または数時間以内）、特定の細胞部位を遮断するために投与され得る。例えば、本発明のカプシドは、肝臓細胞上の細胞受容体を遮断するために送達され得、肝臓細胞の形質導入を低下させ得、他の標的（例えば、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋）の形質導入を増強し得る送達ベクターが、その後にまたは同時に投与され得る。
代表的実施形態によれば、改変されたウイルスカプシドは、本発明に従う改変されたウイルスベクターの前および／または同時に対象に投与され得る。さらに、本発明は、本発明の改変されたウイルスカプシドを含む組成物および医薬製剤を提供し、任意選択的に、この組成物は、本発明の改変されたウイルスベクターもまた含む。
本発明は、本発明の変異または改変されたウイルスカプシドおよびカプシドタンパク質をコードする核酸（任意選択的に、単離された核酸）もまた提供する。核酸を含むベクター、ならびに本発明の核酸および／またはベクターを含む細胞（ｉｎ ｖｉｖｏまたは培養物中）がさらに提供される。適切なベクターには、当該分野で周知の、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、ワクシニア、ポックスウイルス、バキュロウイルスなど）、プラスミド、ファージ、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが含まれるがこれらに限定されない。かかる核酸、ベクターおよび細胞は、例えば、本明細書中に記載される改変されたウイルスカプシドまたはウイルスベクターの生成のための試薬（例えば、ヘルパーパッケージング構築物またはパッケージング細胞）として使用され得る。
本発明に従うウイルスカプシドは、例えばバキュロウイルスからの発現によるなどの、当該分野で公知の任意の方法を使用して生成され得る（Ｂｒｏｗｎら、（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：４７７〜４８８頁）。
本発明に従うＡＡＶカプシドタンパク質への改変は、「選択的」改変である。このアプローチは、ＡＡＶ血清型間のサブユニット全体または大きいドメインのスワップを用いる以前の研究とは対照的である（例えば、国際特許公開公報ＷＯ００／２８００４およびＨａｕｃｋら、（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８〜２７７４頁を参照のこと）。特定の実施形態では、「選択的」改変は、約５０、４０、３０、２０、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３または２個未満の連続アミノ酸の挿入および／または置換および／または欠失を生じる。
本発明の改変されたカプシドタンパク質およびカプシドは、現在公知のまたは後に同定される任意の他の変異または改変をさらに含み得る。
例えば、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質およびウイルスカプシドは、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／２８００４号に記載されるように、別のウイルス、任意選択的に、別のパルボウイルスまたはＡＡＶ由来のカプシドサブユニットの全てまたは一部を含み得るという意味で、キメラであり得る。
ウイルスカプシドは、ウイルスカプシドを所望の１もしくは複数の標的組織上に存在する細胞表面分子と相互作用するよう方向付ける標的化配列（例えば、ウイルスカプシド中に置換または挿入されたもの）を含む標的化ウイルスカプシドであり得る（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／２８００４号およびＨａｕｃｋら、（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８〜２７７４頁）；Ｓｈｉら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：３５３〜３６１頁（２００６）［ＡＡＶカプシドサブユニットの５２０位および／または５８４位におけるインテグリン受容体結合モチーフＲＧＤの挿入を記載している］；および米国特許第７，３１４，９１２号［ＡＡＶ２カプシドサブユニットのアミノ酸４４７位、５３４位、５７３位および５８７位の後にＲＧＤモチーフを含むＰ１ペプチドの挿入を記載している］を参照のこと）。挿入を許容するＡＡＶカプシドサブユニット内の他の位置は当該分野で公知である（例えば、Ｇｒｉｆｍａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：９６４〜９７５頁（２００１）に記載される４４９位および５８８位）。
例えば、いくつかの本発明のウイルスカプシドは、対象の殆どの標的組織（例えば、肝臓、骨格筋、心臓、横隔膜筋、腎臓、脳、胃、腸、皮膚、内皮細胞および／または肺）に向かう比較的非効率なトロピズムを有する。標的化配列は、これらの低形質導入ベクター中に有利に組み込まれ得、それにより、所望のトロピズムおよび任意選択的に、１もしくは複数の特定の組織に対する選択的トロピズムをウイルスカプシドに付与する。標的化配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質、カプシドおよびベクターは、例えばＰＣＴ公開公報ＷＯ００／２８００４号中に記載されている。別の可能性として、Ｗａｎｇら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５〜４９頁（２００６）に記載される１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸が、低形質導入ベクターを１もしくは複数の所望の標的組織に再方向付けする手段として、直交部位でＡＡＶカプシドサブユニット中に組み込まれ得る。これらの非天然アミノ酸は、以下が含まれるがそれらに限定されない対象の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結するために有利に使用され得る：グリカン（マンノース−樹状細胞標的化）；特定のがん細胞型への標的化送達のためのＲＧＤ、ボンベシンまたはニューロペプチド；増殖因子受容体、インテグリンなどの特定の細胞表面受容体に標的化されたファージディスプレイから選択されるＲＮＡアプタマーまたはペプチド。アミノ酸を化学的に改変する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９６を参照のこと）。
代表的実施形態では、標的化配列は、１もしくは複数の特定の細胞型への感染を指向するウイルスカプシド配列（例えば、自律的パルボウイルスカプシド配列、ＡＡＶカプシド配列または任意の他のウイルスカプシド配列）であり得る。
別の非限定的な例として、ヘパリン結合ドメイン（例えば、ＲＳウイルスヘパリン結合ドメイン）が、得られた変異体にヘパリン結合を付与するために、典型的にはＨＳ受容体に結合しないカプシドサブユニット（例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）中に挿入または置換され得る。
Ｂ１９は、その受容体としてグロボシドを使用する初代赤血球前駆細胞に感染する（Ｂｒｏｗｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１１４頁）。Ｂ１９の構造は、８Åの分解能まで決定されている（Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０３：１０６頁）。グロボシドに結合するＢ１９カプシドの領域は、アミノ酸３９９〜４０６の間（Ｃｈａｐｍａｎら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４：４１９頁）、βバレル構造ＥとＦとの間のループアウト（ｌｏｏｐｅｄ ｏｕｔ）領域（Ｃｈｉｐｍａｎら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７５０２頁）にマップされている。従って、Ｂ１９カプシドのグロボシド受容体結合ドメインは、それを含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターを赤血球細胞に標的化するために、ＡＡＶカプシドタンパク質中に置換され得る。
代表的実施形態では、外因性標的化配列は、改変されたＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターのトロピズムを変更するペプチドをコードする任意のアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、標的化ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するものであってもよく、あるいは完全にまたは部分的に合成であってもよい。例示的な標的化配列には、細胞表面受容体および糖タンパク質に結合するリガンドおよび他のペプチド、例えば、ＲＧＤペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩなど）、サイトカイン、メラニン細胞刺激ホルモン（例えば、α、βまたはγ）、ニューロペプチドおよびエンドルフィンなど、ならびにそれらの同族受容体へと細胞を標的化する能力を保持したその断片が含まれる。他の例示的なペプチドおよびタンパク質には、サブスタンスＰ、ケラチノサイト増殖因子、ニューロペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン、β−エンドルフィン、ロイシンエンケファリン、リモルフィン、α−ネオエンケファリン、アンジオテンシン、ニューマジン（ｐｎｅｕｍａｄｉｎ）、血管作用性腸ペプチド、ニューロテンシン、モチリン、および本明細書中に記載されるそれらの断片が含まれる。なおさらなる代替として、毒素（例えば、破傷風毒素または蛇毒、例えば、α−ブンガロトキシンなど）由来の結合ドメインが、標的化配列としてカプシドタンパク質中に置換され得る。なおさらなる代表的実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｃｌｅｖｅｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：Ｒ３１８（１９９７））に記載される「非典型的」インポート／エクスポートシグナルペプチド（例えば、線維芽細胞増殖因子−１および−２、インターロイキン１、ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質など）によるＡＡＶカプシドタンパク質中への置換によって改変され得る。
ファージディスプレイ技術ならびに当該分野で公知の他の技術が、対象の任意の細胞型を認識するペプチドを同定するために使用され得る。
標的化配列は、受容体（例えば、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質またはプロテオグリカン）を含む、細胞表面結合部位に標的化する任意のペプチドをコードし得る。細胞表面結合部位の例としては、以下が含まれるがこれらに限定されない：ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸および他のグリコサミノグリカン、ムチン上で見出されるシアル酸部分、糖タンパク質、およびガングリオシド、ＭＨＣ Ｉ糖タンパク質、マンノース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、フコース、ガラクトースを含めた、膜糖タンパク質上に見出される炭水化物成分など。
特定の実施形態では、ヘパラン硫酸（ＨＳ）またはヘパリン結合ドメインは、（例えば、他の方法ではＨＳにもヘパリンにも結合しないＡＡＶ中の）ウイルスカプシド中に置換される。ＨＳ／ヘパリン結合は、アルギニンおよび／またはリシンが豊富な「塩基性パッチ」によって媒介されることが当該分野で公知である。例示的な実施形態は、モチーフＢＸＸＢに続く配列であり、ここで「Ｂ」は塩基性残基であり、Ｘは中性および／または疎水性である。１つの非限定的な例として、ＢＸＸＢはＲＧＮＲである。特定の実施形態では、ＢＸＸＢは、ネイティブＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸２６２位から２６５位または別のＡＡＶのカプシドタンパク質中の対応する位置を置換する。
適切な標的化配列の他の非限定的な例には、Ｍｕｌｌｅｒら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：１０４０〜１０４６頁（２００３）により同定された、冠状動脈内皮細胞を標的化するペプチド（コンセンサス配列ＮＳＶＲＤＬＧ／Ｓ、ＰＲＳＶＴＶＰ、ＮＳＶＳＳＸＳ／Ａ）；Ｇｒｉｆｍａｎら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：９６４〜９７５頁（２００１）に記載される腫瘍標的化ペプチド（例えば、ＮＧＲ、ＮＧＲＡＨＡ）；Ｗｏｒｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：６８３〜６９３頁（２００６）に記載される肺標的化配列または脳標的化配列（ＱＰＥＨＳＳＴ、ＶＮＴＡＮＳＴ、ＨＧＰＭＱＫＳ、ＰＨＫＰＰＬＡ、ＩＫＮＮＥＭＷ、ＲＮＬＤＴＰＭ、ＶＤＳＨＲＱＳ、ＹＤＳＫＴＫＴ、ＳＱＬＰＨＱＫ、ＳＴＭＱＱＮＴ、ＴＥＲＹＭＴＱ、ＱＰＥＨＳＳＴ、ＤＡＳＬＳＴＳ、ＤＬＰＮＫＫＴ、ＤＬＴＡＡＲＬ、ＥＰＨＱＦＮＹ、ＥＰＱＳＮＨＴ、ＭＳＳＷＰＳＱ、ＮＰＫＨＮＡＴ、ＰＤＧＭＲＴＴ、ＰＮＮＮＫＴＴ、ＱＳＴＴＨＤＳ、ＴＧＳＫＱＫＱ、ＳＬＫＨＱＡＬおよびＳＰＩＤＧＥＱ））；Ｈａｊｉｔｏｕら、ＴＣＭ １６：８０〜８８頁（２００６）に記載される血管標的化配列（ＷＩＦＰＷＩＱＬ、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ、ＣＮＧＲＣ、ＣＰＲＥＣＥＳ、ＧＳＬ、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ、ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ、ＣＫＧＧＲＡＫＤＣおよびＣＶＰＥＬＧＨＥＣ）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：８８３〜８８８頁（１９９９）に記載される標的化ペプチド（ＣＲＲＥＴＡＷＡＫ、ＫＧＤ、ＶＳＷＦＳＨＲＹＳＰＦＡＶＳ、ＧＹＲＤＧＹＡＧＰＩＬＹＮ、ＸＸＸＹ＊ＸＸＸ［式中、Ｙ＊はホスホ−Ｔｙｒである］、Ｙ＊Ｅ／ＭＮＷ、ＲＰＬＰＰＬＰ、ＡＰＰＬＰＰＲ、ＤＶＦＹＰＹＰＹＡＳＧＳ、ＭＹＷＹＰＹ、ＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ、ＣＷＤＤＧ／ＬＷＬＣ、ＥＷＣＥＹＬＧＧＹＬＲＣＹＡ、ＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰ、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ、ＬＷＸＸＹ／Ｗ／Ｆ／Ｈ、ＸＦＸＸＹＬＷ、ＳＳＩＩＳＨＦＲＷＧＬＣＤ、ＭＳＲＰＡＣＰＰＮＤＫＹＥ、ＣＬＲＳＧＲＧＣ、ＣＨＷＭＦＳＰＷＣ、ＷＸＸＦ、ＣＳＳＲＬＤＡＣ、ＣＬＰＶＡＳＣ、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ、ＹＳＧＫＷＧＷ、ＧＬＳＧＧＲＳ、ＬＭＬＰＲＡＤ、ＣＳＣＦＲＤＶＣＣ、ＣＲＤＶＶＳＶＩＣ、ＣＮＧＲＣおよびＧＳＬ）；ならびにＮｅｗｔｏｎおよびＤｅｕｔｓｃｈｅｒ、「Ｐｈａｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｉｓｐｌａｙ」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１４５〜１６３頁、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（２００８）に記載される腫瘍標的化ペプチド（ＭＡＲＳＧＬ、ＭＡＲＡＫＥ、ＭＳＲＴＭＳ、ＫＣＣＹＳＬ、ＷＲＲ、ＷＫＲ、ＷＶＲ、ＷＶＫ、ＷＩＫ、ＷＴＲ、ＷＶＬ、ＷＬＬ、ＷＲＴ、ＷＲＧ、ＷＶＳ、ＷＶＡ、ＭＹＷＧＤＳＨＷＬＱＹＷＹＥ、ＭＱＬＰＬＡＴ、ＥＷＬＳ、ＳＮＥＷ、ＴＮＹＬ、ＷＩＦＰＷＩＱＬ、ＷＤＬＡＷＭＦＲＬＰＶＧ、ＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ、ＣＶＰＥＬＧＨＥＣ、ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ、ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ、ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ、およびＣＶＦＴＳＮＹＡＦＣ、ＶＨＳＰＮＫＫ、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ、ＣＲＧＤＧＷＣ、ＸＲＧＣＤＸ、ＰＸＸＳ／Ｔ、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ、ＳＧＫＧＰＲＱＩＴＡＬ、Ａ９Ａ／Ｑ）（Ｎ／Ａ）（Ｌ／Ｙ）（Ｔ／Ｖ／Ｍ／Ｒ）（Ｒ／Ｋ）、ＶＹＭＳＰＦ、ＭＱＬＰＬＡＴ、ＡＴＷＬＰＰＲ、ＨＴＭＹＹＨＨＹＱＨＨＬ、ＳＥＶＧＣＲＡＧＰＬＱＷＬＣＥＫＹＦＧ、ＣＧＬＬＰＶＧＲＰＤＲＮＶＷＲＷＬＣ、ＣＫＧＱＣＤＲＦＫＧＬＰＷＥＣ、ＳＧＲＳＡ、ＷＧＦＰ、ＬＷＸＸＡｒ［Ａｒ＝Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｈ］、ＸＦＸＸＹＬＷ、ＡＥＰＭＰＨＳＬＮＦＳＱＹＬＷＹＴ、ＷＡＹ（Ｗ／Ｆ）ＳＰ、ＩＥＬＬＱＡＲ、ＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ、ＡＹＴＫＣＳＲＱＷＲＴＣＭＴＴＨ、ＰＱＮＳＫＩＰＧＰＴＦＬＤＰＨ、ＳＭＥＰＡＬＰＤＷＷＷＫＭＦＫ、ＡＮＴＰＣＧＰＹＴＨＤＣＰＶＫＲ、ＴＡＣＨＱＨＶＲＭＶＲＰ、ＶＰＷＭＥＰＡＹＱＲＦＬ、ＤＰＲＡＴＰＧＳ、ＦＲＰＮＲＡＱＤＹＮＴＮ、ＣＴＫＮＳＹＬＭＣ、Ｃ（Ｒ／Ｑ）Ｌ／ＲＴ（Ｇ／Ｎ）ＸＸＧ（Ａ／Ｖ）ＧＣ、ＣＰＩＥＤＲＰＭＣ、ＨＥＷＳＹＬＡＰＹＰＷＦ、ＭＣＰＫＨＰＬＧＣ、ＲＭＷＰＳＳＴＶＮＬＳＡＧＲＲ、ＳＡＫＴＡＶＳＱＲＶＷＬＰＳＨＲＧＧＥＰ、ＫＳＲＥＨＶＮＮＳＡＣＰＳＫＲＩＴＡＡＬ、ＥＧＦＲ、ＲＶＳ、ＡＧＳ、ＡＧＬＧＶＲ、ＧＧＲ、ＧＧＬ、ＧＳＶ、ＧＶＳ、ＧＴＲＱＧＨＴＭＲＬＧＶＳＤＧ、ＩＡＧＬＡＴＰＧＷＳＨＷＬＡＬ、ＳＭＳＩＡＲＬ、ＨＴＦＥＰＧＶ、ＮＴＳＬＫＲＩＳＮＫＲＩＲＲＫ、ＬＲＩＫＲＫＲＲＫＲＫＫＴＲＫ、ＧＧＧ、ＧＦＳ、ＬＷＳ、ＥＧＧ、ＬＬＶ、ＬＳＰ、ＬＢＳ、ＡＧＧ、ＧＲＲ、ＧＧＨおよびＧＴＶ）が含まれる。
