CN114214364B - 一种刺参基因编辑体系的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属水产遗传育种领域，具体地说是一种刺参基因编辑体系的构建方法。获取刺身精、卵，获取后将卵细胞固定排成单细胞列，并对其受精，经配置的含刺参目标基因sgRNA的混合液注入至上述排成单细胞列的受精后的刺参卵中，注射剂量为刺参胚胎体积的8‑12％，在23℃下孵育显微注射后的胚胎，进而可获得刺参基因编辑体系。采用本发明构建方法待发育到目标阶段后即可得到预期表型胚胎，成功率达90％以上。本发明的应用可显著提高育种效率，定点、精准改变刺参DNA序列，获得具有目标性状的刺参新品系，提升刺参产品品质和经济效益。

Description

一种刺参基因编辑体系的构建方法
技术领域
本发明属水产遗传育种领域，具体地说是一种刺参基因编辑体系的构建方法。
背景技术
基因编辑是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。在育种过程中，基因编辑技术可以实现品种中目标性状遗传位点的修饰与改变，从而加速品种改良。尽管基因编辑技术在动物育种中尚处于初始发展阶段，但在以基因组选择为核心的遗传育种中具有广阔前景，可实现目标物种目标性状的高效、精准改良。锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs)和成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR ClusteredRegularly Interspaced Short PalindromicRepeats/Cas9)是3种不同的基因编辑工具。CRISPR/Cas系统本质上是RNA引导的核酸酶。与ZFN、TALEN通过蛋白质-DNA相互作用识别靶序列的核酸酶不同，CRISPR/Cas核酸酶是通过RNA和DNA碱基配对来识别靶序列。CRISPR/Cas9提供了一种更低成本、高效且易于使用的基因编辑系统。与TALENS相比，CRISPR采用易于传递的小蛋白质，更快捷；与ZFN相比，CRISPR不需要成对的蛋白质即可靶向特定基因座，更方便。CRISPR/Cas除了具有一次性促进多重基因组修饰的能力外，与其他2种DNA核酸酶相比设计要容易很多。
与其他海水经济动物相比,刺参因性成熟年龄需3年以上,故新品种培育周期至少需12～13年以上,具有育种周期长、育种效率低的限制因素。此外,因体长、体重、疣足数量、疣足长度、体色等关键数量性状难以定量与定性的测定,造成了性状的基础数量遗传特性解析不明确。因此,以杂交育种、选择育种为代表的传统育种技术在时效性、可靠性等方面已不能满足当前刺参良种选育的技术要求。因此挖掘具有育种价值的分子标记，开展含有优良目标性状的刺参体色新品(种)系的优化设计选育，建立刺参基因编辑育种技术，实现刺参体色新品系精准育种体系，是刺参产业健康可持续发展的迫切需求。
随着CRISPR技术的完善与发展，基因编辑在水产动物中的应用也逐渐广泛。水产品是世界第三大动物蛋白来源，水产动物提供了一种经济且优质的动物蛋白。因此，基因编辑技术在水产动物中的应用，使得我们可以获得更多优质渔业资源，从而助力渔业健康可持续发展。目前，CRISPR/Cas9已被成功应用于斑马鱼、罗非鱼、大西洋鲑、鲤鱼、草鱼、舌鳎等鱼类，贝类中的大西洋舟螺、静水椎实螺、乌贼、长牡蛎也实现了成功应用。然而对于棘皮动物而言，目前CRISPR/Cas9只在海胆中成功进行了应用。刺参作为棘皮动物中重要代表性物种，其基因编辑体系尚未建立，刺参显微注射等研究亟待开展。
