CN109897867B - 基因改造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种基因改造方法。该方法包括：对模式动物体内的未成熟卵母细胞原位显微注射基因改造试剂。利用根据本发明实施例的基因改造方法，将显微注射的时间提前到卵子还未成熟的时期，并且采用在母体内直接注射的办法，注射后的卵母细胞在母体内自然成熟后，被排出并受精，能在F0代得到几乎所有细胞基因组都被编辑的突变体，在注射的当代胚胎里就能看到和纯合突变体一致的表型，以及稳定表达的转基因图谱，相比现有技术，突变体获得时间缩短为2‑3个月，并且无需进行大规模的筛选工作。

Description

基因改造方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及基因改造方法。

背景技术

以斑马鱼(Danio rerio)为例，斑马鱼是典型的发育生物学模式生物之一，其卵子在体外进行受精和早期胚胎发育。雌鱼排出未受精的成熟卵子，同时雄鱼排出精子，两者在体外完成受精过程。并且斑马鱼早期胚胎是透明的，便于观察和实验操作。现有胚胎显微注射技术是对在体外成功受精的受精卵进行的显微注射。它是将受精后还未进行有丝分裂的胚胎置于由琼脂凝固而成的带孔注射盘内，用玻璃毛细吸管加热拉制而成的玻璃针在显微镜下进行的注射。注射针固定在持针器上，操作简单方便。注射的物质可以是mRNA，蛋白质，DNA，反义寡核苷酸(Morpholino)，以及其他小分子物质，可短时间内对大量胚胎进行注射(平均每30分钟注射200枚胚胎)。注射完成后，将胚胎从琼脂盘中冲洗下来，置于胚胎专用的培养水中，与28-30℃的培养箱中进行培养。

受精后，斑马鱼早期胚胎会进入快速卵裂期，时间间隔大概是：受精到第一次细胞分裂完成是45分钟；随后进行大约十次快速细胞分裂，每次间隔15分钟；然后胚胎的合子基因开始大量激活，胚胎逐步开始原肠运动(Kimmel et al.,1995)。现有显微注射技术受限于早期胚胎的快速分裂，注射操作必须在40分钟内完成，并且注射到胚胎里的试剂无法充分的发挥作用便被快速分裂的细胞稀释掉了；以至于单个细胞内的注射试剂含量快速下降，作用效率降低。在构建CRISPR/Cas9突变体的时候，由于注射到胚胎里的gRNA和Cas9mRNA或者蛋白质被快速分散到各个细胞中，无法保证所有细胞的基因组都被它们编辑，更无法保证生殖细胞内的基因组被编辑，所以通常只能得到F0代的生殖细胞嵌合体；然后需要花费大量的时间和精力进行筛选，最终需要6个月甚至一年的时间才能得到稳定的突变体品系(Chang et al.,2013；Hwang et al.,2013；Varshney et al.,2015)。对于转基因鱼的构建也是类似的情况，Tol2转座酶mRNA和质粒DNA也会在注射后因为胚胎细胞的快速分裂而被稀释，导致转基因插入只发生在部分细胞中，也需要大量的时间和精力进行筛选才能得到稳定的转基因品系(Hamlet et al.,2006；Kawakami,2007)。更重要的是，当需要同时敲除几个，甚至几十个功能冗余的基因时；或者得到多重转基因鱼时，胚胎显微注射技术需要花费巨大的时间和精力，有时甚至无法办到。

目前，在斑马鱼研究领域，某些母源基因敲除或者敲低是现有的胚胎显微注射无法办到的。在许多物种的早期胚胎发育过程，卵子需要积累大量的母源mRNA和蛋白质，这些物质对早期胚胎发育十分重要。但是当需要研究某些母源基因的功能时，需要敲低或者敲除这些基因，但是许多纯合子突变体是致死的或者不育的，无法得到母源合子突变体；在合子基因激活前的短时间内也无法被注射的Morpolino快速封闭；最终导致敲低某个母源表达的基因时，效率不高，有时甚至是无效的。

