JPH1056915A - Ｌｄｌレセプター遺伝子不活性化動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】高脂血症治療モデルに有用な病体モデル動物の
作製。 【解決手段】ＬＤＬ−Ｒ遺伝子が不活性化された非ヒト
哺乳動物胚幹細胞およびこれを用いて得られるＬＤＬ−
Ｒ遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物の提供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 〔発明の詳細な説明〕

【発明の属する技術分野】本発明は、ＬＤＬレセプター
（以下、ＬＤＬ−Ｒと略称することがある）遺伝子が不
活性化された非ヒト哺乳動物の胚幹細胞およびＬＤＬ−
Ｒ遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物に関する。

【０００２】

【従来の技術】発生工学的技術の発展ならびに分子生物
学の知識の急激な蓄積に伴い、遺伝子を人為的に操作
し、さらに動物個体へ導入することが可能になり〔Gord
on, J.W.ら, プロシーディングス オブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sc
i.） USA, ７７：７３８０−７３８４，１９８０〕、元
来その生物に備わっていない外来性の遺伝形質を人為的
に付加、あるいは生物が持っている内在性の遺伝形質の
発現を抑制する方法も開発されるにいたり、様々な形質
転換動物が作り出されている。このような形質転換動物
は、遺伝子工学等の技術によって単離され、クローン化
された様々な遺伝子の機能を明らかにする上で、従来
は、株化細胞や初代培養細胞など体外培養細胞を用いて
いたため、遺伝子の機能解析について得られる知見が限
られていたが、かかる遺伝子の機能解析を個体レベルで
研究することが可能となる点で上述の形質転換動物は重
要である。特に、クローン化された遺伝子の生物体内で
の生理学的機能の解析や遺伝子疾患のモデル系として、
この形質転換動物を利用した実験や研究が盛んになって
きている。胚幹細胞（Embryonic stem cell：ＥＳ細
胞）は、受精後の初期胚である胚盤胞の内部に存在する
内部細胞塊から樹立され、未分化状態を保ったまま増
殖、培養可能な細胞株である。この細胞は、生体のあら
ゆる種類の細胞に分化することができる多分化能を有し
ており、正常初期胚に注入すると胚体の形成に参加して
キメラ動物を形成することができる〔Evans M.J. およ
びKaufman M.H., ネイチャー（Nature），第２９２巻，
１５４頁（１９８１）〕。この性質を利用して、様々な
遺伝子変異動物の作出が試みられてきた。その歴史は１
９８１年のEvans 及び Kaufman によるＥＳ細胞の樹立
に始まり、BradleyらによるＥＳキメラマウスの作製
〔ネイチャー，第３０９巻，２５５頁（１９８４）〕に
より本格的な研究が開始された。Thomas 及び Capecchi
がＥＳ細胞の遺伝子相同組換え〔セル（cell）第５１
巻，５０３頁（１９８７）〕に、続いてKoller らのグ
ループなど３組の研究グループがＥＳ細胞形質のGermli
ne Transmission に次々に成功し〔プロシーディングス
オブ ナショナル アカデミーオブ サイエンス（Pr
oc. Natl. Acad. Sci.）USA, 第８６巻，８９２７頁
（１９８９）〕、遺伝子欠損マウスの作製とこれを用い
た研究が急速に進展してきた。

【０００３】現在までに樹立が報告されているＥＳ細胞
には、Evans 及び Kaufman のＥＫ細胞〔ネイチャー，
第３０９巻，２５５頁（１９８４）〕の他に、Doetschm
anのＥＳ−Ｄ３細胞〔ジャーナル オブ エンブリオロ
ジー アンド エクスペリメンタル モルフォロジー
（J. Embryol. Exp. Molph.）第８７巻，２７頁（１９
８１）〕、Robertson のＣＣＥ細胞〔ネイチャー，第３
２３巻，４４５頁（１９８６）〕、Ledermann 及び Bur
kiのＢＬ／６III細胞〔エクスペリメンタルセル リサ
ーチ（Exp. Cell Res.）第１９７巻，２５４頁〕等があ
るが、これらの大部分が１２９系のマウスより樹立され
たものである。ＥＳ細胞は特定の遺伝子を修飾する遺伝
子ターゲティング等において利用価値が非常に高いにも
かかわらず、その樹立や未分化状態を保ったままでの継
代維持が困難であるため、利用が制限されているという
のが現状である。ＥＳ細胞を用いた動物疾患モデルの作
製を一般化するためには、絶えず良好なＥＳ細胞を樹
立、供給していく体制を確立することが望まれている。
このようなＥＳ細胞を用いて作出された遺伝子発現不全
動物としては、Hooper等 ネイチャー（Nature）, 第３
２６巻，２９２頁（１９８７年）及びKnehn等ネイチャ
ー（Nature），第３２６巻，２９５頁（１９８７年）の
自然突然変異ＥＳ細胞を用いたＨＰＲＴ遺伝子欠損マウ
ス、Donehower等 ネイチャー（Nature），第３５６巻，
２１５頁（１９９２年）の癌抑制遺伝子の一つであるｐ
５３を欠失したｐ５３欠失マウス、Zijlstra等 ネイチ
ャー（Nature），第３４４巻，７４２頁（１９９０年）
のβ２ミクログロブリン遺伝子変異マウス、免疫疾患モ
デルマウスの一つであるSinkai等 セル（Cell），第６
８巻，８５５頁（１９９２年）のＲＡＧ−２（Ｖ(Ｄ)Ｊ
recombination activation gene）変異マウス、Glimc
her等 サイエンス（Science），第２５３巻，１４１７
頁（１９９１年）及びCosgrove等 セル（Cell），第６
６巻，１０５１頁（１９９１年）のＭＨＣ classII変
異マウス、発育関連疾患モデルマウスの一つとしてMacM
ahon等 セル（Cell），第６２巻，１０７３頁（１９９
０年）のint−１遺伝子欠損マウス及びSoriano等 セル
（Cell），第６４巻，６９３頁（１９９１年）の大理石
病様症状を呈するsrc遺伝子欠損マウスなどがそれぞれ
報告されている。

