CN109072218A - 基因修饰非人生物、卵细胞、受精卵以及目的基因的修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种Cas9的表达更高且能够同时高效地编辑多个不同基因或同一基因内的多个位点的基因修饰非人生物。本发明的基因修饰非人生物的编码Cas9(CRISPR相关核酸酶9)的基因在核基因组中至少具有三个拷贝。本发明的卵细胞来自具有导入了编码Cas9的基因的至少三个拷贝的核基因组的基因修饰非人生物。本发明的受精卵使所述卵细胞与来自同种生物的精子受精而成。本发明的目的基因的修饰方法包括将向导RNA导入来自所述基因修饰非人生物的细胞、所述卵细胞或者所述受精卵中的工序。
Description
技术领域
本发明涉及基因修饰非人生物、卵细胞、受精卵以及目的基因的修饰方法。
本申请基于2015年12月18日在日本申请的日本特愿2015-247960号提出并要求其优先权,其内容援用于本文。
背景技术
在疾病机制的研究、新药品的开发研究中,反映该疾病的病情的疾病模型动物的存在是研究成功与否的关键。关于人类疾病的遗传因素,通过近年来基因组解析技术的迅速发展,对涉及几百万个位点的SNP位点能够较容易地获得遗传信息。使用该技术对多数疾病鉴定了大量疾病相关基因位点并进行了报告。另一方面,即使制备这样的疾病候选基因的基因修饰小鼠,也几乎不呈表现型。这是因为,单个基因的异常并不一定能够说明生活方式疾病的多种因素参与的病情。因此,认为以上述各候选基因为目标的创新药的效果也有限。为了解决这种问题,需要实现迅速且系统地准备并有效利用多基因座修饰疾病模型动物的体制,对于以往的ES细胞(embryonicstemcell,胚胎胎干细胞)介导的基因修饰法而言,由于只能改变一个操作、一个基因座、一个位点的基因,因此难以实现。
近年来,出现了使用CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列,ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统的基因修饰技术。CRISPR系统具有超越以往的ES细胞介导的基因修饰技术的崭新的潜能。在CRISPR系统中,将三种RNA或DNA即引导目的基因的切断的向导RNA、作为实际上与切断有关的核酸酶的Cas9(CRISPR相关核酸酶9)的mRNA、同样地被编入要切断的基因区域的修饰基因这三种显微注入受精卵中,使胚胎发育至成体,从而获得基因修饰小鼠。
在非专利文献1中,记载了通过使用CRISPR系统在ES细胞的ROSA26基因区域敲入编码Cas9的基因,能够制备Cas9敲入小鼠。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Randall J.Platt等,Cell,vol.159,p.440-455,2014。
发明内容
发明所要解决的问题
在以往的有效利用CRISPR系统的基因修饰小鼠的制备方法中,Cas9的mRNA大,显微注入的其他向导RNA和修饰基因的量有限。
另外,由于在非专利文献1中记载的Cas9敲入小鼠中仅导入Cas9基因的一个拷贝,因此,难以同时编辑多个不同基因或同一基因内的多个位点。
本发明是鉴于上述情况完成的,提供一种Cas9的表达更高且能够同时高效地编辑多个不同基因或同一基因内的多个位点的基因修饰非人生物。另外,利用所述基因修饰非人生物,简便且迅速地为目的基因提供部位特异性基因修饰技术。
解决问题的技术手段
即,本发明包括以下方式。
[1]一种基因修饰非人生物,其特征在于,编码Cas9(CRISPR-associated9,CRISPR相关核酸酶9)的基因在核基因组中至少具有三个拷贝。
[2]如[1]所述的基因修饰非人生物,所述Cas9为变体。
[3]如[2]所述的基因修饰非人生物,所述Cas9是缺乏对包括目标序列的目的基因的一条或两条链进行切断的活性的变体。
[4]如[1]~[3]中任一项所述的基因修饰非人生物,所述核基因组包括与所述编码Cas9的基因可操作地连接的CAG启动子、表达诱导型启动子、病毒性启动子或组织特异性启动子。
[5]如[1]~[4]中任一项所述的基因修饰非人生物,非人生物为哺乳动物。
[6]如[1]~[5]中任一项所述的基因修饰非人生物,将所述编码Cas9的基因串联导入所述核基因组中。
[7]一种卵细胞,其特征在于,来自基因修饰非人生物,该基因修饰非人生物具有导入了编码Cas9的基因的至少三个拷贝的核基因组。
[8]如[7]所述的卵细胞,所述卵细胞在核内不具有导入了编码Cas9的基因的核基因组。
[9]一种受精卵,其特征在于,使[7]或[8]所述的卵细胞与来自同种生物的精子受精而成。
[10]如[9]所述的受精卵,所述卵细胞在核内不具有导入了编码Cas9的基因的核基因组。
[11]如[9]或[10]所述的受精卵,所述精子来自野生型的所述同种生物。
[12]一种目的基因的修饰方法,其特征在于,包括将向导RNA导入来自[1]~[6]中任一项所述的基因修饰非人生物的细胞、[7]或[8]所述的卵细胞、或者[9]~[11]中任一项所述的受精卵中的工序。
[13]一种目的基因的修饰方法,其特征在于,包括:
将向导RNA导入来自[1]~[6]中任一项所述的基因修饰非人生物的细胞、[7]或[8]所述的卵细胞、或者[9]~[11]中任一项所述的受精卵中的工序;
在来自所述基因修饰非人生物的细胞、来自所述基因修饰非人生物的卵细胞、或者来自所述基因修饰非人生物的受精卵内表达的Cas9在位于PAM(Proto-spacer AdjacentMotif,前间区序列邻近基序)序列的上游的切断部位切断所述目的基因的工序;以及
在通过所述向导RNA与所述目的基因的互补结合而确定的区域内,得到修饰后的所述目的基因的工序,
所述目的基因具有所述PAM序列,
所述向导RNA包括由与所述目的基因中的所述PAM序列的上游碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸。
[14]一种目的基因的修饰方法,其特征在于,包括:
将向导RNA导入来自[1]~[6]中任一项所述的基因修饰非人生物的细胞、[7]或[8]所述的卵细胞、或者[9]~[11]中任一项所述的受精卵中的工序;
在来自所述基因修饰非人生物的细胞、来自所述基因修饰非人生物的卵细胞、或者来自所述基因修饰非人生物的受精卵内表达的Cas9在位于PAM序列的上游3个碱基处的切断部位切断所述目的基因的工序;以及
在通过所述向导RNA与所述目的基因的互补结合而确定的区域内,得到修饰后的所述目的基因的工序,
所述目的基因具有由NGG(N是从由腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及鸟嘌呤组成的组中选出的任意一个碱基)构成的PAM序列,
所述向导RNA包括由与所述目的基因中的从所述PAM序列的上游1个碱基处起至上游20个碱基以上且24个碱基以下为止的碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸。
[15]如[12]~[14]中任一项所述的目的基因的修饰方法,在所述导入工序中,当导入对象为来自基因修饰非人生物的细胞时,将向导RNA导入活的基因修饰非人生物中。
[16]如[12]~[14]中任一项所述的目的基因的修饰方法,在所述导入工序中,当导入对象为来自基因修饰非人动物的受精卵时,还包括将所述受精卵移植至同种非人动物的子宫或输卵管中并使其发育的工序。
[17]如[12]~[16]中任一项所述的目的基因的修饰方法,在所述导入工序中,导入两种以上的所述向导RNA。
[18]如[12]~[17]中任一项所述的目的基因的修饰方法,在所述导入工序中,将外源基因与所述向导RNA一同导入。
[19]如[18]所述的目的基因的修饰方法,所述外源基因不具有PAM序列。
发明效果
根据本发明的基因修饰非人生物、卵细胞以及受精卵,能够同时高效地编辑多个不同基因或同一基因内的多个位点。另外,根据本发明的卵细胞和受精卵,能够迅速且以低成本制备基因修饰非人生物。进一步地,本发明的基因修饰非人生物、卵细胞以及受精卵能够有效用于多数基因的异常所参与的心脏病、癌等生活方式疾病或根据全基因组关联研究(GWAS)可知的疾病相关基因的研究中。
附图说明
图1A是表示实施例1中的NFCas9(具有NLS(Nuclear localization signal,核定位序列)以及Flag标签的Cas9基因)和FCas9(仅具有Flag标签的Cas9基因)的各结构的示意图。
图1B是将试验例1中的NFCas9-2系小鼠的各组织中的50ngRNA中的Cas9mRNA的拷贝数进行比较而得到的图。
图1C是表示试验例1中的NFCas9-2系基因型不同的雄或雌性小鼠(4周龄至10周龄)的体重变化的图。
图1D是对试验例1中的NFCas9-2系基因型不同的小鼠(10周龄)的各组织切片进行苏木精和伊红染色而得到的结果的图像。
图1E是表示检测试验例1中的NFCas9-2系基因型不同的小鼠(10周龄)血清中的生理学标志物的量而得到的结果的图。
图2A是表示在实施例1中建立的NFCas9小鼠4系和FCas9小鼠5系中导入的Cas9基因的拷贝数、性别、F1代的基因型、F1代有无Cas9的导入以及Cas9的表达量的表。
图2B是表示用于计算在实施例1中建立的NFCas9小鼠4系和FCas9小鼠5系中导入的Cas9的拷贝数的标准曲线的图。
图2C是表示对在实施例1中建立的NACas9小鼠和FCas9小鼠中的Cas9蛋白质的表达进行利用Flag标签的免疫印迹分析而得到的结果的图像。
图3A是表示通过1%琼脂糖凝胶电泳检测使用实施例1中的NFCas9-2系基因组DNA的spPCR的PCR产物而得到的结果的图像。
图3B是表示实施例1中的NFCas9-2系的插入有NFCas9的位置的示意图。
图3C是表示通过1%琼脂糖凝胶电泳对实施例1中的使用用于确认图3B的结果的部位特异性引物的PCR产物进行检测而得到的结果的图像。
图4A是表示试验例2中通过各种交配对的人工授精得到的受精卵的基因型的图。
图4B是表示试验例2中通过各种交配对的人工授精得到的受精卵的存活数和插入缺失(insertion-deletion,indel)突变数的表。
