CN101412999A - 一种基因打靶定点转基因方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基因打靶定点转基因方法及其应用,该方法以目标基因家族的间隔DNA序列为靶位点,以其两侧序列为同源重组引导序列构建基因打靶载体,通过基因打靶获得目的基因定点整合且稳定表达的转基因细胞、转基因生物个体。本发明的方法可用于通过动植物生物反应器、细胞或微生物来生产目的蛋白质和RNA产品,也可用于改良生物个体的性状、基因治疗人类疾病等。本发明的靶位点设计在转录活跃的基因组区域,为外源基因提供一个开放和活跃的转录环境,克服位置效应的影响,外源基因稳定表达、稳定遗传;靶位点一般在基因间的间隔序列,克服了毒性整合的安全性问题;靶位点为重复序列,将基因定点整合的效率提高了数百倍以上。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,具体涉及一种基因打靶定点转基因方法及其应用。
背景技术
自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵,获得了个体比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来,转基因这项高新技术受到各国重视,发展迅速,取得不少突破。转基因猪、兔、牛、羊和鱼等相继问世,全世界已申请的工程动物专利达到八十多项。为培养生产性状优良的超级种群、制备高增值的蛋白和激素类特效药物以及按人的需求提供理想的实验动物等方面开辟了新途径。因此,转基因方法的研究无论对于基因调控的理论研究,还是获得具有经济价值的转基因动植物都具有重要的意义。
然而,现有转基因方法存在一些缺陷,其主要问题是由于外源基因是通过各种载体或其他方法将外源基因导入靶细胞,然后让外源基因及载体序列随机整合到染色体的基因组上。随机整合的外源基因往往是优先插入基因位点,从而破坏细胞生命活动的相关基因甚至使细胞恶变(毒性整合)。随机整合也可能因位置效应使外源基因表达不稳定或失活;为达到细胞内环境的自身平衡,随机整合外源基因的细胞可能改变其染色质的高级结构,使外源基因隐藏在染色质高级结构的内部而失活(沉默整合)。因此,随机插入的转基因方法严重阻碍了外源基因在转基因动植物内的有效整合和稳定遗传及表达,利用随机整合获得稳定表达外源基因的转基因动植物的效率极低。为了避免上述缺陷,使外源基因整合到染色体基因组的特定位点是问题的关键,能使基因定点整合的基因打靶技术是解决该问题的一种理想方法。
基因打靶技术是一种通过同源重组的方法定向改变生物活体遗传信息的实验手段。基因打靶已经被证明是目前精确地修饰基因组的最有效方法之一。目前基因打靶技术主要应用于基因功能的研究、研制人类疾病动物模型、改良动物品种和研制动物反应器。为了将外源基因整合在基因组中的特定位置,从而避免毒性整合和沉默整合,有人尝试采用基因打靶的基因敲入技术解决这些问题。2000年,Mc Creath等成功地利用基因打靶技术在绵羊胎儿成纤维细胞中将α抗胰蛋白酶(AAT)基因定点整合入绵羊α1原胶原(COL1A1)基因位点,并通过核移植技术获得了一只活的绵羊,外源基因在乳汁中的含量达0.65mg/ml。(Mc Creath KL,et al.Production of gene-targeted ship by nucleartransfer from cultured somatic cells.Nature,2000,405(6790):1066-1069)。2003年,李宁等得到了我国首批通过基因打靶获得的转基因克隆牛(龚国春,李宁等,利用体细胞核移植技术生产转基因牛.科学通报,2003,48(24):2528-2533)。
这些基因打靶技术虽然克服了随机整合的一些问题,但是基因打靶技术仍然存在一些不足之处:(1)由于外源基因整合位点常常不在转录活跃区域,很多基因打靶的敲入基因表达量低且不稳定。(2)通常基因打靶敲入需要置换体内一些原有的基因,这破坏了细胞原有的内环境平衡;(3)基因打靶的基因敲入技术利用的同源重组靶位点通常为单拷贝序列,与打靶载体发生同源重组的概率极低,即定点整合效率太低。其中,基因打靶技术存在的另一关键问题在于靶位点通常为单拷贝序列,而基因之间的间隔DNA重复序列被认为是外源基因整合的禁区,原因是DNA重复序列处通常无基因表达。然而,rRNA等基因家族的间隔DNA序列完全能表达(Sylvester JE,et al.Thehuman ribosomalRNA genes:structure and organization of the complete repeating unite.Hum Genet,1986,3:193-198)。目前尚未见有关以基因家族的间隔DNA序列为靶位点的基因打靶定点转基因技术的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的不足,提供一种以基因家族的间隔DNA序列为靶位点的,适用于各种生物和细胞、表达稳定且安全高效的基因打靶定点转基因方法。