以目前基因编辑运用比较成熟的斑马鱼为例，其显微注射前期准备过程大体如下：注射的前一天，按照雌:雄为1:1或2:1的比例将成年斑马鱼放置于配种缸，用隔板分开。注射的早上，抽去隔板，雌雄鱼开始交配。一般在十多分钟左右亲鱼产卵并使卵受精。一般第一次抽板2缸鱼左右，随后根据实验进度适时给其它缸抽板。可在抽板前先将内缸连同亲鱼换到另一干净外缸中以节约清洁胚胎的时间。亲鱼产卵后，取180μm孔径的过滤网，收集外缸底部的鱼卵，并用养殖水清洗鱼卵2-3次。应尽量收集20min内的受精卵(即对于同一缸亲鱼，两次收集受精卵的时间间隔不得超过20分钟，以保证发育阶段的一致性)。受精卵分选和洗净后，用吸管将收集的卵置于平板培养皿中，清除平皿内的异物和胚胎周围的水，采用干法注射。
由于物种的特异性，斑马鱼等生物的精卵获取方式对于刺参而言并不适用，就连亲缘关系最近的海胆，其精卵获取方式是通过注射KCL来获得，对于刺参而言同样不适用。此外，斑马鱼等生物采用干法注射，刺参无法进行干法注射，会大批死亡。因此，建立试用于刺参的专用的基因编辑体系迫在眉睫。
发明内容
为实现构建刺参体色新品系精准育种体系，解决刺参遗传选育中的定点、精准技术难点，本发明目的在于提供一种刺参基因编辑体系的构建方法，从而获得具有目标优良性状的刺参新品系，为刺参产业健康发展提供支持。
为实现上述发明目的，本发明采用技术方案为：
一种刺参基因编辑体系的构建方法，精、卵获取、固定显微注射、目标基因gRNA设计、配置注射体系和显微注射，获取刺身精、卵，获取后将卵细胞固定排成单细胞列，并对其受精，经配置的含刺参目标基因sgRNA的显微注射混合液注入至上述排成单细胞列的受精后的刺参卵中，注射剂量为刺参胚胎体积的8-12％，在23℃下孵育显微注射后的胚胎，进而可获得刺参基因编辑体系。
所述获得刺参卵子固定于含硫酸鱼精蛋白溶液的培养皿中排成单细胞列，而后将精液打入培养皿中，使卵子完成受精；固定后受精的刺参卵在显微镜下注射含刺参目标基因sgRNA的显微注射混合液。
所述固定为在显微注射用的培养皿底部背面划线，并将培养皿内用0.1％-1％的硫酸鱼精蛋白溶液润洗，而后用口吸器将卵细胞整齐地排列在涂有硫酸鱼精蛋白的注射盘表面划线处。
所述润洗将0.1％-1％的硫酸鱼精蛋白溶液涂在培养皿上，沥干，然后立即用去离子水漂洗，或者晾干，用去离子水漂洗，待用。
所述刺参卵子的获得为利用神经肽NGIWY-NH2促熟刺参获得其卵细胞。
将NGIWY-NH2(10μM)注射入刺参体腔中，注射的量约为刺参的0.1％(v/w)，以刺参开始出现摇晃身体的现象起15-20分钟后排卵，收集刺身卵子。
所述含刺参目标基因sgRNA的混合液为每微升混合液中500ng Cas9蛋白、300ng目标基因的sgRNA、0.2μg 20％甘油、0.25μg FITC和0.2μgRNase-free水。
所述含刺参目标基因的sgRNA的显微注射混合液中Cas9蛋白与sgRNA浓度比例为30:1—1:1。
所述刺参与生长发育相关基因编辑的gRNA的获得：根据CRISPRscan(http:// www.crisprscan.org/？page＝sequence)设计gRNA序列，并根据CRISPRscan score选择分值高的gRNAs,配置显微注射混合液时，可以每条序列单独使用，也可以全部混合使用或者组合使用。
更进一步的刺参基因编辑体系的构建步骤为：
1)5月份开始于山东省烟台莱州海区收集获取刺参种参。刺参精子通过解剖获得，刺参卵子通过注释神经肽NGIWY-NH2促熟获得。将NGIWY-NH2(10μM)注射入刺参体腔中，注射的量约为刺参的0.1％(v/w)。注射完该多肽后，刺参开始出现摇晃身体的现象，约15分钟后排精排卵。
2)将显微注射用的培养皿用0.1％-1％％的硫酸鱼精蛋白溶液润洗，而后在培养皿底部背面从边缘处画1/3的线，在这条线后面划痕。将硫酸鱼精蛋白涂在培养皿上，沥干，然后立即用去离子水漂洗，或者晾干，用去离子水漂洗，然后储存在无尘容器中供以后使用。用口吸器将卵细胞整齐地排列在涂有硫酸鱼精蛋白的注射盘表面。将卵细胞排成一排极大地促进了快速和成功的微量注射，而后显微注射伊始，用移液枪将稀释后的1ul精液打入培养皿中，使其完成受精。
