CN101570763A - 一种用于制备人类疾病动物模型的转基因猪及其培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于制备人类疾病动物模型的转基因猪及其培养方法,采用基因工程的方法构建诱导性表达Cre重组酶表达载体pET28a-Mxl-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR,用干扰素诱导剂聚肌胞(polyI:C)进行诱导后能够表达Cre重组酶,从而用于敲除靶基因;通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出可以诱导性表达Cre重组酶的猪成纤维细胞;利用体细胞核移植技术进行克隆猪。该克隆猪可用于制备人类疾病的基因敲除的动物模型。
Description
技术领域:
本发明提供一种用于制备人类疾病动物模型的转基因猪及其培育方法,通过体细胞核移植技术制备了用于基因敲除的诱导性表达Cre重组酶的转基因猪,属于生物医药技术领域。
背景技术:
研究人类疾病动物模型可以帮助科学家理解疾病的发病机制、病理过程,甚至研究对疾病进行基因治疗,从而治愈人类疾病。迄今为止,小鼠模型已被广泛用于研究人类造血功能,先天和适应性免疫,免疫,传染病,癌症生物学和再生医学等领域。但是,许多小鼠疾病模型往往不能完全地模仿人类的疾病。猪在解剖、生理、器官发育和疾病发展过程等方面与人类的十分相似。猪动物模型是研究人类疾病的最好的动物模型。
本发明的任务是要建立Mx1-Cre转基因猪,下一步将用该工具猪去制备人类疾病的基因敲除的动物模型。
发明内容:
本发明提供了一种用于制备人类疾病动物模型的转基因猪,可用于制备人类疾病的基因敲除的动物模型。
本发明提供用于制备人类疾病动物模型的转基因猪,其特征在于:
该转基因猪是由Mx1启动子启动Cre重组酶表达的转基因猪,Cre重组酶可识别loxp位点从而敲除两个loxp位点之间的基因。
上述转基因猪的培育方法,包括以下步骤:
采用基因工程的方法构建诱导性表达Cre重组酶表达载体pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR,用干扰素诱导剂聚肌胞(poly I:C)进行诱导后能够表达Cre重组酶,从而用于敲除靶基因;
通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出可以诱导性表达Cre重组酶的猪成纤维细胞;
利用体细胞核移植技术进行克隆猪。
所述的诱导性表达载体pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR:是以pGL3-Mx1载体为模板,通过PCR循环扩增mx1启动子;以PMD-Cre载体为模板,通过PCR循环扩增Cre启动子;以pcDNA3.1(+)载体为模板,通过PCR循环扩增BGHpolyA;从pGCFRT2NeoR载体上用Xho I and Sal I酶切得到FRT2NeoR盒子;将所扩增的片段和酶切回收片段,分别连入pET28a载体。
具体制备工艺如下:
1、诱导性表达Cre重组酶基因表达载体的构建
1.1Cre重组酶基因的优化 对噬菌体P1的Cre重组酶基因编码序列密码子按小型猪基因嗜好密码子进行优化,克隆出优化的Cre重组酶基因(Cre),并克隆到PMD18T载体上构建了中间载体pMD-Cre。
1.2载体pCIneo-FRT2neoR的构建 用XhoI和SalI分别将载体pCIneo和pGC-FRT2NeoR进行双酶切,构建了中间载体pCIneo-FRT2neoR。然后用XhoI和NotI双酶切获得FRT2NeoR片段。
1.3Mx1-Cre-BGHpolyA片段的获得 通过PCR方法分别从pGL3Mx1载体上和pcDNA3.1(+)载体上扩增猪Mx1启动子和BGHpolyA。将Mx1、Cre和BGHpolyA 3个片段利用SOE-PCR进行连接,连接后产物用Nhe I和XhoI双酶切。
1.4PET28a+的处理 用Nhe I和Not I双酶切PET28a+载体,凝胶回收。