本发明的另一个目的是提供上述方法在生产目的蛋白质、RNA产品、改良生物个体性状、基因治疗疾病及其他转基因领域中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的:
本发明采用一种以基因家族的间隔DNA序列为靶位点的定点转基因方法,即基因打靶的定点整合技术,如利用rRNA基因家族的间隔DNA序列作为靶位点和同源重组引导序列进行定点转基因。所有生物的细胞存在rRNA基因家族,动物细胞由18S、5.8S、28S rRNA基因及其基因间的内部转录序列(ITS)串联成一个转录单位。每个细胞的基因组中均有100-300个拷贝的转录单位;不同个体、同一个体的不同组织细胞甚至同种细胞的不同代谢时期,其rRNA拷贝数或表达水平不一致。因此,在3种rRNA基因间的ITS定点插入外源基因时,外源基因整合到某个转录活跃的基因组区域,可以为外源基因的表达提供一个开放和活跃的转录环境,克服位置效应的影响,外源基因稳定表达、稳定遗传,避免基因沉默;ITS为非基因的间隔序列,不会改变rRNA表达水平而影响细胞的功能,避免了细胞内环境平衡的破坏及基因失活。此外,每个真核细胞的基因组中均有100-300个拷贝的转录单位,增加了基因定点整合的潜在靶位点,将基因定点整合的效率提高了数百倍。
本发明选择以基因家族的间隔DNA序列为靶位点,以其两侧序列为同源重组引导序列构建基因打靶载体,通过基因打靶获得目的基因定点整合且稳定表达的转基因细胞、定点转基因生物。
本发明的基因打靶转基因方法,其具体操作步骤如下:
(1)克隆生物基因组中目标基因家族的间隔DNA序列,寻找合适的靶位点;
(2)以上述间隔DNA序列为靶位点,以靶位点两侧的DNA序列为左、右同源重组引导序列;用该左、右同源重组引导序列、目的基因及其表达框架和(或)正负筛选基因等元件构建基因打靶载体;将基因打靶载体导入体细胞、生殖细胞、干细胞、微生物等受体细胞,通过基因定点整合检测获得定点转基因细胞;
(3)筛选获得表达目的基因的定点转基因细胞;
(4)将上述定点转基因细胞通过各种繁育方法产生定点转基因生物个体;
(5)筛选获得表达目的基因的定点转基因生物个体。
上述步骤(1)中,基因家族的间隔DNA序列包括生物基因组中的低度重复序列、中度重复序列、高度重复序列、低拷贝序列,包括基因间的转录活跃序列和非转录序列,如各种生物的rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因、珠蛋白基因、免疫球蛋白基因等基因家族的间隔DNA序列,其GenBank号为AY452489、AY452490、AY452491、AY452492、AY452493、AY452494、AY452495、AY779625、AY779626、AY779627、AY779628、AY779629、DQ018752、DQ018753、DQ018754、DQ018755、DQ018756。
在进行本发明的基因打靶定点转基因操作中,首先克隆生物中的rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因、珠蛋白基因、免疫球蛋白基因等目标基因家族及其间隔DNA序列,接着在所得间隔DNA序列上选择合适的靶位点,然后以该靶位点两侧的DNA序列为左、右同源重组引导序列,用该左、右同源重组引导序列、外源目的基因及其表达框架等元件构建基因打靶载体。其中目标基因家族是指目标靶位点,目的基因是指外源目的基因。
上述步骤(2)和(3)中,定点转基因细胞包括定点插入目的基因的体细胞、生殖细胞、原始生殖细胞、干细胞、种子细胞或微生物等。
上述步骤(4)中,各种繁育方法包括克隆、人工授精、胚胎注射、繁殖、杂交、嫁接或组织培养等。