【０００４】ＬＤＬ−Ｒは血漿中からＩＤＬ（choleste
rol-rich intermediate density lipoproteins）とＬＤ
Ｌ（low density lipoproteins）を取り除くことによっ
て血漿中のコレステロール濃度をコントロールしている
（Brown, M. S. 等、サイエンス、２３２巻、３４頁、
１９８６）。ＩＤＬおよびＬＤＬの肝臓への取り込み
は、ＬＤＬ−Ｒのハイ アフィニティー（high affinit
y）リガンドの apo Ｅの含量に依存しているが、インテ
スティナル カイロミクロン（Intestinal chylomicro
n）の トリグリセライド−デプレテッド コレステロー
ル−リッチ レムナント（triglyceride-depleted chole
strol-rich remnant）も カイロミクロン レムナント
（chylomicron remnant）レセプター、ＬＲＰ（ＬＤＬ
receptor related protein）だけでなく、ＬＤＬ−Ｒを
介しても肝臓へ取り込まれることが分かっている（Brow
n, M. S. 等、Curr. Opin. in Lipidol.、２巻、６５
頁、１９９１）。ＬＤＬ−Ｒ遺伝子の発現不全は、ヒト
（Hobbs, H. H. 等、Hum. Mutat. １巻、４４５頁、１
９９２）、ワタナベウサギ（Watanabe, Y. 等、Atheros
cleorosis. ５６巻、７１頁、１９８５）あるいはリー
サスモンキー（Scanu, A. M. J. Lipid Res. ２９巻、
１６７１頁、１９８８）において、高コレステロール血
症を引き起こすことが知られている。特に、ヒトやワタ
ナベウサギでは、若年から発症する重傷の動脈硬化症の
起因遺伝子であることが分かっているばかりでなく、Ｉ
ＤＬ、ＬＤＬのクリアランスの遅延とＩＤＬからＬＤＬ
への転換の促進も認められている（Souter, A. K. 等、
Atheroscleorosis ４３巻、２１７頁、１９８２、Kita,
T. 等、Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ７９巻、５６
９３頁、１９８２）。ＬＤＬ−Ｒ遺伝子以外にも高脂血
症に係わる遺伝子の存在が示唆されているが、これらの
遺伝子は同定が難しく明らかにはされていない。

【０００５】マウス及びラットではＬＤＬの代謝が他の
動物と異なっている（Spady, D. K.等、Annu. Rev. Nut
r. １３巻、３５５頁、１９９３）ことから、マウスや
ラットでは一般に高脂血症や動脈硬化症が起きにくいと
されてきた。しかし、これらの汎用されている実験動物
で、高脂血症モデルを作製することは病態の解析や本疾
患に対する治療薬の開発にとって非常に重要である。そ
こで、本発明者らはマウスにおいてそのＬＤＬ−Ｒ遺伝
子を相同組換え法によって特異的に修飾し、ＬＤＬ−Ｒ
遺伝子の発現が抑制されたマウスを作製することに成功
し、かかるマウスが高脂血症モデルとして有用であるこ
とを確認した。本技術はラットをはじめ他のヒト以外の
哺乳動物にも応用可能であり、本発明はヒト以外のすべ
ての哺乳動物のＬＤＬ−Ｒ遺伝子発現抑制による高脂血
症モデルを提供するものである。また、翻って高脂血症
患者の治療におけるＬＤＬ−Ｒ遺伝子導入による遺伝子
治療の評価にも本モデル動物を応用できる。さらに、動
脈硬化症についてもその原因は多岐にわたっているが、
高脂血症はその中で最も有力な危険因子である。本モデ
ル動物は加齢に伴い、また、高脂肪食で飼育することに
より動脈硬化症を呈するものであり、この意味でも有用
性が高い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、遺伝子転移操
作を用いて病態モデル動物の作出に応用しうるＥＳ細胞
を提供、またはこのようなＥＳ細胞を用いてＬＤＬ−Ｒ
遺伝子不全非ヒト哺乳動物を作出することができれば、
高脂血症などの治療薬を見い出すのに有用なスクリーニ
ング系の確立、高脂血症患者などの治療のためにＬＤＬ
−Ｒ遺伝子を導入する遺伝子治療の評価などが可能にな
ると考えられる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ね、ヒト白血病抑制因子
（Leukemia Inhibitory Factor；ＬＩＦ）を産生するネ
オマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性のマウス胎仔線
維芽細胞由来のＳＴＯ細胞〔ザ ニュー バイオロジス
ト（The New Biologist）第３巻，８６１（１９９
１）〕をフィーダー細胞として用い、培地中にＬＩＦを
通常使用量の５倍量加える条件下で、ＢＤＦ１（Ｃ５７
ＢＬ／６ Ｘ ＤＢＡ／２）マウス及びＣ５７ＢＬ／６
マウスの初期胚からキメラ形成能を有するＥＳ細胞株を
それぞれ樹立することに成功し、このＥＳ細胞が高率に
生殖系列キメラ形成能を有することを確認した。さらに
樹立したＥＳ細胞株を用いて、遺伝子相同組換え法によ
りＬＤＬ−Ｒ遺伝子欠損マウスを作出し、この知見に基
づいて検討を重ね、本発明を完成させた。

【０００８】すなわち本発明は、（１）外来性レポータ
ー遺伝子を有し、ＬＤＬレセプター遺伝子が不活性化さ
れた非ヒト哺乳動物胚幹細胞、（２）レポーター遺伝子
が大腸菌βガラクトシダーゼ遺伝子である上記（１）記
載の胚幹細胞、（３）ネオマイシン耐性でかつチミジン
キナーゼ非感受性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記
載の胚幹細胞、（５）ゲッ歯動物がマウスである上記
（４）記載の胚幹細胞、（６）上記（１）記載の胚幹細
胞を用いて得られるＬＤＬレセプター遺伝子発現不全非
ヒト哺乳動物、（７）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物であ
る上記（６）記載の動物、および（８）ゲッ歯動物がマ
ウスである上記（７）の動物などを提供するものであ
る。

