CN108441513A - 一种外源基因植入蜜蜂基因组的方法 - Google Patents

一种外源基因植入蜜蜂基因组的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108441513A
CN108441513A CN201810179845.XA CN201810179845A CN108441513A CN 108441513 A CN108441513 A CN 108441513A CN 201810179845 A CN201810179845 A CN 201810179845A CN 108441513 A CN108441513 A CN 108441513A
Authority
CN
China
Prior art keywords
added
honeybee
solution
plasmid
fertilized eggs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201810179845.XA
Other languages
English (en)
Inventor
何旭江
柯俐
胡小芬
曾志将
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangxi Agricultural University
Original Assignee
Jiangxi Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangxi Agricultural University filed Critical Jiangxi Agricultural University
Priority to CN201810179845.XA priority Critical patent/CN108441513A/zh
Publication of CN108441513A publication Critical patent/CN108441513A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
    • A01K67/0337—Genetically modified Arthropods
    • A01K67/0339—Genetically modified insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/70—Invertebrates
    • A01K2227/706—Insects, e.g. Drosophila melanogaster, medfly
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/103—Plasmid DNA for invertebrates
    • C12N2800/105—Plasmid DNA for invertebrates for insects

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种外源基因植入蜜蜂基因组的方法，其包括如下步骤：S1、制备质粒和提取转座酶mRNA；S2、收集至少一个蜜蜂受精卵；S3、将所述质粒以及转座子mRNA注射到至少一个受精卵中；S4、对注射有所述质粒以及转座子mRNA的受精卵进行体外培养；以及S5、进行基因转移结果检测。本发明在显微操作平台下将基因转移元件通过显微注射系统注入蜜蜂卵中，从而使外源性遗传物质嵌入到蜜蜂基因组上，形成蜜蜂转基因嵌合体。同时，本发明还研制了配套的蜜蜂人工培养技术，可在人工条件下将注射外源遗传物质后的蜜蜂卵成功培育成成年蜜蜂。该发明操作简单，实践性强，成功率高。

Description

一种外源基因植入蜜蜂基因组的方法
技术领域
本发明涉及转基因技术领域，具体涉及一种将外源基因植入蜜蜂基因组的方法。
背景技术
外源基因移植技术广泛应用于许多动植物的育种与分子生物学机理研究，但在蜜蜂这种社会性昆虫中却研究较少，成功的蜜蜂基因移植技术更是凤毛麟角。在蜜蜂领域也有先后尝试了精子介导法、电穿法与显微注射法等基因移植和转基因技术。
由于蜜蜂的生物学特殊性，致使上述的基因移植技术不能进行高效的基因移植与表达，至今仍然没有较为有效的适用于蜜蜂的外源基因移植技术，上述方法的蜜蜂基因转移效率极低，能够成活的蜜蜂个体也极低。
发明内容
本发明针对现有技术的上述缺陷，提供一种可极大提高蜜蜂基因转移效率和蜜蜂个体的成活率的蜜蜂基因转移方法，以此获得蜜蜂转基因嵌合体。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
提供了一种外源基因植入蜜蜂基因组的方法，其包括如下步骤：
S1、制备质粒和提取转座酶mRNA；
S2、收集至少一个蜜蜂受精卵；
S3、将所述质粒以及转座子mRNA注射到至少一个受精卵中；
S4、对注射有所述质粒以及转座子mRNA的受精卵进行体外培养；
S5、进行基因转移结果检测；
以及S6、基因表达荧光检测。
优选的，步骤S1中，制备质粒的过程包括：
S11、质粒转化：从-80℃冰箱中取预定量的感受态细胞悬液，室温下解冻，且解冻后立即置于冰上；加入pBac[6×P3-rubia]质粒溶液，摇匀，且冰上放置25-35min；42℃水浴中热击90秒；热击后迅速置于冰上冷却3～5min；加入不含Amp的LB液体培养基，混匀后，在37℃培养箱中，转速200转/min条件下培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因AmpR；将上步菌液摇匀后取100μL涂布于含Amp的筛选平板LB上，且正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃下培养12～24h；
