CN117535353A - 一种糖尿病视网膜病变模型的建立方法及应用 - Google Patents
一种糖尿病视网膜病变模型的建立方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117535353A CN117535353A CN202311314820.3A CN202311314820A CN117535353A CN 117535353 A CN117535353 A CN 117535353A CN 202311314820 A CN202311314820 A CN 202311314820A CN 117535353 A CN117535353 A CN 117535353A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- angptl3
- diabetic retinopathy
- mice
- gene
- model
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 101150112653 Angptl3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 7
- 101100001705 Mus musculus Angptl3 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 6
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 6
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 6
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 4
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 claims description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 102100025668 Angiopoietin-related protein 3 Human genes 0.000 abstract description 46
- 101710085848 Angiopoietin-related protein 3 Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000035699 permeability Effects 0.000 abstract description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000004232 retinal microvasculature Effects 0.000 abstract description 2
- 101000693085 Homo sapiens Angiopoietin-related protein 3 Chemical group 0.000 description 39
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical group O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 24
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 18
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 3
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 244000144992 flock Species 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000007410 oral glucose tolerance test Methods 0.000 description 2
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 230000002137 anti-vascular effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000011697 diabetes animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013118 diabetic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(3-oxido-6-oxoxanthen-9-yl)benzoate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=O)C=C2OC2=CC([O-])=CC=C21 NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000030172 endocrine system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000012014 optical coherence tomography Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000649 photocoagulation Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种糖尿病视网膜病变模型的建立方法及应用。本发明公开的糖尿病视网膜病变模型的建立方法，包括如下步骤：通过缺失修饰使得细胞基因组中的Angptl3基因不表达，且目标动物为小鼠。本发明采用了敲除或阻断血管生成素样蛋白3，达到减少视网膜微血管通透性的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种糖尿病视网膜病变模型的建立方法及应用。
背景技术
糖尿病(DM)是我国常见的内分泌疾病，其患病率随着人口增长、老龄化、经济发展及生活习惯的改变，呈逐年上升趋势，预计到2030年全球范围内DM患病总人数达到3.66亿，而中国将成为DM患者最多的国家。DM所致的组织病理病变可累及多个靶器官并引起多种并发症，其中糖尿病视网膜病变(DR)是DM最常见的并发症之一，也是工作年龄人群的首要致盲疾病。在我国，75％的DM患者在确诊后的15-20年内会出现DR，对患者的视力造成严重影响。因此，深入探索DR临床早期诊治方法，显得尤为重要。诊断方面，目前的筛查方式包括眼底照相、光学相干断层扫描、荧光素眼底血管造影等。
目前，针对糖尿病视网膜病变的治疗手段非常有限，除了控制血糖、血压等危险因素，以及使用抗血管内皮细胞生长因子或光凝治疗晚期糖尿病视网膜病变，而缺乏改善早期血管通透性的方法。
发明内容
本发明至少一个方面和优点将在下面的描述中部分地被阐述，或者可以从描述中显而易见，或者可以通过实践本公开的主题来获取。
根据本发明的第一个方面，一种糖尿病视网膜病变模型的建立方法，包括如下步骤：
通过缺失修饰使得细胞基因组中的Angptl3基因不表达，且所述细胞基因组来源于小鼠。
根据本发明的一个实施例，通过基因工程使的Angptl3第1-7外显子不表达或者表达受到抑制。
根据本发明的一个实施例，所述基因工程为基因编辑技术、基因敲除技术和RNA干扰技术中的任意一种技术或多种技术的组合。
根据本发明的一个实施例，所述建立方法为通过CRISPR技术使Angptl3基因的第1外显子到第7外显子序列在小鼠模型中不表达或表达受到抑制，获得Angptl3基因被敲除的小鼠。
根据本发明的一个实施例，Angptl3基因被敲除的小鼠获取方法包括：
选取gRNA靶点体外转录成RNA，与CAS蛋白一起注射到小鼠受精卵中，得到发生基因突变的小鼠。
根据本发明的一个实施例，所述CAS蛋白为spCas91.1蛋白。
根据本发明的一个实施例，所述的Angptl3基因为Angptl3-201。
根据本发明的一个实施例，CRISPR敲除时，目标靶向序列如SEQ ID No:1所示；
SEQ ID No:1ATTTCCACTGGGCAAAAGAGG。
根据本发明的第二个方面，使用糖尿病视网膜病变模型的建立方法得到的动物模型在研究糖尿病视网膜病变模型中的应用。
本发明提出了一种能改善微血管通透性的方法，提出阻断血管生成素样蛋白3可以改善视网膜微血管通透性，为糖尿病视网膜病变的研究提供依据。
附图说明
图1为正常组、STZ组、ANGPTL3-/-组和ANGPTL3-/-+STZ组小鼠血清中ANGPTL3的含量检测结果图；
图2为ANGPTL3-/-组小鼠的基因型鉴定结果图；
图3为正常组、STZ组、ANGPTL3-/-组和ANGPTL3-/-+STZ组小鼠的体重检测结果图；
图4为正常组、STZ组、ANGPTL3-/-组和ANGPTL3-/-+STZ组小鼠的OGTT检测结果图；
图5为正常组小鼠的FFA检测荧光渗漏结果图；
图6为STZ组小鼠的FFA检测荧光渗漏结果图；
图7为ANGPTL3-/-组小鼠的FFA检测荧光渗漏结果图；
图8为ANGPTL3-/-+STZ组小鼠的FFA检测荧光渗漏结果图；
