KR20020057943A - 트랩 벡터 및 이를 이용한 유전자 트랩법 - Google Patents

트랩 벡터 및 이를 이용한 유전자 트랩법 Download PDF

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가부시끼가이샤 트랜스제닉
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Abstract

본 발명은 역반복 서열 1, 스페이서 서열 및 역반복 서열 2의 순서로 구성되는 loxP 서열 중 역반복 서열 1의 일부 서열 또는 역반복 서열 2의 일부 서열에 변이가 도입된 변이형 loxP를 포함하는 트랩 벡터에 관한 것이다.

Description

트랩 벡터 및 이를 이용한 유전자 트랩법 {Trap Vector and Gene Trapping Method by Using the Same}
인간 게놈프로젝트의 진전으로 인간 게놈의 구조 해석은 2003년 또는 그 이전에 종료될 것이라고 여겨지고 있다. 따라서, 개별적으로 유전자를 단리하여 구조 해석을 행하는 시대가 아니라 게놈의 "기능 해석" 시대에 진입했다고 할 수 있다.
그러나, 게놈의 염기 서열만으로는 기능에 관한 정보가 충분하지 않기 때문에 기능 해석을 위한 새로운 해석계가 필요하다. 또한, 인간 게놈 해석의 하나의 큰 목표는 인간 질환의 원인 유전자에 관한 해명인데, 원인 유전자의 구조만으로는 질병을 설명할 수 없다. 또한, 환자를 이용하여 실험을 수행할 수 없으므로 발병 기작을 해석할 수 없다.
따라서, 원인 유전자의 동정 후 발병 기작의 해석과 새로운 치료법의 개발을 위해서는 모델 개체의 제작이 필수 과제가 되고 있다.
한편, 게놈을 그 구조로부터 유전자 부분과 그 이외의 부분으로 나눈다고 한다면 각각 별개의 기능을 갖는다고 여겨지며, 양자의 기능을 해석하는 것이 필요하다 (도 1). 게놈을 전체적으로 보면 개개의 유전자는 일부 기능밖에 수행하지 못하며, 게놈은 단순히 유전자의 집합체가 아니라 아직 알려져 있지 않은 기능을 갖고 있다고도 생각된다. 사실 위치 효과 돌연변이 (position effect mutation)라는 새로운 개념이 성립된 점으로부터 게놈은 기능을 알지 못하는 미지의 영역을 갖는다고 추정된다.
유전자 부분에 있어서는 조절 영역과 코드 영역이 있는데, 현재 게놈 기능 해석의 표적이 되고 있는 것은 코드 영역이다. 인간과 마우스를 비교해 보아도 유전자의 종류는 거의 동일하기 때문에, 조절 영역의 기능 해석은 중요하다. 단, 인간의 유전자와 마우스의 유전자 사이에는 종의 차이가 있다. 이 차이는 단백질의 차이가 아니라 유전자 발현 조절의 차이에 의한 것이라고 생각된다.
발현 조절에 관여하는 전사 인자 등의 기능은 유전자 코드 영역의 서열로부터 해명할 수 있다. 전사 인자가 결합하는 성분석은, 하나의 유전자의 조절 영역 내에 다수 존재하기 때문에 그 기능의 해명은 현재 시점에서 매우 곤란하다. 단, 기능 해석의 하나의 수법으로서 세균 인공 염색체를 이용하는 방법 등을 생각할 수 있다.
코드 영역의 기능 해석의 수준(대상)은 mRNA 수준, 단백질 수준, 세포 수준, 조직·장기 수준, 개체 수준이 고려된다. mRNA 수준은 DNA칩으로 대응할 수 있다고 생각된다. 한편, mRNA 이외의 수준 해석을 고려할 때, ES 세포를 이용하는 것이 가장 좋은 방법이라고 생각된다. 왜냐하면 ES 세포로부터 직접 시험관내에서각종 세포 및 조직의 유도사(誘導絲)가 개발되고 있는 것도 있으며, 금후 개발될 수 있는 가능성이 있는 것도 많기 때문이다. 또한, 개체 수준의 해석계를 확립할 수 있는 잇점도 있기 때문이다.
상기로부터 게놈의 기능 해석을 생각하는 데 있어서도 ES 세포 수준에서의 유전자 파괴와 그 마우스의 제작은 매우 중요하다는 것을 알았다.
이제까지는 ES 세포를 이용한 상동 유전자 재조합법이 유전자 파괴 마우스 제작에 있어서 주역을 담당했지만, 이것은 유전자가 파괴된 개개의 마우스를 제작한다는 전술로서가 아니라 총괄적으로 제작한다는 전략적인 입장에서 보았을 때 큰 문제점이 있다.
첫째는, 시간이 너무 많이 걸린다는 점이다. 유전자 파괴 마우스 제작에 있어서, ES 세포를 이용한 상동 재조합에 의해 넉 아웃 ES 클론을 단리하는 것이 속고 제한 단계가 되고 있다. 한명의 숙련된 연구자가 넉 아웃 ES 클론을 단리하기 위해서는 최저 3개월이 걸리기 때문에 연간 4개의 유전자를 파괴할 수 있는 것에 지나지 않는다. 따라서, 10만개의 유전자에 각각 하나의 변이를 도입하는 경우에는 1년 당 25,000명이 필요하게 된다. 현재 전세계에서 1년 동안 약 1000 계통의 유전자 파괴 마우스가 제작되고 있다고 추산되고 있다. 그렇다면 넉 아웃 ES 클론을 10만 종류 제작하는 데에는 100년이 걸리게 된다. 이런 상태에서는 2003년에 종료된다고 여겨지고 있는 인간 게놈의 구조 해석 진전과 비교해도 현실적이지 않다.
둘째는, 비용이 많이 든다는 점이다. 1 계통의 유전자 파괴 마우스 제작을위해 인건비 및 감가상각비를 제외하고도 최저 200 내지 400 만엔이 필요하다. 따라서, 10만개의 단순한 유전자 파괴 마우스 제작만으로도 2,000 내지 4,000억엔이 필요하게 된다.
이상과 같이 종래의 ES 세포를 이용한 상동 유전자 재조합에는 문제점이 있으며, 또한 게놈은 거대하기는 하지만 수는 정해져 있다. 따라서, 이 중에서 중요한 기능을 갖는 유전자를 단리하는 것이 필요하게 된다. 유전자 기능에 대해서는 유전자 파괴 마우스를 제작하고 나서야 비로서 명확해지는 경우가 많기 때문에 유전자 파괴 마우스는 장래 획기적인 약제 개발 등에도 직결되어 매우 부가 가치가 높다. 따라서, "무작위로", "대규모"로 마우스의 변이체 제작을 행하는 것이 세계의 "전략"이 되고 있으며, 현시점에서 이하에 기술하는 세가지 방법이 무작위적 변이 마우스 제작에 있어서 가장 타당하다고 여겨지고 있다.
첫째는, 변이 원인물질인 에틸니트로소우레아(ethylnitrosourea: ENU)를 이용하는 방법이다. ENU를 이용한 방법에 의해 대규모 돌연 변이체를 제작하는 프로젝트가 유럽에서 개시되고 있다. 독일에서는 인간 게놈프로젝트의 일환으로서 포유류 유전학 연구소의 파링 박사를 중심으로 1997년도에 개시되었다. 영국에서도 스미스클라인사가 자금을 제공하고, 하웰(Harwell)에 있는 MRC의 마우스 게놈 센터에서 브라운 박사를 중심으로 주로 뇌·신경계의 돌연 변이 마우스를 확립하는 것을 목적으로서 개시되었다. 현재까지 두곳 모두 합쳐 우성 유전을 나타내는 변이 마우스가 약 200 계통 확립되어 예상보다 효율적으로 프로젝트가 진행되고 있다. 미국에서도 케이스 웨스턴 리저브 대학 및 오크릿지 국립 연구소를 중심으로 방대한 예산 (연간 60억엔)으로 마우스 게놈의 구조 해석 및 ENU법에 의한 변이체 제작이 개시되었다.
ENU를 성숙한 수컷 마우스에 투여하면 감수 분열 전의 정원 세포에 작용하여 1 세포 당 약 50 내지 100군데에 점돌연변이를 무작위로 일으킨다. 그리고, 하나의 유전자 좌위 당 약 1/1,000/배우자의 빈도로 돌연 변이가 발생한다. 따라서, 한 마리의 처리 마우스를 암컷 마우스와 교배함으로써 F1 세대에서 다양한 종류의 변이 마우스를 제작할 수 있다. 또한, ENU를 이용하는 방법은 특정한 유전자 좌위에 대하여 1,000 마리를 스크리닝하면, 한 마리는 그 유전자에 변이가 발생할 확률이 되기 때문에 매우 효율적이라고 생각되고 있다.
둘째는, 역시 변이 원인물질인 클로람부실을 이용하는 방법이다. 이 방법에 따르면, ENU법과 동일한 빈도로 정원 세포에 돌연 변이를 일으킨다. 단, 이 경우에는 때때로 1 메가베이스에 미치는 결실 변이가 발생한다.
셋째는 유전자 트랩법에 의한 것이다. 유전자 트랩법이란 마커 유전자를 포함하는 트랩 벡터를 ES 세포에 도입하고, 마커 유전자의 발현을 지표로서 미지의 유전자를 탐색하는 것을 목적으로 개발된 방법이다. 트랩 벡터의 삽입은 무작위로 수행하며, 그 삽입에 의해 대부분의 경우 내생 유전자 (세포 및 조직에 본래 존재하는 유전자)가 파괴된다. 따라서, 그 ES 세포를 이용하여 키메라 마우스를 제작함으로써 여러가지 유전자 파괴 마우스를 제작할 수 있다.
그러나, 이들 변이 원인물질을 이용하는 방법 및 유전자 트랩법은 각각 장,단점이 있다 (표 1).
