CN109652459A - 一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及编辑材料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及基因编辑材料，其包括如下步骤：S1、确定靶基因的sgRNA序列；S2、合成靶基因的sgRNA；S3、在蜂卵的尾部背侧或近头端腹侧显微注射编辑材料，以及进行注射卵的后期孵化；S4、注射卵靶基因的PCR扩增；以及S5、对步骤S4中获得的PCR扩增产物进行测序，以获得靶基因的基因编辑结果。其将蜜蜂基因编辑中的注射位点由尾部改为靠近头端的腹侧；同时首次在蜜蜂中使用sgRNA+Cas9蛋白混合物为基因编辑材料，高效地获得了G0代双敲Indel突变体，大大简化了培育双敲突变体工蜂的繁育过程，降低了蜜蜂基因编辑研究的生态风险。

Description

一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及编辑材料
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及编辑材料。
背景技术
蜜蜂是一种在授粉中发挥着重要作用的飞行昆虫，也是在整个生态系统中起着支撑作用的关键物种。
目前有关蜜蜂基因编辑成功的报导都是通过注射基因编辑原料(例如mRNA)到蜂卵的尾部来产生有基因编辑的性细胞，从而产生突变的后代来达到产生转基因蜜蜂的目的。但由于当卵裂细胞到达尾部时，胚胎本身的卵裂细胞总量已经是非常大了，因此产生基因编辑的细胞数量比较多，一个个体的后代就会有多种编辑体的出现，由此，对于筛选到单一的编辑体是比较困难的。而且，这种方式获得突变体后代的效率也非常低。
其次，为了获得目标基因双等位突变的工蜂，需要几代蜂的繁育过程，而该过程要求的技术难度相对比较高，经历的时间较为漫长。同时，期间会增加嵌合体蜂王逃逸的可能性，由此可能进一步引发因嵌合体蜜蜂逃逸而对生态环境带来的破坏。
因此，迫切需要创建一种高效的蜜蜂基因编辑技术。该技术可以在基因编辑处理后的当代(G0)个体就能产生双等位基因敲除的突变体，即完全突变体。这些完全突变的工蜂可以直接用于蜜蜂基因功能的研究等其他相关各种科学研究的需求。
发明内容
本发明针对现有基因编辑技术的上述缺陷，提供了一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及编辑材料，其将蜜蜂基因编辑中的胚胎注射位点由性细胞存在的尾部改为合子形成的近头端腹侧，由此将编辑目标由性细胞转变成合子；同时首次使用sgRNA+Cas9蛋白混合物作为编辑材料，高效地获得了 G0代双敲Indel突变体，大大简化了培育双敲突变体工蜂的繁育过程，降低了蜜蜂基因编辑研究的生态风险。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一方面，提供了一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法，其包括如下步骤：
S1、确定靶基因的sgRNA序列；
S2、合成靶基因的sgRNA；
S3、在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料，以及进行注射卵的后期孵化；
S4、注射卵靶基因的PCR扩增；
以及S5、对步骤S4中获得的PCR扩增产物进行测序，以获得靶基因的基因编辑结果。
优选的，所述靶基因为蜜蜂Mrjp1基因或Pax6基因。
优选的，步骤S3中，所述编辑材料为靶基因的sgRNA与Cas 9蛋白的混合物；当在蜂卵的尾部背侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白；当在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白。
优选的，步骤S3中，当在蜂卵的尾部背侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有200ng靶基因 sgRNA以及200ng Cas 9蛋白；当在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有200ng 靶基因sgRNA以及200ng Cas 9蛋白。
优选的，所述步骤S3包括：
S31、在蜜蜂的繁殖季节，将用于采集待注射卵的人工巢脾进行无卵化处理；将无卵化处理后的人工巢脾放置到蜂箱中，以让工蜂进行清理过夜，同时将蜂王与人工巢脾进行隔离；
S32、将蜂王关在人工巢脾的固定范围内排卵，且关王排卵时间为2-2.5小时，产卵后放出蜂王；
S33、显微镜下采用注射针在蜂卵的近头端腹侧完成编辑材料的注射，以获得注射卵，且每个卵在 45-60s内完成注射全过程，且保证完成编辑材料注射后的卵处在1细胞期。
