CN111485003B - 一种视网膜血管疾病模型的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种视网膜血管疾病模型的构建方法及其应用，涉及视网膜血管疾病研究技术领域。构建方法包括如下步骤：通过基因工程技术使得Capsl基因在目标动物的血管内皮细胞中不表达或表达受到抑制。可以构建出具有视网膜血管生成缺陷表型的视网膜血管疾病动物模型，为本领域研究人员深入研究视网膜血管疾病尤其是家族性渗出性玻璃体视网膜病变的发病机制，临床早期筛查以及筛选出可有效靶向治疗药物提供了模型基础。

Description

一种视网膜血管疾病模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及视网膜血管疾病研究技术领域，具体而言，涉及一种视网膜血管疾病模型的构建方法及其应用。

背景技术

家族性渗出性玻璃体视网膜病变(familial exudative vitreoretinopathy，FEVR)是一种进行性视网膜血管病变，其特征是视网膜血管发育不全或异常，其遗传异质性较高，包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X染色体连锁隐性遗传等多种遗传方式。视网膜血管生成缺陷会导致各种并发症，包括视网膜新生血管和渗漏、视网膜褶皱和分离、玻璃体出血和黄斑异位，最终导致完全失明。

目前，鉴定出的FEVR致病基因包括FZD4, NDP, LRP5, TSPAN12, ZNF408, KIF11,RCBTB1，CTNNB1，JAG1, ATOH7。其中，Norrin信号通路中的四个突变基因FZD4，NDP，LRP5和TSPAN12只能解释约一半FEVR患者的病因。FEVR患者临床表现多样，轻症患者可无任何症状，重症患者可发生视网膜脱落甚至失明。眼底血管造影及遗传学筛查是主要的诊断方式，早期筛查对该病的治疗及预后具有重要意义。疾病初期激光治疗可控制其进展；疾病晚期视网膜脱离可进行巩膜扣带术及玻璃体切割术，但预后差；抗血管内皮生长因子对新生血管的抑制作用在治疗中可发挥一定作用。随着对致病基因的进一步鉴定和致病机制的深入研究，针对FEVR致病基因的选择性靶向治疗会成为某些临床表型FEVR患者的治疗新方向。

为了更好地筛查和研究FEVR疾病，以及筛选出有效的靶向治疗药物，本领域需要鉴定出更多新的FEVR致病基因，以及需要模拟出FEVR疾病特征的动物模型。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种视网膜血管疾病模型的构建方法及其应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

一种视网膜血管疾病动物模型的构建方法，视网膜血管疾病为家族性渗出性玻璃体视网膜病变，构建方法包括如下步骤：通过基因工程技术使得Capsl基因在目标动物的血管内皮细胞中不表达或表达受到抑制。

发明人首次发现，在血管内皮细胞中通过基因工程技术抑制Capsl基因的表达或使Capsl基因不表达，可使动物体表现出家族性渗出性视网膜病变(familial exudativevitreoretinopathy，FEVR)的特征，即动物具有视网膜血管生成缺陷的表型。这样可以构建出具有视网膜血管生成缺陷表型的视网膜血管疾病动物模型，为本领域研究人员深入研究视网膜血管疾病尤其是家族性渗出性玻璃体视网膜病变的发病机制，临床早期筛查以及筛选出可有效靶向治疗药物提供了模型基础。

在本发明应用较佳的实施例中，上述构建方法包括通过基因工程技术使得Capsl基因的第2外显子序列在目标动物的血管内皮细胞中不表达或表达受到抑制。

本发明揭示了使得Capsl基因在目标动物的血管内皮细胞中不表达或表达受到抑制可以导致视网膜血管生成缺陷的基础上，本领域的技术人员采用任何的基因操作技术使得Capsl基因在目标动物的血管内皮细胞不表达或表达受到抑制（即不发挥正常的功能）均在本发明的保护范围之内。

在本发明应用较佳的实施例中，上述基因工程技术为基因编辑技术、基因敲除技术和RNA干扰技术中的任意一种技术或多种技术的组合。

在本发明应用较佳的实施例中，上述基因敲除技术为Cre-loxp基因敲除技术。

在本发明应用较佳的实施例中，上述基因编辑技术选自DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、ZFN技术和TALEN技术中的至少一种。

在本发明应用较佳的实施例中，上述构建方法包括利用DNA同源重组技术和CRISPR/Cas9技术使Capsl基因的第2外显子序列在目标动物的血管内皮细胞中不表达或表达受到抑制，获得Capsl基因敲除的首建动物，将Capsl基因敲除的首建动物与另一个Capsl基因敲除的首建动物交配获得Capsl基因条件性敲除的纯合子动物。