なおさらなる代替として、標的化配列は、細胞中への進入を標的化する別の分子への化学的カップリングのために使用され得る（例えば、そのＲ基を介して化学的にカップリングされ得るアルギニンおよび／またはリシン残基を含み得る）ペプチドであり得る。
別の選択肢として、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質またはウイルスカプシドは、ＷＯ２００６／０６６０６６に記載される変異を含み得る。例えば、カプシドタンパク質は、ネイティブＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸２６３位、７０５位、７０８位および／または７１６位における選択的アミノ酸置換、あるいは別のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質中の対応する１もしくは複数の変化を含み得る。加えてまたは代替的に、代表的実施形態では、カプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸２６４位の直ぐ後ろの選択的アミノ酸挿入または他のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質中の対応する変化を含む。「アミノ酸Ｘ位の直ぐ後ろ」とは、その挿入が、示されたアミノ酸位置の直後にあることを意図する（例えば、「アミノ酸２６４位の後ろ」は、２６５位における点挿入または２６５〜２６８位などのより大きい挿入を示す、など）。
本発明の上述の実施形態は、本明細書中に記載されるように細胞または対象に異種核酸を送達するために使用され得る。例えば、改変されたベクターは、本明細書中に記載されるように、リソソーム蓄積症、例えば、ムコ多糖症障害（例えば、スライ症候群［β−グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ］、Ｂ［β−ガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ］など）、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸α−グルコシダーゼ）を治療するために使用され得る。
いくつかのＡＡＶカプシドタンパク質について、対応するアミノ酸位置が、ウイルス中に部分的にまたは完全に存在するかどうか、あるいは完全に存在していないかに依存して、対応する改変が挿入および／または置換となることを、当業者は理解するであろう。同様に、ＡＡＶ９以外のＡＡＶを改変する場合、１もしくは複数の特定のアミノ酸位置は、ＡＡＶ９中の位置とは異なる位置であり得る（例えば、表４および８を参照のこと）。本明細書中の別の箇所で考察するように、１もしくは複数の対応するアミノ酸位置は、周知の技術を使用して当業者に容易に明らかとなろう。
他の代表的実施形態では、本発明の改変されたカプシドタンパク質またはウイルスカプシドはさらに、ＷＯ２００７／０８９６３２に記載された１つまたは複数の変異（例えば、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５３１位または別のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質の対応する位置におけるＥ→Ｋ変異）を含む。
さらなる実施形態では、改変されたカプシドタンパク質またはカプシドは、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００９／１０８２７４号に記載された変異を含み得る。
別の実施形態として、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｚｈｏｎｇら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８１：１９４〜２０２頁（２００８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：７８２７〜３２頁（２００８））に記載された変異を含み得る。例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸７３０位においてＹ→Ｆ変異を含み得る。
上記改変は、互いに組み合わせて、および／あるいは現在公知のまたは後に発見される任意の他の改変と組み合わせて、本発明のカプシドタンパク質またはカプシド中に取り込まれ得る。
本発明は、本発明の改変されたカプシドタンパク質およびカプシドを含むウイルスベクターもまた包含する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスカプシドおよび／またはベクターゲノムを含んでいる）、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶカプシドおよび／またはベクターゲノムを含んでいる）である。代表的実施形態では、ウイルスベクターは、本発明の改変されたカプシドサブユニットを含む改変されたＡＡＶカプシドとベクターゲノムとを含む。
例えば、代表的実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）本発明の改変されたカプシドタンパク質を含む改変されたウイルスカプシド（例えば、改変されたＡＡＶカプシド）と、（ｂ）末端反復配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ）を含む核酸とを含み、この末端反復配列を含む核酸は、改変されたウイルスカプシドによってカプシド封入されている。核酸は、２つの末端反復（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を任意選択的に、含み得る。
代表的実施形態では、ウイルスベクターは、対象のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする異種核酸を含む組換えウイルスベクターである。組換えウイルスベクターは、以下により詳細に記載される。
特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、改変されたカプシドタンパク質なしのウイルスベクターによる形質導入のレベルと比較して、肝臓の形質導入が減少している。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、筋肉に対する全身性形質導入を有し、例えば、ベクターは、体中の複数の骨格筋群を形質導入し、任意選択的に、心筋および／または横隔膜筋を形質導入する。
本発明の改変されたカプシドタンパク質、ウイルスカプシドおよびウイルスベクターは、そのネイティブ状態において特定の位置に示されたアミノ酸を有するカプシドタンパク質、カプシドおよびウイルスベクター（即ち、変異体ではない）を排除することが、当業者に理解されるであろう。
ウイルスベクターを生成する方法。
本発明は、本発明のウイルスベクターを生成する方法をさらに提供する。１つの代表的実施形態では、本発明は、ウイルスベクターを生成する方法を提供し、この方法は、（ａ）少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）を含む核酸鋳型と、（ｂ）核酸鋳型の複製およびＡＡＶカプシド中へのカプシド封入に充分なＡＡＶ配列（例えば、本発明のＡＡＶカプシドをコードするＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列）とを、細胞に提供するステップを含む。任意選択的に、核酸鋳型は、少なくとも１つの異種核酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、核酸鋳型は２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、これらは、（存在する場合）異種核酸配列に対して５’側および３’側に位置するが、異種核酸配列と直接隣接している必要はない。
核酸鋳型ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた核酸鋳型を含むウイルスベクターが細胞中で生成されるような条件下で提供される。この方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含み得る。ウイルスベクターは、培地からおよび／または細胞を溶解することによって回収され得る。
細胞は、ＡＡＶウイルスの複製を許容する細胞であり得る。当該分野で公知の任意の適切な細胞が使用され得る。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失した機能を提供するトランス補完性（ｔｒａｎｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完性細胞であり得る。
ＡＡＶ複製およびカプシド配列は、当該分野で公知の任意の方法によって提供され得る。現在のプロトコールは典型的に、単一のプラスミド上のＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は、一緒に提供される必要はないが、一緒に提供するのが簡便であり得る。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失型アデノウイルスベクターのＥ１ａ領域またはＥ３領域中に挿入される）。ＥＢＶベクターもまた、ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現するために使用され得る。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであるが、連続的な細胞分裂の間中、高コピー数をなおも維持することである（即ち、「ＥＢＶベースの核エピソーム（ＥＢＶ ｂａｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｐｉｓｏｍｅ）」と称される染色体外エレメントとして細胞中に安定に組み込まれる、Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７頁を参照のこと）。
さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞中に安定に取り込まれ得る。
典型的には、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防止するために、ＴＲと隣接していない。
核酸鋳型は、当該分野で公知の任意の方法を使用して細胞に提供され得る。例えば、鋳型は、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施形態では、核酸鋳型は、ヘルペスウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失型アデノウイルスのＥ１ａ領域またはＥ３領域中に挿入される）。別の説明として、Ｐａｌｏｍｂｏら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５頁は、ＡＡＶ ＴＲが隣接するレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターを記載している。ＥＢＶベクターもまた、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上記したように、鋳型を送達するために使用され得る。
別の代表的実施形態では、核酸鋳型は、複製するｒＡＡＶウイルスによって提供される。なお他の実施形態では、核酸鋳型を含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体中に安定に組み込まれる。
ウイルス力価を増強するために、増殖性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が、細胞に提供され得る。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当該分野で公知である。典型的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルス配列またはヘルペスウイルス配列は、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５頁；ならびに米国特許第６，０４０，１８３号および同第６，０９３，５７０号によって記載されるような、効率的なＡＡＶ生成を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、別の非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって提供され得る。
さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体中に埋め込まれたまたは安定な染色体外エレメントとして維持されるヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン中にパッケージングすることはできない、例えば、ＴＲが隣接していない。
単一のヘルパー構築物上のＡＡＶ複製およびカプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利であり得ることを、当業者は理解するであろう。このヘルパー構築物は、非ウイルス構築物でもウイルス構築物でもよい。１つの非限定的説明として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。
１つの特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、核酸鋳型をさらに含み得る。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルスの欠失した領域（例えば、Ｅ１ａ領域またはＥ３領域）中に挿入され得る。
さらなる実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施形態によれば、ｒＡＡＶ鋳型は、プラスミド鋳型として提供され得る。
別の例示的実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、ｒＡＡＶ鋳型は、プロウイルスとして細胞中に取り込まれる。あるいは、ｒＡＡＶ鋳型は、染色体外エレメント（例えば、ＥＢＶベースの核エピソーム）として細胞内で維持されるＥＢＶベクターによって提供される。
さらなる例示的な実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。ｒＡＡＶ鋳型は、別個の複製するウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ｒＡＡＶ鋳型は、ｒＡＡＶ粒子または第２の組換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。
上述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは典型的に、アデノウイルスの複製およびパッケージングに充分なアデノウイルスの５’および３’のシス配列（即ち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列および存在する場合にはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルス骨格中に埋め込まれ、５’および３’のシス配列がそれに隣接しており、その結果これらの配列は、アデノウイルスカプシド中にパッケージングされ得る。上記のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列には一般に、これらの配列がＡＡＶビリオン中にパッケージングされないように、ＴＲが隣接していない。
Ｚｈａｎｇら（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４〜１２頁）は、アデノウイルスならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーを記載している。
ヘルペスウイルスもまた、ＡＡＶパッケージング法においてヘルパーウイルスとして使用され得る。１もしくは複数のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、拡大縮小可能なＡＡＶベクター生成スキームを有利に促進し得る。ＡＡＶ−２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）ベクターが、Ｃｏｎｗａｙら（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９８６頁およびＰＣＴ公開公報ＷＯ００／１７３７７号に記載されている。
さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、例えばＵｒａｂｅら（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５〜４３頁に記載されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶ鋳型を送達するためのバキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞中で生成され得る。
混入するヘルパーウイルスを含まないＡＡＶベクターストックは、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得る。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に識別され得る。ＡＡＶはまた、ヘパリン基質に対する親和性に基づいて、ヘルパーウイルスから分離され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３頁）。任意の混入するヘルパーウイルスが複製コンピテントにならないように、欠失型複製欠損ヘルパーウイルスが使用され得る。アデノウイルス初期遺伝子発現のみがＡＡＶウイルスのパッケージングを媒介するために必要なので、さらなる代替として、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーが使用され得る。後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルス変異体は当該分野で公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。
組換えウイルスベクター。
本発明のウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで細胞に核酸を送達するために有用である。特に、ウイルスベクターは、例えば哺乳動物細胞を含む動物細胞に核酸を送達または移入するために有利に使用され得る。
対象の１もしくは複数の任意の異種核酸配列は、本発明のウイルスベクター中で送達され得る。対象の核酸には、治療的（例えば、医療用途または獣医学用途のため）ポリペプチドまたは免疫原性（例えば、ワクチンのため）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸が含まれる。
治療的ポリペプチドには以下が含まれるがこれらに限定されない：嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＦＴＲ））、ジストロフィン（ミニジストロフィンおよびマイクロジストロフィン）が含まれる、例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０頁；米国特許公開公報２００３０１７１３１号；ＰＣＴ公開公報ＷＯ／２００８／０８８８９５号、Ｗａｎｇら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３７１４〜１３７１９頁（２０００）；およびＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃら Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７〜６４頁（２００８）を参照のこと）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ−１、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９頁）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α１−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子−３および−４、脳由来神経栄養因子、骨形態形成（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）タンパク質［ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦが含まれる］、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子−αおよび−βなど）、リソソーム酸α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死増殖因子α可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、カルシウムハンドリングをモジュレートする分子（例えば、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＰＰ１のインヒビター１およびそれらの断片［例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００６／０２９３１９号およびＷＯ２００７／１００４６５号］）、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子、ＩＲＡＰなどの抗炎症性因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体が含まれる；例示的なＭａｂは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｍａｂである）、ニューロペプチドおよびその断片（例えば、ガラニン、ニューロペプチドＹ（米国特許第７，０７１，１７２号を参照のこと）、バソヒビンなどの血管新生インヒビターならびに他のＶＥＧＦインヒビター（例えば、バソヒビン２［ＰＣＴ公開公報ＷＯＪＰ２００６／０７３０５２号を参照のこと］）。他の例示的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子）、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ−リガンド、およびそれを必要とする対象において治療効果を有する任意の他のポリペプチドをコードする。ＡＡＶベクターは、モノクローナル抗体および抗体断片、例えば、ミオスタチンに対する抗体または抗体断片を送達するためにも使用され得る（例えば、Ｆａｎｇら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：５８４〜５９０頁（２００５）を参照のこと）。
ポリペプチドをコードする異種核酸配列には、レポーターポリペプチド（例えば酵素）をコードする異種核酸配列が含まれる。レポーターポリペプチドは当該分野で公知であり、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。
任意選択的に、異種核酸は、分泌型ポリペプチド（例えば、そのネイティブ状態で分泌型ポリペプチドであるポリペプチド、または例えば当該分野で公知の分泌シグナル配列との作動可能な関連によって分泌されるように操作されたポリペプチド）をコードする。
あるいは、本発明の特定の実施形態では、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載される）、スプライソソーム媒介性のトランススプライシングをもたらすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４頁６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照のこと）、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１頁を参照のこと）および「ガイド」ＲＮＡなどの他の非翻訳ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９頁；Ｙｕａｎらに対する米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードし得る。例示的な非翻訳ＲＮＡには、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または化学療法による損傷を予防するために心臓に投与するため）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのため）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療および／または予防するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患を治療するため、例えば、Ａｎｄｉｎｏら Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２〜１４２頁（２００８）およびＬｉら Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１〜５５頁（２００５）を参照のこと）；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害分子またはドミナントネガティブ分子（例えば、心血管疾患を治療するため、例えば、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａら Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４〜８７１頁（２００２）を参照のこと）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、癲癇のため）、ならびに病原性生物およびウイルス（例えば、Ｂ型および／またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルスなど）に対するＲＮＡｉが含まれる。
さらに、選択的スプライシングを指示する核酸配列が送達され得る。説明するために、ストロフィンエクソン５１の５’および／または３’スプライス部位に相補的なアンチセンス配列（または他の阻害配列）が、このエクソンの読み飛ばしを誘導するためにＵ１またはＵ７低分子核内（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターと合わせて送達され得る。例えば、１もしくは複数のアンチセンス／阻害配列に対して５’側に位置するＵ１またはＵ７ ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列は、本発明の改変されたカプシド中にパッケージングされて送達され得る。
ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有し、宿主染色体上の遺伝子座と組み換わる異種核酸もまた含み得る。このアプローチは、例えば、宿主細胞中の遺伝的欠陥を修正するために利用され得る。
本発明は、例えばワクチン接種のための免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスベクターもまた提供する。核酸は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶまたはＳＩＶのｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原など由来の免疫原が含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知の対象の任意の免疫原をコードし得る。
ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は当該分野で公知である（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：８５０７頁；Ｙｏｕｎｇらに対する米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａらに対する米国特許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Ｓａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第５，８６３，５４１号を参照のこと）。抗原は、パルボウイルスカプシド中に存在し得る。あるいは、抗原は、組換えベクターゲノム中に導入された異種核酸から発現され得る。本明細書中に記載されるおよび／または当該分野で公知の対象の任意の免疫原は、本発明のウイルスベクターによって提供され得る。
免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を惹起するのに適した、ならびに／または微生物、細菌、原生動物、寄生生物、真菌および／もしくはウイルスの感染および疾患が含まれるがこれらに限定されない感染および／もしくは疾患に対して対象を保護するのに適した任意のポリペプチドであり得る。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原などの、インフルエンザウイルス免疫原）もしくはレンチウイルス免疫原（例えば、ＨＩＶもしくはＳＩＶのエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶもしくはＳＩＶのマトリックス／カプシドタンパク質ならびにＨＩＶもしくはＳＩＶのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物などの、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原）であり得る。免疫原性ポリペプチドは、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス核カプシドタンパク質および／またはラッサ熱エンベロープ糖タンパク質などのラッサ熱ウイルス免疫原）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物などのワクシニアウイルス免疫原）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、ＮＰおよびＧＰ遺伝子産物などの、エボラウイルス免疫原またはマールブルグウイルス免疫原）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦおよび／またはＳＦＳウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質などの感染性ヒトコロナウイルス免疫原、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原またはトリ感染性気管支炎ウイルス免疫原）でもあり得る。免疫原性ポリペプチドはさらに、ポリオ免疫原、ヘルペスウイルス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）ムンプスウイルス免疫原、麻疹ウイルス免疫原、風疹ウイルス免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）免疫原、および／または当該分野で現在公知のまたは免疫原として後に同定される任意の他のワクチン免疫原であり得る。
あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍細胞またはがん細胞の抗原であり得る。任意選択的に、腫瘍抗原またはがん抗原は、がん細胞の表面上に発現される。例示的ながんおよび腫瘍細胞の抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１頁（１９９１））に記載されている。他の例示的ながん抗原および腫瘍抗原には、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、β−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５頁；Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７頁；Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４頁）、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００ ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ−１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９頁）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＮＳＥ、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ−１、ＣＡ７２−４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ−ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ、（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３頁）；ムチン抗原（ＰＣＴ公開公報ＷＯ９０／０５１４２号）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；および／あるいは現在公知のまたは以下のがんに関連することが後に発見される抗原：メラノーマ、腺がん腫、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がん、および現在公知のまたは後に同定される任意の他のがんまたは悪性状態（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１〜９１頁を参照のこと）。