优选的，步骤S33中，所述注射针为内径2-5μm、尖端带有刃的玻璃针。
优选的，步骤S33中，当在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料时，所述注射针与卵的近头端腹侧的夹角小于30度，沿头侧向尾侧的方向进针，注射压600hPa，平衡压50hPa，且所述注射针进入卵内后，将编辑材料注入卵内的时间为0.1s。
优选的，所述步骤S5中还包括：选取与注射卵相同孵化日龄的蜂卵，进行相同的靶基因的PCR扩增，并将该PCR产物测序后的结果作为注射卵靶基因编辑结果的空白对照。
另一方面，还提供一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑材料，每ml编辑材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白，且所述编辑材料可被注射至蜜蜂蜂卵的尾部背侧或近头端腹侧。
优选的，每ml编辑材料中含有200ng靶基因sgRNA以及200ng Cas 9蛋白。
本发明技术方案的有益效果在于：
本发明利用CRISPR/Cas9显微注射技术建立了蜜蜂胚胎期基因编辑方法。以蜜蜂胚胎学卵裂细胞的产生、增殖和迁移规律为依据，改变了以往常规的注射位点，由尾部改为近头端的腹侧。同时，在蜜蜂CRISPR/Cas9编辑方法中首次使用sgRNA+Cas9蛋白混合物为编辑材料，高效地获得了G0代双敲Indel 突变体。直接获得G0代双敲Indel突变体大大简化了培育双敲突变体工蜂的繁育过程，降低了蜜蜂基因编辑研究的生态风险，同时为今后利用该技术对蜜蜂进行相关的科学研究打下了良好的基础。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明的实施例一中Mrjp1基因sgRNA序列设计图；
图2是本发明的实施例一中Pax6基因sgRNA序列设计图；
图3是本发明的实施例一中Mrjp1 sgRNA和Pax6 sgRNA的电泳条带；
图4a是本发明的实施例一中Mrjpr1基因的空白对照序列图；
图4b是本发明的实施例一中Pax6基因的空白对照序列图；
图5a是本发明的实施例一中批次m1样品Mrjp1基因的一代测序图；
图5b是本发明的实施例一中批次m2样品Mrjp1基因的一代测序图；
图5c-5d分别是本发明的实施例一中批次m2中样品6c、8c Mrjp1基因TA克隆后的一代测序图；
图5e是本发明的实施例一中批次m3样品Mrjp1基因的一代测序图；
图5f-5n分别是本发明的实施例一中批次m3中样品1A、2A、3A、6A、9A、10A、12A、14A、 15A Mrjp1基因TA克隆后的一代测序图；
图6是本发明的实施例一中基因Mrjp1所有的被编辑类型图；
图7是本发明的实施例二中批次p4样品Pax6基因的一代测序图；
图8a-8j分别是本发明的实施例二中批次p4中样品1D、3D、4D、5D、6D、7D、8D、10D、11D、 13D Pax6基因TA克隆后的一代测序图；
图9是本发明的实施例二中基因Pax6所有的被编辑类型图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案以及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一：
本实施例中基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法包括如下步骤：
S1、确定靶基因的sgRNA序列；
本实施例中，所述靶基因为蜜蜂Mrjp1(major royal jelly protein 1)基因，其设计图如图1所示。其具体过程包括：根据NCBI等数据库获得Mrjp1(GB14888/NC_007080.3)的基因序列，并选择基因组编辑目标位点(N20NGG)，其中，确定了20个碱基序列的单一导向RNA(sgRNA)靶位点(+55- +74；RefSeq.NMY010115791)，并将NGG序列作为PAM(ProtospacerAdjacent Motif)，sgRNA对应的序列为(5’-TTGTTTATGCTGGTAT GCCT-3’)；
S2、合成靶基因的sgRNA；具体的，其包括如下步骤：
S21、合成扩增靶基因Mrjp1 sgRNA体外转录模板的正向引物以及反向引物，其中，正向引物序列 F-sgRNAMrjp1如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列R-Common如SEQ ID NO.2所示；
