CN102159713A - 用于递送光敏蛋白的载体和使用方法 - Google Patents

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威廉·豪斯维特
刘建文
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Abstract

本发明利用将光敏蛋白递送至感兴趣的病变和正常的细胞和组织的载体，提供用于疾病的基因和病原学非特异性以及回路特异性治疗的化合物和方法。

Description

用于递送光敏蛋白的载体和使用方法
交叉引用
本申请要求以下美国临时申请的权益：2008年5月20日提交的第61/054,571号、2008年11月14日提交的第61/199,241号，2008年11月26日提交的第61/200,430号，通过引用将上述申请全部并入本文。
背景技术
用来治疗疾病或障碍的基因递送疗法，其不依赖于治疗潜在的突变，可能具有潜在的价值。能够控制、调节和/或驱动特异性神经回路从而介导自然神经响应和高分辨率感知以及控制的方法也可能具有巨大的潜在治疗价值。神经元是使用通过去极化形成的电流以产生通信信号(例如神经脉冲)的细胞类型的实例。其他可电兴奋的细胞包括骨骼肌细胞、心肌细胞和内分泌细胞。神经元利用快速去极化来在全身传输信号，并且用于各种目的，例如运动控制(例如肌肉收缩)、感官反应(例如触觉、听觉和其他感觉)以及计算功能(例如脑功能)。通过促进或抑制阳离子或阴离子流经细胞膜，细胞可被暂时去极化、去极化且维持此状态或者超极化。因而，细胞的去极化控制对于许多不同的目的可能是有益的，所述细胞的去极化控制包括视觉控制、肌肉控制和感官控制。光敏蛋白通道、泵和受体可以允许细胞的毫秒精确的光学控制。虽然光敏蛋白与光结合可以用于控制离子经由细胞膜的流动，但对于特定的疾病、障碍和回路，靶向和递送仍然尚待解决。
发明内容
一方面，本发明提供重组核酸，其包含可操作地连接至代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)调控序列或其片段的编码光敏蛋白的核酸。在一种实施方式中，所述光敏蛋白可以选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白(melanopsin)以及它们的变体。在另一实施方式中，所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的光敏蛋白。在另一实施方式中，所述mGluR6调控序列片段包含少于约1000个、少于约750个、少于约500个、少于约250个或者少于约100个碱基对。在相关的实施方式中，所述mGluR6调控序列或其片段为mGluR6启动子或者增强子。在特别相关的实施方式中，所述核酸还包含绿色荧光蛋白。在另一实施方式中，所述核酸被包裹在重组腺相关病毒(AAV)的衣壳中。在一些实施方式中，所述重组AAV的血清型为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个血清型或者它们的突变体的组合杂合体。在一些实施方式中，所述重组腺相关病毒的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。在相关的实施方式中，所述核酸衣被包裹在选自以下的重组病毒的衣壳中：重组腺相关病毒(AAV)、重组逆转录病毒、重组慢病毒和重组痘病毒。
另一方面，本发明提供包含编码光敏蛋白的核酸的载体，所述核酸可操作地连接至代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)调控序列或其片段。在一种实施方式中，所述光敏蛋白选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2C128A、ChR2C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。在相关的实施方式中，所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的光敏蛋白。在另一实施方式中，所述mGluR6调控序列片段少于约1000个、少于约750个、少于约500个、少于约250个或者少于约100个碱基对。在相关的实施方式中，所述mGluR6调控序列片段为图6中所示的序列。在另一实施方式中，所述载体包含重组腺相关病毒(AAV)。在相关的实施方式中，所述载体包括选自以下的重组病毒：重组腺相关病毒(AAV)、重组逆转录病毒、重组慢病毒和重组痘病毒。在具体的实施方式中，所述AAV的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。在其他具体的实施方式中，所述重组AAV的血清型为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个血清型或它们的突变体的组合杂合体。在相关的实施方式中，所述AAV包含突变的衣壳蛋白。在一种具体的实施方式中，所述衣壳蛋白包含突变的酪氨酸残基。所述突变的酪氨酸残基可以选自：Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。在具体的实施方式中，所述突变的衣壳蛋白包含酪氨酸残基突变成苯丙氨酸。
另一方面，本发明提供治疗患有眼部疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括向感染的眼部引入包含可操作地连接至代谢型谷氨酸受体6调控序列(mGluR6)或其片段的光敏蛋白的重组腺相关病毒(AAV)。在一种实施方式中，所述眼部疾病或障碍由光感受器细胞的退化导致。在另一实施方式中，所述光敏蛋白选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。在相关的实施方式中，所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的光敏蛋白。在另一实施方式中，所述mGluR6启动子片段少于约1000个、少于约750个、少于约500个、少于约250个或者少于约100个碱基对。在相关的实施方式中，所述mGluR6启动子片段为图6中所示的序列。在另一实施方式中，所述AAV的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。在其他实施方式中，所述重组AAV的血清型为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个血清型或者它们的突变体的组合杂合体。在相关的实施方式中，所述AAV包含突变的衣壳蛋白。在另一相关的实施方式中，所述衣壳蛋白包含突变的酪氨酸残基。在具体的实施方式中，所述突变的酪氨酸残基选自：Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。在相关的实施方式中，所述突变的衣壳蛋白包含酪氨酸残基突变成苯丙氨酸。在另一实施方式中，所述AAV使用玻璃体内注射、视网膜下注射和/或ILM剥除引入。在具体的实施方式中，所述AAV被引入至视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)。在另一实施方式中，所述方法还包括在眼部外部使用光发生装置。
另一方面，本发明提供在视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)中表达外源核酸的方法，所述方法包括向视网膜引入包含可操作地连接至视网膜双极(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)细胞特异性调控序列的外源核酸的载体，其中所述方法导致至少约25％至30％的转导效率。在其他实施方式中，这种方法导致至少约10％的转导效率。在一种实施方式中，所述方法导致至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转导效率。在相关的实施方式中，所述转导效率通过定量被感染的视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)的总数来测定。在另一实施方式中，所述外源核酸包含光敏蛋白。在相关的实施方式中，所述光敏蛋白选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。在具体的实施方式中，所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的光敏蛋白。在另一实施方式中，所述调控序列包含代谢型谷氨酸受体6调控序列(mGluR6)或其片段。在相关的实施方式中，所述mGluR6调控序列片段少于约1000个、少于约750个、少于约500个、少于约250个或者少于约100个碱基对。在具体的实施方式中，所述mGluR6调控序列片段为图6中所示的序列。在另一实施方式中，所述外源核酸使用重组腺相关病毒载体(AAV)被引入。在相关的实施方式中，所述AAV包含突变的衣壳蛋白。在具体的实施方式中，所述衣壳蛋白包含突变的酪氨酸残基。在相关的实施方式中，所述突变的酪氨酸残基选自：Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。在另一实施方式中，所述突变的衣壳蛋白包含酪氨酸残基突变成苯丙氨酸。在另一实施方式中，所述外源核酸使用玻璃体内注射、视网膜下注射和/或ILM剥除引入。在另一实施方式中，所述AAV为的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。在又一实施方式中，所述重组AAV的血清型为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个血清型或者它们的突变体的组合杂合体。
又一方面，本发明提供将外源核酸引入至视网膜细胞核的方法，所述方法包括将包含可操作地连接至视网膜细胞特异性调控序列的外源核酸的载体引入至视网膜细胞，其中所述载体专门设计用来避免泛素介导的蛋白质降解。在一种实施方式中，所述降解是蛋白酶体介导的。在另一实施方式中，所述外源核酸包含光敏蛋白。在相关的实施方式中，所述光敏蛋白选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。在另一相关的实施方式中，所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的光敏蛋白。在另一实施方式中，所述视网膜细胞为视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)。在相关的实施方式中，所述调控序列包含代谢型谷氨酸受体6启动子(mGluR6启动子)或其片段。在另一实施方式中，所述mGluR6片段小于1000个、750个、500个、250个或100个碱基对。在另一实施方式中，所述mGluR6启动子片段为图6中所示的序列。在另一实施方式中，所述载体选自：重组腺相关病毒(AAV)、重组逆转录病毒、重组慢病毒和重组痘病毒。在相关的实施方式中，所述载体为重组腺相关病毒载体(AAV)。在另一实施方式中，所述AAV的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。在其他实施方式中，所述重组AAV的血清型为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个血清型或者它们的突变体的组合杂合体。在另一实施方式中，所述AAV包含突变的衣壳蛋白。在另一实施方式中，所述衣壳蛋白包含突变的酪氨酸残基。在另一实施方式中，所述突变的酪氨酸残基选自：Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。在另一实施方式中，所述突变的衣壳蛋白包含酪氨酸残基突变成苯丙氨酸。在另一实施方式中，所述载体使用玻璃体内注射、视网膜下注射和/或ILM剥除引入。
另一方面，本发明提供转导视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)的方法，所述方法包括向视网膜引入包含可操作地连接至调控序列的外源核酸的载体。在一种实施方式中，所述调控序列为非细胞类型特异性启动子。在另一实施方式中，所述调控序列为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α激活活性多肽O(GNAO1)启动子或者巨细胞病毒(CMV)即时早期增强子与牛β-肌动蛋白启动子加上内含子1-外显子1衔接点的融合(CBA、smCBA)。在另一实施方式中，所述外源核酸包含光敏蛋白。在相关的实施方式中，所述光敏蛋白选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2C 128A、ChR2 C128S、ChR2C 128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。在另一相关的实施方式中，所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的光敏蛋白。在另一实施方式中，所述载体选自：重组腺相关病毒(AAV)、重组逆转录病毒、重组慢病毒和重组痘病毒。在相关的实施方式中，所述载体为重组腺相关病毒载体(AAV)。在另一实施方式中，所述AAV的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。在一些实施方式中，所述重组AAV的血清型为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个血清型或者它们的突变体的组合杂合体。在相关的实施方式中，所述AAV包含突变的衣壳蛋白。在另一实施方式中，所述衣壳蛋白包含突变的酪氨酸残基。在另一实施方式中，所述突变的酪氨酸残基选自：Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。在另一实施方式中，所述突变的衣壳蛋白包含酪氨酸残基突变成苯丙氨酸。在另一实施方式中，所述载体使用玻璃体内注射、视网膜下注射和/或ILM剥除引入。
