CN110551691A - 一种特发性基底节钙化致病基因突变小鼠模型的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种特发性基底节钙化致病基因Slc20a2‑c.[1805C>G；1806C>G]突变小鼠模型及其构建方法，并将一种突变杂合小鼠精子Slc20a2‑c.[1805C>G；1806C>G]保藏在位于武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C2017256，实验证实本发明构建的特发性基底节钙化致病基因突变小鼠模型模拟了人类特发性基底节钙化(IBGC)患者的系列临床表型，说明IBGC疾病小鼠模型构建成功，为筛选用于治疗特发性基底节钙化(IBGC)疾病的药物奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属生命科学领域，涉及一种致病基因突变小鼠模型及其构建方法，具体涉及特发性基底节钙化致病基因突变敲入小鼠模型及其构建方法。
背景技术
特发性基底节钙化(Idiopathic basal ganglia calcification，IBGC)是一种以基底节及大脑其他部位钙化为特征的神经系统遗传疾病，俗称Fahr病。患者多在30～60岁之间发病，可出现帕金森样症状、共济失调、肌张力障碍、痴呆、记忆力下降、精神错乱、情感障碍、癫痫和头痛等症状。IBGC钙化在CT上表现为卵圆形或八字形高密度影，多呈对称性，常见累及部位有尾状核、齿状核、脑白质、丘脑、皮质、中脑、脑桥等。基底节钙化是临床CT检查中一种常见的征象，发生率为1％～20％，且随着年龄的增加而升高。甲状旁腺功能减退、微生物感染、年龄、肿瘤、外伤、中毒等多种因素均可引发基底节钙化，但IBGC患者颅内钙化的发生与上述因素无关，其血清生化指标如血磷、血钙、甲状旁腺激素(PTH)、碱性磷酸酶(ALP)、1,25(OH)2D、成纤维生长因子23(FGF23)等均正常。
IBGC疾病多以常染色体显性方式(Autosomal dominant,AD)遗传，具有高度遗传异质性。2008年，我们通过对一个来自中国河南的5代IBGC大家系 (HN-IBGC)进行全基因组微卫星标记连锁分析，将该家系致病基因定位在8 号染色体8p21.2-q11.23之间约25.0Mb的区域。这是一个新的IBGC致病位点，为进一步寻找IBGC致病基因奠定了基础。随后，我们又收集了一个来自中国山东的IBGC大家系(SD-IBGC)，连锁分析发现该家系致病基因同样定位于上述位点内，进一步精细定位将8p21.1-q11.23缩短在8p12-q11.23(18.7Mb 物理图距)染色体区段。对该区段内的候选基因进行测序，在HN-IBGC和SD- IBGC家系中分别发现SLC20A2基因c.1492G>A/p.G498R和 c.1802C>G/p.S601W突变，进一步验证在北京、巴西和西班牙的IBGC家系中又发现5个新突变，分别是c.1802C>T/p.S601L、c.124_126delGTG/p.V42del、c.1409delC/p.P470Lfs*38、c.1723G>A/p.E575K和c.1784C>T/p.T595M。上述7个突变分别在各自家系中与IBGC患者共分离，在508例家系外正常汉族人群和389例欧美洲人群中不存在上述突变，在千人基因组数据库中并非SNPs。这些结果首次在遗传上证明了SLC20A2基因突变是导致IBGC疾病的原因，这也是第一个IBGC疾病的致病基因。
SLC20A2基因编码III型钠-磷协同转运体2(PiT2)，在人体内广泛表达。通过体外功能实验我们发现，与野生型PiT2转运体相比，突变型(S601W, S601L,T595M,E575K,G498R和V42del)转运体向胞内转运无机磷(Pi)的活性大大降低，证实SLC20A2突变可导致PiT2磷转运障碍；但突变型转运体并未影响野生型转运体的磷转运功能，说明IBGC钙化发生的分子基础为PiT2单倍剂量不足，而非显性负效应。该研究率先发现SLC20A2突变是导致IBGC的致病原因，并且阐明了该病的致病机制是由无机磷跨膜转运障碍而导致。
IBGC本身涉及到极为复杂的中枢神经系统问题，对其研究存在很大的限制。小鼠Slc20a2基因与人SLC20A2基因同源性高达91％，在脑部也有较高表达量，可以通过构建小鼠IBGC疾病模型研究SLC20A2基因突变导致IBGC的病理、生理和分子机制，为未来开发针对性的药物及治疗手段提供基础。
发明内容
本发明的任务是提供一种特发性基底节钙化致病基因Slc20a2- c.[1805C>G；1806C>G]突变小鼠模型，本专利申请中也称为特发性基底节钙化 (IBGC)疾病小鼠模型。
本发明的另一个任务是提供这种小鼠模型的建构方法。
本发明的又一个任务是提供这种小鼠模型的应用。
实现本发明的技术方案是：
本发明提供的特发性基底节钙化(IBGC)疾病小鼠模型，其特征在于，该模型小鼠的Slc20a2基因cDNA第1805-1806位的碱基由CC突变为GG。所述的特发性基底节钙化(IBGC)疾病小鼠模型可用于筛选用于治疗特发性基底节钙化(IBGC)疾病的药物。
本发明提供的特发性基底节钙化(IBGC)疾病小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)将小鼠Slc20a2基因cDNA第1805-1806位的碱基CC突变为GG，从而使第602位密码子TCC突变为TGG，得到Slc20a2Knock-in小鼠打靶载体；