上述0.1％-1％的硫酸鱼精蛋白溶液的配置：将0.4-0.5g的鱼精蛋白硫酸盐加入40-400ml蒸馏水中，在50ml的无菌锥形管中配制0.1％-1％的硫酸鱼精蛋白溶液，直到鱼精蛋白硫酸盐完全溶解(>1小时)。如果在4℃下保存，该溶液至少可以使用3个月。一些硫酸鱼精蛋白在4℃储存后会沉淀，每次使用时，溶液应加热到室温，使硫酸鱼精蛋白完全溶解。
3)使用CRISPRscan(http://www.crisprscan.org/？page＝sequence)设计刺参基因编辑用gRNA。目标位点在5'端包含两个鸟嘌呤核苷酸，用于使用T7 RNA聚合酶初始转录gRNA，而3'端与Endo16 Module A中NGG基序(PAM)相邻。对于初步评估，首先考虑的是CRISPRscan score分值高的的gRNAs。CRISPRscan提供了带有T7序列和尾部序列的指南序列。订购CRISPRscan提供的选定gRNA序列和来自Eton的80个核苷酸的尾部引物序列，使用Phusion Master mix(Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer)通过PCR仪对gRNA和尾部引物进行退火和延伸。然后，通过QIAquick PCR纯化试剂盒纯化gRNA。使用MEGAshortscriptTM T7Transcription Kit进行体外转录，并通过酒精沉淀进行纯化。
4)配制含有Cas9蛋白、sgRNA、20％甘油、FITC和RNase-free水的显微注射混合物，最终体积为5ul。Cas9蛋白的浓度范围为250ng/ul～750ng/ul。sgRNA的浓度范围为100ng/ul～400ng/ul。在进行显微注射之前，将混合物放在冰上。
5)将溶液注入上述固定于培养皿中已受精的刺参卵中。注射溶液的直径约为胚胎的三分之一至四分之一(<胚胎体积的25％)。实验的对照应包括单独注射Cas9蛋白，不含sgRNA，以评价注射和表达外源性蛋白的效果。在23℃下孵育注射胚胎和对照胚胎。胚胎达到所需阶段后，对其进行基因组DNA的提取以进行基因分型，RNA的提取以进行基因表达水平评估，并进行成像。
6)如果sgRNA/Cas9注射胚胎中没有可检测到的表型，则增加sgRNA/Cas9的注射浓度。然而，高剂量的Cas9蛋白对刺参胚胎具有毒性。另一方面，如果注射胚胎表现出严重的非特异性表型，则注射浓度降低。Cas9蛋白数量与sgRNA的比例也可以调整(从30:1到1:1)。通过检验，刺参基因编辑效率可以达到90％以上。
步骤1)所述注射部位为刺参种参腹部。
步骤2)所述的显微注射用培养皿是用0.1％-1％浓度的硫酸鱼精蛋白润洗，鱼精蛋白硫酸盐会产生一种带正电荷的溶液，胚胎带负电荷的表面会附着在溶液上。用这种方式固定胚胎，有利于快速注射而不影响发育。本发明的优点与积极效果为：
1.本发明可以在繁殖季高效稳定获取刺参卵子，用于显微注射；使用硫酸鱼精蛋白润洗后的培养皿可以固定刺参卵细胞而不影响卵子受精与发育。
2.本发明摸索出的刺参基因编辑显微注射体系和注射方法，可避免刺参胚胎受到损伤，并且编辑效率达到90％以上。
3.本发明的应用可显著提高育种效率，定点、精准改变刺参DNA序列，获得具有目标性状的刺参新品系，提升刺参产品品质和经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例提供的卵细胞固定后用于显微注射示意图；
图2为本发明实施例提供的使用口吸器排列卵细胞示意图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
下述各实验用刺参种参取自山东省烟台莱州海区。