S22、配置体外转录的PCR反应体系，并按照预设反应程序完成靶基因Mrjp1 sgRNA体外转录模板的合成及纯化；具体的，所述PCR反应体系总体积为40μl，具体组成如下： 2×Pfu Mastermix(Transgene)20μl、14μl超纯水、4μl正反向引物(5μM)(F-sgRNAMrjp1和R-Common 各2μl)和2μl的pYSY-sgRNA质粒(20ng/μl)(购自南京尧舜禹生物科技有限公司)；PCR反应程序为：95℃3min，30×(95℃30s，56℃30s，72℃30s)，72℃10min，4℃保存；
在此基础上，为保证后续转录的效率，上述体外转录模板的合成完成后还需要对转录模板进行纯化，其具体包括：利用无核酸酶污染的PCR clean up(Axygen)试剂盒收集经上述PCR反应程序扩增后获得的体外转录模板，且回收溶剂为无核酸酶污染的超纯水，回收体积为30μl；在回收反应体系中加入3倍回收体积的Buffer PCR-A，混匀；将混匀后的溶液转移到PCR产物制备管中，然后置于2ml离心管中， 12000g离心1min，弃滤液；将PCR产物制备管放回到2ml离心管上，加700μl Buffer W2(使用前，需确认在BufferW2浓缩液中已按指定体积加入无水乙醇)，12000g离心1min，弃滤液；将PCR产物制备管放回2ml离心管中，加400μl Buffer W2，12000g离心1min；将PCR产物制备管置于洁净的 1.5ml离心管中，在制备管膜中央加30μl无核酸酶污染的超纯水，室温静置1min；12000g离心1min 洗脱DNA，以获得纯化后的Mrjp1 sgRNA序列体外转录模板；
S23、靶基因Mrjp1 sgRNA的体外转录；
将上述步骤S22中纯化后获得的体外转录模板用T7RNA聚合酶进行体外合成，并使用MAXIscript SP6/T7RNA体外转录试剂盒(Ambion，USA)进行转录；具体的，按试剂盒说明书要求依次加入室温下溶解的10×转录缓冲液4μl、10mM ATP 2μl、10mM CTP 2μl、10mMGTP 2μl、10mM UTP 2μl，RNA 聚合酶混合液(T7/SP6)4μl，模板DNA 24μl，轻弹混匀离心后，37℃水浴1.5h；反应完成后，加入DNase I(Ambion，USA)2μl，37℃水浴20min，以去除模板；再加入60μl DEPC水扩大体积至100μl，同时加入10μl无核酸酶3M醋酸钠(pH5.2)和3倍体积的分析纯无水乙醇，-80℃过夜沉淀；4℃12000g离心20 min，去除上清后，加入75％的乙醇500μl，混匀后于4℃12000g离心20min，去除上清后，沉淀在通风橱晾干，然后以30μl无核酸酶超纯水重悬，以获得靶基因Mrjp1 sgRNA；取1μl合成的Mrjp1 sgRNA进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳，以检测Mrjp1 sgRNA是否满足后续实验要求；
S3、蜂卵显微注射和注射卵的后期孵化；其具体包括如下步骤：
S31、在蜜蜂的繁殖季节，以江西农业大学蜜蜂研究所的意大利蜂群为研究对象，将用于采集待注射卵的人工巢脾进行无卵化处理，即清理所述人工巢脾上残存的蜂卵；将无卵化处理后的人工巢脾放置到蜂箱中，以让工蜂进行清理过夜，在此期间将蜂王与人工巢脾进行隔离，以防止蜂王在此巢脾上产卵；
S32、利用蜂场自制的木质和竹制栅栏等部件限制蜂王的活动范围，该栅栏的空隙允许工蜂进入巢脾，但无法供蜂王爬出，以将蜂王关在人工巢脾的固定范围内排卵，且关王排卵时间为2-2.5小时(优选为2小时)，在关王排卵过程中要保持安静，产卵后放出蜂王，以获取20-40颗卵；
S33、取下人工巢脾上带有卵的成排的塑料插销，插销的底部为卵的尾部粘附的地方，将塑料插销固定在自制的塑料盒里；
显微镜下采用注射针完成编辑材料的注射，以获得注射卵，且每个卵在45-60s内完成注射全过程，同时保证完成编辑材料注射后的卵处在1细胞期，即合子形成期前后；所述编辑材料为靶基因sgRNA与 Cas9蛋白的混合物；所述注射针为内径2-5μm、尖端带有刃的玻璃针；
如表1所示，本实施例针对靶基因Mrjp1共注射了三批卵(均为实验组)，批次分别是m1、m2、m3；批次m1中，每ml编辑材料中含有50ng Mrjp1 sgRNA+400ng mRNA，所述mRNA为购自赛默飞世尔科技有限公司的CRISPR Nuclease mRNA(初始浓度为1μg/μl)经nuclease-free水稀释获得，且注射位点为尾部背侧，待注射卵数量为25个；批次m2、m3中，每ml编辑材料中含有180-220ng(优选为200ng)Mrjp1 sgRNA 以及180-220ng(优选为200ng)Cas9蛋白，Cas9蛋白为购自赛默飞世尔科技有限公司的TrueCutTMCas9 Protein v2(初始浓度为1μg/μl)经nuclease-free水稀释获得，批次m2的注射位点为尾部背侧，待注射卵数量为26个；批次m3的注射位点为近头端腹侧，待注射卵数量为24个，且注射时，所述注射针与卵的近头端腹侧的夹角应保持小于30度，沿头侧向尾侧的方向进针，注射压600hPa，平衡压50hPa，且所述注射针进入卵内后，将编辑材料注入卵内的时间为0.1s；