通过引用合并
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用并入本文，其引用程度就如同特定且单独地指明通过引用合并各个单独的出版物、专利或专利申请。
附图说明
本发明新的特征在所附权利要求书中具体阐明。通过参考以下阐明示例性实施方式(利用了本发明的原理)的详细说明以及附图将获得对本发明特征和优点的更好的理解，其中：
图1图示ChR1核酸序列。
图2图示ChR2核酸序列。
图3图示NpHR核酸序列。
图4图示黑视蛋白核酸序列。
图5图示ChR2核酸序列，所述序列为哺乳动物密码子优化了的序列，并且其编码与绿色荧光蛋白(GFP)融合的ChR2。
图6图示能够以双极细胞特异性方式调控表达的GRM6(代谢型谷氨酸受体6)调控核酸序列的片段。
图7图示smCBA调控核酸序列。
图8图示：神经元表达ChR2和发放。(A)用光刺激神经元表达ChR2；(B)神经元发放响应蓝光快速脉冲群。
图9图示：AAV递送至视网膜双极细胞。第1列显示在用AAV7-CBA-GFP载体视网膜下注射8周之后，GFP在视网膜双极细胞中的表达。第2列显示PKCα染色(双极细胞特异性抗体)，第3列显示对细胞核的DAPI染色，以及第4列显示GFP表达、PKCα染色和DAPI染色的合并图像。第一行为20X放大，第二行为40X放大。
图10图示：ChR2-GFP融合蛋白在rd1、rho-/-和rd16视网膜双极细胞中的表达。在各个图像中，记录了视网膜色素上皮细胞(RPE)、双极细胞或内核层(INL)、内网层(IPL)以及神经节细胞层(GCL)。亮白区域显示GFP表达。在INL的双极细胞中有表达的小环(ringlet)(除了AAV5玻璃体内注射外)。
图11图示：用酪氨酸突变AAV载体视网膜下注射后1个月时，通过免疫组织化学分析冷冻视网膜切片中EGFP的表达。示例性切片图示出用血清型2Y444(a)或血清型8Y733(b)转导之后，EGFP荧光在视网膜中的分布和强度。图像方向为玻璃体面向底部和光感受器层面向顶部。来自用血清型2Y444视网膜下注射小鼠眼部的光感受器、RPE细胞和神经节细胞中的EGFP荧光。(c)在递送血清型8Y733之后，光感受器、RPE细胞和米勒(Müller)细胞中的EGFP荧光。(d)通过使用谷氨酰胺合成酶(GS)抗体的免疫染色检测米勒细胞突起(process)(红色)。(e)合并图像显示来自用血清型8Y733治疗的眼部的视网膜切片中EGFP荧光(绿色)和GS染色(红色)的共定位。(f)校准线100μM。gcl，神经节细胞层；ipl，内网层；inl，内核层；onl，外核层；os，外段；rpe，视网膜色素上皮细胞。
图12图示：水迷宫任务训练小鼠。(A)用于测量暗视阈值的水迷宫示意图(Hayes和Balkema，1993)。(B)各小鼠组(视网膜退化-治疗、视网膜退化-未治疗和野生型)发现目标(黑色平台+LED阵列)所花费的时间与训练时间的函数关系。(C)各小鼠组(治疗rd1、治疗rd16、治疗rho-/-、未治疗视网膜变性和野生型)发现目标(黑色平台+LED阵列)所花费的时间与不同光强度的函数关系。
图13图示：联合有可触发光敏蛋白表达的光发生/产生元件(LED阵列/激光系统)的护目镜(goggle)样装置。
具体实施方式
光敏蛋白
本发明提供编码光敏蛋白的重组核酸，用于递送编码光敏蛋白的重组核酸的病毒载体和非病毒载体，以及用于递送光敏蛋白的方法。
光敏蛋白属于视蛋白家族，包括脊椎动物(动物)和无脊椎动物视紫红质。动物视蛋白、视紫红质是具有7个跨膜螺旋的G-蛋白偶联受体(GPCR)，其可以调控离子通道的活性。无脊椎动物视紫红质通常不是GPCR，但为光敏性或光激活的离子泵或离子通道。
由于去极化阳离子通量穿过光门控孔(light-gated pore)，来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的海藻视蛋白(如视紫红质通道蛋白(ChR2))允许在细胞内以毫秒精确触发蓝光诱导的动作电位。古细菌视蛋白(如氯视紫红质法老(嗜)盐碱单孢菌(Natronomonas pharaonis))允许光激活的氯泵作用；当暴露于黄光时，所述泵可以被超极化，并可被抑制触发动作电位。这种光敏视蛋白的应用允许神经元发放活动的时空调控。
本文所提及的“光敏”蛋白包括视紫红质通道蛋白(ChR1、ChR2)、氯视紫红质(NpHR)、黑视蛋白、松果体视蛋白、细菌视紫红质以及它们的变体。本发明的光敏蛋白可以天然存在于植物、动物、古细菌、海藻或细菌细胞中，或者可选择地，通过实验室技术制备。
视紫红质通道蛋白ChR1(GenBank登录号AB058890/AF385748；图1)和ChR2(GenBank登录号AB058891/AF461397；图2)是来自绿藻莱茵衣藻的两种视紫红质(Nagel，2002；Nagel，2003)。二者都是光敏通道，在神经组织中表达和激活时，允许细胞在被光刺激时去极化(Boyden，2005)。
在一些实施方式中，可以通过结合ChR1和ChR2蛋白的不同部分而形成和使用杂合或嵌合视紫红质通道蛋白。
在一种实施方式中，可以通过用ChR1的同源配对物取代ChR2的N-末端片段而制备和使用杂合或嵌合视紫红质通道蛋白(反之亦然)。在一些实施方式中，所述杂合视紫红质通道蛋白导致敏感性以可以忽略的减敏现象和减慢的开启(turning-on)和关闭(turning-off)动力学移动至不同的波长谱(例如至红光波长谱)。
在另一实施方式中，可以制备和使用ChR1(氨基酸1-345)和ChR2(氨基酸1-315)杂合体/嵌合体。
在又一实施方式中，可以制备和使用保留ChR1的N-末端部分，并且用相应的ChR2片段取代C-末端部分的ChR1-ChR2杂合体/嵌合体。在具体的实施方式中，可以构建和利用包括在嵌合体的视网膜结合袋(pockets)周围的突变残基的ChR1和ChR2杂合体/嵌合体。在示例性实施方式中，可以制备和使用以下嵌合体：
a.ChD：ChR1的N-末端部分和ChR2的C-末端部分的杂合体/嵌合体，其中交叉位置位于两种视紫红质通道蛋白的螺旋D的同源位点。
b.ChEF：ChR1的N-末端部分和ChR2的C-末端部分的杂合体/嵌合体，其中交叉位置位于两种视紫红质通道蛋白的螺旋E和F之间的环。
c.ChIEF：异亮氨酸170突变成缬氨酸的ChEF嵌合体的变体。
d.ChF：ChR1的N-末端部分和ChR2的C-末端部分的杂合体/嵌合体，其中交叉位置位于两种视紫红质通道蛋白的螺旋F的末端。
在一些实施方式中，在持久性光存在下，所述嵌合体保留ChR1的减少失活，但是除质子外，可以允许钠和钾离子渗透。在其他实施方式中，所述嵌合体可以通过刺激后增强通道关闭的比率而改进通道的动力学。
在一些实施方式中，可以改造其他ChR1和ChR2变体。在具体的实施方式中，ChR2蛋白的单个或多个点突变可以得到ChR2变体。在示例性实施方式中，ChR2在C128位点的突变可以得到改变的通道特性。在相关的实施方式中，C128A、C128S和C128T ChR2突变可以得到更多的总平均开放次数(Berndt，2009)。在其他相关的实施方式中，ChR2变体可以导致改变的动力学。
在另一实施方式中，可以使用VChR1(GenBank登录号EU622855)。
在具体的实施方式中，利用ChR2的哺乳动物密码子优化型(图5)。
NpHR(氯视紫红质)(GenBank登录号EF474018；图3)来自嗜(耐)盐碱古菌法老(嗜)盐碱单孢菌。在一些实施方式中，可以制备NpHR的变体。在具体的实施方式中，NpHR蛋白的单个或多个点突变可以得到NpHR变体。在具体的实施方式中，可以利用NpHR的哺乳动物密码子优化型。
在一种实施方式中，利用NpHR变体。在一种具体实施方式中，利用eNpHR(增强的NpHR)。将氨基酸FCYENEV增加至NpHR的C-末端，同时将来自烟碱型乙酰胆碱受体β亚基的信号肽增加至NpHR的N-末端，实现eNpHR的构建。黑视蛋白(GenBank登录号6693702；图4)是发现于视网膜特化光敏神经节细胞中的光色素，其涉及生理节律的调控、瞳孔对光反射和其他对光的非可视响应。在结构上，黑视蛋白为视蛋白，它是G-蛋白偶联受体的亚视黄基蛋白变体。黑视蛋白在许多方面类似无脊椎动物视蛋白，包括它的氨基酸序列和下游信号级联放大。如同无脊椎动物视蛋白，黑视蛋白似乎是双稳态光色素，具有内在的光异构酶活性。在一些实施方式中，可以制备黑视蛋白变体。在具体的实施方式中，黑视蛋白蛋白质的单个或多个点突变可以得到黑视蛋白变体。
光敏蛋白还可以包括与光敏蛋白ChR1、ChR2、NpHR和黑视蛋白至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％相同的蛋白质。例如，ChR2蛋白可以包括与ChR2至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的蛋白质。此外，这些蛋白质可以包括光敏且可以由高强度光的特定波长激活的ChR2。
在一些实施方式中，光敏蛋白可以调节神经回路中的信号传导，并且在单神经元水平双向控制离子电导行为。在一些实施方式中，所述神经元为视网膜神经元、视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)、视网膜神经节细胞、光感受器细胞或视网膜无长突细胞。
腺相关病毒载体
如本文所描述，本发明提供包含编码光敏蛋白的核酸的病毒载体及其使用方法。
腺相关病毒(AAV)是小的(25-nm)无包膜病毒，其包装4.7Kb的线性单链DNA基因组。AAV基因组的小尺寸以及关于Rep对细胞基因表达的潜在作用的顾虑，致使构建的AAV载体不编码Rep，并且缺失对于频繁的位点特异性整合所需要的顺式活性(cis-active)IEE。保留ITR，因为它们是包装所需要的顺式信号。因此，当前的重组AAV(rAAV)载体主要作为染色体外元件继续存在。
可以使用各种重组腺相关病毒载体(rAAV)来递送感兴趣的基因至细胞，并且实现感兴趣的基因的表达，例如编码光敏蛋白的基因。例如，可以使用rAAV在靶细胞中表达光敏蛋白，例如ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体，或者本文描述的任何一种光敏蛋白。本文有时使用的“转基因”是指编码感兴趣的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸被包裹在病毒载体(例如rAAV)的衣壳中。
腺相关病毒是小的单链DNA病毒，其需要辅助病毒来促进有效的复制。AAV的4.7kb基因组以两个反向末端重复序列(ITR)和分别编码Rep蛋白和Cap蛋白的两个开放阅读框为特征。Rep阅读框编码分子量为78kD、68kD、52kD和40kD的四种蛋白质。这些蛋白质的功能主要是调控AAV复制和拯救，以及整合AAV至宿主细胞的染色体。Cap阅读框编码分子量为85kD(VP 1)、72kD(VP2)和61kD(VP3)的三种结构蛋白(Berns，以上引用)，这些结构蛋白形成病毒粒衣壳。AAV病毒粒中多于80％的总蛋白质包含VP3。
rAAV的基因组通常包含：(1)5′腺相关病毒ITR，(2)用于所期望的基因产物(例如光敏蛋白)的编码序列(例如转基因)，其可操作地连接至在细胞中调控该编码序列表达的序列(例如启动子序列，如mGluR6或其片段)，以及(3)3′腺相关病毒反向末端重复序列。此外，rAAV载体优选地可包含多聚腺苷酸化序列。
通常，为了允许复制、包装和有效整合至细胞染色体，rAAV载体在感兴趣的转基因或基因的各个末端具有一个AAV ITR拷贝。所述ITR由位于AAV的DNA基因组5′末端的1至145位核苷酸和位于AAV的DNA基因组3′末端的4681至4536位核苷酸(即相同的序列)组成。所述rAAV载体还可以包含在所述ITR的末端之后的至少10个核苷酸(即“D区域”的一部分)。