上述步骤(4)和(5)中,定点转基因生物个体包括定点插入目的基因的所有动物(含人类)出生前胚胎、所有动物(含人类)出生后个体、植物的出生前胚芽或植物出生后个体。
上述步骤(5)筛选得到表达目的基因的细胞或生物个体,通过分离纯化表达产物,即可获得目的蛋白质(含药物、食品)和RNA产品等。
本发明的基因打靶定点转基因方法,可应用于通过动植物生物反应器(含动物乳腺生物反应器、输卵管生物反应器、植物生物反应器)、细胞或微生物来生产目的蛋白质(含药物、食品)和RNA产品,也可用于改良生物个体的性状、基因治疗人类疾病及其它所有转基因领域。
本发明已经建立了以基因家族的间隔DNA序列为靶位点的鱼类体内、体外基因打靶技术,获得基因定点整合并表达的阳性桂花鱼,并建立了哺乳动物类、禽类体外基因打靶技术,该发明所建立的一套表达稳定、安全高效的定点转基因技术,为该技术应用于人类基因治疗提供了动物体内实验模型。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1.本发明是一种适用于各种生物和细胞的表达稳定、安全高效的定点转基因方法。本发明的基因打靶定点转基因方法,其靶位点设计在转录活跃的基因组区域,为外源基因提供一个开放和活跃的转录环境,克服位置效应的影响,外源基因稳定表达、稳定遗传,避免了基因沉默;靶位点一般在基因间的间隔序列,故插入外源基因不会破坏细胞基因而导致细胞死亡或恶变,克服了毒性整合的安全性问题;靶位点为DNA重复序列,增加了基因定点整合的潜在靶位点,将基因定点整合的效率提高了数百倍以上,部分解决基因打靶时基因定点整合效率低的问题,突破了基因组中DNA重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。
2.本发明的方法操作高效、简单,且可用于制备哺乳动物乳腺生物反应器、禽类输卵管生物反应器、植物生物反应器,用于生产目的蛋白质(含药物、食品)和RNA产品,也可用于改良生物个体的性状、基因治疗人类疾病及其它所有转基因领域,极大地扩充了转基因技术的运用。
附图说明
图1为翘嘴桂花鱼多位点基因打靶载体结构示意图;
图2为翘嘴桂花鱼基因定点整合PCR分析电泳图;
图中:M是DNA Marker DL2000;1-6是1、2、4、12、13和20号转基因阳性翘嘴桂花鱼;其中2、4、13号桂花鱼为转基因定点整合阳性翘嘴桂花鱼;
图3为翘嘴桂花鱼基因定点整合PCR产物的部分测序分析图;
图4为翘嘴桂花鱼定点整合的IFN基因表达的RT-PCR分析图;
图中:M是DNA Marker DL2000;1-2是2、4号转基因定点整合阳性翘嘴桂花鱼;其中2、4转基因定点整合阳性翘嘴桂花鱼具有IFN基因表达;
图5为荷斯坦牛细胞的基因定点整合的PCR分析图;
图中,M为DNA Marker DL2,000,1-7是转基因阳性荷斯坦牛细胞,其中5号为转基因定点整合阳性荷斯坦牛细胞;
图6为荷斯坦牛胎儿成纤维细胞定点整合的GFP基因表达的RT-PCR分析图;
图中,M为DNA Marker DL2,000,泳道1为阳性对照,泳道2是5号荷斯坦牛细胞具有GFP基因表达。
具体实施方式
下面以翘嘴桂花鱼、荷斯坦牛为例,结合附图详细说明本发明。下述实施步骤中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1 翘嘴桂花鱼
1、基因家族的间隔DNA序列的获得
基因家族如rRNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。结合亲缘生物法生物信息学技术,经反复摸索后选用长片断PCR法(LA PCR)即采用市售的LA PCRTaq酶结合市售的GC缓冲液来扩增翘嘴桂花鱼的rRNA基因家族及其间隔DNA序列,经测序鉴定最终克隆了翘嘴桂花鱼的3个rRNA基因及其2个间隔序列(ITS),其GenBank号为AY452489、AY452490、AY452491、AY452492、AY45249。
2、翘嘴桂花鱼打靶载体的构建