实施例1
本实施例基于CRISPR/Cas9技术，针对刺参胚胎骨骼关键基因ALX1进行刺参基因编辑体系构建：
1)设计刺参ALX1基因的gRNA序列并合成sgRNA：
使用CRISPRscan(http://www.crisprscan.org/？page＝sequence)设计刺参ALX1基因的gRNA序列。在CRISPRscan网站的“Submit sequence”界面输入刺参ALX1基因的DNA序列，选择“Sea urchin-Strongylocentrotus purpuratus”、“No mismatch”、“Cas9-NGG”、“In vitro T7 promoter”，而后点击“Get sgRNAs”按钮，即可获得gRNA序列列表。
目标位点在5'端包含两个鸟嘌呤核苷酸，用于使用T7 RNA聚合酶初始转录gRNA，而3'端与ALX1中NGG基序(PAM)相邻。根据CRISPRscan网站提供的CRISPRscan score(Moreno-Mateos et al.,2015)，以及将gRNA序列与刺参基因组进行blast比对，我们选择了CRISPRscan score得分较高且比对后相同序列较少的4条gRNA序列用于后续实验(参见表1)。订购CRISPRscan提供的目标gRNA序列和尾部引物序列(GTTTTAGAGCTAGAA)，使用Phusion Master mix(Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer)通过PCR仪对gRNA和尾部引物进行退火和延伸。然后，通过QIAquick PCR纯化试剂盒纯化gRNA。使用MEGAshortscriptTM T7 Transcription Kit进行体外转录，并通过酒精沉淀进行纯化得到sgRNA。
表1本实验中设计的刺参Alx1基因的gRNA序列
Figure BDA0003385707300000051
2)配置显微注射混合液：
配置Cas9蛋白(购自GenScript)、sgRNA、质量浓度20％甘油、FITC荧光染料(购自Molecular Probes)和RNase-free水的显微注射混合物，最终体积为5ul。配置前Cas9蛋白的浓度,2.5μg/ul，sgRNA的浓度为1.25μg/ul。在进行显微注射之前，将混合物放在4℃冰上保存。
实验1组的5ul显微注射混合物为1ul Cas9蛋白；1ul 20％甘油；1ul染料(FITC)；1.2ul sgRNA(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4各0.3ul)；0.8ul RNase-free水。最终实验1组的Cas9蛋白的注射浓度为500ng/ul，sgRNA的浓度为300ng/ul。
实验2组的5ul显微注射混合物为1.5ul Cas9蛋白；0.8ul 20％甘油；1ul染料(FITC)；1.5ul sgRNA(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4各0.375ul)；0.2ul RNase-free水。最终实验2组的Cas9蛋白的注射浓度为750ng/ul，sgRNA的浓度为375ng/ul。
实验3组的5ul显微注射混合物为0.5ul Cas9蛋白；1ul 20％甘油；1ul染料(FITC)；1.0ul sgRNA(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4各0.25ul)；1.5ul RNase-free水。最终实验3组的Cas9蛋白的注射浓度为250ng/ul，sgRNA的浓度为250ng/ul。
实验4组的5ul显微注射混合物与实验1组相同，只是注射剂量不同，用于检验注射量对于刺参基因编辑效果的影响。