さらなる代替として、異種核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞中で生成されることが望ましい任意のポリペプチドをコードし得る。例えば、ウイルスベクターは、培養細胞中に導入され得、発現された遺伝子産物がそこから単離される。
対象の１もしくは複数の異種核酸が適切な制御配列と作動可能に関連し得ることが、当業者に理解されよう。例えば、異種核酸は、発現制御エレメント、例えば転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどと、作動可能に関連し得る。
さらに、対象の１もしくは複数の異種核酸の調節された発現は、転写後レベルで、例えば、オリゴヌクレオチド、小分子および／または特定の部位におけるスプライシング活性を選択的に遮断する他の化合物（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００６／１１９１３７号に記載される）の存在または非存在によって、異なるイントロンの選択的スプライシングを調節することによって、達成され得る。
種々のプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望されるレベルおよび組織特異的発現に依存して使用され得ることを、当業者は理解するであろう。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに依存して、構成的または誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であり得、天然配列または合成配列であり得る。外来とは、転写開始領域が、その転写開始領域が導入される野生型宿主において見出されないものであることを意図する。
特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象にとってネイティブであり得る。代表的実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列にとってネイティブであり得る。プロモーター／エンハンサーエレメントは一般に、対象の１もしくは複数の標的細胞において機能するように選択される。さらに、特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的でも誘導性でもよい。
誘導性発現制御エレメントは典型的に、１もしくは複数の異種核酸配列の発現の調節を提供することが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的プロモーター／エンハンサーエレメントまたは好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントであり得、筋特異的または好ましい（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好ましいものが含まれる）、神経組織特異的または好ましい（脳特異的または好ましいものが含まれる）、眼特異的または好ましい（網膜特異的および角膜特異的なものが含まれる）、肝臓特異的または好ましい、骨髄特異的または好ましい、膵臓特異的または好ましい、脾臓特異的または好ましい、および／あるいは肺特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントが含まれる。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、ホルモン誘導性エレメントおよび金属誘導性エレメントが含まれる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
１もしくは複数の異種核酸配列が標的細胞において転写され、次いで翻訳される実施形態では、特異的開始シグナルが一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために含まれる。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得るこれらの外因性翻訳制御配列は、天然および合成の両方の、種々の起源のものであり得る。
本発明に従うウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞を含む広範な細胞中に異種核酸を送達する手段を提供する。ウイルスベクターは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでポリペプチドを生成するためまたはｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子療法のために、対象の核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に送達するために使用され得る。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性もしくは治療的ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを発現するために、それを必要とする対象に核酸を送達する方法において、さらに有用である。この様式で、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡは、対象中でｉｎ ｖｉｖｏで生成され得る。対象は、ポリペプチドの欠乏症を有するので、そのポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチドまたは機能的ＲＮＡの生成は、いくらかの有益な効果を付与し得るので、この方法が実施され得る。
ウイルスベクターは、（例えば、スクリーニング方法と合わせて、例えばポリペプチドを生成するためまたは対象に対する機能的ＲＮＡの影響を観察するためのバイオリアクタとして対象を使用して）培養細胞または対象において対象のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを生成するためにも使用され得る。
一般に、本発明のウイルスベクターは、治療的ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを送達することが有利な任意の疾患状態を治療および／または予防するために、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする異種核酸を送達するために使用され得る。例示的な疾患状態には、以下が含まれるがこれらに限定されない。嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質）および他の肺の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β−グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β−インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（反復を除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、癲癇（ガラニン、神経栄養因子）および他の神経学的障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ−リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ、ｍｉｒ−２６ａ［例えば、肝細胞がん腫のため］）、真正糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様増殖因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、エクソン読み飛ばしを誘導するためのジストロフィン遺伝子中のスプライスジャンクションに対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ［例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ／２００３／０９５６４７号を参照のこと］、エクソン読み飛ばしを誘導するためのＵ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ／２００６／０２１７２４号を参照のこと］、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片）およびベッカー型を含む筋ジストロフィー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠乏症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原貯蔵疾患（例えば、ファブリー病［α−ガラクトシダーゼ］およびポンペ病［リソソーム酸α−グルコシダーゼ］）および他の代謝障害、先天性肺気腫（α１−アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（Ｔａｙｓ Ｓａｃｈｓ ｄｉｓｅａｓｅ）（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸脱水素酵素）、網膜変性疾患（ならびに眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症についてＰＤＧＦ、および／あるいは例えばＩ型糖尿病における網膜障害を治療／予防するためのバソヒビンもしくはＶＥＧＦの他のインヒビターまたは他の血管新生インヒビター）、固形臓器の疾患、例えば脳（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンジオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、膠芽腫［エンドスタチン、アンジオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］が含まれる）、肝臓、腎臓、うっ血性心不全または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含む心臓（例えば、プロテインホスファターゼインヒビターＩ（Ｉ−１）およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２アドレナリン受容体、β２アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子；カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害分子またはドミナントネガティブ分子などを送達することによる）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節障害（インスリン様増殖因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することによる）、心臓移植物の生存の改善（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様増殖因子Ｉ）、腎臓欠損症（ｋｉｄｎｅｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（ＩＲＡＰおよびＴＮＦα可溶性受容体などの抗炎症性因子）、肝炎（α−インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠乏症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脊髄性大脳性運動失調症（ｓｐｉｎａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｔａｘｉａｓ）、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患など。本発明はさらに、移植の成功率を増加させるためおよび／または臓器移植もしくは補助療法の負の副作用を低下させるために、臓器移植後に使用され得る（例えば、サイトカイン生成を遮断するために免疫抑制剤または阻害核酸を投与することによって）。別の例として、骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）が、例えば、がん患者における破壊（ｂｒｅａｋ）または外科的除去後に、骨同種移植片と共に投与され得る。
本発明は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を生成するためにも使用され得る。例えば、本発明のウイルスベクターは、例えば成人線維芽細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腎細胞、脂肪細胞、心臓細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞などの非多能性細胞中に、１もしくは複数の幹細胞関連核酸を送達するために使用され得る。幹細胞に関連する因子をコードする核酸は、当該分野で公知である。かかる幹細胞および多能性に関連する因子の非限定的な例には、Ｏｃｔ−３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３および／またはＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４および／またはＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃおよび／またはＮ−ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８が含まれる。
本発明はまた、代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子）、リソソーム蓄積症、例えば、ムコ多糖症障害（例えば、スライ症候群［β−グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［α−Ｌ−イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ］、Ｂ［β−ガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ］など）、ファブリー病（α−ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸α−グルコシダーゼ）を治療および／または予防するために実施され得る。
遺伝子移入は、疾患状態のための療法を理解および提供するためのかなり有望な用途を有する。欠損した遺伝子が既知でありクローニングされている多数の遺伝性疾患が存在する。一般に、上記疾患状態は２つのクラスに入る：劣性様式で一般に遺伝する、通常は酵素の欠乏状態、および調節タンパク質または構造タンパク質が関与し得、典型的には優性様式で遺伝するバランスを欠いた状態。欠乏状態の疾患について、遺伝子移入は、補充療法のために罹患組織中に正常な遺伝子をもたらすため、ならびにアンチセンス変異を使用して疾患の動物モデルを創出するために使用され得る。バランスを欠いた疾患状態について、遺伝子移入は、モデル系において疾患状態を創出するために使用され得、このモデル系は次いで疾患状態に対抗するための試みにおいて使用され得る。従って、本発明に従うウイルスベクターは、遺伝疾患の治療および／または予防を可能にする。
本発明に従うウイルスベクターは、機能的ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に提供するためにも使用され得る。細胞における機能的ＲＮＡの発現は、例えば、細胞による特定の標的タンパク質の発現を減殺し得る。従って、機能的ＲＮＡは、それを必要とする対象において特定のタンパク質の発現を減少させるために投与され得る。機能的ＲＮＡはまた、遺伝子発現および／または細胞生理学を調節するため、例えば、細胞もしくは組織培養系を最適化するために、またはスクリーニング方法において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に投与され得る。
さらに、本発明に従うウイルスベクターは、診断方法およびスクリーニング方法において用途を見出し、それにより、対象の核酸が、細胞培養系において、あるいはトランスジェニック動物モデルにおいて、一過的にまたは安定に発現される。
本発明のウイルスベクターは、当業者に明らかなように、遺伝子の標的化、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコールにおける使用が含まれるがこれらに限定されない種々の非治療的目的のためにも使用され得る。ウイルスベクターは、安全性（伝播、毒性、免疫原性など）を評価する目的のためにも使用され得る。かかるデータは、例えば、臨床的有効性の評価の前に、通常の承認プロセスの一部として、米国食品医薬品局によって検討される。