(2)将打靶载体线性化后转染ES细胞，药物筛选出阳性ES克隆，通过显微注射构造阳性ES克隆囊胚，得到嵌合雄鼠，将嵌合率大于50％的成熟雄鼠与雌鼠交配，获得双臂阳性F1代小鼠，将F1代小鼠进行自交，分别获得野生型(WT)Slc20a2Knock-In小鼠、杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠及纯和型(Slc20a2S602W/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠；
(3)取上述步骤(2)获得的雄性可育成年杂合型(Slc20a2+/S602W) Slc20a2Knock-In小鼠，进行精子的提取，得到突变杂合小鼠精子Slc20a2- c.[1805C>G；1806C>G](本发明中也称为：杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2 Knock-In小鼠精子)，将提取的精子浸入液氮中保存；
本专利申请人已经于2017年11月9日将该突变杂合小鼠精子Slc20a2- c.[1805C>G；1806C>G]送交位于武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017256；
(4)取步骤(3)中保存在液氮中的突变杂合小鼠精子Slc20a2- c.[1805C>G；1806C>G](本发明中也称为：杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2 Knock-In小鼠精子)进行复苏，检测精子活力正常后，取成年野生型小鼠卵子进行体外受精，再进行胚胎移植，繁殖小鼠获得杂合型(Slc20a2+/S602W) Slc20a2Knock-In小鼠后代，通过此基因型的雌雄后代小鼠交配获得25％的野生型(WT)Slc20a2Knock-In小鼠、50％的杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2 Knock-In小鼠及25％的纯和型(Slc20a2S602W/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠，对所获得的小鼠进行基因型鉴定，鉴定为纯和型(Slc20a2S602W/S602W)Slc20a2 Knock-In的小鼠即为本发明构建的特发性基底节钙化(IBGC)疾病小鼠模型。
上述步骤(2)中所述的将打靶载体线性化后转染ES细胞的方法是：将打靶载体线性化后通过电转染的方法转染ES细胞；上述步骤(2)中所述的雌鼠为C57BL/6J雌鼠。
上述步骤(3)中所述的进行精子的提取和将提取的精子浸入液氮中保存具体方法是：将精子冷冻液解冻后加浓度为1uL/1mL的硫代甘油混均，提取所述的雄性可育成年杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠的附睾于加有硫代甘油的冷冻液中，在显微镜下将附睾剪破使精液流出，室温放置8-12分钟，优选10分钟，将小鼠精液与加有硫代甘油的冷冻液混均后装入冻存管中，在液氮上空预冷后浸入液氮中保存。
上述步骤(4)中所述的检测精子活力的具体方法是：室温条件下从液氮中取出存有所述含精子的冻存管，室温放置15-30秒，优选20秒，37℃水浴25- 35秒，优选30秒，从冻存管中取10-20uL含精子的混合液至HTF平衡液中，转移至培养箱中放置15-60min，显微镜下观察精子活力。检测观察到精子活力正常，表明此杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠的精子冻存成功。
上述步骤(4)中所述的对所获得的小鼠进行基因型鉴定的具体方法是：剪取小鼠脚趾提取基因组DNA进行Sanger法测序。
本发明方法构建的特发性基底节钙化(IBGC)疾病小鼠模型可用于筛选用于治疗特发性基底节钙化(IBGC)疾病的药物。
本发明将小鼠Slc20a2基因[Ensembl Gene ID:
(ENSMUSG00000037656)]cDNA(Transcript:Slc20a2-201(ENSMUST00000067786))第1805-1806位的碱基CC突变为GG，从而使第 602位密码子TCC突变为TGG，编码的丝氨酸变为色氨酸(p.S602W)，得到 Slc20a2Knock-in小鼠打靶载体(见图1A)。将打靶载体线性化后通过电转染的方法转染ES细胞，药物筛选出阳性ES克隆，通过显微注射构造阳性ES克隆囊胚(囊胚来源：C57BL/6J小鼠超数排卵，自然受孕，体内发育至囊胚阶段)，得到8只>50％嵌合雄鼠。将嵌合率大于50％的成熟雄鼠与C57BL/6J雌鼠交配，获得双臂阳性F1代小鼠6只。将F1代小鼠进行自交，分别获得野生型 (WT)Slc20a2Knock-In小鼠、杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠及纯和型(Slc20a2S602W/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠(图1B和C)。
