CN113862304A - 一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法，属于水产动物基因编辑技术领域。本发明在显微注射时采用半干露固定方法，不仅能够对皱纹盘鲍进行很好的固定，且极大的提高了注射效率；显微注射中采用最佳的sgRNA和Cas9终浓度，可使注射后的皱纹盘鲍幼虫存活率和编辑效率提高，为采用CRISPR/Cas9基因编辑方法进行皱纹盘鲍基因功能研究和遗传改良奠定基础。

Description

一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法
技术领域
本发明属于水产动物基因编辑技术领域，具体涉及一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法。
背景技术
鲍鱼是一种单壳、食草、栖息在珊瑚礁的海洋软体动物，分布在世界各地的沿海地区。由于其对珊瑚礁生态系统的影响，它被用于生态研究，也是被用于受精和发育生物学研究的模式动物。由于其营养丰富，鲍鱼成为了世界范围内重要的水产养殖经济贝类。皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)是东亚国家的主要养殖品种。然而目前全基因组选择育种及分子辅助选择育种等技术在鲍鱼遗传育种中还并未得到广泛应用，这其中主要限制因素是鲍鱼基因的功能尚不清楚。目前鲍鱼中开展的基因功能研究多为基因克隆和表达模式分析。
基因编辑技术是研究基因功能最直接有效的方法，在高等动物和模式动物中，基因编辑技术在基因功能研究中已得到广泛应用，从早期的TALENs、ZFNs基因编辑技术，到现在广泛应用的CRISPR/Cas9基因编辑技术。规律成簇的间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)广泛存在细菌和古生菌内的免疫系统。作为一种编辑工具，CRISPR系统能够定点修饰基因组，其结构分为cas基因、前导区序列、crRNA(包括重复序列和间隔序列)。
与TALENs、ZFNs基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术因具有操作简单、靶点选择广、成本低、效率高等优点，自诞生以来便受到了广大科研人员的关注并得到迅速发展。目前已成为生命科学、医学等研究领域中最受瞩目和最具前景的技术之一。2020年诺贝尔化学奖授予CRISPR/Cas9基因编辑技术，再次证实了该技术的巨大影响力。在基础研究层面，CRISPR/Cas9技术极大促进了模式物种尤其是非模式物种的基因功能研究。目前，CRISPR系统已被广泛应用于药物研制、疾病治疗、动物模型和生物遗传育种等方面，研究者利用CRISPR/Cas9技术已成功的在人类、小鼠、拟南芥、高粱、斑马鱼、线虫、果蝇、山羊、牛、猪、家蚕、牡蛎、脊尾白虾等多种动植物中实现基因编辑。
目前CRISPR/Cas9基因编辑主要借助显微注射技术、电转、病毒介导以及基因枪等技术对受精卵进行Cas9和sgRNA导入。目前利用显微注射进行CRISPR/Cas9基因编辑是最为常用的方法。
然而，目前海洋经济贝类基因编辑技术仍然发展较为缓慢，仅见于少数几个物种，且在仅有的几个物种中，编辑效率仍然较低。鲍鱼中，仅有TALEN基因编辑技术曾见报道，但其操作复杂，编辑效率较低。相较于TALEN基因编辑技术，CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、靶点选择广、成本低、效率高等优点，能够形成更加稳定的技术体系，使基因编辑技术更加广泛的应用于鲍鱼基因功能研究中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法，步骤如下：
(1)将目的基因sgRNA与Cas9蛋白混合，并室温孵育获得sgRNA与Cas9的复合物；向复合物中加入小分子染料混合均匀即得CRISPR/Cas9基因编辑的显微注射液；
(2)将皱纹盘鲍受精卵转移至糙面的固体海水琼脂平板上，吸去大量水分，使受精卵呈半干露状固定；
(3)采用内径为1-2μm的注射毛细管针吸取步骤(1)制备的显微注射液对步骤(2)固定的皱纹盘鲍的受精卵进行显微注射；
(4)注射后将受精卵置于无菌海水中培养。
上述皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法中，所述显微注射液中目的基因sgRNA终浓度为100-300ng/μL；所述Cas9蛋白的终浓度为200-600ng/μL。
上述皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法中，所述皱纹盘鲍受精卵的发育阶段为人工授精后1h-2h内的单细胞期。
上述皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法中，所述糙面的固体海水琼脂平板的制备方法为：