ENU법 클로람부실법 유전자 트랩법
변이의 성질 점변이 결실 변이 내재 변이
변이 마우스 제작 간편함 간편함 곤란함
변이 유전자 동정 곤란함 중간 정도 간편함
그 밖의 특징 ES 트랩 클론의 사용이 가능함
ENU법은 변이 마우스의 제작은 쉽지만, 개개의 변이 계통의 확립은 교배에 의한 분리를 행하지 않으면 안된다. 또한, 변이된 유전자의 동정에는 우선 다형 DNA 마커를 이용한 연관 해석에 의해 유전자 좌위를 동정하고, 그 후에 포지셔널 클로닝법에 의해 유전자를 단리해야만 한다. 따라서, ENU법은 조작이 번잡하다.
클로람부실법은 변이 마우스의 제작은 쉽지만, 결실 부위를 동정해야만 하고 그를 위해서는 다수의 다형 DNA 마커를 이용하여 해석할 필요가 있다. 또한, 일반적으로 클로람부실법 등의 변이 원인물질법에서는 대규모의 사육실을 필요로 하기 때문에 비용 및 노력이 든다.
유전자 트랩법은 변이 마우스의 제작에 시간과 기술을 필요로 하지만, 변이 유전자의 동정은 쉬우며 사육실 규모에 따라 실험이 가능하다. 유전자 트랩 ES 클론은 그 자체가 게놈 기능 해석을 위한 귀중한 자원이 되며, 이 점도 다른 방법과 특별히 다른 점이다.
유전자 트랩법에 대해서도 세계 여러 연구실에서 변이체 제작이 개시되고 있다. 미국에서는 민간 렉시콘 제네틱스사가 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 트랩에 의해 랜덤 파괴를 행하고 있다. 그러나, 유전자가 트랩되었다고 해도 내생 유전자를 파괴할 수 있는지의 여부가 명확하지 않고, 생식 키메라 마우스를 제작할수 있는지의 여부가 불명확하며, 키메라 마우스 제작은 별도 요금이 요구되고, 이용시 상당한 금액이 요구되는 점 등으로부터 일반적인 연구자에 있어서는 거의 이용할 수 없는 상황이다. 또한, 독일에서는 ENU 프로젝트의 일환으로서 12,000 클론을 목표로서 유전자 트랩이 행해지고 있다. 어쨋든 마우스 계통의 확립보다 트랩된 유전자의 해석을 선행시키는 방법으로 진행되고 있다.
본 발명은 유전자 트랩법에 의한 랜덤 변이 ES (Embryo Stem) 클로닝 기술에 관한 것이다.
도 1은 유전자 부분과 그 외의 부분에서의 양자의 기능 해석의 개념을 나타내는 도면.
도 2는 본 발명의 트랩 벡터의 제작법 및 유전자의 트랩법 개요를 나타내는 도면.
도 3은 loxP의 구조를 나타내는 도면.
도 4는 lox71과 lox66의 재조합을 나타내는 도면.
도 5는 변이형 loxP에 의한 DNA 단편의 삽입을 나타내는 도면.
도 6은 본 발명의 트랩 벡터를 나타내는 도면.
도 7은 트랩 벡터-pU-Hachi의 제작도.
도 8은 2 단계의 가변형 유전자 트랩법을 나타내는 도면.
도 9는 키메라 동물 제작에 의한 트랩 계통의 확립 개요를 나타내는 도면.
도 10은 트랩 벡터의 삽입 위치를 나타내는 도면.
도 11은 마우스의 꼬리뼈 굴곡 변이를 나타내는 사진.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 종래의 유전자 트랩법의 문제점을 극복하고, 거의 이상적이라고 여겨지는 신규 "가변형 유전자 트랩법"을 개발하여 이 방법을 이용해서 대규모 ES 트랩 클론의 확립과 그것을 이용한 마우스 변이체 제작을 행하는 데 있다. 따라서, 본 발명은 트랩 벡터, 유전자 트랩법, 트랩된 유전자가 도입된 트랜스제닉 또는 넉 아웃 동물, 또한 트랩된 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 유전자 트랩법에 박테리오 파지 유래의 재조합 시스템인 Cre-loxP를 이용하는 것을 고안하여 본 발명을 완성하기에 이른 것이다. 여기에서 Cre는 재조합 효소이며, loxP 서열을 인식하여 이 부위에서 재조합을 일으키는 것이다.
즉, 본원은 이하의 발명을 제공한다.
(1) 역반복 서열 1, 스페이서 서열 및 역반복 서열 2의 순서로 구성되는 loxP 서열 중, 역반복 서열 1의 일부 서열 또는 역반복 서열 2의 일부 서열에 변이가 도입된 변이형 loxP를 포함하는 트랩 벡터.
여기에서, 역반복 서열 1의 일부 서열에 변이가 도입된 것으로서는 lox71 (예를 들면, 서열 번호 1로 표시되는 것)을 들 수 있으며, 역반복 서열 2의 일부 서열에 변이가 도입된 것으로서는 lox66 (예를 들면, 서열 번호 2로 표시되는 것)을 들 수 있다.
(2) 역반복 서열 1의 일부 서열에 변이가 도입된 트랩 벡터와 역반복 서열 2의 일부 서열에 변이가 도입된 트랩 벡터가 재조합을 일으킨 벡터.
(3) 이하의 (a) 내지 (i)의 트랩 벡터.
(a) SP-SA-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP
(b) SP-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP
(c) SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP
(d) SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP
(e) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(f) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(g) (lox71이 삽입된 SA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(h) (lox71이 삽입된 SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(i) (lox71이 삽입된 SA)-M-loxP-pA-lox2272-프로모터-M-lox511-SD
(SP는 임의의 서열, SA는 스플라이스 억셉터 (splice acceptor), SD는 스플라이스 도너, IRES는 분자 내 리보좀 엔트리 부위, M은 마커 유전자, puro는 퓨로마이신 내성 유전자, pA는 폴리 A 서열, PV는 플라스미드 벡터를 나타낸다.)
상기 (a) 내지 (i)의 트랩 벡터에 있어서, 마커 유전자로서는 β-geo 유전자를 들 수 있으며, 플라스미드 벡터로서는 pBR322, pUC(pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 등), pSP(pSP64, pSP65, pSP73 등), pGEM(pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z 등)을 들 수 있다.
(4) 상기 중 어느 하나의 트랩 벡터를 배의 간세포 (embryonic stem cell)에 도입하는 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 방법, 및 이 방법에 의해 트랩 벡터가 도입된 배의 간세포.
(5) 상기 배의 간세포를 동물에 도입하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물 또는 넉 아웃 동물의 제작 방법, 및 이 방법에 의해 제작된 트랜스제닉 동물 또는 넉 아웃 동물.
상기 동물로서는 마우스, 래트, 토끼, 몰모트, 돼지, 양 및 염소로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1종을 들 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 명세서는 본원의 우선권 기초인 일본국 평성 11년 특허 출원 제1999-200997호의 명세서 및(또는) 도면에 기재된 내용을 포함한다.
본 발명은 유전자 트랩법, 트랩된 유전자가 도입된 트랜스제닉 또는 넉 아웃 동물, 또한 트랩된 유전자에 관한 것이다. 본 발명의 트랩법의 개요를 도 2에 나타낸다. 우선, 본 발명의 목적을 달성하기 위해 트랩 벡터를 제작하고, 이것을 ES 세포에 도입하여 트랩 클론을 단리 및 선택한다 (도 2A 내지 C). 도 2는 pU-Hachi 트랩 벡터를 예시한다. 그 후, 키메라 동물 (예를 들면, 키메라 마우스)을 제작하여 트랩 클론 유래의 마우스를 제작한다 (도 2F 내지 G). 한편, 단리 및 선택된트랩 클론을 이용하여 트랩된 유전자의 단리 및 서열 결정과 플라스미드 복구 (plasmid rescue)에 의해 게놈을 회수한다 (도 2C 내지 E). 또한, 클론을 전기 천공법 및 퓨로마이신 등의 약제 선택을 행하여 트랩된 유전자를 발현시키고, ES 클론의 마우스 계열을 제작한다 (도 2H 내지 I).
본 발명을 정리하면 이하와 같이 요약할 수 있다 (파일럿 연구를 포함).
(1) 전체의 효율
(1-1) 배 모양체 형성에 의한 스크리닝
네오 내성 클론 106개를 부유 배양하여 배 모양체를 형성시키고, ES 세포의 단계 및 분화 유도 후의 2 세포 시기에서 b-gal의 발현을 해석하였다. 그 결과, 90개(86 ％)의 트랩 클론은 어느 시기에도 발현되었다.
(1-2) 단일 카피의 삽입을 나타내는 클론의 선별
배 모양체 형성 과정에서의 유전자 발현을 나타낸 109개의 트랩 클론에 대하여 DNA를 추출하여 삽입 패턴을 해석하였다. 그 결과, 75개 (70 ％)는 단일 카피의 삽입이며, 그 중 완전한 것 (플라스미드 기원을 유지하는 것)이 24개 (22 ％), pUC 부분이 결실된 것이 40개 (37 ％)였다. pUC가 결실되어도 lox71 부위를 이용하면 pUC는 다시 삽입할 수 있기 때문에, 이들 64개 (59 ％)의 클론에 대하여 이용할 수 있는 것을 알았다 (표 4).
(1-3) 생식 키메라 제작 효율
상기한 트랩 클론을 이용하여 키메라 마우스를 제작하였는데, 약 반수의 클론에서 생식 키메라 마우스를 얻을 수 있었다.
(1-4) 전체 요약
처음에 선택한 네오 내성 클론의 약 26 ％의 것이 최종 단계까지 이르는 것을 알았다. 생식 키메라 제작 효율은 현재 상승하고 있기 때문에 좀더 전체 효율을 높일 수 있다고 생각되지만, 현시점에서도 충분한 연구 실시에는 지장이 없을 정도의 양호한 효율이라고 생각된다.