图4C是表示试验例2中用于Ramp2基因的修饰的向导RNA的序列的示意图。
图4D是表示试验例2中T7核酸内切酶I(T7EI)的分析结果的图像。
图5A是表示试验例3中囊胚的存活数和indel突变数的表。
图5B是表示试验例3中囊胚的T7EI分析的结果的图像。
图6A是表示试验例3中从移植开始13.5天~15.5天后胎儿的存活数和indel突变数的表。
图6B是表示试验例3中从移植开始13.5天后10只胎儿的形态的图像。
图6C是表示试验例3中从移植开始13.5天后胎儿的囊胚的T7EI分析的结果的图像。
图6D是表示试验例3中从移植开始13.5天后10只胎儿的Ramp1基因序列的结果的图。
图6E是表示试验例3中从移植开始13.5天后10只胎儿的Ramp1基因和Ramp2基因的RNA的相对表达量的图。
图7A是表示试验例4中的基因型和有无突变的判定结果的表和图。
图7B是表示试验例4中囊胚的T7EI分析的结果的图像。
图8是表示试验例5中用于基因修饰的向导RNA的序列的示意图。
图9A是表示试验例5中使用本发明的方法时基因型和有无突变的判定结果的表。
图9B是表示试验例5中使用本发明的方法的10个囊胚的T7EI分析的结果的图像。
图9C是表示试验例5中作为对照组的、使用以往方法时的基因型和有无突变的判定结果的表。
图10A是表示试验例6的方法的概略图。
图10B是表示试验例6中用于Ggat1基因的修饰的向导RNA的序列的示意图。
图10C是表示试验例6中的成纤维细胞的T7EI分析的结果的图像。
图10D是表示试验例6中有效利用FITC-标记同工凝集素、BS-I-B4(IB4)与α-Gal表位特异性识别的FACS解析的结果的图。
图10E是对试验例6中通过用皂草素复合物IB4(IB4SAP)进行处理的存活分析后的成纤维细胞进行拍摄而得到的图像。
图11A是表示试验例7的方法的概略图。
图11B是表示试验例7中用于修饰Alb1基因的向导RNA的序列的示意图。
图11C是表示试验例7中的Cas9小鼠或野生型小鼠的EGFP阳性或阴性肝细胞的T7EI分析结果的图像。
图12A是表示试验例8中的12.5~13天龄的胎儿的indel突变率的表。
图12B是表示试验例8中的12.5~13天龄的内皮素1(ET-1)基因敲除表现型小鼠胎儿和野生型小鼠胎儿的颚形成状态的图像。
图12C是表示试验例8中来自各受精卵的胎儿的镶嵌率的图。
图13是表示试验例9中来自向导RNA的导入时间不同的各受精卵的胎儿的镶嵌率的图。
图14是表示试验例10中来自向导RNA的导入浓度不同的各受精卵的胎儿的Indel突变率和镶嵌率的图。
图15A是表示试验例11中用于修饰基因的向导RNA和敲入片段的序列的示意图。
图15B是表示试验例11中对通过使用由来自Cas9小鼠受精卵的囊胚制备的溶液的PCR得到的以Klf5基因为模板的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳而得到的结果的图像。
图15C是表示试验例11中来自Cas9小鼠或野生型小鼠的受精卵的囊胚的敲入效率的表。
具体实施方式
<基因修饰非人生物>
作为一实施方式,本发明提供一种基因修饰非人生物,编码Cas9(CRISPR相关核酸酶9)的基因在其核基因组中至少具有三个拷贝。
对本实施方式的基因修饰非人生物而言,在全身或任意细胞中Cas9过量表达。根据本发明人等可知,Cas9的过量表达状态在非人生物的生物体内没有影响。另外,由于Cas9预先过量表达,因此,仅导入向导RNA就能够简便且迅速地修饰目的基因。
在本说明书中,“基因修饰”是指通过CRISPR/Cas9系统、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases,TALEN)等技术执行靶向基因重组或靶向突变(例如,包括SNP、部分突变等插入),从而进行特异基因破坏、报告基因的敲入等。
在本说明书中,作为“非人生物”,例如,可举出大肠杆菌、枯草菌、酵母、昆虫、植物(例如,单子叶植物或双子叶植物等)、鸡等鸟类动物、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、狨猴、猴等哺乳动物,但并不限定于这些非人生物。其中,优选哺乳动物,优选小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔等啮齿目哺乳动物。
作为小鼠,例如,作为纯系,可举出C57BL/6系统、DBA2系统等,作为杂交系,可举出B6C3F1系统、BDF1系统、B6D2F1系统、BALB/c系统、ICR系统等,但并不限定于这些系统。作为大鼠的具体例,例如,可举出Wistar、SD等,但并不限于这些大鼠。
[Cas9]
“Cas9”是在细菌和古细菌中构成适应性免疫系统的Cas蛋白质家族之一,所述适应性免疫系统提供对侵入外源核酸的获得抗性,所述Cas9是识别外源侵入性DNA中的PAM序列并在其上游将双链DNA切出平滑末端的核酸内切酶。在本说明书中,Cas9形成向导RNA和复合体,具有DNA切断活性。
在本说明书中,作为Cas蛋白质家族,例如,可举出Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(作为Csn1和Csx12也是公知的)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、它们的同源物、或对它们修饰后的物质等。其中,对于本实施方式的基因修饰非人生物而言,特别优选导入Cas9基因、它们的同源物、或者对它们修饰后的物质。
Cas9指导从目的基因中的PAM序列的最初或最后的核苷酸开始在例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多的碱基对之内的单链或双链的切断。在PAM序列的上游的多少bp处切断因来自Cas9的细菌种的不同而不同,包括化脓链球菌(Streptococcus pyogenes:化脓性链球菌)在内的大部分Cas9在PAM序列的上游3个碱基处切断。
另外,作为本实施方式中使用的Cas9,可以为缺乏对包括目标序列的目的基因的一条或两条链进行切断的能力的变体。例如,将来自化脓性链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸置换为丙氨酸(D10A)是将Cas9由切断双链的核酸酶转化为切口酶(切断单链)。在除了使Cas9成为切口酶的突变以外的例子中包括H840A、N854A以及N863A,并不限定于这些。另外,Cas9的两个以上的催化结构域(RuvC I、RuvC II和RuvC III)能够生产实质上缺乏全部DNA切断活性的突变的Cas9。在该情况下,优选为与其他具有DNA切断活性的酶融合的嵌合酶。D10A突变可以与H840A、N854A或N863A突变中的一个或多个组合,以生产实质上缺乏全部DNA切断活性的Cas9。在突变的Cas9的DNA切断活性相对于其非突变形式约为25%、10%、5%、1%、0.1%或小于0.01%的情况下,可看作实质上缺乏全部DNA切断活性。
在本实施方式中,编码Cas9的碱基序列可以进行密码子最优化以在真核生物细胞等特定细胞中表达。作为真核生物细胞,可举出特定的生物,例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猪或非人灵长类等,但并不限定于这些生物。通常,密码子最优化是指,在保持天然的氨基酸序列的同时,用在导入的生物种基因中较频繁或最频繁使用的密码子来置换天然序列中的至少一个密码子,从而修饰核酸序列以在导入的生物种中进行强化表达的过程。各种生物对特定的氨基酸的特定密码子表现出特定的偏好。在很多情况下,密码子偏好(生物间的密码子使用频率的差异)与mRNA的翻译效率相关,认为其特别依赖于翻译的密码子的特性和特定的tRNA的利用可能性。通常,细胞中所选择的tRNA的优势是在肽合成中使用最频繁的密码子的反映。因此,基于密码子最优化,基因能够为给定的生物中的最适合的基因表达进行个别化。密码子使用频率表能够容易地在例如刊登在www.kazusa.or.jp/codon/(在2015年12月16日访问)的“密码子使用数据库”中获取,使用这些表能够将密码子最优化(例如,参照Nakamura,Y.等“Codon usage tabulated from the international DNA sequencedatabases:status for the year 2000”Nucl.Acids Res.28:292(2000))。用于对特定的序列进行密码子最优化以在特定的生物种中表达的计算机算法也能够例如在基因制造(Gene forge)(Aptagen公司;Jacobus;PA)等中获得。在本实施方式中,编码Cas9的序列中的一个或多个密码子与对于特定的氨基酸而言最频繁使用的密码子对应。
如果细胞内中的Cas9的表达量多,则不需要从外部导入Cas9,相应地能够大量导入向导RNA。因此,能够使用CRISPR系统对一个基因进行一个位点或多个位点的基因修饰,进一步地,能够通过一次操作同时修饰不仅一个基因而且多个基因。在本实施方式中,导入的Cas9基因的拷贝数优选为三个拷贝以上。Cas9基因也受到导入的基因座、启动子的影响,这是因为,通常存在导入的Cas9基因的拷贝数越多则Cas9的表达量越多的倾向。导入的编码Cas9的基因的拷贝数例如可以为3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多的个数。
在本说明书中,“核基因组”是指核内包含的全部染色体。例如,在人的情况下,构成核基因组的染色体数为22对常染色体和2条性染色体,总计有46条;在牛的情况下,为29对常染色体和2条性染色体,总计有60条;在小鼠的情况下,为19对常染色体和2条性染色体,总计有40条。
在本说明书中,“拷贝数”是指存在于核基因组中的特定基因的碱基序列的个数,例如,在构成核基因组的一个染色体中存在一个特定基因的情况下,拷贝数为1。另外,在一个染色体及其同源染色体两者中各存在一个特定基因的情况下(即,在纯合子的情况下),拷贝数为2。
在本实施方式中,Cas9基因可以在同一染色体上导入多个,也可以在不同染色体上各导入一个或多个。另外,Cas9基因也可以串联导入同一染色体上的相同基因座。