取上述获得的雄性可育成年(2-6月龄)Slc20a2Knock-In杂合型 (Slc20a2+/S602W)小鼠，进行精子的提取。首先，将精子冷冻液解冻，解冻后加浓度为1uL/1mL的硫代甘油混均，提取上述小鼠的附睾于加有硫代甘油的冷冻液中，在显微镜下将之剪破使精液流出，室温放置8-12分钟，优选10分钟，将小鼠精液与有硫代甘油的冷冻液混均后装入冻存管中，在液氮上空预冷后浸入液氮中保存。取上述1管冻存在液氮中的精子，进行解冻检测精子活力。先室温从液氮中取出冻存管1支，室温放置15-30秒，优选20秒，37℃水浴25-35秒，优选30秒，从冻存管中取10-20uL含精子的混合液至HTF平衡液中，转移至培养箱中放置15-60min，显微镜下观察精子活力，检测观察到精子活力正常，表明此杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠的精子冻存成功。
需要通过小鼠精子获得杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠时，提取杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠的精子，进行复苏，检测精子活力正常后，取成年野生型小鼠卵子进行体外受精，再进行胚胎移植，即可繁殖小鼠获得杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠后代，通过此基因型的雌雄后代小鼠交配可以获得25％的野生型(WT)Slc20a2Knock-In小鼠、 50％的杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠及25％的纯和型 (Slc20a2S602W/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠，可通过剪取此后代小鼠脚趾提取基因组DNA并进行Sanger法测序，以此鉴定以上小鼠基因型，筛选获得的纯和型(Slc20a2S602W/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠即为本发明构建的特发性基底节钙化(IBGC)疾病小鼠模型(也称为：特发性基底节钙化致病基因Slc20a2- c.[1805C>G；1806C>G]突变小鼠模型)。
本发明对Slc20a2Knock-In小鼠的表型分析：鉴于IBGC是一种随着年龄的增长呈渐进性发展的疾病，首先挑选年龄较大(248天大)的WT、 Slc20a2+/S602W及Slc20a2S602W/S602W小鼠，取脑部组织制备石蜡切片并进行HE (苏木精-伊红染色)、Von Kossa(钙沉积染色)及Gallyas-Braak银染色。结果显示，Slc20a2S602W/S602W小鼠脑部出现了多处钙化灶，而WT和Slc20a2+/S602W小鼠脑部则未发现钙化现象(见图2A、B和C)。
为了进一步观察Slc20a2S602W/S602W小鼠脑部钙化的发生发展过程，分别选择出生年龄为80、90、120、180、240、300天的Slc20a2S602W/S602W小鼠，取脑部组织制备石蜡切片并进行Von Kossa染色。结果显示，Slc20a2S602W/S602W小鼠出生90天时开始出现脑钙化，钙化结节最初仅在丘脑部位沉积，随着年龄的增长，小鼠脑部钙化结节数量逐渐增多，且大脑其他部位如海马、皮质、纹状体等部位也逐渐被累及(见图3)。随后选取180天年龄的Slc20a2S602W/S602W小鼠脑组织制备超薄切片，通过透射电镜观察发现钙化灶呈同心圆板层排列，钙化灶附近的血管形态异常(见图4)。
本发明对Slc20a2Knock-In小鼠脑脊液、血清无机磷浓度的检测：SLC20A2 基因在脑部大量表达。前期体外实验发现SLC20A2突变导致其编码的PiT2蛋白磷转运功能障碍，推测在体内SLC20A2突变可能导致胞外无机磷转运障碍，造成局部Pi浓度升高，引发脑钙化部位Pi稳态失衡。本发明分别取年龄2月的WT、Slc20a2+/S602W及Slc20a2S602W/S602W小鼠，取脑脊液、血清检测无机磷浓度。结果显示，Slc20a2S602W/S602W小鼠的脑脊液无机磷浓度(平均值＝1.858 mM)与WT小鼠(平均值＝1.149mM)相比显著升高，而Slc20a2+/S602W小鼠脑脊液无机磷浓度(平均值＝1.163mM)与WT小鼠无显著差异，此外3种基因型小鼠血清无机磷浓度(WT平均值＝3.961mM，Slc20a2+/S602W平均值＝3.996mM， Slc20a2S602W/S602W平均值＝3.857mM)无显著差异(见图5)。
本发明对Slc20a2Knock-In小鼠行为学分析：IBGC患者在临床上可表现出一系列复杂的神经精神症状，主要有运动障碍、认知障碍和精神障碍等。因此本发明通过平衡木实验、旷场实验、高架十字迷宫、Morris水迷宫、糖水偏好、强迫游泳等实验，对Slc20a2Knock-In小鼠的运动平衡能力、焦虑行为、学习与记忆以及抑郁行为进行检测。结果显示，在平衡木实验中， Slc20a2S602W/S602W小鼠通过平衡木所花的时间比与WT小鼠多，说明其运动平衡与协调能力较差(见图6A)；在旷场实验中，Slc20a2S602W/S602W小鼠在中央区呆的时间较WT小鼠长，而在高架十字迷宫实验中，Slc20a2S602W/S602W小鼠进入开放臂的时长和次数都明显更高，说明其焦虑显著过低(见图6B、C和 D)；在Morris水迷宫实验中，Slc20a2602W/S602W小鼠找到站台所花的时间及路径长度均比与WT小鼠多(见图6E和F)，以及Slc20a2602W/S602W小鼠在撤去站台的象限内游泳时间更长(见图6G)，说明其学习与记忆能力降低。
