CN102747102A

CN102747102A - 一种hsa乳腺特异性表达载体及其构建的重组细胞

Info

Publication number: CN102747102A
Application number: CN2012102692099A
Authority: CN
Inventors: 罗艳; 张涌; 刘军; 王勇胜; 权富生; 郭泽坤; 余源
Original assignee: YANGLING KEYUAN CLONE CO Ltd; Northwest A&F University
Current assignee: YANGLING KEYUAN CLONE CO Ltd; Northwest A&F University
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-07-31
Also published as: CN102747102B

Abstract

本发明公开了一种HSA乳腺特异性表达载体及其构建的重组细胞，该载体包括位于启动子下游的目的基因HSA，在HSA基因的5'端连接BCP5序列，在其3'端连接有BGHpolyA序列；在启动子的上游还设有phiC31整合酶特异性识别位点。通过在HSA基因5'端插入牛β-酪蛋白基因的和3'端插入牛生长激素polyA，牛β-酪蛋白基因的5'调控区和BGHpolyA能够指导目的基因在牛的乳腺组织中特异的高效表达。以包含目的基因HSA的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫有望生产出转HSA基因的奶牛。

Description

一种HSA乳腺特异性表达载体及其构建的重组细胞

技术领域

本发明属于人血清白蛋白重组表达技术领域，涉及一种HSA乳腺特异性表达载体及其构建的重组细胞。

背景技术

人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是血浆中含量最为丰富的蛋白质。它是一种在肝脏中合成的非糖基化球蛋白。在健康人体中的血循含量为42g/l。白蛋白在人体中发挥着重要的作用。它参与了脂肪酸、氨基酸、胆色素以及许多的小分子运输，对维持血液正常的渗透压有着重要的意义。另外，它具有独特的结合内源和外源复合物能力，可以储存循环代谢和作为细胞外的抗氧化剂。因此，人血清白蛋白的应用除了广泛用作血浆容量扩充剂外，它还可以作为药物赋形剂、稳定剂和药物载体等。

目前，大多数治疗性的HSA都是从人血浆或全血中通过乙醇分馏纯化而来。尽管这种纯化而来的HSA是较安全的，但是一方面，血浆的供应和纯化也会受到一些病毒的污染，例如，艾滋病病毒（HIV），肝炎病毒C和朊病毒，等。另外，血源供应毕竟是有限的。因此，重组人血清白蛋白（rHSA）的生产研究对开发人血清白蛋白替代品有着重要的意义。

利用乳腺生物反应器生产药用蛋白早在90年代已兴起，乳腺生物反应器是将外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，以转基因动物的乳腺组织生产药用蛋白。采用乳腺生物反应器生产药用蛋白质是一种全新的生产模式，它已经成为生物技术领域发展的重要方向。而应用体细胞核移植技术（SCNT）生产乳腺生物反应器，不仅可以在体外培养条件下对整合外源基因的体细胞进行大量增殖和筛选，还可以对外源基因的整合和表达进行初步分析，后将通过以上筛选和分析得到的阳性克隆体细胞进行核移植，得到具有同一遗传特征的转基因动物群系。另外，该技术突出的优点是将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本（WHEELER MB,WALTERS EM.Transgenic technology and applications in swine[J].Theriogenology，2001,56:1345-69）。

SCNT在生产乳腺生物反应器的应用已表现出强大的生命力。早在1987年，Gordon等就首次报道了人的组织纤溶酶原激活剂(tPA)基因在小鼠的乳腺中成功表达（Gordon K,et al.Production of human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk[J].NatureBiotechnology，1987,(5):1183-1187）。1991年，Wright G等培育成乳腺特异表达人抗胰蛋白酶转基因绵羊，表达水平高达35g/L，在世界范围内引起了极大的轰动（Wright G;CarverA,Cottom D.High level expression of active human Alpha-1-antitrypsin in the milk oftransgenic sheep[J].Nature Biotechnology，1991,9:830-834）。2002年，Van Berkel等成功获得了人乳铁蛋白转基因牛，乳汁中人乳铁蛋白的含量上升到3g/L（Van Berkl et al.Largescale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows[J].NatureBiotechnology，2002,20:484-487）。2006年，Maga等将人溶菌酶基因在转基因山羊乳腺中的表达量提高到270μg/mL（Maga E A et al.Consumption of milk from transgenic goatexpression human lysozyme in the mammary gland result in modulation of intestinalmicrofluro[J].Transgenic Ras,2006,15:515-519）。2008年，邹贤刚等利用转基因克隆奶山羊乳腺生物反应器大量生产重组人的抗凝血酶Ⅲ（rhATⅢ）蛋白，其中1头转基因克隆羊后代的奶中rhATⅢ的含量为3g/L（邹贤刚,袁三平,鲜建，等.转基因克隆奶山羊大量生产重组人的抗凝血酶Ⅲ蛋白质(rhATⅢ)[J].生物工程学报,2008,24(1):117-123）。2009年，Yann等人成功地将人血清白蛋白在转基因牛乳腺中表达，其最高表达量可达40g/l（Yann Echelard et al.Production of recombinant albumin by a herd of cloned transgeniccattle[J].Transgenic Res 2009,18:361-376）。

HSA最初在大肠杆菌中(Escher ichia.coli)表达成功。表达的重组蛋白为HSA前体,含有585个氨基酸及24个氨基酸的前导肽,并在细胞内形成包涵体。但由于原核表达系统不具备转录后加工的功能，HSA前体分子量较大,导致在原核生物中表达量不高,分泌效果不够理想。之后，研究者转而研究HSA在真核细胞中的表达。酵母表达系统有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖基化加工系统,并能将外源蛋白质分泌到培养液中,便于纯化。目前认为毕氏酵母表达系统研究较为成熟，如日本的绿十字公司(GREENCROSSCO.L IM ITED)利用毕赤酵母表达系统生产的rHSA,其表达量可达7g/L,美国富源集团曾报道其rHSA表达产量可达20g/L。但为了进一步的提高r H SA的表达量及其活性，人们对r HSA转基因动物的研究也开始活跃起来。