在本实施方式中,只要导入Cas9基因的基因座为恒定且稳定地表达的基因区域、且即使在该区域本来编码的基因缺失或修饰的情况下也能够维持生命的区域即可。另外,在导入Cas9基因时,在有效利用CRISPR系统的情况下,优选在附近具有PAM序列。作为导入Cas9基因的基因座,例如,可举出GTP结合蛋白10基因座、Rosa26基因座、β-肌动蛋白基因座等。
[启动子]
在本实施方式中,导入核基因组的Cas9基因可以包括可操作地连接该Cas9基因的启动子。作为启动子,例如,可举出融合了病毒性启动子、表达诱导型启动子、组织特异性启动子或增强子序列、启动子序列的启动子等。优选上述启动子与Cas9基因的上游(5’侧)连接。
在本说明书中,“病毒性启动子”是指来自病毒的启动子。作为来源的病毒,例如,可举出巨细胞病毒、莫洛尼氏白血病病毒、JC病毒、乳腺癌病毒、猴病毒、逆转录病毒等。
在本说明书中,“表达诱导型启动子”是指在施加化学药剂、物理应力等特定的刺激时能够表达要表达的基因(在本实施方式,Cas9基因)而在不存在刺激的条件下未表现出表达活性的启动子。作为表达诱导型启动子,例如,可举出TetO(四环素操纵子)启动子、金属硫蛋白(metallothionein)启动子、IPTG/lacl启动子系、蜕皮激素启动子系以及用于不可逆地使抑制翻译或转录的序列缺失的“lox stop lox”系等,但并不限定于这些启动子。
在本说明书中,“组织特异性启动子”是指仅在特定组织具有活性的启动子。作为组织特异性启动子,例如,在黑色素瘤细胞或黑素细胞的情况下,可举出酪氨酸酶启动子或TRP2启动子;在乳房细胞或乳腺癌的情况下,可举出MMTV启动子或WAP启动子;在肠细胞或肠癌的情况下,可举出绒毛蛋白启动子或FABP启动子;在胰腺细胞的情况下,可举出PDX启动子;在胰腺β细胞的情况下,可举出RIP启动子;在角质形成细胞的情况下,可举出角蛋白启动子;在前列腺上皮的情况下,可举出腺血管舒缓素(Probasin)启动子;在中枢神经系统(CNS)的细胞或中枢神经系统的癌的情况下,可举出巢蛋白启动子或GFAP启动子;在神经元的情况下,可举出酪氨酸羟化酶启动子、S100启动子或神经丝启动子;Edlund等在Science,230:912-916(1985)中记载的胰腺特异性启动子;在肺癌的情况下,可举出克拉拉细胞分泌蛋白质启动子;在心细胞的情况下,可举出α肌球蛋白启动子等,但并不限定于这些启动子。
作为使增强子序列、启动子序列融合的启动子,例如,可举出由猴病毒40(SV40)的早期基因的启动子和人T细胞白血病病毒1的长末端重复序列(LTR,Long TerminalRepeat)的一部分序列构成的SRα启动子、由巨细胞病毒的即刻早期(IE,ImmediatelyEarly)基因增强子和鸡β-肌动蛋白启动子构成的CAG启动子等。特别是,CAG启动子通过在要表达的基因(在本实施方式中,Cas9基因)的3’末端具有兔的β-珠蛋白基因的多聚腺苷酸化(polyA)信号位点,能够使要表达的基因(在本实施方式中,Cas9基因)几乎在全身过量表达。
其中,作为启动子,在想要使全身恒定高表达的情况下,优选为病毒性启动子或CAG启动子。另外,在调整了Cas9的表达时期或表达的组织的情况下,优选为表达诱导型启动子或组织特异性启动子。
在本说明书中,“可操作地连接”是指基因表达控制序列(例如,启动子或一系列转录因子结合部位)与要表达的基因(在本实施方式中,Cas9基因)之间的功能性连接。此处,“表达控制序列”指的是指导所述要表达的基因(在本实施方式中,Cas9基因)转录的序列。
在本实施方式中,导入核基因组的Cas9基因可以在该Cas9基因的下游(3’侧)可操作地连接mRNA的3’末端的聚腺苷酸化所需的聚腺苷酸化信号。作为聚腺苷酸化信号,能够举出来自上述病毒、各种人或非人生物的各基因所含的聚腺苷酸化信号,例如,SV40的后期基因或早期基因、兔β珠蛋白基因、牛生长激素基因、人A3腺苷受体基因等聚腺苷酸化信号等。此外,为了使Cas9基因进一步高表达,可以将各基因的剪接信号、增强子区域、内含子的一部分与启动子区域的5’上游、启动子区域与翻译区域之间或翻译区域的3’下游连接。
在本实施方式中,对导入核基因组的Cas9基因而言,可以使该Cas9基因的上游(5’侧)或下游(3’侧)可操作地连接一个或多个核定位序列(NLS)。
作为NLS,例如,可举出具有氨基酸序列PKKKRKV(序列号1)的SV40病毒大T抗原的NLS;具有来自核质蛋白的NLS(例如,具有序列KRPAATKKAGQAKKKK(序列号2)的核质蛋白的双分型NLS);具有氨基酸序列PAAKRVKLD(序列号3)或RQRRNELKRSP(序列号4)的c-myc NLS;具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(序列号5)的hRNPA1M9NLS;来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(序列号6);肌瘤T蛋白质的序列VSRKRPRP(序列号7)和PPKKARED(序列号8);人p53的序列PQPKKKPL(序列号9);小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP(序列号10);流感病毒NS1的序列DRLRR(序列号11)和PKQKKR(序列号12);肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL(序列号13);小鼠Mx1蛋白质的序列REKKKFLKRR(序列号14);人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(序列号15);类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(序列号16),但并不限定于这些序列。
在本实施方式中,导入核基因组的Cas9基因可以在该Cas9基因的上游(5’侧)或下游(3’侧)可操作地连接一个或多个荧光蛋白质等标志物基因。作为荧光蛋白质,例如,可举出绿色荧光蛋白质(Green Fluorescent Protein:GFP)、黄色荧光蛋白质(YellowFluorescent Protein:YFP)、蓝色荧光蛋白质(Blue Fluorescent Protein:BFP)、青色荧光蛋白质(Cyan Fluorescent Protein)、红色荧光蛋白质(Red FluorescentProtein)等。
[基因修饰非人生物的制备方法]
本实施方式的基因修饰非人生物能够使用用于制备将外源基因导入核基因组而得到的基因修饰非人生物的公知的基因修饰技术(例如,使用CRISPR系统、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases,TALEN)的方法;使用锌指核酸酶的方法等)制备。另外,也能够通过将Cas9基因(优选为线状化状态的基因)导入作为对象的非人哺乳动物的受精卵、胚胎干细胞、精子或未受精卵并从使用这些细胞产生的个体中选择Cas9基因被编入包括胚芽细胞的全部细胞的染色体上的个体的方法来制备。其中,本实施方式的基因修饰非人生物能够通过以往的有效利用CRISPR系统的基因修饰非人生物的制备方法来高效地获得。更具体地说,可举出后述的<用于选择性且部位特异性地修饰目的基因的方法>中所示的方法,作为外源基因,使用包括上述Cas9基因以及在该Cas9基因的上游(5’侧)和下游(3’侧)包括具有与目的基因中进行插入的基因座相同的序列的基因的载体,导入作为对象的非人生物,由此能够制备。
另外,对本实施方式的基因修饰非人生物而言,还可以同时导入除了Cas9基因以外的外源基因,其可以为具有导入了Cas9基因以及除了Cas9基因以外的外源基因的核基因组的基因修饰非人生物。
得到的生物的后代在其胚芽细胞和全部体细胞中均具有该导入基因,由此,能够确认在得到的基因修饰非人生物的胚芽细胞中存在Cas9基因。通过在DNA水平确认在由构成个体的组织例如血液组织、上皮组织、结缔组织、软骨组织、骨组织、肌肉组织、口腔内组织或骨格系统组织的一部分制备的基因组DNA中存在Cas9基因,从而进行个体的选择。
或者,通过使用导入Cas9基因后的单囊胚的基因型确定法,能够确认Cas9基因的存在(参考资料:Sakurai T.等,“A single blastocyst assay optimized for detectingCRISPR/Cas9system-induced indel mutations in mice”,BMC Biotech.,14:69,2014)。根据该方法,能够比以往更迅速地判定是否存在Cas9基因。
由于以此方式选择的个体通常为在同源染色体的一侧具有Cas9基因的杂合子,因此,通过使杂合子的个体彼此交配,能够从后代中获取在同源染色体两侧具有Cas9基因的纯合子生物。由于通过使该纯合子的雌雄生物交配,全部后代均成为稳定地保持Cas9基因的纯合子,因此,在一般饲养环境下能够使本实施方式的基因修饰非人生物繁殖传代。
<卵细胞>
在一实施方式中,本发明提供一种来自基因修饰非人生物的卵细胞,所述基因修饰非人生物具有至少导入有编码Cas9的基因的三个拷贝的核基因组。
本实施方式的卵细胞能够同时高效地编辑多个不同基因或同一基因内的多个位点。另外,通过使本实施方式的卵细胞与来自同种生物的精子受精而得到的受精卵,能够迅速且以低成本制备基因修饰非人生物。
本实施方式的卵细胞来自上述雌性基因修饰非人生物。
需要说明的是,在本说明书中,“卵细胞”是指雌性的生殖细胞,包含卵母细胞以及未受精卵。
在基因修饰非人生物为在核基因组中的同源染色体的一侧具有Cas9基因的杂合子的情况下,作为来自本实施方式的基因修饰非人生物的卵细胞,存在该卵细胞的核内具有至少导入了Cas9基因的三个拷贝的核基因组的卵细胞、以及不具有导入了Cas9基因的核基因组的卵细胞。然而,任一卵细胞均能够有效利用于目的基因的修饰。这是因为,在卵形成期,来自母性的Cas9(以下,称为maCas9)的mRNA或蛋白质在卵细胞中蓄积,从受精卵直至2细胞期为止发挥作用后,逐渐被分解。因此,在要制备不具有外源基因且目的基因被修饰的基因修饰非人生物的情况下,优选使用在核内不具有导入了Cas9基因的核基因组的卵细胞。