S12、质粒的提取：从37℃培养12～16h的氨苄青霉素固体培养平板中挑取白色单菌落接种到5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃、转速200转/min条件下培养约12h至对数生长后期；取5-15mL过夜培养的菌液，加入离心管中，4℃下13000rpm离心1分钟，收集菌体；用移液枪尽量吸弃全部上清，且吸弃过程中不碰到细菌；向留有菌体沉淀的离心管加入300μLBuffer P1溶液，使用移液枪充分混匀，悬浮细菌沉淀；加入300μL Buffer P2溶液，盖紧管口，轻轻地上下颠倒离心管8～10次，以混匀内容物，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟，使得溶液变得清亮粘稠；向离心管中加入300μLBuffer E3溶液，立即上下颠倒混匀8～10次，待出现白色絮状沉淀时，室温放置5分钟；4℃下13000rpm离心5min；吸取上清液，加入到已装有收集管的过滤柱中，13000rpm离心1min过滤，将收集管中的滤液转移到离心管中；向滤液中加入300μL异丙醇，上下颠倒混匀；向已加入收集管的吸附柱中加入200μL的Buffer PS溶液，然后4℃下13000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，以完成柱平衡；将滤液与异丙醇的混合液转移到已完成柱平衡的吸附柱中，4℃下13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；向吸附柱中加入750μLBuffer PW溶液，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心1min；在吸附柱的吸附膜的中间部位加入20μL含RNaseA的TE缓冲液，室温放置2-5分钟，13000rpm离心2min，离心后获得的质粒pBac[6×P3-rubia]存于-20℃冰箱中备用；
S13、质粒鉴定：用限制性内切酶EcoR I对步骤S12中，最后离心获得的质粒pBac[6×P3-rubia]进行单酶切，其反应体系总体积为40μL，包括如下组分：
10×buffer 4μL
pBac[6×P3-rubia] 14μL
EcoR I 2μL
其余为ddH2O；
37℃下反应2h，酶切完成后，加入2μL溶度为20μg/mL的Rnase，65℃下反应10min，杀酶和除RNA后取3μL电泳，剩余保存备用。
优选的，步骤S1中，提取转座酶mRNA的过程包括：
S11’、模板线性化：使用SalI限制酶内切线性化提取转座酶质粒DNA，线性化体系共300μL，且包括如下组分：
10×Buffer 15μL
模板DNA 40μL
SalI限制酶 10μL
其余为ddH2O；
37℃下进行2h酶切反应，获得转座酶质粒DNA；
S12’、终止限制酶消化反应：终止限制酶消化反应体系如下：
1/20体积 0.5M EDTA
1/10体积 3M醋酸钠或者5M醋酸铵
2体积 乙醇
将所述终止限制酶消化反应体系混合均匀，放置在-20℃冷却至少15分钟；对获得的转座酶质粒DNA以10000rpm离心15分钟，以对所述转座酶质粒DNA进行纯化，再移除悬浮液，重新离心5-10秒钟，再用微量枪头移除残余液体，滴入单蒸水或者TE缓冲液至转座酶质粒DNA总浓度为0.5-1μg/μL；
S13’、配置转录反应体系：所述反应体系共20体积，其包括如下组分：
其余为Nuclease-free Water；
将所述转录反应体系在试管中充分混合，轻柔敲击试管，或用移液枪上下轻柔混匀所述转录反应体系，然后4000-6000转/min下离心10-20s，以此将残留在试管壁上的反应混合液离心到试管底部；
S14’、37℃下孵育1-2小时，通过逆转录获得转座酶mRNA；
S15’、回收RNA：在转座酶mRNA样品中加入Elution Solution到100μL终体积，轻柔混合均匀；加入350μLBinding Solution Concentrate以及250μL 100％乙醇到转座酶mRNA样品中，用移液器吸打，使混合液均匀；在收集管中放入滤筒，再向所述滤筒中加入所述混合液，10000-14000rpm离心15-60s，直至所述混合液全部通过所述滤筒，滤过液进入到所述收集管中；将所述滤过液重新注入到所述滤筒内，对所述滤筒10000-14000rpm离心15秒-60s，重复2-3次；加入500μL Wash Solution到所述滤筒内，离心，弃滤过液，重复2-3次；不加入任何液体，再次对所述滤筒离心10-30秒；在所述滤筒中加入50μL的Elution Solution后置于新的收集管中，且将新的收集管置于65-70℃的加热器中5-10分钟；取出所述加热器中的收集管，在室温下离心1分钟，将回收的转座酶mRNA保存在-80℃环境下备用。
优选的，所述步骤S2包括：将巢脾预先放入蜂群清理12小时，利用隔王栅将蜂王限制在所述巢脾上，控王产卵2小时，获得并收集至少一个蜜蜂受精卵。
优选的，所述步骤S3包括：
S31、将所述质粒与转座酶mRNA进行溶解和混合，获得混合液，且在冷冻离心机上，4℃、1000rpm对所述混合液离10min；
S32、将混合液上样于显微注射针中，且将所述显微注射针与显微操作系统连接；所述显微注射针直径2-5μm，针尖角度37°，长度5.1cm；
S33、将所述显微注射针中的混合液注入到蜜蜂受精卵中，且注射时，将蜜蜂受精卵与显微注射针分别调试在倒置显微镜视野的中央，调节注射压力为650-680hpa，确认出液后备用，调整受精卵与针尖的角度至70-90°；所述显微注射针从受精卵的尾端1/3处注入约2.5-3.5nL的混合液，待看到蜂卵中出现液滴时立即移出针端。