さらなる態様として、本発明のウイルスベクターは、対象において免疫応答を生成するために使用され得る。この実施形態によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むウイルスベクターが対象に投与され得、その免疫原性ポリペプチドに対する能動免疫応答が、対象によって開始される。免疫原性ポリペプチドは、本明細書中で上記したとおりである。いくつかの実施形態では、防御免疫応答が惹起される。
あるいは、ウイルスベクターは、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞に投与され得、変更された細胞が対象に投与される。異種核酸を含むウイルスベクターが細胞中に導入され、その細胞が対象に投与され、ここで、免疫原をコードする異種核酸が発現され得、対象においてその免疫原に対する免疫応答を誘導し得る。特定の実施形態では、細胞は抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。
「能動免疫応答」または「能動免疫」は、「免疫原との遭遇後の宿主組織および細胞の関与」を特徴とし、「これは、抗体の合成もしくは細胞媒介反応性の発生またはそれら両方を導く、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化および増殖に関与する。」Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ、Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ編、１９８５）。代替的に述べると、能動免疫応答は、感染またはワクチン接種による免疫原への曝露後に宿主によって開始される。能動免疫は受動免疫と対比され得、受動免疫は、「能動免疫された宿主から非免疫宿主への、予め形成された物質（抗体、トランスファー因子、胸腺移植片、インターロイキン−２）の移入」を介して達成される（同文献）。
「防御」免疫応答または「防御」免疫は、本明細書中で使用される場合、疾患の発生率を予防するまたは低下させるという点で、免疫応答が対象にいくらかの利益を付与することを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特にがんまたは腫瘍の治療および／または予防において有用であり得る（例えば、がんまたは腫瘍の形成を予防することによって、がんまたは腫瘍の退縮を引き起こすことによって、および／あるいは転移を予防することによって、および／あるいは転移性小結節の増殖を予防することによって）。防御効果は、治療の利益がその任意の不利益を上回る限り、完全でも部分的でもよい。
特定の実施形態では、異種核酸を含むウイルスベクターまたは細胞は、本明細書中に記載される免疫原的有効量で投与され得る。
本発明のウイルスベクターは、１つまたは複数のがん細胞抗原（または免疫学的に類似の分子）あるいはがん細胞に対する免疫応答を生成する任意の他の免疫原を発現するウイルスベクターの投与によるがん免疫療法のためにも投与され得る。説明するために、例えばがんを有する患者を治療するためおよび／または対象においてがんの発生を予防するために、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することによって、対象においてがん細胞抗原に対する免疫応答が生成され得る。ウイルスベクターは、本明細書中で記載されるように、ｉｎ ｖｉｖｏでまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法を使用することによって、対象に投与され得る。あるいは、がん抗原は、ウイルスカプシドの一部として発現され得るか、またはウイルスカプシドと他の方法で関連し得る（例えば、上記されるように）。
別の代替として、当該分野で公知の任意の他の治療的核酸（例えば、ＲＮＡｉ）またはポリペプチド（例えば、サイトカイン）が、がんを治療および／または予防するために投与され得る。
本明細書中で使用する場合、用語「がん」は、腫瘍形成がんを包含する。同様に、用語「がん性組織」は腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は腫瘍抗原を包含する。
用語「がん」は、当該分野で理解される意味を有し、例えば、身体の離れた部位に伝播する能力を有する組織の制御されない増殖（即ち、転移）である。例示的ながんには、メラノーマ、腺がん腫、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんならびに現在公知のまたは後に同定される任意の他のがんまたは悪性状態が含まれるが、これらに限定されない。代表的実施形態では、本発明は、腫瘍形成がんを治療および／または予防する方法を提供する。
用語「腫瘍」もまた、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊として、当該分野で理解される。腫瘍は悪性または良性であり得る。代表的実施形態では、本明細書中に開示される方法は、悪性腫瘍を予防および治療するために使用される。
用語「がんを治療する」、「がんの治療」および等価な用語は、がんの重症度が低下されもしくは少なくとも部分的に排除されること、ならびに／または疾患の進行が減速されるおよび／もしくは制御されること、ならびに／または疾患が安定化されることを意図する。特定の実施形態では、これらの用語は、がんの転移が予防もしくは低下もしくは少なくとも部分的に排除されること、ならびに／または転移性小結節の増殖が予防もしくは低下もしくは少なくとも部分的に排除されることを示す。
用語「がんの予防」または「がんを予防する」および等価な用語は、その方法が、がんの発症の発生率および／または重症度を、少なくとも部分的に排除または低下および／または遅延させることを意図する。代替的に述べると、対象におけるがんの発症は、尤度もしくは確率において低下され得る、および／または遅延され得る。
特定の実施形態では、細胞は、がんを有する対象から取り出され得、本発明に従うがん細胞抗原を発現するウイルスベクターと接触され得る。次いで、改変された細胞が対象に投与され、それにより、がん細胞抗原に対する免疫応答が惹起される。この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで充分な免疫応答を開始できない（即ち、充分な量で促進抗体を生成できない）易感染性対象と共に有利に使用され得る。
免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、ω−インターフェロン、τ−インターフェロン、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１８、Ｂ細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、単球走化性因子タンパク質−１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびリンホトキシン）によって増強され得ることが、当該分野で公知である。従って、免疫調節性サイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）が、ウイルスベクターと合わせて対象に投与され得る。
サイトカインは、当該分野で公知の任意の方法によって投与され得る。外因性サイトカインが対象に投与され得るか、あるいはサイトカインをコードする核酸が適切なベクターを使用して対象に送達され得、サイトカインがｉｎ ｖｉｖｏで生成され得る。
対象、医薬製剤および投与様式。
本発明に従うウイルスベクターおよびカプシドは、獣医学適用および医療適用の両方において用途を見出す。適切な対象には、トリおよび哺乳動物の両方が含まれる。用語「トリ」には、本明細書中で使用する場合、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコなどが含まれるがこれらに限定されない。用語「哺乳動物」には、本明細書中で使用する場合、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどが含まれるがこれらに限定されない。ヒト対象には、新生児、乳幼児、若年、成人および老人の対象が含まれる。
代表的実施形態では、対象は、本発明の方法「を必要とする」、従っていくつかの実施形態では、「それを必要とする対象」であり得る。
特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体中に本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドを含み、任意選択的に、他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、担体、補助剤、希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注射について、担体は典型的には液体である。他の投与方法について、担体は固体または液体のいずれかであり得る。吸入投与について、担体は呼吸用であり、任意選択的に、固体または液体の粒状形態であり得る。
「薬学的に許容される」とは、毒性でなくその他の点でも望ましくない材料、即ち、その材料が、望ましくない生物学的影響をいずれも引き起こすことなしに対象に投与され得ることを意味する。
本発明の一態様は、核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に移入する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適した標準的な形質導入法に従って、適切な感染多重度で細胞中に導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞の型および数、ならびに特定のウイルスベクターに依存して変動し得、過度の実験なしに当業者によって決定され得る。代表的実施形態では、少なくとも約１０３感染単位、任意選択的に、少なくとも約１０５感染単位が、細胞に導入される。
ウイルスベクターが導入される１もしくは複数の細胞は、任意の型の細胞であり得、以下が含まれるがこれらに限定されない：神経細胞（末梢神経系および中枢神経系の細胞、特に、ニューロンおよびオリゴデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｉｃｙｔｅ）などの脳細胞が含まれる）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮および角膜細胞が含まれる）、上皮細胞（例えば、腸および呼吸器の上皮細胞）、筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞が含まれる）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞など。代表的実施形態では、細胞は任意の前駆細胞であり得る。さらなる実施形態として、細胞は幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であり得る。なおさらなる実施形態として、細胞はがん細胞または腫瘍細胞であり得る。さらに、細胞は、上で示したような任意の種起源であり得る。
ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞中に導入され得る。特定の実施形態では、細胞は、対象から取り出されたものであり、ウイルスベクターがその細胞に導入され、次いでその細胞が対象中に戻し投与される。ｅｘ ｖｉｖｏでの操作のために対象から細胞を取り出し、その後対象中に戻し導入する方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）。あるいは、組換えウイルスベクターは、ドナー対象由来の細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の適切な供給源由来の細胞中に導入され得、この細胞が、それを必要とする対象（即ち、「レシピエント」対象）に投与される。
ｅｘ ｖｉｖｏ核酸送達に適した細胞は上記のとおりである。対象に投与する細胞の投薬量は、対象の年齢、状態および種、細胞の型、細胞が発現する核酸、投与様式などに応じて変動する。典型的には、少なくとも約１０２〜約１０８細胞または少なくとも約１０３〜約１０６細胞が、１投薬当たり薬学的に許容される担体中で投与される。特定の実施形態では、ウイルスベクターで形質導入された細胞は、医薬担体と組み合わせて、治療有効量または予防有効量で対象に投与される。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが細胞中に導入され、その細胞が、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子として発現されたまたはカプシド中の）に対する免疫原性応答を惹起するために、対象に投与され得る。典型的には、免疫原的有効量のポリペプチドを発現する細胞の量が、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される。「免疫原的有効量」は、医薬製剤が投与される対象において、そのポリペプチドに対する能動免疫応答を誘起するのに充分な、発現されたポリペプチドの量である。特定の実施形態では、投薬量は、防御免疫応答（上で定義した）を生成するのに充分である。免疫原性ポリペプチドを投与することの利益がその任意の不利益を上回る限り、付与される保護の程度は、完全または永続的である必要はない。
本発明のさらなる態様は、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを対象に投与する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への、本発明に従うウイルスベクターおよび／またはカプシドの投与は、当該分野で公知の任意の手段によってであり得る。任意選択的に、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、薬学的に許容される担体中で、治療有効用量または予防有効用量で送達され得る。
本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドはさらに、（例えば、ワクチンとして）免疫原性応答を惹起するために投与され得る。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、免疫原的有効量のウイルスベクターおよび／またはカプシドを含む。任意選択的に、投薬量は、防御免疫応答（上で定義した）を生成するのに充分である。
対象に投与されるウイルスベクターおよび／またはカプシドの投薬量は、投与様式、治療および／または予防される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクターまたはカプシド、送達される核酸などに依存し、慣用的な様式で決定され得る。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０３、１０１４、１０１５形質導入単位、任意選択的に、約１０８〜１０１３形質導入単位の力価である。
特定の実施形態では、１回より多い投与（例えば、２回、３回、４回またはそれ以上の投与）が、例えば、毎日、週１回、月１回、年１回などの種々の間隔の期間にわたって、所望のレベルの遺伝子発現を達成するために使用され得る。
例示的な投与様式には、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介して）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋への投与が含まれる］、皮内、胸膜内、脳内および関節内）、外用（例えば、気道表面を含む皮膚表面および粘膜表面の両方への、ならびに経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接的な組織または臓器への注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳への）が含まれる。
投与は、腫瘍への投与であり得る（例えば、腫瘍またはリンパ節の中または近傍）。任意の所与の場合における最も適切な経路は、治療および／または予防される状態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のベクターの性質に依存する。
本発明に従う骨格筋への投与には、四肢（例えば、上腕、前腕、大腿および／または下腿）、背部、頚部、頭部（例えば、舌）、胸郭、腹部、骨盤／会陰部および／または指の骨格筋への投与が含まれるが、これらに限定されない。適切な骨格筋には以下が含まれるがこれらに限定されない：小指外転筋（手の）、小趾外転筋（足の）、母趾外転筋、第五中足骨外転筋（ａｂｄｕｃｔｏｒ ｏｓｓｉｓ ｍｅｔａｔａｒｓｉ ｑｕｉｎｔｉ）、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転筋、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、顎二腹筋、背側骨間筋（手の）、背側骨間筋（足の）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短趾伸筋、長趾伸筋、短母趾伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手の）、短小趾屈筋（足の）、短趾屈筋、長趾屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大臀筋、中臀筋、小臀筋、薄筋、頸腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋（ｉｌｌｉａｃｕｓ）、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間筋（ｉｎｔｅｒｔｒａｎｓｖｅｒｓｉ）、外側翼突筋、外直筋、広背筋、口角挙筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋（ｌｏｎｇ ｒｏｔａｔｏｒｓ）、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手の）、虫様筋（足の）、咬筋、内側翼突筋、内直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頸半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋（ｓｈｏｒｔ ｒｏｔａｔｏｒｓ）、ヒラメ筋、頭棘筋、頸棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頸板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸部の筋、甲状舌骨筋、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋および小頬骨筋、ならびに当該分野で公知の任意の他の適切な骨格筋。