在本实施方式中作为卵细胞的来源的基因修饰非人生物只要具有至少导入了Cas9基因的三个拷贝的核基因组即可,在卵形成期,maCas9的mRNA或蛋白质能够在卵母细胞中蓄积。另外,导入的Cas9基因的拷贝数越多,蓄积的maCas9的mRNA或蛋白质越多,因此优选。导入的Cas9基因的拷贝数例如可以为3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多的个数。
<受精卵>
在一实施方式中,本发明提供一种受精卵,该受精卵是使来自基因修饰非人生物的卵细胞和来自同种生物的精子受精而成的,所述基因修饰非人生物的卵细胞具有至少导入了编码Cas9的基因的三个拷贝的核基因组。
根据本实施方式的受精卵,能够同时高效地编辑多个不同基因或同一基因内的多个位点。另外,根据本发明的受精卵,能够迅速且以低成本制备基因修饰非人生物。
本实施方式的受精卵能够通过使来自雌性的上述基因修饰非人生物的卵细胞与来自同种生物的精子人工授精而得到。
在基因修饰非人生物为在核基因组中的同源染色体的一侧具有Cas9基因的杂合子的情况下,作为来自本实施方式的基因修饰非人生物的卵细胞,存在该卵细胞的核内具有至少导入了Cas9基因的一个拷贝的核基因组的卵细胞、以及不具有导入了Cas9基因的核基因组的卵细胞。然而,任一卵细胞均能够有效利用于目的基因的修饰。这是因为,在卵形成期,maCas9的mRNA或蛋白质在卵细胞中蓄积,从受精卵直至2细胞期为止发挥作用后,逐渐被分解。因此,在要制备不具有外源基因且目的基因被修饰的基因修饰非人生物的情况下,优选使用在核内不具有导入了Cas9基因的核基因组的卵细胞。
在本实施方式中作为卵细胞的来源的基因修饰非人生物只要具有至少导入了Cas9基因的三个拷贝的核基因组即可,在核基因组卵形成期,maCas9的mRNA或蛋白质能够在卵母细胞中蓄积。另外,导入的Cas9基因的拷贝数越多,蓄积的maCas9的mRNA或蛋白质越多,因此优选。导入的Cas9基因的拷贝数例如可以为3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多的个数。
作为本实施方式的精子,只要是与获得卵细胞的生物种同种的精子即可,可以为来自在该精子的核内具有至少导入了Cas9基因的一个拷贝的核基因组的基因修饰非人生物的精子,也可以为来自不具有导入了Cas9基因的核基因组的基因修饰非人生物的精子,还可以为来自野生型生物的精子。在要制备不具有Cas9基因且目的基因被修饰的基因修饰非人生物的情况下,优选为来自在核内不具有导入了Cas9基因的核基因组的生物或野生型生物的精子。
如上所述,在所述核内不具有导入了Cas9基因的核基因组的卵细胞中,蓄积有maCas9的mRNA或蛋白质。因此,在使核内不具有导入了Cas9基因的核基因组的卵细胞与来自核内不具有导入了Cas9基因的核基因组的生物或野生型生物的精子受精而成的受精卵的情况下,maCas9的mRNA或蛋白质在从受精卵直至2细胞期为止的短时间内短暂地过量存在。因此,如后述的实施例所示,与以往的将合成的Cas9mRNA和向导RNA显微注入受精卵的基因组编辑法相比,镶嵌型突变显著降低。
<目的基因的修饰方法>
在一实施方式中,本发明提供一种目的基因的修饰方法,该方法包括将向导RNA导入来自上述基因修饰非人生物的细胞、上述卵细胞或上述受精卵的工序。
另外,在一实施方式中,本发明提供一种目的基因的修饰方法,该方法包括:
将向导RNA导入来自上述基因修饰非人生物的细胞、上述卵细胞或上述受精卵的工序;
在来自所述基因修饰非人生物的细胞、来自所述基因修饰非人生物的卵细胞、或者来自所述基因修饰非人生物的受精卵内表达的Cas9在位于PAM(Proto-spacer AdjacentMotif,前间区序列邻近基序)序列的上游的切断部位切断所述目的基因的工序;以及
在通过所述向导RNA和所述目的基因的互补结合确定的区域内,得到修饰后的所述目的基因的工序,
所述目的基因具有所述PAM序列,
所述向导RNA包括由与所述目的基因中的所述PAM序列的上游碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸。
根据本实施方式的方法,能够在体外和体内简便且高效地编辑目的基因。进一步地,能够迅速且以低成本制备基因修饰非人生物。
在本说明书中,作为“目的基因”,只要是具有PAM序列的基因,就没有特别的限定,例如,可举出与心脏病、癌等生活方式疾病相关的基因等能作为研究对象的基因。
在本说明书中,“PAM序列”是指能被Cas9识别的序列,PAM序列的长度、碱基序列因作为Cas9的来源的细菌种的不同而变化。例如,对化脓性链球菌而言,识别“NGG”(N表示任意的碱基)3个碱基。
嗜热链球菌(S.thermophilus)具有2个Cas9,分别将“NGGNG”或“NNAGAA”(N表示任意碱基)的5~6个碱基识别为PAM序列。由于识别的PAM序列短,难以限制能够编辑的目的基因,因此,PAM序列优选为“NGG”。
在本实施方式中,在来自所述基因修饰非人生物的细胞、来自所述基因修饰非人生物的卵细胞、或者来自所述基因修饰非人生物的受精卵内表达的Cas9只要能够识别PAM序列“NGG”即可,例如,可举出来自化脓性链球菌的Cas9等。另外,如上述<基因修饰非人生物>中记载的那样,Cas9可以被修饰,也可以使由密码子最优化后的碱基序列构成的Cas9基因表达。
在本说明书中,“向导RNA”是指模仿了tracrRNA-crRNA嵌合体的发夹结构而得到的RNA,所述tracrRNA-crRNA嵌合体是使包括外源序列(引导序列)的小RNA片段(CRISPR-RNA:crRNA)和与该crRNA一部分互补的RNA(反式激活crRNA:tracrRNA)融合而成的,所述tracrRNA-crRNA嵌合体在细菌和古细菌中构成提供对侵入外源核酸的获得抗性的适应性免疫系统。
本实施方式中使用的向导RNA可以为在包括引导序列的crRNA与tracrRNA融合的状态下合成的tracrRNA-crRNA嵌合体,也可以分别制备包括引导序列的crRNA和tracrRNA,并在导入前退火从而形成tracrRNA-crRNA嵌合体。
本实施方式的向导RNA在5’末端区域包括由与以下序列互补的碱基序列构成的多核苷酸,所述序列是目的基因中的从PAM序列的上游1个碱基处起至优选20个碱基以上且24个碱基以下、更优选22个碱基以上且24个碱基以下为止的碱基序列。还可以包括与目的基因非互补的碱基序列,也可以包括一个以上由排列成以一点为轴对称地互补的序列且能形成发夹结构的碱基序列构成的多核苷酸。
下面,详细地对本实施方式的方法进行说明。
[导入工序]
首先,将向导RNA导入来自上述基因修饰非人生物的细胞、上述卵细胞或上述受精卵。作为向导RNA的导入方法,能够使用公知的基因导入方法(例如,磷酸钙法、电穿孔法、脂转染法、凝集法、微注射法、基因枪法、二乙氨乙基-葡聚糖法等)。其中,由于操作简便,因此优选为电穿孔法。对于以往的有效利用CRISPR系统的基因修饰方法而言,Cas9的mRNA大,导入效率差。然而,在本实施方式的方法中,由于使用来自Cas9能被表达的基因修饰非人生物的细胞、卵细胞或受精卵,因此,能够通过电穿孔法等更简便且高效地导入向导RNA。
在导入对象为来自所述基因修饰非人生物的细胞的情况下,能够将向导RNA导入活的基因修饰非人生物。作为该情况下的导入方法,可举出动脉注射、静脉注射、皮下注射、鼻腔内导入、经支气管的导入、肌肉内的导入、经皮导入或经口导入等本领域技术人员公知的方法,优选静脉注射。
另外,在组织特异性启动子可操作地连接Cas9基因的上游(5’侧)的情况下,通过将向导RNA直接导入基因修饰非人生物的全身或目标组织,仅在目标组织内利用向导RNA和Cas9进行基因修饰,能够观察疾病的动态。
在导入对象为使所述卵细胞受精而成的受精卵或所述受精卵的情况下,优选使用受精后4小时以上且24小时以内、优选6小时以上且12小时以内、更优选6小时以上且8小时以下的出现有雄性前核的受精卵。通过使受精后的时间在上述范围内,maCas9的mRNA或蛋白质高表达,能够防止形成目的基因被修饰的细胞和目的基因未被修饰的细胞混杂在一起的所谓的镶嵌型胚胎,能够高效地修饰目的基因。
另外,如上述<受精卵>记载的那样,在想要制备核内不具有导入了Cas9基因的核基因组且目的基因被修饰的基因修饰非人生物的情况下,使用的受精卵优选为使核内不具有导入了Cas9基因的核基因组的卵细胞与来自核内不具有导入了Cas9基因的核基因组的生物或野生型生物的精子受精而成的受精卵。在所述核内不具有导入了Cas9基因的核基因组的卵细胞中蓄积有maCas9的mRNA或蛋白质。因此,在使用的受精卵为使核内不具有导入了Cas9基因的核基因组的卵细胞和来自核内不具有导入了Cas9基因的核基因组的生物或野生型生物的精子受精而成的受精卵的情况下,maCas9的mRNA或蛋白质在从受精卵直至2细胞期为止的短时间内短暂地过量存在。因此,如后述的实施例所示,与以往的将合成的Cas9mRNA和向导RNA显微注入受精卵的基因组编辑法相比,镶嵌型突变显著降低。
在受精卵中导入向导RNA的情况下,作为向导RNA的浓度,没有特别的限定,浓度越浓,越能够以高概率进行基因修饰。作为向导RNA的浓度,例如,只要为1ng/μL以上且300ng/μL以下即可。
另外,在所述受精卵来自基因修饰非人动物(特别是,非人哺乳动物)的情况下,导入向导RNA后,将所述受精卵移植至对应的非人动物的子宫或输卵管中并使其发育,从而能够简便地获得基因修饰非人动物。
在修饰一个目的基因的两个位点以上的情况下、或者在将两个以上的多个基因作为目的基因的情况下,设计两种以上在5’末端区域包括由与各基因的碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸的向导RNA并进行导入即可。由此,能够同时高效地编辑多个不同的基因或同一基因内的多个位点。
在本实施方式的方法中,可以将外源基因与向导RNA一同导入。通过将外源基因一起导入,从而在切断目的基因后,通过同源重组能够获得具有外源基因被插入到目的基因而成的核基因组的基因修饰非人生物。