【０００９】本発明におけるＬＤＬ−Ｒ遺伝子が不活性
化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動
物のＬＤＬ−Ｒゲノム遺伝子に人為的に変異を加えるこ
とにより遺伝子の発現能を抑制するもしくは該遺伝子が
コードしているＬＤＬ−Ｒ蛋白の活性を実質的に喪失さ
せることにより、遺伝子が実質的にＬＤＬ−Ｒの発現能
を有さない（以下、ＬＤＬ−Ｒノックアウト遺伝子と称
することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（ＥＳ細
胞）をいう。ここで、非ヒト哺乳動物としては、個体発
生及び生涯のサイクルが短くかつ繁殖が比較的容易なマ
ウス、ラット等のゲッ歯動物が動物モデルを作出するの
に用いるうえで好ましいが、特にこれに限定されるもの
ではなく、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ等もこれ
に含まれる。上記でいうＬＤＬ−Ｒゲノム遺伝子に人為
的に変異を加える方法としては、遺伝子工学的手法によ
り該遺伝子配列の一部又は全部の削除、他遺伝子を挿入
または置換させることによって行ない得る。具体例とし
ては、本発明のＬＤＬ−Ｒ遺伝子不活性化ＥＳ細胞（Ｌ
ＤＬ−ＲノックアウトＥＳ細胞）は、例えば、目的とす
る非ヒト哺乳動物のＬＤＬ−Ｒゲノム遺伝子を単離し、
そのエキソン部分（好ましくはエキソン５部分）に外来
性薬剤耐性遺伝子あるいは外来性レポーター遺伝子等を
挿入することによりエキソンの機能を抑制または破壊す
る、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転
写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナ
ルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成
できなくすることによって結果的に遺伝子を破壊するよ
うに構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ター
ゲッティングベクターと略する）を例えば自体公知の相
同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥ
Ｓ細胞についてＬＤＬ−Ｒ遺伝子上あるいはその近傍の
ＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーシ
ョン解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ
配列とターゲッティングベクター作製に使用したＬＤＬ
−Ｒ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーと
したポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）
法による解析により、ＬＤＬ−Ｒ遺伝子が実質的にＬＤ
Ｌ−Ｒの発現能を有さないＬＤＬ−ＲノックアウトＥＳ
細胞を選別して得ることができる。上記「薬剤耐性遺伝
子」は抗生物質などの薬剤耐性に関与する遺伝子を示
し、導入される遺伝子が細胞において発現したかを選抜
するマーカーとして利用される。具体的には、ネオマイ
シン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピ
シリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、スト
レプトマイシン耐性遺伝子などがあげられ、ネオマイシ
ン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、特にネオ
マイシン耐性遺伝子が好ましい。上記「レポーター遺伝
子」とは、遺伝子発現の指標になる遺伝子群のことを示
し、通常、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺
伝子が利用されることが多く、遺伝的バックグラウン
ドがないもの、遺伝子発現を定量的に行える高感度の
方法があるもの、形質転換細胞への影響が少ないも
の、発現部位の局在性が示せるものなどが好ましく用
いられる（植物細胞工学、２：７２１、１９９０）。ま
た、上記「薬剤耐性遺伝子」なども同様の目的で使用さ
れるが、「レポーター遺伝子」は、単に導入される遺伝
子が細胞において発現したかどうかだけではなく、どの
組織でいつ発現したかを調べることができ、しかも定量
的に発現量を精確に調べることができる点において、異
なるものである。具体的には、lacＺ（大腸菌β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子）、ＣＡＴ（クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（β−グル
クロニダーゼ遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオ
リン遺伝子、タウマリン遺伝子などがあげられ、なかで
もlacＺ、ＣＡＴ、特に、lacＺが好ましい。ＬＤＬ−Ｒ
ゲノム遺伝子に人為的に変異を加える好ましい方法とし
ては目的とする非ヒト哺乳動物のＬＤＬ−Ｒゲノム遺伝
子を単離し、そのエキソン部分（好ましくはエキソン５
部分）に外来性ネオマイシン耐性遺伝子または／および
外来性lacＺを挿入することによりエキソンの機能を破
壊し、ＬＤＬ−Ｒ遺伝子が実質的にＬＤＬ−Ｒの発現能
を有さないＬＤＬ−ＲノックアウトＥＳ細胞を作出する
方法などがあげられる。この操作において、ＬＤＬ−Ｒ
ゲノム遺伝子は、例えば既報のヒトＬＤＬ−ＲｃＤＮＡ
配列〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
第２６６巻，１０４０６頁（１９９１）〕など公知のｃ
ＤＮＡ配列に基づき、センスプライマーとアンチセンス
プライマーを用いたＰＣＲ法などの公知方法によって単
離することができる。

【００１０】相同組換え法等によりＬＤＬ−Ｒ遺伝子を
不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば前述のよう
な既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEran
s とKaufman の方法に準じて新しく樹立したものでもよ
い。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在一般的には
１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景
がはっきりしていないので、これに変わる純系で免疫学
的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目
的で、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６
の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善した
ＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ
１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤ
Ｆ１マウスは採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるとい
う利点に加えてＣ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つの
で、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウス
を作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロス
する事でその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに変え
る事が可能である点で有利に用いうる。これらＬＤＬ−
Ｒノックアウト遺伝子が相同組換え法等により導入され
たＥＳ細胞を選抜するためには、上述の外来性レポータ
ー遺伝子、外来性薬剤耐性遺伝子など含むマーカー遺伝
子をＬＤＬ−Ｒノックアウト遺伝子に自体公知の方法で
組み込み、ＥＳ細胞内で発現させることによってなさ
れ、例えば、外来性レポーター遺伝子として大腸菌βガ
ラクトシダーゼ遺伝子を有し、ＬＤＬレセプターが不活
性化されたＥＳ細胞、ネオマイシン耐性でかつチミジン
キナーゼ非感受性であるＬＤＬレセプターが不活性化さ
れたＥＳ細胞などが好ましく、特に、大腸菌βガラクト
シダーゼ遺伝子を有し、ネオマイシン耐性でかつチミジ
ンキナーゼ非感受性であるＬＤＬレセプターが不活性化
されたＥＳ細胞が好ましく用いられる。