所述转基因序列(例如编码光敏蛋白的多核苷酸)的长度可以为约2至5kb(或可选择地，转基因可以额外包含“充填”或“填充”序列，以使两个ITR之间的核酸序列的总大小为2至5kb)。可选择地，所述转基因序列可以由相同或相似异源序列多次的重复拷贝(例如编码由核糖体通读隔离，或可选择地，由内部核糖体进入位点或“IRES”隔离的一种或一种以上光敏蛋白的两种核酸分子)组成，或者由几种不同的异源序列(例如由核糖体通读隔离或IRES隔离的ChR2和NpHR；或任何两种或多种本文所描述的光敏蛋白，它们包括但不限于ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体)组成。
本发明的重组AAV载体可以产生自各种腺相关病毒，包括例如本文所描述的血清型1至12的任何一种。例如，来自任何一种AAV血清型的ITR预期具有在复制、整合、剪切和转录机制方面相似的结构和功能。
在一些实施方式中，利用细胞类型特异性启动子(或其他调控序列，如增强子)来驱动感兴趣的基因在一种或一种以上特定的细胞类型中的表达，例如光敏蛋白、ChR2等。在其他情况下，在本发明的一些实施方式中，光敏转基因的表达可以通过独立的启动子(例如病毒启动子、真核启动子或其他在真核细胞、尤其是哺乳动物细胞中促进被可操作地连接的序列的表达的启动子)来完成。在这点上，适当的启动子的代表性实例包括mGluR6启动子、GNA01启动子、CBA/smCBA(CMV即时早期增强子与牛β-肌动蛋白启动子加上内含子1-外显子1衔接点的融合)启动子、CBA启动子(鸡β-肌动蛋白)、CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子、MoMLV启动子或它们的衍生物、突变体和/或片段。启动子和其他调控序列将在本文进一步描述。
在本发明中同样可以利用其他启动子，包括细胞或组织特异性启动子(例如视杆、视锥或神经节衍生的启动子)或诱导型启动子。适当的诱导型启动子的代表性实例包括对抗生素敏感的诱导型启动子，例如四环素-响应启动子，如“tet-on”和/或“tet-off”启动子。诱导型启动子还可以包括对除抗生素外的化学物质敏感的启动子。
rAAV载体还包含额外的序列，例如来自腺病毒的序列，用于辅助实现载体的期望的功能。这种序列包括例如辅助将rAAV载体包装至病毒颗粒的序列。
适于生产腺相关病毒载体的包装细胞系可以用已知可利用的技术完成(参见如美国专利第5,872,005号)。用于构建和包装rAA7I载体的方法描述于例如WO 00/54813中。
在rep和cap开放阅读框的5′末端一侧和3′末端一侧为145bp的反向末端重复序列(ITR)，其前125bp能够形成Y-形或T-形双螺旋结构。所述两个ITR是用于AAV复制、拯救、包装和AAV基因组整合的唯一的必要顺式元件。AAV ITR有两种构象，被称为“翻(flip)”和“转(flop)”。构象上的这些区别源自腺相关病毒使用ITR来启动和再启动复制的复制模式(R.O.Snyder等，1993，J.Virol.，67：6096-6104(1993)；K.I.Berns，1990Microbiological Reviews，54：316-329)。完整的rep和cap结构域可以被切除并且可用治疗或报告转基因取代。
在一些实施方式中，使用自身互补型AAV载体。自身互补型载体已被开发用来在单链AAV载体基因组中防止限速第二链合成，并且促进以最小剂量进行的强烈的转基因表达。在具体的实施方式中，任何一种血清型或杂合血清型或突变血清型或突变杂合血清型的自身互补型AAV，与相同血清型的非自身互补型rAAV相比，光敏蛋白的表达增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％或大于200％，所述光敏蛋白如ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。
腺相关病毒血清型
在一种实施方式中，所述载体包含天然存在或改造的特定血清型的重组AAV。
已在许多动物种类中发现AAV，包括灵长类、犬类、禽类和人类。
病毒血清型是具有一组共同可识别抗原的微生物菌株。有几种已知的AAV血清型，并且在视网膜中的转染或转导效力可能随着特定的血清型和靶细胞的性质而变化。rAAV或者rAAV或AAV的特定血清型能提供用于基因递送至视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)的组织-特异性或细胞-类型特异性嗜性。虽然rAAV和/或AAV可能是递送转基因至靶组织的相对安全的方法，但递送的效力(以及可能的情况下，递送的安全性)可能依赖于AVV的外壳蛋白。蛋白外壳或衣壳决定哪种细胞可以吸收病毒有效载荷。不同的AAV血清型，即蛋白外壳或衣壳不同的病毒，可能在它们的组织嗜性和转导靶细胞的能力上不同。转基因可被包装于具有许多功能不同的外壳蛋白或衣壳的AAV颗粒中。这些不同的衣壳定义了血清型，并且可能(全部或部分)有助于其转导特定细胞类型的能力。病毒载体的进入开始于衣壳与靶细胞表面蛋白的交互作用。不希望受理论束缚，正是在转导通路这一点上，不同的血清型可能显著影响转基因递送的效率。
在一些实施方式中，所述AAV载体的血清型或其变体/突变体包括但不限于：AAV1(GenBank登录号AY724675)、AAV2(GenBank登录号AF043303)、AAV3、AAV4、AAV5(GenBank登录号M61166)、AAV6、AAV7(GenBank登录号AF513851)、AAV8(GenBank登录号AF513852)、AAV9(GenBank登录号AX753250)、AAV10、AAV11(GenBank登录号AY631966)或AAV12(GenBank登录号DQ813647)或者它们的突变体、杂合体或片段。在一些实施方式中，所述AAV载体包含一种或一种以上、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或者五种或更多种以下的血清型：AAV1(GenBank登录号AY724675)、AAV2(GenBank登录号AF043303)、AAV3、AAV4、AAV5(GenBank登录号M61166)、AAV6、AAV7(GenBank登录号AF513851)、AAV8(GenBank登录号AF513852)、AAV9(GenBank登录号AX753250)、AAV10、AAV11(GenBank登录号AY631966)或AAV12(GenBank登录号DQ813647)或者它们的突变体、杂合体或片段。在其他实施方式中，所述AAV载体为迄今仍然未被发现和未被表征的天然血清型或它们的变体/突变体。
在一些实施方式中，所述重组AAV的血清型为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种血清型或者它们的突变体的组合杂合体。
在一些实施方式中，所述AAV载体可被用于特异性转导特定的细胞类型，例如视网膜细胞或视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)。在一些情况中，特定的血清型(例如AAV2、AAV5、AAV7或AAV8)在转导特定的细胞类型(例如视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)，神经元)或组织时，可能比其他血清型更佳。例如，特定的AAV血清型(如AAV2、AAV5、AAV7或AAV8)，可以与不同的AAV血清型相比增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％或大于200％的转导效率转导特定的细胞类型，例如视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)。在一些情况中，特定的血清型(例如AAV2、AAV5、AAV7或AAV8)可以允许特定细胞类型的细胞(例如视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞))或者在特定组织(例如视网膜组织)中的细胞至少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转导。
本领域内需要能有效地转导视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)的AAV血清型，尤其是当这种转导能够递送和表达光敏蛋白，例如ChR2。治疗眼部障碍或疾病(例如视觉受损、失明)的重要疗法，可包括使用特定的AAV血清型在视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)中表达光敏蛋白，如ChR2。例如，在优选的实施方式中，在视网膜细胞例如视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)中，使用AAV5或AAV7血清型来靶向感兴趣的基因(例如光敏蛋白、ChR2等)的表达。在一些情况中，AAV5和/或AAV7比其他AAV血清型能更有效地转导视网膜细胞，例如视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)。例如，在一些实施方式中，使用AAV5和/或AAV7血清型(而非AAV1血清型)来转导视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)。在其他情况中，使用AAV2和/或AAV8血清型来转导视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)。在一些情况中，特定的血清型(例如AAV2、AAV5、AAV7或AAV8)可被笼统地应用于组织(例如视网膜组织)，但随后特定的血清型优先于其他细胞类型转导特定的细胞类型。
在一些情况中，引入至视网膜的AAV(例如AAV2、AAV5、AAV7或AAV8)能优先转导视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)，以致与其他视网膜细胞相比，转基因在视网膜双极细胞中更高地表达。在一些情况中，AVV的特定血清型(例如AAV2、AAV5、AAV7或AAV8)可能是导致或有助于导致这种优先转导的原因。在一些情况中，仅有双极细胞小的亚群被转导。
在一些实施方式中，包含非细胞类型特异性启动子的AAV的特定血清型，例如AAV5和/或AAV7(或本文所描述的任何一种其他AAV血清型或突变体)，被用于驱动光敏蛋白在特定细胞类型中的表达。在一些情况中，已被证明优先转导特定细胞类型的AAV的特定血清型，与细胞-类型特异性启动子一起使用来驱动感兴趣的蛋白质(例如光敏蛋白)在特定细胞类型中的表达。
在产生小基因、载体和衣壳中使用的AAV ITR序列和其他AAV序列，以及在一些实施方式中使用的其他构建体可以获自各种来源。例如，所述序列可以由目前鉴别的人AAV类型和有待鉴别的AAV血清型提供。类似地，已知感染其他动物的AAV也可以提供在本发明的分子或构建体中使用的这些ITR。类似地，来自各种AAV血清型的衣壳可以与其他载体成分“混合和匹配”。参见，例如于2001年11月8日公开的国际专利公开号第WO01/83692号(通过引用并入本文)。各种这些病毒血清型和株系可获自美国模式培养物藏所(American Type Culture Collection，Manassas，Va.)或者可获自各种学术或商业来源。可选择地，使用已知的技术合成在制备本发明的载体和病毒中使用的序列可能是合乎需要的，这可能利用公开的和/或可获自各种数据库的AAV序列。
腺相关病毒和表面暴露残基的突变
重组腺相关病毒载体正用在几个临床试验中，但是为达到疗效需要相对大的载体剂量。大的载体剂量还可能触发免疫响应，因为相当大的一部分载体可能未能有效地被运输至核中，并且可能通过宿主细胞蛋白酶体机制被靶向而降解。已报道，通过减少载体的核转运，表皮生长因子受体蛋白质酪氨酸激酶(EGFR-PTK)信号传导负面影响AAV血清型2载体的转导(Zhong 2007)。酪氨酸磷酸化的AAV2载体进入但未有效转导，部分地是因为AAV衣壳的泛素化(接着是蛋白酶体介导的降解)。AAV2中酪氨酸的点突变可能导致在较低病毒滴度下的高效率转导(Zhong 2008)。在一种实施方式中，为了提高视网膜细胞(例如视网膜双极细胞)转导的效率，使用酪氨酸突变的AAV，例如AAV2或AAV8(图9至图12)。在一种实施方式中，rAAV衣壳的表面暴露酪氨酸残基的突变允许载体避免磷酸化和随后的泛素化，从而防止蛋白酶体介导的降解，导致更多的转导和随后的光敏蛋白的基因表达。
在相关的实施方式中，除酪氨酸外，可以突变任何一种或一种以上表面暴露残基，以提高转导效率、组织/细胞类型嗜性、表达特性和有效感染所需的滴度。
如本文所描述的，对野生型rAAV载体的多核苷酸和多肽的结构的修饰和变化可能得到具有期望特性的改良rAAV病毒粒。例如，突变的rAAV载体可以改善光敏基因构建体向经选择的哺乳动物细胞、组织和器官的递送，用于各种疾病和障碍的治疗、阻止和预防。这种方法还可以提供用于这些疾病的症状改善的手段，并且通过rAAV载体介导的基因疗法，促进感兴趣的外源治疗多肽和/或预防多肽的表达。所述突变的rAAV载体可以编码一种或一种以上蛋白质，例如本文所描述的光敏蛋白，如ChR2。在本文中，在编码一种或一种以上由公开的rAAV构建体编码的光敏蛋白的特定多核苷酸序列中形成(或插入)一个或一个以上突变。在某些情况下，通过这些突变改变所得的光敏多肽序列，或者在其他情况下，多肽的序列未因在编码多核苷酸中的一个或一个以上突变而被改变，以产生具有改良特性的修饰载体，用于在哺乳动物系统中实现基因治疗。如本文所描述，编码光敏蛋白的多核苷酸的密码子优化也可能提高转导效率。