图9为正常组小鼠的PAS染色检测结果图；
图10为STZ组小鼠的PAS染色检测结果图；
图11为ANGPTL3-/-组小鼠的PAS染色检测结果图；
图12为ANGPTL3-/-+STZ组小鼠的PAS染色检测结果图；
图13为正常组、STZ组、ANGPTL3-/-组和ANGPTL3-/-+STZ组小鼠的PAS染色内皮细胞数量统计结果图；
图14为正常组、STZ组、ANGPTL3-/-组和ANGPTL3-/-+STZ组小鼠的PAS染色周细胞数量统计结果图；
图15为正常组、STZ组、ANGPTL3-/-组和ANGPTL3-/-+STZ组小鼠的PAS染色外周细胞数量统计结果图；
图16为正常组、STZ组、ANGPTL3-/-组和ANGPTL3-/-+STZ组小鼠的PAS染色无功能血管数量统计结果图；
图17为正常组小鼠的视网膜内皮细胞连接蛋白透射电镜检测结果图；
图18为STZ组小鼠的视网膜内皮细胞连接蛋白透射电镜检测结果图；
图19为ANGPTL3-/-组小鼠的视网膜内皮细胞连接蛋白透射电镜检测结果图；
图20为ANGPTL3-/-+STZ组小鼠的视网膜内皮细胞连接蛋白透射电镜检测结果图；
图21为M-KO-G7-N1的PCR样品琼脂糖凝胶电泳结果图；
图22为M-KO-G7-N3的PCR样品琼脂糖凝胶电泳结果图；
图23为M-KO-G7-N1-9#的测序峰图。
具体实施方式
现在将参照若干示例性实施例来论述本公开的内容。应当理解，论述了这些实施例仅是为了使得本领域普通技术人员能够更好地理解且因此实现本公开的内容，而不是暗示对本公开的范围的任何限制。
如本文中所使用的，术语“包括”及其变体要被解读为意味着“包括但不限于”的开放式术语。术语“基于”要被解读为“至少部分地基于”。术语“一个实施例”和“一种实施例”要被解读为“至少一个实施例”。术语“另一个实施例”要被解读为“至少一个其他实施例”。术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“竖直”、“水平”、“横向”、“纵向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本申请及其实施例，并非用于限定所指示的装置、元件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本申请中的具体含义。此外，术语“安装”、“设置”、“设有”、“连接”、“相连”应做广义理解。例如，可以是固定连接，可拆卸连接，或整体式构造；可以是机械连接，或电连接；可以是直接相连，或者是通过中间媒介间接相连，又或者是两个装置、元件或组成部分之间内部的连通。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。此外，术语“第一”、“第二”等主要是用于区分不同的装置、元件或组成部分(具体的种类和构造可能相同也可能不同)，并非用于表明或暗示所指示装置、元件或组成部分的相对重要性和数量。除非另有说明，“多个”的含义为两个或两个以上。
根据本发明的一个实施例，糖尿病视网膜病变模型的建立方法，包括如下步骤：
通过缺失修饰使得细胞基因组中的Angptl3基因不表达，且目标动物为小鼠。
根据本发明的一个实施例，糖尿病视网膜病变模型的建立方法获取的动物模型，在研究糖尿病视网膜病变模型中的应用。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，其应当被理解为是对本发明的解释而不是限定。
本申请拟解决早期糖尿病视网膜病变中微血管通透性增加的问题，通过研究发现血管生成素样蛋白3与糖尿病视网膜病变的严重程度相关，并且阻断血管生成素样蛋白3可以改善视网膜微血管通透性，同时修复细胞连接。
ANGPTL3与糖尿病视网膜病变的发生密切相关，可能是糖尿病视网膜病变患者潜在的生物标记物，研究发现ANGPTL3在糖尿病视网膜病变患者中的血清中的含量异常升高，同时在动物模型上发现ANGPTL3敲除后，动物的微血管渗漏明显改善。因此，本发明公开了ANGPTL3阻断在糖尿病视网膜病变中的应用。
在本发明的一个实施例内，所选取小鼠的注射情况如下：
(1)测序结果分析
使用如下引物进行PCR并且琼脂糖凝胶电泳检测敲除情况
①M-KO-G7-N1的PCR样品琼脂糖凝胶电泳结果如图21所示，其中1-11为PCR样品跑胶检测结果；M:BM2000 Marker；NC:阴性对照，如图中红色箭头所示，PCR样品条带大小约为350bp，该条带为片段删除后扩增的条带。
②M-KO-G7-N3的PCR样品琼脂糖凝胶电泳结果如图22所示，其中1-22为PCR样品跑胶检测结果；M:BM2000 Marker；NC:阴性对照，如图中红色箭头所示，PCR样品条带大小约为350bp，该条带为片段删除后扩增的条带。