胚胎的显微注射技术在其他物种中也得到了广泛的应用。例如小鼠(Mice)和非洲爪蟾(Xenopus)，由于小鼠胚胎是体内发育，所以显微注射技术涉及到将供体雌鼠处死取卵或者胚胎，然后将注射后的卵子进行体外受精培养(胚胎则无需体外受精)，最后将存活的胚胎移植到受体雌鼠的子宫等待产出；此操作非常复杂，成功率低并且对技术要求极高。对于非洲爪蟾，卵子显微注射技术也是现将卵子从母体取出，注射然后放入母体继续发育，产出；而胚胎的显微注射也面临和斑马鱼胚胎显微注射一样的问题。上述所有现有技术均是将注射的卵母细胞或者受精卵从母体中取出进行体外培养和显微注射后，再体外受精或者移植到另一母体内继续发育。

然而，目前在模式动物中并没有成熟有效的卵母细胞母体原位的显微注射技术。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

本申请的发明人将注射的时间提前到卵子还未成熟的时期，并且采用在母体内直接注射的办法，发明人发现，卵母细胞母体原位显微注射后会激发一系列的应激反应，卵母细胞的成活率会显著下降。本申请的发明人经过一系列的注射缓冲液的筛选与尝试，模式动物注射前的驯化以及注射后的恢复条件的摸索，成功克服了未成熟卵母细胞在体内被注射后激发的一些列应激反应，注射后的卵母细胞最终能够在母体内高效地自然存活下来并发育成熟排出受精。

本申请的发明人以斑马鱼为例，成功实现了卵母细胞的在体注射，卵母细胞从注射到成熟大约的40小时内，对于卵子内基因编辑(例如Cas9突变和转基因)非常的充分。本申请首次实现了未成熟卵母细胞的基因编辑，为母源基因功能研究提供了全新的技术手段。本申请的发明人能在F0代就得到几乎所有细胞基因组都被编辑的突变体或转基因鱼；所以发明人在注射的当代胚胎里就能看到和纯合突变体一致的表型，以及稳定表达的转基因图谱。对比现有技术，本申请的基因改造的方法将突变体和转基因鱼的获得时间缩短为2-3个月，并且无需进行大规模的筛选工作。

基于此，本发明提出了一种基因改造方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对模式动物体内的未成熟卵母细胞原位显微注射基因改造试剂。利用根据本发明实施例的基因改造方法，将原位显微注射的时间提前到卵子还未成熟的时期，并且采用在母体内直接注射的办法，注射后的卵母细胞在母体内自然成熟后，被排出并受精，能在F0代得到几乎所有细胞基因组都被编辑的突变体，在注射的当代胚胎里就能看到和纯合突变体一致的表型，以及稳定表达的转基因图谱，相比现有技术，突变体获得时间缩短为2-3个月，并且无需进行大规模的筛选工作。

根据本发明的实施例，上述基因改造方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述基因改造试剂包括选自gRNA、质粒、mRNA、蛋白质、染料和Morpholino的至少之一。上述小分子物质可更加便利地原位显微注射入卵母细胞内，基因组编辑效率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述模式动物是斑马鱼。斑马鱼早期胚胎是透明的，更加便于观察和实验操作，且斑马鱼卵母细胞从注射到成熟大约需要40小时，这个时间对于卵母细胞内基因编辑(例如Cas9突变和转基因)非常的充分，基因改造成功率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述斑马鱼的年龄是6个月～1年。年龄是6个月～1年的斑马鱼是刚性成熟不久的斑马鱼，斑马鱼的状态好，其未成熟卵母细胞进行显微注射后，卵子的成活率会进一步提高。

根据本发明的实施例，进行所述原位显微注射处理前，进一步包括：对所述年龄为6个月～1年的斑马鱼进行驯化处理；其中，所述驯化处理是通过如下方式进行的：(1)让所述雌性斑马鱼每周交配一次，以便卵母细胞成熟形成规律的周期；(2)卵母细胞成熟形成规律的周期后，让所述雌性斑马鱼休息两周，以便卵母细胞得到积累。由此，雌鱼及其卵母细胞处于一种良好状态，有利于显微注射操作以及后续的恢复和发育。

根据本发明的实施例，所述原位显微注射前2-3小时内对所述斑马鱼进行禁食处理。进而避免在对斑马鱼注射前麻醉的过程当中，斑马鱼发生死亡。

根据本发明的实施例，所述原位显微注射前，将所述斑马鱼进行麻醉处理，并置于湿润的海绵上，所述湿润的海绵是将海绵在含有5.4mM KCl，136.8mM NaCl，4.2mMNaHCO₃，0.44mM KH₂PO₄，0.25mM Na₂HPO₄以及0.5％质量体积比的BSA的溶液中浸润后获得的。发明人发现，将麻醉后的斑马鱼置于用上述缓冲液浸润的海绵上，可防止在显微操作过程中，卵子被激活，或者雌鱼过分干燥。