将加热后液态的琼脂含量为0.6％-1.2％的海水琼脂倒入培养皿中，在琼脂尚未完全凝固时，将糙面模具倒扣至琼脂表面，使海水琼脂固定后呈凹凸不平状；所述糙面模具为表面布满了划痕的塑料糙面平板；所述划痕长度为3-4mm，深度0.2mm，宽度约0.05mm；在一个具体的实施例中，所述海水琼脂中的琼脂含量优选的为0.7％。
一种皱纹盘鲍opsin基因的CRISPR/Cas9基因编辑方法，步骤如下：
(1)将opsin基因sgRNA与Cas9蛋白混合，并室温孵育获得sgRNA与Cas9的复合物；向复合物中加入小分子染料混合均匀即得CRISPR/Cas9基因编辑的显微注射液，其中，opsin基因sgRNA终浓度为100-300ng/μL；所述Cas9蛋白的终浓度为200-600ng/μL；
(2)将人工授精后1h-2h内单细胞期的皱纹盘鲍受精卵转移至糙面的固体海水琼脂平板上，吸去大量水分，使受精卵呈半干露状固定；
(3)采用内径为1-2μm的注射毛细管针吸取步骤(1)制备的显微注射液对步骤(2)固定的皱纹盘鲍的受精卵进行显微注射；
(4)注射后将受精卵置于无菌海水中培养；
所述糙面的固体海水琼脂平板的制备方法为：
将加热后液态的琼脂含量为0.6％-1.2％的海水琼脂倒入培养皿中，在琼脂尚未完全凝固时，将糙面模具倒扣至琼脂表面，使海水琼脂固定后呈凹凸不平状；所述糙面模具为表面布满了划痕的塑料糙面平板；所述划痕长度为3-4mm，深度0.2mm，宽度约0.05mm。
上述皱纹盘鲍opsin基因的CRISPR/Cas9基因编辑方法中，所述opsin基因sgRNA由以下方法制备而成：
针对CRISPR/Cas9基因编辑的靶位点设计sgRNA特异性引物，将sgRNA特异性引物与通用引物合成sgRNAs DNA模板，将合成的sgRNAs DNA模板体外转录后获得opsin基因的sgRNA。
在一个具体的实施例中，所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶位点为SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4所示核酸序列中的至少一个。
在一个具体的实施例中，针对SEQ ID NO:2所示靶位点设计的sgRNA特异性引物序列如SEQ ID NO:5所示；针对SEQ ID NO:3所示靶位点设计的sgRNA特异性引物序列如SEQID NO:6所示；针对SEQ ID NO:4所示靶位点设计的sgRNA特异性引物序列如SEQ ID NO:7所示。
在一个具体的实施例中，所述通用引物序列如SEQ ID NO:8所示。
在一个具体的实施例中，所述显微注射液中opsin基因sgRNA终浓度为200ng/μL；所述Cas9蛋白的终浓度为250ng/μL；所述显微注射的体积为每个受精卵0.1nL。
在一个具体的实施例中，所述sgRNA与Cas9的复合物与小分子染料的混合为等体积混合；所述小分子染料为0.07％酚红溶液。
本发明技术方案的优点：
目前尚无CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于皱纹盘鲍的报道，本发明用显微注射方法成功地将sgRNA和Cas9蛋白导入至皱纹盘鲍受精卵中，最终获得了皱纹盘鲍基因突变。
首次建立了皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑技术，为今后进一步开展皱纹盘鲍基因功能研究和遗传改良提供了强有力的技术基础。本发明能够实现皱纹盘鲍靶基因的精准编辑，而且，本发明在显微注射时采用半干露固定方法，不仅能够对皱纹盘鲍进行很好的固定，且极大的提高了注射效率；显微注射中采用最佳的sgRNA和Cas9终浓度，可使注射后的皱纹盘鲍幼虫存活率和编辑效率提高，为采用CRISPR/Cas9基因编辑方法进行皱纹盘鲍基因功能研究和遗传改良奠定基础。
附图说明
图1塑料糙面平板(右)和制备好的表面凹凸不平的0.7％固体海水琼脂(左)；
图2基因编辑后目的基因序列缺失情况；
图3突变1突变后峰图；
图4突变2突变后峰图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
以皱纹盘鲍opsin基因为例，建立了皱纹盘鲍基因编辑技术，具体步骤如下：
(1)皱纹盘鲍受精卵的获得
挑选性腺发育成熟的皱纹盘鲍亲本，亲本来源于山东省蓬莱市某鲍鱼养殖场，进行人工催产。
①准备24℃，1000-1500D°UV海水(海水UV量根据雌鲍状态调整，其中，雌鲍性腺较为饱满时可用UV剂量较小的1000D°UV海水，雌鲍性腺状态略差时可用UV剂量较大的1500D°UV海水)；
UV照射剂量＝紫外灯管功率(毫瓦)×照射时间(h)÷照射海水量(L)
②将雌鲍从20℃海水中取出，避光干露40min，置于24℃UV海水中避光刺激排卵，第1h释放少量卵，弃之不用，再次加入24℃UV海水中避光刺激，如不产卵，每1h更换一次UV海水；
③雌鲍处理1h之后，开始处理雄鲍，将雄鲍从20℃海水中取出，避光干露40min，置于24℃UV海水中避光刺激排精，通常性腺较好的雄鲍会较快释放精子；