在本发明应用较佳的实施例中，上述Capsl基因敲除的首建动物通过如下方法获得：将针对Capsl基因的第2外显子序列的gRNA、Donor同源模板与Cas9 mRNA混合，注射至目标动物的受精卵中，经发育成熟后，获得Capsl基因敲除的首建动物。

在本发明应用较佳的实施例中，上述Donor同源模板带有loxp序列。

Donor同源模板在Capsl基因的第二外显子两端带有loxp序列。Donor同源模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

利用CRISPR/Cas9技术靶向Capsl基因的第二外显子，Cas9蛋白切开目的基因，并将带有loxp的Donor同源模板通过同源重组的方式替换Capsl基因的第二外显子。

此外，在其他实施方式中，敲除Capsl基因（含五个外显子）的外显子是指敲除Capsl基因的第二外显子。

在本发明应用较佳的实施例中，上述构建方法还包括将Capsl基因条件性敲除的纯合子动物与转基因动物交配，得到血管内皮细胞条件性敲除Capsl基因动物。

在本发明应用较佳的实施例中，上述将Capsl基因条件性敲除的纯合子动物与转基因动物交配得到的血管内皮细胞条件性敲除Capsl基因动物再次与转基因动物交配。这样可以获得血管内皮细胞条件性敲除Capsl基因的纯合子动物。

在本发明应用较佳的实施例中，上述转基因动物为转Pdgfb-iCreER基因动物或转Cdh5基因动物。

由于影响血管系统的基因突变通常是胚胎致死的，很难应用于对出生后动物血管发育的研究。因此，利用含有Pdgfb基因的噬菌体人工染色体得到在血管内皮细胞中表达的他莫昔芬可诱导型Cre重组酶(iCreER(T2))的转基因小鼠。

转Pdgfb-iCreER基因动物购自英国伦敦University College London。此转基因动物表达血管内皮细胞特异的血小板衍生因子(Platelet-derived growth factorβ，PDGFβ)启动子驱动的特殊改造的Cre基因表达。改造的Cre蛋白正常情况下定位于细胞质中，在结合他莫昔芬(Tamoxifen)后可以进入细胞核，识别基因组上LoxP位点，实现基因敲除。

在本发明应用较佳的实施例中，上述目标动物为非人哺乳动物。

在本发明应用较佳的实施例中，上述非人哺乳动物选自小鼠、大鼠、马、猪、猴、狗和猿中的任意一种。

对于任何非人哺乳动物，只要其具有Capsl基因，即可以通过本发明提供的方法构建出相应的视网膜血管疾病模型。无论选用何种非人哺乳动物，构建视网膜血管疾病模型，均属于本发明的保护范围。

由上述构建方法得到的视网膜血管疾病动物模型在视网膜血管疾病研究中的应用，研究是以非疾病的诊断或治疗为目的。

视网膜血管疾病动物模型在早期分子筛查药物、预防或筛选靶向治疗家族性渗出性玻璃体视网膜病变药物中的应用。

上述应用包括：给予上述视网膜血管疾病动物模型施用候选药物；观察被施用候选药物后的视网膜血管疾病动物模型是否出现以下变化，如果出现以下变化中的任意一种或几种，则指示所施用的候选药物可以作为治疗视网膜血管疾病的药物：

（1）施用候选药物后，视网膜血管疾病动物模型的视网膜血管发育缺陷较施用候选药物前得到抑制或减轻；

（2）施用候选药物后，视网膜血管疾病动物模型的血管内皮细胞增殖情况较施用候选药物前增加；

（3）施用候选药物后，视网膜血管疾病动物模型的玻璃体血管退化滞后较施用候选药物前得到改善。

当然，需要说明的是，上述的变化仅仅是示例性的说明，本领域技术人员可以根据实际情况，以本发明方法构建出的视网膜血管疾病动物模型作物研究对象，选择合适的观察指标，观察施用候选药物前后的这些指标的变化，根据指标的变化情况作出合理的判断，以指示所施用的候选药物是否可以作为治疗视网膜血管疾病的药物。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种视网膜血管疾病模型的构建方法及其应用，本发明首次提出通过基因工程技术抑制Capsl基因的表达或使Capsl基因不表达，可使动物体表现出家族性渗出性视网膜病变的贴张，可以构建出具有视网膜血管生成缺陷表型的视网膜血管疾病动物模型，为本领域研究人员深入研究视网膜血管疾病尤其是家族性渗出性玻璃体视网膜病变的发病机制，临床早期筛查以及筛选出可有效靶向治疗药物提供了模型基础。