关于转HSA转基因动物的研究，国内已有了人血清白蛋白转基因猪、牛以及小鼠等的报道。但除了2002年和2003年郑新民等人所报道的HSA在转基因猪中的表达量可达20.3mg/ml，以及2005年，王云龙等人将HSA的c D NA在山羊乳腺中的进行了瞬时表达研究，其最大表达量为20μg/l外。而在其他报道中未检测到HSA的表达或是表达量很低。国外关于HSA转基因动物的研究最早在1992年Shani等人成功研制了的人血清白蛋白转基因小鼠，检测到的HSA最大表达量为35μg/ml。1994年，David等应用β-乳清蛋白(BLG)启动子对由HSA的cDNA和14个内含子进行了不同的组合所得到的不同的HSA小基因以及全基因组进行表达调控研究，在体外实验中发现c DNA+内含子1-6组和c DNA+（7-14）的组与HSA全基因组实验组的HSA在COS-7细胞中的表达量几乎相同的，cDNA+（2+7-14）组的表达量高于HSA全基因组。而在体内实验中c DNA+内含子1-6组的在小鼠乳腺中表达量最高，可达10mg/mL。2002年Echelard等进行了r HSA在牛乳腺中的表达研究。2009年Yann等人在Shani等人构建的HSA表达载体上作了一些改造,他们采用的是山羊的β-酪蛋白启动子，并在启动子5’端加入绝缘子（1.2kb的鸡β-珠蛋白基因座控制区的5＇HS2基因），在“neo”两侧也加入了该绝缘子，且采用HSA全基因组在牛乳腺中表达，牛乳中检测到HSA最低表达量为1-2g/l，最高表达量为40g/l。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种HSA乳腺特异性表达载体及其构建的重组细胞，作为核供体细胞的包含HSA乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞系，为重组人血清白蛋白的生产奠定坚实基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种HSA乳腺特异性表达载体，包括位于启动子下游的目的基因HSA，在HSA基因的5'端连接BCP5序列，在其3'端连接有BGHpolyA序列；在启动子的上游还设有phiC31整合酶特异性识别位点。

所述的目的基因HAS包括了HSA所有外显子和前6个内含子，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；BCP5序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；BGHpolyA序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

所述的HSA乳腺特异性表达载体，还包括抗生素筛选基因和标记基因，标记基因位于启动子与BCP5序列之间，抗生素筛选基因位于BGHpolyA序列和phiC31整合酶特异性识别位点之间；抗生素筛选基因的上下游还分别设有两个同向的loxP序列。

所述的抗生素筛选基因为neo基因，标记基因为EGFP基因；phiC31整合酶特异性识别位点为attB，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；loxP序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

所述的标记基因与BCP5序列之间还设有两个串联的c HS4绝缘子序列，BGHpolyA序列和抗生素筛选基因上游的loxP序列之间还设有一个c HS4绝缘子序列；所述的c HS4绝缘子序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

所述的HSA乳腺特异性表达载体，该载体是pIACH表达载体，包括以下依次连接的元件：PUC ori、attB序列、CMV启动子、EGFP标记基因、两个串联的c HS4绝缘子序列、BCP5序列、HAS基因、BGHpolyA序列、一个c HS4绝缘子序列、lxop1序列、SV40p、SV40ori、抗生素筛选基因neo、HSV TKpolyA和lxop2序列。

基于所述的HSA乳腺特异性载体的重组细胞，其特征在于，宿主细胞为原代牛乳腺上皮细胞，通过

HD转染试剂将外源性表达载体p IACH和phiC31整合酶表达载体pCMVint共转染到宿主细胞中。

一种诱导所述的重组细胞HAS表达的方法，将pIACH阳性表达的牛乳腺上皮细胞在无血清M199培养液中培养，添加5～10ng/ml的上皮生长因子（EGF），5～10μg/ml绵羊催乳素，1～5%体积分数胰岛素样的转铁蛋白进行诱导，每24小时更换一次培养液，诱导时间为15～20天。

一种包含目的基因HSA的牛胎儿成纤维细胞，宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，通过

所述的包含目的基因HSA的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明构建了一种HSA乳腺特异性表达载体，通过在HSA基因5'端插入牛β-酪蛋白基因的和3'端插入牛生长激素polyA（BGHpolyA），牛β-酪蛋白基因的5'调控区和BGHpolyA能够指导目的基因在牛的乳腺组织中特异的高效表达。

2、本发明构建的HSA乳腺特异性表达载体，还综合应用phiC31整合酶系统、绝缘子以及Cre/loxP酶系统，不仅能提高HSA表达水平，还能提高该表达载体应用的安全性。

3、本发明建立了一种在原代牛乳腺上皮细胞中检测了表达载体pIACH表达HSA的方法，该方法经济、简单、适用。

4、本发明将HSA乳腺特异性表达载体pIACH转染到牛胎儿成纤维细胞，构建转基因的牛胎儿成纤维细胞系；荧光显微观察标记基因EGFP的表达情况，经G418筛选获得阳性克隆细胞，并进行PCR鉴定证实目的基因HSA整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。

5、以包含目的基因HSA的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫有望生产出转HSA基因的奶牛。

6、将转基因克隆胚移入20头受体牛子宫，获得6头妊娠4-6个月的转基因克隆胚胎受体牛。

附图说明

图1是BspEⅠ/BamHⅠ双切鉴定阳性重组质粒p IAC；

图2-1、2-2分别是XhoⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定阳性重组质粒pIACH；

图3是HSA牛乳腺特异性表达载体p IACH的质粒图谱；

图4是对p IACH载体阳性表达的牛乳腺上皮细胞总RNA的HSA基因RT-PCR检测结果图；

图5是对p IACH载体阳性表达的牛乳腺上皮细胞诱导培养液中HSA和beta-酪蛋白的western-blotting检测结果图；

图6是转染36h后荧光显微镜下观察pIACH载体阳性表达的牛胎儿成纤维细胞中表达报告基因EGFP表达的结果图；

图7是对p IACH载体阳性表达的牛胎儿成纤维细胞基因组的HSA基因PCR检测结果图；

图8-1～8-2是包含HSA基因的重组胚的囊胚发育图；

图9是对包含HSA基因重组胚的基因组的HSA基因PCR检测结果图。

具体实施方式

本发明首先构建含有HSA和绿色荧光蛋白（EGFP）基因的乳腺特异性表达载体pIACH；其次用

HD转染试剂将外源性表达载体p IACH和p CMVint（phiC31整合酶表达载体）共同转染牛乳腺上皮细胞，荧光显微观察标记基因EGFP的表达情况，并经G418筛选获得阳性克隆细胞，经PCR鉴定，证实目的基因HSA整合到牛乳腺上皮细胞的基因组，后对牛乳腺上皮细胞克隆进行激素诱导表达HSA，经RT-PCR和western-blotting检测HSA表达情况；最后，将pIACH和p CMVint（phiC31整合酶表达载体）共同转染牛胎儿成纤维细胞，方法同上。后将转染了HSA基因的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚，并进行PCR鉴定，将转基因克隆胚移入20头受体牛子宫，获得6头妊娠4-6个月的转基因克隆胚胎受体牛。

具体所涉及的试剂如下：G418、胎牛血清、

I Reduced Serum Media和DMEM/F12培养基、Trizol RNA提取试剂均购自美国GIBCO(Invitrogen）公司；EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司；细胞培养板和培养皿为丹麦Nunclon公司产品；质粒小提试剂盒和细胞基因组提取试剂盒均购自天根公司；Taq DNA聚合酶、DNALigation Kitver.2.0购自Takara公司；Pfu DNA聚合酶购自Fermentas公司；所有限制性内切酶均购自NEB公司；PureYield^TM Plasmid Midiprep System质粒中提试剂盒购自Promega公司；