本发明构建的特发性基底节钙化致病基因Slc20a2-c.[1805C>G；1806C>G] 突变小鼠模型(也称为：特发性基底节钙化(IBGC)疾病小鼠模型)模拟了人类IBGC患者的系列临床表型，说明IBGC疾病小鼠模型构建成功，为开发对应的治疗药物奠定了基础。
附图说明
以下将通过附图对本发明的有关内容作进一步的说明。
图1：Slc20a2Knock-In小鼠模型建立。图中A：Slc20a2Knock-in小鼠打靶载体，其中小鼠Slc20a2基因cDNA第1804-1806位的碱基TCC突变为 TGG；图中B：Slc20a2Knock-in小鼠纯和个体突变位点测序图；图中C： WT、Slc20a2+/S602W以及Slc20a2S602W/S602W小鼠基因型鉴定酶切图，图中I对应 WT小鼠，II对应Slc20a2+/S602W小鼠，III对应Slc20a2S602W/S602W小鼠。
图2：Slc20a2Knock-In小鼠表型鉴定。图中A、B和C：Slc20a2S602W/S602W小鼠脑组织HE染色、Von Kossa染色及Gallyas-Braak银染色结果。
图3、Slc20a2Knock-In小鼠脑钙化的时空发展过程。图中黑色尖头指示钙化灶。靶值是500μm。
图4：Slc20a2Knock-In小鼠脑组织超薄切片透射电镜观察结果。图中A：正常血管；图中B：异常血管；图中C、E：钙化灶。V：血管，P：周细胞， C：钙化灶。白色箭头指示胞外囊泡，D图和F图分别为C图和E图中白色虚线框中的放大图。
图5：WT、Slc20a2+/S602W以及Slc20a2S602W/S602W小鼠脑脊液、血清Pi浓度检测结果。图中A：Slc20a2S602W/S602W小鼠脑脊液Pi浓度显著高于WT小鼠，但Slc20a2+/S602W小鼠脑脊液Pi浓度与WT小鼠无显著差异；图中B：WT、 Slc20a2+/S602W以及Slc20a2S602W/S602W小鼠血清Pi浓度无显著差异。
图6：Slc20a2Knock-In小鼠行为学实验结果。图中A：平衡木实验，小鼠分别通过12mm和6mm宽的平衡木所用的时间；图中B：旷场实验，小鼠在旷场中央区域所滞留的时间；图中C～D：高加十字迷宫实验：小鼠在开放臂所滞留的总时间(C)，以及小鼠进入开放臂占进入开放臂和闭合臂总次数的百分比 (D)；图中E～G：Morris水迷宫实验，在第1～4天隐藏平台的实验中，小鼠上台前的逃避潜伏期(E)和游泳路程(F)，图中G：在第5天撤去平台的实验中，小鼠在隐藏平台的象限内游泳总时长。
图7：实施例3的PCR反应程序。
具体实施方式
实验用动物及饲养
实验动物：C57BL/6L品系的Slc20a2+/+、Slc20a2+/S602W及 Slc20a2S602W/S602W小鼠为实验对象(转基因小鼠由我们委托上海南方模式动物中心制备)。
饲养环境：所有实验小鼠均饲养在华中科技大学SPF级实验动物中心。小鼠专用饲料及垫料由湖北省疾控中心提供。饲养条件：室温在22-25℃之间，湿度在40-70％之间，自由饮水摄食。
实施例1：Slc20a2Knock-In小鼠的建立
本发明建立基因knockin小鼠的技术为小鼠ES细胞同源重组技术和ES细胞囊胚注射技术，ES细胞上的基因剔除鉴定方法为PCR和测序；筛选基因为 Neo基因。具体实施过程如下：
1、通过构建质粒来获得Slc20a2突变基因(c.[1805C>G；1806C>G])打靶载体：(1)首先以BAC质粒为模板DNA，扩增Slc20a2基因同源重组臂A和 B。利用HindIII和BamHI限制性酶切位点将A臂和B臂克隆至pBR322-2S 质粒，获得Retrieve质粒。(2)将该质粒和BAC克隆，以同源重组方式，获得A区域到B区域之间包含5'和3'同源臂的Slc20a2基因片段。(3)利用 EcoRI和BamHI限制性酶切位点将新霉素Neo基因克隆至质粒PL-452的 Slc20a2-FRT内。(4)该重组质粒经Hind III酶切后，分离获得含c.1805- 1806CC>GG突变位点的Slc20a2-Neo-FRT基因的重组片断。(5)经过同源重组将该突变位点引入到上述获得的Retrieve质粒中，成功构建了打靶载体 pBR322-MK-Slc20a2(KI)，并用限制性内切酶及测序鉴定(图1A)。
2、通过细胞培养获得胚胎干(ES)细胞：按常规方法培养，培养皿以0.1％ Gelatin包被后接种丝裂霉素C处理的滋养层细胞(2×106cells/10cm)，过夜培养后即可接种ES细胞。ES细胞完全培养基为DMEM(含10-6mol/Lβ-巯基乙醇，2mM谷胺酰胺，0.1mM非必须氨基酸，100U/ml青霉素，50mg/L 链霉素，15％ES胎牛血清，1000U/ml LIF。
3、通过ES细胞电穿孔使得目的DNA转移：处于对数生长期的ES细胞加 0.125％的胰蛋白酶-EDTA消化并计数，加适量的PBS使细胞密度达到～1.5×107/m1。取0.8ml上述ES细胞悬液，加入约35μg经NotI线性化的 pBR322-MK-Slc20a2(KI)质粒DNA，混匀后转移至无菌电穿孔杯中以240 V、500μF的电参数进行电穿孔(实际通电时间9.6ms，实际电压256v)，重新悬浮后平均分配到三个已铺好滋养层细胞的10cm盘的培养皿中培养。