优选的，所述步骤S4包括：
将完成步骤S3中显微注射的蜜蜂受精卵放在塑料盒中，并移入35℃、湿度75％的生化培养箱中人工培养；所述塑料盒中添加18％硫酸溶液，以用于保湿与消毒，且所述受精卵放置在所述硫酸溶液的液面上方；培养至第3天，待所述受精卵孵化成为幼虫时，立即用移虫针将幼虫取出，移入已装有食物的24孔细胞培养皿中；所述24孔细胞培养皿上，每孔中均放置约1克粥状食物以及5只幼虫，每两天换一次食物，孵化后的第7天结束喂食，盖上培养皿盖板，使幼虫进入蛹期发育；蛹期发育12天后羽化成成年蜜蜂个体。
优选的，所述粥状食物按重量百分比计，包括如下组分：
且每只幼虫前3天每天喂食200μL食物，后3天每天喂食300μL食物。
优选的，所述步骤S5包括：
S51、受精卵RNA提取：将所取的受精卵样品移入无Rnase的离心管中，加入200μLTransZol溶液，充分研磨；再加入800μLTransZol溶液，室温下放置10分钟，4℃下13000rpm离心10min，将上清液转移至新的无Rnase的离心管中；在所述上清液中加入200μL氯仿，轻轻摇匀，室温下静置5min；4℃下13000rpm离心10min，吸取550-650μL上层水相，且转移至新的无Rnase的离心管中；加入与所述上层水相等体积的氯仿，轻轻混匀，室温下静置5min；4℃下13000rpm离心15min，再次取上清液转移至新的无Rnase的离心管中；加入上清液两倍体积的氯仿，轻轻混匀，室温下静置10min，4℃下13000rpm离心15min后弃去上清液；加入1ml 75％乙醇，4℃下8000rpm离心5min，弃上清液；加入1ml无水乙醇，洗涤RNA沉淀，4℃下8000rpm离心5min，弃上清液；于超净台干燥RNA沉淀；加入20μL的DEPC水，待RNA沉淀完全溶解后，分装一部分用于测定RNA质量，其余保存于-80℃环境备用；
S52、RNA变性：所述RNA变性反应体系包括如下组分：
总RNA 8μL
Oligo-dT 3μL
将上述试剂混匀，于70℃下温育10min后立即冰浴2min。
S53、反转录：所述RNA变性反应体系供50μL，其包括如下组分：
其余为DEPC水；
将上述反应体系于42℃下温育60min，再在70℃下温育15min，最后合成的cDNA加50μL灭菌超纯水稀释置于-80℃环境保存备用；
S54、PCR：所述PCR所用引物如下：
上游引物:5’-gatttaaggtcaagatggaggga-3’
下游引物:5’-gtgtagtccccattatggctga-3’
所述PCR反应体系共25μL，包括如下组分：
其余为dd H2O；
所述PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s；56℃退火45s；72℃延伸90s；30个循环；72℃终延伸10min；
S55、电泳与测序：将PCR产物采用琼脂糖凝胶进行电泳，电压90V，时间30～45min；电泳后，在紫外灯下观察，并用凝胶成像系统拍照，确认PCR产物的质量；切胶回收，并对PCR产物进行序列检测，最终确定基因转移效果。
优选的，所述步骤S6包括：将蛹期蜜蜂置于荧光显微镜视野中，选择红色荧光检测模式，以对蜜蜂头部进行荧光检测。
本发明技术方案的有益效果在于：本发明提供了一种成熟的蜜蜂卵显微注射技术，该技术在显微操作平台下，将基因转移元件通过显微注射系统注入蜜蜂卵中，从而使外源性遗传物质嵌入到蜜蜂基因组上，形成蜜蜂转基因嵌合体。同时，本发明还研制了配套的蜜蜂人工培养技术，可在人工条件下将注射外源遗传物质后的蜜蜂卵成功培育成成年蜜蜂。该发明操作简单，实践性强，成功率高。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是实施例一中外源基因植入蜜蜂基因组的方法的步骤流程图；
图2是实施例一中pBac[6×p3-rubia]转座子质粒结构图；
图3是实施例一中显微注射的操作示意图；
图4是实施例一中Rubia基因体外PCR扩增电泳图；
图5是实施例一中Rubia基因回收产物序列对比图；
图6是实施例一中Rubia荧光蛋白基因在蜜蜂头部中的荧光表达结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案以及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一：
如图1所示，本发明中的外源基因植入蜜蜂基因组的方法包括如下步骤：
S1、制备质粒和提取转座酶mRNA；
S2、收集至少一个蜜蜂受精卵；
S3、将所述质粒以及转座子mRNA注射到至少一个受精卵中；
S4、对注射有所述质粒以及转座子mRNA的受精卵进行体外培养；
S5、进行基因转移结果检测；
以及S6、基因表达荧光检测。
需要说明的是，本实施例中的质粒为携带外源性rubia基因的PiggyBac质粒，(也即下述的pBac[6×p3-rubia]质粒)，引自德国Martin Beye教授团队，图2示出了pBac[6×p3-rubia]转座子质粒结构图；
具体的，步骤S1中，制备质粒的过程包括：
S11、质粒转化：从-80℃冰箱中取预定量(如200μL)的感受态细胞悬液，室温下解冻，且解冻后立即置于冰上；加入1μl/100μl的pBac[6×p3-rubia]质粒溶液，摇匀，且冰上放置25-35min(优选为30min)；42℃水浴中热击90秒；热击后迅速置于冰上冷却3～5min(优选为4min)；加入不含Amp的LB液体培养基，混匀后，在37℃培养箱中，转速200转/min条件下培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因AmpR；将上步菌液摇匀后取100μL涂布于含Amp的筛选平板LB上，且正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃下培养12～24h；