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流（任意選択的に、下肢および／または腕の孤立した四肢灌流；例えば、Ａｒｒｕｄａら（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８〜３４６４頁を参照のこと）、および／または直接的筋内注射によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、四肢灌流、任意選択的に、孤立した四肢灌流（例えば、静脈内投与または関節内投与による）によって、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）の四肢（腕および／または下肢）に投与される。本発明の実施形態では、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、「水力学的」技術を使用することなく有利に投与され得る。ベクターの組織送達（例えば、筋肉への）は、脈管構造中の圧力を増加させ、内皮細胞障壁を横切るベクターの能力を促進する水力学的技術（例えば、大容量での静脈内／静脈内投与）によって増強されることが多い。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、高容量注入および／または上昇した血管内圧力（例えば、正常な収縮期血圧より高い、例えば、血管内圧力における５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下の、正常な収縮期血圧を超えた増加）などの水力学的技術の非存在下で投与され得る。かかる方法は、浮腫、神経損傷および／またはコンパートメント症候群などの、水力学的技術に関連する副作用を低下または回避し得る。
心筋への投与には、左心房、右心房、左心室、右心室および／または中隔への投与が含まれる。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接的心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室中への）および／または冠状動脈灌流によって、心筋に送達され得る。
横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与および／または腹腔内投与を含む任意の適切な方法によるものであり得る。
標的組織への送達は、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むデポーを送達することによっても達成され得る。代表的実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むデポーは、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋組織中に移植され、あるいは組織が、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むフィルムまたは他のマトリックスと接触され得る。かかる移植可能なマトリックスまたは基材は、例えば米国特許第７，２０１，８９８号中に記載されている。
特定の実施形態では、本発明に従うウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、（例えば、筋ジストロフィー、心臓疾患［例えば、ＰＡＤまたはうっ血性心不全］を治療および／または予防するために）骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与される。
代表的実施形態では、本発明は、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋の障害を治療および／または予防するために使用される。
代表的実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において筋ジストロフィーを治療および／または予防する方法を提供し、この方法は、治療有効量または予防有効量の本発明のウイルスベクターを哺乳動物対象に投与するステップを含み、このウイルスベクターは、以下をコードする異種核酸を含む：ジストロフィン、ミニジストロフィン、ミクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ−１、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミクロジストロフィン、ラミニン−α２、α−サルコグリカン、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、δ−サルコグリカン、ＩＧＦ−１、ミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片、および／あるいはミオスタチンに対するＲＮＡｉ。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書中の別の箇所に記載するように、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与され得る。
あるいは、本発明は、骨格筋、心筋または横隔膜筋に核酸を送達するために実施され得、これらの筋肉は、正常に血中を循環するポリペプチド（例えば、酵素）または機能的ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の生成のための、あるいは障害（例えば、代謝障害、例えば糖尿病［例えば、インスリン］、血友病［例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子］、ムコ多糖障害［例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群など］、またはリソソーム蓄積症、例えば、ゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］もしくはファブリー病［α−ガラクトシダーゼＡ］、またはポンペ病［リソソーム酸αグルコシダーゼ］などの糖原貯蔵障害）を治療および／または予防するための他の組織への全身送達のための、プラットフォームとして使用される。代謝障害を治療および／または予防するのに適した他のタンパク質は、本明細書中に記載されている。対象の核酸を発現するためのプラットフォームとしての筋肉の使用は、米国特許公開公報２００２０１９２１８９号に記載されている。
従って、一態様として、本発明はさらに、それを必要とする対象において代謝障害を治療および／または予防する方法を包含し、この方法は、治療有効量または予防有効量の本発明のウイルスベクターを対象の骨格筋に投与するステップを含み、このウイルスベクターはポリペプチドをコードする異種核酸を含み、この代謝障害は、ポリペプチドの欠乏および／または欠損の結果である。例示的な代謝障害およびポリペプチドをコードする異種核酸は、本明細書中に記載されている。任意選択的に、ポリペプチドは分泌される（例えば、そのネイティブ状態で分泌されたポリペプチドであるポリペプチド、あるいは例えば当該分野で公知の分泌シグナル配列との作動可能な関連によって分泌されるように操作されたポリペプチド）。本発明の任意の特定の理論に限定されず、この実施形態によれば、骨格筋への投与は、全身循環中へのポリペプチドの分泌および１もしくは複数の標的組織への送達を生じ得る。ウイルスベクターを骨格筋に送達する方法は、本明細書中でより詳細に記載される。
本発明は、全身送達のためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたは他の機能的ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を生成するためにも実施され得る。
本発明は、それを必要とする対象において先天性心不全またはＰＡＤを治療および／または予防する方法もまた提供し、この方法は、治療有効量または予防有効量の本発明のウイルスベクターを哺乳動物対象に投与するステップを含み、このウイルスベクターは、例えば以下をコードする異種核酸を含む：筋小胞体（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｎｄｏｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼインヒビターＩ（Ｉ−１）およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害分子またはドミナントネガティブ分子、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、β２アドレナリン受容体、β２アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、カルサルカン（ｃａｌｓａｒｃａｎ）、βアドレナリン受容体キナーゼインヒビター（βＡＲＫｃｔ）、プロテインホスファターゼ１のインヒビター１およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子、Ｐｉｍ−１、ＰＧＣ−１α、ＳＯＤ−１、ＳＯＤ−２、ＥＣ−ＳＯＤ、カリクレイン、ＨＩＦ、チモシン−β４、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−２０６、ｍｉｒ−２０８および／またはｍｉｒ−２６ａ。
注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液、注射の前に液体中で溶液もしくは懸濁液にするのに適した固体形態、または乳濁液のいずれかとして、従来の形態で調製され得る。あるいは、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを、全身様式ではなく局所様式で、例えば、デポー製剤または徐放性製剤で、投与し得る。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、外科的に移植可能なマトリックスに付着して送達され得る（例えば、米国公開公報２００４００１３６４５号に記載される）。
本明細書中に開示されるウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、対象が吸入する、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドから構成される呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液を任意選択的に投与することによって、任意の適切な手段で対象の肺に投与され得る。呼吸用粒子は、液体または固体であり得る。ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを含む液体粒子のエアロゾルは、圧力駆動式エアロゾルネブライザーまたは超音波ネブライザーなどの任意の適切な手段によって、当業者に公知のように生成され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照のこと。ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含む固体粒子のエアロゾルも同様に、医薬分野で公知の技術によって、任意の固体粒状医薬エアロゾル生成器を用いて生成され得る。
ウイルスベクターおよびウイルスカプシドは、中枢神経系（ＣＮＳ）の組織（例えば、脳、眼）に投与され得、本発明の非存在下で観察されるものよりも広い分布のウイルスベクターまたはカプシドを有利に生じ得る。
特定の実施形態では、本発明の送達ベクターは、遺伝性障害、神経変性障害、精神障害および腫瘍を含むＣＮＳの疾患を治療するために投与され得る。ＣＮＳの例示的疾患には、以下が含まれるがこれらに限定されない：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄および頭部の損傷に起因する外傷、テイ・サックス病、レッシュ・ナイハン病（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙａｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、癲癇、脳梗塞、気分障害（例えば、うつ病、双極性感情障害、持続性感情障害、二次的気分障害）、統合失調症、薬物依存性（例えば、アルコール依存症および他の物質の依存性）、神経症（例えば、不安症、強迫障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、パラノイア、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食障害もしくは体重障害（例えば、肥満症、悪液質、神経性食欲不振症および過食症（ｂｕｌｅｍｉａ））を含む精神障害、ならびにＣＮＳのがんおよび腫瘍（例えば、原発性腫瘍）。
ＣＮＳの障害には、網膜、後方路（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｒａｃｔ）および視神経に関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性症、緑内障）が含まれる。
全部ではないが殆どの眼科の疾患および障害は、３つの型の指標のうち１つまたは複数と関連する：（１）血管新生、（２）炎症および（３）変性。本発明の送達ベクターは、抗血管新生因子；抗炎症性因子；細胞変性を遅延させ、細胞温存（ｓｐａｒｉｎｇ）を促進し、または細胞増殖を促進する因子、および上述の組み合わせを送達するために使用され得る。
例えば、糖尿病性網膜症は、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼内（例えば、硝子体中）または眼窩周囲（例えば、テノン下領域中）のいずれかに、１つまたは複数の抗血管新生因子を送達することによって治療され得る。１つまたは複数の神経栄養因子もまた、眼内（例えば、硝子体内）または眼窩周囲のいずれかに同時送達され得る。
ブドウ膜炎は炎症に関与する。１つまたは複数の抗炎症因子が、本発明の送達ベクターの眼内（例えば、硝子体または前房）投与によって投与され得る。
比較として、網膜色素変性症は、網膜変性によって特徴付けられる。代表的実施形態では、網膜色素変性症は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼内（例えば、硝子体投与）によって治療され得る。
加齢性黄斑変性症は、血管新生および網膜変性の両方に関与する。この障害は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体）に、および／あるいは１つまたは複数の抗血管新生因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内または眼窩周囲（例えば、テノン下領域中）に投与することによって、治療され得る。
緑内障は、眼圧の増加および網膜神経節細胞の喪失によって特徴づけられる。緑内障の治療には、本発明の送達ベクターを使用して興奮毒性損傷から細胞を保護する１つまたは複数の神経保護剤の投与が含まれる。かかる薬剤には、眼内に、任意選択的に硝子体内に送達される、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカインおよび神経栄養因子が含まれる。
他の実施形態では、本発明は、発作を治療するため、例えば、発作の発症、発生率および／または重症度を低下させるために使用され得る。発作の治療的処置の効力は、行動的手段（例えば、眼または口の震え、チック（ｔｉｃｋ））および／または電気記録手段（殆どの発作は、顕著な電気記録の異常を有する）によって評価され得る。従って、本発明は、経時的な複数の発作を特徴とする癲癇を治療するためにも使用され得る。
１つの代表的実施形態では、ソマトスタチン（またはその活性断片）が、下垂体腫瘍を治療するために、本発明の送達ベクターを使用して脳に投与される。この実施形態によれば、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする送達ベクターは、微量注入によって下垂体中に投与される。同様に、かかる治療は、先端巨大症（下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療するために使用され得る。ソマトスタチンの核酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１６６；プロセシングされた活性ペプチドソマトスタチン−２８およびソマトスタチン−１４を含む）は、当該分野で公知である。