4、对正负药物筛选细胞并提取目的DNA：ES细胞在电穿孔24h和48h后使用含有选择药物G418(终浓度为300mg/L)和Ganciclovoir(终浓度为2umol/L) 的培养液进行选择性培养，每天更换培养液，经7-8天选择性培养，待抗性 ES细胞长成肉眼可见的克隆时即可进行挑取。挑取双抗性克隆放入30 μl0.1％胰蛋白酶-EDTA的96孔板(凹底)中消化3min，轻轻吹打，使细胞分散，转移至96孔培养板中培养，待细胞长满到60％-80％后取大部分细胞冻存，剩余细胞继续培养至长满后用于提取基因组DNA。
5、通过提取电转ES细胞获得其基因组DNA：在长满ES细胞的96孔板中吸去培养液，每孔加入80μL裂解液(含1g/L蛋白酶K)，56℃过夜消化后加入无水乙醇进行常规DNA提取，溶于100μL TE溶液中。
6、通过PCR鉴定同源重组阳性克隆的ES细胞：在Slc20a2打靶同源重组臂外侧分别设计Slc20a2-5p112和Slc20a2-3p211引物，在Neo基因序列上设计 Neo-Rh和Neo-Lh引物。用Slc20a2-5p112与Neo-Rh引物配对，鉴定5'臂同源重组，片段大小为3022bp，反应条件为：95℃4min变性后，94℃45 s，68℃180s进行34个循环后，72℃10min；用Scn11a-3p211和Neo-Lh 引物配对鉴定3’臂同源重组，片段大小为3011bp，反应条件为94℃4min 变性后，94℃45s，68℃180s进行34个循环，72℃延伸10min。
利用在Slc20a2打靶同源重组臂外侧分别设计Slc20a2-5p112和Slc20a2- 3p211引物，在neo序列上设计Neo-Rh和Neo-Lh引物。用Slc20a2-5p112与Neo-Rh引物配对，鉴定5'臂同源重组。通过胶回收试剂盒回收5'重组臂及3' 重组臂的PCR产物，经过酶切、测序确认。最后将上述克隆的ES细胞用于后续显微注射和囊胚移植。ES细胞阳性克隆检测结果显示双侧臂均发生正确同源的克隆共2个。
7、通过ES细胞的囊胚注射及胚胎移植获得嵌合体小鼠：鉴定阳性的ES细胞进行囊胚注射。注射采用无LIF的DMEM完全培养基，每枚囊胚注射15个左右的ES细胞，注射后囊胚培养于无LIF的DMEM完全培养基，37℃， 5％CO2条件下培养1h左右，将注射后的胚胎移植到2.5天假孕母鼠子宫中，每侧移植8-10枚。假孕母鼠饲养于SPF级动物房，自然分娩，产下的后代即为嵌合体小鼠。
8、嵌合体小鼠的育种及PCR实验鉴定小鼠基因型：挑选毛色嵌合率大于50％的雄性鼠与C57BL/6J纯系小鼠交配以获得ES细胞来源的小鼠。同ES细胞鉴定方法一样，用PCR方法鉴定阳性杂合子小鼠基因型。
通过ES细胞的囊胚注射和胚胎移植，F7克隆共注射72枚胚胎，制作7 只受体，共出生21只小鼠，其中8只为>50％嵌合雄鼠。嵌合体雄鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配。新生小鼠出生七天左右，进行剪指编号。经基因型鉴定确认获得杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠6只(图1B)。
实施例2：杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠精子冻存及保藏
取雄性可育成年(2-6月龄)Slc20a2Knock-In杂合型(Slc20a2+/S602W) 小鼠，进行精子的提取并保藏。首先，将精子冷冻液解冻，解冻后每1mL精子冷冻液中加1uL硫代甘油，混均。提取上述小鼠的附睾于解冻的冷冻液中，在显微镜下将附睾剪破，室温放置10分钟使附睾中精液充分流出，将小鼠精液与冷冻液混均，得到精子混合液。取含精子混合液于冻存管中，在液氮上空预冷后，再浸入液氮中保存，即得到突变杂合小鼠精子Slc20a2- c.[1805C>G；1806C>G]。
取上述1管冻存在液氮中的精子，进行解冻检测精子活力。先室温从液氮中取出冻存管1支，室温放置20秒，37℃水浴30秒，再取10-20uL精子混合液至HTF平衡液中，转移至培养箱中放置15-60min，显微镜下观察精子活力，检测观察到精子活力正常，表明此杂合型(Slc20a2+/S602W) Slc20a2Knock-In小鼠的精子冻存成功。
本发明专利申请人已经将上述冻存在液氮中的杂合型(Slc20a2+/S602W)Slc20a2Knock-In小鼠精子(突变杂合小鼠精子Slc20a2- c.[1805C>G；1806C>G]),通过液氮运输转移至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017256。
实施例3：Slc20a2Knock-In小鼠的表型分析
1、Slc20a2Knock-In小鼠基因型鉴定
本发明通过创造酶切位点的方法对不同基因型的小鼠，取出生3-5天小鼠脚趾样本，提取DNA进行酶切鉴定基因型。发明人应用引物设计软件，针对小鼠Slc20a2基因突变位点设计了一对错配引物(上游引物P1： GTCTCTGCTCCTCCAGGTGAGA，下游引物P2：GCAGCACTGAAGAGTCCAGCCA)。
使用该错配引物扩增小鼠Slc20a2基因，则PCR产物含有一段GAGCTC 序列，可被SacI内切酶识别，而当小鼠Slc20a2基因cDNA第1804-1806位的碱基TCC突变为TGG后，PCR产物中的对应序列变为GAGCTG，不能被SacI内切酶识别。因此以野生型小鼠DNA为模板的PCR扩增产物可完全被SacI内切酶识别，酶切后生成115bp和23bp两个片段；以杂合型Slc20a2Knock-In小鼠DNA为模板的PCR产物只有一半可被SacI内切酶识别，酶切后产生138bp、115bp和23bp三种片段；以纯合型Slc20a2Knock-In小鼠 DNA为模板的PCR产物不能被SacI内切酶识别，酶切后仅有138bp一种片段。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据不同片段的大小即可分辨出不同基因型的小鼠。其中23bp由于片段太小，电泳后跑出琼脂糖胶外。