1.5PET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR载体的构建 上述酶切处理的片段经T4 DNA连接酶22℃连接过夜,经转化后,质粒小提,酶切和测序鉴定,获得Cre重组酶表达载体pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR。
2、诱导性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞的构建
2.1载体线性化 将pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR载体质粒大提后用NheI和XhoI双酶切,然后乙醇沉淀,用高压ddH2O溶解。
2.2脂质体转染 将线性化的载体按照脂质体LipofectamineTM2000说明书进行转染小型猪成纤维细胞,5%CO2,39℃培养。
2.3核供体细胞的获得 用G418筛选8~10天后,获得抗性细胞。采用PCR方法及和hiTAIL PCR方法对所获得的细胞进行鉴定,得到诱导性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞。该细胞即为核供体细胞。
3、诱导性表达Cre重组酶转基因猪的构建
3.1受体细胞的准备 从屠宰场获得卵巢从而得到未成熟的卵母细胞,随后进行体外成熟培养。成熟的卵母细胞移入装有去卵丘培养液的1.5mL离心管。剧烈的涡旋卵母细胞4~5min,把卵母细胞转入含有操作培养基的35mm平皿中。选择形态正常、具完整质膜、圆形和明显的卵周隙且排出第一极体的卵母细胞,在TCM199+10%FCS的培养液中洗涤3次,保存于胚胎操作液,放入CO2培养箱中待用。
3.2供核细胞的准备 以筛选得到的诱导性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞为核供体,将冷冻保存的供体细胞在39℃水浴快速复苏,离心去除上清液,把细胞传到含有细胞培养基的培养皿中,培养过程中继续用G418(300μg/mL)筛选。待细胞长至70~80%汇合时,用胰酶消化细胞,离心收集细胞,加入200μL胚胎操作液重悬细胞,室温下放置细胞30min,备用。
3.3去核 把去核卵母细胞和供体细胞放入同一去核培养液滴中,放入100mm平皿中,上面覆盖有轻质矿物油的显微操作培养基的液滴。5分钟后用显微操作仪进行去核操作。在显微镜下用持卵管从极体对侧固定卵母细胞,用外径20~25μm的斜口去核管吸出极体及附近少许胞质,完成去核操作。
3.4核供体细胞的注射 采用胞质内直接注射法,注射完成后培养30min,检测卵母细胞质膜完整性,弃去裂解卵,对完整的存活卵进行激活操作。
3.5融合和激活 注射完后通过电脉冲使供体细胞和受体卵母细胞融合。在融合和激活前注射后的卵母细胞保持在含有BSA的PZM-3中。移植结束后,应立即融合激活。激活于进行胞质注射后进行,采用电激活方法激活重组卵。融合的胚胎在500mL含有BSA的PZM-3中培养,上覆盖矿物油。
3.6胚胎移植 重构胚激活后经18~22h培养后,选择存活的进行胚胎移植。将融合好的细胞移入代孕母猪输卵管中,每头猪大约150~200个融合细胞。受体猪采用自然发情,术前禁食12h,麻醉。腹部剪毛,消毒,做10cm切口,暴露卵巢和输卵管,用移植管将胚胎经卵巢伞口放入输卵管的壶腹部。
3.7诱导Cre重组酶表达 小猪断奶后,肌注聚肌胞6mg,72小时重复注射同剂量,连用三次,最后一次注射2天后将小猪屠杀后取肝、脾、肾、心脏各组织进行免疫组化分析和RT-PCR分析Cre重组酶表达。
本发明的积极效果在于:对建立人类重大疾病的基因修饰猪动物模型,了解基因功能、阐明相关疾病发病机理、寻找疾病早期分子标志、研究新的治疗方法、验证新的药物靶标和开发新药具有重要意义。
目前已经成功获得了10头健康转基因小猪,该转基因猪已经经过鉴定可用于制备猪动物模型。
附图说明
图1:pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR载体图;
图2:出生的13头转基因猪和一个木乃伊照片;
图3:核移植过程示意图;
图4:转基因猪PCR鉴定;
图5:RT-PCR鉴定各组织Cre重组酶表达。
具体实施方式
为了便于理解本发明,特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。
实施例1