(2) 유전자 트랩법의 효율
이제까지의 시험 결과 24 트랩 계통을 확립하였다. 유전자 수준의 해석까지 진행된 것은 13 계통이며, 염기 서열을 블라스트 프로그램(Blast program)을 이용하여 진뱅크(Genebank) 및 EMBL 데이타 베이스와 비교하였다. 그 결과, 9 클론이 공지의 유전자, 3 클론이 EST, 나머지 1 클론이 미지의 유전자였다 (표 2). 이제까지 다른 연구자에 의한 보고에서는 10 내지 25 ％가 공지의 유전자, 10 내지 20 ％가 EST, 50 내지 10 ％가 미지의 유전자, 2 내지 10 ％가 반복 서열이었다.
공지의 유전자 EST 미지의 유전자 반복 서열
본 발명 9 (69.2%) 3 (23.1%) 1 (7.7%)
기존의 보고 10-25% 10-20% 50-80% 2-10%
(3) 트랩된 유전자
배 모양체 형성에 의한 스크리닝법에 의해 발생 및 세포 증식에 관련된 유전자를 효율적으로 트랩하고 있는가의 여부를 공지의 유전자 종류를 조사함으로써 검토하였다. 그 결과, 전사 인자인 CBP(CREB binding protein) 및 Spl, 세포 주기에 관여하는 사이클린 B2, 시그널 전달에 관여하는 Crk와 pHPS1-2, 번역에 관여하는rRNA, sull, hnRNP L, RNA 폴리머라제 I, 그리고 미토콘트리아 DNA였다 (표 3). 각각 잘 알려진 유전자가 트랩되어 있는 것을 알았다. 이들 대부분은 세포 증식에 관여하는 유전자이며, 배 모양체 형성에 의한 스크리닝계가 잘 기능하고 있는 것을 시사하고 있다.
클래스 클론 번호 유전자
1. 핵(1) 전사 Ayu3-112 CBPAyu8-038 Sp1(2) 세포 주기 Ayu3-008 사이클린 B2Ayu6-003 대장균의 세포 분열 단백질Ftsj1과 상동(3) 시그널 전달 Ayu8-104 CrkAyu8-025 pHPS1-2(4)세포 골격 Ayu8-003 디나민 (dynamin) II
2. 세포질(1) 번역 Ayu3-022 rRNAAyu8-016 sul 1Ayu8-016 hnRN의 상류Ayu8-019 RNA 폴리머라제 I의 가능성이 큼(2) 그 외 Ayu3-001 미토콘드리아 DNA
3. 미지 Ayu7-003 불명확함
(4) 트랩에 의한 유전자 파괴의 확인
유전자 트랩에 의해 실제로 내생 유전자가 파괴되는가의 여부가 중요한 포인트 중 하나이기 때문에, 6개의 공지의 유전자에 대하여 트랩 부위의 구조를 해석하였다. 그 결과, 1개는 프로모터 영역, 1개는 엑손 내에, 4개는 인트론 내에 삽입되어 있으며, 모든 유전자가 완전 또는 부분적으로 파괴되어 있었다. 따라서, 본 발명의 유전자 트랩법에 의해 효율적으로 내생 유전자를 파괴할 수 있는 것이 밝혀졌다 (도 10).
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
1. 트랩 벡터의 제작
유전자 트랩법이란, 트랩 벡터를 ES 세포에 도입하면 우연히 또는 랜덤하게 마우스 내생 유전자에 삽입되는 것을 이용하여 미지의 유전자를 게놈 상에서 트랩한다는 것이다. "유전자 트랩"이란, 트랩 벡터가 게놈 상의 특정한 유전자에 삽입되어 이 특정한 유전자를 포획하는 것을 의미하며, 유전자를 포획하기 위한 벡터를 "트랩 벡터"라고 한다. 유전자에는 인핸서(enhancer), 프로모터, 엑손, 폴리 A 등이 존재하며 각각을 포획할 수 있지만, 그러기 위해서는 목적에 따른 구조를 가진 트랩 벡터를 사용할 수 있다.
일반적으로 엑손 트랩 벡터는 스플라이스 억셉터만을 갖는 리포터 유전자, 항생제 선택 마커 유전자, 및 플라스미드 부분으로 구성되어 있으며, 마우스 내생 유전자의 하류에 삽입되었을 때에만 리포터 유전자가 발현된다. 다시 말해서, 트랩 벡터 중의 리포터 유전자의 발현을 모니터함으로써 내생 유전자로의 삽입을 알 수 있다. 또한, pUC19 등의 플라스미드를 트랩 벡터에 연결해 두면, 이른바 플라스미드 복구법이라고 불리우는 방법에 의해 트랩된 내생 유전자를 단리할 수 있다. "플라스미드 복구법"이란 전기 충격법 (electroporation method) 등에 의해 형질 전환된 세포의 앰피실린 선별 등을 통해 목적하는 유전자를 회수하는 방법이다 (도 2E). 또한, 포획시에 그 유전자를 파괴하기 때문에 즉시 유전자 파괴 마우스를 제작할 수 있다. 또한, 리포터 유전자는 마우스 내생 유전자의 발현 조절 영역에 지배되어 발현되기 때문에, 내생 유전자 발현의 조직 특이성, 시기 특이성을 간단히 해석할 수 있다.
종래의 유전자 트랩법에서는 유전자를 완전히 파괴할 수 있어도 인간 유전병에서 보여지는 작은 변이, 예를 들면 1 아미노산 치환과 같은 변이를 도입할 수 없으며, 또한 인간 유전자와 치환할 수도 없다는 문제점이 있었다. 따라서, 본 발명은 이러한 문제점을 해소하기 위해 박테리오 파지 유래의 재조합 시스템인 Cre-loxP를 개질하고, 이것을 유전자 트랩법에 이용함으로써 일단 유전자 트랩 벡터를 삽입시켜 마우스 유전자를 파괴한 후, 트랩 벡터 내의 변이 lox 부위에 임의의 유전자를 삽입할 수 있도록 한 것이다. 이에 따라 인간 유전병에서 보여지는 작은 변이, 예를 들면 1 아미노산 치환과 같은 변이를 도입하는 것이 가능해지고, 또한 인간 유전자와 치환하는 것도 가능해진다. 본 발명의 트랩 벡터는 여러가지 유전자를 트랩하기 위해 사용할 수 있는데, 엑손 트랩 또는 프로모터 트랩용으로서 바람직하게 사용할 수 있다.
loxP (locus of crossing (X-ring) over, P1)는 34 염기 (5'-ataacttcgtata gcatacat tatacgaagttat-3')로 이루어지는 서열이며 (서열 번호 3), 5' 말단에서부터 13개 염기(역반복 서열 1이라고 함), 및 3' 말단에서부터 13개 염기의 서열 (역반복 서열 2라고 함)이 각각 역반복 서열을 구성하고, "gcatacat"에 의해 표시되는 8 염기의 스페이서라고 불리우는 서열이 상기 역반복 서열 1과 2 사이에 끼워져 있다 (도 3). "역반복 서열"이란 스페이서를 경계로 하여 한쪽의 서열이 다른쪽 서열과 서로 마주보는 방향으로 상보적인 서열을 의미한다. 다시 말해서, 한쪽 서열중 센스 가닥의 서열이 다른쪽 서열의 안티센스 가닥과 서로 마주보는 방향으로 상동인 것을 의미한다. 방향이 서로 마주하고 있으며, 이중 가닥을 형성하였을 때의서열 자체는 동일하고 반복되어 있기 때문에 역반복 서열이라고 불리운다. 도 3에 나타낸 바와 같이 이중 가닥 중 한쪽 가닥 (예를 들면, 센스 가닥)에 있어서 지면 좌측의 역반복 서열 1 (5'-ataacttcgtata-3': 서열 번호 4)은 지면 우측의 역반복 서열 2 (5'-tatacgaagttat-3': 서열 번호 5)에 대하여 각각 5'→3' 방향, 3'←5' 방향으로 상보적인 관계로 되어 있다.
loxP는 통상의 서열과 달리 방향성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 있어서 상기 5'→3'의 방향으로 loxP의 서열을 표시할 때에는 그 표시 중에 지면 좌향의 화살표 (예를 들면 "←")를 포함시키기로 한다.
Cre(causes recombination)란 유전자 재조합을 일으키는 재조합 효소 (리컴비나제"라고도 함)를 의미하며, 상기 반복 서열을 인식하여 스페이서부의 "cataca"을 점착 말단으로 하는 절단 양식으로 절단한다 (도 3).
그런데, 박테리아 중에서는 두 군데의 loxP 사이에 재조합이 일어나 삽입 또는 결실 반응이 일어난다. 포유류 세포에서 삽입 반응을 일으킬 수 있다면, 후에 임의의 유전자를 삽입할 수 있기 때문에 응용성은 특히 넓어진다. 포유류 세포에서는 핵이 크기 때문에 일단 결실된 loxP를 갖는 환상 DNA가 확산되어 삽입 반응은 거의 관찰되지 않는다.
따라서, 본 발명자는 삽입 반응을 일으키기 위해 loxP 서열에 변이를 도입하고, 일단 유전자가 게놈에 삽입되면 삽입된 유전자를 결실시킬 수 없게 (게놈으로부터 탈리되지 않게) 되는 것을 고려하여, 이를 위해 2 종류의 변이형 loxP를 준비하였다 (도 4).
하나는 loxP의 반복 서열 (센스 가닥측) 중 지면 좌측의 반복 서열 (ATAACTTCGTATA)의 좌측으로부터 5 염기까지를 'TACCGTTCGTATA"가 되도록 치환 변이 (밑줄 친 부분이 변이시킨 부분)를 도입한 것으로, 이것을 "lox71"이라고 명명하였다 (서열 번호 1; 도 4b). 또 하나는 지면 우측의 반복 서열 (TATACGAAGTTAT)을 우측에서 5 염기까지 "TATACGAACGGTA" (밑줄 친 부분이 변이시킨 부분)가 되도록 치환 변이를 도입한 것으로, 이것을 "lox66"이라고 명명하였다 (서열 번호 2; 도 4b).