具体方法如下：
剪小鼠脚趾(1mm即可)放入EP管中，加入裂解液A 150μl，95- 100℃煮45-60min，快速离心10000rpm，30sec，加入150μl裂解液B，涡旋混合，12000rpm离心1min，即可作为PCR反应用模板。其中裂解液A成分为25mM NaOH/0.2mM EDTA，裂解液B成分为40Mm Tris-HCl(PH＝8.0)。
PCR反应体系：(dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR buffer由北京天根生化科技有限公司提供，PCR引物由美国Life Technologies公司合成)
PCR反应总体系为10μl。PCR反应程序：见图7。
PCR程序结束后取2-3μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，只有电泳条带单一且亮度较强的PCR产物可以进行酶切反应。酶切体系如下所示：
将酶切体系配好后放入37℃培养箱中过夜酶切，酶切时间约为14-16个小时，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察并记录不同小鼠的酶切电泳结果(图1C)。从而确认获得了WT、Slc20a2+/S602W及Slc20a2S602W/S602W小鼠。
2、石蜡切片制备
取材：将小鼠用10％水合氯醛麻醉，固定于解剖板上，打开胸腔，将灌流针插入左心室，并在右心耳剪开小口。首先用生理盐水灌流，待血液完全流出后换成4％多聚甲醛灌流(15min)，然后将大脑取出放入4％多聚甲醛溶液中过夜固定。
脱水：将组织分别置于75％酒精4h，85％酒精2h，90％酒精2h，95％酒精 1h，无水乙醇I 30min，无水乙醇II 30min，醇苯5-10min，二甲苯I 5-10min，二甲苯II 5-10min，蜡I1h，蜡II 1h，蜡III 1h。
包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。至此，石蜡切片制作完成。
3、HE染色
石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 20min，二甲苯II20min，无水乙醇I10min，无水乙醇II 10min，95％酒精5min，90％酒精5min，80％酒精 5min，70％酒精5min，蒸馏水洗。
苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。
伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。
脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-二甲苯I 5min-二甲苯II 5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。观察结果发现，Slc20a2S602W/S602W小鼠脑部出现了多处钙化灶，而WT和Slc20a2+/S602W小鼠脑部则未发现钙化现象(图 2A)。
4、Von kossa染色
将脱蜡至水的切片在5％硫代硫酸钠溶液中孵育30min，蒸馏水冲洗，1％硝酸银溶液于紫外线下染色30min，蒸馏水冲洗浮在切片表面的黑色物质，继续用5％的硫代硫酸钠染色2min，1％中性红复染10min，最后脱水透明，中性树胶封片。5％硫代硫酸钠和1％硝酸银溶液均现用现配。观察结果发现， Slc20a2S602W/S602W小鼠脑部出现了多处钙化灶，而WT和Slc20a2+/S602W小鼠脑部则未发现钙化现象(图2B)。
5、Gallyas-braak银染色
将切片脱蜡至水，具体步骤如下：
a)0.3％高锰酸钾溶液中孵育10min；
b)蒸馏水中轻轻冲洗；
c)1％草酸溶液中孵育1min；
d)蒸馏水冲洗5min；
e)碱性银碘溶液中孵育1min；
碱性银碘溶液：NaOH 40g，碘化钾100g，蒸馏水500ml，1％硝酸银35ml
将NaOH溶于蒸馏水中后再加入碘化钾，直至完全溶解。缓慢加入硝酸银溶液并轻轻搅拌直至溶液清澈。最后加入蒸馏水定容至1000ml。
f)在0.5％的醋酸溶液中洗3次，每次1min；
g)显影液孵育16-18min；
显影液由溶液A和溶液B构成，两种溶液分别配好后在棕瓶中可放置2-3个月。用之前将两种溶液加到一起即可。溶液A:2g硝酸银，2g硝酸铵，10g硅钨酸，5.1ml 35％的甲醛溶液，依次溶于1000ml蒸馏水中。溶液B:50g无水碳酸钠溶于1000ml蒸馏水中。
h)在0.5％的醋酸溶液中洗3次，每次1min；
i)0.5％氯化金溶液中孵育5min；
j)蒸馏水中轻轻冲洗；
k)1％硫代硫酸钠孵育1min；
l)蒸馏水冲洗1min；
m)0.1％核固红染3min；
n)酒精脱水，二甲苯透明，封片。
观察结果发现，Slc20a2S602W/S602W小鼠脑部出现了多处钙化灶，而WT和 Slc20a2+/S602W小鼠脑部则未发现钙化现象(图2C)
6、超薄切片制备及透射电镜