一、诱导性表达Cre重组酶基因表达载体的构建
1质粒 形成的重要的中间质粒有pCIneo-FRT2neoR和重组质粒pMD-Cre。
2实验过程 对噬菌体P1的Cre重组酶基因编码序列密码子按小型猪基因嗜好密码子进行优化,克隆出优化的Cre重组酶基因(Cre)。通过PCR方法分别从pGL3Mx1载体上和pcDNA3.1(+)载体上扩增猪Mx1启动子和BGHpolyA。从pGCFRT2NeoR上用Xho I and SalI酶切得到FRT2NeoR盒子。将上述4个片段利用SOE-PCR及酶连接的方法用T4DNA连接酶连接,然后利用原核表达载体PET28a(+)构建出Cre表达载体pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR(见附图1),委托赛百盛公司合成SOE-PCR引物(见表1)。
表1SOE-PCR引物
名称 | 引物序列 |
Mx1.f | 5′-GGTACCGCTAGCCATTCCAAAGGACAGCAGGGT-3′(NheI) |
Mx1.r | 5′-ATTGGCCATGGTGGAGTACTGAATTCCGTCCCCGGTGCGGTGAC-3′ |
Cre.f | 5′-AGTACTCCACCATGGCCAATCTCCTGACCGTCCACCAGAA-3′ |
Cre.r | 5′-GGCAACTAGAAGGCACAGTCAATCGCCATCTTCCAGCAGG-3′ |
BGHpolyA.f | 5′-CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTCTTTGCC-3′ |
BGHpolyA.r | 5′-TATAGGAACTTCCTCGAGCATAGAGCCCACCGCATCCCCA-3′(XhoI) |
3结果 PET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR经酶切和测序鉴定完全正确。
4结论 成功的构建了Cre重组酶表达载体PET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR。
二、诱导性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞的构建
1质粒 PET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR
2细胞 小型猪胚胎成纤维细胞
3实验过程 Cre重组酶表达载体PET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR线性化后,利用脂质体LipofectamineTM2000转染小型猪胚胎成纤维细胞,用G418筛选8~10天后,获得抗性细胞。采用PCR方法及和hiTAIL PCR方法(引物见表2)对所获得的细胞进行鉴定,得到诱导性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞。
表2hiTAILPCR引物
名称 | 引物序列 |
LAD1 | 5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)N(G/C/A)NNNGGAA-3’ |
LAD2 | 5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/T)N(G/C/T)NNNGGTT-3’ |
LAD3 | 5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/A)(G/C/A)N(G/C/A)NNNCCAA-3’ |
LAD4 | 5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGC(G/C/T)(G/A/T)N(G/C/T)NNNCGGT-3’ |
AC | 5’-ACGATGGACTCCAGAG-3’ |
GSP1 | 5′-TATAGGAACTTCCTCGAGCATAGAGCCCACCGCATCCCCA-3′(Xhol)(476bp) |
GSP2 | ACG ATG GAC TCC AG TC CGG CC AGG ACA TAG CGT TGG CTA CCC G-3’(278bp) |