게놈 상의 lox71과 플라스미드 상의 lox66 사이에서 재조합이 일어나면, 삽입된 DNA의 5'측 (지면 좌측)에는 loxP의 양측 반복 서열이 변이된 것 ("lox71/66"이라고 함;TACCGTTCGTATA GCATACAT TATACGAACGGTA: 서열 번호 6)이, 우측에는 야생형의 loxP (ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT: 서열 번호 3)가 배치된다 (도 4a). 그 결과, Cre는 이제 lox71/66을 분별할 수 없으며, loxP와의 사이에서 재조합을 일으키지 않고 게놈에 유전자가 삽입된 채로 유지된다. 즉, loxP들의 상동 재조합의 경우에는, 절단된 loxP를 포함하는 환상 DNA가 물리적으로 떨어지기 때문에 삽입보다도 결실에 반응이 치우친다. 한편, 염색체측에 lox71을, 또한 환상 DNA 측에 lox66을 사용하면 삽입되었을 때 발생하는 lox71/66을 Cre 리컴비나제가 인식할 수 없게 되어 결실 반응보다 삽입 반응에 치우치기 때문에 삽입 상태가 유지된다 (도 5). 여기에서, 본 발명에 있어서는 염색체측에 lox66, 환상 DNA 측에 lox71을 사용할 수도 있다.
실제로 ES 세포에 미리 lox71 등의 변이형 loxP (이하, "변이형 lox"라고도함)를 삽입해 두고, 여기에 다른 변이형 loxP (예를 들면, lox66)를 포함하는 플라스미드를 도입하면, 플라스미드가 게놈에 삽입된다. 따라서, 예를 들어, 이 lox71을 미리 유전자 트랩 벡터에 삽입해 두면, 후에 어떠한 유전자라도 lox66을 이용하여 삽입할 수 있게 된다. 즉, 작은 변이를 도입한 유전자 및 인간 유전자로 치환하는 것도 가능해진다.
이 변이형 lox (lox71 또는 lpx66)를 이용한 유전자 트랩 벡터는 이하와 같이 제작할 수 있다 (도 6 참조). 단, 이하의 트랩 벡터는 예시적인 것으로, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 이하의 벡터에 있어서 변이형 lox로서 lox71을 예시하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니며 lox71 대신에 lox66을 사용한 것도 본 발명의 트랩 벡터에 포함된다.
(a) U8: SP-SA-lox71-IRES-M-pA-loxP-PV-SP
(b) U8 delta: SP-lox71-IRES-M-pA-loxP-PV-SP
(c) pU-Hachi: SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP
(d) pU-12: SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP
(e) pU-15: lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(f) pU-16: lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(g) pU-17: (lox71이 삽입된 SA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(h) pU-18: (lox71이 삽입된 SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
(i) (lox71이 삽입된 SA)-M-loxP-pA-lox2272-프로모터-M-lox511-SD
상기 벡터의 구성 요소에 있어서, SP는 임의의 서열, SA는 스플라이스 억셉터, SD는 스플라이스 도너, IRES는 분자 내 리보좀 엔트리 부위, M은 마커 유전자, puro는 퓨로마이신(puromycin) 내성 유전자, pA는 폴리 A 서열, PV는 플라스미드 벡터를 나타낸다.
트랩 벡터가 게놈 DNA에 삽입될 때, 대부분의 경우 벡터의 일부가 결실되며, 그 결과 벡터의 중요 부분이 결실되는 경우가 있다. SP는 이러한 결실을 방지하기 위해 부가된 임의의 서열이고, 서열은 자유롭게 결정할 수 있다. SP의 서열 길이는 100 내지 1000개 염기, 바람직하게는 300 내지 400개 염기이다. 또한, 공지된 임의의 서열을 SP로 사용할 수 있다. 공지 서열로서는 예를 들면, 토끼 β-글로빈 유전자의 일부 등을 들 수 있다.
스플라이스 억셉터는 스플라이싱할 때 엑손의 3' 말단측에 연결할 수 있는 서열을 의미한다.
스플라이스 도너는 스플라이싱할 때 엑손의 5' 말단측에 연결할 수 있는 서열을 의미한다.
IRES는 분자 내 리보좀 엔트리 부위 (internal ribosomal entry site)라고 불리우며, 단백질 합성시에 아미노아실 t-RNA가 결합되는 리보좀 상의 부위 (A 부위)이고, CAP 비의존적으로 번역을 개시할 수 있도록 하기 위한 서열이다.
마커 유전자는 본 발명의 벡터가 표적 유전자를 트랩할 수 있었는가의 여부를 나타내는 마커가 되는 유전자이며, 대장균 유래의 β-갈락토시다제 유전자 (lacZ 유전자), 또는 lacZ 유전자와 네오마이신 (G418) 내성 유전자와의 융합 유전자 (β-geo 유전자), CAT 유전자, GFP 유전자, SV40 라지 T 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자, 히글로마이신 내성 유전자, 블라스트사이딘 S 내성 유전자 등을 들 수 있다.
플라스미드 벡터는 유전자 트랩 후에 내생 유전자를 플라스미드 복구법에 의해 단리하기 위해 사용되는 것이다. "플라스미드 복구법"이란, 트랩 벡터 내의 플라스미드 (대장균으로 증식되는 것)의 일부를 이용하여 이 플라스미드 부분의 근접 영역을 회수하는 방법을 의미한다. 예를 들면, 플라스미드에 게놈 DNA가 연결된 경우에 있어서, 제한 효소 처리에 의해 플라스미드와 게놈 DNA가 연결된 단편을 절단하고, 절단된 단편을 환상으로 한 후, 대장균에 도입하여 증식시키면 플라스미드에 근접한 게놈 DNA를 회수할 수 있다. 플라스미드 벡터로서는 예를 들면 pBR322, pUC(pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 등), pSP(pSP64, pSP65 등), pGEM (pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z 등) 등을 들 수 있다. 또한, 플라스미드 벡터에는 supF, 앰피실린 내성 유전자, 복제 개시점, 및 클로닝을 위한 제한 효소 부위 (예를 들면 멀티클로닝 부위)를 단독으로 또는 적절히 조합하여 연결해 둘 수 있다.
상기 (a)에 나타낸 벡터를 U8이라고 한다. U8의 기본 부분 (SA-IRES-β-geo-pA: 도 7)은 pGT1.8IRESbetageo로부터 유래하고 있다. 이 pGT1.8IRESbetageo는 마우스 En-2 유전자 유래의 스플라이스 억셉터, IRES, β-geo를 포함하고 있다. 이 pGT1.8IRESbetageo의 BglII 부위에 lox71을 삽입한 후, SalI로 처리하여 SalI 단편을 준비해 둔다. 한편, pUC19 등의 벡터에 180 염기쌍의 SP 서열, loxP, 폴리 A 시그널을 삽입하고, 플라스미드 pEBN-Seti를 제작한다. 이 플라스미드의 SalI 부위에 상기한 SalI 단편을 삽입하고 U8을 제작한다. 따라서, 이 구조는 5'측에서부터 순서대로 임의의 서열, 스플라이스 억셉터, lox71, IRES, β-geo, pA, loxP, pUC19, 임의의 서열이다 (도 7).
상기 (b)에 나타낸 벡터를 U8delta라고 한다. U8delta는 U8의 스플라이스 억셉터를 결실시킨 벡터이다. 이 벡터는 lox71이 리포터인 β-geo 앞에, loxP가 β-geo 뒤에 연결된 구성으로 되어 있다. 이러한 구성으로 한 것은 벡터가 삽입된 후에 Cre를 일과성으로 발현시킴으로써 중간의 IRES와 β-geo 부분을 완전히 제거할 수 있기 때문이다. 그 결과, 상류에 존재하는 마우스 내생 유전자 근처에 플라스미드 pUC19가 위치하게 되고, 마우스 내생 유전자를 쉽게 단리할 수 있다.
상기 (c)에 나타낸 벡터를 "pU-Hachi"라고 한다. 이 벡터는 SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP로 구성되어 있다. pU-Hachi 벡터는 pGT1.8IRESβ-geo로부터 유래하며, 마우스 En-2 유전자로부터의 SA 서열과 뇌심근염바이러스 유래의 IRES 서열에 연결된 β-geo 서열을 함유한다. lox71의 BamHI 단편을 pGT1.8IRESβ-geo의 BglII 부위에 삽입하고, 임의의 서열, loxP 서열 및 마우스 포스포글리세레이트키나제-1 (PGK) 유래의 polyA 부가 시그널을 벡터의 LacZ 서열이 제거된 개변형 벡터에 삽입함으로써 플라스미드를 제작한다. SP 서열은 트랩 벡터의 3'측을 보호하기 위해 사용된다. 플라스미드의 제한 효소 SalI 부위에 SA-IRES-lox71-β-geo의 SalI 단편을 삽입함으로써 pU-Hachi를 얻을 수 있다.
상기 (d)에 나타낸 벡터를 "pU-12"라고 한다. 이 벡터는 SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP로 구성되어 있다. pU12 트랩 벡터를 제작하기 위해 우선 pE3NSE7의 PGK poly(A) 시그널을 퓨로마이신 내성 유전자 + PGK poly(A) 시그널에치환하고, 또한 그 하류의 BglII 부위에 lox511을 삽입한다. 얻어지는 플라스미드의 제한 효소 부위에 pU-Hachi로부터의 SA-IRES-lox71-β-geo의 SalI 단편을 삽입함으로써 pU-12를 얻을 수 있다.
상기 (e)에 나타낸 벡터를 "pU-15"라고 한다. 이 벡터는 lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511로 구성되어 있다. 여기에서 "lox2272"란, loxP의 스페이서 영역 (gcatacat) 중 2번째 c를 g에, 7번째 a를 t에 치환한 서열 (ggatactt)을 갖는 것을 말한다. 또한, "lox511"은 loxP의 스페이서 영역 (gcatacat) 중 2번째 c를 t에 치환한 서열 (gtatacat)을 갖는 것을 말한다. lox511 및 lox2272는 loxP 서열의 스페이서 부분에 변이가 있기 때문에 그 자체 (lox511들끼리, lox2272들끼리)와는 재조합을 일으키지만, loxP 및 lox71과는 재조합을 일으키지 않는 변이 lox 서열이다. 또한, lox2272 및 lox511의 서열 순서는 어떠한 것을 전방 또는 후방에 놓아도 상관없으며, 임의로 선택할 수 있다 (이하 동일).