【００１１】また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には
受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、本発明におい
てはこれ以外に８細胞期胚を採卵し、胚盤胞まで培養し
て用いることにより、効率よく多数の初期胚を取得でき
ることを見い出している。また、雌雄いずれのＥＳ細胞
を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キ
メラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手
間を削減するためにも、できるだけ早く雌雄の判別を行
うことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法として
は、例えばＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺
伝子を増幅、検出する方法をその１例として挙げること
ができる。この方法を使用すれば、従来核型分析をする
のに約１０⁶個の細胞数を要していたのに対して、１コ
ロニー程度のＥＳ細胞数（５０個）で済むので、培養初
期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別
で行うことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能に
したことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。ま
た、第二次セレクションとしては、例えばＧ−バンディ
ング法による染色体数の確認等により行うことができ
る。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数であることが
望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場
合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細
胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細
胞）をクローニングすることが望ましい。

【００１２】このようにして得られた胚幹細胞株の増殖
性は通常大変良いが、個体発生できる能力を失いやすい
ので、注意深く継代培養することが必要である。例え
ば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上
でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養
器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気あるいは
５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培
養するなどの方法で培養し、継代時には例えばトリプシ
ン／ＥＤＴＡ溶液（好ましくは、０．０２５％トリプシ
ン、１mＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに
用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられ
る。このような継代は通常１−３日毎に行うが、この
際、細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けら
れた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。本
発明のＬＤＬ−Ｒ遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物は、Ｌ
ＤＬ−Ｒ遺伝子の不活性化により、正常なＬＤＬ−Ｒ遺
伝子を有する同種の動物に対して、その遺伝子発現量が
５０％以下に減退させられた非ヒト哺乳動物であり、例
えば、後述の実施例に示すように該動物のmＲＮＡ量を
公知方法を用いて測定し、間接的にその発現量を比較す
ることにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、病態動物モデル系の作製の
面から固体発生及び生物サイクルが比較的短く、また繁
殖が容易なマウス、ラット等のゲッ歯動物が好ましい
が、特にこれらに限らず例えば、ウサギ，ブタ，ウシ，
ヤギ，ヒツジ，イヌ，ネコ等もこれに含まれる。

【００１３】本発明のＬＤＬ−Ｒ遺伝子発現不全（ＬＤ
Ｌ−Ｒノックアウト）非ヒト哺乳動物は、例えば、述の
ようにして作製したターゲッティングベクターを、マウ
ス胚幹細胞あるいはマウス卵細胞に自体公知の方法（例
えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム
法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェク
ション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン法など）によって導入し、これによりＬＤＬ−Ｒ遺伝
子が不活性化されたターゲッティングベクターのＤＮＡ
配列が、遺伝子相同組換えによりマウス胚幹細胞あるい
はマウス卵細胞の染色体上のＬＤＬ−Ｒ遺伝子と入れ換
わることにより、ＬＤＬ−Ｒ遺伝子をノックアウトさせ
ることができる。ＬＤＬ−Ｒ遺伝子がノックアウトされ
た細胞は、ＬＤＬ−Ｒ遺伝子上あるいはその近傍のＤＮ
Ａ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション
解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列
とターゲッティングベクターに使用したマウスＬＤＬ−
Ｒ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとし
たＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト
哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えに
よりＬＤＬ−Ｒ遺伝子の不活性化された細胞株をクロー
ニングし、その細胞を適当な時期、例えば８細胞期の非
ヒト哺乳動物胚あるいは胚盤胞に注入し、作製したキメ
ラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植す
る。作出された動物は正常なＬＤＬ−Ｒ遺伝子座をもつ
細胞と人為的に変異したＬＤＬ−Ｒ遺伝子座をもつ細胞
との両者から構成されるキメラ動物であり、該キメラ動
物の生殖細胞の一部は変異したＬＤＬ−Ｒ遺伝子座をも
つ。このようなキメラ個体と正常個体を交配することに
より得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を
加えたＬＤＬ−Ｒ遺伝子座をもつ細胞で構成された個体
が得られ、例えばコートカラーの判定等により、これを
選別することができる。このようにして得られた個体
は、通常ＬＤＬ−Ｒヘテロ発現不全個体であり、ＬＤＬ
−Ｒヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔か
らＬＤＬ−Ｒホモ発現不全個体を得ることができる。

【００１４】卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞
核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入
することにより、ターゲッティングベクターを染色体内
に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得るこ
とができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物
は、遺伝子相同組換えによってＬＤＬ−Ｒ遺伝子座に変
異のあるものを選択することにより得られる。このよう
にしてＬＤＬ−Ｒ遺伝子がノックアウトされている個体
は、交配により得られた動物個体も該遺伝子がノックア
ウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継
代を行うことができる。さらに、生殖系列の取得および
保持についても常法に従えばよい。すなわち該不活化遺
伝子の保有する雌雄の動物を交配することにより、該不
活化遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動
物を取得し、この雌雄の動物を交配することにより、す
べての子孫が該不活化遺伝子を有するように繁殖継代す
る。本発明のＬＤＬ−Ｒ遺伝子が不活性化された非ヒト
哺乳動物胚幹細胞は、ＬＤＬ−Ｒ遺伝子発現不全非ヒト
哺乳動物を作出する上で、非常に有用であり、また、本
発明のＬＤＬ−Ｒ発現不全マウスではＬＤＬ−Ｒによる
肝臓へのＩＤＬ、ＬＤＬの取り込みが低下し、その結
果、血漿中ＩＤＬ、ＬＤＬ濃度が増加する。さらに本マ
ウスは加齢に伴ない、また、高脂肪食を与えることによ
り動脈硬化症を呈することから、高脂血症だけでなく動
脈硬化モデル動物としても有用である。また、本発明の
ＬＤＬ−Ｒ遺伝子が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹
細胞を用いて得られるＬＤＬ−Ｒ遺伝子発現不全非ヒト
哺乳動物は、家族性高コレステロール血症のモデルとし
て有用であるが、適当な食餌と組み合わせることによ
り、種々の疾患治療薬のスクリーニングに応用すること
ができる。例えば、高脂血症治療薬のスクリーニン
グ、粥状動脈硬化治療薬のスクリーニング、冠動脈
硬化治療薬のスクリーニング、脳動脈硬化治療薬のス
クリーニング、黄色腫治療薬のスクリーニングなどが
あげられる。さらに、上記のスクリーニングに加えて、
各々の病体に関する研究から、体成分、例えば、血液中
のリポ蛋白の組成を調べることにより、臨床症状を予測
するための新しい臨床検査法を開発することができる。
また、動脈硬化をはじめとする上記病体の新しい診断
法、特に、無侵襲的な方法を開発するために、本発明の
ＬＤＬ−Ｒ遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物を利用するこ
とができ、ひいては、臨床への適用が可能になると期待
できる。これらの他に、病態の解明あるいは解析を行う
過程で得られる新しい知見に基づいて、新しいスクリー
ニング法や診断法の開発も可能になると期待できる。