HD转染试剂购自Roche公司。

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、乳腺特异性表达载体p IACH的构建

a、人血清白蛋白微基因的克隆

根据NCBI登录号为NM000477.5的人血清白蛋白mRNA序列设计引物P1和P2，通过RT-PCR方法，以从流产胎儿肝脏所提取到的总RNA为模板，扩增HSA所有外显子。引物序列如下：

前向引物P1:GGATCCGGCAGCCAATGAAATACAAAG 27

后向引物P2:CTCGAGCAGAATTTTCAGGATAGCAAC 27

引物P1引物下划线标注为BamHⅠ位点；P2引物下划线标注为XhoⅠ位点。

第一条c DNA链合成：参照RT Reagent Kit（TAKARA）反转录试剂盒操作说明进行。

50μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer（含Mg²⁺）：5μL，dNTPs（2.5mmol/L）：4μL，P1（10μmol/L）：0.5μL，P2（10μmol/L）：0.5μL，rTaq聚合酶（5U/μL）：0.25μL，模板（第一条c DNA链）2μL，加超纯水至50μL。

PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，31个PCR循环，72℃再延伸10min；

PCR产物与pMD-19T Vector 4℃连接过夜，转化感受态细胞E.coli DH5α,通过α-互补的蓝白斑筛选挑选重组子，经XhoⅠ和BamHⅠ酶切鉴定阳性重组质粒p19T-HSA，并送交华大基因公司测序。HSA基因测序结果与公布的HSA基因序列（NCBI登录号：NM_000477.5）同源性为99.8%，因此所克隆的基因为HSA基因。

参照NCBI登录号为NG_009291.1的人血清白蛋白基因组DNA序列设计引物P3和P4，以流产胎儿肝脏基因组DNA为模板，通过PCR扩增HSA前6个内含子基因。引物序列如下：

P3：ATATTAGTGCTAATTTCCCTCCGTTTGTCCTAG 33

P4：CATTCCTTCAGTTTACTGGAGATCGAATCTTGAT 34

50μL的PCR反应体系为：10×LA PCR Buffer（含Mg²⁺）：5μL，dNTPs（各2.5mM）：7μL，P1（10μmol/L）：0.5μL，P2（10μmol/L）：0.5μL，LATaq聚合酶（5U/μL）：0.5μL，模板3μL，加超纯水至50μL。

PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸7min，31个PCR循环，72℃再延伸10min；

PCR产物与p GEM-Teasy Vector 4℃连接过夜,转化感受态细胞E.coli DH5α,通过α-互补的蓝白斑筛选挑选重组子，经NotⅠ酶切鉴定阳性重组质粒pGEMT-H17，并送交华大基因公司测序。HSA基因测序结果与公布的HSA基因组序列（NCBI登录号：NG_009291.1）同源性为99.4%，因此所克隆的基因为HSA基因。

将p EGMT-H17经BstEⅡ和NcoⅠ酶切后，纯化回收得到包含HSA前6个内含子基因的大片段，与相同酶切后，纯化回收的p 19T-HSA连接，最后HSA前6个内含子连接到它们在基因组中原有的位置上，从而构建了p H16，该载体包含了HSA所有外显子和前6个内含子基因。HSA基因序列如SEQ.ID.NO.1所示，与公布的HSA基因组序列（NCBI登录号：NG_009291.1）同源性为99.5%。

b、p IAC载体的构建

p EGFP-C1是一种真核表达载体，在p EGFP-C1中插入的调控元件包括两个loxP序列、牛的生长激素polyA（BGHpolyA）序列、c HS4绝缘子序列（Ins，鸡绝缘子的核心）、phiC31整合酶识别位点attB和牛β-酪蛋白基因的5'调控区（BCP5），最后得到载体牛乳腺特异性表达p IAC。

其中，牛β-酪蛋白是奶牛乳汁中主要的蛋白质，牛β-酪蛋白基因具有很强的表达活性，在泌乳激素的刺激下，牛β-酪蛋白基因的5'调控区能够指导目的基因在牛乳腺组织中特异的高效表达；

phiC31整合酶，它是一种位点特异性重组酶，可精确催化30-40bp（Phage attachmentsite,attP）噬菌体附着位点和(Bacterial attachment site,attB)细菌附着位点间的单向重组。在哺乳动物细胞中，它也可以介导质粒上attB位点和那些部分序列与attP位点相似序列（即假attP位点）间的重组。phiC31整合酶系统具有介导整合的高效性和安全性，现已在基因治疗和反向转基因研究中广泛应用。

绝缘子既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件；它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强或抑制作用；绝缘子抑制增强子的功能是有极性的。它只抑制处于绝缘子所在边界另一侧的增强子的作用，而对处于同一结构域的增强子没有抑制作用，从而创造一个独立的功能区。对克服影响转基因表达的“位置效应”带来了极大的便利。

鸡β-球蛋白的(DNAseⅠ-hypersensitive site4,HS4)DNA酶Ⅰ超敏感位点4的上游区是最早发现并被研究的绝缘子，目前对c HS4核心区序列的研究和应用已成为热点，2个拷贝的核心区活性与全序列c HS4的活性完全相同。phiC31整合酶系统和绝缘子的综合应用，能够有效地提高表达载体应用的安全性和外源基因蛋白表达水平。Cre酶可催化34bpDNA序列（即loxP）重组。

LoxP序列由一个8bp的核心序列和两个位于其两侧的13bp回文序列组成。Cre酶可介导切除同向重复的2个LoxP位点间DNA片段和1个LoxP位点,保留1个LoxP位点。因此，在neo基因两侧放置两个方向相同的loxP序列，在Cre酶介导下可以将neo基因剔除，避免了新霉素在转基因动物中的残留，以提高转基因动物的安全性。

具体的构建过程如下：

①第一个loxP序列的插入

以pEGFP-C1为模板，并参照pEGFP-C1上MluⅠ和EgaⅠ间序列设计引物P5和P6，经PCR扩增得到一个新的MluⅠ/EgaⅠ基因片段。该基因片段与pEGFP-C1原MluⅠ/EgaⅠ基因片段相比较，该片段不再包含单链噬菌体的复制起点（f1 ori），并5’端的MluⅠ位点后插入一个loxP序列(GenBank ID:HQ683722.1)。具体如下：

P5：TATACGCGTA

CCACTTTTCGGGGAAATGT 63

P6：ATACGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAG 29

引物P5下划线标注为MluⅠ位点，加粗标注为loxP序列；P6引物位于载体pEGFP-C1中EgaⅠ位点的下游。

50μL的PCR反应体系为：10×Pfu PCR Buffer（含Mg²⁺）：5μL，dNTPs（2.5mmol/L）：4μL，P5（10μmol/L）：0.5μL，P6（10μmol/L）：0.5μL，Pfu Taq聚合酶（2.5U/μL）：0.25μL，模板1μL，加超纯水至50μL。

PCR条件为94℃预变性1min；94℃变性30s；61℃退火30s，72℃延伸1min，共31个循环；72℃在延伸10min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离后，胶回收纯化符合目的基因大小的条带。