S12、质粒的提取：从37℃培养12～16h的氨苄青霉素固体培养平板中挑取白色单菌落接种到5mL含Amp的LB液体培养基(含100μg/mL Amp)中，37℃、转速200转/min条件下培养约12h至对数生长后期；取5-15mL过夜培养的菌液，加入离心管中，4℃下13000rpm离心1分钟，收集菌体；用移液枪尽量吸弃全部上清，且吸弃过程中不碰到细菌；向留有菌体沉淀的离心管加入300μL Buffer P1溶液，使用移液枪充分混匀，悬浮细菌沉淀；加入300μLBuffer P2溶液，盖紧管口，轻轻地上下颠倒离心管8～10次，以混匀内容物(此过程千万不要振荡)，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟，使得溶液变得清亮粘稠；向离心管中加入300μL Buffer E3溶液，立即上下颠倒混匀8～10次，待出现白色絮状沉淀时，室温放置5分钟；4℃下13000rpm离心5min；吸取上清液，加入到已装有收集管的过滤柱(如Endo-Remover FM)中，13000rpm离心1min过滤，将收集管中的滤液转移到离心管中；向滤液中加入300μL异丙醇，上下颠倒混匀；向已加入收集管的吸附柱(如Spin Columns DL)中加入200μL的BufferPS溶液，然后4℃下13000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，以完成柱平衡；将滤液与异丙醇的混合液转移到已完成柱平衡的吸附柱中，4℃下13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；向吸附柱中加入750μLBuffer PW溶液，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心1min；在吸附柱的吸附膜的中间部位加入20μL含RNaseA的TE缓冲液(优选的，所述含RNaseA的TE缓冲液pH为8.0，且含20μg/mL RNaseA)，室温放置2-5分钟，13000rpm离心2min，离心后获得的质粒pBac[6×P3-rubia]存于-20℃冰箱中备用；
S13、质粒鉴定：用限制性内切酶EcoR I对步骤S12中，最后离心获得的质粒pBac[6×P3-rubia]进行单酶切，其反应体系总体积为40μL，包括如下组分：
10×buffer 4μL
pBac[6×P3-rubia] 14μL
EcoR I 2μL
其余为ddH2O；
37℃下反应2h，酶切完成后，加入2μL溶度为20μg/mL的Rnase，65℃下反应10min，杀酶和除RNA后取3μL电泳，剩余保存备用。
步骤S1中，提取转座酶mRNA的过程包括：
S11’、模板线性化：使用SalI限制酶内切线性化提取转座酶质粒DNA，线性化体系共300μL，且包括如下组分：
10×Buffer 15μL
模板DNA 40μL
SalI限制酶 10μL
其余为ddH2O；
37℃下进行2h酶切反应，获得转座酶质粒DNA；
S12’、终止限制酶消化反应：终止限制酶消化反应体系如下：
1/20体积 0.5M EDTA
1/10体积 3M醋酸钠或者5M醋酸铵
2体积 乙醇
将所述终止限制酶消化反应体系混合均匀，放置在-20℃冷却至少15分钟；对获得的转座酶质粒DNA以10000rpm离心15分钟，以对所述转座酶质粒DNA进行纯化，再移除悬浮液，重新离心5-10秒钟，再用微量枪头移除残余液体，滴入单蒸水或者TE缓冲液至转座酶质粒DNA总浓度为0.5-1μg/μL；
S13’、配置转录反应体系，其具体包括如下步骤：
S131’、复苏冷冻试剂：放置RNA多聚酶混合物(一般储存在甘油中，不会在-20℃凝结)于冰上，轻摇10×Reaction Buffer和核糖核苷酸(如2×NTP/CAP)，直到两者均彻底变成溶液；将核糖核苷酸储存于冰上，以及将10×Reaction Buffer存在室温下；优选的，所述RNA多聚酶混合物、10×Reaction Buffer和核糖核苷酸在开盖之前均要进行微离心，防止存在于试管周边边缘的试剂丢失；
S132’、室温下配制转录反应体系：先加入水和核糖核苷酸(如2×NTP/CAP)，后加入10×Reaction Buffer，以下是20体积(如每1体积为μL，供2020μL)的反应体系，实际反应体系可以根据需要按比例增加或减少；所述20体积的反应体系包括如下组分：
其余为Nuclease-free Water；
将所述转录反应体系在试管中充分混合，轻柔敲击试管，或用移液枪上下轻柔混匀所述转录反应体系，然后4000-6000转/min下离心10-20s，以此将试管壁残留的反应混合液离心到试管底部；
S14’、37℃下孵育1-2小时(优选为2小时)，通过逆转录获得转座酶mRNA；
S15’、回收RNA：在转座酶mRNA样品中加入Elution Solution到100μL终体积，轻柔混合均匀；加入350μLBinding Solution Concentrate以及250μL 100％乙醇到转座酶mRNA样品中，用移液器吸打，使混合液均匀；在收集管中放入滤筒(如Filter Cartridge)，再向所述滤筒中加入所述混合液，10000-14000rpm离心15-60s(优选的，离心时速度保持在10000-15000×g，或10000-14000rpm，否者滤膜会被破坏)，直至所述混合液全部通过所述滤筒，滤过液进入到所述收集管中；将所述滤过液重新注入到所述滤筒内，对所述滤筒10000-14000rpm离心15秒-60s，重复2-3次；加入500μL Wash Solution到所述滤筒内，离心(优选的，离心时速度保持在10000-15000×g)，弃滤过液，重复2-3次；不加入任何液体，再次对所述滤筒离心(优选的，离心时速度保持在10000-15000×g)10-30秒；在所述滤筒中心处加入50μL的Elution Solution后置于新的收集管中，且将新的收集管置于65-70℃的加热器中5-10分钟；取出所述加热器中的收集管，在室温下离心(优选的，离心时速度保持在10000-15000×g)1分钟，将回收的转座酶mRNA保存在-80℃环境下备用。