【００１５】本明細書および図面において、塩基、アミ
ノ酸、溶媒等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合、特に明示しなければＬ−体を示すもの
とする。なお、上記略号は、それに相当する化合物のペ
プチド結合を形成しうる残基を示す場合もある。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸

【００１６】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 ［配列番号１］実施例１記載のＰＣＲ法によるプライマ
ーＭＬ１４の塩基配列を示す。 ［配列番号２］実施例１記載のＰＣＲ法によるプライマ
ーＭＬ１５の塩基配列を示す。 ［配列番号３］実施例１記載のＰＣＲ法によるプライマ
ーＭＬ１９の塩基配列を示す。 ［配列番号４］実施例１記載のＰＣＲ法によるプライマ
ーＭＬ２２の塩基配列を示す。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下に、実施例を挙げて本発明を
より具体的に説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。

【００１８】

【実施例】

実施例１ＥＳ細胞由来ＬＤＬ−ＲゲノムＤＮＡの取得とターゲテ
ィングベクターの構築 １）ロングアンドアキュレイトポリメラーゼチェインリ
アクション（ＬＡ ＰＣＲ）用鋳型ＤＮＡの調製 液体窒素中で凍結保存してある３×１０⁶個のマウス胚
幹細胞（ＥＳ細胞：ＢＤＭ−３株）を３７℃で融解後、
１０mlの冷ＥＳ用培地（ＥＳＭ）：２０％非働化牛胎仔
血清（ＦＣＳ、Ｆlow社製）、０.１mＭ非必須アミノ酸
（ＮＥＡＡ、ＧＩＢＣＯ社製）、１.０mＭピルビン酸ナ
トリウム、０.１mＭ２−メルカプトエタノール、０.１m
Ｍ核酸、１０³Ｕ／mlリコンビナントマウス白血病阻害
因子rmＬＩＦを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ、日水製薬製）に懸濁し１０００rpmで５分遠心
後、上清を除去した。事前に３７℃に保温した６ml Ｅ
ＳＭに沈殿を再懸濁後、ゼラチンコートした６cmセルカ
ルチャーディッシュ（Ｆalcon社製）に播種し、３７
℃、５％ＣＯ₂存在下で数日間培養した。細胞が飽和細
胞密度に達した時点で培地を除去し、抽出用緩衝液（１
００mＭトリス塩酸p.Ｈ.８.５、５mＭ ＥＤＴＡ、０.２
％ＳＤＳ、２００mＭ ＮaＣｌ、１００μg／ml protena
se Ｋ、（ベーリンガー社製））２mlを加え、３７℃で
細胞が溶解するまで１時間インキュベーションした。溶
解後、５００μlずつをエッペンドルフチューブに移
し、等量のフェノール／イソアミルアルコールを加え穏
やかに振盪後、５０００rpmで５分間遠心し、上清を新
しいチューブに移し等量のイソプロパノールを加えＤＮ
Ａを析出させた後、４℃、１４０００rpm、５分遠心し
上清を取り除いた。１００％の冷ＥtＯＨをＤＮＡに添
加し、洗浄後、１０分間真空乾燥し、チューブあたり３
００μlの無菌脱イオン水を加えてＤＮＡを溶解した。

【００１９】２）ターゲティングベクターの構築 前述の方法で調製したＤＮＡをテンプレートとしてロン
グアンドアキュレイトポリメラーゼチェインリアクショ
ン法（ＬＡＰＣＲ）を行い、ターゲティングベクターの
構築に必要な断片を以下の条件で取得した。ＰＣＲに用
いたプライマーはポルビノ（Ｐolvino, Ｗ.Ｊ.）ら［ソ
マティックセル モレキュラー ジェネティックス（Ｓom
atic Ｃell and Ｍolecular Ｇenetics）、第１８巻、
第４４３頁−４５０頁（１９９２年）］およびホッファ
ー（Ｈoffer, Ｍ.Ｊ.Ｖ.）ら［バイオケミカル アンド
バイオフィジカル リサーチコミュニケーションズ（Ｂi
ochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃommun.）、第１９１巻、第
８８０頁−８８６頁（１９９３年）］が報告したＬＤＬ
−ＲcＤＮＡ塩基配列、およびＢＡＬＢ／cマウス系統ゲ
ノムライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣ社製）を用い、プラ
ークハイブリダイゼーション法によりエキソン５付近の
断片２.５Ｋbpをクローニングした後、pＢluescript II
ＫＳ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にサブクローニ
ングしたpＳＢ２.５のシークエンスデータに基づき、デ
ザインした（図１）。図１中のExonまたはExはエキソン
を示し、Ｎ，Ｂ，Ｓ，ＫはそれぞれＮot Ｉ，Ｂam Ｈ
I，Ｓal Ｉ，Ｋpt Ｉの切断箇所を示す。各プライマー
の５’末端にはターゲティングベクター構築の際、プラ
スミドに断片をサブクローニングするために必要な制限
酵素配列を挿入した［具体的には、配列番号１で示され
るプライマーＭＬ１４の５’末端から３ないし８番目の
塩基配列（ＧＧＡＴＣＣ）がＢam ＨIの制限酵素配列を
示し、配列番号２で示されるプライマーＭＬ１５の５’
末端から３ないし８番目の塩基配列（ＧＴＣＧＡＣ）が
Ｓal Ｉの制限酵素配列を示し、配列番号３で示される
プライマーＭＬ１９の５’末端から３ないし１０番目の
塩基配列（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）がＮot Ｉの制限酵素配
列を示し、配列番号４で示されるプライマーＭＬ２２の
５’末端から３ないし８番目の塩基配列（ＧＧＴＡＣ
Ｃ）がＫpn Ｉの制限酵素配列を示す］。ＰＣＲはゲノ
ムＤＮＡ１μl、１０×ＬＡ ＰＣＲ緩衝液５μl、２.５
mＭ dＮＴＰs ５μl、フォワード プライマー（forward
primer）２０pmole、reverse primer（リバース プラ
イマー） ２０pmole、ＬＡ Ｔapポリメラーゼ（５Ｕ／
μl：宝酒造社製）０.５μlに無菌脱イオン水を加え
て、total ５０μlの系で９４℃、２０秒・６８℃、１
０分、３０サイクルのシャトルＰＣＲで行った。これに
よりエキソン（Exon）５の５’側（ＮotＩ−ＢamＨI断
片）２.８Ｋbpと３’側（Ｓall−Ｋpnl断片）３.６Ｋbp
のゲノムＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ増幅ＮotＩ−ＢamＨ
I断片２.８ＫbpとpＭＣ１ neo polyＡ（ＳＴＲＡＴＡＧ
ＥＮＥ社製）より調製したＮeoカセットＸhol−ＢamＨ
Ｉ断片１.１ＫbpをpＢluescript II ＫＳ＋にサブクロ
ーニング後、ＰＣＲ増幅Ｓal Ｉ−Ｋpn Ｉ断片３.６Ｋb
pを連結し、pＮＦＲ４を得た。pＮＦＲ４をＮot ＩとＫ
pn Ｉで切断することにより、エキソン５がネオマイシ
ン耐性遺伝子に置換されたターゲティングコンストラク
ト７.５Ｋbpを調製することが出来た（図２）。図２中
Ｎ，Ｂ，Ｘ，Ｓ，Ｋ，ＨはそれぞれＮot Ｉ，Ｂam Ｈ
I，Ｘho Ｉ，Ｓal Ｉ，Ｋpt Ｉ，Ｈind IIIの切断箇所
を示す。