将pEGFP-C1和回收到的PCR产物片段分别进行MluⅠ和EgaⅠ双酶切，经回收纯化后，将酶切后的PCR产物和pEGFP-C1大片段在4℃下连接过夜，转化感受态细胞E.coliDH5α，次日挑取阳性克隆，提取质粒。经MluⅠ和EgaⅠ酶切鉴定阳性重组质粒pML，并送交华大基因公司测序。插入的MluⅠ/EgaⅠ基因片段的测序结果（除去loxP序列后）与p EGFP-C1的MluⅠ与EgaⅠ间的基因序列同源性为100%；插入的loxP序列（SEQ.ID.NO.4所示）与所公布序列（GenBank:AB673360.1）的同源性也为100%。因此第一个loxP序列插入成功，得到载体pML。

②第二个loxP序列的插入

以pEGFP-C1为模板，参照pEGFP-C1上EcoO109Ⅰ和ApaLⅠ间序列设计引物P7和P8，经PCR扩增得到一个新的EcoO109Ⅰ/ApaLⅠ基因片段。该基因片段与pEGFP-C1原EcoO109Ⅰ/ApaLⅠ基因片段相比较，该片段在5’端的EcoO109Ⅰ位点后插入一个loxP序列(GenBank ID:HQ683722.1)，这第二个与前述的第一个loxP序列和方向都相同。具体如下：

P7：TATAGGCCCTA

GGCCATAGCCTCAGGTTACTC 66

P8：TCACGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAG 28

引物P7下划线标注为EcoO109Ⅰ位点，加粗标注为loxP序列；P8引物位于载体pEGFP-C1中ApaLⅠ位点的下游。

50μL的PCR反应体系为：10×Pfu PCR Buffer（含Mg²⁺）：5μL，dNTPs（2.5mmol/L）：4μL，P7（10μmol/L）：0.5μL，P8（10μmol/L）：0.5μL，Pfu Taq聚合酶（2.5U/μL）：0.25μL，模板1μL，加超纯水至50μL。

PCR条件为94℃预变性1min；94℃变性30s；62℃退火30s，72℃延伸1min，共31个循环；72℃在延伸10min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离后，胶回收纯化符合目的基因大小的条带。

将pML和回收到的PCR产物片段分别进行EcoO109Ⅰ和ApaLⅠ双酶切，经回收纯化后，将酶切后的PCR产物和pML大片段在4℃下连接过夜，转化感受态细胞E.coli DH5α，次日挑取阳性克隆，提取质粒。经EcoO109Ⅰ和ApaLⅠ酶切鉴定阳性重组质粒pMEL，并送交华大基因公司测序。插入的EcoO109Ⅰ/ApaLⅠ基因片段的测序结果（除去loxP序列后）与p EGFP-C1的EcoO109Ⅰ和ApaLI间的基因序列同源性为100%；插入的loxP序列（SEQ.ID.NO.4所示）与所公布序列（GenBank:AB673360.1）的同源性也为100%。至此两个loxP序列插入成功，得到载体pMEL。

③BGHpolyA的插入

以pcDNA4.0载体为模板，并参照pcDNA4.0上BGHpolyA序列设计引物P9和P10，经PCR扩增得到一个272bp的BGHpolyA基因片段。具体如下：

P9：CAGCAATTG GATCAGCCTCGACTGT 31

P10：TATACGCGTTCTTTCCGCCTCAGAAG 26

引物P9下划线标注为MunⅠ位点，加粗标注为XhoⅠ位点，为后续插入HSA微基因做准备；P10引物下划线标注为MluⅠ位点。

50μL的PCR反应体系为：10×Pfu PCR Buffer（含Mg²⁺）：5μL，dNTPs（2.5mmol/L）：4μL，P9（10μmol/L）：0.5μL，P10（10μmol/L）：0.5μL，Pfu Taq聚合酶（2.5U/μL）：0.25μL，模板1μL，加超纯水至50μL。

PCR条件为94℃预变性1min；94℃变性30s；58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃在延伸7min。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后，胶回收纯化符合目的基因大小的条带。

为了将pMEL多克隆位点后的SV40polyA替换为BGHpolyA，对pMEL和回收到的PCR产物片段分别进行MunⅠ和MluⅠ双酶切，经回收纯化后，将酶切后的PCR产物和p MEL大片段在4℃下连接过夜，转化感受态细胞E.coli DH5α，次日挑取阳性克隆，提取质粒。经MunⅠ和MluⅠ酶切鉴定阳性重组质粒p MEL-b，并送交华大基因公司测序。插入的BGHpolyA基因的测序结果（SEQ.ID.NO.3所示）与pcDNA4.0的MunⅠ和MluⅠ间基因序列同源性为100%。因此成功构建了载体p MEL-b。

BGHpolyA是一种终止子，在转录中起到终止转录的作用，从而提高转录剪接后mRNA的稳定性和表达效率。将SV40polyA替换为BGHpolyA，更有利于提高基因的表达效率。

④两侧c HS4绝缘子的插入

以鸡血中提取到的基因组为模板，参照NCBI登录号为NW_0014715

56.1所公布的序列设计两对引物P11和P12，以及引物P13和P14，借助PCR分别扩增得到290bp左右的基因片段，该片段都包含了c HS4核心区（250bp）。具体如下：

P11：GATATGTACACAGCCTAAAGCTTTTTCCCCGTATC 35

P12：TATATGTACAAGCAGGCTTTCCTGGAAGGTCCT 33

P13：ATATACGCGTCCTAAAGCTTTTTCCCCGTATC 32

P14：TATAACGCGTAGGCTTTCCTGGAAGGTCCT 30

引物P11和P12下划线标注为BsrGⅠ，引物P13和P14下划线标注为MluⅠ位点。

50μL的PCR反应体系为：10×Pfu PCR Buffer（含Mg²⁺）：5μL，dNTPs（2.5mmol/L）：4μL，上游引物（10μmol/L）：0.5μL，下游引物（10μmol/L）：0.5μL，Pfu Taq聚合酶（2.5U/μL）：0.25μL，模板1μL，加超纯水至50μL。

PCR条件为94℃预变性1min；94℃变性30s；62℃退火30s，72℃延伸30s，共31个循环；72℃在延伸7min。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后，胶回收纯化符合目的基因大小的条带。

将p MEL-b和回收纯化后包含有BsrGⅠ位点的PCR产物片段分别进行BsrGⅠ酶切，经回收纯化后，将酶切后的PCR产物和pMEL-b在4℃下连接过夜，转化感受态细胞E.coliDH5α，次日挑取阳性克隆，提取质粒。经BsrGⅠ酶切鉴定阳性重组质粒pLBI，并送交华大基因公司测序。测序结果表明为所插入的片段与所NCBI公布序列（NCBI登录号：NW001471556.1）的同源性为97%，且插入的基因为2个拷贝的目的片段，即该位点插入了两个串联的c HS4绝缘子，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