상기 (f)에 나타낸 벡터를 "pU-16"이라고 한다. 이 벡터는 lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511로 구성되어 있으며, pU-15의 lox71과 β-geo 사이에 IRES를 삽입함으로써 제작할 수 있다.
상기 (g)에 나타낸 벡터를 "pU-17"이라고 한다. 이 벡터에 있어서 lox71은 SA의 일부 영역에 삽입되어 있다. 예를 들면, pSP 플라스미드에 lox511, loxP, PGK poly(A) 시그널, lox2272를 삽입하여 플라스미드를 제작하고, 이어서 pU-Hachi의 SA 내에 lox71 서열을 삽입하며, 이어서 β-geo를 이 순서로 삽입한다. 이 플라스미드를 앞서 제작해 둔 플라스미드와 연결시킴으로써 pU-17을 얻을 수 있다.
상기 (h)에 나타낸 벡터를 "pU-18"이라고 한다. 이 벡터도 pU-17과 마찬가지로 SA 중에 lox71이 삽입되어 있다. pU-18은 pU-17의 SA와 β-geo 사이에 IRES를 삽입함으로써 얻을 수 있다.
상기 (i)에 나타낸 벡터는 (lox71이 삽입된 SA)-M-loxP-pA-lox2272-프로모터 -M-lox511-SD로 구성된다. 이 벡터는 pU-17 내의 PV 대신에 프로모터 및 M을 이 순서대로 삽입하고, lox511 후방에 SD를 연결함으로써 얻을 수 있다. 이 벡터에는 프로모터가 부가되어 있다. 프로모터로서는 특별히 한정되지 않고, 임의의 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 후술하는 형질 전환체 제작의 항에 기재된 세균 유래 프로모터, 효모 유래 프로모터 등 외에 SP6 RNA 폴리머라제프로모터, T7RNA 폴리머라제프로모터, T3RNA 폴리머라제 프로모터 등의 RNA 폴리머라제 프로모터 또는 EF1 (신장 인자 1) 프로모터, PGK (글리세로인산키나제) 프로모터, MC1(폴리오마인핸서/단순 헤르페스바이러스 티미딘키나제) 프로모터 등의 포유 동물 유래 프로모터를 예시할 수 있다.
2. 유전자 트랩
상기와 같이 제작된 벡터를 사용하여 2 단계의 유전자 트랩을 행한다.
제1 단계는 통상의 유전자 트랩법이다. "통상의 유전자 트랩"이란 ES 세포에 상기 트랩 벡터를 도입하여 ES 세포 내에 본래 존재하는 내생 유전자를 트랩하는 것을 의미한다. 이에 따라, ES 세포 중의 내생 유전자는 파괴된다. 또한, 이 ES 세포를 이용하여 후술하는 유전자 파괴 마우스를 제작할 수 있다. 그리고, 트랩된 내생 유전자 (도 8, 유전자 X)를 단리한 후에 대장균 중에서 부위 특이적 변이 도입법 등의 방법으로 이 유전자에 미세한 변이를 도입하고 (도 8, 유전자 X'), 이것을 플라스미드 상에서 lox66의 하류에 연결하고, 제2 단계 유전자 트랩을 행한다 (도 8). 또한, 유전자 X에 변이를 도입하기 위해서는 쿤캘(Kunkel)법, 갭트 듀플렉스(Gapped duplex)법 등의 공지된 방법 또는 이에 준하는 방법을 채용할 수 있다. 예를 들어 부위 특이적 돌연 변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트 (예를 들면, Mutant-K 또는 Mutant-G (다까라사 제조) 등을 이용하거나, 또는 LA PCR 시험관내 돌연변이유발 시리즈 키트 (다까라사)를 이용하여 변이 도입이 행해진다.
제2 단계 유전자 트랩은 lox66의 하류에 연결된 내생 유전자의 변이형 (유전자 X')을 ES 세포에 도입하는 것을 의미한다. 이에 따라, 제1 단계에서 도입된 트랩 벡터의 lox71 부위와 제2 단계에서 도입된 벡터의 lox66 사이에서 재조합을 일으켜 "(lox71/66)-(유전자 X')-(loxP)"로 구성되는 카세트를 포함하는 변이된 유전자를 도입할 수 있다 (도 8).
이 방법에 따르면 변이된 내생 유전자 뿐만 아니라, 인간 유전자로 치환하는 것도 가능하며 모든 유전자를 도입할 수 있다. 이것을 본 발명에 있어서 가변형 유전자 트랩법이라고 명명한다.
3. 트랩 벡터가 삽입된 클론 (ES 세포)의 스크리닝
유전자 트랩 벡터를 ES 세포에 도입하여 네오 내성 클론을 선별하면, 이들은 마우스 내생 유전자의 하류에 트랩 벡터가 삽입되어 있는 클론이라고 간주된다. 이러한 클론으로부터 DNA를 추출하고, 서던 블롯법 (Southern blotting) 등에 의해 해석하여 트랩 벡터가 1 카피만 삽입되어 있는 클론을 선별한다. 이 선별 방법을이용함으로써 효율적으로 마우스 유전자를 트랩하고 있는 클론을 선별할 수 있는 것을 알았기 때문에 이것을 스크리닝계로서 사용한다.
(1) 네오 내성 클론의 단리
본 발명에 있어서, 트랩 벡터를 ES 세포에 도입하기 위해서는 전기 충격법, 미세주입법 (microinjection) 등이 채용된다. 예를 들면, 전기 천공법 (바이오래드 GenePulser를 사용하고, 80O V, 3 μF의 조건하)으로 0.8 ml의 인산 완충액 중에 부유시킨 3000만개의 TT2 ES 세포에 트랩 벡터 100 μg을 도입하고, 200 μg/ml 농도의 G418 존재하에서 배양한다. 1주일 후에 네오 내성 클론을 단리한다.
유전자 트랩 벡터는 ES 세포의 게놈 상에 랜덤하게 삽입된다. 따라서, 단순히 트랩 벡터를 ES 세포에 도입하는 것만으로는 반드시 유전자 중에 삽입되는 것은 아니며, 유전자와는 관계없는 장소에도 삽입된다. 그러나, 트랩 벡터 내에는 항생제 내성 유전자인 네오 내성 유전자가 포함되어 있기 때문에, 그것이 발현되는 세포는 네오마이신 (G418이라고도 함) 내성이 된다. 바꾸어 말해서, 네오마이신의 존재하에서 생존하는 세포는 네오 내성 유전자를 발현하게 된다. 트랩 벡터 내의 네오 내성 유전자는 ES 세포에서 발현하고 있는 마우스 유전자의 하류에 삽입되지 않으면 발현되지 않는다. 따라서, 발현된다는 것은 어느 한 유전자의 하류에 삽입되었다는 것을 의미한다.
(2) 삽입 패턴에 의한 ES 클론의 선별
ES 클론으로부터 통상의 방법에 따라 DNA를 추출하고, 서던 블롯법 등에 의해 삽입 패턴을 해석한다. 서던 블롯의 패턴이 단일 밴드로서 나타난 경우에는, 1카피만이 삽입되어 있다고 해석할 수 있기 때문에 그 패턴을 나타낸 DNA를 선별한다. 이것은 플라스미드에 의한 마우스 내생 유전자의 단리를 쉽게 행할 수 있는 클론을 선별하기 위해서이며, 또한 1 카피로 네오 내성이 되는 클론에서는 실제로 마우스 유전자를 트랩하고 있을 확률이 매우 높기 때문이다.
4. 키메라 동물 제작에 의한 트랩 계통 (트랜스제닉 동물)의 확립
키메라 동물의 제작은 표준적인 방법으로 행한다 (도 9). 본 발명에 있어서 제작되는 키메라 동물의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 마우스, 래트, 몰모트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 취급이 쉽고 번식도 쉬운 마우스가 바람직하다.
네오마이신으로 선별된 ES 세포를 동물 유래의 뽕나무 열매 배와 응집시켜 (ES 세포와 뽕나무 열매 배의 융합체를 형성시키는 것), 키메라 동물 배 (예를 들면 배반포(balstocyte)까지 발생된 것)를 제작한다. 이들을 불임 수컷과 교미시켜 가임신 상태가 된 대리모의 자궁에 이식한다. 예를 들어 마우스의 경우에는 약 17일 후에 새끼가 태어나므로 대리모로부터 태어난 새끼 중 키메라 동물을 선별한다. 키메라로의 기여율이 높은 동물은 생식 계열의 가능성이 높은데, 키메라 동물을 정상 동물과 교배함으로써 생식 계열의 키메라 동물인 것을 확인할 수 있다.
그 후 정상적인 암컷과 교배하여 F1을 얻고 변이 동물 계통을 확립한다. 계통 (트랜스제닉 동물) 확립이 생긴 것에 대해서만 이하의 해석을 수행한다. 또한, F1로부터의 정자, 및 상기 정자를 이용하여 체외 수정을 행하여 얻어지는 2 세포기배는 초급속 동결법으로 동결 보존해 둘 수 있다.
(1) 발현 패턴의 해석
F1 동물을 교배하여 배 (예를 들면, 마우스의 경우 9.5일째의 것)와 성체에서의 발현 패턴을 해석한다.
(2) 표현형의 해석
확립한 동물 계통에 대하여 헤테로 및 호모 동물의 표현형을 해석한다. 표현형의 해석은 육안적 관찰, 해부에 의한 내부 관찰, 각 장기의 조직 절편, X선 촬영에 의한 골격계, 행동 및 기억, 혈액을 이용하여 행한다.