所述步骤S2包括：将巢脾预先放入蜂群清理12小时，利用隔王栅将蜂王限制在所述巢脾上，控王产卵2小时，获得并收集至少一个(优选为50个)蜜蜂受精卵。
所述步骤S3包括：
S31、将所述质粒pBac[6×P3-rubia]与转座酶mRNA进行溶解和混合，获得混合液，且在冷冻离心机上，4℃、1000rpm对所述混合液离10min；
S32、将混合液上样于显微注射针中，且将所述显微注射针与显微操作系统(优选为OLYMPUS倒置荧光显微镜系统)连接；所述显微注射针直径2-5μm，针尖角度37°，长度5.1cm；
S33、如图3所示，将所述显微注射针中的混合液注入到蜜蜂受精卵中，且注射时，将蜜蜂受精卵与显微注射针分别调试在倒置显微镜视野的中央，调节注射压力为650-680hpa(优选为660hpa)，确认出液后备用，调整受精卵与针尖的角度至70-90°；所述显微注射针从受精卵的尾端1/3处注入约2.5-3.5nL的混合液，停留1-2s，待看到蜂卵中出现液滴时立即移出针端；
因受精卵在离体数小时内会进行细胞扩增，从而影响对外源基因的接受率，因此，整个步骤S3要在1小时内完成。
所述步骤S4包括：
将完成步骤S3中显微注射的蜜蜂受精卵放在塑料盒中，并移入35℃、湿度75％的生化培养箱中人工培养；所述塑料盒中添加16％硫酸溶液，以用于保湿与消毒，且所述受精卵放置在所述硫酸溶液的液面上方；培养至第3天，待所述受精卵孵化成为幼虫时，立即用移虫针将幼虫取出，移入已装有食物的24孔细胞培养皿中；所述24孔细胞培养皿上，每孔中均放置约1克粥状食物以及5只幼虫，每两天换一次食物，孵化后的第7天结束喂食，盖上培养皿盖板，使幼虫进入蛹期发育；蛹期发育12天后羽化成成年蜜蜂个体；
其中，所述粥状食物按重量百分比计，包括如下组分：
且每只幼虫前3天每天喂食200μL食物，后3天每天喂食300μL食物。
如表1所示，对232粒蜜蜂受精卵进行显微注射后，在恒温恒湿培养箱中室内培养，其平均孵化率达13.4％，成蛹率达7.3％。高于郭冬生等人(即郭冬生，孙亮先，曾志将等.中华蜜蜂精子介导egfp基因转移[J].昆虫学报,2007,50(9):878-882.)的实验结果。
表1 注射转座子质粒与转座酶mRNA培养数据
所述步骤S5包括：
S51、受精卵RNA提取：将所取的受精卵样品移入无Rnase的离心管中，加入200μLTransZol溶液，充分研磨；再加入800μL TransZol溶液，室温下放置10分钟，4℃下13000rpm离心10min，将上清液转移至新的无Rnase的离心管中；在所述上清液中加入200μL氯仿，轻轻摇匀，室温下静置5min；4℃下13000rpm离心10min，吸取550-650μL上层水相(不要吸到中间蛋白层)，且转移至新的无Rnase的离心管中；加入与所述上层水相等体积的氯仿，轻轻混匀，室温下静置5min；4℃下13000rpm离心15min，再次取上清液转移至新的无Rnase的离心管中；加入上清液两倍体积的氯仿，轻轻混匀，室温下静置10min，4℃下13000rpm离心15min，待离心管底部和侧壁上形成胶状沉淀后弃去上清液；加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，剧烈涡旋，4℃下8000rpm离心5min后弃上清液；加入1ml无水乙醇，剧烈涡旋，洗涤RNA沉淀，4℃下8000rpm离心5min后弃上清液；于超净台干燥RNA沉淀；加入20μL的DEPC水，待RNA沉淀完全溶解后，分装一部分用于测定RNA质量，其余保存于-80℃环境备用；
S52、RNA变性：所述RNA变性反应体系包括如下组分：
总RNA 8μL
Oligo-dT 3μL
将上述试剂混匀，于70℃下温育10min后立即冰浴2min。
S53、反转录：所述RNA变性反应体系供50μL，其包括如下组分：
其余为DEPC水；
将上述反应体系于42℃下温育60min，再在70℃下温育15min，最后合成的cDNA加50μL灭菌超纯水稀释置于-80℃环境保存备用；
S54、PCR：所述PCR所用引物由Primer Primier 5软件设计，上海生工技术有限公司合成，其具体序列如下：
上游引物:5’-gatttaaggtcaagatggaggga-3’
下游引物:5’-gtgtagtccccattatggctga-3’
所述PCR反应体系共25μL，包括如下组分：
其余为ddH2O；
所述PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s；56℃退火45s；72℃延伸90s；30个循环；72℃终延伸10min；
S55、电泳与测序：将PCR产物采用琼脂糖凝胶(含5μL/100mL的EB)进行电泳，电压90V，时间30～45min；电泳后，在紫外灯下观察，并用凝胶成像系统拍照，确认PCR产物的质量；切胶回收，由上海生物工程科技有限公司对PCR产物进行序列检测，最终确定外源基因转移效果；
如图4所示，通过琼脂糖凝胶电泳获得的特异性的Rubia基因产物条带大小与预期目的片段大小基本一致(约590bp)，且目的条带清楚，说明转座子质粒Rubia基因体外PCR扩增效果良好；进一步的，如图5所示，将PCR回收产物进行测序，并在NCBI的blast进行比对，结果表明：目的条带的基因序列与质粒pBac[6×P3-rubia]中Rubia基因原始基因序列配比率为81.23％，序列基本一致，由此表明外源性Rubia基因片段成功嵌入蜜蜂卵基因组中。