另外,优选外源基因不具有PAM序列。在外源基因中,例如,在通过不改变氨基酸序列的单碱基置换等将PAM序列改变为nonPAM序列的情况下,能够通过同源重组将外源基因插入到核基因组上,进一步地,能够防止插入的外源基因再次被内部存在的Cas9切断。
对于外源基因而言,优选使用包括该外源基因的载体导入。另外,对于包括外源基因的载体而言,优选的是,在外源基因的5’末端和3’末端连接具有与目的基因的进行插入的部位相同的序列的DNA。作为具有与目的基因的进行插入的部位相同的序列的DNA的碱基数,优选为100碱基以上且300碱基以下。对于包括外源基因的载体而言,上述<基因修饰非人生物>中记载的启动子、聚腺苷酸化信号、NLS、荧光蛋白质的标志物基因等可以可操作地连接于外源基因的5’末端或3’末端。
在本说明书中使用的情况下,“载体”是实现或促进实体从一个环境移行至另一环境的工具。作为例子,在重组DNA技术中使用的一些载体能够使DNA片段(例如异源DNA片段;例如异源cDNA片段)等实体移行至非人生物的细胞中。在本实施方式中,载体包含病毒载体(例如,慢病毒载体、杆状病毒载体、腺病毒/腺相关病毒载体等)、细菌载体、原生动物载体、DNA载体或能包含这些重组的重组载体。
[切断工序]
在体外或体内,在温和条件下将所述向导RNA与在来自所述基因修饰非人生物的细胞、来自所述基因修饰非人生物的卵细胞、或者来自所述基因修饰非人动物的受精卵内表达的Cas9混合,从而形成Cas9-向导RNA复合体。温和条件表示蛋白质不分解或不变性的温度和pH,只要温度为4℃以上且40℃以下即可,只要pH为4以上且10以下即可。因此,在活的基因修饰非人生物的生物体内也能够形成所述Cas9-向导RNA复合体。
对于所述Cas9-向导RNA复合体而言,向导RNA的一部分与目的基因结合,Cas9识别目的基因中的PAM序列。接着,在位于上游3个碱基处的切断部位切断所述目的基因,制备平滑末端。更具体地说,Cas9识别PAM序列,以PAM序列为起点,目的基因的双螺旋结构解开,与向导RNA中的与目的基因互补的碱基序列进行退火,从而目的基因的双螺旋结构部分松散。此时,Cas9在位于PAM序列的上游3个碱基处的切断部位切断目的基因的磷酸二酯键,产生平滑末端。
[修饰工序]
接着,在通过所述向导RNA和所述目的基因的互补结合确定的区域内,能够获得根据目的实施了修饰的目的基因。
在本说明书中,“修饰”是指目的基因的碱基序列发生变化。例如,可举出目的基因的切断、由切断后的外源性序列的插入(物理插入或利用由同源定向修复介导的复制进行的插入)引起的目标双链多核苷酸的碱基序列的变化、由切断后的非同源末端连接(NHEJ:切断产生的DNA末端彼此再次结合)引起的目的基因的碱基序列的变化等。通过本实施方式的目的基因的修饰,能够将突变导入目的基因、或者破坏目的基因的功能。
因此,在本实施方式中,在使用所述受精卵的情况下,能够容易地制备目的基因的功能被破坏(敲除)或置换(敲入)的基因修饰非人生物。
<用途以及有效利用方法>
在一实施方式中,本发明提供用于执行基因修饰的方法及组合物。与以往已知的靶向基因重组的方法相比,本发明的执行高效且廉价,而且能够适用于任意细胞或生物。细胞或生物的目的基因的任意片段均能通过本发明的方法修饰。该方法利用了全部细胞中内源性的同源重组过程以及非同源重组过程。
另外,在一实施方式中,本发明提供一种进行靶向DNA插入或靶向DNA缺失的方法。该方法包括使用包含供体DNA的核酸构建体转化细胞的工序。对于与目的基因切断后的DNA插入和DNA缺失相关的方案而言,本领域技术人员能够按照公知的方法确定。
另外,在一实施方式中,本发明用于体细胞和生殖细胞两种细胞,在特定的基因座提供基因操作。
另外,在一实施方式中,本发明提供一种用于在体细胞中破坏基因的方法。此处,基因过量表达对细胞或生物有害的产物,表达对细胞或生物有害的产物。这种基因能在疾病中产生的一种以上的细胞型中过量表达。利用本发明的方法破坏所述过量表达的基因,能给遭受因所述过量表达的基因导致的疾病的个体带来更好的健康。
即,细胞中仅很小比例的基因的破坏起作用,减少表达水平,能产生治疗效果。
另外,在一实施方式中,本发明提供一种用于在生殖细胞中破坏基因的方法。能选择出特定基因被破坏的细胞能以制备不具有特定基因的功能的生物。在所述基因被破坏的细胞中,基因能完全被敲除。该特定细胞中的功能缺失能具有治疗效果。
另外,在一实施方式中,本发明还提供编码基因产物的供体DNA的插入。在该基因产物组成性表达的情况下,具有治疗效果。
例如,可举出将所述供体DNA插入遭受糖尿病的个体以在胰腺细胞的个体群中插入活性启动子和编码胰岛素基因的供体DNA的方法。然后,包括外源性DNA的胰腺细胞的所述个体群生成胰岛素,能够治疗遭受糖尿病的个体。
另外,将所述供体DNA插入农作物,能引起药物相关基因产物的生成。将蛋白质产物的基因(例如,胰岛素、脂肪酶、血色素等)与控制单元(组成性活性启动子或诱导型启动子)一起插入植物,在植物中能生成大量的药品。然后,这种蛋白质产物能从植物中分离。基因修饰植物或基因修饰生物能通过使用核酸移入技术(McCreath,K.J.等(2000)Nature405:1066-1069;Polejaeva,I.A.等,(2000)Nature 407:86-90)的方法制备。组织型特异性载体或细胞型特异性载体能用于提供仅在选择的细胞内的基因表达。
另外,在一实施方式中,本发明用于生殖细胞内,以计划的方式插入,可选择的细胞是之后的全部细胞分裂具有所设计的基因性修饰的细胞。
另外,在一实施方式中,本发明能应用于全部生物、培养细胞、培养组织、培养核(包括能用于将完整的生物再生的细胞、组织或细胞核)、配子(例如,这些生物发育的各个阶段的卵子或精子)。
另外,在一实施方式中,本发明能应用于来自任意生物(可举出昆虫、真菌、啮齿类、牛、绵羊、山羊、鸡、其他在农业上重要的动物、以及其他哺乳动物(可举出狗、猫和人,但并不限定于这些哺乳动物),但并不限定于这些动物)的细胞。
另外,在一实施方式中,本发明能应用于病理学动物模型(例如,病理学模型小鼠)的制备。
另外,在一实施方式中,本发明能用于植物。作为植物,没有特别的限定,能用于任意的各种植物种(例如,单子叶植物或双子叶植物等)。
实施例
下面,举出实施例等进一步地对本发明进行详细描述,但本发明并不限定于这些实施例等。
[实验材料]
将本实施例中使用的向导RNA和引物的碱基序列示于以下表1~3中。在表1中,粗体(碱基序列的3’侧的3个碱基)示出了与目的基因上的PAM序列相同的碱基序列。
表1
向导RNA
表2
引物1
表3
引物2
表4
脱靶分析用引物
另外,上述向导RNA通过以下的方法制备。
首先,使用pgRNA-GFP-T1载体(#41819,艾德基因(Addgene)公司制)作为模板,通过PCR对在5’末端附加有TTTTTT位点的向导RNA进行扩增。接着,将向导RNA插入pBluescript II载体(安捷伦科技(Agilent Technologies)公司制),获得pBS-T7-gRNA质粒。得到的质粒上的向导RNA碱基序列通过序列分析确认。
接着,使用MEGAshortscript(注册商标)T7试剂盒(美国生命技术(LifeTechnologies)公司制),由用EcoRI线状化的质粒制备向导RNA。
[实施例1]Cas9高表达小鼠系的建立
(1)Cas9基因插入用构建体的设计
以包括Cas9基因(碱基序列:序列号17)的phCas9(艾德基因公司制)为模板,使用Cas9ATG-S引物和Cas9Cla-A进行PCR,获得扩增后的基因产物,所述Cas9基因是通过基因合成将密码子最优化后的Cas9基因。接着,通过PCR将SV40核定位序列(NLS)和Flag标签的碱基序列或者仅Flag标签的碱基序列插入Cas9基因的起始密码子(ATG)之后。由此,获得NFCas9(具有NLS和Flag标签的Cas9基因)和FCas9(仅具有Flag标签的Cas9基因)。
接着,分别将NFCas9和FCas9插入pCAGGS载体的EcoRI位点,构建pCAG-NFCas9pA和pCAG-FCas9pA。
用NotI分别将这些基因进行线状化,对CAG-NFCas9pA和CAG-FCas9pA部位进行纯化(参照图1A)。
(2)注射到小鼠受精卵中
在本实施例中,从日本克莱公司(CLEA Japan,Inc.(クレアジャパン株式会社))购入BDF1系统、C57BL6/J-Jcl系统(以下,称为“B6”)和ICR系统的小鼠并使用。
使用的受精卵通过常规的体外受精(in vitro fertilization:IVF)方法使雄性B6小鼠的精子与雌性BDF1小鼠的卵细胞受精而制备。
然后,将包含(1)中制备的两种Cas9基因的载体分别以浓度成为2ng/μL的方式制备注射溶液。接着,将注射溶液注射到小鼠受精卵(在NFCas9的情况下,为56个,在FCas9的情况下,为83个)的前核。接着,将导入了基因的受精卵移植到雌性假妊娠ICR小鼠的输卵管,获得Cas9转基因小鼠的F1代。Cas9导入的鉴定通过使用CAG1620-S引物和CAS9215-A引物的PCR进行。其结果是,建立4系NFCas9小鼠,建立5系FCas9。将各系的特征示于图2A。
根据图2A,证实了在2系NFCas9小鼠和5系FCas9小鼠中Cas9导入基因均传递给子鼠。
另外,通过定量实时PCR、RT-PCR以及免疫印迹分析(参照图2C)确认了Cas9在从上述全部7系F1子代中分离的成纤维细胞中的表达。
此外,采用定量实时PCR制作Cas9的标准曲线(图2B参照)的方法如下所述。
使用作为模板包含100ng的基因组DNA以及pCAG-NFCas9载体或pCAG-FCas9载体的稀释系列(每100ng基因组DNA,1、2、4、8、16、32、64以及128倍的拷贝)的DNA溶液进行PCR,根据得到的PCR产物的量绘制标准曲线。
根据图2A,在建立的小鼠中,NFCas9-2系为Cas9高表达,用于以后的解析。
(3)确认在NFCas9-2系中的导入了Cas9的基因座