泛素-蛋白酶体通路在AAV细胞内运输中发挥作用。在例如AAV2或AAV8衣壳上的表面暴露酪氨酸残基的取代，允许载体具有有限的泛素化，或者完全避开泛素化。泛素化的降低或缺失可有助于防止衣壳遭受蛋白酶体介导的降解。在体外磷酸化分析中，AAV或rAAV衣壳可通过EGFR-PTK在酪氨酸残基处被磷酸化，并且所述磷酸化的AAV衣壳保持它们的结构完整性。虽然磷酸化的AAV载体可能与它们的未磷酸化的对应物(counterpart)一样有效地进入细胞，但是它们的转导效率可能显著减少。
在一些情况中，重组腺相关病毒(rAAV)载体包含具有突变的酪氨酸残基的衣壳蛋白，其能够使载体具有提高的靶细胞(例如视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞))转导效率。在一些情况中，所述rAAV进一步包含能够驱动感兴趣的蛋白质表达于靶细胞中的启动子(例如mGluR6或其片段)。
在一些情况中，在特定细胞类型中的表达还通过将本文描述的细胞类型特异性启动子包括在rAAV载体中而实现。
在一种实施方式中，重组腺相关病毒(rAAV)载体至少包含第一衣壳蛋白，所述第一衣壳蛋白至少包含第一磷酸化的酪氨酸氨基酸残基，并且其中所述载体还至少包含可操作地连接至启动子的编码光敏蛋白的第一核酸片段，所述启动子能够在宿主细胞中表达所述片段。
在一种实施方式中，可以在AAV 1-12或杂合AAV的衣壳蛋白的任何一个或一个以上酪氨酸残基中进行突变。在具体的实施方式中，这些是表面暴露的酪氨酸残基。在相关的实施方式中，所述酪氨酸残基是VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的一部分。在示例性实施方式中，可以在AAV-VP3衣壳蛋白的一个或一个以上以下氨基酸残基中进行突变：Tyr252、Tyr272、Tyr444、Tyr500、Tyr700、Tyr704、Tyr730；Tyr275、Tyr281、Tyr508、Tyr576、Tyr612、Tyr673或Tyr720。示例性突变为酪氨酸至苯丙氨酸的突变，包括但不限于：Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。在具体的实施方式中，这些突变在AAV2血清型中进行。在一些情况中，AAV2血清型包含Y444F突变和/或AAV8血清型包含Y733F突变，其中444和733表示病毒衣壳的酪氨酸点突变的位点。在进一步的实施方式中，这种突变的AAV2和AAV8血清型编码光敏蛋白(例如ChR2)，并且还可能包含调控序列(例如mGluR6)来驱动这种光敏蛋白的表达。
在相关的实施方式中，对AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或杂合血清型的酪氨酸残基进行1、2、3、4、5、6或7个突变。在一个示例性实施方式中，3个酪氨酸突变形成由Y444F、Y500F和Y730F组成的具有三重突变的AAV血清型。
本发明的rAAV载体可以包含于腺相关病毒颗粒或感染性rAAV病毒粒中，包括例如选自以下的病毒粒：AAV血清型1、AAV血清型2、AAV血清型3、AAV血清型4、AAV血清型5和AAV血清型6、AAV血清型7、AAV血清型8、AAV血清型9、AAV血清型10、AAV血清型11、AAV血清型12或杂合AAV血清型。
本发明的rAAV载体还可以包含于分离的哺乳动物宿主细胞中，包括例如人类、灵长类、鼠科、猫科，犬科、猪科、绵羊科、牛科、马科、epine、山羊和狼宿主细胞。所述rAAV载体可以包含于分离的哺乳动物宿主细胞中，如人内皮、上皮、血管、肝脏、肺脏、心脏、胰脏、肠、肾、肌肉、骨骼、神经、血液或脑细胞。
在一些实施方式中，与表达光敏蛋白的野生型AAV相比时，表达光敏蛋白且包含突变的衣壳蛋白(例如本文所描述的酪氨酸残基的突变)的AAV的转导效率增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％或大于200％，所述光敏蛋白例如是ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。本发明还提供了能够转导双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)的至少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的突变的rAAV载体(例如AAV2 Y444F载体或AAV8 Y733F载体)。由突变的衣壳造成的转导的提高可以允许通过玻璃体内注射转导双极细胞。例如，在一些实施方式中，通过玻璃体内注射，将突变的rAAV载体或rAAV组合血清型杂合载体或突变的组合血清型杂合rAAV载体引入至视网膜，所述载体可能能够转导至少2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)。在具体的实施方式中，仅转导视网膜双极细胞的亚群。在其他具体的实施方式中，仅转导高度敏感的双极细胞。
在一些实施方式中，与表达光敏蛋白的野生型AAV相比时，包含具有突变的衣壳蛋白且表达光敏蛋白的AAV的泛素或蛋白酶体介导的降解减少了至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％，所述光敏蛋白例如是ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。
其他基因递送载体
适用于在眼部细胞，特别是视网膜细胞，更特别的是非光感受器细胞(例如无长突细胞、视网膜神经节细胞、视网膜双极细胞(ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞))中表达ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体或者任何光敏蛋白的多种其他载体中的任何一种都在本发明的范围之内。基因递送载体可以是病毒载体(例如衍生自或包含病毒DNA或RNA序列，优选包装于病毒颗粒中)或非病毒载体(例如并未包装于病毒颗粒中，包括“裸”多核苷酸，与诸如脂质体或靶分子的载体颗粒联合的核酸等)。
以下描述其他示例性基因递送载体。
重组腺病毒载体(Ad)：在其他实施方式中，所述基因递送载体为重组腺病毒载体。美国专利第6,245,330号描述的重组腺病毒可适合用于本发明中。Ad载体并不整合至宿主细胞基因组，当需要短期基因表达(一般约14日)时特别优选。因而，Ad载体的应用可能要求重复眼内注射来治疗在一般患者中持续几十年的视网膜疾病。
Ad和AAV在视网膜内的病毒嗜性可能不同。由载体转导的细胞亚群通常是受体介导的事件。已证明，注射后Ad载体主要转导视网膜米勒细胞和视网膜色素上皮细胞。当注射至眼部时，AAV载体非常有效地转移它们的基因有效荷载至视网膜光感受器细胞和非光感受器细胞。
逆转录病毒基因递送载体：本发明的基因递送载体可以是适合表达经选择的感兴趣的基因或序列(例如ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体)的逆转录病毒基因递送载体。本发明的逆转录病毒基因递送载体可易于从各种各样的逆转录病毒(包括例如B、C和D型逆转录病毒以及泡沫病毒和慢病毒)构建。例如，在一些情况中，将诸如慢病毒的逆转录病毒用包膜蛋白或其他病毒蛋白假型化，以促进进入靶细胞。在一些情况中，将慢病毒用水疱性口炎病毒g蛋白假型化(参见RNA Tumor Viruses，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，1985)。这些逆转录病毒可易于从保藏机构或保藏所如美国模式培养物保藏所(“ATCC”；Rockville，Maryland)获得，或者由本文提供的已知和标准重组技术(例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Kunkel，PNAS 52：488，1985)分离。
此外，在本发明的一些实施方式中，部分逆转录病毒基因递送载体可以源自不同的逆转录病毒。例如，在本发明的一种实施方式中，逆转录病毒LTR可以源自鼠科肉瘤病毒、来自劳氏(Rous)肉瘤病毒的tRNA结合位点、来自鼠科白血病病毒的包装信号、以及来自禽白血病病毒的第二链合成起始位点。
在本发明的一个方面，提供的逆转录病毒载体构建体包含5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、一种或一种以上异源序列、第二链DNA合成起始位点和3′LTR，其中所述载体构建体缺失gag、pol或env编码序列。
其他逆转录病毒基因递送载体同样可以用在本发明中，并且是本领域所熟知的。
适合用于上述逆转录病毒载体构建体的包装细胞系可以根据本领域熟知的方法容易地制备，并且可被用来形成用于重组载体颗粒生产的生产细胞系。
甲病毒递送载体：适合在本发明中应用的基因递送载体还可以基于甲病毒载体。例如，辛德毕斯(Sindbis)病毒是披膜病毒科甲病毒属的原型成员。辛德毕斯病毒不分节段的基因组RNA(49S RNA)长度大约为11,703个核苷酸，包含5′帽和3′多聚腺苷酸尾巴，并且显示正极性。传染性的包膜辛德毕斯病毒通过在细胞质中装配病毒核衣壳蛋白于病毒基因组RNA上并且出芽穿过嵌入了病毒编码的糖蛋白的细胞膜而形成。病毒进入细胞是通过经由被膜小窝的细胞内吞作用、病毒膜和内涵体的融合、核衣壳的释放以及病毒基因组的脱壳而实现的。在病毒复制期间，基因组49S RNA作为用于合成互补负链的模板。这种负链又作为用于基因组RNA和内在启动(internally initiated)的26S亚基因组RNA的模板。
所述辛德毕斯病毒非结构蛋白是从基因组RNA翻译的，而结构蛋白是从亚基因组26S RNA翻译的。全部病毒基因表达为多聚蛋白，并且通过翻译后蛋白裂解加工成单个蛋白。包装序列位于非结构编码区，因此仅有基因组49SRNA被包装进病毒粒中。
在本发明中，可以构建和利用几种不同的辛德毕斯载体系统。这种系统的代表性实例包括在美国专利第5,091,309号和第5,217,879号以及PCT公开第WO 95/07994号中描述的那些。
其他病毒基因递送载体。除了逆转录病毒载体和甲病毒载体，许多其他病毒载体系统也可用作基因递送载体。这种基因递送载体的代表性实例包括诸如痘病毒之类的病毒，诸如金丝雀痘病毒或牛痘病毒之类的病毒。
非病毒基因递送载体：除了以上基于病毒的载体外，在本发明中，同样可以利用许多非病毒基因递送载体。这些基因递送载体的代表性实例包括直接递送核酸表达载体、裸DNA(例如未包含于病毒载体的DNA)(WO 90/11092)、连接或未连接至灭活腺病毒的聚阳离子浓缩的DNA(Curiel等，Hum.Gene Ther.3：147-154，1992)、连接至具有或不具有上述高亲和性配对物之一的配体的DNA配体(Wu等，R of Biol.Chem(264：16985-16987，1989)、包含脂质体的核酸(例如WO 95/24929和WO 95/12387)以及某些真核细胞。
调控序列
在一些实施方式中，利用调控序列或元件以允许ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体的细胞类型或组织类型特异性靶定。在相关的实施方式中，将调控元件用于特异性靶向视网膜神经元、或视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)、或视网膜神经节细胞、或光感受器细胞、或无长突细胞。调控序列或元件的实例包括但不限于：启动子、沉默子、增强子和绝缘子序列。
在一些实施方式中，适用于本发明的调控序列(如启动子)包括组成型启动子、强启动子(例如CMV启动子)、诱导型启动子和组织特异性或细胞特异性启动子(例如优先促进在少数组织或细胞类型中(例如眼部组织、视网膜、视网膜细胞、光感受器细胞等)表达的启动子)。
可以在本发明的基因递送载体中使用任何一种调控序列，以用于感兴趣的光敏蛋白的合适水平或模式的表达。所述调控序列通常源自真核调控序列。
在一些实施方式中，使用非细胞特异性调控元件。在一种实施方式中，所述启动子包含(从5′至3′)病毒增强子(CMV即时早期增强子)和β-肌动蛋白启动子(牛或鸡β-肌动蛋白启动子-外显子1-内含子1元件)。在具体的实施方式中，所述启动子包含(从5′至3′)CMV即时早期增强子(381bp)/牛或鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子外显子1-内含子1(1352bp)元件，本文统称为“CBA启动子”(图7)。在一些实施方式中，使用病毒载体(如AAV)将编码光敏蛋白的核酸递送至细胞，所述AAV携带由非细胞特异性启动子和/或其他调控序列调控的表达DNA产物的经选择的光敏转基因编码DNA。在一些相关的实施方式中，所述非细胞特异性启动子为通用启动子，如基于泛素的启动子，例如泛素C启动子。