首先对小鼠进行灌注处理，步骤同上述石蜡切片制作的取材过程。注意灌流过程中需用含3％多聚甲醛和2.5％戊二醛的PB溶液进行预固定。灌流完毕后将大脑取出放入4％多聚甲醛溶液中固定1～2h，然后沿正中线将大脑分成对称的两份，每只小鼠取其中一份进行石蜡切片染色，观察钙化发生部位，因颅内钙化具有对称性，这样有利于在制备电镜样品时精确取材；另一份则在固定完毕后移至30％蔗糖溶液中进行脱水处理。然后取出该脑组织制作成50um厚的冰冻切片以此获得较薄的组织便于后续浸样，将获得的组织切片用0.1M PB 溶液清洗3次，每次10min；而后将组织切片置于1％锇酸中处理2h，处理完后再用0.1M PB清洗3次，每次10min；接着50％酒精脱水2h，再用含1％醋酸铀的70％酒精溶液过夜12h以上；再用梯度酒精脱水，70％酒精0.5h，90％酒精0.5h，95％酒精2次0.5h，100％酒精2次1h；脱水完成后，将组织块用配制好的包埋剂(Resin 31.4g、DOSA 9.3g、NNA 20.5g、DMP-30 0.8g)浸泡处理，分别用无水乙醇：包埋剂为1:1、1:2的两种溶液先后处理1h，再用纯包埋剂过夜12h以上处理；然后将包埋剂中的组织切片置于电镜专用塑料膜中，以两片载玻片夹紧后于45℃烘箱中24h，再转移到60℃烘箱中烘48h以上，使得组织样品在包埋剂中聚合完全。将聚合完成的组织样品在低倍显微镜下找到具有钙化的部位，用手术刀片修取出1mm左右长宽的样品固定于包埋剂制作的基座上，最后用超薄切片机将样品切成70nm厚度的超薄切片，以300目的铜网捞取后，于透射电镜下观察、拍照。
观察结果发现，Slc20a2S602W/S602W小鼠脑部出现了异常血管和多处钙化灶现象，而WT和Slc20a2+/S602W小鼠脑部正(图4)。
实施例4、小鼠脑脊液、血清无机磷浓度检测
取材：将小鼠麻醉后固定于解剖板上，暴露延髓与小脑交界处，在此处插入毛细玻璃管的尖端，可吸出3-5μl脑脊液。随后刺破小鼠眼球取血，2500rpm 离心15min后分离血清。
发明人通过孔雀石绿法检测小鼠血清、脑脊液无机磷浓度。其反应原理为：孔雀石绿染料能与无机磷在钼酸溶液中形成的磷钼酸盐作用，在酸性条件下产生染料-磷钼酸盐络合物起呈色反应，溶液从棕色转变为绿色。
所需试剂：KH2PO4，4N盐酸(即4mmol/L的盐酸)，四水合钼酸铵，孔雀石绿
溶液配制：溶于4N盐酸中的4.2％钼酸铵溶液，0.045％孔雀石绿溶液 (现配现用)
具体实验步骤如下：
1、标准曲线制备：
a)用超纯水配制100mM的KH2PO4溶液；
b)将100mM的KH2PO4溶液用超纯水稀释，分别配制浓度为1，2，3，4，5， 6，8，10，12，14，16μM的KH2PO4工作液；
c)取50μl的KH2PO4工作液，先后加入75μl孔雀石绿溶液和25μl钼酸铵溶液，混合后加入到96孔板中，每种浓度设置3组平行实验；
d)在酶标仪上读取650nm处溶液的吸光值，并绘制标准曲线。
2、脑脊液无机磷浓度检测步骤：
取1μl脑脊液稀释至50μl，先后加入75μl孔雀石绿溶液和25μl钼酸铵溶液，混合后加入到96孔板中，酶标仪检测650nm处溶液的吸光值，并根据标准曲线得出溶液中的无机磷浓度。每个样品测3次取平均值。
3、血清无机磷浓度检测步骤：
取1μl血清稀释至150μl，从中取50μl先后加入75μl孔雀石绿溶液和 25μl钼酸铵溶液，混合后加入到96孔板中，酶标仪检测650nm处溶液的吸光值，并根据标准曲线得出溶液中的无机磷浓度。每个样品测3次取平均值。
结果显示，Slc20a2S602W/S602W小鼠的脑脊液无机磷浓度(平均值＝1.858mM) 与WT小鼠(平均值＝1.149mM)相比显著升高，而Slc20a2+/S602W小鼠脑脊液无机磷浓度(平均值＝1.163mM)与WT小鼠无显著差异，此外3种基因型小鼠血清无机磷浓度(WT平均值＝3.961mM，Slc20a2+/S602W平均值＝3.996mM， Slc20a2S602W/S602W平均值＝3.857mM)无显著差异(图5)。
实施例5、Slc20a2Knock-In小鼠行为学分析
本发明中行为学实验所用小鼠皆为雄性小鼠，Slc20a2602W/S602W基因型与 WT基因型小鼠各15只。
1、平衡木实验
将小鼠分别置于12mm宽和6mm宽的平衡木上，使行走0.8m的距离，统计其所需时间以及脚滑、掉落的次数。正式实验前对小鼠训练2天，每天分别在12mm宽和6mm宽的平衡木通过3次；第3天正式实验，让小鼠分别在12mm宽和6mm宽的平衡木上通过2次，取平均值，进行统计。
结果显示，Slc20a2S602W/S602W小鼠通过平衡木所花的时间比与WT小鼠多，说明其运动平衡与协调能力较差(图6A)。
2、旷场实验
实验参数：旷场实验箱长宽高为50cm*50cm*50cm，检测时间15min。实验开始时将小鼠置于实验箱中央，通过软件记录小鼠进入实验箱后15min 内的运动轨迹，统计小鼠在中央区域停留的时间。
结果显示，Slc20a2S602W/S602W小鼠在中央区呆的时间较WT小鼠长，说明其焦虑显著过低(图6B)。
3、高架十字迷宫实验
实验参数：开放臂(25x 5x 0.5cm)，闭合臂(25x 5x 16cm)，中央站台(5x 5x0.5cm)，整个实验装置距离地面高度50cm。
将小鼠头朝闭合臂方向放置，记录开放臂进入次数、停留时间，闭合臂进入次数、停留时间，并计算开放臂停留时间比例，开放臂计入次数比例。
结果显示，Slc20a2S602W/S602W小鼠进入开放臂的时长和次数都明显更高，说明其焦虑显著过低(图6C和D)。
4、Morris水迷宫实验