在上述克隆得到的翘嘴桂花鱼rRNA基因家族的间隔序列(ITS1)中寻找合适的靶位点,以该靶位点两侧序列为同源重组引导序列(homologousrecombination directing sequences,HRDS)构建打靶载体,其具体步骤如下:先构建含胸苷激酶基因(TK)和新霉素基因(Neo)的通用打靶载体pCTKNeo,采用LA Taq高保真酶扩增靶位点两侧序列获得左、右同源重组引导序列HRDS1和HRDS2,经T质粒克隆后,分别插入到pCTKNeo载体Neo基因的上下游,构建成翘嘴桂花鱼专用的打靶载体pCTKNeo-HRDS1/2;同样将目的基因干扰素基因(IFN)插入到pCTKNeo-HRDS1/2载体的Neo基因与HDRS2之间;每次克隆均经PCR、酶切和测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向,最终构建成打靶载体pCTKNeo-HRDS1/2-hIFN,如图1所示。
3、翘嘴桂花鱼精子的打靶载体转染
翘嘴桂花鱼人工催产,采集鱼卵、精液。
取一尾性成熟的健康雄鱼,将精子挤入一平皿中,迅速吸取200ul(等体积)精液加入到含精子保存液的离心管中,轻柔混匀。加入已线性化的质粒溶液混匀,使终浓度为2.0ug/mL,在室温下放置30分钟,使打靶载体进入精子头部或吸附在精子表面。
4、定点转基因翘嘴桂花鱼的繁育与筛选
将上述步骤3处理过的精子与鱼卵进行人工授精1~2分钟,通过精子介导基因转移,并作对照组,将上述人工授精的受精卵在模拟的人工玻璃环道中进行孵化,在人工授精6h和12h后分别加入G418和丙氧鸟苷进行富集筛选,Neo-IFN基因定点整合的鱼胚存活,鱼苗出膜、开口摄食后,投喂相应规格的饲料鱼苗,采用微流水环境培育桂花鱼苗。
5、定点转基因翘嘴桂花鱼的鉴定
培育约3个月后,剪取阳性翘嘴桂花鱼尾鳍提取DNA,并穿刺其背部肌肉提取总RNA,采用PCR、测序等通用方法进行基因定点整合的鉴定,采用RT-PCR鉴定IFN的表达。
定点整合的PCR鉴定:在打靶载体上Neo基因序列和同源引导序列2(HRDS2)之外的基因组序列上,分别设计引物,在外源基因Neo基因上设计外测上游引物P1,然后在HRDS2之外的下游基因组序列上设计一个与上游引物P1配对的外测下游引物P2,用这对定点整合引物对基因组DNA进行PCR检测。当无Neo基因整合时,只有P2引物配对;当有Neo基因随机整合时,P2在桂花鱼相应的基因组配对,而P1在随机整合处配对,PCR不能扩增出特异性产物;只有当发生定点整合时,Neo基因整合到与HRDS1和HDRS2相对应基因组的同源序列处,P1与Neo基因配对,P2与定点整合处的基因组配对,形成一对引物而进行PCR扩增,从而鉴定出定点整合。
P1 引物序列:CAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGAT,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
P2 引物序列:CAAGACGGACGAAAGCGAAAGCA,其核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
为了增强PCR扩增的灵敏度,提高鉴定的效率,在外测引物的内侧设计一对引物(内侧上游P3,内侧下游P4),内侧上游P3在Neo上,内侧下游P4在桂花鱼相应的基因组上,并以外测引物扩增的产物为模板进行PCR的扩增。PCR鉴定结果如图2所示。
P3 引物序列:GTGCCCAGTCATAGCCGAATAGC,其核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
P4 引物序列:TCCGACCATAAACGATGCCAACT,其核苷酸序列如SEQID NO:4所示。
定点整合的测序鉴定:结合LA PCR和DNA测序技术,在成功转入了IFN的桂花鱼中检测定点整合。测序鉴定的结果如图3所示,图中所示的序列包括了桂花鱼同源重组引导序列的下游序列和Neo基因序列的接头序列,505bp前的序列为Neo基因序列,505bp后的序列为同源重组引导序列;
基因表达的检测:根据IFN的cDNA序列设计一对引物,以提取的总RNA经逆转录后的产物为模板,RT-PCR检测定点整合的桂花鱼中IFN特异表达情况,获得定点整合的基因打靶成功桂花鱼。RT-PCR检测的结果如图4所示。
本实施例中所采用酶、质粒等均为本领域技术人员试验中所通用的,可在市场上购买得到,实施例中所涉及的PCR扩增以及T质粒克隆和载体构建等操作也都是采用本领域技术人员通用的技术。
实施例2 荷斯坦牛
1、基因家族的间隔DNA序列的获得
选用LAPCR法即采用市售的LA PCR Taq酶结合市售的GC缓冲液来扩增荷斯坦牛的rRNA基因家族的间隔DNA序列,经测序鉴定最终克隆了荷斯坦牛的3个rRNA基因及其2个间隔序列,其GenBank号为AY779625、AY779626、AY779627、AY779628、AY779629。