表1不同批次注射蜂卵的信息表
S34、将获得的注射卵置于塑料盒中，且放到恒温箱中进行培养，培养条件为温度35℃、相对湿度85％，且培养时在放置注射卵的塑料盒里加入约2ml 16％的稀硫酸溶液(不能碰到卵体)，以抑制受伤卵的感染；
S4、注射卵靶基因的PCR扩增；其具体包括如下步骤：
S41、注射卵被培养48-60小时后，此时卵处在胚胎发育的第9期，基本具有幼虫的结构特征，胚胎的细胞量已经很大，因此有足够量的DNA作为靶基因的PCR模板，此时可在显微镜下选取正常发育的卵进行裂解，具体裂解过程包括：将卵组织用枪头在EP管中捣碎，加入20μl AD1buffer和10μl AD2 buffer，混匀，分别于置室温下10min，55℃下10min，95℃下3min，最后加入40μl AD3buffer混匀制成卵组织裂解液；
S42、配置PCR反应体系，并按照预设反应程序完成靶基因Mrjp1的扩增；所述PCR反应体系包括：基因Mrjp1扩增正向引物0.4μl，基因Mrjp1扩增反向引物0.4μl，2×TransDirect PCRs upermix(+dye)10μl， ddH2O 5.2μl，卵组织裂解液4μl，其中，基因Mrjp1扩增正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，基因Mrjp1扩增反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；PCR反应程序为：94℃10min，35×(94℃30s，56℃30s，72℃ 1min)，72℃10min，4℃保存；最终获得的扩增片段总长度为403bp；
以及S5、测序和TA克隆；
采用上述基因Mrjp1扩增正向引物(即SEQ ID NO.3所示序列)作为测序引物，通过第一代DNA 测序技术(Sanger法)检验样品是否在PAM的附近有双峰出现，若在PAM位点或其附近出现双峰，则对应样品即被认定为可能产生靶基因突变的样品，则进一步对该样品进行20个TA克隆，克隆产物测序后确定其确切的序列信息，以此获知靶基因Mrjp1编辑结果，所述基因编辑结果包括靶基因编辑的效率、类型等；本实施例中，TA克隆测序的公司为湖南擎科生物技术有限公司(长沙，中国)；
同时，由于本发明所采用的蜜蜂为人工养殖的普通意大利蜜蜂，没有经过特殊的选育过程，蜂王后代的遗传基础可能比较复杂。为了能更好地判断候选基因的敲除效果，先要了解蜂王后代的遗传基础，尤其需要调查在guide RNA和PAM位点上或附近是否存在关键性碱基的野生型突变，这些位点可能会影响敲除效果。因此，步骤S5还包括：选取与实验组注射卵相同孵化日龄的10颗卵，按照步骤S42进行相同的靶基因Mrjp1PCR扩增，并将该PCR产物测序后的结果作为实验组靶基因Mrjp1基因编辑类型判断的空白对照。
实施例二：
本实施例与实施例一的不同之处仅在于，步骤S1中，所述靶基因为蜜蜂的一种转录因子基因Pax6 (paired homebox 6)，其设计图如图2所示。其具体过程包括：根据NCBI等数据库获得Pax6 (LOC102654776/NC_007075.3)的基因序列，并选择基因组编辑目标位点(N20NGG)，其中，确定了20个碱基序列的单一导向RNA(sgRNA)靶位点(+1106-+1125；RefSeq.XM_006565377.2)，并将NGG序列作为PAM(Protospacer Adjacent Motif)，sgRNA对应的序列为(5’- GACCATTACCAGACTCTACA-3’)；
步骤S21中，合成扩增靶基因Pax6sgRNA体外转录模板的正向引物序列F-sgRNAPax6如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列R-Common如SEQ ID NO.2所示；
步骤S33中，本实施例针对靶基因Pax6共注射了一批卵，即表1中所示的批次p4；其中，每ml编辑材料中含有180-220ng(优选为200ng)Pax6 sgRNA以及180-220ng(优选为200ng)Cas9蛋白，注射位点为近头端腹侧，待注射卵数量为22个；
步骤S42中，完成靶基因Pax6扩增的PCR反应体系中，靶基因Pax6扩增正向引物序列如SEQ ID NO.6 所示，靶基因Pax6扩增反向引物序列如SEQ ID NO.7所示，最终获得的扩增片段总长度为446bp。
其他步骤均与实施例一相同，在此不再赘述。
实施例三：