将pLBI和回收纯化后包含有MluⅠ位点的PCR产物片段分别进行MluⅠ酶切，经回收纯化后，将酶切后的PCR产物和pLBI在4℃下连接过夜，转化感受态细胞E.coli DH5α，次日挑取阳性克隆，提取质粒。经BsrGⅠ酶切鉴定阳性重组质粒pLBI，并送交华大基因公司测序。测序结果表明为所插入的片段与所NCBI公布序列（NCBI登录号：NW_001471556.1）的同源性为97%。该位点插入了一个目的片段，即一个c HS4绝缘子，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。至此成功构建了p LI，该载体的多克隆位点两侧都插入了绝缘子序列，多克隆位点5’端插入的是两个拷贝的c HS4核心区，3’端插入的是一个拷贝的cHS4核心区，且它们的方向相同。

⑤attB位点序列的插入

将载体pARNG（已有载体用于提供attB位点序列）、p MEL-b和p LI分别进行AseⅠ酶切，回收纯化pARNG酶切后的小片段（大小为285bp）分别和酶切后的pMEL-b和p LI，将回收纯化产物于4℃下连接过夜，转化感受态细胞E.coli DH5α，次日挑取阳性克隆，提取质粒。经AseⅠ酶切鉴定阳性重组质粒pA和pIA，并送交华大基因公司测序。测序结果表明为所插入的attB位点序列与pARNG上的同源性为100%。attB序列如SEQ.ID.NO.6所示。

⑥牛β-酪蛋白基因5′调控区的插入

以中国荷斯坦奶牛血液基因组为模板，参照NCBI公布的（GenBank：X14711.1）牛β-酪蛋白基因组序列设计引物P15和P16，经PCR扩增3687bp的基因片段，其包含了牛β-酪蛋白基因1702bp5’侧翼区和外显子1，内含子1和部分的外显子2。具体如下：

P15：TCCGGATAATGTAATTCAAAATTGGTGAGAG 31

P16：GGATCCCAATTCCTGGGAATGGGAAGAT 28

引物P15下划线标注为BspEⅠ，引物P16下划线标注为BamHⅠ位点。

50μL的PCR反应体系为：10×LA PCR Buffer（含Mg²⁺）：5μL，dNTPs（2.5mmol/L）：7μL，P15（10μmol/L）：0.5μL，P16（10μmol/L）：0.5μL，LATaq聚合酶（5U/μL）：0.25μL，模板1μL，加超纯水至50μL。

PCR条件为94℃预变性1min；94℃变性30s；58℃退火30s，72℃延伸3min，共31个循环；72℃在延伸10min。PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后，胶回收纯化符合目的基因大小的条带。

将回收纯化后的PCR产物片段与p MD20-T，在4℃下连接过夜，转化感受态细胞E.coliDH5α，次日挑取阳性克隆，提取质粒。经BspEⅠ和BamHⅠ酶切鉴定阳性重组质粒p20T-C，并送交华大基因公司测序。测序结果表明，所插入的片段与所NCBI公布序列NCBI公布的牛的β-酪蛋白基因（GenBank：X14711.1）同源性为99.5%，序列如SEQ.ID.NO.2所示。

载体p20T-C，pA和pIA分别进行BspEⅠ和BamHⅠ双酶切，经纯化回收后，将p20T-C酶切后的大片段分别与pA和pIA进行连接，4℃下连接过夜，转化感受态细胞E.coli DH5α，次日挑取阳性克隆，提取质粒。经BspEⅠ和BamHⅠ酶切鉴定阳性重组质粒pAC和pIAC，并送交华大基因公司测序。p IAC的BspEⅠ/BamHⅠ双切鉴定结果如图1所示，而且测序结果表明，牛β-酪蛋白基因启动子已成功插入，pAC和pIAC牛乳腺特异性表达载体构建成功。

c、p IACH的载体结构

将载体pAC，pIAC和p H16分别进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，经纯化回收后，将p H16酶切后的大片段分别与pAC和pIAC进行连接，4℃下连接过夜，转化感受态细胞E.coliDH5α，次日挑取阳性克隆，提取质粒。经BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定阳性重组质粒pACH和pIACH，并送交华大基因公司测序。

XhoⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定阳性重组质粒pIACH分别如图2-1、2-2所示，酶切结果表明HSA基因插入到了预定的位点；测序结果表明，HSA基因已成功插入，牛乳腺特异性表达载体pACH和pIACH构建成功。

以p IAC载体和p H16载体构建包含目的基因HSA的乳腺特异性表达载体p IACH的质粒图谱如图3所示。

由于质粒在大肠杆菌中增殖，用普通的质粒提取方法容易将细菌内毒素带到终产物中，细菌内毒素的存在会影响质粒转染效率和细胞生长，所以本研究使用了去内毒素的质粒提取试剂盒，以减少内毒素对试验结果的负面影响。经Promega公司PureYield^TM PlasmidMidiprep System质粒中提试剂盒提取质粒，后用核酸蛋白测定仪测定质粒的浓度和纯度。经测定，质粒的浓度为697.3ng/μl，OD260/280为2.01，说明质粒较纯，可用于转染。

2、检测表达载体pIACH在原代牛乳腺上皮细胞中HSA的表达

a、原代牛乳腺上皮细胞的培养

将从屠宰场中无菌采集的泌乳期奶牛乳腺，用PBS冲洗3次，含300IU/ml双抗的D-Hank’s液洗3次，后放入无菌的90mm培养皿中，无菌地将外包的组织去掉，从中间取一小块组织放入另一个无菌的60mm培养皿中，后将该小块组织剪成1cm³大小的块状，用D-Hank’s液洗几次直到液体变得清亮，没有奶液。此后，继续将组织块剪小，直至剪成1mm³大小，用D-Hank’s液洗至液体变得清亮后，用移液器枪头将小组织块按间距为0.5cm均匀地移入事先用培养液DMEM/F12+10%FBS(胎牛血清)湿润过的60mm细胞培养皿中。后倒置于培养箱中37℃，5%CO2条件下培养4小时，后缓慢地向培养皿中加入4ml的培养液DMEM/F12+10%FBS，于37℃，5%CO2条件下培养。之后，每48小时换一次液并镜下观察细胞生长情况，直至第7天可见有乳腺上皮细胞从组织块中开始迁出，至第12天细胞长满了培养皿。通过乳腺上皮细胞核成纤维细胞对胰酶的敏感度不同，将成纤维细胞去除。将胰酶消化下来的上皮细胞接种至6孔板中，后经过几次的消化将成纤维细胞彻底去除。冻存一部分细胞；一部分按每孔1～2×10⁴个细胞的密度接种于12孔板中，待长满后，用于免疫荧光染色检测角蛋白18；另一部分按每孔4～5×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，为转染做准备。