在其他实施方式中，使用病毒载体(如AAV)将光敏蛋白递送至感兴趣的细胞类型或组织类型，所述AVV携带由非细胞特异性启动子和/或其他调控序列调控的经选择的光敏转基因编码DNA，该DNA在受试者的经选择的视网膜细胞中表达DNA产物。在具体的实施方式中，通过使用被设计到载体中的特异性启动子核苷酸序列和/或其他调控区(如沉默子、增强子或绝缘子序列)，将表达靶定至视网膜中特定类型的细胞。在一些实施方式中，在不同的细胞群中使用不同的调控序列来驱动不同改造基因的表达。
在其他实施方式中，使用视网膜双极细胞特异性调控序列，如启动子、增强子、沉默子和绝缘子序列。在具体的实施方式中，靶定ON双极细胞。在其他实施方式中，靶定OFF双极细胞。在其他实施方式中，靶定视杆双极细胞。在其他实施方式中，靶定视锥双极细胞。
在一种实施方式中，使用可操作地连接至GRM6(代谢型谷氨酸受体6，mGluR6)调控序列或其片段的光敏蛋白来靶向光敏蛋白在ON双极细胞中的特异性表达，所述光敏蛋白如ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。在一种实施方式中，利用全长mGluR6调控序列。
在另一实施方式中，使用可操作地连接至mGluR6调控序列片段的光敏蛋白来靶向光敏蛋白在ON双极细胞中的特异性表达，所述光敏蛋白如ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。在具体的实施方式中，所述mGluR6调控序列片段为图6中所示的序列。在相关的实施方式中，所述mGluR6调控序列片段基本上与图6中所示的序列相同，或者与图6中所示的序列约60％相同或约70％相同或约80％相同或约90％相同或约95％相同。
许多已知启动子太大而不能装配到AAV的基因组中。事实上，mGluR6的原始细胞特异性调控序列(Dhingra、2008)太大(大约10.5Kb)而不能在AVV中使用。在本发明优选的实施方式中，使用mGluR6调控序列片段，它小得足以在AAV介导的递送中使用。在相关的实施方式中，所述mGluR6调控序列片段长度为少于约2000个碱基对、少于约1000个碱基对、少于约750个碱基对、少于约500个碱基对、少于约250碱基对或少于约100个碱基对。在另一相关的实施方式中，所述mGluR6调控序列片段为图6中所示序列的变体。
在另一实施方式中，使用可操作地连接至GNA01(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白质)，α激活活性多肽O)调控序列的光敏蛋白来靶向光敏蛋白在ON双极细胞中的特异性表达，所述光敏蛋白如ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。在相关的实施方式中，所述调控序列基本上与GNA01序列相同，或者与GNA01序列约60％相同或约70％相同或约80％相同或约90％相同或约95％相同。
视网膜双极细胞和靶定
虽然仅是人视觉系统的一小部分，但视网膜是在视觉信号发送至其余视觉系统之前，过滤、放大和调节视觉信号的复杂系统(Wassle 2004)。这个过程大部分发生于内网层(IPL)中，其中双极和无长突细胞系统提炼视觉信号成为其主要成分(例如运动、对比度、分辨率)(Mills 1999；Roska 2001)。一些小组当前将ChR2靶定至神经节细胞层，其绕开了所述IPL和无长突细胞系统的处理能力(Bi 2006；Greenberg 2007；Tomita 2007)。这些小组极少报道行为的变化。
大多数视网膜细胞是ON中心型(由于感受野中心内对比度的逐步增加(step increase)而具有增加的发放率)或OFF中心型(由于感受野中心内对比度的逐步减小(step decrease)而具有增加的发放率)，以一种推挽式抑制模式运行(Wassle 2004)。为了维持所述两种路径之间的这种关系，这两种路径可以被独立地驱动。从双极细胞至神经节细胞的信息传送的ON和OFF通道通过在内核层中的抑制性无长突细胞的网络被部分地调控(Roska 2001)。这种双极-无长突网络形成信息的临时区别平行通道：例如，持续活性神经元在整个光步骤(light step)中维持活性，而短暂活性神经元仅在开启或关闭时具有活性。这些响应的不同模式决定了视觉信息亮度、形状、边缘和运动(Wassle 2004)。在一些实施方式中，视网膜神经节细胞的突触前细胞被遗传性地靶向，以维持这些通道的本能和引起自然的神经节细胞发放。
在一些实施方式中，视网膜双极细胞(例如ON或OFF视网膜双极细胞；视杆和视锥双极细胞)被遗传性地靶向。靶向视网膜双极细胞可允许视网膜响应外部光，并且更重要地，甚至是在缺乏天然的光感受器时，传送有意义的图像信息至大脑。
可被治疗的病症
在一些实施方式中，本发明提供了治疗患疾病或障碍的受试者的方法。可以利用本文所描述的组合物和方法来治疗中枢和外周神经系统疾病和障碍。
一方面，利用本发明的组合物和方法来治疗光感受器疾病。光感受器疾病(如色素性视网膜炎(RP)和年龄相关性黄斑变性(ARMD))导致全世界1500万人失明(Congdon 2004；Chader 2002)，数量随着人口年龄增长而增加。曾有尝试通过基因替代疗法或细胞移植来恢复基本视觉功能(Acland 2001，Acland 2005，Batten 2005，Pawlyk 2005，Aguirre 2007，MacLaren 2006)。然而，当前的方法基本上限于潜在影响的范围和程度，因为他们试图以一次一种(one-at-a-time)为基础机械地纠正不同的遗传通路(Punzo 2007)。光感受器疾病在遗传上是多种多样的，具有超过160种不同的突变导致退化(Punzo 2007)。还有利用植入于人类受试者中的急性、半急性和长期视网膜假体来进行电刺激的努力(de Balthasar，2008；Horsager，2009)。他们已显示出初步的进展，但是为基因非特异性的；电刺激仅提供总的特异性并且不加选择地驱动由独特的细胞类型介导的视觉信息通道。激活视网膜神经元需要大的圆盘电极(至少是视网膜神经节细胞直径的20倍)，导致以非选择的方式刺激视网膜广阔区域，极大限制了可达到的视觉分辨率(Winter 2007)。在这方面，本发明的组合物和方法由以下组成：引入编码光敏蛋白的基因以在二级神经元(例如双极细胞)中诱导光敏性，所述光敏蛋白例如是ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体，所述基因是在调控元件(例如GRM6)的控制下，使用具有单个酪氨酸突变成苯丙氨酸的病毒载体(如AAV8)来递送的。这些光敏蛋白的活化可以由环境光或通过光递送装置(如图13所描述的护目镜)控制。
本发明的方法可以用于治疗(例如在症状发作之前或之后)易感性受试者或诊断为具有各种眼部疾病的受试者。所述眼部疾病可能是由环境因素(例如化学物质损伤、热损伤等)、机械损伤(例如由于事故或手术的损伤)或者遗传因素导致的结果。患有病症的受试者可能单眼或双眼感染，并且可根据本发明对感染的眼部或者由于这种病症在受试者另一感染的眼部存在而处于光感受器变性危险的眼部给予治疗。
本发明提供的方法通常包括眼内给予(例如通过视网膜下注射或通过玻璃体内注射)基因递送载体的步骤，所述基因递送载体将光敏蛋白的表达导引至眼部，从而治疗、预防或抑制眼部疾病的发作或发展。如本文所使用，应当理解术语“治疗、预防或抑制”是指以统计学上显著的方式改变疾病发作、过程或发展。
可根据本发明治疗的另一种病症为年龄相关性黄斑变性(AMD)。所述黄斑为包含中央凹的视网膜中心附近的结构。视网膜的此特化部分负责高分辨率视觉，允许诸如阅读的行为。AMD中的中央视觉损失是破坏性的。黄斑的变性变化(黄斑病变)几乎可发生在一生中的任何时间，但是年老阶段更普遍。由于复发性脉络膜新生血管形成，常规治疗是短效的。AMD有两种主要的病理过程，脉络膜新生血管形成(CNV)和黄斑性光感受器细胞死亡。
可根据本发明的方法治疗的特别感兴趣的示例性病症包括但不必须限于：视网膜色素变性(RP)、糖尿病视网膜病变和青光眼，青光眼包括开角型青光眼(例如原发性开角型青光眼)、闭角型青光眼和继发性青光眼(例如色素性青光眼、假性剥脱性青光眼以及由外伤和炎症性疾病导致的青光眼)。
可根据本发明治疗的进一步示例性病症包括但不必须限于：视网膜剥离、年龄相关或其他黄斑病变、光视网膜病变、手术引发的视网膜病变、中毒性视网膜病变、早产儿视网膜病变、由眼部外伤或穿透性损伤引起的视网膜病变、遗传性视网膜变性、手术引发的视网膜病变、中毒性视网膜病变、由眼部外伤或穿透性损伤引起的视网膜病变。
根据本发明治疗的感兴趣的具体示例性遗传病症包括但不必须限于：Bardet-Biedl综合征(常染色体隐性)；先天性黑朦(常染色体隐性)；视锥细胞或视锥-视杆细胞变性(常染色体显性和X-连锁形式)；先天性静止性夜盲症(常染色体显性、常染色体隐性和X-连锁形式)；黄斑变性(常染色体显性和常染色体隐性形式)；视神经萎缩(常染色体显性和X-连锁形式)；视网膜色素变性(常染色体显性、常染色体隐性和X-连锁形式)；综合征性或系统性视网膜病变(常染色体显性、常染色体隐性和X-连锁形式)；以及Usher综合征(常染色体隐性)。
另一方面，利用本发明的组合物和方法来治疗外周损伤、疼痛感或慢性疼痛。长时间的疼痛感(疼痛)可能引起慢性疼痛，并且可能由身体中的内脏、肉体或神经结构的损伤或疾病而引起。虽然用于神经性疼痛的药物治疗范围在过去十年已增加，但许多患者并没有得到有效镇痛，甚至有效的药物经常产生不期望的副作用。P物质(SP)与疼痛感有关，它将关于组织损伤的信息从外周受体传输到中枢神经系统以转变为痛觉。已有理论表明，它与纤维肌痛有关。对由NK1和NK2拮抗剂中心给药引起的有害刺激的响应阈值的降低表明了P物质在疼痛感中的作用。在缺失SP/NKA的突变小鼠中，由机械、热和化学物质刺激肉体和内脏组织引起的疼痛行为减少。在一种实施方式中，使用NpHR或eNpHR，光敏蛋白能抑制由于外周损伤或慢性疼痛而过度活跃的神经元(即P物质表达外周神经元)的活性。使用P物质启动子序列，NpHR/eNpHR可被遗传性地靶定至P物质表达细胞。在另一实施方式中，光敏蛋白增强由于外周损伤或慢性疼痛而失活的神经元的活性。
在另一方面，利用本发明的组合物和方法来治疗脊髓损伤和/或运动神经元病。脊髓损失可导致脊髓病或白质和有髓纤维束损伤，有髓纤维束将感觉和运动信号传送到和传送出脑。它也可能损伤脊柱中央部分的灰质，导致中间神经元和运动神经元的节段损失(segmental loss)。脊髓损伤可能发生自许多原因，包括但不限于：外伤、肿瘤、缺血、发育异常、神经发育性疾病、神经退行性障碍或血管畸形。在一种实施方式中，光敏蛋白激活受损的神经回路以恢复运动或感觉功能。在一种具体的实施方式中，所述元件发挥作用以允许自主和内脏功能的控制。在其他实施方式中，所述元件发挥作用以允许肉体骨骼功能的控制。尿的储存和排泄的神经控制是复杂的，并且功能失常可能难以治疗。对于患难治性症状的人的一种治疗是使用植入电极和植入脉冲发生器对骶神经根进行持续的电神经刺激。然而，这种神经根的刺激可能导致许多不同的并发症或副作用。通过基因靶向工具能够直接控制骶神经将非常有益。在一种实施方式中，ChR2和NpHR都可以表达于这种神经中来控制膀胱的存储和排泄。
在另一方面，利用本发明的组合物和方法来治帕金森(Parkinson′s)病。帕金森病属于被称为运动障碍的一类病症。它们的特征是肌肉僵化、颤动、身体运动慢化(运动迟缓)以及在极端情况下，身体运动丧失(运动不能)。主要症状是由基底神经节对运动皮质的刺激降低导致的，这通常由多巴胺的形成和作用不足引起，多巴胺产生于脑的多巴胺能神经元中。帕金森病既是慢性又是进行性的。与诸如丘脑切开术和/或苍白球切开术的损伤性技术相比，深部脑刺激(DBS)是用于晚期帕金森病(PD)的有效手术治疗法，在发病率-死亡率和生命质量方面具有显著的优势。具有严重静止性震颤、对常规药物治疗无响应或者具有运动并发症的患者需要该治疗方法。最常见报道的在手术中和手术后期的并发症是程序中止、错放导线(misplaced leads)、颅内出血、突然发作和硬件并发症(hardware complication)，而长期看来，症状可能包括高度认知功能障碍、精神病和轻微语言问题。事实上，这种治疗的方法将通过能够在给定区域内靶向特异性细胞类型来避免这些副作用而改进。在一种实施方式中，光敏蛋白特异性激活多巴胺能回路。
在另一特定方面，利用本发明的组合物和方法来治疗癫痫症和突然发作。癫痫症是经常以突然发作为特征的神经病症。这些突然发作是由于脑中异常、过量或异时的神经元活动导致的短暂征兆和/或症状。即使有最好的可利用的药物，患癫痫症的人超过30％不能控制突然发作。癫痫症并不是单一的障碍，而是相当于具有许多不同症状的一组综合病症，但是全部涉及脑中短暂的异常电活动。最近在小规模的初步研究中已证明，在不同的丘脑核和内侧颞叶结构中的急性深部脑刺激(DBS)是有效的。关于合理靶标和刺激参数的循证信息很少。在长期随访期间，扁桃体海马DBS已导致突然发作次数和间歇EEG异常的显著降低。来自初步研究的数据表明，用于癫痫症的慢性DBS可能是可行、有效和安全的过程。此外，能够遗传学上靶向激活细胞的特异性亚群将提高治疗质量并使整体副作用最小化。在具体实施方式中，利用所述光敏蛋白改变在这些脑区域深处的、导致突然发作的异时电活动。