通过使用EcoRV splinkerette寡核苷酸(sp-EV上游引物和sp-下游引物)的splinkerette PCR(spPCR)(参照Potter,C.J.&Luo,L.Splinkerette PCR for mappingtransposable elements in Drosophila.PloS One 5,e10168(2010)),鉴定在NFCas9-2系中的导入了Cas9的基因座。进一步地,为了确保spPCR的结果,使用Gtpbp10-S引物、Sp#2引物、Cas9E-S引物、CAGGS-A引物和Gtpbp10-A引物得到NFCas9-2系的基因组DNA的PCR产物。将结果示于图3A~图3C。
根据图3A~图3C,明确了NFCas9-2系在细胞内具有9个NFCas9导入基因,这些导入基因插入到Gtpbp10基因中。
[试验例1]NFCas9-2系小鼠的遗传学、形态学以及生理学性质的确认试验
(1)使用NFCas9-2系小鼠的交配
使NFCas9-2系的雄性或雌性小鼠与NFCas9-2系的小鼠、野生型的BDF1系统或野生型的B6系统的小鼠进行交配。其结果是,虽然未显示出详细的数据,但导入基因在子代中的繁殖率符合孟德尔法则。
另外,对于NFCas9-2系,NFCas9以纯合子导入的个体也正常生长,其平均产仔数与BDF1系统的野生型小鼠相同(6仔/产出)。
(2)恒定的Cas9mRNA的表达量的确认
通过定量实时PCR确认从NFCas9-2系小鼠中分离的各组织中的Cas9mRNA。将结果示于图1B。
根据图1B可知,特别是在心脏、肌肉和精巢中Cas9mRNA的表达高。
(3)NFCas9-2系小鼠的形态变化的确认
使NFCas9-2系雌性小鼠与野生型的BDF1系统的小鼠进行交配。接着,分别测量得到的作为同窝仔的NFCas9杂合型(以下,称为“Tg/+小鼠”)的小鼠以及不具有NFCas9的小鼠(以下,称为“+/+小鼠”)的4周龄至10周龄的体重。将结果示于图1C。
根据图1C,在Tg/+小鼠和+/+小鼠中具有体重增加相同的倾向,未观察到形态变化的差异。
另外,在Tg/+小鼠和+/+小鼠中取出各组织,制备组织切片。接着,通过常规方法进行苏木精和伊红染色。将结果示于图1D。
根据图1D,对Tg/+小鼠而言,在观察到Cas9mRNA高表达的心脏、肌肉和精巢中,未观察到其与+/+小鼠的形态差异。
(4)NFCas9-2系小鼠的生理学标志物的确认
从10周龄的Tg/+小鼠和+/+小鼠中采取血液,委托SRL株式会社检查通常作为血清中的生理学标志物为人所知的血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)。将结果示于图1E。
根据图1E确认各种生理学标志物。
[试验例2]Ramp2基因修饰试验
对于来自Cas9小鼠的受精卵,作为母性因子的Cas9的mRNA和蛋白质(两者或任意一个)(以下,称为maCas9)在细胞内蓄积,认为在基因组编辑中不需要Cas9导入基因,进行以下的试验。
(1)向导RNA的导入
仅将针对Ramp2基因修饰的R2-gRNA(序列号27)显微注入通过各种交配对的人工授精得到的受精卵的前核。将通过交配制备的受精卵的基因型示于图4A。另外,将R2-gRNA中的与Ramp2基因相同的碱基序列示于图4C。在图4A中,接着,在钾单纯形优化培养基(potassium-supplements simplex-optimized medium,KSOM)中将注入的受精卵培养至囊胚。
(2)Cas9基因型判定
使用与实施例1(3)相同的方法对囊胚中的1个胚胎判定Cas9基因型。将结果示于图4B。
(3)T7核酸内切酶I(T7EI)分析
使用Ramp2-5S引物和Ramp2-6A进行PCR,从囊胚中的1个胚胎的核提取液中获得PCR产物。在PCR产物中加入T7核酸内切酶I(新英格兰生物学实验室日本(New EnglandBiolabs Japan)公司制),获得DNA片段。接着,通过琼脂糖电泳确认切断片段。将结果示于图4D。
根据图4B和图4D明确了:使Tg/+小鼠彼此进行人工受精或者使Tg/+雌性小鼠和+/+雄性小鼠进行人工授精的情况下,插入/缺失(insertion-deletion,indel)突变(因碱基的插入或缺失导致的遗传突变)以92~94%的高比率产生。因此,可知通过Tg受精卵内的Cas9能够进行高比率的基因组编辑。
另一方面,在+/+雌性小鼠和Tg/+雄性小鼠进行人工授精的情况下,indel突变为23%的低比率。进一步地,通过研究囊胚的基因型与基因组编辑能力的相关性,发现了在不存在Cas9导入基因的囊胚中indel突变也以高比率发生。
另外,根据图4B,在Tg/+小鼠之间实施体外受精或者在Tg/+雌性小鼠与+/+雄性小鼠之间实施体外受精的情况下,全部+/+囊胚均在Ramp2基因座(5+7/5+7)具有突变。已知在受精卵期的细胞中,基因组上的基因尚未表达。基因组上的基因的转录物逐渐产生直至2细胞期。
因此,根据本次结果,认为maCas9的mRNA和蛋白质(两者或任意一个)承担着受精卵中的基因组编辑的作用。
另外,如图4B所示,作为其他系的FCas9-13也能够确认该现象。
[试验例3]Ramp1基因和Ramp2基因修饰试验
(1)向导RNA的导入
将针对Ramp1基因修饰的R1-gRNA(序列号26)、针对Ramp2基因修饰的R2-gRNA(序列号27)中的任意一个或两者显微注入使Tg/+雌性小鼠和+/+雄性小鼠进行人工授精而得到的受精卵的前核。接着,在钾单纯形优化培养基(KSOM)中将注入的受精卵培养至囊胚。将同时导入R1-gRNA和R2-gRNA的囊胚的一部分移植至雌性假妊娠的ICR系统小鼠的子宫。得到自移植开始起13.5天~15.5天后的胎儿。将从移植开始13.5天后的10只胎儿的形态示于图6B。
(2)有无突变的判定
使用Ramp1-2S引物和Ramp1-2A引物以及Ramp2-5S引物和Ramp2-6A对囊胚中的1个胚胎的核提取液或由从移植开始13.5天后的胎儿的尾或手制备的DNA溶液进行PCR,得到PCR产物。接着,使用BigDye终止剂v.3.1和ABI基因分析仪3130Ramp1对PCR产物进行序列分析。判定Ramp1基因和Ramp2基因有无突变。将结果示于图5A(囊胚)、以及图6A和图6D(从移植开始13.5天后的胎儿)。
(3)T7EI分析
使用与试验例2(3)同样的方法对囊胚中的1个胚胎的核提取液或由从移植开始13.5天后的胎儿的尾或手制备的DNA溶液进行T7EI分析。对于导入R1-gRNA的囊胚而言,使用Ramp1-2S引物和Ramp1-2A引物。将结果示于图5B(囊胚)或图6C(从移植开始13.5天后的胎儿)。
根据图5A和图5B,在仅将R1-gRNA注入受精卵的情况下,仅在Ramp1基因座观察到indel突变。在仅将R2-gRNA注入受精卵的情况下,也确认了同样的结果。在同时注入R1-gRNA和R2-gRNA的情况下,在两个基因座同时观察到诱变。
由此,通过囊胚能够确认在仅注入向导RNA的受精卵中的基因组编辑对目的基因座特异性地发挥作用。
进一步地,考察来自同时注入R1-gRNA和R2-gRNA的受精卵(Tg/+雌性小鼠×+/+雄性小鼠)的胎儿期的indel突变,结果几乎全部为杂合或纯合基因修饰胎儿(参照图6A)。
另外,对于由得到的10只胎儿(使用图6A中记载的实验1)的尾或手制备的DNA溶液而言,通过使用上述表所示的脱靶分析用引物的PCR考察Ramp1基因和Ramp2基因上各假定的三种脱靶部位处有无突变。其结果是,一个突变也没有观察到。
[试验例4]与以往方法的比较试验1
接着,对将合成的Cas9mRNA和向导RNA显微注入受精卵的基因组编辑法和使用本发明的maCas9的基因组编辑法实施比较研究。
(1)向导RNA的导入
通过使用Tg/+卵细胞和+/+精子的人工授精制备含有maCas9的受精卵。接着,仅将R2-gRNA(25ng/μL)显微注入含有maCas9的受精卵(基因型;Tg/+或+/+)的细胞质和前核。作为对照,将合成Cas9mRNA(50ng/μL)和R2-gRNA(25ng/μL)两者注入野生型受精卵(不含有maCas9,基因型+/+)的细胞质和前核。将这些受精卵培养至囊胚。
(2)基因型和有无突变的判定
使用与实施例1(3)同样的方法判定基因型。进一步地,使用与试验例3(2)同样的方法判定有无突变。将结果示于图7A。
(3)T7EI分析
使用与试验例2(3)同样的方法对具有杂合突变体(单等位基因或多等位基因)的囊胚进行T7EI分析。将结果示于图7B。
在图7B中,对于通道2的“<Indel 50%”而言,两个切断的谱带的总强度比双亲的谱带小。另外,对于通道1和4的“Indel 50%”而言,两个切断的谱带的总强度与双亲的谱带大致相同。对于通道3的“多等位基因突变”而言,生成两个以上的切断的谱带。
根据图7A,目标部位的突变的诱导率和indel突变型(纯合(双等位基因)、单等位基因或多等位基因KO)与三种实验组(maCas9保持+/+和Tg/+受精卵和对照组(maCas9非保持+/+受精卵))在统计学上相同(p>0.05,单因素方差分析)。另外,maCas9保持+/+和Tg/+受精卵中的非镶嵌突变型(50%indel突变)和镶嵌型(<50%单等位基因indel突变和多等位基因突变)也与对照组在统计学上相同(p>0.05,单因素方差分析)。进一步地,观察到与maCas9保持Tg/+受精卵和对照组相比maCas9保持+/+受精卵中的多等位基因镶嵌型突变具有诱导率低的倾向,maCas9保持+/+受精卵中的多等位基因非镶嵌型突变(50%indel突变)具有诱导率高的倾向。
另外,在由注入R2-gRNA的maCas9保持受精卵产生的囊胚中,通过使用上述表所示的脱靶分析用引物的PCR考察假定的三种脱靶部位处的碱基序列有无突变。其结果是,一个位点的突变都未产生。
由此,认为maCas9的基因组编辑能力与将合成Cas9注入受精卵的方法的相同。另外,可知对于使用maCas9的基因组编辑而言,与以往的将合成Cas9注入受精卵的方法相比,镶嵌型突变显著減少。
[试验例5]同时确认多个基因突变的试验
接着,考察maCas9在不存在Cas9导入基因的胚胎中能够同时诱导的突变的个数。
(1)向导RNA的导入
将9种不同的向导RNA显微注入通过Tg/+雌性小鼠和+/+雄性小鼠的体外受精而准备的受精卵中。作为靶的基因为Ramp1基因、Ramp2基因、Amy基因、Crlr基因、Et-1基因、Hprt基因、Imdn基因和Klf5基因9种。向导RNA的序列如上表的“向导RNA”、图4C和图8所示。作为对照,将上述9种向导RNA和合成的Cas9mRNA显微注入通过+/+雌性小鼠和+/+雄性小鼠的体外受精而准备的受精卵中(参照图9C)。