(3) 트랩된 유전자의 단리와 구조 해석, 염색체 지도의 작성
트랩 클론으로부터 DNA의 단리와 염기 서열을 결정하고(후술), 상동 관계 조사를 행한다. 그 결과, 얻어진 서열 정보가 공지의 유전자, EST, 미지의 유전자 및 반복 서열 중 어디에 속하는지 구별해 둔다. EST와 미지의 유전자에 대해서는 염색체 지도를 작성할 수도 있다. 염색체 지도는 형광 제자리 혼성화 (in situ hybridization; FISH)법, 또는 미세 인공 프로브 등을 이용한 연관 해석 또는 방사선 조사에 의한 잡종 세포를 이용한 해석에 의해 행한다. 염색체 상의 위치가 명확해지면 기존의 변이 마우스 위치와 대비하여 일치하는지의 여부도 조사해 둔다.
(4) 데이타 베이스 제작
확립된 각 계통에 대하여 마커 유전자의 배 (예를 들면 마우스의 경우 10일째 배)와 성체에서의 발현 패턴, F1 및 F2 동물에서의 표현형, 트랩된 동물 내생 DNA의 염기 서열, EST와 미지의 유전자에 대해서는 그 염색체 상의 위치에 대하여 데이타 베이스를 작성한다.
5. 넉 아웃 동물
본 발명의 넉 아웃 동물은 유전자의 기능이 상실되도록 처리된 것이다. 그 처리 방법에 대하여 설명한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 동물로서는 마우스, 래트, 몰모트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는 취급이 쉽고 번식도 쉬운 마우스가 바람직하다.
동물 ES 세포로부터 제조한 게놈 DNA로부터 PCR에 의해, 또는 게놈 라이브러리로부터 미지의 유전자를 포함하는 게놈 DNA를 얻고, 여기에 본 발명의 트랩 벡터를 삽입한다. 이 조작에 의해 이 엑손의 기능은 파괴된다. 이와 동시에 벡터 중에 음성 선별용 티미딘키나제(tk) 유전자 또는 디프테리아(DT) 독소 유전자를 연결해 둔다. 전기 충격법에 의해 트랩 벡터를 ES 세포에 도입하고, 이 세포를 양성 선별용 네오마이신 및 음성 선별용 핵산 유사체 FIAU (fluoroiodo adenosyluracil), 또는 디프테리아 독소의 존재하에서 배양한다. 이 선별에 의해 트랩 벡터가 삽입된 ES 세포만이 남는다. 이 ES 클론에서는 파괴된 엑손을 포함하는 유전자가 넉 아웃된다. 얻어진 세포를 대리모의 자궁에 이식하고, 그 후 태어나는 키메라 동물을 선별한다. 키메라 동물과 정상 동물과의 교배에 의해 헤테로 접합체 동물이 얻어지고, 헤테로 접합체들의 교배에 의해 호모 접합체를 얻을 수 있다.
또한, 넉 아웃 마우스가 얻어졌다는 확인은 F1 마우스 개체에 대하여 X선 사진 촬영을 행하여 뼈의 이상 (예를 들면, 뼈의 변형) 유무를 관찰한다. 또한, 외견 상의 이상 유무 및 해부했을 때의 여러 조직-장기의 이상을 관찰할 수도 있다. 또한, 조직으로부터 RNA를 추출하고, 노던 블롯 (Northern blotting) 해석에 의해 유전자의 발현 패턴을 해석하며, 필요에 따라 혈액을 채취하여 혈액 검사 및 혈청 생화학 검사를 실시할 수도 있다.
6. 유전자의 단리, 재조합 벡터의 제작 및 형질 전환체의 제작
(1) 유전자의 단리
본 발명에 있어서는, 상기한 바와 같이 트랩된 유전자의 클로닝을 행하여 구조 해석을 수행할 수 있다.
트랩 클론으로부터의 DNA 단리는 통상 행해지는 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 트랩 클론의 mRNA로부터 클로닝하는 경우에는, 우선 트랩 클론을 구아니딘 시약, 페놀 시약 등으로 처리하여 전체 RNA를 얻은 후, 올리고 dT-셀룰로오스 또는 세파로스 2B를 담체로 하는 폴리 U-세파로스 등을 이용한 친화 칼럼법, 또는 배치법에 의해 폴리(A+)RNA (mRNA)를 얻는다. 얻어진 mRNA를 주형으로 사용하고 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 사용하여 단일 가닥 cDNA를 합성한 후, 이 단일 가닥 cDNA로부터 이중 가닥 cDNA를 합성한다. 이와 같이 하여 얻어진 이중 가닥 cDNA를 적당한 발현 벡터 (예를 들면, λgt11 등)에 삽입함으로써 cDNA 라이브러리를 얻는다.
상기한 바와 같이 얻어진 유전자에 대하여 염기 서열을 결정한다. 염기 서열의 결정은 맥삼 길버트의 화학 변형법, 또는 DNA 폴리머라제를 이용하는 디데옥시뉴클레오티드 가닥 종결법 등의 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 통상은 자동염기 서열 결정 장치 등에 의해 염기 서열을 결정할 수 있다. 또한, cDNA의 5' 영역 또는 3' 영역의 염기 서열이 미결정된 경우에는 5'-RACE법, 3'-RACE 등을 이용하여 전체 염기 서열을 결정한다. RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)법은 해당 기술 분야에서 공지된 것이며 (Frohman, M. A. et al., Methods Enzymol. Vol. 218, pp340-358(1993)), RACE를 행하기 위한 키트도 시판되고 있다 (예를 들면, MarathonTMcDNA Amplification Kit; CLONETECH사, 기타).
일단 본 발명의 유전자 염기 서열이 결정되면, 그 후에는 화학 합성에 의해, 또는 결정된 해당 염기 서열로부터 합성된 프라이머를 이용한 PCR에 의해 본 발명의 유전자를 얻을 수 있다.
(2) 재조합 벡터의 제작
목적으로 하는 유전자 단편을 정제하여 벡터 DNA와 연결한다. 벡터로서는 파지 벡터, 플라스미드 벡터 등의 임의의 것을 사용할 수 있다. DNA와 벡터의 연결 방법은 해당 분야에서 공지된 것이다 (J. Sambrook, et al., Molecular cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 또한, 이로부터 재조합 벡터를 제조하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니를 선별해서 원하는 재조합 벡터를 제조한다.
(3) 형질 전환체
본 발명의 형질 전환체는, 본 발명의 재조합 벡터를 목적 유전자가 발현할 수 있도록 숙주 안에 도입함으로써 얻을 수 있다. 여기에서, 숙주는 본 발명의DNA를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 등을 들 수 있다.
대장균 등의 세균을 숙주로 하는 경우에는 본 발명의 재조합 벡터가 상기 세균 중에서 자율 복제가 가능함과 동시에 프로모터, 리보좀 결합 서열, 본 발명의 유전자, 전사 종결 서열에 의해 구성되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있을 수도 있다. 대장균으로서는 예를 들면 이. 콜라이 (Escherichia coli) K12, DH1 등을 들 수 있으며, 고초균으로서는 예를 들면, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 프로모터는 대장균 등의 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 예를 들면, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등의 대장균 및 파지로부터 유래하는 프로모터가 사용된다. tac 프로모터 등과 같이 인위적으로 설계 변형된 프로모터를 사용할 수도 있다. 세균으로의 재조합 벡터의 도입 방법은 세균에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 칼슘 이온을 사용하는 방법 (Cohen, S. N. et al.: Proc. Natl. Acad Sci., USA, 69: 2110-2114 (1972)), 전기 충격법 (Becker, D. M. et al.: Methods Enzymol., 194: 182-187 (1990)) 등을 들 수 있다.
효모를 숙주로 하는 경우에는 예를 들면 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 등이 사용된다. 이 경우, 프로모터로서는 효모 중에서 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 gal1 프로모터, gal10 프로모터, 열 충격단백질 프로모터, MFα1 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, AOX1 프로모터 등을 들 수 있다. 효모로의 재조합 벡터의 도입 방법은 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 전기 충격법, 스페로플라스트법 (spheroplast method) (Hinnen, A. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법 (Itoh, H.: J. Bacteriol ., 153: 163-168(1983)) 등을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로 하는 경우에는 COS 세포, Vero 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포), 마우스 골추종 세포 등이 사용된다. 프로모터로서 SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, EF1 프로모터, PGK 프로모터, MC1 프로모터 등이 사용되며, 또한 인간 사이토메갈로바이러스의 초기 유전자 프로모터 등을 사용할 수도 있다. 동물 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들면 전기 충격법, 인산칼슘법, 리포펙션법 (Lipofection) 등을 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로 하는 경우에는 Sf9 세포, Sf21 세포 등을 들 수 있다. 곤충 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들면 인산칼슘법, 리포펙션법, 전기 충격법 등을 이용할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예로 그 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 유전자 트랩 벡터 변이체의 제작
(1) pU-Hachi 트랩 벡터의 제작
pU-Hachi 벡터는 pGT1.8IRESβ-geo로부터 유래하며, 마우스 En-2 유전자로부터의 SA 서열과 뇌심근염바이러스 유래의 IRES 서열에 연결된 β-geo 서열을 함유한다. 우선, lox71의 BamHI 단편을 pGT1.8IRESβ-geo의 Bg1II 부위에 삽입하였다. 이어서, 토끼 β-글로빈 유전자의 일부인 180bp의 서열, loxP 서열, 및 마우스 포스포글리세레이트키나제-1 (PGK) 유래의 polyA 부가 시그널을 벡터 pUC19의 LacZ 서열이 제거된 개변형 벡터에 삽입함으로써 플라스미드 pEBN-SE7ti를 제작하였다.SP 서열은 트랩 벡터의 3'측을 보호하기 위해 사용하였다. 플라스미드 pEBN-SE7ti의 Sa1I 부위에 SA-IRES-lox71-β-geo의 Sa1I 단편을 삽입함으로써 pU-Hachi를 얻었다.
(2) pU12 트랩 벡터의 제작
pU12 트랩 벡터를 제작하기 위해 우선 pE3NSE7의 PGK poly(A) 시그널을 퓨로마이신 내성 유전자 + PGK poly(A) 시그널로 대체하고, 또한 그 하류의 BglII 부위에 lox511을 삽입한 플라스미드를 제작하였다. 그 플라스미드의 Sa1I 부위에 pU-Hachi로부터의 SA-IRES-lox71-β-geo의 Sa1I 단편을 삽입함으로써 pU-12를 얻었다.