在另一方面，利用本发明的组合物和方法来实现用于疾病预防、治疗和改善的植入药物或疫苗存储的光刺激释放。
在另一方面，利用本发明的组合物和方法来治疗神经退行性疾病，所述神经退行性疾病选自但不限于：酒精中毒、亚历山大(Alexander′s)病、阿尔珀斯(Alper′s)病、阿尔茨海默(Alzheimer′s)病、肌萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、巴滕(Batten)病(又被称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、牛脑海绵状病(BSE)、慢性疼痛、卡那文(Canavan)病、科凯恩(Cockayne)综合征、皮质基底核退化症、克-雅(Creutzfeldt-Jakob)病、亨廷顿(Huntington′s)病、HIV-相关痴呆、肯尼迪(Kennedy′s)病、克拉伯(Krabbe′s)病、路易(Lewy)体痴呆、马查多-约瑟夫(Machado-Joseph)病(脊髓小脑共济失调3型)、多发性硬化、多系统萎缩、发作性睡病、神经疏螺旋体病(Neuroborreliosis)、帕金森病、佩-梅(Pelizaeus-Merzbacher)疾病、皮克(Pick′s)病、原发性侧索硬化、朊病毒(Prion)病、雷夫苏姆(Refsum′s)病、桑德霍夫(Sandhoff′s)病、希尔德(Schilder′s)病、脊髓亚急性联合变性合并急性贫血(Subacute combined degeneration of spinal cord secondary to Pernicious Anaemia)、精神分裂症、Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病(又被称为巴滕(Batten)病)、脊髓小脑共济失调(具有不同特征的多种类型)、脊髓性肌萎缩、进行性核上性瘫痪(Steele-Richardson-Olszewski病)以及脊髓痨(Tables dorsalis)。
在另一方面，利用本发明的组合物和方法来治疗神经发育疾病，所述神经发育疾病选自但不限于：注意缺陷多动障碍(ADHD)、注意缺陷障碍(ADD)、精神分裂症、强迫症(OCD)、精神发育迟滞、自闭症谱系障碍(ASD)、脑性麻痹、脆性X综合征、唐氏(Downs)综合征、雷特(Rett’s)综合征、阿斯伯格(Asperger’s)综合征、威廉斯(Williams-Beuren)综合征、儿童崩解症、分节发音障碍、学习障碍(即阅读或计算)、阅读障碍、表达性语言障碍以及混合性感受-表达性语言障碍、言语或表演能力。由异常的神经发育过程导致的疾病还可以包括但不限于：双极障碍、厌食症、普遍抑郁、癫痫发作、强迫症(OCD)、焦虑、磨牙症(bruixism)、快乐木偶(Angleman’s)综合征、攻击性、爆发性发作(explosive outburst)、自伤、创伤后压力、品行障碍、妥瑞(Tourette’s)症、制式行为疾患(stereotypic movement disorder)、情绪病、睡眠呼吸暂停、不安腿综合征、睡眠障碍(dysomnias)、妄想型人格障碍、分裂样(schizoid)人格障碍、分裂型(schizotypal)人格障碍、反社会型人格障碍、边缘型人格障碍、表演型人格障碍、自恋型人格障碍、逃避型人格障碍、依赖型人格障碍、反应性依恋障碍；分离性焦虑障碍；对立违抗性障碍；性交疼痛、纵火癖、盗窃癖、拔毛发癖、赌博癖、异食癖、精神官能症、酒精相关障碍、安非他明相关障碍、可卡因相关障碍、大麻滥用、阿片相关性障碍、苯环利啶(phencyclidine)滥用、烟草使用障碍、神经性暴食症、妄想症、性障碍(sexual disorder)、恐惧症、身体化症、遗尿、大便失禁、文字表达障碍、表达性语言障碍、精神发育迟滞、数学障碍、短暂性抽动障碍、口吃、选择性缄默症、克罗恩(Crohn′s)病、溃疡性结肠炎、细菌过度生长综合征、碳水化合物不耐症、乳糜泻、传染病和感染症、肠内引流式胰腺移植、短肠综合征、热带性口炎性腹泻、惠普尔(Whipple′s)病、阿尔茨海默病、帕金森病、ALS、脊髓性肌萎缩和亨延顿病。关于神经发育障碍的进一步实例、讨论和信息可以例如通过国家精神卫生研究所(National Institute of Mental Health)神经发育障碍分部(万维网网址nihm.nih.gov/dptr/b2-nd.cfm)找到。关于神经发育疾病的其他信息还可以例如在Developmental Disabilities in Infancy and Childhood：Neurodevelopmental Diagnosis and Treatment，Capute and Accardo，eds.1996，Paul H Brookes Pub Co.；Hagerman，Neurodevelopmental Disorder：Diagnosis and Treatment，1999，Oxford Univ Press；Handbook of Neurodevelopmental and Genetic Disorders in Children，Goldstein and Reynolds，eds.，1999，Guilford Press；Handbook of Neurodevelopmental and Genetic Disorders in Adults，Reynolds and Goldstein，eds.，2005，Guilford Press；以及Neurodevelopmental Disorders，Tager-Flusberg，ed.，1999，MIT Press中找到。
治疗的评估
如本文所描述，本发明的治疗效果可使用本领域内已知的方法，以各种方式评估。例如，可以根据常规方法测试受试者的视力。这些常规方法包括但不必须限于：视网膜电流图(ERG)、聚焦ERG、用于视野的测试、用于视敏度的测试、光学相干断层扫描(OCT)、眼底照相、视觉诱发电位(VEP)以及瞳孔测量法。在其他实施方式中，可以从行为上评估所述受试者。总体来说，本发明用于受试者视力的维持(例如预防或抑制由于光感受器变性而引起进一步的视力减退)、减慢视力减退发作或进程，或者在一些实施方式中，用于治疗之前相对于受试者视力的改良视力。
给药的方法
本发明的基因递送载体可以通过各种途径递送至眼部。它们可通过局部施用至眼部或通过眼内注射至例如玻璃体(玻璃体内注射)或视网膜下(视网膜下注射)光感受器之间的(inter-photoreceptor)空间而被眼内递送。可选择地，它们可通过插入或注射至眼部周围的组织而被局部递送。它们可通过口服途径或通过皮下、静脉内或肌肉注射而被全身递送。可选择地，它们可通过导管或通过植入物而被递送，其中这种植入物由多孔、无孔或凝胶材料制成，包括膜(如硅橡胶膜或纤维)、可生物降解聚合物或蛋白质的材料。所述基因递送载体可以在病症发作之前被递送以预防其出现，例如在眼部手术期间，或者紧接在病理病症发作之后，或者急性或长期病症出现期间。
在另一实施方式中，所述内界膜(ILM)被分解以实现递送。ILM是视网膜和玻璃体之间的边界，由星形胶质细胞和米勒细胞脚板形成。在非人灵长类和人类中，ILM厚且提供视网膜的基本屏障。事实上，使用玻璃体内注射，大部分病毒颗粒不能转导视网膜细胞。在一种实施方式中，为提高转导效率，进行ILM剥除，包括实施包括剥除一小部分ILM的手术程序。在另一实施方式中，为提高转导效率，ILM屏障可以部分或全部分解，包括使用酶技术和一种或一种以上酶。
在一种实施方式中，ILM被保留以限制光敏蛋白对黄斑的治疗效果。在另一实施方式中，使用本文所描述的ILM剥除方法和/或ILM酶消化方法以实现光敏蛋白更广泛的分布。
可以修饰所述基因递送载体以增强血-视网膜屏障的渗透。这种修饰可以包括增加含有基因递送载体的药物制剂的亲脂性。
所述基因递送载体可以单独或联合递送，并且可以与药学上可接受的载体一起递送。理想地，这种载体将增强稳定性和/或递送特性。本发明还提供了包含活性因子或其片段或其衍生物的药物组合物，其可以使用合适的载体(如脂质体、微粒或微胶囊)给药。在本发明的各种实施方式中，使用这种组合物以实现活性组分的持续释放可能是有用的。
在治疗特定障碍或病症中有效的基因递送载体量(例如病毒颗粒的数量)和表达的光敏蛋白量可能依赖于所述障碍或病症的性质和各种患者特异性因素，并且可以通过标准临床技术确定。
在一种实施方式中，所述基因递送载体被施用于眼部，并根据要治疗、预防或抑制的疾病类型以及疾病的程度眼内施用于眼内的各种位置。合适的位置实例包括视网膜(例如对于视网膜疾病)、玻璃体或者视网膜内或附近的其他位置、眼内或附近的其他位置。
人视网膜被安排于相当精确的镶嵌结构(mosaic)中。在中央凹内，所述镶嵌结构为视锥细胞的六边形聚集(packing)。在中央凹外，视杆细胞打破视锥细胞的紧密的六边形聚集，但是仍然允许视锥细胞更加均匀隔开的、有组织的结构被多圈视杆细胞环绕。因此，在人视网膜中不同的光感受器群的密度方面，很明显视锥细胞密度在中央凹小凹处最大，而在中央凹外部至外周视网膜迅速降低至相当均匀的密度(参见Osterberg，G.(1935)Topography of the layer of rods and cones in the human retin.Acta Ophthal.(suppl.)6，1-103；同样参见Curcio，C.A.，Sloan，K.R.，Packer，O.，Hendrickson，A.E.and Kalina，R.E.(1987)Distribution of cones in human and monkey retina：individual variability and radial asymmetry.Science 236，579-582)。
本领域技术人员可以易于接近期望的视网膜部分或眼的其他部分(参见Generally Medical and Surgical Retina：Advances，Controversies and Management，Hilel Lewis，Stephen J.Ryan，Eds.，medical-″illustrator，Timothy C.Hengst.St.Louis：Mosby，c1994.xix，534；同样参见Retina，Stephen J.Ryan，editor in chief，.2nd ed.，St.Louis，Mo.：Mosby、c1994.3v.(xxix，2559)。
在一种实施方式中，应用于视网膜的特异性病毒载体的量一律相当小，因为眼部为相对包含的结构，并且试剂直接注入其中。需要注射的载体的量由所选的用于治疗的靶向细胞的眼内位置来确定。要转导的细胞类型可以由要治疗的具体疾病实体来确定。
例如，单独20微升体积(例如包含约1013个物理颗粒滴度/ml rAAV)可以用于视网膜下注射来治疗人眼部的黄斑和中央凹。可以使用50～100微升的更大注射来递送rAAV至视网膜区域的实质性部分，或许是全部视网膜，这取决于所述颗粒横向扩散的程度。
100微升注射可以提供几百万活性rAAV颗粒至视网膜下空间。这种计算基于1013个物理颗粒/毫升的滴度。这种滴度下，估计1/1000至1/10,000的AAV颗粒是感染性的。视网膜解剖学限制了在视网膜下空间(SRS)中可能的注射体积。假设最大注射量100微升，这可在SRS中提供105个至109个rAAV的感染滴度。这将具有用单次注射感染在整个人视网膜中全部大约150×106个光感受器的潜力。
在黄斑变性或其他局部视网膜病变的情况下，集中应用于中央凹或黄斑的更小注射体积可以充分转染受疾病感染的整个区域。
根据具体的应用，可以递送至少103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014个或更多的颗粒至感兴趣的组织。
可选择地，基因递送载体可以通过眼内注射至玻璃体而被递送至眼部，例如来治疗由于细胞凋亡导致的与青光眼有关的视网膜神经节细胞损失。在青光眼的治疗中，要转导的主要靶细胞是主要受感染的视网膜神经节细胞和视网膜细胞。在这种实施方式中，所述基因递送载体的注射体积可以实质性地更大，因为体积并不受视网膜下空间的解剖学的限制。在这种情况下，可接受的剂量范围可以为约25微升至1000微升。
药物组合物
基因递送载体可以制备成适合用于给药的药学上可接受的组合物。一般地，这种药物组合物包含一定量的基因递送载体并结合了药学上可接受的载体或赋形剂，基因递送载体的量适合将编码光敏蛋白的多核苷酸递送至眼部细胞，用于表达治疗有效量的光敏蛋白。优选地，所述药学上可接受的载体适合用于眼内给药。示例性的药学上可接受的载体包括但不必须限于：盐水或缓冲盐水溶液(例如磷酸盐缓冲液)。
本领域内熟知各种药学上可接受的赋形剂。本文所使用的“药学上可接受的赋形剂”包括任何一种与组合物的活性成分结合时，允许该成分保留生物活性的材料，优选不会导致与受试者的免疫系统产生破坏性反应或者不利地影响给药位置(例如眼内)周围的组织。
示例性的药物载体包括非水溶液、悬浮液和乳剂的无菌液。实例包括但不限于：任何一种标准的药物赋形剂，如盐水、缓冲盐水(例如磷酸缓冲盐水)、水、乳剂(如油/水乳剂)以及各种类型的润湿剂。