进一步的，所述步骤S6包括：将蛹期蜜蜂置于荧光显微镜视野中，选择红色荧光检测模式，以对蜜蜂头部进行荧光检测。如图6所示，荧光显微镜检测17只显微注射蜜蜂蜂蛹，结果表明：显微注射实验组(即图6中的A)蜜蜂头部的吻与复眼有微弱的荧光信号，而对照组(即图6中的B)无明显红色荧光信号，由此表明Rubia红色荧光蛋白基因嵌入蜜蜂基因组后，可在注射组蜜蜂蛹中进行有效表达。
综上所述，本发明建立了蜜蜂外源基因显微注射技术，可将外源基因通过该技术植入蜜蜂基因组中，实现基因转移，并通过人工体外培养获得有效转基因嵌合体。与传统的精子介导和电穿法等转基因技术相比，本发明的基因转移技术操作性更强，转移效率以及个体成功率均大幅提高，并可广泛应用与其他卵生动物的外源基因植入和转基因研究与应用中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种外源基因植入蜜蜂基因组的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备质粒和提取转座酶mRNA；
S2、收集至少一个蜜蜂受精卵；
S3、将所述质粒以及转座子mRNA注射到至少一个受精卵中；
S4、对注射有所述质粒以及转座子mRNA的受精卵进行体外培养；
S5、进行基因转移结果检测；
以及S6、基因表达荧光检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，制备质粒的过程包括：
S11、质粒转化：从-80℃冰箱中取预定量的感受态细胞悬液，室温下解冻，且解冻后立即置于冰上；加入pBac[6×P3-rubia]质粒溶液，摇匀，且冰上放置25-35min；42℃水浴中热击90秒；热击后迅速置于冰上冷却3～5min；加入不含Amp的LB液体培养基，混匀后，在37℃培养箱中，转速200转/min条件下培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因AmpR；将上步菌液摇匀后取100μL涂布于含Amp的筛选平板LB上，且正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃下培养12～24h；
S12、质粒的提取：从37℃培养12～16h的氨苄青霉素固体培养平板中挑取白色单菌落接种到5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃、转速200转/min条件下培养约12h至对数生长后期；取5-15mL过夜培养的菌液，加入离心管中，4℃下13000rpm离心1分钟，收集菌体；用移液枪尽量吸弃全部上清，且吸弃过程中不碰到细菌；向留有菌体沉淀的离心管加入300μLBuffer P1溶液，使用移液枪充分混匀，悬浮细菌沉淀；加入300μL Buffer P2溶液，盖紧管口，轻轻地上下颠倒离心管8～10次，以混匀内容物，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟，使得溶液变得清亮粘稠；向离心管中加入300μL Buffer E3溶液，立即上下颠倒混匀8～10次，待出现白色絮状沉淀时，室温放置5分钟；4℃下13000rpm离心5min；吸取上清液，加入到已装有收集管的过滤柱中，13000rpm离心1min过滤，将收集管中的滤液转移到离心管中；向滤液中加入300μL异丙醇，上下颠倒混匀；向已加入收集管的吸附柱中加入200μL的Buffer PS溶液，然后4℃下13000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，以完成柱平衡；将滤液与异丙醇的混合液转移到已完成柱平衡的吸附柱中，4℃下13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；向吸附柱中加入750μL Buffer PW溶液，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心1min；在吸附柱的吸附膜的中间部位加入20μL含RNaseA的TE缓冲液，室温放置2-5分钟，13000rpm离心2min，离心后获得的质粒pBac[6×P3-rubia]存于-20℃冰箱中备用；
S13、质粒鉴定：用限制性内切酶EcoR I对步骤S12中，最后离心获得的质粒pBac[6×P3-rubia]进行单酶切，其反应体系总体积为40μL，包括如下组分：
10×buffer 4μL
pBac[6×P3-rubia] 14μL
EcoR I 2μL
其余为ddH2O；
37℃下反应2h，酶切完成后，加入2μL溶度为20μg/mL的Rnase，65℃下反应10min，杀酶和除RNA后取3μL电泳，剩余保存备用。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，提取转座酶mRNA的过程包括：
S11’、模板线性化：使用SalI限制酶内切线性化提取转座酶质粒DNA，线性化体系共300μL，且包括如下组分：
10×Buffer 15μL
模板DNA 40μL
SalI限制酶 10μL
其余为ddH2O；
37℃下进行2h酶切反应，获得转座酶质粒DNA；
S12’、终止限制酶消化反应：终止限制酶消化反应体系如下：
1/20体积 0.5M EDTA
1/10体积 3M醋酸钠或者5M醋酸铵
2体积 乙醇
将所述终止限制酶消化反应体系混合均匀，放置在-20℃冷却至少15分钟；对获得的转座酶质粒DNA以10000rpm离心15分钟，以对所述转座酶质粒DNA进行纯化，再移除悬浮液，重新离心5-10秒钟，再用微量枪头移除残余液体，滴入单蒸水或者TE缓冲液至转座酶质粒DNA总浓度为0.5-1μg/μL；
S13’、配置转录反应体系：所述反应体系共20体积，其包括如下组分：