2、荷斯坦牛打靶载体的构建
在上述隆得到的荷斯坦牛的rRNA基因家族的间隔序列(ITS1)中寻找合适的靶位点,以该靶位点两侧序列为同源重组引导序列,基于BAC(细菌人工染色体)重组酶系统构建打靶载体,其具体步骤如下:采用LA Taq高保真酶扩增靶位点两侧序列获得左、右同源重组引导序列HRDS1`和HRDS2`;在BAC质粒上构建包含TK、HDRS2`、Neo基因的BAC-TDN筛选载体,然后在pYLVS质粒上构建包含绿色荧光蛋白基因(GFP)、HDRS1`基因的pYLVS-GD表达载体;将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GD表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GD质粒,采用归位内切酶I-Sce I切除pYLVS载体骨架,构建荷斯坦牛打靶载体BAC-TDN-GD,利用接头LS使之环化,BAC-TDN-GD打靶载体与pYLSV质粒组成了通用型荷斯坦牛打靶载体系统;每次克隆均经酶切或PCR、测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向。
3、荷斯坦牛细胞的转染与筛选
采用组织块贴附培养的方法分离培养出2~5月龄荷斯坦牛胎儿耳尖成纤维细胞,通过PCR方法鉴别细胞的性别,筛选出雌性胎儿的细胞。
使用脂质体介导法或电穿孔法等方法转染荷斯坦牛的细胞。细胞转染24~48小时在荧光镜下各组均可检测到绿色荧光的表达。
48小时后用含800μg/mL G418的培养液筛选7天,300μg/mL G418和10μg/mL的丙氧鸟苷(GCV)同时进行筛选10天,之后用克隆杯对细胞集落进行收获,扩大培养并冻存。
4、定点转基因细胞的鉴定
将单克隆细胞系扩大培养,利用常规分子生物学方法提取基因组DNA。先PCR鉴定Neo和GFP基因是否转入,并测序证实。
定点整合的PCR鉴定:在打靶载体上Neo基因序列和同源引导序列2(HRDS2`)之外的基因组序列上,分别设计引物,在外源基因Neo基因上设计外测上游引物P5,然后在HRDS2`之外的下游基因组序列上设计一个与上游引物P5配对的外测下游引物P6,用这对定点整合引物对基因组DNA进行PCR检测。当无Neo基因整合时,只有P6引物配对;当有Neo基因随机整合时,P6在荷斯坦牛相应的基因组配对,而P5在随机整合处配对,PCR不能扩增出特异性产物;只有当发生定点整合时,Neo基因整合到与HRDS1`和HDRS2`相对应基因组的同源序列处,P5与Neo基因配对,P6与定点整合处的基因组配对,形成一对引物而进行PCR扩增,从而鉴定出定点整合。
P5 引物序列:GGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAG,其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
P6 引物序列:GGTCTGTAACTCAGGAGGTTCGGTC,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
为了增强PCR扩增的灵敏度,提高鉴定的效率,在外测引物的内侧设计一对引物(内侧上游P7,内侧下游P8),内侧上游P7在Neo上,内侧下游P8在荷斯坦牛相应的基因组上,并以外测引物扩增的产物为模板进行PCR的扩增。PCR鉴定结果如图5所示,PCR产物经测序证实。
P7 引物序列:TCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTT,其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
P8 引物序列:GGTCTGTAACTCAGGAGGTTCGGTC,其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
基因表达的检测:提取基因定点整合细胞的总RNA,根据GFP基因序列设计一对引物,RT-PCR扩增检测基因定点整合细胞GFP表达情况。RT-PCR检测的结果如图6所示。
5、定点转基因荷斯坦牛的克隆