④用300目筛绢收集卵，用18℃-20℃无菌过滤海水(FSW)多次冲洗，尽量将卵子冲洗干净，用烧杯取少量精子，将其置于冰上备用。
(2)人工授精
为了尽量延长注射窗口期，调试好注射系统后开始受精，精子少量多次加入，显微镜视野中量精卵比例调整为约20:1较为合适；人工授精后1h-2h内(单细胞期)可以进行显微注射，需将精子和卵子分批进行人工授精。
(3)构建皱纹盘鲍opsin基因的sgRNA
①设计sgRNA引物
皱纹盘鲍opsin基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示：
SEQ ID NO:1：
Figure BDA0003253802850000051
该基因含有6个外显子，在第5个外显子设计sgRNA位点，靶位点分别为：
5’-GGCAGTTTCCAACCACAGCA-3’(SEQ ID NO:2)；
5’-GGTTGCCGAACTGTGCGATC-3’(SEQ ID NO:3)；
5’-GGCAACAGCACATCATCCAA-3’(SEQ ID NO:4)；
针对上述靶位点设计sgRNA引物序列为，
Hd_opsin_sgRNA1：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGTTTCCAACCACAGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID NO:5)，
Hd_opsin_sgRNA2：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGTTG CCGAACTGTGCGATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID NO:6)，
Hd_opsin_sgRNA3：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAACAGCACATCATCCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID NO:7)。
②sgRNAs DNA模板扩增与纯化
使用特异性引物sgRNAs与通用引物合成sgRNAs DNA模板，其中通用引物的序列为：
CRISPR_REV_universal：5’-AAAAGCAC CGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’(SEQ ID NO:8)；
反应体系为32μL ddH2O,40μL 2×PrimeSTAR Max DNA(TAKALA)，4μL 10μMFprimer,4μL10μM R primer；
PCR反应条件为：95℃30s；35个循环包含95℃15s，60℃15s，72℃15s；72℃5min。使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海上工)纯化sgRNAs DNA模板。
③sgRNA体外转录
以纯化后的PCR产物为模板，使用T7体外转录试剂盒(Thermo，AM1334)转录sgRNA，使用RNA纯化试剂盒纯化sgRNA(RNAClean&Concentrator-5，ZYMO)，纯化后的sgRNA1浓度为2500ng/μL，sgRNA2浓度为3800ng/μL，sgRNA3浓度为3200ng/μL。
(4)制作固定模具
制作固体海水琼脂模具时，将加热后液态0.7％的海水琼脂倒入直径60mm的一次性塑料培养皿中，在琼脂尚未完全凝固时，将塑料糙面平板倒扣至琼脂表面，使海水琼脂固定后呈凹凸不平状。显微注射固定受精卵使用时，将少量受精卵转移至该0.7％固体海水琼脂糙面上，小心吸去大量水分，可以使受精卵呈半干露状固定。
其中所述塑料糙面平板直径35mm，其表面布满了划痕，划痕长度为3-4mm，深度约0.2mm，宽度约为0.05mm；塑料糙面平板和制备好的表面凹凸不平的0.7％固体海水琼脂如图1所示。
分别采用0.6％、0.7％、0.8％、1％和1.2％的固体海水琼脂制备固定模具，其中，0.7％的海水琼脂固定受精卵效果最佳；0.8％次之；而0.6％海水琼脂过软，不能有效固定受精卵；1％和1.2％的海水琼脂较硬，也不能有效固定受精卵，因此0.7％的海水琼脂最适宜制作固定模具。
(5)显微注射
将目的基因sgRNA与Cas9蛋白混合，并室温(25℃)孵育5min，将混合物与0.07％酚红溶液等体积混匀；其中3条sgRNA终浓度均为200ng/μL，Cas9蛋白终浓度250ng/μL。
将皱纹盘鲍受精卵转移至步骤(4)制备的0.7％的固体海水琼脂培养基，吸去其中大部分海水，固定受精卵，再使用内径为1.5μm的注射毛细管针进行注射，每个受精卵注射sgRNA与Cas9混合物的体积为0.1nL。
分别采用不同终浓度的sgRNA和Cas9显微注射皱纹盘鲍的受精卵，并检测皱纹盘鲍幼虫存活率和编辑效率，其中sgRNA和Cas9的终浓度分别为：
浓度1：Cas9：200ng/μL，sgRNAs：100ng/μL；