对照组的5ul显微注射混合物为1ul Cas9蛋白；1ul 20％甘油；1ul染料(FITC)；2ul RNase-free水。最终对照组的Cas9蛋白的注射浓度为500ng/ul，sgRNA的浓度为0。
3)刺参精、卵获取：
从上述地域刺参中解剖获得精子；刺参卵子通过注释神经肽NGIWY-NH2促熟获得，具体将NGIWY-NH2(10μM))注射入刺参体腔中，注射的量约为刺参的0.1％(v/w)。注射完该多肽后，刺参开始出现摇晃身体的现象，约15分钟后排精排卵。
4)刺参卵细胞固定、受精：
将上述获得的卵子固定于显微注射用的培养皿中，具体为：将0.4g的鱼精蛋白硫酸盐加入40ml蒸馏水中，在50ml的无菌锥形管中配制1％的硫酸鱼精蛋白溶液，直到鱼精蛋白硫酸盐完全溶解(>1小时)，待用；在培养皿背面按培养皿面积的1/3处于培养皿直径平行画线，而后用1％的硫酸鱼精蛋白溶液加入至培养皿内润洗培养皿，沥干，然后立即用去离子水漂洗，或者晾干，用去离子水漂洗；待用，同时可储存在无尘容器中供以后使用。最后，使用口吸器将卵细胞整齐地排列固定在涂有硫酸鱼精蛋白的培养皿标记的划线处(参见图1和2)。显微注射伊始，用移液枪将稀释后的1ul精液打入培养皿中，使其完成受精。
5)显微注射：
将固定好的胚胎放置到体视显微镜镜下，用低倍物镜对准胚胎调焦，轻轻的落下针尖，并将注射针尖推入视野中心，通过微操作系统的微调调整注射针位置，直到清晰见到针尖为止。进一步调整显微镜焦距和注射针及胚胎的位置，使胚胎和注射针尖均达到最佳清晰程度。推动操纵杆，小心进针，使注射针针尖进入胚胎。脚踏开关将样品注入胚胎。实验1-3组以及对照组注射剂量为刺参胚胎体积的10％，一般为1nL。实验4组的注射剂量为刺参胚胎体积的15％，一般为1.5nL。上述4个实验组和1个对照组各注射500个刺参胚胎，注射完成后在荧光显微镜下，根据胚胎内荧光情况判断注射是否成功。根据镜检结果，实验1组注射成功488个胚胎，实验2组注射成功478个胚胎，实验3组注射成功490个胚胎，实验4组注射成功450个胚胎，对照组注射成功489个胚胎。
6)注射后胚胎培养：
将注射后的胚胎置于23℃培养箱中培养，直至发育到耳状幼体阶段。
7)基因编辑成功率
对于正常发育的刺参胚胎，其在耳状幼虫时期，每个幼虫只有一块实心骨骼，并且骨骼的位置是固定的，只出现在背部的右侧。而到了樽形幼虫发育初期，胚胎骨骼的数量和位置开始发生变化，有些胚胎开始在不同的位置有两种骨骼元素。
实验1组注射后的胚胎发育至耳状幼体的阶段活胚胎有450个，其中有439个胚胎中骨骼消失，基因编辑成功率为97.5％；实验2组注射后的胚胎发育至耳状幼体的阶段活胚胎有419个，其中有365个胚胎中骨骼消失，基因编辑成功率为87.1％；实验3组注射后的胚胎发育至耳状幼体的阶段活胚胎有446个，其中有387个胚胎中骨骼消失，基因编辑成功率为86.7％；实验4组注射后的胚胎发育至耳状幼体阶段的活胚胎仅有42个，其他注射后胚胎均出现畸形或死亡，42个正常胚胎中有35个胚胎骨骼消失，基因编辑成功率为83.3％；对照组注射后的胚胎发育至耳状幼体的阶段活胚胎有459个，其中有0个胚胎中骨骼消失，基因编辑成功率为0。该实验证明了刺参基因编辑体系的构建已经成功。
由上述实施例可见本发明基于CRISPR/Cas9技术构建刺参基因编辑育种体系解决了(1)刺参基因编辑用卵子和精子无法及时获取的难题；同时采用本发明刺参卵细胞的固定和高效显微注射，可在短时间内完成大量胚胎的注射，显著提高实验效率，并且按照优化的刺参显微注射体系的试剂配比以及注射量，进而用以提高基因编辑效率。本发明可以实现刺参的定点精准遗传改造，可根据刺参选育的目标性状应用于不同基因，通过构建其基因编辑体系实现多个目的基因及多种目标性状的编辑，进而可获得具有目标性状的优良刺参品系，提供了刺参育种的新途径和方法。