【００２０】実施例２ＥＳ細胞用フィーダー細胞の調製 フィーダー細胞は、サワイ（Ｓawai,Ｓ.）ら、ザ ニュ
ーバイオロジスト（Ｔhe Ｎew Ｂiologist）第３巻、第
８６１頁−８６９頁（１９９１年）によるＬＩＦ産生、
ネオマイシン耐性およびハイグロマイシン耐性マウス胎
仔線維芽細胞ＮＨＬ−７（大阪大学 近藤寿人先生より
分与）を用いた。まず１０％非働化牛胎仔血清（ＦＣ
Ｓ、日本製薬製）、０.１mＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡ
Ａ、ＧＩＢＣＯ社製）を含むダルベッコ変法イーグル培
地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ社製）で培養し、細胞がコン
フルエントになる直前の約７０−８０％コンフルエント
まで培養した時点で、最終濃度が１０μg／mlになるよ
うマイトマイシンＣ（協和発酵工業製）を添加し、３７
℃で２.５時間培養した後、１mＭ ＥＤＴＡ含有ダルベ
ッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ（−））で２回洗浄
し、０.０２５％トリプシンを含む１mＭ ＥＤＴＡ（Ｐ
ＢＳ（−））処理によりシングルセルに懸濁したのち培
地を添加し、２００×g、５分間遠心してＮＨＬ−７細
胞を採取した。２×１０⁵個／mlの濃度に懸濁し、０.１
％ゼラチン（シグマ社製）でコートした９６穴および２
４穴リンブロカルチャープレート（Ｆlow社製）、６０m
m，１００mm径のセルカルチャーディッシュ（Ｆalcon社
製）および２５cm²フラスコにそれぞれ１００μl，１m
l，３ml，１０ml，３０mlの細胞懸濁液を播種し、細胞
シートを形成させた。

【００２１】実施例３エレクトロポレーション 凍結保存してあるＥＳ細胞株ＢＤＭ−３（継代数８）２
×１０⁶個を３７℃で融解後、２５cm²フラスコ（Ｆalco
n社製）に１×１０⁶個ずつ播種した。２５cm²フラスコ
には上記のとおりマウス胎仔線維芽細胞ＮＨＬ−７の細
胞シートを形成させたものを用いた。３日後に７５cm²
フラスコ（Ｆalcon社製）フィーダー上にＥＳ細胞を継
代し、３×１０⁸個程度に増殖した時点でトリプシン処
理を行い、シングルセルに解離した細胞を冷ＨＢＳ（２
５mＭ ＨＥＰＥＳ p.Ｈ.７.０５、１３７mＭ塩化ナトリ
ウム、５mＭ塩化カリウム、０.７mＭ Ｎa₂ＨＰＯ₄、１
ｇ／lグルコース）に懸濁した。２.５×１０⁷個のＥＳ
細胞と６pmoleのターゲティングベクターをジーンパル
サーキュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製０.４cm electrod
e gap）に加え、懸濁後すみやかにジーンパルサー（Ｂ
ＩＯ−ＲＡＤ社製）にセットし、９６０μＦ ２５０Ｖ
抵抗∞でＥＳ細胞へのターゲティングベクターのエレク
トロポレーションを行った。薬剤耐性ＥＳ株の選択 エレクトロポレーション後のＥＳ細胞は、ＥＳ細胞用培
地（ＥＳＭ）で５０倍に希釈し、１０cmセルカルチャー
ディッシュ（Ｆalcon社製）内のフィーダー上に３×１
０⁶個ずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ₂存在下で培養し
た。エレクトロポレーションの２４時間後にＥＳＭで１
回培地交換を行い、４８時間後に２００μg／ml Ｇ４１
８（ＧＩＢＣＯ社製）およびガンシクロビル入りＥＳＭ
でネオマイシン耐性およびチミジンキナーゼ非感受性株
の選択を開始した。適宜培地交換を行い、１０日目前後
にコロニーを顕微鏡下で無菌的にピックアップした。ピ
ックアップしたコロニーはトリプシン処理によりシング
ルセルに解離して、１／２量を９６穴マイクロプレート
（Ｆalcon社製）フィーダー上に播種し、コロニーを再
度形成した時点で、１０％ＤＭＳＯ入りＥＳＭで一時的
に凍結保存した。残りの１／２量はゼラチン（シグマ社
製）でコートした２４穴リンブロ（ＦＬＯＷ社製）上に
播種しコンフルエントにした後、実施例１記載の方法で
のＤＮＡの調製に使用した。