本实施例中提供了一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑材料，所述蜜蜂基因编辑材料可用于实现实施例一或二中的蜜蜂基因编辑方法，且所述编辑材料可被注射至蜜蜂蜂卵的尾部背侧或近头端腹侧。其中，每ml编辑材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas9蛋白，优选的，每ml编辑材料中含有200ng靶基因sgRNA以及200ng Cas9蛋白。
结果与分析：
1、sgRNA质量检测结果：
对两个靶基因(Mrjp1和Pax6)的sgRNA进行琼脂糖(1.5％)凝胶电泳，从图3中可以看出，泳道2和3分别为稀释后的Mrjp1和Pax6基因的sgRNA，其条带均较为清晰，说明两个靶基因的sgRNA 完整性都比较好的，适合做下一步的显微注射实验。
2、靶基因Mrjp1和Pax6空白对照样品的测序结果：
图4a是靶基因Mrjp1空白对照序列图，其中方形线框内所示序列为sgRNA位点，椭圆形线框内的碱基代表的是杂合位点。从图4a中可以发现十个Mrjp1 sgRNA样品位点上有一个T/C的变异位点 5’-TTGTTT(C)ATGCTGGTATGCCTTGG-3’，该位点在距离NGG(PAM)5’端第15个碱基的位置，属于 sgRNA的非核心识别区域，可能会对编辑结果有一定的影响，因此将十个Mrjp1 sgRNA样品中的两个命名为WT-M1和WT-M2，以作为靶基因Mrjp1编辑结果类型的判定对照。
类似的，图4b是靶基因Pax6空白对照序列图，其中方形线框内所示序列为sgRNA位点，椭圆形线框内的碱基代表的是杂合位点，从图4b中可以发现十个Pax6 sgRNA样品位点上有一个G/A的变异位点5’-GACCATTACCAGACTCTACAA GG(A)-3’，该位点正好在PAM位点上，也可能会对编辑效果有一定的影响，因此将十个Pax6 sgRNA样品中的两个命名为WT-p1和WT-p2，以作为靶基因Pax6编辑结果类型的判定对照。
3、各批次注射样品胚胎正常发育情况：
如表2所示，实施例一、二中，m1批次的25颗注射卵中有14个发育正常，m2批次的26颗注射卵中有17个样本发育正常，m3批次的24颗注射卵中有15个样本发育正常，p4批次的22颗注射卵中有 13个发育正常；由此可见，编辑材料为sgRNA+Cas9 Protein v2的批次m1、m2、m3及p4中，即使注射位点不同，但注射卵的正常发育率也无明显差异。
表2各批次注射卵胚胎正常发育情况
4、批次m1、m2、m3以及p4中靶基因Mrjp1、Pax6的编辑效果：
从图5a(其中方形线框内序列为Mrjp1的sgRNA序列)中可以看到，m1批次注射卵的靶基因Mrjp1 扩增后送测的14个样本(即图5a中的1M-14M)中均未发现有典型双峰的出现，因此可判定没有明显的嵌合体的出现。
从图5b(其中方形线框内序列为Mrjp1的sgRNA序列)中可以看到，m2批次注射卵的靶基因Mrjp1 扩增后送测的17个样本(即图5b中的1c-17c，WT-M1、WT-M2为空白对照)中，6c和8c两个样品的测序图(分别如图5b所示)中出现有双峰，可被视为基因编辑后出现的嵌合体样品。
从图5e中可以看到，m3批次注射卵的靶基因Mrjp1扩增后送测的15个样本(即图5e中的1A-15A， WT-M1、WT-M2为空白对照)中出现三种类型的编辑结果：第一种为可产生明显双峰的嵌合体类型，包括1A、2A、3A、6A、9A、10A、12A、14A、15A(如图5e所示)共9个样品；第二种为靶基因Mrjp1 被完全敲除形成的另一种编辑类型的突变体，包括13A、4A、5A、8A、11A(如图5e所示)共5个样品；第三种是完全没有被编辑的样品7A。
由此可以发现，如表3所示，同样的孵化时龄，同样在尾部背侧注入编辑材料，但注射mRNA的批次m1里没有发现能产生双峰的个体，而注射Cas9 protein V2的批次m2里有11.8％的被编辑率，说明同样条件下mRNA的作用效果远低于Cas9 protein V2。
进一步的，取批次m2以及m3中，在PAM位点附近呈现双峰的样品进行TA克隆，然后各提取20 个克隆菌落进行测序。根据TA克隆测序结果(分别如图5c-5d,5f-5n所示)和如图5e所示的突变体(13A、 4A、5A、8A、11A)的类型得出Mrjp1基因被编辑的所有类型(如图6所示)，同时将批次m2以及 m3中的基因编辑效果进行比较发现：如表3所示，在近头端腹侧注射的批次m3的样品中，其被编辑个体数为14个，编辑效率(93.3％)，显著高于在尾部背侧注射的批次m2的编辑效率(11.8％)，且批次 m3中产生的双等位突变体个体有11个(3A、4A、5A、8A、9A、10A、11A、12A、13A、14A、15A)，占总样本的73.3％，因此从结果可以看出在近头端腹侧注射的编辑效果显著好于在尾部背侧注射的编辑效果。