浓度2：Cas9：600ng/μL，sgRNAs：300ng/μL；
浓度3：Cas9：250ng/μL，sgRNAs：200ng/μL；
结果发现，当浓度3：目的基因sgRNA终浓度200ng/μL，Cas9蛋白终浓度250ng/μL时，皱纹盘鲍幼虫存活率和编辑效率最高；注射浓度3的幼虫存活率分别比浓度1和浓度2提高2倍和3倍，注射浓度3的编辑效率分别比浓度1和浓度2提高2倍和5倍。因此，浓度3可以作为皱纹盘鲍受精卵显微注射的最佳浓度。
(6)受精卵孵育与收集
将注射后的受精卵置于20℃的无菌海水中培养，孵化8h、16h后，分别收集皱纹盘鲍胚胎或幼虫，其中，8h对应鲍鱼胚胎发育过程，16h为孵化后的幼虫阶段。
(7)突变基因型检测
使用试剂盒(RoomTempTM Sample Lysis Kit，诺唯赞)，每3-5个胚胎或幼虫混合提取DNA。设计检测引物：
testF1 5’-TGCGTGCCAGTCCTCATCATTCT-3’(SEQ ID NO:9)；
testR1 5’-GGAAGCACCAACAGCAACGCCTA-3’(SEQ ID NO:10)；
扩增包含目的位点的基因组片段。挑选可能被编辑的条带，连接转化后挑取单克隆送至测序公司测序。
如图2所示，检测到662bp和681bp的缺失突变；其中突变1突变后峰图如图3所示，突变2突变后峰图如图4所示。
上述结果表明，利用本发明提供的皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑方法介导的目的基因产生突变，本发明能够实现皱纹盘鲍目的基因的精准编辑，而且，本发明在显微注射时采用半干露固定方法，不仅能够对皱纹盘鲍受精卵进行很好的固定，且极大的提高了对受精卵的注射效率，能够在5min完成100个受精卵的显微注射编辑操作；显微注射中采用最佳的sgRNA和Cas9终浓度，可使注射后的皱纹盘鲍幼虫存活率和编辑效率提高，为采用CRISPR/Cas9基因编辑方法进行皱纹盘鲍基因功能研究和遗传改良奠定基础。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1731
<212> DNA
<213> 皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)
<400> 1
atgaacgtta caaggttttt atctcatgga gcagtttctc ttaatgttct acatccccgt 60
cttggtgtag atggtaacaa tcaccccctg agtcttgtga taaaggtcgc cagttcgagc 120
cgctggttca gcgctggttc aagagtatgt gagatacatc gtatgtacca cgcttcacat 180
cggaaggaga gcatcatggc tgcgatgaca actgaagtca cggcggtgga gggaacgaca 240
agtttccatg acaacgtaac ccacttgtac gattcgtggg aggatatatt catccaccct 300
cactggaaga gcttcccccc aatccctgat gtgtggcact acaccatcgg cgtctacatc 360
accgctgtcg gcatcaccgg cgtcatcggt aacctcattg tcatctacat cttcagcaag 420
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ttccagacat cctgcacttt cgactacctc actaggaacg accacttcac ctcctacttc 840
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cccaagttcc ggaatgcgct gaacaagctg ttcccttgga tgatgtgctg ttgccaaccg 1260
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agcgactctg cgatcgaaat gagccagcgt ggaaacagca aaagaatcag ggaccgcgac 1440
atccaggaga ccgtcctagc aggccaggag gcgaatggcg ccctcatccg tgacatcctt 1500
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gtcgacgtca gcaacgaagc ccctgcagac agcgagaaca aaaccgcagt aaccattgac 1680
acaaaagctg aagtgacggg tcacgacaac caaacattcg agaaagagtg a 1731