特定の実施形態では、ベクターは、例えば米国特許第７，０７１，１７２号に記載された分泌シグナルを含み得る。
本発明の代表的実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、ＣＮＳに（例えば、脳にまたは眼に）投与される。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉皮質、側頭葉皮質、頭頂葉皮質および前頭葉皮質、基底核、海馬ならびに扁桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ）を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳および／または下丘中に導入され得る。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、網膜、角膜および／または視神経などの眼の異なる領域にも投与され得る。
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、送達ベクターのより分散した投与のために、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達され得る。ウイルスベクターおよび／またはカプシドはさらに、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与され得る。
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、髄腔内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼窩周囲（例えば、テノン下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行性送達と合わせた筋内送達が含まれるがこれらに限定されない当該分野で公知の任意の経路によって、ＣＮＳの１もしくは複数の所望の領域に投与され得る。
特定の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、ＣＮＳ中の所望の領域または区画への直接的注射（例えば、定位注射）によって、液体製剤で投与される。他の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、所望の領域への外用適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の外用適用によるものであり得る。さらなる代替として、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、固体の持続放出製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照のこと）。
なおさらなる実施形態では、ウイルスベクターは、運動ニューロンに関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治療および／または予防するための逆行性輸送に使用され得る。例えば、ウイルスベクターは、筋肉組織に送達され得、そこからニューロン中に移動し得る。
本発明を説明してきたが、同内容は以下の実施例においてさらに詳細に説明され、以下の実施例は、本発明の説明目的のためだけに本明細書中に含まれるものであり、本発明を限定する意図ではない。
実施例１。心臓および筋骨格遺伝子移入のための操作された肝臓脱標的化ＡＡＶ９ベクター
本発明の態様は、肝臓トロピズムの選択的な喪失を示し、心臓および筋骨格遺伝子移入適用のための可能性を実証する、新規クラスのＡＡＶ９由来ベクターの開発に関する。主要ＡＡＶ９カプシドタンパク質の表面曝露した領域内の残基のランダム変異誘発により、正二十面体の三回対称軸においてクラスター化した変異を有するカプシドライブラリーを得た。配列分析、構造モデルおよびｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングの組み合わせを使用して、いくつかの機能的に多様なＡＡＶ９バリアントを同定した。後者を、親ＡＡＶ９に関して、以下を示す３つの機能的下位群に分類した：（Ｉ）複数の組織にわたる減少した形質導入効率；（ＩＩ）肝臓形質導入における選択的減少、または（ＩＩＩ）類似の形質導入プロファイル。特に、バリアント９．４５および９．６１（下位群ＩＩ）は、肝臓における１０分の１〜２５分の１の遺伝子移入効率を示したが、ＡＡＶ９と同様に効率的に心筋および骨格筋を形質導入した。これらの結果は、ベクターゲノムコピーの定量およびレポーター（ｔｄＴｏｍａｔｏ）遺伝子発現の組織学的分析によって、さらに実証された。この研究は、他の標的化戦略と組み合わせた場合に明確に分離した遺伝子発現を可能にし得る、選択的に除去された組織トロピズムを有するＡＡＶベクターを生成することの実行可能性を強調している。
ＡＡＶ９カプシドライブラリーの生成。ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ Ｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶ９ヘルパープラスミドｐＸＲ９を、ＵＮＣ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅから得た。ランダムプラスミドライブラリーを、アミノ酸３９０〜６２７をコードするカプシド領域（ＶＰ１の番号付け；Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）データベース受託番号ＡＹ５３０５７９．１）［４３］を、フォワード５’−ＧＧＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＣＣ ＴＴＴ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＴＧ ＧＡＡ−３’プライマーおよびリバース５’−ＧＣＣ ＧＴＣ ＣＧＴ ＧＴＧ ＡＧＧ ＡＡＴ ＴＴＴ ＧＧＣ ＣＣＡ−３’プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するエラープローンＰＣＲに供することによって生成した。サイクリングは、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ ＥＺクローン（登録商標）ドメイン変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に概説された製造業者の指示に従って実施した。個々のクローンの配列決定を、ＵＮＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ設備によって実施し、カプシド配列を、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（登録商標）ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分析した。
分子モデリング研究。ＡＡＶ９および種々のバリアントのＶＰ３モノマーの相同性モデルを、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬオンライン３Ｄモデル構築サーバー［４４］（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）と共に、鋳型としてＡＡＶ８の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：２ＱＡ０）［２６］を使用して生成した。ＶＰ３トリマーモデルを、ＶＩＰＥＲｄｂ２データベース［４５］（ｈｔｔｐ：／／ｖｉｐｅｒｄｂ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／）中のオンラインオリゴマー生成ツールを使用して得た。アミノ酸位置の表面レンダリング描写および漫画モデルを、プログラムＰｙｍｏｌ（Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＬＬＣ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／）を使用して生成した。最後に、異なるアミノ酸残基を強調するＡＡＶ９カプシド表面の「ロードマップ」投影を、ＲＩＶＥＭプログラム［４６］を使用して構築した。
細胞株、プラスミドおよびウイルス。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％胎仔ウシ血清およびペニシリン−ストレプトマイシン−アンホテリシンＢを補充したダルベッコ変法イーグル培地中で、５％ＣＯ２中３７℃で維持した。親およびバリアントのｐＸＲ９プラスミドストックを、本明細書中に記載するランダム化ライブラリーから得た。アデノウイルスヘルパー遺伝子を含むプラスミドｐＸＸ６−８０を、ＵＮＣ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｒｅから得た。ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター駆動性のルシフェラーゼ導入遺伝子を含むベクターカセットｐＴＲ−ＣＢＡ−Ｌｕｃ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ赤色蛍光タンパク質をコードするベクターカセットｐＴＲ−ＣＢＡ−Ｔｏｍを、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位が隣接したＬｕｃ／Ｔｏｍ挿入物をｐＴＲ−ＣＢＡ骨格中にライゲーションすることによって生成した。親およびバリアントのＡＡＶ９ベクターを、他に記載されているように［４７］、三重トランスフェクション法と、その後の塩化セシウム勾配超遠心および透析によって生成した。ウイルス力価を、ＣＢＡプロモーターに特異的なプライマー（フォワード５’−ＣＧＴ ＣＡＡ ＴＧＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＴＡＴ ＴＴ−３’；リバース５’−ＧＣＧ ＡＴＧ ＡＣＴ ＡＡＴ ＡＣＧ ＴＡＧ ＡＴＧ−３’）またはＬｕｃ導入遺伝子領域に特異的なプライマー（フォワード５’−ＡＡＡ ＡＧＣ ＡＣＴ ＣＴＧ ＡＴＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＴＡＣ−３’；リバース５’−ＣＣＴ ＴＣＧ ＣＴＴ ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＡＡ Ｃ−３’）と共にＲｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）を使用して、ｑＰＣＲによって決定した。
動物研究。８〜１０週齢の動物に、ＣＢＡ−ｌｕｃもしくはＣＢＡ−ｔｏｍベクターカセットをパッケージングするＡＡＶ９および関連バリアントのベクターゲノム含有粒子５×１０１０の用量で、尾静脈を介して注射した。動物におけるルシフェラーゼ発現を、Ｄ−ルシフェリン基質（１２０ｍｇ／ｋｇ；Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ、Ｐｉｎｅｔｏｐ、ＡＺ）の腹腔内注射後にＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ（登録商標）画像化システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、異なる時間間隔で画像化した。生物発光画像分析を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して実施した。
ルシフェラーゼ発現の定量。画像化研究に使用した同じ群の動物を、注射の４週間後に屠殺し、以下の臓器を回収した：脳、心臓、肺、肝臓および骨格筋（腓腹筋）。約５０ｍｇの各組織を、Ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒ ＩＩ（登録商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１５０μｌの受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でホモジナイズした。組織溶解物を、８０００ｒｐｍで２分間遠心分離してペレットデブリにし、５０μｌの上清を、Ｖｉｃｔｏｒ２（登録商標）ルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用する発光分析用の９６ウェルプレート（Ｐｒｏｍｅｇａ）に移した。組織溶解物中の総タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して決定した。遺伝子発現の時間経過をモニタリングするために、ＡＡＶ９およびＡＡＶ９．４５ベクターを、３つの異なる群の動物に、５×１０１０ｖｇ／マウスの用量で投与した。１週目、２週目および４週目に屠殺した後、各群由来の心臓および肝臓組織を、本明細書中に記載されるようにルシフェラーゼ導入遺伝子発現の定量のために処理した。導入遺伝子発現レベルに対するベクター用量の影響を決定するために、ＡＡＶ９およびＡＡＶ９．４５ベクターを、３つの異なる用量で投与した：低い（マウス１匹当たり１×１０１０ｖｇ）、中程度の（マウス１匹当たり５×１０１０ｖｇ）および高い（マウス１匹当たり１×１０１１ｖｇ）。動物を、投与の２週間後に屠殺し、その後、心臓および肝臓組織を、ルシフェラーゼ導入遺伝子発現レベルの決定のためにさらに処理した。
ベクターゲノムの定量。本明細書中に記載したように得た組織溶解物由来の上清約１００μｌを、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して処理して、宿主およびベクターゲノムＤＮＡを抽出した。ベクターゲノム（Ｌｕｃ）およびマウスラミン遺伝子（内部標準）のコピー数を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して、１００ｎｇの総抽出ＤＮＡから決定した。血液中のベクターゲノムコピー数を、ＣＢＡ−ｌｕｃカセットをパッケージングするＡＡＶ９および関連のバリアントの粒子１×１０１０の静脈内投与後に、異なる時間間隔で決定した。注射の１時間後、２４時間後および４８時間後に、１０μｌの全血を、ヘパリン化キャピラリーチューブ（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ（登録商標））中に尾静脈から収集し、ウイルスＤＮＡをｑＰＣＲによって定量した。
組織学的分析。ＣＢＡ−ｔｏｍカセットをパッケージングするＡＡＶ９および関連のバリアントの粒子５×１０１０の静脈内投与の２週間後に、マウスに、腹腔内アベルチン（０．２ｍＬ／１０ｇの１．２５％溶液）を過剰投薬し、氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で、次いで新たに調製したＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで経心腔灌流した。次いで、心臓組織および肝臓組織を、４℃で一晩固定し、４０μｍの厚さの切片を、Ｌｅｉｃａ（登録商標）振動ブレードミクロトームを使用して切断した。次いで、組織切片を、ローダミンフィルター（発光マックス：５８０ｎｍ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡を使用して画像化し、Ｈａｍａｍａｔｓｕデジタルカメラを使用して画像を収集した。
構造モデルは、ＡＡＶ９ ＶＰ３トリマー内にクラスター化した変異を明らかにする。エラープローンＰＣＲを使用して、アミノ酸３９０〜６２７（ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付け）にわたるＧＨループ上に集中した変異を有する多様なＡＡＶ９カプシドライブラリーを生成した。合計９６個のバリアントを配列決定し、その後、４３個の生存クローンを得た（表６）。終止コドン、フレームシフト変異および欠失／挿入を有するバリアントをトリアージした。変異誘発に供した可変ループ領域は、ＡＡＶ９のＶＰ３サブユニットおよびＶＰ３トリマーのモデル中に赤色で強調している（図１Ａ、Ｂ）。４３個の異なるクローンの各々に関する個々のアミノ酸変化（赤色の球）をＡＡＶ９トリマーモデル上にマッピングすることにより、ＶＰ３の外側表面上に大部分が存在する変異のクラスタリングが明らかになった（図１Ｃ、Ｄ）。この可視化の後に、異なるＡＡＶ株間で高度に保存されたβ鎖および他の領域内のアミノ酸変化を、さらなる分析から排除した。最後に、ＡＡＶ９カプシドモデルの模式的「ロードマップ」投影を生成して、表面曝露した変異の位置をマッピングした（図１Ｅ）。配列分析と構造分析とのこの組み合わせによって、１０個の構造的に多様なＡＡＶ９表面バリアントのサブセット（表１）を、ベクター生成及びｉｎ ｖｉｖｏでの特徴付けのために選択した。