GSP2-3 | 5’-CC AGG ACA TAG CGT TGG CTA CCC G-3’ |
GSP3 | 5’-AAA AGA CAG AAT AAA ACG CAC GGG TG-3’(124bp) |
4实验结果
4.1细胞毒性实验检测结果
通过对非转染细胞进行G418毒性检测,结果表明G418浓度在150~400μg/mL时对猪胎儿成纤维细胞有一定毒性作用。细胞的药物筛选浓度,应以细胞7天内全部死亡为标准,最终确定筛选浓度为300μg/mL。
4.2转染用DNA的准备
将构建好的Cre重组酶表达载体PET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR大量提取质粒。用NheI合Not I对其进行双酶切,用1/10体积3M乙酸钠和2倍体积无水乙醇沉淀线性化DNA。12000r/min离心10min,收集沉淀,70%乙醇洗涤后,无菌条件下自然风干,加入无菌4馏水溶解质粒备用。
4.3阳性细胞筛选结果
猪胚胎成纤维细胞,经脂质体转染后,G418筛选10天左右,得到了抗性细胞。抗性细胞基因水平检测了Cre重组酶基因为阳性。并通过hiTAIL PCR分析同一细胞整合了3条染色体,分别为1号,5号和13号染色体。在每条染色体的整合位点3’端设计整合位点特异性引物ISP1、ISP5和ISP13,利用ISP和GSP3进行PCR扩增,13号染色扩出了456bp片段,将片段回收后进行测序分析,结果显示整合位点在13号染色体,即有一个整合位点。用同样的方法分析了另一株细胞的整合位点为6号染色体。
5结论 成功的获得了转染Cre重组酶的猪成纤维细胞,该细胞已经从基因水平进行了鉴定。两株细胞的整合位点分别在13号和6号染色体上。
三、诱导性表达Cre重组酶转基因猪的构建
1实验过程
1.1卵母细胞的采集和体外成熟培养
收集活体外成熟的卵母细胞。猪核移植需要大量成熟的卵母细胞,获得体内成熟的卵母细胞价格昂贵。因此许多人选择使用体外成熟的卵母细胞。从屠宰场获得卵巢从而得到未成熟的卵母细胞,随后进行体外成熟培养。
1.2受体细胞的准备
成熟的卵母细胞移入装有去卵丘培养液的1.5mL离心管。剧烈的涡旋卵母细胞4~5min,把卵母细胞转入含有操作培养基的35mm平皿中。选择形态正常、具完整质膜、圆形和明显的卵周隙且排出第一极体的卵母细胞,在TCM199+10%FCS的培养液中洗涤3次,保存于胚胎操作液,放入CO2培养箱中待用。
1.3供核细胞的准备
以筛选得到的诱导性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞为核供体,将冷冻保存的供体细胞在39℃水浴快速复苏,离心去除上清液,把细胞传到含有细胞培养基的培养皿中,培养过程中继续用G418(300μg/mL)筛选。待细胞长至70~80%汇合时,用胰酶消化细胞,离心收集细胞,加入200μL胚胎操作液重悬细胞,室温下放置细胞30min,备用。
1.4去核
成熟的猪卵母细胞采用盲吸法吸出卵母细胞的第一极体,卵母细胞的细胞核位于第一极体的附近,不要破坏卵母细胞的细胞膜。去核后拔出移核管即完成,把细胞质连同染色体和极体推出移核管。把去核卵母细胞和供体细胞放入同一去核培养液滴中,放入100mm平皿中,上面覆盖有轻质矿物油的显微操作培养基的液滴。5分钟后用显微操作仪进行去核操作。在显微镜下用持卵管从极体对侧固定卵母细胞,用外径20~25μm的斜口去核管吸出极体及附近少许胞质,完成去核操作。
1.5核供体细胞的注射
采用胞质内直接注射法,注射完整的供体细胞到卵母细胞卵黄周的(perivitelline)位置。通过显微操作用移核管吸取单个供体细胞后注入卵母细胞透明带的裂口处。当移核管拔出时,膜的刺破部位应立即自动封闭。注射完成后培养30min,检测卵母细胞质膜完整性,弃去裂解卵,对完整的存活卵进行激活操作。注射时尽可能少注射培养基到卵母细胞,并确定卵母细胞膜被穿透和供体核留在卵母细胞内。
1.6融合和激活
注射完后通过电脉冲使供体细胞和受体卵母细胞融合。在融合和激活前注射后的卵母细胞保持在含有BSA的PZM-3中。移植结束后,应立即融合激活。激活于进行胞质注射后进行,采用电激活方法激活重组卵。BTX Electro-Cell Manipulator 200(BTX,SanDiego,CA)激活参数为2次间隔1s的110V/mm直流脉冲,时程20μs。融合的胚胎在500mL含有BSA的PZM-3中培养,上覆盖矿物油。