经证实角蛋白18免疫荧光染色检测结果为阳性后，将达到80%汇合的6孔板中的培养液吸弃，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞,加入胰酶消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用DMEM/F12+10%FBS的细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例接种于6孔板，放入CO₂培养箱中培养。1-3代的牛乳腺上皮细胞，培养至细胞达到80%汇合用于转染。

具体以G418作为筛选药物，由于表达载体pIACH的骨架上有G418抗性基因neo，pIACH成功转染的牛乳腺上皮细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染成功的正常细胞会在该浓度下死亡，因此需要确定正常细胞G418的最小致死浓度来作为筛选浓度。

G418最小致死浓度的测定：在牛乳腺上皮细胞培养液（DMEM/F12+10%FBS）中分别加入浓度梯度的G418筛选1周,测定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中G418的浓度≧500μg/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡,所以G418的最小致死浓度为500μg/ml。

b、表达载体pIACH转染牛乳腺上皮细胞

转基因的方法有很多种，包括物理的方法（电穿孔法、显微注射法、基因枪法，等）、化学的方法（脂质体法，

HD转染试剂法，等）和病毒载体法等。具体采用

HD转染试剂法介导载体pIACH转染牛乳腺上皮细胞。具体为：

接种前一天，将第1代牛乳腺上皮细胞接种于6孔板中，培养过夜使细胞达到70-80%汇合。对于每孔细胞，参照转染试剂操作说明分别将总量为2μg的pIACH、pCMVint（该载体是常用的phiC31整合酶表达载体，具体由professor M.P.Calos，Department ofGenetics,Stanford University School of Medicine,Stanford,CA惠赠）和8μl的

HD转染试剂加入到含有100μlI Reduced Serum Media的200μl离心管中（离心管事先用

I Reduced Serum Media洗一次），轻轻混合，置于室温孵育25min，后缓慢将其加入到细胞培养液中，放入CO₂培养箱中培养24-48h。

c、载体pIACH阳性表达的细胞克隆筛选

pIACH转染牛乳腺上皮细胞24h后，在荧光显微镜下观察报告基因EGFP的表达情况，结果看不到EGFP的表达。转染36h后，在荧光显微镜下可以看到绿色荧光。转基因的牛乳腺上皮细胞发出绿色荧光，说明pIACH已经进入细胞并且阳性表达；后将培养液吸弃，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞,加入胰酶消化液，消化细胞。离心收集细胞，DMEM/F12+10%FBS培养液重悬细胞，接种于已加入培养液的90mm培养皿中培养24h后，更换新鲜培养液，并在培养液中添加500μg/ml的最小致死浓度的G418筛选。

pIACH转染细胞7d后，对照组的细胞全部死亡，将包含pIACH转染阳性的细胞组的G418浓度减半持续筛选直到细胞长满皿底，可见到阳性细胞形成岛屿状细胞群，在荧光显微镜下仍然可以看到绿色荧光；然后消化细胞用不加G418的正常培养液扩大培养。

所筛选的阳性克隆细胞都是稳定转染pIACH的细胞，包含目的基因的pIACH已整合到细胞的基因组上，而不是游离于基因组之外；在稳定转染的过程中，由于质粒pIACH包含有phiC31整合酶识别位点attB，因此pIACH在牛乳腺上皮细胞基因组中整合的位置不是随机的，而是通过与phiC31整合酶表达载体pCMVint的共转，从而在phiC31整合酶介导下，pIACH整合于牛基因组中的“假attP位点”上；通过G418筛选7天再半剂量持续筛选来达到稳定转染的目的，表现为报告基因在被转染的阳性细胞内持续表达，因此筛选的阳性细胞持续发出绿色荧光并呈现G418抗性。

通过以上方法的转染和筛选，使得pIACH载体稳定整合到牛乳腺上皮细胞基因组中，从而得到了包含目的基因HSA的牛乳腺上皮细胞。

d、载体pIACH阳性表达细胞的PCR鉴定

取单克隆的pIACH阳性表达的牛乳腺上皮细胞扩大培养后，提取细胞基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR鉴定HSA基因是否整合到细胞基因组中，阴性对照为未转染的正常牛乳腺上皮细胞。由于目的基因为HSA微基因（包括了HSA所有外显子和前6个内含子，基因片段大小达9159bp），基因片段太大，因此，针对目的基因的3’端、5’端和中间区域设计了3对引物进行PCR鉴定。

P17：AACACCCACTGATTTCTATGCTA 23

P18：CATTGAAAACTGAGGAGTAACAC 23

P19：ATCTGCTTGAATGTGCTGATGAC 23

P20：TTGGGGTACTTTCTTGGTGTAAC 23

P21：TTTGGCACAATGAAGTGGGTAAC 23

P22：CAATGGATAGGTCTTTGGGATAGT 24

25μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer（含Mg²⁺）：2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）：2μL，上游引物（10μmol/L）：0.25μL，下游引物（10μmol/L）：0.25μL，rTaq聚合酶（5U/μL）：0.25μL，模板1μL，加超纯水至25μL。

PCR反应条件为：94℃预变性1min，94℃变性30s，58.9℃退火30s，72℃延伸30s，31个PCR循环，72℃再延伸7min；PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明所检测到的条带大小与预期相符，说明目的基因HSA已整合到牛乳腺上皮细胞基因组中。

与之相连的牛β-酪蛋白基因的5'调控区、BGHpolyA以及其他的调控元件c HS4和loxP序列与目的基因一起整合到牛乳腺上皮细胞的基因组。

对单克隆进行扩大培养，后提取细胞基因组，于37℃水浴条件下，50μl体系中，对1μg基因组DNA进行HindⅢ酶切过夜，对酶切产物进行纯化回收，酶切产物在100μl体系中，T4DNAligase作用下，于4℃连接过夜。以200ng回收纯化后的连接产物为模板，应用巢式反向PCR（nested inverse PCR）对其整合为点进行分析，具体为：

P23：GGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTC 25

P24：TCCACACCCTAACTGACACACATTC 25

P25：GCTGATTCTGTGGATAACCGTATTA 25

P26：GGTTATTGTCTCATGAGCGGATAC 24

50μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer（含Mg2+）：5μL，dNTPs（2.5mmol/L）：4μL，上游引物P23（10μmol/L）：0.5μL，下游引物P24（10μmol/L）：0.5μL，rTaq聚合酶（5U/μL）：0.5μL，模板200ng，加超纯水至50μL。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54-61℃退火30s，72℃延伸3min，31个PCR循环，72℃再延伸10min；15μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

取10μL第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR。其上下游引物为P25，P26。反应体系与条件同第一轮PCR。最后取15μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，对产物条带进行胶回收。回收产物与pMD19-T连接，转化DH5α大肠杆菌，挑取阳性克隆进行扩增培养，后送菌液至华大基因进行测序。依据phiC31整合酶介导attB与attP位点整合机制：在整合酶的介导下，外源性质粒上所带的attB序列与基因组中假attP位点进行交叉杂合，最后使得外源基因整合于基因组中，且两侧被attL和attR所包含。一般这种交叉杂合发生在“TTG”核心区，attL或attR是由一半的attB和一半的attP序列杂合所组成的。对测序后得到断点序列进行分析后，确定了在phiC31整合酶介导下，所构建的载体p IACH是可以特异性整合于牛基因组中的。以下为一例整合为点鉴定结果中attL的序列:

AAGCCGCGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCC GTTCCACCAAAGAGTAAAATGCTCTGGAATTC

下划线标记的序列为attB序列，加粗标记的“TTG”为attB与attP序列间发生交叉杂合的核心位点，不加任何标记的序列为基因组序列。

e、载体pIACH阳性表达细胞总RNA的HSA基因RT-PCR检测

经整合位点分析后，选取HSA特异性整合于牛基因组的乳腺上皮细胞单克隆扩大培养后，应用Trizol提取细胞的总RNA，通过

RT reagent Kit进行第一链cDNA的扩增，后经PCR进行HSA基因的检测。具体如下：

P27：GAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTA 23

P28：AGGTTTGGGTTGTCATCTTTGTG 23

P29：CACAAAGATGACAACCCAAACCT 23

P30：CTTGGAAACTTCTGCAAACTCAG 23

25μL的PCR反应体系为：10×Pfu PCR Buffer（含Mg²⁺）：2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）：2μL，P27/P29（10μmol/L）：0.25μL，P28/P30（10μmol/L）：0.25μL，Pfu Taq聚合酶（2.5U/μL）：0.15μL，模板2μL，加超纯水至25μL。

PCR条件为94℃预变性1min；94℃变性30s；58-60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃在延伸7min。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果条带大小与预期相符。如图4所示，分别扩增到324bp和387bp两个片段（H1和H2）与预期相符。图4所示的结果是对3个乳腺上皮细胞克隆，牛乳腺上皮细胞（BMEC）以及p IACH阳性质粒进行以上两片段RT-PCR检测的结果图，M为Trans5K DNA marker。

f、载体pIACH阳性表达细胞诱导培养液的HSA的western-blotting检测

将单克隆的pIACH阳性表达的牛乳腺上皮细胞按4～5×10⁵个细胞密度接种于6孔板中，待细胞汇合时，吸弃培养液，用无血清M199培养液洗2次，后每孔加入800μL的修饰过的无血清M199培养液，其中包含10ng/ml上皮生长因子（EGF），5μg/ml绵羊催乳素，1%（v/v）胰岛素样的转铁蛋白（Insulin-likelin-transferrin-seuim,ITS）。每24小时更换一次培养液，并收集培养液，后于-80℃冻存。一直这样诱导培养15天。

之后，将冻存的培养液在冻干机中冻干，用200μL的SDS-PAGE上样缓冲液重溶，并于12%的分离胶中进行电泳分离。后经考马斯亮蓝染液染色或是经半干法将胶中的蛋白转入PVDF膜中，室温下，在含10%的脱脂奶粉的TBST中封闭2小时，后放入含1:5000稀释的HSA单克隆抗体和10%的脱脂奶粉的TBST中，于4℃中孵育过夜，后用TBST，在摇床上振摇清洗5min，3次，后10min，3次。之后于室温下，膜与1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时，在摇床上振摇清洗5min，3次，后10min，3次。最后于暗室中曝光于Kodak XBT-1胶片中。同时也对β-酪蛋白表达进行检测。结果如图5所示，a图为检测一个转染了pIACH的阳性克隆细胞表达HSA的结果图，b图为该细胞表达β-酪蛋白的结果图，都分别检测了1-5天，以及第9和13天的表达情况，a图中HSA为HSA的标准品（50ng）。

牛乳腺上皮细胞来源于牛的乳腺，具有泌乳功能的牛乳腺上皮细胞是最能模仿乳腺泌乳功能，是最适合用于乳腺特异性表达载体评估的，是可作为乳腺泌乳功能调控机制研究的细胞模型。β-酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质之一，通过检测β-酪蛋白的表达可以确定乳腺上皮细胞是否具有泌乳功能。对β-酪蛋白的表达检测结果（如图5中的b图所示）显示，该上皮细胞是具有泌乳功能的，因此它是可以作为牛乳腺泌乳功能研究的细胞模型的，是可以反映乳腺特异性表达载体在乳腺中的作用的。对p IACH阳性表达的单克隆细胞进行的HSA表达检测结果表明了，所构建的载体p IACH是具有乳腺特异性的，是能够表达HSA的（如图5中的a图所示）。

3、表达载体pIACH转染牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞系

a、牛胎儿成纤维细胞的培养

从液氮中取一管荷斯坦奶牛的牛胎儿成纤维细胞于37℃解冻，加0.8mlDMEM/F12+10%FBS的细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液DMEM/F12+10%FBS重悬，取细胞悬浮液接种于6孔板中，置于培养箱中37℃，5%CO2条件下培养。

待牛胎儿成纤维细胞达到80%汇合时，吸弃培养液，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞,加入胰酶消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用DMEM/F12+10%FBS的细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例接种于6孔板，放入CO₂培养箱中培养。1-3代的牛胎儿成纤维细胞，培养至细胞达到80%汇合用于转染。

本发明以G418作为筛选药物，由于表达载体pIACH的骨架上有G418抗性基因neo，pIACH成功转染的牛胎儿成纤维细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染成功的正常细胞会在该浓度下死亡，因此需要确定正常细胞G418的最小致死浓度来作为筛选浓度。

G418最小致死浓度的测定：在牛胎儿成纤维细胞培养液（DMEM/F12细胞培养液）中分别加入浓度梯度的G418筛选1周,测定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中G418的浓度≧600μg/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡,所以G418的最小致死浓度为600μg/ml。

b、表达载体pIACH转染牛胎儿成纤维细胞

具体方法与表达载体pIACH转染牛乳腺上皮细胞相同。转染36h后，荧光显微镜下观察绿色荧光表达的情况如图6所示。

c、载体pIACH阳性表达的细胞克隆筛选

细胞克隆筛选方法与载体pIACH阳性表达的乳腺上皮细胞克隆筛选相似，只有G418的筛选浓度为600μg/ml。

通过转染和筛选，使得pIACH载体稳定整合到牛胎儿成纤维细胞基因组中，从而得到了包含目的基因HSA的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞。

d、pIACH载体阳性表达细胞的PCR鉴定

PCR鉴定的具体方法与pIACH载体阳性表达乳腺上皮细胞的PCR鉴定相同。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，以2Kplus DNAMarker(全式基因)为分子质量标准,获得了与预期大小相同的3个片段，分别为P1（538bp）、P2(506bp)和P3(413bp)检测结果如图7所示，其中，BFFgennome组为牛胎儿成纤维细胞基因组对照，pIACH组为质粒pIACH阳性对照，M为DNAMarker，clone1-3为阳性克隆细胞基因检测组，从图上明显可见检测组与阳性对照组完全相同，而阴性对照（BFFgennome组）并没有看到任何条带，说明目的基因HSA已整合到牛胎儿成纤维细胞基因组中。与之相连的牛β-酪蛋白基因的5'调控区、BGHpolyA以及其他的调控元件c HS4和loxP序列和attB序列也会与目的基因一起整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。