非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、透明质酸、植物油(如橄榄油)以及可注射的有机酯(如油酸乙酯)。
水载体包括水、乙醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏(Ringer′s)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏油或固定油。静脉内载体可以包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂)等。
本发明的基因递送载体组合物还以使用本领域内熟知的手段冻干，用于根据本发明的后续复原和应用。当要递送的载体没有被封装于病毒颗粒中(例如作为“裸”多核苷酸)时，用于脂质体递送的制剂以及包含微囊化的多核苷酸的制剂，也可能是令人感兴趣的。
包含赋形剂的组合物通过熟知的常规方法配制(参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Chapter 43，14th Ed.，Mack Publishing Col，Easton PA 18042，USA)。
一般地，所述药物组合物可以制成各种形式，优选与眼内给药相容的形式。稳定剂、湿润和乳化剂、用于改变渗透压的盐或用于确保适当pH值的缓冲液也可以任选地存在于所述药物组合物中。
药物制剂中基因递送载体的量可以广泛变化，即按重量计，从少于约0.1％(通常为或至少为约2％)至多达20％至50％或更多，并且可以根据所选给药的特定模式主要按流体体积、粘性等选择。
所述药物组合物可以包含适合用于给药的其他试剂，这些其他试剂可具有与要递送的光敏蛋白(例如ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体)相似的药理活性，甚至与其相比具有附加的药理活性。
试剂盒
本发明还提供了用于实施本发明方法的包含各种材料的试剂盒。在一种实施方式中，所述试剂盒包含编码光敏蛋白多肽(例如ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体)的载体，所述载体适合用于递送至受试者，尤其是受试者的眼部，并且适合来提供光敏多肽在眼部细胞的表达，尤其是哺乳动物细胞中。所述试剂盒可以包括在无菌瓶中的载体，可以被标记用途。所述载体可以提供于药物组合物中。在一种实施方式中，所述载体包装于病毒中。所述试剂盒可进一步包括适合与小瓶一起使用的针和/或注射器，或者可选择地，包括含有载体的针和/或注射器，该针和/或注射器优选为无菌的。在另一实施方式中，所述试剂盒包括适合用于将载体递送至眼部的导管，所述导管可以任选地附着于用于载体递送的注射器上。所述试剂盒还可包括使用说明，例如关于给药途径、剂量、给药方案、给药位置等的说明。
装置
图12C中的数据示出光敏蛋白的递送可以在正常视力范围内进行。在一些实施方式中，为了更大的效力，可以使用内部或外部装置。在一种实施方式中，诸如护目镜之类的外部装置可以用于光的产生和/或放大。在具有部分视力的受试者正接受治疗的实施方式中，即受试者的光感受器仅部分受损并且光敏蛋白(如ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体)正被递送的治疗中，可以调节刺激以便存活的和/或健康光感受器未被光产生/放大装置过度驱动。在各种实施方式中，限制光产生/放大装置的过度驱动可以通过以下方式实现：i)均匀刺激，但是通过植入的或外部隐形眼镜型局部太阳眼镜(光感受器上着色、光敏蛋白转导区域上光亮)遮蔽存活的或健康的光感受器细胞使其不受明亮的光线刺激；ii)调节刺激强度以匹配要刺激的细胞类型；或者iii)调节刺激至接近视觉动态范围上限。
在一种实施方式中，植入内部光发生装置。
在另一实施方式中，与所述装置联合或独立地植入保护性的光学镜型或隐形眼镜型屏障。在具体实施方式中，这种光学镜或隐形眼镜保护光感受器不受光刺激。在具体的实施方式中，镜片使光感受器上着色和光敏蛋白转导区域上光亮。
在一些实施方式中，利用头部安装的外部装置或眼镜。在一些实施方式中，当自然或环境光未能触发所述光敏元件达到期望的程度时，提供额外的光生产或产生源，如LED阵列/激光系统。在一些实施方式中，所述外部眼镜可以附加包括相机和图片处理部件，用于所呈现图像的过滤、增强、处理和分解。图13图示了具有相联合的光产生元件(LED阵列/激光系统)的护目镜样装置，该光产生元件可以触发光敏蛋白的表达。
在一种实施方式中，示例性相机系统包括至少三种主要组件：1)小的眼镜内置相机，2)图像处理部件，和3)包括LED和/或激光系统的光递送系统。所述相机可以为单镜头相机或为双相机系统，双相机系统有可能提供双目成像和深度信息。所述相机可以捕获可见光或红外光。所述相机可以适应各种照明条件或可以被固定。所述图像处理部件(IPU)可以提供任何数量的信号转化，包括放大、增加或降低对比度、从运动恢复结构、边缘增强或时间滤波(即整合)。此外，可以利用显著性算法以便仅增强视野内的某些物体(例如移动的汽车、门口)，而滤出较不重要的物体(例如云)。所述LED和/或激光照明阵列系统可以包括高密度LED阵列或扫描激光系统，所述扫描激光系统由一个(1)或更多个激光器组成。光的位置可以是固定的，也可以移动。例如，使用眼移动跟踪装置作为输入，光相对于眼部的定位可以随着眼移动而移动。这图示于图13中。
在其他相关的示例性实施方式中，图像增强装置，如Telesensory(http://www.telesensory.com)所提供的图像增强装置，可以与如Microvision(http://www.microvision.com/milprod.html)所开发的视网膜扫描装置(RSD)结合，以提供能够将明亮的、增强的图像直接递送至具有受损视力的患者的视网膜的头戴设备。简而言之，RSD投射图像至视网膜上使得个体无需额外屏幕或显示器就能看到大的全运动图像。因此，通过在具有受损视力的个体视网膜上直接投射增强图像，可能会改善被认为是失明或接近失明的个体的视力。
虽然本文示出和描述了本发明的一些实施方式，对于本领域技术人员来说显而易见的是这些实施方式仅以实例的方式提供。在不背离本发明的前提下，对于本领域技术人员来说现在将出现许多变体、变化和取代。应当理解的是，在实施本发明时可以利用本文所描述的本发明的实施方式的各种替代物。
实施例
实施例1：注射方法
根据视觉与眼科研究协会(Association of Research in Vision and Ophthalmology)的视觉与眼科研究动物应用声明和佛罗里达大学(University of Florida)动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care和Use Committee)的指导原则，操作关于动物的所有程序。
对于玻璃体内注射，将小鼠用氯胺酮(ketamine，72mg/kg)/甲苯噻嗪(xylazine，4mg/kg)通过腹膜内注射麻醉。麻醉之后，使用配有33号针规的平端针的Hamilton注射器。针穿过巩膜，在赤道处临近角膜缘进入玻璃体腔。注射在直接观察到所述针在玻璃体腔中部时进行。递送的总体积为1.5μl，包含所测试AAV载体的不同浓度。
对于视网膜下注射，在麻醉之前1小时，用1％阿托品(atropine)滴眼剂扩大小鼠的眼睛，接着局部给予2.5％苯肾上腺素。然后将小鼠用氯胺酮(72mg/kg)/甲苯噻嗪(4mg/kg)通过腹膜内注射麻醉。用30 1/2号针规的一次性针穿过角膜在瞳孔内形成小孔，并且通过角膜孔将在Hamilton注射器中的33号针规的平端钝针引入至视网膜下空间并递送1.5μl的AAV。
AAV载体的一般滴度为1.3×1012至3.0×1013。
实施例2：筛选用于转导视网膜双极细胞的AAV血清型1、2、5、7、8和9
本实施例进行了用于视网膜双极细胞最佳转导的已知和被表征了的病毒载体的筛选。将携带绿色荧光蛋白(GFP)的AAV血清型1、2、5、7、8和9分别视网膜下注射4周大的rd1小鼠。Rd1纯合子小鼠携带rd1突变，并且在这些小鼠中视杆细胞光感受器退化开始于出生后(P)10日左右，且到P21日差不多完成。在强的非细胞类型特异性启动子CBA(CMV即时早期增强子与牛β-肌动蛋白启动子加上内含子1-外显子1衔接点的融合)的控制下放置GFP。1个月之后，测试小鼠的GFP表达。用AAV7注射的小鼠的PKCα抗体双重标记显示转导的细胞最可能是残留(无外段)的光感受器，而不是双极细胞。然后在8周大的小鼠中进行AAV7视网膜下注射，此时有残留的光感受器的机会较少。结果发现AAV7在转导视网膜双极细胞时非常有效，导致在单次注射后GFP表达于至少75％的全部双极细胞中(图9)。这些图像是在注射之后16周获得的，其额外地显示使用AAV7递送机制的GFP表达稳定至少4个月。AAV7是可以用于以有效和稳定的方式转导双极细胞的血清型。
实施例3：用血清型AAV5、AAV2 Y444F突变体和AAV8 Y733F突变体转导视 网膜双极细胞
如图10所示，将小鼠用1.5μl不同血清型的腺相关病毒(AAV)进行视网膜下(右眼)和玻璃体内(左眼)注射。所测试的血清型包括AAV2、AAV5和AAV8，全部都是传统野生型血清型。此外，还注射了单个酪氨酸至苯丙氨酸突变的血清型AAV2 Y444F突变体和AAV8 Y733F突变体，其中444和733分别指示病毒衣壳酪氨酸点突变的位点。病毒包含自身互补型DNA构建体GRM6-ChR2-GFP，其中GRM6为驱动在ON双极细胞(包括视杆双极)中的细胞特异性表达的代谢型谷氨酸受体6调控序列，ChR2为治疗性光敏蛋白基因，并且GFP为报告基因。
图10中的图像显示GFP(报告基因)的总体表达。这种表达在黑白图像中显示为白色。这指示了ChR2的总体表达，因为ChR2-GFP复合体为融合蛋白。注意在所述INL中GFP表达的小环，显示ChR2-GFP蛋白复合体的表达是膜结合的。这些数据显示具有腺相关病毒构建体的递送导致ChR2-GFP在全部3只失明小鼠模型(rd1、rd16和rho-/-)中的强烈表达。这是使用视网膜下注射3种不同的血清型进行的(第1列)。当使用酪氨酸至苯丙氨酸突变体血清型时，使用视网膜下或玻璃体内注射，可能得到在双极细胞(INL)中的良好表达。然而，野生型血清型需要视网膜下注射来得到双极细胞的合理转导；使用野生型血清型的玻璃体内注射不能有效地转导双极细胞(第2列)。
实施例4：形成AAV7-GRM6-ChR2以在视网膜On-双极细胞中建立光敏性
mGluR6为G-蛋白偶联的代谢型谷氨酸受体，即在视网膜中特异性表达于ON双极细胞中(Tian 2006)。构建所述腺相关病毒血清型7(AAV7)，mGluR6调控序列片段基因序列(在图6中示出)GRM6和视紫红质通道蛋白-2(ChR2)来形成AAV7-GRM6-ChR2构建体。编码ChR2和eGFP的cDNA被克隆至mGluR6调控序列片段-SV40最小启动子的下游(即3′)。未使用IRES；将ChR2和GFP融合。一旦使用病毒递送机制递送这种病毒载体构建体并表达，就能在视网膜ON双极细胞中建立具有高时空分辨率的光敏性。这种方法使用ChR2类光激活分子来直接使剩下的视网膜神经元对光敏感，从而可恢复视网膜对光学信息的响应。
实施例5：AAV8突变体Y733F-GRM6-ChR2和AAV8突变体Y446F-CBA-ChR2 在视网膜ON-双极细胞中建立光敏性
使用AAV8(在733位点)的酪氨酸突变型，在双极细胞特异性启动子GRM6控制下，以自身互补型结构，可在rd1小鼠中恢复视觉行为效力，如图11和12所示。图11图示在用酪氨酸突变体AAV载体视网膜下注射之后1个月，通过免疫组织化学分析冷冻视网膜切片中EGFP的表达。示例性切片图示了用血清型2Y444(a)或血清型8 Y733(b)转导之后，EGFP荧光在视网膜中的分布和强度。图像被定向，使得玻璃体面向底部，而光感受器层面向顶部。来自用血清型2Y444视网膜下注射小鼠眼部的光感受器、RPE细胞和神经节细胞中的EGFP荧光。(c)在血清型8 Y733递送之后，在光感受器、RPE细胞和米勒细胞中的EGFP荧光。(d)通过使用谷氨酰胺合成酶(GS)抗体的免疫染色米勒细胞突起(红色)的检测。(e)合并图像显示来自用血清型8 Y733治疗的眼部视网膜切片中EGFP荧光(绿色)和GS染色(红色)的共定位；(f)校准线100μM。gcl，视网膜节细胞层；ipl，视网膜内网层；inl，内核层；onl，外核层；os，外段；rpe，视网膜色素上皮。
使用AAV8(在446位点)的酪氨酸突变型，在非细胞特异性启动子CBA(CMV即时早期增强子与牛β-肌动蛋白启动子加上内含子1-外显子1衔接点的融合，和ChR2)控制下，以自身互补型结构，可以靶向大部分或全部双极细胞，并且恢复视觉功能，如图12所示。
实施例6：AAV5-CBA-ChR2在视网膜On双极细胞中建立光敏性
使用AAV5、非细胞类型特异性启动子CBA(CMV即时早期增强子与牛β-肌动蛋白启动子加上内含子1-外显子1衔接点的融合)和ChR2，以自身互补型结构，可以靶向全部双极细胞，并且恢复视觉功能和行为(图12)。将治疗的小鼠用1.5μl不同血清型的腺相关病毒(AAV)进行视网膜下(右眼)和玻璃体内(左眼)注射。所测试的血清型包括AAV2、AAV5和AAV7，全部都是传统野生型血清型。此外，还注射了所述单个酪氨酸至苯丙氨酸的突变血清型AAV2Y444F突变体和AAV8 Y733F突变体，其中444和733分别指示病毒衣壳的酪氨酸点突变的位点。病毒包含自身互补型DNA构建体GRM6-ChR2-GFP，其中GRM6为驱动在ON双极细胞(包括视杆双极细胞)中的细胞特异性表达的调控序列，ChR2为治疗性光敏蛋白基因，并且GFP为报告基因。