根据本发明的实施例，进行原位显微注射后，进一步包括：将所述斑马鱼进行恢复饲养处理和交配处理，所述恢复饲养处理是通过如下方式进行的：(1)将所述斑马鱼置于含有32μg/ml的麻醉剂以及10units/ml Penicillin和10μg/ml Streptomycin的水中进行单独饲养，以便于所述斑马鱼恢复意识；(2)将恢复意识的斑马鱼在温度为28℃的条件下饲养2～3小时；(3)将步骤(2)获得的斑马鱼置于含有16μg/ml的麻醉剂以及10units/mlPenicillin和10μg/ml Streptomycin的水中进行单独饲养过夜；(4)将步骤(3)获得的斑马鱼置于含有8μg/ml的麻醉剂以及10units/ml Penicillin和10μg/ml Streptomycin的水中进行单独饲养10～12小时，以便获得待交配斑马鱼。根据本发明的实施例，所述麻醉剂为三卡因(Triaine)。发明人发现，在上述麻醉剂的梯度用量下，斑马鱼处于一种比较镇定的状态并且斑马鱼的状态可以得到逐渐恢复，利于后续进行交配，交配后受精卵的成活率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述mRNA，DNA，染料和/或Morpholino预先稀释在缓冲溶液中，所述缓冲溶液含有5.4mM KCl，136.8mM NaCl，4.2mM NaHCO₃，0.44mMKH₂PO₄，0.25mMNa₂HPO₄以及100nM的褪黑素。发明人发现，上述缓冲溶液能够缓解注射操作对于卵的物理刺激，pH值的改变以及氧化作用；能有效的提高注射过的卵母细胞的存活率和质量。

根据本发明的实施例，所述未成熟卵母细胞为I期、II期或III期卵母细胞。

根据本发明的实施例，所述未成熟卵母细胞为I期或II期卵母细胞，进一步包括：斑马鱼完成交配后，将所述斑马鱼体内的未经过原位显微注射处理的III期卵母细胞经信号刺激后成熟并排出体外。以此刺激I和II期的卵子进一步成熟发育。

根据本发明的实施例，处于I和II期的卵母细胞利用原位显微注射不同mRNA，都可以得到正常表达的图谱，但是效率要稍低于处于III期的卵母细胞注射。

附图说明

图1是根据本发明实施例的时间流程图；

图2是根据本发明实施例的卵母细胞显微注射试剂体积示意图和具体技术的流程图及其实施的照片；

图3是根据本发明实施例的注射后雌鱼的恢复方法示意图；

图4是根据本发明实施例的注射所用的缓冲剂配方和效果比较，以及注射后一个月雌鱼产卵能力恢复情况；

图5是是根据本发明实施例的处于I或者II期卵子注射的时间流程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

以下实施例以斑马鱼为例，详细介绍了基因改造方法及其应用。

实施例1

对于显微注射所用的斑马鱼雌鱼以及其未成熟的卵的质量有较为严格的要求。在注射之前，需对雌鱼及其卵的质量进行一定的调控，具体办法如下：(1)选取状态较好的性成熟不久的雌鱼(斑马鱼性成熟一般需要3个月)，例如年龄在6个月到一年之间的鱼；(2)在性成熟后，有规律的让雌鱼每周交配一次，使雌鱼的卵母细胞成熟形成相对规律的周期；(3)在规律交配后，让雌鱼休息两周，使卵母细胞充分积累。最终，雌鱼及其卵母细胞就处于一种良好状态，有利于显微注射操作以及后续的恢复和发育(参见附图1)。