本发明提供了由模型构建方法获得的视网膜血管疾病动物模型在视网膜血管疾病研究、在早期分子筛查药物、预防或筛选靶向治疗家族性渗出性玻璃体视网膜病变药物中的应用，具有非常广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为构建Capsl基因带有loxp的小鼠流程图；

图2为小鼠基因型鉴定图；

图3为他莫昔芬给药示意图；

图4为小鼠视网膜血管染色结果图（图中：Ctrl-野生型小鼠，CAPSLiECKO/iECKO-Capsl基因敲除小鼠）；

图5为玻璃体血管染色结果；

图6为视网膜血管内皮细胞增殖染色结果示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了的一种视网膜血管疾病小鼠模型的构建方法，利用提供带有点突变和Floxp的同源模板Donor，利用DNA同源重组技术在特定外显子实现了替换，利用Cre-loxp条件敲除技术，构建出在血管内皮细胞中特异性敲除Capsl基因的视网膜血管发育缺陷小鼠模型。

视网膜血管疾病小鼠模型的构建方法包括如下依次进行的步骤：

（1）Capsl-flox首建鼠的建立。在体外合成两边加有loxp位点，且带有点突变（exon2: c.G70A, pD24N）的用于替换Capsl基因第二外显子的同源模板Donor。

同源模板Donor的核苷酸序列参照SEQ ID NO.1所示。

设计一对gRNA靶点进行基因组的剪切：

Capsl-L gRNA：5’-CTATCCCAA TTGTGCTCCTGG-3’；

Capsl-R gRNA：5’-TGGGACTCATGGTTCTAGAGG-3’。

参照图1所示，将基因组DNA中的第二外显子同源替换为带有点突变且两端带loxp的Donor DNA。首先将Cas9 mRNA、Capsl-L gRNA、Capsl-R gRNA和Donor质粒混合物注射到小鼠（购自北京唯尚立德生物科技有限公司）的受精卵中，待小鼠出生后对其进行测序，从而进行基因分型和鉴定。得到Capsl第二外显子5’和3’端loxp插入的杂合子小鼠，即Capsl^loxp/+小鼠。

（2）将Capsl^loxp/+小鼠和Capsl^loxp/+小鼠交配，获得稳定遗传的F1代小鼠，即Capsl^loxp/loxp小鼠。

（3）将Pdgfb-iCreER；Capsl^+/+小鼠（转Pdgfb-iCreER基因小鼠购自英国伦敦）和Capsl^loxp/loxp小鼠交配，根据孟德尔遗传定律，后代中有一半小鼠基因型为Pdgfb-iCreER；Capsl^loxp/+。

由于影响血管系统的基因突变通常是胚胎致死的，步骤（2）获得的Capsl^loxp/loxp小鼠很难应用于对出生后动物血管发育的研究。因此，利用含有Pdgfb基因的噬菌体人工染色体得到在血管内皮细胞中表达的他莫昔芬可诱导型Cre重组酶(iCreER(T2))的转基因小鼠。

（4）将Pdgfb-iCreER；Capsl^loxp/+小鼠和Capsl^loxp/loxp小鼠交配，检测子代小鼠的基因型，选择血管内皮细胞中特异性敲除Capsl基因（第二个外显子）的小鼠（基因型为Pdgfb-iCreER;Capsl^loxp/loxp），该小鼠即可作为具有视网膜血管发育缺陷特征的视网膜血管疾病小鼠模型（即Capsl基因敲除小鼠）。

采用本发明提供的小鼠模型构建方法构建获得了具有Pdgfb-iCreER;Capsl^{loxp /loxp}基因型的小鼠。

实施例2

为了诱导Cre重组酶的表达，本实施例利用他莫昔芬（Tamoxifen）诱导Cre重组酶的表达（参照图3所示）。Capsl基因敲除小鼠出生后一天（P1）开始腹腔注射25mg/kg他莫昔芬，连续注射三天，取P5、P9天小鼠视网膜用于实验。

在他莫昔芬诱导的Cre-loxp系统中，雌激素受体（ER）的配体结合域的突变形式与Cre重组酶结合形成融合蛋白，使雌激素受体（ER）不再与它的生理性雌激素结合，而只能与外源性的雌激素类似物他莫昔芬结合。当不外加他莫昔芬时，融合蛋白分布于细胞质中并结合热激蛋白如Hsp90，抑制雌激素受体临近配体结构域的功能，使这种复合体定位于细胞质中，而不能进入细胞核内。当加入他莫昔芬时，Hsp90与融合蛋白分离，雌激素受体转变为活性状态，暴露出雌激素受体的核定位信号，在核定位信号的引导下，Cre重组酶能进入核中并识别基因组上的LoxP位点，实现基因敲除。