然后对这些小鼠进行水迷宫任务(图12A)训练14日，对于野生型小鼠是7日，并且记录发现目标(具有4×6LED光源的黑色平台)的时间。图12B示出经治疗的、未治疗的和野生型小鼠发现目标所花费的平均时间随训练时间的变化。未治疗和治疗组都包括来自rd1、rd16和rho-/-(不同失明小鼠模型，其具有导致光感受器疾病的不同类型的基因突变，)组的样本。这些数据证明用ChR2治疗的小鼠能够通过使用视觉信息学习行为任务，表明诸如ChR2的光敏蛋白具有恢复至少一些视觉功能的能力。
然后在不同光水平下评估动物在任务中的表现。图12C示出由rd1、rd16和rho-/-经治疗的、假手术注射(假手术注射小鼠代表未治疗的rd1、rd16和rho-/-的平均值)和野生型小鼠发现目标花费的平均时间随光强度的变化。这些数据显示治疗的小鼠可以在多种光水平下执行任务，并且它们的表现依赖于所呈现光的量。

Claims (83)

1.一种重组核酸，其包含可操作地连接至代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)调控序列或其片段的编码光敏蛋白的核酸。
2.权利要求1所述的核酸，其中所述光敏蛋白选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。
3.权利要求1所述的核酸，其中所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或者至少约95％相同的光敏蛋白。
4.权利要求1所述的核酸，其中所述mGluR6调控序列片段包含少于约1000个、少于约750个、少于约500个、少于约250个或者少于约100个碱基对。
5.权利要求1所述的核酸，其中所述mGluR6调控序列或者其片段为mGluR6启动子或者增强子。
6.权利要求1所述的核酸，所述核酸还包含绿色荧光蛋白。
7.权利要求1所述的核酸，其中所述核酸被包裹于重组腺相关病毒(AAV)的衣壳中。
8.权利要求7所述的核酸，其中所述重组腺相关病毒的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。
9.权利要求7所述的核酸，其中所述重组腺相关病毒的血清型选自：AAV2、AAV5、AAV7、AAV8以及它们的杂合体。
10.权利要求1所述的核酸，其中所述核酸被包裹于选自下列重组病毒的衣壳中：重组腺相关病毒(AAV)、重组逆转录病毒、重组慢病毒和重组痘病毒。
11.一种载体，其包含编码光敏蛋白的核酸，所述核酸可操作地连接至代谢型谷氨酸受体6(mGluR6)调控序列或其片段。
12.权利要求11所述的载体，其中所述光敏蛋白选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。
13.权利要求11所述的核酸，其中所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的光敏蛋白。
14.权利要求11所述的载体，其中所述mGluR6调控序列片段少于约1000个、少于约750个、少于约500个、少于约250个或者少于约100个碱基对。
15.权利要求11所述的载体，其中所述mGluR6调控序列片段为图6中所示的序列。
16.权利要求11所述的载体，其中所述载体包含重组腺相关病毒(AAV)。
17.权利要求11所述的载体，其中所述载体包含选自以下的重组病毒：重组腺相关病毒(AAV)、重组逆转录病毒、重组慢病毒和重组痘病毒。
18.权利要求16所述的载体，其中所述AAV为的血清型选自：AVV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。
19.权利要求18所述的载体，其中所述AAV包含突变的衣壳蛋白。
20.权利要求19所述的载体，其中所述衣壳蛋白包含突变的酪氨酸残基。
21.权利要求20所述的载体，其中所述突变的酪氨酸残基选自：Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。
22.权利要求20所述的载体，其中所述突变的衣壳蛋白包含酪氨酸残基突变成苯丙氨酸。
23.一种治疗患有眼部疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括向感染的眼部引入重组腺相关病毒(AAV)，所述重组腺相关病毒(AAV)包含可操作地连接至代谢型谷氨酸受体6调控序列(mGluR6调控序列)或其片段的光敏蛋白。
24.权利要求23所述的方法，其中所述眼部疾病或障碍由光感受器细胞退化引起。
25.权利要求23所述的方法，其中所述光敏蛋白选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。
26.权利要求23所述的方法，其中所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的光敏蛋白。
27.权利要求23所述的方法，其中所述mGluR6调控序列片段少于约1000个、少于约750个、少于约500个、少于约250个或者少于约100个碱基对。
28.权利要求27所述的方法，其中所述mGluR6调控序列片段为图6中所示的序列。
29.权利要求23所述的方法，其中所述AAV的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。
30.权利要求29所述的方法，其中所述AAV包含突变的衣壳蛋白。
31.权利要求30所述的方法，其中所述衣壳蛋白包含突变的酪氨酸残基。
32.权利要求31所述的方法，其中所述突变的酪氨酸残基选自：Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。
33.权利要求31所述的载体，其中所述突变的衣壳蛋白包含酪氨酸残基突变成苯丙氨酸。
34.权利要求23所述的方法，其中所述AAV使用玻璃体内注射、视网膜下注射和/或ILM剥除引入。
35.权利要求23所述的方法，其中所述AAV被引入至视网膜双极细胞。
36.权利要求23所述的方法，其中所述方法还包括在眼部外部使用光发生装置。
37.一种在视网膜双极细胞中表达外源核酸的方法，所述方法包括向视网膜引入包含可操作地连接至视网膜双极细胞特异性调控序列的外源核酸的载体，其中所述方法导致至少约25-30％的转导效率。
38.权利要求36所述的方法，其中所述方法导致至少约40％、50％、60％、70％、80％、或者90％的转导效率。
39.权利要求36所述的方法，其中所述转导效率通过定量被感染的视网膜双极细胞的总数来测定。
40.权利要求36所述的方法，其中所述外源核酸包含光敏蛋白。
41.权利要求40所述的方法，其中所述光敏蛋白选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。
42.权利要求40所述的核酸，其中所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的光敏蛋白。
43.权利要求36所述的方法，其中所述调控序列包含代谢型谷氨酸受体6调控序列(mGluR6)或其片段。
44.权利要求43所述的方法，其中所述mGluR6调控序列片段少于约1000个、少于约750个、少于约500个、少于约250个或者少于约100个碱基对。
45.权利要求43所述的方法，其中所述mGluR6调控序列片段为图6中所示的序列。
46.权利要求36所述的方法，其中所述外源核酸使用重组腺相关病毒载体(AAV)引入。
47.权利要求46所述的方法，其中所述AAV包含突变的衣壳蛋白。
48.权利要求47所述的方法，其中所述衣壳蛋白包含突变的酪氨酸残基。
49.权利要求48所述的方法，其中所述突变的酪氨酸残基选自：Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。
50.权利要求48所述的载体，其中所述突变的衣壳蛋白包含酪氨酸残基突变成苯丙氨酸。
51.权利要求46所述的方法，其中所述外源核酸使用玻璃体内注射、视网膜下注射和/或ILM剥除引入。
52.权利要求46所述的方法，其中所述AAV的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。
53.一种引入外源核酸至视网膜细胞核的方法，所述方法包括将包含可操作地连接至视网膜细胞特异性调控序列的外源核酸的载体引入至视网膜细胞，其中所述载体专门设计用来避免泛素介导的蛋白质降解。
54.权利要求53所述的方法，其中所述降解是蛋白酶体介导的。
55.权利要求53所述的方法，其中所述外源核酸包含光敏蛋白。
56.权利要求55所述的方法，其中所述光敏蛋白选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体。
57.权利要求55所述的核酸，其中所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的光敏蛋白。
58.权利要求53所述的方法，其中所述视网膜细胞为视网膜双极细胞。
59.权利要求58所述的方法，其中所述调控序列包含代谢型谷氨酸受体6调控序列(mGluR6)或其片段。
60.权利要求59所述的方法，其中所述mGluR6片段少于1000个、少于750个、少于500个、少于250个或者少于100个碱基对。
61.权利要求59所述的方法，其中所述mGluR6调控序列片段为图6中所示的序列。
62.权利要求53所述的方法，其中所述载体选自：重组腺相关病毒(AAV)、重组逆转录病毒、重组慢病毒和重组痘病毒。
63.权利要求53所述的方法，其中所述载体为重组腺相关病毒载体(AAV)。
64.权利要求63所述的方法，其中所述AAV的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。
65.权利要求63所述的方法，其中所述AAV包含突变的衣壳蛋白。
66.权利要求65所述的方法，其中所述衣壳蛋白包含突变的酪氨酸残基。
67.权利要求66所述的方法，其中所述突变的酪氨酸残基选自：Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。
68.权利要求66所述的载体，其中所述突变的衣壳蛋白包含酪氨酸残基突变成苯丙氨酸。
69.权利要求53所述的方法，其中所述载体使用玻璃体内注射、视网膜下注射和/或ILM剥除引入。
70.一种转导视网膜双极细胞的方法，其包括向视网膜引入包含可操作地连接至调控序列的外源核酸的载体。
71.权利要求70所述的方法，其中所述调控序列为非细胞类型特异性启动子。
72.权利要求70所述的方法，其中所述调控序列为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α激活活性多肽O(GNAO1)启动子或者巨细胞病毒(CMV)即时早期增强子与牛β-肌动蛋白启动子加上内含子1-外显子1衔接点的融合(CBA、smCBA)。
73.权利要求70所述的方法，其中所述外源核酸包含光敏蛋白。
74.权利要求73所述的方法，其中所述光敏蛋白选自：ChR1、ChR2、VChR1、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChR1-ChR2杂合体/嵌合体、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑视蛋白以及它们的变体.
75.权利要求73所述的核酸，其中所述光敏蛋白为ChR2，或者为与ChR2至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％相同的光敏蛋白。
76.权利要求70所述的方法，其中所述载体选自：重组腺相关病毒(AAV)、重组逆转录病毒、重组慢病毒和重组痘病毒。
77.权利要求70所述的方法，其中所述载体为重组腺相关病毒载体(AAV)。
78.权利要求77所述的方法，其中所述AAV的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它们的杂合体。
79.权利要求77所述的方法，其中所述AAV包含突变的衣壳蛋白。
80.权利要求79所述的方法，其中所述衣壳蛋白包含突变的酪氨酸残基。
81.权利要求79所述的方法，其中所述突变的酪氨酸残基选自：Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。
82.权利要求80所述的载体，其中所述突变的衣壳蛋白包含酪氨酸残基突变成苯丙氨酸。
83.权利要求70所述的方法，其中所述载体使用玻璃体内注射、视网膜下注射和/或ILM剥除引入。
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