1.7胚胎移植
重构胚激活后经18~22h培养后,选择存活的进行胚胎移植。将融合好的细胞移入代孕母猪输卵管中,每头猪大约150~200个融合细胞。由于核移植胚胎由于普遍质量低、数量多(>100),所以选择具有形状好的1-细胞期胚胎培养18~22h后用于移植入代孕猪的输卵管。受体猪采用自然发情,术前禁食12h,麻醉。腹部剪毛,消毒,做10cm切口,暴露卵巢和输卵管,用移植管将胚胎经卵巢伞口放入输卵管的壶腹部。
1.8诱导Cre重组酶表达
选择0282-6号Mx1-Cre转基因小猪和同1天出生的非Mx1-Cre转基因小猪0283-40进行诱导。小猪断奶后,肌注聚肌胞6mg,72小时重复注射同剂量,连用三次,最后一次注射2天后将小猪屠杀后取肝、脾、肾、心脏各组织一部分放入10%福尔马林中固定24h,准备做免疫组化分析。另一部分提取总RNA进行RT-PCR分析Cre重组酶表达。
2实验结果
2.1胚胎移植
移植的7头长白猪中,移植30天后用B超检查,均可见明显胎儿,腹部明显隆起。其中耳号为0258的中途流产,耳号为0291的10月12日发现感染,10月28日返情,其余5头均顺利产下小猪。共产5窝小猪,13头(表1、表2和附图2)。
核移植过程见附图3。
表1猪胚胎移植记录
表2转基因猪出生记录
2.2基因组检测Cre重组酶基因
提取了5窝共13头小猪的基因组,然后用Cre的上、下游引物扩增,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳结果(如附图4所示)。在PCR中以PMD18-T-Cre载体为阳性对照和非转基因猪及水作阴性对照,从13头小猪的基因组中均扩增出约1kb的Cre片段与阳性对照一致,且阴性对照均未扩增出目的片段。
2.3RT-PCR检测结果
用聚肌胞进行诱导转基因猪0282-6和非转基因组0283-40后,取肝,肾,心和脾组织提取总RNA后进行RT-PCR分析,以猪GAPDH为内参照,其上游引物序列为:ACCTGACCTGC-CGTCTAGAA;下游引物序列为:TCCACCACCCTGTTGCTGTA,扩增目的片段为480bp,结果进行1%琼脂糖凝胶电泳如附图5所示。结果从转基因猪0282-6的肝,肾和心总RNA中均扩增出约1kb的Cre片段,非转基因组0283-40的相应组织中没有扩出目的片段。
3结论通过核移植技术成功的获得了13头转基因猪,目前有10头生长健康,通过基因水平和转录水平均已证实了该转基因猪的Cre重组酶已成功整合到基因组中并且已经表达。Cre重组酶的活性已经在本实验室的其他实验中证实。
Claims (3)
1、一种用于制备人类疾病动物模型的转基因猪,其特征在于:
由Mx1启动子启动Cre重组酶表达的转基因猪,Cre重组酶可识别loxp位点从而敲除两个loxp位点之间的基因。
2、权利要求1所述猪的培养方法,包括以下步骤:
采用基因工程的方法构建诱导性表达Cre重组酶表达载体pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR,用干扰素诱导剂聚肌胞(polyI:C)进行诱导后能够表达Cre重组酶,从而用于敲除靶基因;
通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出可以诱导性表达Cre重组酶的猪成纤维细胞;
利用体细胞核移植技术进行克隆猪。
3、权利要求2所述的培养方法,其特征在于:
诱导性表达载体pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR以pGL3-Mx1载体为模板,通过PCR循环扩增mx1启动子;
以PMD-Cre载体为模板,通过PCR循环扩增Cre启动子;
以pcDNA3.1(+)载体为模板,通过PCR循环扩增BGHpolyA;
从pGCFRT2NeoR载体上用Xho I and Sal I酶切得到FRT2NeoR盒子;
将所扩增的片段和酶切回收片段,分别连入pET28a载体。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20091104 |