(3) pU17 트랩 벡터의 제작
우선, pSP73(Promega)에 lox511, loxP, PGK poly(A) 시그널, lox2272를 이 순서대로 삽입하여 플라스미드 pSP5PP2를 제작하였다. 이어서, pU-Hachi의 SA 내에 2군데 있는 BamHI 중 상류의 BamHI 부위에서 절단하고, pBluescriptII KS+ 플라스미드에 SA 앞쪽의 BamHI까지의 DNA 단편, lox71 서열, SA 뒷쪽의 BamHI에서 KpnI까지의 DNA 단편, β-geo의 NcoI에서 Sa1I 부위까지를 이 순서대로 삽입하고, 플라스미드 pKS+S71Aβgeo를 제작하였다. 이 pKS+S71Aβgeo로부터 lox71을 포함하는 SA-βgeo의 XbaI 단편을 절단하고, 이것을 pSP5PP2의 SpeI 부위에 삽입함으로써 pU-17을 얻었다.
<실시예 2> ES 세포 클론의 선별
pU-Hachi 트랩 벡터를 이용한 전기 충격에 있어서는, 100 μg의 SpeI으로 절단한 DNA 및 3×107개의 세포를 사용하였다. 세포를 0.8 ml의 PBS에 현탁하고, 바이오-라드 진 펄서 (Bio-Rad Gene Pulser)를 사용하여 80O V, 3 μF의 조건으로 전기 충격을 행하였다. 48시간 후 200 μg/ml의 G418의 존재하에서 배양하였다. 선별을 7일간 유지하고, 콜로니를 24웰 플레이트에 뿌려 증식시키고 동결 보존하였다. 트랩 클론을 서던 블롯팅에 의해 해석하고, 단일 카피의 삽입 패턴을 나타내는 세포주를 선별하였다.
트랩 클론으로부터 β-geo 서열을 제거하기 위해 pCAGGS-Cre (Araki, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 160-164, 1995; Araki, K. et al., Nucl. Acids Res., 25: 868-872, 1997; Araki, K. et al., J. Biochem. Tokyo, 122: 977-982, 1997)를 환상의 형태로 전기 충격에 의해 도입하였다. 세포수가 1.5×107개, PBS 용량이 0.4 ml인 것을 제외하고 상기와 동일한 조건에서 전기 충격을 행하였다.
처리된 세포의 반을 1장의 100 mm 플레이트에 뿌려 48시간 증식시켰다. 이어서, 1×103개/플레이트의 농도로 100 mm의 플레이트에 다시 뿌리고, 콜로니를 형성시켰다. 1주일 후, 콜로니를 거둬들여 DNA 제조를 위해 증식시켰다.
트랩 벡터의 lox71 부위에 삽입이 행해지도록 설계된 전기 충격을 행하기 위해 20 μg의 각 플라스미드 (p662IEGPPac, p662INZPPac 또는 p66PGKPac-5) 및 pCAGGS-Cre를 환상 형태로 사용하였다.
또한, 플라스미드 p66PGKPac-5는 lox66 단편 및 PGK 프로모터-퓨로마이신 내성 유전자 코드 서열을 pSP73 벡터 (Promega)에 삽입함으로써 제작하였다. 플라스미드 p662IEGPPac는 pSP73 벡터 (Promega), IRES 서열, EGFP 유전자 (Clonetech), PGK 프로모터, Pca 유전자 및 lox66 서열로부터 제작하였다. 플라스미드 p662INZPPac는 p662IEGPPac의 EGFP 유전자를 SV40 파지 T 유전자 유래의 핵 편재 시그널과 융합된 lacZ 유전자로 치환함으로써 제작하였다.
PBS 중, 1×107개/0.8 ml의 세포를 전기 충격에 걸었다 (200 V, 950 μF). 48시간 후, 2 μg/ml의 퓨로마이신을 이용하여 3일간 선별하고, 그 후 통상의 배지로 세포를 옮겼다. 전기 충격 후 9일째 콜로니를 거둬들여 증식시켰다.
공지된 방법 (Abe, K, Niwa, H. et al., Exp. Cell Res. 229: 27-34, 1996)에 따라 배 모양체 (EB)를 생산하였다. ES 세포 중의 β-갈락토시다제 활성 및 EB는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드 (X-gal)로 염색함으로써 측정하였다 (Gossler, A. and Zachgo, J., Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, A. (ed.), 0xford University Press, 0xford, 1993, pp.181-227).
트랩 벡터 pU-Hachi를 직쇄상으로 하여 TT2 ES 세포에 도입한 결과, 109개의 클론을 단리하였다. 각 클론으로부터 게놈 DNA를 단리하고, pUC 프로브 및 적어도 3개의 제한 효소를 이용하여 서던 블롯팅을 행하고 삽입 패턴을 검토하였다.
69 ％의 클론에 있어서 단일 밴드가 확인되었다. lox71 부위의 존재는 Cre매개 삽입에 불가결하기 때문에 LacZ 프로브를 이용한 서던 블롯팅 및 PstI 절단에 의해 그 존재를 확인하였다. 그 결과, 10 ％의 클론에 lox71 부위가 결실되어 있었다 (표 4). 단일 카피가 삽입되고, 동시에 lox71 부위가 유지되어 있는 나머지 59 ％의 클론을 더 해석하기 위해 선택하였다.
단일 카피의 삽입 (%) 멀티카피의 삽입
lox71 부위를 유지하는 클론 lox71 부위를 유지하지 않는 클론
클론의 총수 (%) 플라스미드 기원을 유지함 플라스미드 기원을 유지하지 않음 2 내지 3 카피 5 카피 이상
109(100) 24(22) 40(37) 11(10) 26(24) 8(7)
트랩 벡터에 의한 내생 유전자의 포획을 평가하기 위해 배 모양체 형성 전후에 X-gal로 염색하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이 97 ％의 클론이 분화의 특정한 단계에서 β-gal 활성을 나타내었다. 이것은 pU-Hachi 트랩 벡터를 사용하면 다른 IRES-β-geo 벡터와 같이 효과적인 유전자 트랩이 행해지는 것을 의미한다.
클론 번호 (%) β-geo 발현
미분화 ES 세포 분화된 배 모양체 (8일)
26 (41) + +
32 (50) - +
4 (6) + -
2 (3) - -
<실시예 3> 클론의 선택 빈도
트랩 벡터가 1 카피만 삽입되어 있는 클론을 선택하기 위해 선별된 네오 내성 클론으로부터 DNA를 추출하고, 서던 블롯법에 의해 해석하였다.
세포를 SDS/프로테이나제 K로 용해하고, 페놀/클로로포름 (1:1) (vol/vol)을사용하여 2회 처리하였다. 이어서 에탄올 침전을 행하고, TE 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH7.5/1 mM EDTA)에 용해하였다. 6 μg의 게놈 DNA를 적당한 제한 효소로 절단하고, 0.9 ％ 아가로스 전기 영동을 행한 후, 나일론막 (Boehringer Mannheim) 상에 블롯하였다. 혼성화는 DIG DNA 표지 및 검출 Kit (Boehringer Mannheim)를 사용하여 행하였다.
PCR 해석은 이하의 반응 조성액을 사용하여 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 2분 및 72 ℃에서 2분의 반응을 1 사이클로 하여 이것을 28 사이클 행하였다.
PCR에 사용한 프라이머는 이하와 같다.
β-geo 검출용 프라이머
Z1 (포워드): 5'-gcgttacccaacttaatcg-3' (서열 번호 7)
Z2 (리버스): 5'-tgtgagcgagtaacaacc-3' (서열 번호 8)
pUC 벡터 서열의 복제 기점 영역의 서열 검출용 프라이머
Ori2 (포워드): 5'-gccagtggcgataagtcgtgtc-3' (서열 번호 9)
Ori3 (리버스): 5'-cacagaatcaggggataacgc-3' (서열 번호 10)
반응 조성액
---------------------------------------------
10XPCR 완충액 2 ㎕
10mM dNTP 0.2 ㎕
포워드 프라이머 (100 pmol/㎕) 0.2 ㎕
리버스 프라이머 (100 pmol/㎕) 0.2 ㎕
AmpliTaq DNA 폴리머라제 (Perkin Elmer) 0.2 ㎕
----------------------------------------------
전체량 (멸균 증류수로 조정) 20 ㎕
PCR 반응 산물의 1/2의 양을 아가로스 겔에 로딩하고 해석하였다.
플라스미드 복구 (트랩된 유전자의 회수)는 이하와 같이 행하였다.
게놈 DNA (20 μg)를 적당한 제한 효소로 처리하고, 400 μl의 반응 용액 중에서 동결하여 환상 분자를 얻었다. 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 행한 후, DNA를 10 μl의 TE에 현탁하고, DNA 용액의 반량을 사용하여 전기 충격에 의해 대장균 (E. coli STBL2; Life Technologies)을 형질 전환하였다. 또한, 전기 충격은 바이오-라드사의 진 펄서 (Gene Pulser)를 사용 설명서에 따라 행하였다. 전기 충격 후의 세포를 1 ml의 원형 생장 (Circle Grow) 배지 (BI0101) 중에서 30 ℃로 교반하면서 1시간 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 농축한 후 LB/agar 플레이트에 뿌리고, 앰피실린에 의한 플라스미드의 선별을 행하였다. 복구된 플라스미드에 대하여 제한 효소 지도 해석 및 서열 결정을 행하였다. 서열은 시판되는 키트 (Thermo Sequenase Fluorescent-Labeled Primer Cycle Sequencing Kit; Amersham)를 사용하여 결정하였다.
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 고빈도로 재조합을 일으킨 클론을 얻을 수 있었다.