(2)基因型和有无突变的判定
使用与实施例1(3)同样的方法判定基因型。进一步地,使用与试验例3(2)同样的方法判定有无突变。此时,作为引物,使用上述表<引物>所示的Amy-1S引物和Amy-1A引物、Crlr-5S引物和Crlr-5A引物、Et-1-1S引物和Et-1-1A引物、Hprt-1S引物和Hprt-1A引物、Imdn-1S引物和Imdn-1A引物、Klf5-1S引物和Klf5-1A引物、Ramp1-2S引物和Ramp1-2A、Ramp2-5S引物和Ramp2-6A。将结果示于图9A。
(3)T7EI分析
使用与试验例2(3)同样的方法进行T7EI分析。将结果示于图9B。使用的引物与本试验例(2)举出的引物相同。
根据图9A和图9C,能够确认使用本发明的方法的囊胚在平均7.3基因座处同时产生indel突变,其与对照组相同。另外,对于9种indel突变,同时在来自maCas9保持+/+和Tg/+受精卵的囊胚中分别观察到2例。
进一步地,重要的是,使用本发明的方法的囊胚发生率为42~50%,而对照组的囊胚发生率为5~19%,对于获得子鼠而言太低。
由此,含有maCas9的受精卵能够同时在多基因座中导入突变,可以说对于多基因的基因修饰小鼠的制备极其有用。
[试验例6]在体外的基因修饰试验
然后,为了验证体外的基因修饰的Cas9小鼠的实用性,尝试破坏与细胞表面的α-Gal表位的合成有关的Ggat1基因。在图10A中示出本试验的方法。
(1)向导RNA的导入
从Cas9小鼠的Tg/+和+/+子鼠的尾部对成纤维细胞进行原代培养。培养,使用含有10%牛血清的杜尔贝科(Dulbecco)改良伊格尔(Eagle)培养基(Dulbecco's ModifiedEagle's Medium,DMEM)培养5天。接着,通过使用基因脉冲II(美国伯乐公司制)的电穿孔法将溶解在磷酸缓冲生理盐水(不含钙和镁,pH7.4)中的100μg/mL的Ggta1gRNA(序列号22)瞬时导入培养的5×106个成纤维细胞中。将与Ggta1gRNA中的Ggat1基因相同的碱基序列示于图10B。
(2)T7EI分析
通过使用Ggta1-S引物和Ggta1-A引物的PCR,利用导入向导RNA后的成纤维细胞的破碎液制备PCR产物。接着,使用与试验例2(3)同样的方法进行T7EI分析。将结果示于图10C。
根据图10C,证实了仅在Ggta1基因内产生indel突变。
(3)FACS(Fluorescence-activated cell sorting,荧光激活细胞分选)解析
使用导入向导RNA后的成纤维细胞进行有效利用了FITC(fluoresceinisothiocyanate,异硫氰酸荧光素)-标记同工凝集素、BS-I-B4(IB4)特异性识别α-Gal表位的FACS解析。将结果示于图10D。
根据图10D,能够确认作为目标的α-Gal表位表达減少(与野生型细胞相比,减少~30%)。
(4)存活分析
通过皂草素复合物IB4(IB4SAP)对导入向导RNA后的成纤维细胞进行处理。观察到具有2个Ggta1基因的(+/+型)细胞和敲除1个Ggta1基因的(KO/+型)细胞的死亡。另一方面,观察到认为是双等位基因Ggta1KO的细胞的存活(参照图10E)。推定其存活率是每5×105细胞为20个(菌落),由此推定的基因缺失的诱导效率为~0.004%。
由此,确认了由Cas9小鼠系制备的原代培养细胞仅通过导入向导RNA就能引起CRISPR/Cas9的基因组编辑。
[试验例7]在体内的基因修饰试验
为了证明Cas9小鼠能够通过给予向导RNA进行体内基因组编辑,尝试通过水动力学(Hydrodynamic)的向导RNA导入法进行肝细胞的基因破坏。将本试验的方法示于图11A。
(1)向导RNA的导入
使用TransIT-QR水动力学注射试剂盒(TransIT-QR Hydrodynamic DeliverySolution kit)(米瑞思生物(Mirus Bio)公司制)将120μg的白蛋白(Alb)gRNA(序列号18)和4μg的pCAG-EGFPpA同时注入Cas9小鼠和野生型小鼠的尾静脉。将与AlbgRNA中的Alb1基因相同的碱基序列示于图11B。
接着,从各小鼠中分离肝细胞。通过该方法以0.1%(1/1000细胞)的比率获得EGFP阳性细胞。
(2)T7EI分析
从来自Cas9小鼠的肝细胞中分离30个EGFP阳性细胞和30个阴性细胞。同样地,也从来自野生型小鼠的肝细胞中分离30个EGFP阳性细胞和30个阴性细胞。接着,通过使用Alb-7S引物和Alb-7A引物的PCR,利用这些细胞的各破碎液制备PCR产物。接着,使用与试验例2(3)同样的方法进行T7EI分析,考察有无indel突变。将结果示于图11C。
根据图11C,仅在来自EFGP阳性的Cas9小鼠的肝细胞中观察到约为50%(15/30)的比率的Alb1基因indel突变,计算出引起该突变的肝细胞的比率为0.05%(1/2000细胞)。在来自EGFP阴性的Cas9小鼠的肝细胞、来自EGFP阳性的野生型小鼠的肝细胞以及来自EGFP阴性的野生型小鼠的肝细胞中,未观察到Alb1基因indel突变。
根据上述结果可知,在体内给予向导RNA会导致在Cas9小鼠内部存在的目的基因的indel突变。
[试验例8]与以往方法的比较试验2
根据上述试验例4表明了:根据Ramp2gRNA注入受精卵及其囊胚期的解析,maCas9的基因组编辑能力与将合成Cas9mRNA注入受精卵的方法相同,而且,maCas9保持+/+受精卵中的多等位基因镶嵌型基因组突变的诱导率与maCas9保持Tg/+受精卵和对照组相比有降低的倾向。为了更有力地证明该见解,将作为其他基因的gRNA的ET-1-gRNA导入受精卵,使该受精卵发育直至12.5-13天龄的胎儿,考察Indel突变率和镶嵌率。
(1)向导RNA的导入
通过使用Tg/+卵细胞和+/+精子的人工授精制备含有maCas9的受精卵。接着,使用电穿孔法仅将ET-1-gRNA(200ng/μL)导入含有maCas9的受精卵(基因型;Tg/+或+/+)的细胞质和前核中。作为对照组,使用电穿孔法将合成Cas9mRNA(100ng/μL)和ET-1-gRNA(200ng/μL)两者导入野生型受精卵(不含有maCas9;基因型+/+)。将这些受精卵培养至囊胚。将导入了ET-1-gRNA的各囊胚移植至雌性假妊娠的ICR系统小鼠的子宫中。得到自移植开始12.5~13天后的胎儿。将从移植开始12.5~13天后的10只胎儿的形态示于图12B。
(2)基因型和有无突变的判定
使用与实施例1(3)同样的方法判定基因型。进一步地,除了使用Et-1-1S引物和Et-1-1A引物以外,使用与试验例3(2)同样的方法判定有无突变。另外,在Tg/+和+/+以及对照组中随机选择Et-1KO表现型的胎儿(各N=5)并解析,计算镶嵌率。将结果示于图12C。
根据图12A,对于Indel突变而言,相对于对照组75%,Cas9小鼠的Tg/+和+/+胎儿均为100%,为高比率。
另外,根据图12B,在Et-1敲除(KO)表现型中观察到颚形成异常。
根据图12A,对于Et-1KO表现型而言,对照组为50%,相对于此,Cas9小鼠的Tg/+和+/+胎儿分别为50%和44%。
另外,根据图12C,对于镶嵌率而言,在Cas9小鼠的Tg/+和+/+胎儿中,大部分有两种Indel突变,得到一种Indel突变(纯合:只有相同的突变基因组)。另一方面,对照组大部分有三种Indel突变。
根据以上结果表明了:maCas9的基因组编辑能力与将合成Cas9mRNA注入受精卵的方法相同,与以往的Cas9mRNA/gRNA注入法相比,镶嵌率低,maCas9的基因组编辑能力的特性(高比率性和低镶嵌率)在Et-1基因中也再次得到证明。
[试验例9]gRNA导入时的研究试验
研究了gRNA导入至来自Cas9小鼠的受精卵的时间差对Indel率和镶嵌率造成的影响。
(1)向导RNA的导入
通过使用Tg/+卵细胞和+/+精子的人工授精制备含有maCas9的受精卵。接着,使用电穿孔法仅将ET-1-gRNA(200ng/μL)导入从授精开始6~8小时后或10~12小时后的含有maCas9的受精卵(基因型;Tg/+或+/+)的细胞质和前核中。将这些受精卵培养至囊胚。
(2)基因型和有无突变的判定
使用与实施例1(3)同样的方法判定基因型。进一步地,除了使用Et-1-1S引物和Et-1-1A引物以外,使用与试验例3(2)同样的方法判定有无突变。另外,在Tg/+和+/+中,随机选择Et-1KO表现型的胎儿(各N=5)并解析,计算镶嵌率。将结果示于图13。
根据图13,在授精后6~8小时后以及10~12小时后,导入了gRNA的任意受精卵均为高Indel率(在任意条件下均为100%)。
在Tg/+囊胚中,在从授精开始6~8小时后以及10~12小时后的条件下进行比较时,观察到在10~12小时后的条件下,单一Indel基因组突变比率减少,多等位基因镶嵌型突变增加。
另一方面,在从授精开始6~8小时后以及10~12小时后的条件下的+/+囊胚中,未观察到单一Indel基因组突变和多等位基因镶嵌型突变的比率发生变化。推测这是因为,与早期导入的gRNA相比,后期导入的gRNA未分解且存在更长时间。进一步地,由于基因型为Tg/+胚胎,因此,认为来自接合子的Cas9有可能被转录和翻译而发挥作用。
由此,确认了由gRNA导入Tg/+的受精卵的时间差造成的Indel基因组突变数的变化。暗示了为了减少多等位基因镶嵌型突变,优选在更早的时间将gRNA导入受精卵。另一方面,暗示了为了得到具有大量多等位基因镶嵌型突变的个体,只要有效利用后期受精卵即可。
[试验例10]gRNA浓度的研究试验
研究导入的gRNA浓度的变化对Indel突变能力造成的影响。
(1)向导RNA的导入
通过使用Tg/+卵细胞和+/+精子的人工授精制备含有maCas9的受精卵。接着,使用电穿孔法仅将ET-1-gRNA以25ng/μL、80ng/μL和200ng/μL三种不同的浓度导入从授精开始6~8小时后的含有maCas9的受精卵(基因型;Tg/+或+/+)的细胞质和前核中。将这些受精卵培养至囊胚。
(2)基因型和有无突变的判定