ＡＡＶ９バリアントは、２つの別個の全身性形質導入プロファイルを示す。ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター駆動性のホタルルシフェラーゼ導入遺伝子をパッケージングするＡＡＶ９バリアント１０個を、親ＡＡＶ９ベクターの２〜３倍以内の力価で生成した。異なるＡＡＶ９バリアント（５×１０１０ｖｇ／動物）を尾静脈を介して注射したマウスの生物発光画像を、投与の４週間後に得た。形質導入パターンの定性分析により、２つの別個のプロファイル、即ち、親ＡＡＶ９ベクターと比較した場合に変更されたプロファイルまたは変更されていないプロファイルが明らかとなった（図２Ａ、Ｂ）。最初に、図２Ａに示すように、バリアントＡＡＶ９．１１は、形質導入欠損バリアントであるように見える。肝臓領域における減少した形質導入効率を伴う形質導入プロファイルにおける顕著な変化は、バリアント９．２４、９．４５、９．４７および９．６１についても観察される。さらに、バリアントＡＡＶ９．６８は、肝臓の方をより好む形質導入プロファイルを示すように見える。第二に、図２Ｂに示すように、バリアント９．９、９．１３、９．１６および９．８４は、ＡＡＶ９ベクターと比較しても概して変更されないままの形質導入プロファイルを示す。
導入遺伝子発現および生体内分布研究により、３つの異なる機能的表現型が明らかになる。組織溶解物におけるルシフェラーゼ活性およびベクターゲノムコピー数を分析して、脳、心臓、肺、肝臓および骨格筋を含む主要臓器において、ＡＡＶ９およびバリアントの形質導入効率を比較した。以前の報告と一致して、ＡＡＶ９は、心臓、肝臓、骨格筋において強い形質導入を示し、脳および肺において中程度の導入遺伝子発現レベルを示した［３、４、６］。比較すると、いくつかのバリアントは、心臓および骨格筋において、肝臓内のＡＡＶ９よりも数オーダー低い強度から約１ｌｏｇ単位低い強度までの範囲の形質導入効率を示した（図３Ａ）。他の組織内のベクターゲノムコピーの中程度の減少（５分の１以下）と共に、肝臓におけるバリアントのベクターゲノムコピー数を親ＡＡＶ９と比較した場合に同様の傾向が注目された（図３ｂ）。特定の機能的サブタイプを、本明細書中に詳述されるように、対応する形質導入効率および生体内分布プロファイルに基づいて、個々のバリアントそれぞれに割り当てた。
機能的サブタイプＩ。欠損表現型を示すバリアントを、機能的サブタイプＩに割り当てた（黒色のバー、図３Ａ、Ｂ）。最初に、ＡＡＶ９．１１は、５分の１（肺）から５００分の１（肝臓）の範囲で、複数の臓器にわたり形質導入効率の顕著な減少を示した。このバリアントについて、それぞれの組織型内のベクターゲノムコピー数の減少は、骨格筋における有意な変化なしから肝臓内の約１ｌｏｇ単位までの範囲の不均衡を示した。従って、画像分析と一致して、ＡＡＶ９．１１は、形質導入欠損のように見える。バリアントＡＡＶ９．４７は、３分の１（心臓）および７分の１（骨格筋）から１１０分の１（肝臓）までの範囲の欠損した形質導入レベルを示す。ベクターゲノムコピー数における付随した減少（約４分の１〜１４０分の１）が、それぞれの組織において見られる。これらの結果は、次に形質導入効率に悪影響を与える欠損した生体内分布プロファイルをＡＡＶ９.４７が示し得るという意見を支持するものである。合わせて考えると、これらの結果は、ＡＡＶ９．１１および９．４７が、機能的に欠損したサブタイプＩを構成することを示している。
機能的サブタイプＩＩ。肝臓形質導入が顕著に欠損しているが、他の組織型において中程度の変化〜変化なし（約２分の１以下）を示すバリアントを、機能的サブタイプＩＩに割り当てた（白色のバー、図３Ａ、Ｂ）。具体的には、バリアント９．２４、９．４５および９．６１は、肝臓内の形質導入レベルにおける約１０分の１〜２５分の１の減少を示した。約１０分の１から約２５分の１の範囲のベクターゲノムコピー数における対応する減少もまた、肝臓内で観察される。ＡＡＶ９．２４バリアントは、心臓および脳内の導入遺伝子発現レベルにおいて、中程度ではあるが有意な減少（約２分の１）を示した。肝臓以外の組織型内のベクターゲノムコピー数には、顕著な変化は観察されなかった。従って、バリアント９．２４、９．４５および９．６１を、機能的サブタイプＩＩに、肝臓脱標的化ＡＡＶ９バリアントとして分類した。
機能的サブタイプＩＩＩ。複数の組織型においてＡＡＶ９と概して類似した形質導入プロファイルおよび生体内分布を示すバリアントを、機能的サブタイプＩＩＩに割り当てた（灰色のバー、図３Ａ、Ｂ）。具体的には、ＡＡＶ９．１３および９．６８は、異なる組織型内で、形質導入効率ならびにベクターゲノムコピー数における中程度の増加（約３倍〜５倍）を示した。興味深いことに、ＡＡＶ９．６８は、遺伝子発現（約３分の１）およびベクターゲノムコピー数（約５分の１）に関するより低い心臓対肝臓比によって実証されるように、ＡＡＶ９および他のバリアントと比較して、肝臓形質導入について僅かに増加した傾向を示した（図６Ａ、Ｂ）。バリアント９．９、９．１６および９．８４は、殆どの組織型を親ＡＡＶ９ベクターと同様に効率的に形質導入した。後者のサブセットのＡＡＶ９バリアントは、肝臓内で形質導入レベルにおける約２分の１〜５分の１の減少を示し、ベクターゲノムコピー数における付随する減少を示した（約２〜３分の１）。合わせて考えると、ＡＡＶ９．１３および９．６８は機能的サブタイプＩＩＩに割り当てたが、ＡＡＶ９．９、９．１６および９．８４は、機能的サブタイプＩＩとＩＩＩとの間で重複するように見える。
ＡＡＶ９．４５の導入遺伝子発現の動態および用量応答プロファイルは、ＡＡＶ９とは異なる。ＡＡＶ９およびＡＡＶ９．４５ベクターに対するベクター用量および導入遺伝子発現の時間経過の影響を決定した。図４Ａに示すように、ＡＡＶ９およびＡＡＶ９．４５は共に、心臓における導入遺伝子発現の類似の動態を実証している。しかし肝臓の場合、ＡＡＶ９．４５によって達成される形質導入レベルは、１週間後の時点で最大に達するように見えるが、ＡＡＶ９は、４週間にわたり＞１ｌｏｇ単位まで増加し続けた（図４Ｂ）。機能的サブタイプＩＩベクターの生物学についてのさらなる見識を積み重ねるために、静脈内投与後のＡＡＶ９およびＡＡＶ９．４５の形質導入効率に対する漸増ベクター用量の影響を分析した。用量反応プロファイルは、心臓においてＡＡＶ９とＡＡＶ９．４５との間で類似しているように見えるが（図５Ａ）、後者は、肝臓においてＡＡＶ９と比較して、一貫して低い導入遺伝子発現（約３〜４５分の１）を示す（図５Ｂ）。この現象についての可能性のある説明は、肝臓内での取り込み増加を生じる高用量における、ＡＡＶ９．４５ベクターによる末梢臓器の飽和である。
バリアントＡＡＶ９．４５は、筋肉向性であり、肝臓から効率的に脱標的化される。肝臓と比較した場合の、心臓に対する種々のＡＡＶ９バリアントの相対的トロピズムを分析した。簡潔に述べると、心臓および肝臓組織溶解物における導入遺伝子発現レベルならびにベクターゲノムコピー数の比率を得て、示したようにプロットした（図６Ａ、Ｂ）。バリアント９．１６、９．２４、９．９、９．６１、９．４７、９．１１および９．４５は、親ＡＡＶ９ベクターよりも約４倍〜４０倍高い、遺伝子発現についての心臓対肝臓比を示した（図６Ａ）。約３倍から３５倍の範囲の、ベクターゲノムコピー数についての心臓対肝臓比における付随する増加が観察された（図６Ｂ）。９．１１および９．４７は欠損サブタイプＩに分類されるので、バリアントＡＡＶ９．４５は、心臓形質導入に対する最も高い優先性を示すように見える。上述の結果を、組織学的分析によってさらに実証した（図６Ｃ）。簡潔に述べると、ＣＢＡプロモーター駆動性のｔｄＴｏｍａｔｏレポーター導入遺伝子をパッケージングするＡＡＶ９およびＡＡＶ９．４５ベクターを、尾静脈を介して注射し、その後、肝臓、心臓および骨格筋組織を、投与の２週間後に回収した。固定した組織切片の蛍光顕微鏡により、ＡＡＶ９．４５が心臓向性および骨格筋向性であるが、肝臓から効率的に脱標的化されていることが確認される。対照的に、ＡＡＶ９ベクターは、以前に報告されたように３つ全ての組織型において強い形質導入を実証する［３］。
本研究における重要な知見は、欠損表現型を生じる変異の発見である。サブタイプＩには、別個の欠損を有する２つのバリアントＡＡＶ９．１１および９．４７が含まれる。変異体９．１１は、形質導入欠損表現型を生じる２つの変異Ｔ５６８ＰおよびＱ５９０Ｌを有する。Ｔ５６８Ｐ変異はＡＡＶ９トリマー内に埋め込まれているが、ウイルス力価によって示されるように、カプシドアセンブリまたはパッケージング効率には影響を与えないように見える（表７）。Ｑ５９０Ｌ変異は、Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙら［２４］によって記載された可変領域ＶＩＩＩ内に位置する。ＡＡＶ９内部ループ領域（残基５９０〜５９５、ＶＰ１の番号付け）中に変異を有する他のバリアントには、親ＡＡＶ９と比較して肝臓内での形質導入効率における中程度の減少を示す、ＡＡＶ９．９（Ｗ５９５Ｃ）およびＡＡＶ９．１６（Ｑ５９２Ｌ）が含まれる。
バリアントＡＡＶ９．４７は、次に形質導入効率に悪影響を与える欠損した生体内分布プロファイルを示した。この欠損プロファイルと一致して、ＡＡＶ９．４７は、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４５およびＡＡＶ９．６８ベクターと比較して、血液循環から迅速に排除される（図８）。後者の表現型についての１つのもっともらしい説明は、ＡＡＶ９．４７表面上の負に荷電したクラスターへのＧ４５３Ｄ変異およびＫ５５７Ｅ変異の寄与であり（図１Ｅ）、それにより、カプシドは迅速な血液クリアランスの傾向を有するようになる。
本研究により、ＡＡＶ９ベクターに肝臓トロピズムを付与する際に特定のアミノ酸残基が果たす役割が明らかになった。具体的には、サブタイプＩＩのバリアント９．２４、９．４５および９．６１は、可変領域Ｖ内でクラスター化する変異（Ｎ４９８位およびＷ５０３位）を有するように見える。さらに、Ｐ５０４Ｔ変異を含むＡＡＶ９．６８サブタイプＩＩＩバリアントは、ＡＡＶ９と比較して、心臓対肝臓導入遺伝子発現比における減少によって実証される優先的な肝臓トロピズムを示した。この領域（残基４９８〜５０４）は、三回対称軸において内部ループ残基５９０〜５９５の後ろに位置する（図１Ｅ）。単一のＡＡＶ９カプシド鋳型上に異なる位置でアミノ酸残基を変化させるおよび／または複数の点変異（例えば、Ｎ４９８、Ｗ５０３およびＷ５９５）を組み合わせることによる、ＡＡＶ９由来ベクターのさらなる最適化は、肝臓脱標的化効率を改善し得る。
本研究における種々のバリアントの構造的特徴の分析は、残基４９８〜５０４が、隣接する５９０〜５９５クラスターと一緒になって、ＡＡＶ９カプシド上の部分的受容体フットプリントを構成し得る重要な残基（Ｎ４９８、Ｗ５０３、Ｐ５０４、Ｑ５９０Ｌ）を含むことを示唆している（図７）。結果として、１つの説明は、ＡＡＶ９受容体に対する親和性の変更が、次に肝臓トロピズムに影響を与え得るというものである。
肝臓脱標的化ＡＡＶ９バリアントは、心臓疾患および筋骨格疾患の治療における遺伝子移入のための顕著な可能性を実証している。心臓もしくは筋肉特異的プロモーター［３９、４０］またはマイクロＲＮＡ−１２２標的配列［４１、４２］などの転写標的化エレメントを有する肝臓脱標的化ＡＡＶ９ベクターのさらなる最適化により、心臓および／または骨格筋への治療的導入遺伝子の選択的送達が可能になる。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞上のガラクトシル化グリカンに対するＡＡＶ９変異体の結合親和性についての研究。図９および図１０の実験を実施して、ＣＨＯ細胞上のガラクトシル化グリカンへの異なるＡＡＶ９変異体の結合を評価した。簡潔に述べると、細胞を、異なる力価のウイルス粒子と共に４℃でインキュベートし、定量的ＰＣＲを使用して、結合したウイルスの量を計算した（未結合のウイルスの洗浄後に）。次いで、得られたデータを、単一部位結合モデルに当てはめ、結合パラメータを図１０に記載したように計算した。これらの結果により、肝臓から脱標的化されたＡＡＶ９変異体が低いグリカン結合能を示すことが確認される。低下したグリカン結合親和性を生じる１つまたは複数の変異を含むカプシドタンパク質を含むＡＡＶ９ベクターは、肝臓が対象の主要臓器ではない治療適用における遺伝子移入プロトコールにおいて有用性を有する。
上記は本発明の例示であり、本発明の限定として解釈すべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって規定され、特許請求の範囲の等価物が本明細書中に含まれる。
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Claims (15)

  1. ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けによるＷ５０３Ｒ変異、Ｎ４９８Ｙ及びＬ６０２Ｆ変異、Ｅ５００Ｄ及びＰ４６８Ｔ変異、またはそれらの任意の組み合わせを含み、前記変異が、対照と比較して減少した肝臓形質導入の表現型を生じる、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質。
  2. ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けによるＷ５０３Ｒ変異、Ｎ４９８Ｉ変異、Ｅ５００Ｄ及びＰ４６８Ｔ変異、またはそれらの任意の組み合わせを含み、前記変異が、対照と比較して減少した肝臓形質導入の表現型を生じる、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質。
  3. ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けによるＷ５０３Ｒ変異を含むＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質であって、前記変異が、対照と比較して減少した肝臓形質導入の表現型を生じる、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質。
  4. ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けによるＮ４９８Ｙ及びＬ６０２Ｆ変異を含むＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質であって、前記変異が、対照と比較して減少した肝臓形質導入の表現型を生じる、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質。
  5. ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けによるＮ４９８Ｉ変異を含むＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質であって、前記変異が、対照と比較して減少した肝臓形質導入の表現型を生じる、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質。
  6. ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けによるＷ５０３Ｒ変異、Ｎ４９８Ｙ及びＬ６０２Ｆ変異、Ｅ５００Ｄ及びＰ４６８Ｔ変異またはそれらの任意の組み合わせを含み、前記変異が、対照と比較して低下したガラクトシル化グリカン結合親和性の表現型を生じる、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質。
  7. ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けによるＷ５０３Ｒ変異、Ｎ４９８Ｉ変異、Ｅ５００Ｄ及びＰ４６８Ｔ変異、またはそれらの任意の組み合わせを含み、前記変異が、対照と比較して低下したガラクトシル化グリカン結合親和性の表現型を生じる、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質。
  8. ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けによるＷ５０３Ｒ変異を含むＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質であって、前記変異が、対照と比較して低下したガラクトシル化グリカン結合親和性の表現型を生じる、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質。
  9. ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けによるＮ４９８Ｙ及びＬ６０２Ｆ変異を含むＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質であって、前記変異が、対照と比較して低下したガラクトシル化グリカン結合親和性の表現型を生じる、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質。
  10. ＡＡＶ９ ＶＰ１の番号付けによるＮ４９８Ｉ変異を含むＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質であって、前記変異が、対照と比較して低下したガラクトシル化グリカン結合親和性の表現型を生じる、ＡＡＶ９またはクレードＦ ＡＡＶカプシドタンパク質。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド。
  12. （ａ）請求項１１に記載のＡＡＶカプシドと、
    （ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸と
    を含むウイルスベクターであって、前記核酸が、ＡＡＶカプシドによってカプシド封入されている、ウイルスベクター。
  13. 薬学的に許容される担体中に、請求項１２に記載のウイルスベクターを含む組成物。
  14. 請求項１２に記載のウイルスベクターまたは請求項１３に記載の組成物に、インビトロで細胞を接触させるステップを含む、細胞中に核酸を導入する方法。
  15. ヒト対象を治療するための、請求項１３に記載の組成物。
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