实验例1

本实验例对实施例1中构建的视网膜血管发育缺陷小鼠模型的基因型进行鉴定，以确定构建的小鼠模型的血管内皮细胞中Capsl基因被敲除。

采用碱裂解法提取小鼠尾巴基因组DNA。利用如下引物对小鼠尾巴基因组DNA进行PCR扩增进行基因分型：

Capsl-loxp-F: 5’-GGCAGGTAAGATGGTGTC-3’；

Capsl-loxp-R: 5’-TCTGTTTGTGGATCAATGTG-3’。

鉴定结果参照图2所示。图2可知，纯合子条件敲除小鼠（Pdgfb-iCreER;Capsl^{loxp /loxp}）扩增出240bp的PCR产物，而野生型小鼠扩增出206bp的PCR产物，杂合子小鼠（Pdgfb-iCreER；Capsl^loxp/+小鼠）扩增出240bp和206bp的两种PCR产物。

用如下通用Pdgfb-Cre引物对Pdgfb-iCreER进行基因分型：

Pdgfb-Cre-F: 5’-GCCGCCGGGATCACTCTCG-3’；

Pdgfb-Cre-R: 5’-CCAGCCGCCGTCGCAACTC-3’。

结果显示，Pdgfb-iCreER阳性的小鼠扩增出350bp的条带，证明本发明提供的小鼠模型构建方法构建获得了具有Pdgfb-iCreER; Capsl^loxp/loxp基因型的小鼠。

实验例2

本实验例对实施例1构建的视网膜血管发育缺陷小鼠模型进行表型鉴定。

（1）Capsl基因敲除小鼠视网膜血管发育缺陷鉴定。

收取同窝野生型和实施例1 Capsl基因敲除小鼠的出生后第五天（P5）的眼睛，剥取视网膜做视网膜铺片。利用血管特异性抗体Isolectin-B4（Life technologies,15120630）对血管进行染色，观察视网膜浅层血管的水平生长情况。P0-P7天，原发性血管从视神经盘长出沿着神经纤维层（NFL）生长，形成浅层血管；从P7天开始，神经节细胞层的浅丛(GCL)垂直萌发，形成外丛的深丛(OPL) (P12天)，然后形成中间丛（INL）(P12-15)。

生长情况参照图4中a-b所示，由图4可知，小鼠出生后第5天（P5），与野生型小鼠相比，Capsl基因敲除小鼠视网膜血管发育异常：浅层血管分支减少，血管密度降低，血管发育滞缓，顶端细胞数量减少，丝状伪足密度降低，血管分支、血管密度、血管发育、顶端细胞数量及丝状伪足统计图参照图4中的d图所示。图中：Ctrl-野生型小鼠，Capsl ^iECKO/iECKO -Capsl基因敲除小鼠。

收取同窝野生型和实施例1 Capsl基因敲除小鼠的出生后第9天（P9）的眼睛做冰冻切片，Isolectin-B4对血管进行染色，观察深层血管发育情况。由图4中的c图可知，小鼠的出生后第9天（P9），野生型小鼠视网膜血管从视神经结垂直发育至OPL和IPL，而Capsl基因敲除小鼠视网膜血管发育至OPL。与野生型小鼠相比，Capsl基因敲除小鼠视网膜血管向深层发育滞缓。

视网膜是一种高代谢组织，耗氧量高，在眼睛发育过程中形成复杂的血管提供氧气和营养物质。视网膜的发育发生在发育晚期，早期视网膜发育对氧和营养的需求依赖于脉络膜血管和玻璃体血管。玻璃体血管的发育在小鼠出生后第三天（P3）达到最大，随着视网膜血管的成熟，玻璃体血管开始逐渐完全退化。

收取同窝野生型和实施例1 Capsl基因敲除小鼠的出生后第10天（P10）的眼睛，剥取玻璃体血管染色铺片。利用DAPI（细胞核抗体，Cell Signaling Technology，4083S）观察玻璃体血管的退化情况。

实验结果参照图5所示，由图5可以看出：与野生型小鼠相比，Capsl基因敲除小鼠视网膜血管发育滞缓；并导致了玻璃体血管退化延迟。

（2）Capsl基因敲除小鼠视网膜血管内皮细胞增殖减少。

野生型和Capsl基因敲除小鼠在收取视网膜前3个小时，腹腔注射EDU 200μg/只，使用Click-iT EDU Alexa Fluor-647染色试剂盒（Beyotime，C1088）对EDU阳性标记进行染色和检测。野生型和实施例1视网膜血管发育缺陷小鼠模型的EDU染色结果参照图6所示，由图6可知：与野生型小鼠相比，实施例1Capsl基因敲除小鼠视网膜血管内皮细胞的增殖明显减少。