其余为Nuclease-free Water；
将所述转录反应体系在试管中充分混合，轻柔敲击试管，或用移液枪上下轻柔混匀所述转录反应体系，然后4000-6000转/min下离心10-20s，以此将残留在试管壁上的反应混合液离心到试管底部；
S14’、37℃下孵育1-2小时，通过逆转录获得转座酶mRNA；
S15’、回收RNA：在转座酶mRNA样品中加入Elution Solution到100μL终体积，轻柔混合均匀；加入350μL Binding Solution Concentrate以及250μL 100％乙醇到转座酶mRNA样品中，用移液器吸打，使混合液均匀；在收集管中放入滤筒，再向所述滤筒中加入所述混合液，10000-14000rpm离心15-60s，直至所述混合液全部通过所述滤筒，滤过液进入到所述收集管中；将所述滤过液重新注入到所述滤筒内，对所述滤筒10000-14000rpm离心15秒-60s，重复2-3次；加入500μL Wash Solution到所述滤筒内，离心，弃滤过液，重复2-3次；不加入任何液体，再次对所述滤筒离心10-30秒；在所述滤筒中加入50μL的Elution Solution后置于新的收集管中，且将新的收集管置于65-70℃的加热器中5-10分钟；取出所述加热器中的收集管，在室温下离心1分钟，将回收的转座酶mRNA保存在-80℃环境下备用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2包括：将巢脾预先放入蜂群清理12小时，利用隔王栅将蜂王限制在所述巢脾上，控王产卵2小时，获得并收集至少一个蜜蜂受精卵。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3包括：
S31、将所述质粒与转座酶mRNA进行溶解和混合，获得混合液，且在冷冻离心机上，4℃、1000rpm对所述混合液离10min；
S32、将混合液上样于显微注射针中，且将所述显微注射针与显微操作系统连接；所述显微注射针直径2-5μm，针尖角度37°，长度5.1cm；
S33、将所述显微注射针中的混合液注入到蜜蜂受精卵中，且注射时，将蜜蜂受精卵与显微注射针分别调试在倒置显微镜视野的中央，调节注射压力为650-680hpa，确认出液后备用，调整受精卵与针尖的角度至70-90°；所述显微注射针从受精卵的尾端1/3处注入约2.5-3.5nL的混合液，待看到蜂卵中出现液滴时立即移出针端。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4包括：
将完成步骤S3中显微注射的蜜蜂受精卵放在塑料盒中，并移入35℃、湿度75％的生化培养箱中人工培养；所述塑料盒中添加18％硫酸溶液，以用于保湿与消毒，且所述受精卵放置在所述硫酸溶液的液面上方；培养至第3天，待所述受精卵孵化成为幼虫时，立即用移虫针将幼虫取出，移入已装有食物的24孔细胞培养皿中；所述24孔细胞培养皿上，每孔中均放置约1克粥状食物以及5只幼虫，每两天换一次食物，孵化后的第7天结束喂食，盖上培养皿盖板，使幼虫进入蛹期发育；蛹期发育12天后羽化成成年蜜蜂个体。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述粥状食物按重量百分比计，包括如下组分：
且每只幼虫前3天每天喂食200μL食物，后3天每天喂食300μL食物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S5包括：
S51、受精卵RNA提取：将所取的受精卵样品移入无Rnase的离心管中，加入200μLTransZol溶液，充分研磨；再加入800μL TransZol溶液，室温下放置10分钟，4℃下13000rpm离心10min，将上清液转移至新的无Rnase的离心管中；在所述上清液中加入200μL氯仿，轻轻摇匀，室温下静置5min；4℃下13000rpm离心10min，吸取550-650μL上层水相，且转移至新的无Rnase的离心管中；加入与所述上层水相等体积的氯仿，轻轻混匀，室温下静置5min；4℃下13000rpm离心15min，再次取上清液转移至新的无Rnase的离心管中；加入上清液两倍体积的氯仿，轻轻混匀，室温下静置10min，4℃下13000rpm离心15min后弃去上清液；加入1ml 75％乙醇，4℃下8000rpm离心5min，弃上清液；加入1ml无水乙醇，洗涤RNA沉淀，4℃下8000rpm离心5min，弃上清液；于超净台干燥RNA沉淀；加入20μL的DEPC水，待RNA沉淀完全溶解后，分装一部分用于测定RNA质量，其余保存于-80℃环境备用；
S52、RNA变性：所述RNA变性反应体系包括如下组分：
总RNA 8μL
Oligo-dT 3μL
将上述试剂混匀，于70℃下温育10min后立即冰浴2min。
S53、反转录：所述RNA变性反应体系供50μL，其包括如下组分：
其余为DEPC水；
将上述反应体系于42℃下温育60min，再在70℃下温育15min，最后合成的cDNA加50μL灭菌超纯水稀释置于-80℃环境保存备用；
S54、PCR：所述PCR所用引物如下：
上游引物:5’-gatttaaggtcaagatggaggga-3’
下游引物:5’-gtgtagtccccattatggctga-3’
所述PCR反应体系共25μL，包括如下组分：
其余为dd H2O；
所述PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s；56℃退火45s；72℃延伸90s；30个循环；72℃终延伸10min；
S55、电泳与测序：将PCR产物采用琼脂糖凝胶进行电泳，电压90V，时间30～45min；电泳后，在紫外灯下观察，并用凝胶成像系统拍照，确认PCR产物的质量；切胶回收，并对PCR产物进行序列检测，最终确定基因转移效果。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S6包括：将蛹期蜜蜂置于荧光显微镜视野中，选择红色荧光检测模式，以对蜜蜂头部进行荧光检测。