트랩 클론 해석된 서브 클론의 수 재조합을 일으킨 서브 클론의 수 재조합 빈도(%) 플라스미드 복구로 얻어진 5' 플랭킹 영역의 길이 (kb) 플라스미드 복구로 얻어진 3' 플랭킹 영역의 길이 (kb)
Ayu8-003 23 15 65 75 53
Ayu8-016 20 2 10 3.8 4.5
Ayu8-025 23 16 70 1.8 6.5
Ayu8-104 12 5 42 3.5 7
Ayu8-108 12 6 50 2 6
<실시예 4> 키메라 마우스의 제작 및 유전자 해석
(1) 마우스로의 클론 도입
트랩된 ES 클론을 ICR 마우스 유래의 8 세포기배와 응집시키고 하룻밤 배양하였다. 다음날, ES 세포와 8 세포기배가 서로 응집되어 하나의 배반포로 발생된 것을 선택하였다. 이들 키메라배 약 20개를 불임 수컷과 교미한 암컷 (대리모) 자궁 중에 이식하였다. 약 17일 후에 출생하고, 성숙되는 생후 8주 이후에 키메라 마우스를 암컷 마우스와 교배하여 ES 클론 유래의 F1 마우스 개체를 얻었다.
(2) 표현형의 해석
F1 마우스 개체에 대하여 X선 사진 촬영을 행하고, 뼈의 이상 유무를 관찰하였다.
(3) 트랩된 유전자의 해석
트랩된 유전자는 βgeo와의 융합 mRNA를 만들고 있으므로, 이것을 이용하여 트랩된 유전자를 동정하였다.
F1 개체 마우스에서 X-gal 염색에 양성이었던 조직으로부터 mRNA를 추출하고, SA 내의 서열 프라이머를 이용하여 써모스크립트 RT-PCR 시스템 (GIBCO BRL)에서 단일 가닥 cDNA를 합성하고, 이어서 5' RACE 시스템 (GIBCO BRL)을 이용하여 SA의 엑손부가 연결되는 상류에 트랩된 유전자 부분의 cDNA 단편을 얻었다. 얻어진 단편을 플라스미드 벡터에 클로닝하여 염기 서열을 결정하였다.
(4) 결과
트랩된 유전자를 해석한 결과의 일례를 표 7에 나타낸다.
클론 번호 유전자 표현형
1 Ayu8-R38 Sp1
2 Ayu8-029 PCM1(페리센트리올 물질 1)
3 Ayu3-008 사이클린 B2
4 Ayu6-003 대장균의 Ftsj1 유전자의 상동물
5 Ayu8-003 디나민 II 배 치사
6 Ayu8-R16 sui 1
7 Ayu8-016 hn RNP의 상류
8 Ayu8-019 RNA 폴리머라제
9 Ayu8-108 임포틴 β
10 Ayu8-021 불명확 비틀린 꼬리
상기한 바와 같이 얻어진 유전자 중 PCM1 유전자를 해석한 결과, 서열 번호 11 내지 13에 나타낸 서열 (5'-RACE 부분 단편)을 얻을 수 있었다. 이것은 공지된 PCM1 유전자의 서열 일부와 일치하였다. 또한, Ayu8-021 클론으로부터 얻어진 마우스는 꼬리뼈가 굴곡되는 변이 (kinky tail)가 발생하였다 (도 11). 이 변이 유전자 단편의 서열을 결정한 결과, 서열 번호 14에 나타내는 것이었다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 참고문헌으로서 본 명세서에 도입하기로 한다.
본 발명에 의해 유전자 트랩 벡터 및 유전자의 트랩법이 제공된다. 본 발명에 따르면, 우선
(1) 효율적으로 유전자 파괴 마우스를 제작할 수 있다. 트랩 벡터의 마우스 유전자로의 삽입에 의해 대부분의 경우 마우스 유전자는 파괴된다. 따라서, 이 ES 세포를 이용하면 유전자가 파괴된 마우스를 제작할 수 있게 된다. 즉, 네오 내성 클론의 선별과 1 카피의 트랩 벡터의 삽입 클론의 선별에 의해 효율적으로 유전자 파괴 마우스를 제작할 수 있게 된다. 통상의 상동 재조합에 의한 방법에서는 한명의 연구자가 1년에 고작 4 개통의 유전자 파괴 마우스밖에 만들 수 없다. 본 발명의 방법에 따르면, 예를 들어 일주일 동안 6 계통을 확립하여 1년에 40주간 활동한다면 총 240개의 계통을 확립할 수 있다. 따라서, 상기 예의 경우 본 발명의 방법은 통상의 방법과 비교하여 60배의 효율이 있다.
(2) 상세한 유전자 기능의 해석이 가능하다.
본 발명의 트랩법에서는 이미 기능을 갖는다고 여겨지는 유전자의 각 부분에 변이를 도입하고, 이 변이형 유전자를 트랩 벡터에 삽입한 후, 변이 유전자가 삽입된 트랩 벡터를 마우스에 도입하여 그 표현형을 해석할 수 있다.
(3) 보다 인간에 가까운 질환 모델 마우스를 제작할 수 있다.
인간 질환에서 발견된 것과 동일한 돌연 변이를 갖는 인간 유전자를 마우스 유전자에 치환하여 도입할 수 있기 때문에, 보다 인간에 가까운 질환 모델 마우스를 제작할 수 있다.
예비 서열표
서열 번호 1: 합성 DNA
서열 번호 2: 합성 DNA
서열 번호 3: 합성 DNA
서열 번호 4: 합성 DNA
서열 번호 5: 합성 DNA
서열 번호 6: 상동 재조합 서열
서열 번호 7: 합성 DNA
서열 번호 8: 합성 DNA
서열 번호 9: 합성 DNA
서열 번호 10: 합성 DNA
참고 문헌
(1) 유전자 트랩에 관련된 것
1) Wurst, W. et al., Genetics 139: 889-899, 1995.
2) Chowdhury, K. et al., Nucleic Acids Res. 25: 1531-1536, 1997.
3) Hicks, G. G. et al., Nature Genetios 16: 338-344, 1997.
4) Zambrowicz, B.P.et al., Nature 392: 608-611, 1998.
(2) Cre-loxP에 관련된 것
1) Sauer, B. and Henderson, N. Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 85: 5166-5170, 1988.
2) Lakso, M. et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236, 1992.
3) Gu, H. et al., Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced 1993.
4) Albert, H. et al., Plant J. 7: 649-659, 1995.
5) Schwenk, F. et. al., Nucleic Acids Res. 23: 5080-5081, 1995.
(3) 유전자 트랩 관련 문헌 리스트
1) Miyazaki, J. et al., Gene 79: 269-277, 1989.
2) Niwa, H. et al., Gene 108: 193-200, 1991.
3) Niwa, H. et al., J. Biochem. 113: 343-349, 1993.
4) Niwa, H. et al., Gene 169: 197-201, 1996.
5) Abe, K., Niwa, H. et al., Exp. Cell Res. 229: 27-34, 1996.
6) Araki, K. et al., Nucleic Acid Res. 25: 868-872. 1997.
7) Araki, K. et al., J. Biochem. 122: 977-982, 1977.
8) Oike, Y. et al., Human Mol. Genet-In Press.
9) Oike, Y. et al., Blood in Press.

Claims (18)

  1. 역반복 서열 1, 스페이서 서열 및 역반복 서열 2의 순서로 구성되는 loxP 서열 중 역반복 서열 1의 일부 서열에 변이가 도입된 변이형 loxP를 포함하는 트랩 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 변이형 loxP가 lox71인 트랩 벡터.
  3. 제2항에 있어서, lox71이 서열 번호 1로 표시되는 것인 트랩 벡터.
  4. 역반복 서열 1, 스페이서 서열 및 역반복 서열 2의 순서로 구성되는 loxP 서열 중 역반복 서열 2의 일부 서열에 변이가 도입된 변이형 loxP를 포함하는 트랩 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 변이형 loxP가 lox66인 트랩 벡터.
  6. 제5항에 있어서, lox66이 서열 번호 2로 표시되는 것인 트랩 벡터.
  7. 하기 (a) 내지 (h)의 트랩 벡터.
    (a) SP-SA-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP
    (b) SP-lox71-IRES-M-loxP-PV-SP
    (c) SA-lox71-IRES-M-loxP-pA-PV-SP
    (d) SA-lox71-IRES-M-loxP-puro-pA-PV-SP
    (e) lox71-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
    (f) lox71-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
    (g) (lox71이 삽입된 SA)-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
    (h) (lox71이 삽입된 SA)-IRES-M-loxP-pA-lox2272-PV-lox511
    (i) (lox71이 삽입된 SA)-M-loxP-pA-lox2272-프로모터-M-lox511-SD
    (SP는 임의의 서열, SA는 스플라이스 억셉터, SD는 스플라이스 도너, IRES는 분자 내 리보좀 엔트리 부위, M은 마커 유전자, puro는 퓨로마이신 내성 유전자, pA는 폴리 A 서열, PV는 플라스미드 벡터를 나타낸다.)
  8. 제7항에 있어서, 플라스미드 벡터가 pBR, pUC, pSP 및 pGEM으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 트랩 벡터.
  9. 제1항에 기재된 트랩 벡터와 제4항에 기재된 트랩 벡터가 재조합된 것인 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 다른 loxP와의 사이에서 재조합이 일어나지 않은 것인 벡터.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 트랩 벡터를 배의 간세포에 도입하는 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 방법.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 트랩 벡터가 도입된 배의 간세포.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 트랩 벡터가 도입된 트랜스제닉 동물.
  14. 제13항에 있어서, 동물이 마우스, 래트, 토끼, 몰모트, 돼지, 양 및 염소로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1종인 트랜스제닉 동물.
  15. 제12항에 기재된 배의 간세포를 동물에 도입하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물의 제작 방법.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 트랩 벡터가 도입된 넉 아웃 동물.
  17. 제16항에 있어서, 동물이 마우스, 래트, 토끼, 몰모트, 돼지, 양 및 염소로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 1종인 넉 아웃 동물.
  18. 제12항에 기재된 배의 간세포를 동물에 도입하는 것을 특징으로 하는 넉 아웃 동물의 제작 방법.
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