进一步的，批次m3中获得的11个双等位突变体个体中有5个双等位敲除纯合突变体(即样品13A、 4A、5A、8A、11A)(只具有一种编辑类型的完全突变体)，有6个双等位敲除杂合突变体(即样品3A、 9A、10A、12A、14A、15A)(具有多种编辑类型的完全突变体)，由于上述完全突变体在G0代就可以产生，因此其可以大大简化繁琐的繁育过程，尤其可以略过蜂王的培育，从而降低实验蜂王逃逸后产生严重后果的风险，同时会更加有利于实验室的研究和操作，对于实现利用G0代进行相关基因功能研究和转基因蜜蜂的产生具有十分重要的科研意义。
表3针对靶基因Mrjp1不同编辑材料和不同注射位点产生的编辑效率
进一步的，表4列出了批次m3所有靶基因Mrjp1被编辑样品的编辑效果总表。在表中，M1-M15 代表每个样本TA克隆后测序出现的不同具体编辑类型，与图6的编辑类型相对应，括号中的数字表示该种编辑类型在该样品的20个TA克隆中的重复数；有一些样品是没有被完全编辑的个体，因此没有被编辑的TA克隆样品用“无”表示；嵌合率表示该样品中出现编辑的TA克隆占20个TA克隆中的百分比。
图6中的A图代表的是批次m3样品中缺失(deletion)之后碱基缺失的8种类型(M1-M8)，B图代表的是插入(insertion)之后导致碱基增多的7种类型(M9-M15)。椭圆线框中的序列是PAM位点(TGG)，星号指示的碱基为(T/C)野生型序列的SNP变异。A图中黑色暗影区域为缺失的碱基对应的地方，B 图中黑色暗影区域处的碱基为插入碱基，方形线框内为guideRNA识别序列。右边的数值是缺失或插入的碱基数。
根据CRISPR/Cas9系统编辑原理，细胞经过编辑后不会再被guide RNA识别而进行再次编辑，因此蜂胚中出现的编辑类型的数量大小会跟注射时胚胎所处的细胞期有一定的对应关系，同时结合m2、m3注射时胚胎的孵化时间，本实施例中列出了所有实验样品在被编辑时可能处于的(即表4最后一列)卵裂细胞期。根据编辑类型的多少估测所有m3批次被编辑的个体基本都处在1-2细胞期之间，m2批次被编辑的个体估测在1或2细胞期之间，因此，本发明中应尽量保证注射完编辑材料的注射卵处于1细胞期，以此增加编辑效率。
表4 m2、m3批次所有基因Mrjp1被编辑个体的编辑效果总表
类似的，从图7(其中方形线框内序列为Pax6的sgRNA序列)中可以看出靶基因Pax6扩增后送测的13个样本(即图7中的1D-13D，WT-p1、WT-p2为空白对照)中出现了两种类型的编辑结果：第一种为可产生明显双峰的嵌合体类型，包括1D、3D、4D、5D、6D、7D、8D、10D、11D、13D共10 个样品(如图7所示)共10个样品；第二种为靶基因Pax6被完全敲除形成的另一种编辑类型的突变体，包括2D、9D、12D共3个样品(如图7所示)。
将10个可产生明显双峰的嵌合体样品(即1D、3D、4D、5D、6D、7D、8D、10D、11D、13D)进行TA克隆，然后各挑取20个克隆菌落进行测序。根据TA克隆测序结果(分别如图8a-8j所示)和如图7所示的突变体(2D、9D、12D)的类型得出如图9所示的靶基因Pax6被编辑的所有类型。进一步的，表5列出了批次p4所有靶基因Pax6被编辑样品的编辑效果总表。同样的，P1-P15代表每个样本 TA克隆后测序出现的不同具体编辑类型，与图9的编辑类型相对应，括号中的数字、“无”、嵌合率以及可能处于的卵裂时期的含义与表5相同，在此不再赘述。
表5 p4实验批次所有靶基因Pax6被编辑个体的编辑效果
从表4和表5中分别发现m3批次中的样品(1A、2A、6A)有3个未被编辑完全，因此，三个样品对应的嵌合率分别是40％、30％和60％，具有双等位敲除突变的样品11个(73.3％)；而p4批次的样品中同样有三个未被编辑完全的样品(1D、3D、13D)，其嵌合率都是95％，具有双等位敲除突变的样品 10个(76.9％)。从这些结果可以看出同样的基因编辑处理方式用于Pax6基因获得了同样高效的结果。
另外，从表6可以发现在蜂卵近头端腹侧注射编辑材料后，靶基因Pax6的样品被编辑效率是非常高的，达到了100％的编辑率，大于同样条件下靶基因Mrjp1的编辑率93.3％。
表6靠近头端腹侧进行注射的m3、p4批次靶基因编辑效率比较
现有技术中多选择蜜蜂卵的尾部背侧性腺所在的地方作为编辑材料注射位点，而尾部的子核迁移开始于8细胞期之后，完成于128细胞期的时候，并且整个迁移的时间会持续110-115分钟，且尾部迁移的细胞量相对于1-2个细胞而言是比较多的，因此被编辑的嵌合体的后代编辑类型会比较多，导致后期功能研究上相对会比较复杂，并且编辑的细胞占整个细胞的比例较低，同时，要获得工蜂突变体必须经过4 代比较繁琐的繁育和筛选过程才可能获得。