在注射当天，早上和中午的喂食正常进行，但是注射前三小时内不要给雌鱼喂食，以免在注射前麻醉的过程当中发生意外。注射一般在下午进行，操作前，将雌鱼麻醉(三卡因，tricaine；浓度为550μg/ml；注射体积是0.216nl)。，擦干身体上的水分后置于湿润的海绵上，海绵用含有5.4mM KCl，136.8mM NaCl，4.2mM NaHCO₃，0.44mM KH₂PO₄，0.25mMNa₂HPO₄，以及0.5％质量体积比的BSA浸润，以防止在操作过程中，卵母细胞被激活，或者雌鱼过分干燥。随后用手术剪打开一侧的腹部，将卵母细胞暴露出来，再用显微注射的玻璃针(该玻璃针是申请人将玻璃毛细吸管进行拉伸获得的，所用玻璃毛细管的型号为：Sutterinstrument，B100-58-10，所用拉针仪为：Sutter instrument，P-1000，拉针参数是heat＝686；pull＝108；velocity＝183；time＝131)和注射器进行单个卵母细胞的注射，注射液滴的直径约为1.875μm，体积约为0.216nl，液滴大小显著低于在受精卵显微注射中液滴大小(参考图2a)。一般情况下，一条雌鱼体内，发明人能注射30-50枚卵母细胞。然后用手术用缝合针，进行伤口缝合(参见附图2b)。缝合好后将雌鱼置于含有32μg/ml的麻醉剂以及10units/ml Penicillin，和10μg/ml Streptomycin的水中，单独饲养。待鱼慢慢恢复意识，开始游动后置于鱼房内(保证温度为28℃左右)。2-3小时后，将麻醉剂的浓度降低为16μg/ml过夜。第二天可以正常喂食，喂食后给鱼换水，将麻醉剂浓度进一步降低为8μg/ml，直到当天晚上配鱼前(参见附图3)。同时Penicillin和Streptomycin的浓度不变。发明人将雌鱼与普通野生型雄鱼进行交配，配鱼方法与通用办法无异(Kimmel et al.,1995)。第三天上午抽掉隔板，收集所产胚胎，进行后续培养和研究。

发明人利用这个技术注射过mRNA，DNA，染料和Morpholino等。由于未成熟卵母细胞体积相对于胚胎较小，并且调节能力较弱，所以注射物质必须稀释在特定的缓冲溶液中，缓冲溶液含有：5.4mM KCl，136.8mM NaCl，4.2mM NaHCO₃，0.44mM KH₂PO₄，0.25mM Na₂HPO₄，以及100nM的褪黑素。上述溶液能够缓解注射操作对于卵的物理刺激，pH值的改变以及氧化作用；能有效的提高注射过的卵母细胞存活率和质量(参见附图4)。产完卵的雌鱼，可以回到系统中饲养，无需给予额外的照顾；4周之后，这些雌鱼就能够再次交配产卵，并且产卵数目和质量与野生型的雌鱼并无明显差异(附图4)。

上述操作是针对于处于发育周期为III期的卵母细胞而言，利用上述显微注射技术还可以对处于I或者II期的卵母细胞进行显微注射；大致的操作流程是一样的，只是由于卵母细胞成熟所需的时间不一样，需要对上述步骤稍作调整。(1)雌鱼的准备流程是一样的，但是注射的时候，选择注射I或者II期的卵母细胞；(2)注射完的雌鱼仍旧在第二天晚上交配，第三天上午是将未注射的已存在的III期卵母细胞成熟并且排出，以刺激I和II期的卵母细胞进一步成熟发育；(3)在随后的2-3周里，在每周的同一时间将雌鱼与雄鱼交配，所产胚胎即是注射过的I和II期卵母细胞成熟发育所得(参见附图5)。

实施例2

首先，利用实施例1所描述基因改造方法，发明人注射ntla基因的CRISPR/Cas9系统所得胚胎的基因组95％以上被成功编辑；而利用现有技术所得结果，只有60％左右的基因组被编辑过。并且利用实施例1所描述基因改造方法获得的胚胎全都有典型的无尾部的表型，而原有的显微注射技术所得胚胎仅仅有部分胚胎得到类似表型，其余胚胎只得到尾部缩短或者几乎正常的表型。