实验参数：泳池直径1.2m，高0.5m，站台直径10cm，水面高出站台 1cm，水温22℃。
将小鼠头朝池壁轻轻放入水中，总寻找时间1min，第1天为站台高出水面 1cm，训练小鼠寻找站台；第2～5天水面高出站台1cm，小鼠寻找站台；第6 天撤去站台，记录小鼠运动轨迹以及找到站台所需时间。每天站台位置及小鼠入水位点如下表所示：
(N：北，S：南，E：东，W：西，SW：西南，NW：西北，NE：东北， SE：东南，Center：中央)
结果显示，Slc20a2602W/S602W小鼠找到站台所花的时间及路径长度均比与 WT小鼠多(图6E和F)，以及Slc20a2602W/S602W小鼠在撤去站台的象限内游泳时间更长(图6G)，说明其学习与记忆能力降低。
5、糖水偏好实验
每只小鼠单独一笼，第1晚清水瓶喂养，第2晚2％蔗糖溶液水瓶喂养，第 3天白天同时清水瓶、糖水瓶喂养5h使小鼠熟悉，第3、4晚在同时存在清水瓶、糖水瓶的情况下，统计夜晚12h小鼠清水、糖水的摄入量。结果显示，Slc20a2602W/S602W小鼠和WT小鼠无明显差异。
6、强迫游泳实验
实验参数：泳池为直径40cm，高53cm，水深17cm，水温22℃。将小鼠放入 22℃的深水中强迫其游泳5min，记录其漂浮不动的时间。结果显示， Slc20a2602W/S602W小鼠和WT小鼠无明显差异。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种突变杂合小鼠精子Slc20a2-c.[1805C>G；1806C>G]，于2017年11月9日保藏在位于武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C2017256。
2.一种特发性基底节钙化疾病小鼠模型，其Slc20a2基因cDNA第1805-1806位的碱基由CC突变为GG。
3.权利要求2所述的特发性基底节钙化疾病小鼠模型在筛选用于治疗特发性基底节钙化疾病药物中的应用。
4.一种特发性基底节钙化疾病小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)将小鼠Slc20a2基因cDNA第1805-1806位的碱基CC突变为GG，从而使第602位密码子TCC突变为TGG，得到Slc20a2 Knock-in小鼠打靶载体；
(2)将打靶载体线性化后转染ES细胞，药物筛选出阳性ES克隆，通过显微注射构造阳性ES克隆囊胚，得到嵌合雄鼠，将嵌合率大于50％的成熟雄鼠与雌鼠交配，获得双臂阳性F1代小鼠，将F1代小鼠进行自交，分别获得野生型Slc20a2 Knock-In小鼠、杂合型Slc20a2Knock-In小鼠及纯和型Slc20a2 Knock-In小鼠；
(3)取上述步骤(2)获得的雄性可育成年杂合型Slc20a2 Knock-In小鼠，进行精子的提取，得到突变杂合小鼠精子Slc20a2-c.[1805C>G；1806C>G]，将提取的精子浸入液氮中保存；
(4)取步骤(3)中保存在液氮中的突变杂合小鼠精子Slc20a2-c.[1805C>G；1806C>G]进行复苏，检测精子活力正常后，取成年野生型小鼠卵子进行体外受精，再进行胚胎移植，繁殖小鼠获得杂合型Slc20a2 Knock-In小鼠后代，通过此基因型的雌雄后代小鼠交配获得25％的野生型(WT)Slc20a2 Knock-In小鼠、50％的杂合型Slc20a2Knock-In小鼠及25％的纯和型Slc20a2 Knock-In小鼠，对所获得的小鼠进行基因型鉴定，鉴定为纯和型Slc20a2Knock-In的小鼠即为特发性基底节钙化疾病小鼠模型。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的将打靶载体线性化后转染ES细胞的方法是：将打靶载体线性化后通过电转染的方法转染ES细胞。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的雌鼠为C57BL/6J雌鼠。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述的进行精子的提取和将提取的精子浸入液氮中保存具体方法是：将精子冷冻液解冻后加浓度为1uL/1mL的硫代甘油混均，提取所述的雄性可育成年杂合型Slc20a2 Knock-In小鼠的附睾于加有硫代甘油的冷冻液中，在显微镜下将附睾剪破使精液流出，室温放置8-12分钟，优选10分钟，将小鼠精液与加有硫代甘油的冷冻液混均后装入冻存管中，在液氮上空预冷后浸入液氮中保存。
8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述的检测精子活力的具体方法是：室温条件下从液氮中取出存有所述含精子的冻存管，室温放置15-30秒，优选20秒，37℃水浴25-35秒，优选30秒，从冻存管中取10-20uL含精子的混合液至HTF平衡液中，转移至培养箱中放置15-60min，显微镜下观察精子活力。
9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述的对所获得的小鼠进行基因型鉴定的具体方法是：剪取小鼠脚趾提取基因组DNA进行Sanger法测序。
10.权利要求4至9中任一项所述的构建方法获得的特发性基底节钙化疾病小鼠模型在筛选用于治疗特发性基底节钙化疾病药物中的应用。
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