4、以上述基因组整合了目的基因HSA的牛胎儿成纤维细胞作为核供体细胞，构建转基因克隆胚

a、卵母细胞的成熟培养

卵巢采自西安市牛屠宰场，无菌采取荷斯坦奶牛卵巢，2-3小时内运回实验室，抽取3～8mm直径的卵泡，收集卵母细胞卵丘复合体，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵丘细胞，胞质均匀的卵母细胞用于成熟培养。卵母细胞的成熟培养液为：TCM199（Gibaco）加10%胎牛血清，10ng/ml的表皮生长因子，培养条件为：38.5℃，5% CO₂、95%空气的气体环境，饱和湿度；成熟培养20h后用0.2%透明质酸酶去除卵丘细胞，以第一极体排放作为卵母细胞成熟的判定标准，挑选成熟卵母细胞用于核移植试验。

b、转基因克隆胚的构建

本方面采用体细胞核移植（SCNT）技术将供体核转移到去除细胞核的成熟卵母中，其中，整合有外源基因的供体细胞是关键，本发明将供体细胞控制到10代以内，这主要考虑减少体外培养导致的突变在培养过程中的积累。

核移植具体为：显微操作液为含10%FBS，5μg/ml细胞松弛素B的PBS，用内径20μm的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质，以10μg/ml Hoechst33342染色10min，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞；

采用电融合法进行体细胞核移植，过程如下：在显微镜下挑选直径为15μm左右的供体细胞注射到透明带下，并使之与卵母细胞质膜紧密接触，注射后的细胞-卵胞质重组体以微电极挤压融合法进行融合；

融合前先将细胞-卵胞质重组体放入融合液（含0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸、0.1%BSA）中预平衡4～6min；用与显微操作仪连接的微电极的尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，用微电极尖轻轻压住重组体，给予2次电脉冲进行电融合（28V、10μs）。融合后的细胞-卵胞质重组体放入含10%FBS（fetal boving serum，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）的M199（购自GIBCO公司）中，38.5℃、5% CO₂、饱和湿度下培养，0.5～1h后观察融合情况。

c、转基因克隆胚的激活及体外培养

融合的重组胚（细胞-卵胞质重组体）在含10%FBS的M199中平衡2h后,用含5μmol/L离子霉素（Ionomycin，购自SIGMA公司）的mSOFaa培养液（购自SIGMA公司）处理5min，然后在含2mmol/L二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）的mSOFaa培养液内培养5h，洗3次后转移到mSOF aa微滴中培养,培养密度为5μL每个重组胚，在38.5℃、5%CO₂、饱和湿度下培养，每48h半量换液1次，第7-9天检查囊胚发育情况，如图8-1、8-2所示，克隆胚正常发育至囊胚，图中黑色部分为内细胞团，外围为滋养层细胞。

d、转基因克隆胚PCR鉴定目的基因HSA

重组胚胎基因组DNA的提取：将重组胚胎样品放入100μl灭菌的离心管中,加入20μl灭菌双蒸水，煮沸5min后稍离心，置于-20℃保存或直接用于PCR。

以提取的重组克隆胚的基因组为模板，PCR鉴定目的基因HSA，PCR反应：反应体系和过程与pIACH阳性表达的细胞HSA基因PCR鉴定步骤相同，以未转基因的克隆胚为阴性对照。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,以2Kplus DNAMarker(全式基因)为分子质量标准,获得了与预期大小相同的3个片段，分别为P1（538bp）、P2（506bp）和P3（413bp），如图9所示，其中，pIACH组为质粒pIACH阳性对照，BFFgennome组为牛胎儿成纤维细胞基因组对照，ddH₂O为去离子水对照组，M为DNAMarker，cloned embryo为克隆胚基因检测组，从图上明显可见检测组与阳性对照组完全相同，而阴性对照（BFFgennome组与ddH₂O组）并没有看到任何条带，说明目的基因HSA已整合到牛胚胎基因组中。

转基因克隆胚的胚胎移植和妊娠鉴定

第7天的囊胚用非手术法移入自然发情后第七天的荷斯坦受体牛子宫内，每个受体牛移植2枚囊胚。受体牛移植后观察其返情情况，对未返情的在移植后30d用B超做怀孕检查。以后每隔一月检查一次，以观察妊娠维持情况。

本发明共移植转HSA基因克隆胚胎到20头同期发情的受体奶牛体内，一个月后有8头建立妊娠，3个月后有6头维持妊娠并将继续被监测。

Claims

1.一种HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，包括位于启动子下游的目的基因HSA，在HSA基因的5'端连接BCP5序列，在其3'端连接有BGHpolyA序列；在启动子的上游还设有phiC31整合酶特异性识别位点。

2.如权利要求1所述的HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，所述的目的基因HAS包括了HSA所有外显子和前6个内含子，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；BCP5序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；BGHpolyA序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

3.如权利要求1所述的HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，还包括抗生素筛选基因和标记基因，标记基因位于启动子与BCP5序列之间，抗生素筛选基因位于BGHpolyA序列和phiC31整合酶特异性识别位点之间；抗生素筛选基因的上下游还分别设有两个同向的loxP序列。

4.如权利要求3所述的HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，所述的抗生素筛选基因为neo基因，标记基因为EGFP基因；phiC31整合酶特异性识别位点为attB，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；loxP序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

5.如权利要求3所述的HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，所述的标记基因与BCP5序列之间还设有两个串联的c HS4绝缘子序列，BGHpolyA序列和抗生素筛选基因上游的loxP序列之间还设有一个c HS4绝缘子序列；所述的c HS4绝缘子序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

6.如权利要求1～5任何一项所述的HSA乳腺特异性表达载体，其特征在于，该载体是pIACH表达载体，包括以下依次连接的元件：PUC ori、attB序列、CMV启动子、EGFP标记基因、两个串联的c HS4绝缘子序列、BCP5序列、HAS基因、BGHpolyA序列、一个c HS4绝缘子序列、lxop1序列、SV40p、SV40ori、抗生素筛选基因neo、HSVTKpolyA和lxop2序列。

7.一种基于权利要求6所述的HSA乳腺特异性载体的重组细胞，其特征在于，宿主细胞为原代牛乳腺上皮细胞，通过

8.一种诱导权利要求7所述的重组细胞HAS表达的方法，其特征在于，将pIACH阳性表达的牛乳腺上皮细胞在无血清M199培养液中培养，添加5～10ng/ml的上皮生长因子（EGF），5～10μg/ml绵羊催乳素，1～5%体积分数胰岛素样的转铁蛋白进行诱导，每24小时更换一次培养液，诱导时间为15～20天。

9.一种包含目的基因HSA的牛胎儿成纤维细胞，其特征在于，宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，通过

10.权利要求9所述的包含目的基因HSA的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。