使用与实施例1(3)同样的方法判定基因型。进一步地,除了使用Et-1-1S引物和Et-1-1A引物以外,使用与试验例3(2)同样的方法判定有无突变。另外,在Tg/+和+/+中,随机选择Et-1KO表现型的胎儿(各N=5)并解析,计算镶嵌率。将结果示于图14。
根据图14,在25ng/μL、80ng/μL以及200ng/μL中的任意浓度条件下,Indel突变均为90~100%的高比率。在导入200ng/μL的ET-1-gRNA条件下,未观察到非Indel突变(野生),仅有Indel突变基因组的胚胎达到0%。
另外,观察到每个胚胎的Indel突变数以浓度依赖方式增加。即,在导入25ng/μL的ET-1-gRNA条件下,实际上80%为一种Indel突变(包括纯合(仅相同的突变型基因组)和杂合(仅野生型和一种Indel突变型基因组))。另一方面,在导入80ng/μL和200ng/μL的ET-1-gRNA条件下,分别减少至60%和20%。
另外,观察到两种Indel突变(仅有两种Indel突变型基因组,以及包括野生型和两种Indel突变型基因组)增加。
由此可知通过改变导入的gRNA浓度,能够改变胚胎Indel突变基因组数。
在低浓度条件(25ng/μL)下,大部分为由野生型和一种Indel突变型基因组构成的胚胎。认为这些是特别适合于产生纯合型突变的情况、要避免致死性突变而得到基因修饰个体的情况、优先期望杂合突变个体的情况的特性。
[试验例11]将外源基因敲入Klf5基因的试验
通过将外源基因敲入Klf5基因的试验,验证了在来自Cas9小鼠的受精卵中也能够敲入外源基因。
(1)向导RNA和外源基因(KI片段)的设计
如图15A所示,在Klf5基因的翻译起始的atg碱基附近设计了gRNA(Klf5gRNA2:序列号79)。进一步地,作为敲入序列(KI片段)合成包括Flag-tag序列的约100bp的外源基因(总计约1kb)(KI片段:序列号80),所述Flag-tag序列在5’和3’方向将约500bp的相同的DNA序列连接在该区域。
(2)向导RNA的导入
通过使用Tg/+卵细胞和+/+精子的人工授精制备含有maCas9的受精卵。另外,通过使用+/+卵细胞和+/+精子的人工授精制备对照组的受精卵。接着,将(1)中制备的Klf5gRNA2(10ng/μL)和(1)中制备的KI片段(3.3ng/μL)显微注入从授精开始10~12小时后的含有maCas9的受精卵(基因型;Tg/+或+/+)的细胞质和前核中。另外,将(1)中制备的Klf5gRNA2(10ng/μL)以及(1)中制备的KI片段(3.3ng/μL)和Cas9mRNA(33ng/μL)显微注入同时期的对照组的受精卵的细胞质和前核中。将这些受精卵培养至囊胚。
(2)基因型和有无突变的判定
使用与实施例1(3)同样的方法判定基因型。另外,由各囊胚制备PCR用的溶解液,从KI片段的相同序列开始,使用设定为外部基因组DNA序列的PCR引物(Klf5-1S引物(序列号52)和Klf5-1A引物(序列号53))实施PCR。根据是否存在来自野生型PCR产物(约1.1kb)的约0.1kb尺寸的大PCR产物(约1.2kb)来判定敲入的Klf5基因。将结果示于图15B和图15C。
根据图15B,在编号1和编号10的样品中检测到比约1.2kb的野生型PCR产物更大的PCR产物。
另外,根据图15C,在来自Cas9小鼠受精卵的囊胚的30个胚胎中,7个胚胎为敲入胚胎(23%)。另一方面,在来自对照受精卵的囊胚的19个胚胎中,4个胚胎为敲入胚胎(21%)。
由此可知,能够使用含有maCas9的受精卵进行外源基因的敲入,其效率与以往的Cas9mRNA/gRNA注入法相同。
[实施例2]全身表达切口酶Cas9(D10A)的小鼠系的建立
除了上述Cas9小鼠的特性,建立全身表达兼具降低脱靶率的加工能力和基因组缺口(Nick)加工能力的切口酶Cas9的转基因小鼠的切口酶Cas9(D10A)小鼠。
(1)Cas9基因插入用构建体的设计
以实施例1中构建的pCAG-NFCas9pA和pCAG-FCas9pA为模板,使用NFL(D10A)S引物(序列号81)和NFL(D10A)A引物(序列号82)进行PCR,构建将Cas9的第10个氨基酸由D置换为A的Cas9(D10A)载体。
(2)注射入小鼠受精卵
使用的受精卵通过常规的体外受精(in vitro fertilization:IVF)方法使雄性B6小鼠的精子和雌性BDF1小鼠的卵细胞受精来制备。
接着,将(1)中制备的两种Cas9(D10A)载体分别以浓度成为2ng/μL的方式制备注射溶液。然后,将注射溶液注射到小鼠受精卵的前核中。接着,将导入了基因的受精卵移植至雌性假妊娠ICR小鼠的输卵管中,获得切口酶Cas9(D10A)转基因小鼠的F1代。
(3)基因型的判定
使用与实施例1的(3)同样的方法判定成长的F1代的30只子鼠的基因型。通过使用CAG1620引物(序列号32)和Cas9 215-A引物(序列号34)的PCR进行Cas9(D10A)导入的鉴定。其结果是,6只子鼠为Tg个体。对于上述6只子鼠,与Cas9小鼠同样地目前未观察到对发育、存活造成影响。
另外,通过推进上述6只的交配,建立2系切口酶Cas9(D10A)小鼠。根据来自这2系切口酶Cas9(D10A)小鼠的子鼠的肺、卵巢等主要器官制备cDNA,使用该cDNA通过实时PCR研究Cas9(D10A)的表达,结果确认了Cas9(D10A)的表达。
工业实用性
根据本发明的目的基因的修饰方法,能够同时高效地编辑多个不同基因或同一基因内的多个位点。另外,根据本发明的目的基因的修饰方法,能够迅速且以低成本制备基因修饰非人生物。进一步地,本发明的目的基因的修饰方法能够有效用于大量基因的异常所参与的心脏病、癌等生活方式疾病的研究中、或根据全基因组关联研究(GWAS)而明确的疾病相关基因的研究中。
Claims (19)
1.一种基因修饰非人生物,其特征在于,编码Cas9的基因在核基因组中至少具有三个拷贝,所述Cas9是CRISPR相关核酸酶9。
2.如权利要求1所述的基因修饰非人生物,其中,所述Cas9为变体。
3.如权利要求2所述的基因修饰非人生物,其中,所述Cas9是缺乏对包括目标序列的目的基因的一条或两条链进行切断的活性的变体。
4.如权利要求1~3中任一项所述的基因修饰非人生物,其中,所述核基因组包括与所述编码Cas9的基因可操作地连接的CAG启动子、表达诱导型启动子、病毒性启动子或组织特异性启动子。
5.如权利要求1~4中任一项所述的基因修饰非人生物,其中,非人生物为哺乳动物。
6.如权利要求1~5中任一项所述的基因修饰非人生物,其中,将所述编码Cas9的基因串联导入所述核基因组中。
7.一种卵细胞,其特征在于,来自基因修饰非人生物,该基因修饰非人生物具有导入了编码Cas9的基因的至少三个拷贝的核基因组。
8.如权利要求7所述的卵细胞,其中,所述卵细胞在核内不具有导入了编码Cas9的基因的核基因组。
9.一种受精卵,其特征在于,使权利要求7或8所述的卵细胞与来自同种生物的精子受精而成。
10.如权利要求9所述的受精卵,其中,所述卵细胞在核内不具有导入了编码Cas9的基因的核基因组。
11.如权利要求9或10所述的受精卵,其中,所述精子来自野生型的所述同种生物。
12.一种目的基因的修饰方法,其特征在于,包括将向导RNA导入来自权利要求1~6中任一项所述的基因修饰非人生物的细胞、权利要求7或8所述的卵细胞、或者权利要求9~11中任一项所述的受精卵中的工序。
13.一种目的基因的修饰方法,其特征在于,包括:
将向导RNA导入来自权利要求1~6中任一项所述的基因修饰非人生物的细胞、权利要求7或8所述的卵细胞、或者权利要求9~11中任一项所述的受精卵中的工序;
在来自所述基因修饰非人生物的细胞、来自所述基因修饰非人生物的卵细胞、或者来自所述基因修饰非人生物的受精卵内表达的Cas9在位于PAM序列的上游的切断部位切断所述目的基因的工序,所述PAM为前间区序列邻近基序;以及
在通过所述向导RNA与所述目的基因的互补结合而确定的区域内,得到修饰后的所述目的基因的工序,
所述目的基因具有所述PAM序列,
所述向导RNA包括由与所述目的基因中的所述PAM序列的上游碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸。
14.一种目的基因的修饰方法,其特征在于,包括:
将向导RNA导入来自权利要求1~6中任一项所述的基因修饰非人生物的细胞、权利要求7或8所述的卵细胞、或者权利要求9~11中任一项所述的受精卵中的工序;
在来自所述基因修饰非人生物的细胞、来自所述基因修饰非人生物的卵细胞、或者来自所述基因修饰非人生物的受精卵内表达的Cas9在位于PAM序列的上游3个碱基处的切断部位切断所述目的基因的工序;以及
在通过所述向导RNA与所述目的基因的互补结合而确定的区域内,得到修饰后的所述目的基因的工序,
所述目的基因具有由NGG构成的PAM序列,N是从由腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及鸟嘌呤组成的组中选出的任意一个碱基,
所述向导RNA包括由与所述目的基因中的从所述PAM序列的上游1个碱基处起至上游20个碱基以上且24个碱基以下为止的碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸。
15.如权利要求12~14中任一项所述的目的基因的修饰方法,其中,在所述导入工序中,当导入对象为来自基因修饰非人生物的细胞时,将向导RNA导入活的基因修饰非人生物中。
16.如权利要求12~14中任一项所述的目的基因的修饰方法,其中,在所述导入工序中,当导入对象为来自基因修饰非人动物的受精卵时,还包括将所述受精卵移植至同种非人动物的子宫或输卵管中并使其发育的工序。
17.如权利要求12~16中任一项所述的目的基因的修饰方法,其中,在所述导入工序中,导入两种以上的所述向导RNA。
18.如权利要求12~17中任一项所述的目的基因的修饰方法,其中,在所述导入工序中,将外源基因与所述向导RNA一同导入。
19.如权利要求18所述的目的基因的修饰方法,其中,所述外源基因不具有PAM序列。
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