核移植、胚胎培养与鉴定:以阳性体细胞为核供体,去核的成熟卵母细胞为受体细胞质,将消化处理后的细胞注入卵母细胞的卵周隙中,并对重组胚胎进行电极融合和激活,融合良好的重组胚胎会发生卵裂,并放于合适的培养系统使其发育至桑椹胚或囊胚阶段。在此阶段可观察绿色荧光蛋白的表达,融合前仅供体细胞中有绿色荧光,融合并激活培养后2-细胞阶段无荧光表达,4-细胞阶段可观察到荧光表达,且在每个卵裂球中均有表达,随着胚胎的发育,表达强度下降。通过观察绿色荧光表达、巢式或复合PCR结合测序的方法进行重组胚的鉴定。
胚胎移植:将有GFP表达且发育良好的囊胚移植到发情同期的受体荷斯坦母牛有黄体的一侧子宫角内,每头移植2至4枚胚胎,60天后直肠检查受孕情况,对妊娠母牛进行悉心照顾。
6、定点转基因荷斯坦牛的检测
将获得的子一代转基因犊牛或胚胎的部分组织体细胞观察绿色荧光表达情况,并采用测序、RT-PCR等鉴定基因在荷斯坦牛基因组的定点整合与表达,并与供体细胞的检测结果相比较,最终获得表达目的基因的定点转基因荷斯坦牛。
本实施例中所采用酶、BAC质粒、pYLVS质粒等均为本领域技术人员试验中所通用的,可在市场上购买得到,实施例中所涉及的PCR扩增以及T质粒克隆和载体构建等操作也都是采用本领域技术人员通用的技术。
一种基因打靶定点转基因方法及其应用 序列表
SEQUENCE LISTING
<110>唐,冬生
<120>一种基因打靶定点转基因方法及其应用
<130>
<160>8
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
<210>6
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<212>DNA
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<400>6
<210>7
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
Claims (9)
1、一种基因打靶定点转基因方法,其特征在于该方法是以生物基因组中目标基因家族的间隔DNA序列为靶位点,通过基因打靶进行定点转基因。
2、根据权利要求1所述基因打靶转基因方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
(1)克隆生物基因组中目标基因家族的间隔DNA序列;
(2)以上述间隔DNA序列为靶位点,以该靶位点两侧的DNA序列为左、右同源重组引导序列,用该左、右同源重组引导序列和目的基因一起构建基因打靶载体;将基因打靶载体导入受体细胞,基因定点整合检测获得定点转基因细胞;
(3)筛选获得表达目的基因的定点转基因细胞;
(4)通过繁育上述定点转基因细胞得到定点转基因生物个体;
(5)筛选获得表达目的基因的定点转基因生物个体。
3、根据权利要求2所述基因打靶转基因方法,其特征在于步骤(1)中所述间隔DNA序列为低度重复序列、中度重复序列、高度重复序列、低拷贝序列、基因间的转录活跃序列或非转录序列。
4、根据权利要求2所述基因打靶转基因方法,其特征在于步骤(2)或(3)所述定点转基因细胞为体细胞、生殖细胞、原始生殖细胞、干细胞、种子细胞或微生物。
5、根据权利要求2所述基因打靶转基因方法,其特征在于步骤(4)中所述繁育方法为克隆、人工授精、胚胎注射、繁殖、杂交、嫁接或组织培养。
6、根据权利要求2所述基因打靶转基因方法,其特征在于步骤(4)或(5)中所述定点转基因生物个体为动物出生前胚胎、动物出生后个体、植物出生前胚芽或植物出生后个体。
7、根据权利要求1所述基因打靶转基因方法,其特征在于所述目标基因家族为rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因、珠蛋白基因或免疫球蛋白基因的基因家族。
8、根据权利要求1所述基因打靶转基因方法,其特征在于所述间隔DNA序列其GenBank号为AY452489、AY452490、AY452491、AY452492、AY452493、AY452494、AY452495、AY779625、AY779626、AY779627、AY779628、AY779629、DQ018752、DQ018753、DQ018754、DQ018755或DQ018756。
9、权利要求1~8所述任一项基因打靶定点转基因方法在生产目的蛋白质、RNA产品、改良生物个体性状或基因治疗疾病中的应用。
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