【００２２】ＬＤＬ−Ｒ欠損細胞株の判定 Ｇ４１８耐性コロニーより調製したゲノム遺伝子１０μ
gをＢamＨIとＨind IIIで切断後、ゲノム遺伝子のエク
ソン２の塩基配列を含む約１．５KbpのプローブＡを用
いてサザンハイブリダイゼーションを行い、相同組換え
の有無を判定した。相同組換え株からは、ノックアウト
由来の５.０Ｋbpと野生型由来の７.６Ｋbpのバンドが確
認できた。相同組換え株については凍結保存中の９６穴
マイクロプレートから融解し、順次フィーダー細胞上で
継代培養して細胞数を増し、３×１０⁶個／チューブで
再凍結した。ＬＤＬ−Ｒ欠損細胞株の取得率 計 ４.９×１０⁷個のＥＳ細胞、ＢＤＭ−３にエレクト
ロポレーションし、１５９４個のＧ４１８耐性株を得
た。このうち６７４クローンをクローニングし、各々１
／２量を９６穴マイクロプレートで培養後、１０％ＤＭ
ＳＯ含ＥＳＭを用いて凍結した。これと平行して前述の
方法でＤＮＡを抽出し、プローブＡ（図２）を用いてサ
ザンハイブリダイゼーションを行い解析した結果、下表
１に示されるとおり、４株（１−９０、３−５３、３−
７０、５−７１株）が相同組換え体であった。

【表１】 そのうち３株（３−５３、３−７０、５−７１株）につ
いては、染色体数（２n＝４０）の正常率をＧバンディ
ング法、ホーガン（Ｈogan，Ｂ.）らＭanipulating the
Ｍouse Ｅmbryo：ラボラトリー マニュアル（コール
ド スプリングハーバー ラボラトリー発行）（１９８
６年）記載の方法により調べた。下表２に示されるとお
り、正常率は３−５３、３−７０、５−７１株で各々８
７.５％、３０.０％、９２.５％であった。

【表２】 相同組換え株は継代培養で増殖させた後、３×１０⁶個
／チューブで凍結保存した。

【００２３】実施例４インジェクション用細胞株の調製 サザンハイブリダイゼーションで陽性と判定された凍結
保存中の相同組換え株のなかで、染色体数の正常率が高
かった３−５３株および５−７１株を３７℃で融解後、
２５cm²フラスコフィーダー上に播種した。３日間、毎
日ＥＳＭの交換を行い培養し、６cm径セルカルチャーデ
ィッシュフィーダー上に１／２量ずつ継代した。３日
後、ＥＳＭを除去し１mＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳで２回洗浄
後、０.２５％トリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）で細
胞をシングルセルに解離し、ＥＳＭを添加して反応を停
止した。この細胞懸濁液をゼラチンコートした１０cm径
セルカルチャーディッシュに播種し、３７℃、５％ＣＯ
₂存在下で３０分から１時間培養しフィーダー細胞を極
力ディッシュに付着させた。その後、上清を集めて４℃
で３０分間放置した後、顕微鏡下で胚操作用ガラス製マ
イクロピペットを用いてＥＳ細胞のみを回収し、インジ
ェクションに供した。

【００２４】キメラマウスの作製 まず初日に５国際単位（iu）の血清性性腺刺激ホルモン
（ＰＭＳＧ：帝國臓器製薬製）、４６−４８時間後に５
国際単位（iu）の胎盤性性腺刺激ホルモン（hＣＧ：帝
國臓器製薬製）をそれぞれ腹腔内投与することにより過
排卵誘起した後、同系統の雄マウスと交配したＩＣＲ雌
マウスを２.５日後に屠殺、開腹し、採取した子宮を、
１０％ＦＣＳ、２０mＭ ＨＥＰＥＳ含有ＤＭＥＭで灌流
することにより８細胞期胚を採取した。事前に６０mm径
のペトリディッシュに入れた流動パラフィンでおおった
２０mＭ ＨＥＰＥＳ含有ＬＩＦ非含有ＥＳＭのマイクロ
ドロップ内に８細胞期胚およびＥＳ細胞をそれぞれプー
ルした。次にトクナガおよびツノダ（Ｔokunaga, Ｔ．a
nd Ｔsunoda, Ｙ.）Ｄev．Ｇrowth Ｄiffer.,第３４
巻、第５６１頁−５６６頁（１９９２年）に記載された
方法に従ってマイクロインジェクションを行ない、８細
胞期胚の透明帯内にＥＳ細胞を８−１５個ずつ注入し
た。インジェクション後の卵は、精管結紮マウスと交配
した２.５日目の偽妊娠ＩＣＲ雌マウスの左右の子宮角
に約１０個ずつ移植した。ＥＳ細胞３−５３株は２７９
個の卵に注入し６０匹の産仔を、５−７１株は５４０個
の卵に注入し７２匹の産仔を得た。このうちキメラマウ
スは、３−５３株由来が雄６匹、雌２匹で、５−７１株
由来が雄７匹、雌５匹であった。得られた雄のキメラマ
ウスは、生後約６から８週齢で精子ＤＮＡ中にターゲテ
ィングベクター由来のＤＮＡが存在するかどうかを、マ
ン（Ｍann，Ｇ.Ｂ.）らＩＪ.Ｒeprod. and Ｆertil.，
第９９巻、第５０５頁−５１２頁（１９９３年）の報告
に従いＰＣＲ法により調べ、存在が確認できた個体は生
殖系列キメラマウスとしてＩＣＲ雌マウスと交配し産仔
を得た。ＥＳ細胞由来の産仔はコートカラー（アグー
チ）により判定した。ＥＳ細胞由来のコートカラーを示
す産仔の尾からＤＮＡを抽出して、ＬＤＬ−Ｒ欠損細胞
株の判定時と同様の方法でサザンハイブリダイゼーショ
ンを行い、ヘテロ欠損マウス個体を選別した（図３）。