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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Claims (10)

1.一种皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将目的基因sgRNA与Cas9蛋白混合，并室温孵育获得sgRNA与Cas9的复合物；向复合物中加入小分子染料混合均匀即得CRISPR/Cas9基因编辑的显微注射液；
(2)将皱纹盘鲍受精卵转移至糙面的固体海水琼脂平板上，吸去大量水分，使受精卵呈半干露状固定；
(3)采用内径为1-2μm的注射毛细管针吸取步骤(1)制备的显微注射液对步骤(2)固定的皱纹盘鲍的受精卵进行显微注射；
(4)注射后将受精卵置于无菌海水中培养。
2.根据权利要求1所述皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法，其特征在于，所述显微注射液中目的基因sgRNA终浓度为100-300ng/μL；所述Cas9蛋白的终浓度为200-600ng/μL。
3.根据权利要求1所述皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法，其特征在于，所述皱纹盘鲍受精卵的发育阶段为人工授精后1h-2h内的单细胞期。
4.根据权利要求1所述皱纹盘鲍CRISPR/Cas9基因编辑的方法，其特征在于，所述糙面的固体海水琼脂平板的制备方法为：
将加热后液态的琼脂含量为0.6％-1.2％的海水琼脂倒入培养皿中，在琼脂尚未完全凝固时，将糙面模具倒扣至琼脂表面，使海水琼脂固定后呈凹凸不平状；所述糙面模具为表面布满了划痕的塑料糙面平板；所述划痕长度为3-4mm，深度0.2mm，宽度约0.05mm。
5.一种皱纹盘鲍opsin基因的CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将opsin基因sgRNA与Cas9蛋白混合，并室温孵育获得sgRNA与Cas9的复合物；向复合物中加入小分子染料混合均匀即得CRISPR/Cas9基因编辑的显微注射液，其中，opsin基因sgRNA终浓度为100-300ng/μL；所述Cas9蛋白的终浓度为200-600ng/μL；
(2)将人工授精后1h-2h内单细胞期的皱纹盘鲍受精卵转移至糙面的固体海水琼脂平板上，吸去大量水分，使受精卵呈半干露状固定；
(3)采用内径为1-2μm的注射毛细管针吸取步骤(1)制备的显微注射液对步骤(2)固定的皱纹盘鲍的受精卵进行显微注射；
(4)注射后将受精卵置于无菌海水中培养；
所述糙面的固体海水琼脂平板的制备方法为：
将加热后液态的琼脂含量为0.6％-1.2％的海水琼脂倒入培养皿中，在琼脂尚未完全凝固时，将糙面模具倒扣至琼脂表面，使海水琼脂固定后呈凹凸不平状；所述糙面模具为表面布满了划痕的塑料糙面平板；所述划痕长度为3-4mm，深度0.2mm，宽度约0.05mm。
6.根据权利要求5所述皱纹盘鲍opsin基因的CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述opsin基因sgRNA由以下方法制备而成：
针对CRISPR/Cas9基因编辑的靶位点设计sgRNA特异性引物，将sgRNA特异性引物与通用引物合成sgRNAs DNA模板，将合成的sgRNAs DNA模板体外转录后获得opsin基因的sgRNA。
7.根据权利要求6所述皱纹盘鲍opsin基因的CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑的靶位点为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示核酸序列中的至少一个。
8.根据权利要求7所述皱纹盘鲍opsin基因的CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于，
针对SEQ ID NO:2所示靶位点设计的sgRNA特异性引物序列如SEQ ID NO:5所示；
针对SEQ ID NO:3所示靶位点设计的sgRNA特异性引物序列如SEQ ID NO:6所示；
针对SEQ ID NO:4所示靶位点设计的sgRNA特异性引物序列如SEQ ID NO:7所示。
9.根据权利要求6所述皱纹盘鲍opsin基因的CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述通用引物序列如SEQ ID NO:8所示。
10.根据权利要求5-9任一项所述皱纹盘鲍opsin基因的CRISPR/Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述显微注射液中opsin基因sgRNA终浓度为200ng/μL；所述Cas9蛋白的终浓度为250ng/μL；所述显微注射的体积为每个受精卵0.1nL。
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