而本发明中注射完编辑材料的卵处在1细胞期前后，即合子形成期前后，卵裂细胞的数量应该是在 1-2个之间。在此期间，分裂核还没有向尾部迁移，基本集中在近头端腹侧，根据卵裂中心的位点，本发明选择近头端腹侧作为注射位点。通过上述实施例一、二中靶基因的编辑效果看来，本发明选择在近头端腹侧注射的编辑效果显著优于尾部注射的编辑效果，其中有很多个体的编辑率达到了100％，实现了蜜蜂胚胎的双等位敲除。在此基础上，利用这些G0代完全突变体培育成蜂王，则产生的卵细胞的编辑类型会相对比较统一。因此，高编辑率的G0代突变体的产生可大大缩短突变体繁育和筛选的时间，无论对于利用G0当代进行基因功能研究，还是对于利用后代进行基因功能研究和转基因个体的生产都是非常有利的结果。
在关王排卵时间的选择上，本发明选择关王排卵时间为2-2.5小时(优选为2小时)，其理由是：胚胎的孵化时间越长，卵壳的韧性就越强，注射时造成卵的损失率就会增高。因此，在注射时间的选择上，总的原则是既要保证注射完后卵处于1细胞期左右，同时还要考虑到实验群体需要达到一定的数量和实验的可操作性上。本发明选择关王排卵时间为2-2.5小时(优选为2小时)，该条件在普通蜂场都可以实现，同时这个时间段可以满足获得一定量的卵用于注射。且更为重要的是，该时间段内产的卵的头部比较容易注射，超过该时间段注射会导致注射卵的损伤率和失败率大幅增加。基于上述原因，本发明中选择关王排卵时间为2-2.5小时(优选为2小时)，且每个卵在45-60s内完成注射全过程，同时，完成编辑材料注射后的卵处在1细胞期的中期，即合子形成期前后的方式具有非常好的可操作性。
此外，目前在蜜蜂基因编辑中应用的都是注射sgRNA+mRNA的方式。而本发明创造性的将 sgRNA+Cas9蛋白作为编辑材料注射到蜜蜂卵中，由此获得更高的编辑效率。其原因是：Cas9蛋白可以在注入时就起到剪切作用，由此即可保证1细胞期基因编辑的实现。而质粒和mRNA都需要经过一段时间才会产生成熟的Cas9蛋白，这样就会错过1细胞期的最佳敲除时间点。
从本发明的编辑结果可以看到，在尾部背侧注射sgRNA+mRNA不能在G0代检测到嵌合现象，而同样在尾部背侧注射sgRNA+Cas9蛋白则可以检测到两个低嵌合率的个体，由此即说明在同条件下， Cas9蛋白的编辑效率要高于mRNA的编辑效率。进一步的，本发明还在近头端腹侧注射sgRNA+Cas9 蛋白，由此获得极好的编辑效果。具体的，可在G0代就获得达到73.3％(Mrjp1)和76.9％(Pax6)的双等位敲除突变体，该结果对于蜜蜂这个物种进行科学研究来说非常有益。蜜蜂的社会性行为导致它后代的繁育对群系有很强的依赖性，而这种依赖性增加了有效控制实验体的难度，一旦这些用于科学研究的编辑体流失到野外对生态的影响将是十分巨大的。因此，本发明中的高编辑率的方法可以实现G0代作为功能研究的主体，这样就避免了复杂的繁育过程，也减少了编辑体逃逸所造成的生态风险。同时Cas9蛋白在体外的稳定性要明显高于mRNA，尤其是其在体外和sgRNA形成复合体以后，其稳定性得到进一步加强，可以为有效注射赢取更多的时间。
对于外径2-5μm的玻璃针而言，编辑材料的浓度越高，黏稠性就会越高，同时由于蜜蜂卵内的卵黄液也是非常的粘稠，由此使得注射的过程中极易导致针头堵塞，增加了连续注射的难度，极大的增加实验的失败率。因此，在上述内容的基础上，本发明的编辑材料浓度优选为(200ng sgRNA+200ng Cas9 proteinv2)/ml，注射浓度较低，因此可有效避免上述注射浓度高所带来的问题，提高编辑的成功率和效率。
综上，本发明利用CRISPR/Cas9显微注射技术建立了蜜蜂胚胎期基因编辑方法。以蜜蜂胚胎学卵裂细胞的产生、增殖和迁移规律为依据，将注射位点由尾部改为近头端腹侧。同时，在蜜蜂CRISPR/Cas9 编辑方法中首次使用sgRNA+Cas9蛋白混合物为编辑材料。由此，高效地获得了G0代完全indel突变体，进一步大大简化了培育完全突变体工蜂的繁育过程，降低了蜜蜂基因编辑研究的生态风险。即使 G0代用于后代繁育，其高效率的编辑也使后代突变体的获得效率更高，这为今后利用该技术对蜜蜂进行相关的科学研究打下了良好的基础。
上述实施例一、二及三中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本发明的保护范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及编辑材料
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
taatacgact cactatagtt gtttatgctg gtatgcctgt tttagagcta gaaatagc 58
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
aaaaaaagca ccgactcggt gccac 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atattccatt gcttcgttac tcg 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tggatatgaa gaattttgga caag 24