其次，发明人利用实施例1所描述基因改造方法同时敲除20个基因组上的位点的实验结果也显示出比现有技术高得多的效率。

再次，发明人利用Tol2转基因系统在卵注射的技术平台构建转基因鱼，发现利用实施例1所描述基因改造方法同时注射三种转基因质粒，所得的胚胎三个基因的表达图谱均很完整，荧光强度高；显示出基因整合发生在绝大多数细胞中。并且将此胚胎饲养到性成熟之后发现，针对每个基因，它的后代50％都有完整的转基因表达图谱(由于卵母细胞注射只能编辑母源基因组，所以F0代有一半基因组来至于未被编辑的野生型父本；那么产生F1代胚胎时，只有一半的拷贝被编辑过)，并且出现约8％的后代能同时表达三个转基因，此数量足以将三重转基因品系稳定保留下去。而现有技术得到的胚胎只有很少的细胞有荧光，成功整合到生殖细胞中去的胚胎比例就更低了，甚至于无法实现。

可见，实施例1所描述基因改造方法对基因组的编辑能力明显优于现有受精卵显微注射技术。

最后，对于母源基因的敲低，现有技术注射dnmt1的Morpholino后发现，DNA甲基化水平并未发生明显变化，胚胎发育正常。但是利用实施例1所描述基因改造方法，胚胎DNA甲基化水平在早期就出现了明显下调，甚至在dome时期(受精后4.3小时)时，用免疫荧光几乎检测不到DNA甲基化信号。发明人利用高通量测序的办法检测全基因组DNA甲基化水平，发现在256-cell时期(受精后2.5小时)和dome时期，甲基化水平均降低为原有水平的20％左右。胚胎在此时期也出现了发育停滞，局部细胞凋亡等明显表型，随后几小时内便死亡。这个实验结果是首次在斑马鱼里得到了早期胚胎全基因组DNA甲基化水平明显下调的表型，此前有报道的是受精后84小时的胚胎。可见对于dnmt1这样的母源RNA积累量很高，发育早期翻译水平很高，并且合子纯合突变致死的基因，根据本发明实施例的基因改造方法有着无法取代的优势。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (4)

1.一种基因改造方法，其特征在于，包括：

对模式动物体内的未成熟卵母细胞原位显微注射基因改造试剂；

所述基因改造试剂包括选自gRNA、质粒、mRNA、蛋白质、染料和/或Morpholino的至少之一；

所述gRNA，质粒，mRNA，蛋白质、染料和/或Morpholino预先稀释在缓冲溶液中，所述缓冲溶液含有5.4mM KCl，136.8mM NaCl，4.2mM NaHCO₃，0.44mM KH₂PO₄，0.25mM Na₂HPO₄以及100nM的褪黑素；

所述模式动物是斑马鱼；

所述斑马鱼的年龄是6个月～1年；

进行所述原位显微注射处理前，对所述年龄为6个月～1年的斑马鱼进行驯化处理；

其中，所述驯化处理是通过如下方式进行的：

(1)让所述斑马鱼每周交配一次，以便卵母细胞成熟形成规律的周期；

(2)卵母细胞成熟形成规律的周期后，让所述斑马鱼休息两周，以便卵母细胞得到积累；

所述原位显微注射前，将所述斑马鱼进行麻醉处理，并置于湿润的海绵上，所述湿润的海绵是将海绵在含有5.4mM KCl，136.8mM NaCl，4.2mM NaHCO₃，0.44mM KH₂PO₄，0.25mMNa₂HPO₄以及0.5％质量体积比的BSA的溶液中浸润后获得的；

所述未成熟卵母细胞为I期、II期或III期的卵母细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原位显微注射前2-3小时内对所述斑马鱼进行禁食处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行原位显微注射后，将所述斑马鱼进行恢复饲养处理和交配处理，所述恢复饲养处理是通过如下方式进行的：

(1)将所述斑马鱼置于含有32μg/ml的麻醉剂以及10units/ml Penicillin和10μg/mlStreptomycin的水中进行单独饲养，以便于所述斑马鱼恢复意识；

(2)将恢复意识的斑马鱼在温度为28℃的条件下饲养2～3小时；

(3)将步骤(2)获得的斑马鱼置于含有16μg/ml的麻醉剂以及10units/ml Penicillin和10μg/ml Streptomycin的水中进行单独饲养过夜；

(4)将步骤(3)获得的斑马鱼置于含有8μg/ml的麻醉剂以及10units/ml Penicillin和10μg/ml Streptomycin的水中进行单独饲养10～12小时，以便获得待交配斑马鱼。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未成熟卵母细胞为I期或II期卵母细胞，注射完的斑马鱼完成交配后，将所述斑马鱼体内的未经过原位显微注射处理的III期卵母细胞经信号刺激后成熟并排出体外。

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