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种刺参基因编辑体系的构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggcttatc gaggtggcgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggttggcgc cgcccggctc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggttcgact ctcgccgcat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaggcggct aactcgtgta 20

Claims (6)

1.一种刺参基因编辑体系的构建方法，精、卵获取、显微注射用卵细胞固定、目标基因sgRNA设计、配置注射体系和显微注射，其特征在于：获取刺身精、卵，获取后将卵细胞固定排成单细胞列，并对其受精，经配置的含刺参目标基因sgRNA的混合液注入至上述排成单细胞列的受精后的刺参卵细胞中，注射剂量为刺参胚胎体积的8-12%，在23℃下孵育显微注射后的胚胎，进而可获得刺参基因编辑体系；
刺参卵细胞固定于含硫酸鱼精蛋白溶液的培养皿中排成单细胞列，而后将精液打入培养皿中，使卵细胞完成受精；固定后受精的刺参卵细胞在显微镜下注射含刺参目标基因sgRNA的显微注射混合液；
所述含刺参目标基因sgRNA的混合液为每微升混合液中500ng Cas9蛋白、300ng 目标基因的sgRNA、0.2μl 20%甘油、0.2μl FITC和0.16μl RNase-free水；
或所述含刺参目标基因sgRNA的混合液为每微升混合液中750ng Cas9蛋白、375ng 目标基因的sgRNA、0.16μl 20%甘油、0.2μl FITC和0.04μl RNase-free水；
或所述含刺参目标基因sgRNA的混合液为每微升混合液中250ng Cas9蛋白、250ng 目标基因的sgRNA、0.2μl 20%甘油、0.2μl FITC和0.3μl RNase-free水。
2.按权利要求1所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：所述固定为在显微注射用的培养皿底部背面划线，并将培养皿内用0.1%-1%的硫酸鱼精蛋白溶液润洗，而后用口吸器将卵细胞整齐地排列在涂有硫酸鱼精蛋白的注射盘表面划线处。
3.按权利要求2所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：所述润洗为将0.1%-1%的硫酸鱼精蛋白溶液涂在培养皿上，沥干或者晾干，然后立即用去离子水漂洗，待用。
4.按权利要求1所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：所述刺参卵细胞的获得为利用神经肽NGIWY-NH2促熟刺参获得其卵细胞。
5.按权利要求4所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：将10 μM 的NGIWY-NH2注射入刺参体腔中，注射的量约为刺参体积的10%-15%，以刺参开始出现摇晃身体的现象起15-20分钟后排卵，收集刺参卵子。
6.按权利要求1所述的刺参基因编辑体系的构建方法，其特征在于：所述刺参目标基因sgRNA的获得：根据CRISPRscan设计gRNA序列，并根据CRISPRscan score选择分值高的gRNAs, 配置显微注射混合液时，可以每条序列单独使用，也可以全部混合使用或者组合使用。
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