CN201810179845.XA 2018-03-05 2018-03-05 一种外源基因植入蜜蜂基因组的方法 Withdrawn CN108441513A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810179845.XA CN108441513A (zh) 2018-03-05 2018-03-05 一种外源基因植入蜜蜂基因组的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810179845.XA CN108441513A (zh) 2018-03-05 2018-03-05 一种外源基因植入蜜蜂基因组的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108441513A true CN108441513A (zh) 2018-08-24

Family

ID=63193526

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810179845.XA Withdrawn CN108441513A (zh) 2018-03-05 2018-03-05 一种外源基因植入蜜蜂基因组的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108441513A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652459A (zh) * 2018-12-29 2019-04-19 江西农业大学 一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及编辑材料

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109652459A (zh) * 2018-12-29 2019-04-19 江西农业大学 一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及编辑材料

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sasmono et al. Generation and characterization of MacGreen mice, the Cfs1r-EGFP transgenic mice
CN106434748A (zh) 一种热激诱导型 Cas9 酶转基因斑马鱼的研制及应用
CN107012174A (zh) CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用
CN109385451B (zh) 一种牡蛎CRISPR/Cas9基因编辑方法
CN108285906A (zh) 一种定点整合外源dna转基因猪的构建方法
CA2259908A1 (en) In vivo electroporation method for early animal embryo
CN110484549A (zh) 基因组靶向修饰方法
CN105018523B (zh) 一种zb转座子系统及其介导的基因转移方法
Namba et al. GONAD: A new method for germline genome editing in mice and rats
CN107384868A (zh) 永生化原代绵羊肺细胞系的构建及其应用
CN106755080A (zh) 一种快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法
CN108441513A (zh) 一种外源基因植入蜜蜂基因组的方法
CN109652459A (zh) 一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法及编辑材料
CN101875936A (zh) 水稻种胚特异表达的启动子及其应用
CN110747199B (zh) 蜜蜂抗逆相关基因nf-y及其应用
CN102220330A (zh) 一种与植物抗旱性相关的miRNA——gma-miR156b及其应用
CN108949769B (zh) 一种棉铃虫蜕皮激素调控因子E78-C基因cDNA及其应用
CN104726490B (zh) 表达人血清白蛋白的靶向载体及其构建方法
CN103665131B (zh) 棉铃虫和烟夜蛾的npf神经肽及其编码基因和应用
CN110117618A (zh) 一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法
CN103665132B (zh) 棉铃虫和烟夜蛾的npy神经肽及其编码基因和应用
CN114231561A (zh) 一种基于CRISPR-Cas13d敲低动物mRNA的方法及其应用
CN101412999A (zh) 一种基因打靶定点转基因方法及其应用
CN107177630A (zh) 一种无外源标记基因的抗pcv2转基因猪制备方法
Conner Transgenic mouse production by zygote injection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20180824

WW01 Invention patent application withdrawn after publication