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
taatacgact cactatagac cattaccaga ctctacagtt ttagagctag aaatagc 57
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gccggtgtgt gtttattcaa 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
tgcaaaagtg acatccttgc t 21

Claims (10)

1.一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、确定靶基因的sgRNA序列；
S2、合成靶基因的sgRNA；
S3、在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料，以及进行注射卵的后期孵化；
S4、注射卵靶基因的PCR扩增；
以及S5、对步骤S4中获得的PCR扩增产物进行测序，以获得靶基因的基因编辑结果。
2.如权利要求1所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，所述靶基因为蜜蜂Mrjp1基因或Pax6基因。
3.如权利要求1所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，步骤S3中，所述编辑材料为靶基因的sgRNA与Cas 9蛋白的混合物；当在蜂卵的尾部背侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白；当在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白。
4.如权利要求3所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，步骤S3中，当在蜂卵的尾部背侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有200ng靶基因sgRNA以及200ng Cas 9蛋白；当在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料时，每ml编辑材料中含有200ng靶基因sgRNA以及200ng Cas 9蛋白。
5.如权利要求1所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，所述步骤S3包括：
S31、在蜜蜂的繁殖季节，将用于采集待注射卵的人工巢脾进行无卵化处理；将无卵化处理后的人工巢脾放置到蜂箱中，以让工蜂进行清理过夜，同时将蜂王与人工巢脾进行隔离；
S32、将蜂王关在人工巢脾的固定范围内排卵，且关王排卵时间为2-2.5小时，产卵后放出蜂王；
S33、显微镜下采用注射针在蜂卵的近头端腹侧完成编辑材料的注射，以获得注射卵，且每个卵在45-60s内完成注射全过程，且保证完成编辑材料注射后的卵处在1细胞期。
6.如权利要求3所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，步骤S33中，所述注射针为内径2-5μm、尖端带有刃的玻璃针。
7.如权利要求3所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，步骤S33中，当在蜂卵的近头端腹侧显微注射编辑材料时，所述注射针与卵的近头端腹侧的夹角小于30度，沿头侧向尾侧的方向进针，注射压600hPa，平衡压50hPa，且所述注射针进入卵内后，将编辑材料注入卵内的时间为0.1s。
8.如权利要求1所述的蜜蜂基因编辑方法，其特征在于，所述步骤S5中还包括：选取与注射卵相同孵化日龄的蜂卵，进行相同的靶基因的PCR扩增，并将该PCR产物测序后的结果作为注射卵靶基因编辑结果的空白对照。
9.一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑材料，其特征在于，每ml编辑材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白，且所述编辑材料可被注射至蜜蜂蜂卵的尾部背侧或近头端腹侧。
10.如权利要求1所述的蜜蜂基因编辑材料，其特征在于，每ml编辑材料中含有200ng靶基因sgRNA以及200ng Cas 9蛋白。
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