【表３】

【００２５】生殖系列キメラマウスおよびＬＤＬ−Ｒ欠
損マウスの作製 雄キメラマウスのうち生殖系列への移行が見られたマウ
スは、それぞれ３−５３株で３匹、５−７１株で１匹で
あった（表３）。サザンハイブリダイゼーション法でＥ
Ｓ細胞由来のコートカラーを示す産仔よりヘテロ欠損マ
ウスを選別した。３−５３株由来の産仔１８匹より雄３
匹、雌４匹のヘテロ欠損マウスが得られた。これらのヘ
テロ欠損マウス同士の交配により、ＬＤＬ−Ｒ遺伝子ホ
モ欠損個体１５匹、ヘテロ欠損個体２３匹、野生型個体
１３匹の産仔が得られた。その比率はメンデル則に従い
ほぼ１：２：１であった。

【００２６】実施例５ＬＤＬ−Ｒヘテロ欠損マウスにおける血中総コレステロ
ールの測定 １０週齢においてマウスの眼底静脈より７０μl採血
し、総コレステロール値をアレイン（Ａllain, Ｃ.
Ｃ.）らＣlin.Ｃhem.,第２０巻、第４７０頁−４７５頁
（１９７４年）のコレステロールオキシダーゼ法を利用
したキット（コレステロールＥ−ＨＡテストワコー；和
光純光製）により測定した。その結果、下表４に示され
たとおり、総コレステロール平均値はＬＤＬ−Ｒ遺伝子
ホモ欠損雄マウス１８７mg／dl、ヘテロ欠損雄マウス１
３３mg／dl、野生型雄マウス１０１mg／dlであり、ホモ
欠損マウス＞ヘテロ欠損マウス＞野生型の順で高い傾向
にあった。以上のことから、本発明のホモ欠損マウスは
抗高脂血症剤などの薬効評価モデルとして有用であると
考えられる。

【表４】 実施例６ＬＤＬ−Ｒホモ欠損マウスにおける血中総コレステロー
ルの測定 実施例５と同様の方法により、２５〜３５週齢のホモ欠
損マウスと、１５〜２５週齢の野生型マウスについて血
中総コレステロールを測定した（図４）。ホモ欠損マウ
スにおける総コレステロール平均値（ｍｅａｎ±ＳＤ）
は、雄は２７８±３２ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝２５）、雌は２
６３±１００ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝１９）であり、雌雄間に
有意差は認められなかった。一方、野生型マウスにおけ
る総コレステロール平均値（ｍｅａｎ±ＳＤ）は、雄は
１３２±２２ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝１０）に対して、雌は８
９±６ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝１０）で、雄の方が有意（ｐ＜
０．００１）に高い値を示した。ホモ欠損マウスと野生
型マウスの比較においては、雌雄ともにホモ欠損マウス
が有意（ｐ＜０．００１）に高い値を示した。なお、こ
れらのマウスに１％コレステロール食を２週間給餌した
時の血中総コレステロール値は、ホモ欠損マウスの雄は
平均で１．８倍、雌は３．４倍に上昇し、雄より雌のほ
うが高い反応性を示した。一方、野生型マウスでは雄は
１．５倍、雌は２倍の増加を示したが、雌雄ともにホモ
欠損マウスに比べて低い上昇率であった。以上のことか
ら、本発明のホモ欠損マウスは抗高脂血症剤などの薬効
評価モデルとして有用であると考えられる。

【００２７】

【発明の効果】本発明のＬＤＬ−Ｒ遺伝子が不活性化さ
れた非ヒト哺乳動物胚幹細胞または該胚幹細胞を用いて
作出されるＬＤＬ−Ｒ遺伝子不全非ヒト哺乳動物は、高
脂血症患者などの治療におけるＬＤＬ−Ｒ遺伝子導入に
よる薬物スクリーニング系の確立、遺伝子治療の評価な
どに利用し得る。

【００２８】

【配列表】

配列番号（SEQ ID NO）：１ 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：３０ 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STARADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nucl
eic acid） アンチセンス（ANTI-SENCE）：Ｎｏ 配列：CCGGATCCCT TAATTGCAGT TAGAGGGCTG GCAAGATGGC 30

【００２９】配列番号（SEQ ID NO）：２ 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：３０ 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STARADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nucl
eic acid） アンチセンス（ANTI-SENCE）：Ｎｏ 配列：CCGTCGACCC TTTGCCCCTC ATGCAGCAGG AACGAGTTCC 30

【００３０】配列番号（SEQ ID NO）：３ 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：３３ 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STARADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nucl
eic acid） アンチセンス（ANTI-SENCE）：Ｎｏ 配列：ATGCGGCCGC TGTCTGTCAC CTGTCAGTCC AATCAATTCA GCT 33

【００３１】配列番号（SEQ ID NO）：４ 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH）：３０ 配列の型（SEQUENCE TYPE）：核酸（nucleic acid） 鎖の数（STARADEDNESS）：一本鎖（single） トポロジー（TOPOLOGY）：直鎖状（linear） 配列の種類（MOLECULAR TYPE）：他の核酸（other nucl
eic acid） アンチセンス（ANTI-SENCE）：Ｎｏ 配列：CCGGTACCCC ACAGCCTTGC AGACCCTGGT GTGTGGGTCC 30

【００３２】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で調製したプライマーの構築図。

【図２】実施例１で得られたターゲティングベクターの
構築図。

【図３】実施例４で得られたＬＤＬ−Ｒ遺伝子発現不全
マウスのサザンハイブリダイゼーションによる解析結
果。

【図４】実施例６で行われた血中総コレステロール値の
解析結果。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】外来性レポーター遺伝子を有し、ＬＤＬレ
   セプター遺伝子が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細
   胞。
2. 【請求項２】レポーター遺伝子が大腸菌βガラクトシダ
   ーゼ遺伝子である請求項１記載の胚幹細胞。
3. 【請求項３】ネオマイシン耐性でかつチミジンキナーゼ
   非感受性である請求項１記載の胚幹細胞。
4. 【請求項４】非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項
   １記載の胚幹細胞。
5. 【請求項５】ゲッ歯動物がマウスである請求項４記載の
   胚幹細胞。
6. 【請求項６】請求項１記載の胚幹細胞を用いて得られる
   ＬＤＬレセプター遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物。
7. 【請求項７】非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項
   ６記載の動物。
8. 【請求項８】ゲッ歯動物がマウスである請求項７記載の
   動物。