综上实验结果，通过Cre-Loxp条件敲除技术，我们首次构建了在血管内皮细胞中特异性敲除Capsl基因的小鼠模型，在基因水平探索视网膜血管发育缺陷疾病的发病机制。该模型小鼠出现家族性渗出性视网膜病变(familial exudative vitreoretinopathy,FEVR)的病症：小鼠视网膜血管发育缺陷。

本发明构建的小鼠模型表面：血管内皮细胞中特异性敲除Capsl基因的小鼠可以作为家族性渗出性视网膜病变的动物模型，用于FEVR的早期分子筛查，机制研究和靶向治疗药物的筛选中。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省人民医院

<120> 一种视网膜血管疾病模型的构建方法及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 622

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggctgtgt gcttacttat tgtccacagt gaaggaagtg ggtgtctttg taacttgata 60

aattgcaaat ataccaggaa taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatgcacaat 120

tgggatagtc aaaaatgcca aattctggga aggttgagac tggaccctgg aggggagtga 180

acagaaagct gtaagtttcc ttttgtcaac tgcccagcca gaggtaggca gtagggtgta 240

aactccatta acatgctgtg gattctccca ccagatggca gggacagcgc gccatgaccg 300

ggagatggca atccaatcca agaaaaagct ctccacagct actaatccta ttgaaagact 360

tcggttgcag tgcctggcca gaggttctgc aggcatcaaa ggacttggca ggtaagatgg 420

tgtcttgtta tttatttcta ttgcaataac aaaacatgac caaggcaact tatgcaagaa 480

aacatttagt ttgggactca tggttcataa cttcgtatag catacattat acgaagttat 540

tagaggctta gagtcaatga tcaccatggc aaggaacatg gcagcaggca agcaggcatg 600

gcactcgggt agtagctgag aa 622

Claims (10)

1.一种视网膜血管疾病动物模型的构建方法，其特征在于，视网膜血管疾病为家族性渗出性玻璃体视网膜病变，构建方法包括如下步骤：通过基因工程技术使得Capsl基因在目标动物的血管内皮细胞中不表达或表达受到抑制；

所述构建方法包括通过基因工程技术使得Capsl基因的第2外显子序列在目标动物的血管内皮细胞中不表达或表达受到抑制。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因工程技术为基因编辑技术、基因敲除技术和RNA干扰技术中的任意一种技术或多种技术的组合。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述基因敲除技术为Cre-loxp基因敲除技术。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、ZFN技术和TALEN技术中的至少一种。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括利用DNA同源重组技术和CRISPR/Cas9技术使Capsl基因的第2外显子序列在目标动物的血管内皮细胞中不表达或表达受到抑制，获得Capsl基因敲除的首建动物，将Capsl基因敲除的首建动物与另一个Capsl基因敲除的首建动物交配获得Capsl基因条件性敲除的纯合子动物。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述Capsl基因敲除的首建动物通过如下方法获得：将针对Capsl基因的第2外显子序列的gRNA、Donor同源模板与Cas9 mRNA混合，注射至目标动物的受精卵中，经发育成熟后，获得所述Capsl基因敲除的首建动物；

所述Donor同源模板带有两个loxp序列；

所述Donor同源模板在Capsl基因第二外显子区两端有两个loxp序列，所述Donor同源模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括将Capsl基因条件性敲除的纯合子动物与转基因动物交配，得到血管内皮细胞条件性敲除Capsl基因动物；

将Capsl基因条件性敲除的纯合子动物与转基因动物交配得到的血管内皮细胞条件性敲除Capsl基因动物再次与转基因动物交配；

所述转基因动物为转Pdgfb-iCreER基因动物或转Cdh5基因动物。

8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述目标动物为非人哺乳动物；

所述非人哺乳动物选自小鼠、大鼠、马、猪、猴、狗和猿中的任意一种。

9.由权利要求1-8任一项所述的构建方法得到的视网膜血管疾病动物模型在视网膜血管疾病研究中的应用，所述研究是以非疾病的诊断或治疗为目的。

10.如权利要求1-8任一项所述的构建方法得到的视网膜血管疾病动物模型在早期分子筛查家族性渗出性玻璃体视网膜病变药物或筛选靶向治疗家族性渗出性玻璃体视网膜病变药物中的应用。

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