(2)测序结果及分析
①M-KO-G7-N1-9#的测序峰如图23所示，通过峰形分析，可以将突变型的DNA序列(红色箭头所指峰形)分析出来。结果为TATAGAATTGATT前的缺失9790bp，发生片段敲除。
②测序结果序列比对如下
(3)结论
综合上述分析，得到Angptl3基因敲除F0代阳性小鼠如下
| 项目编号 | 基因型(阳性鼠) |
| M-KO-G7-N1 | 9♀，11♀ |
| M-KO-G7-N3 | 6♂，15♀ |
在本发明的一个实施例内，本发明进行了造模，具体过程如下：
成功培育ANGPTL3-/-小鼠后，剪取鼠尾进行基因型鉴定，以C57BL/6J小鼠为对照，将动物随机分入正常组(Control)、链脲佐菌素组(streptozotocin,STZ)，将ANGPTL3-/-随机分入ANGPTL3-/-组和ANGPTL3-/-+STZ组，以Elisa检测方法检测各组小鼠血浆中ANGPLT3的水平，如图1所示，与C57BL/6J小鼠组相比，ANGPTL3-/-组和ANGPTL3-/-+STZ组的血浆中ANGPTL3的水平降低，差异有统计学意义。如图2所示，琼脂糖凝胶电泳结果表明ANGPTL3基因成功被敲除，综上分析ANGPTL3-/-已成功培育。
随后，通过连续5次腹腔注射1％STZ(以pH 4.5的柠檬酸钠缓冲液溶解)80mg/kg剂量，复制糖尿病小鼠模型，随机血糖＞16.7mmol/L纳入实验组，对照组注射空白柠檬酸缓冲液，并进行口服葡萄糖耐量试验，结果如图3和图4所示，腹腔注射STZ后，与对照组相比，STZ组小鼠的体重降低，空腹血糖升高，注射葡萄糖后，高峰延迟，曲线下面积升高，差异有统计学意义，表明糖尿病模型造模成功，可用于后续试验。
实施例1CRISPR技术制备Angptl3基因移码突变小鼠，实现Angptl3基因敲除
①根据Angptl3的基因组序列结构，设计CRISPR靶点：
选取Angptl3-201进行设计，Exon1-7为编码蛋白的转录产物的全部外显子，删除这Exon1-7后，翻译该蛋白的mRNA将不会被转录出来，该基因被完全敲除，决定在Exon1-7的两边设计靶点，实现Exon1-7敲除。
本发明涉及的Angptl3基因组序列基因型检测引物请参见后文序列表Angptl3基因组序列SEQ ID No:2到SEQ ID No:3；
其中，SEQ ID No:2AGTGCCTATTAGACAGCAAGAAAG；
SEQ ID No:3CTGTGAAGGGTGTCGTTTCTC；
本发明涉及的Angptl3基因组序列请参见后文序列表Angptl3基因组序列SEQ IDNo:4；
本发明涉及的外显子Exon请参见后续序列表SEQ ID No:5到SEQ ID No:11。
②基因敲除小鼠的建立和品系交配：过spCas91.1/gRNA体外酶切检测上述靶点的剪切DNA活性。选取活性高的gRNA靶点体外转录成RNA，与spCas91.1蛋白一起显微注射到小鼠受精卵中，得到发生基因突变的首建鼠(founder)。对小鼠进行基因型鉴定，获得发生期望突变的首建鼠。通过基因组DNA，CRISPR靶点位置附近进行测序，确定首建鼠带有突变，并且发生片段删除。
③建立稳定遗传的Angptl3敲除小鼠品系
将带有突变的首建鼠(founder)与野生型小鼠交配，得到片段删除的杂合子小鼠(+/-)F1代，并进行DNA测序，确认目标基因发生了片段删除从而目标蛋白被失活，实现基因敲除。
实施例2敲除血管生成素样蛋白3可改善糖尿病视网膜微血管渗漏
通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)复制糖尿病动物模型，正常饮食饮水的条件下喂养24周，监测动物的体重情况，糖耐量试验表明与正常对照组相比，STZ的血糖显著升高，高峰延迟，敲除ANGPTL3后，血糖有所降低，表明糖尿病小鼠模型建立成功。通过腹腔注射荧光素钠观察小鼠视网膜的渗漏情况，结果表明与正常对照组相比，STZ造模24周后，小鼠视网膜渗漏严重，敲除ANGPTL3后，渗漏情况恢复明显，结果如图5-8。
实施例3阻断血管生成素样蛋白3改善血管内皮细胞通透性
将小鼠眼球经4％多聚甲醛固定后，分离出视网膜后，用PBS缓冲液清洗，将清洗后的视网膜分别用胶原酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化，至消化液浑浊、视网膜更加透明、表面绒絮物质变少，用宽头吸管将视网膜转移至盛有PBS的玻璃平皿中，换成玻璃吸管轻轻的吹打，即重复吸进-吐出的动作，定向对准视网膜上绒絮物质较多的部位，去除非血管组织，直至PBS中没有崩解的神经组织碎片，视网膜呈现出完全透明的血管网的状态。用宽头吸管将血管网转移到载玻片上，室温自然干燥后进行PAS染色，即将视网膜血管铺片蒸馏水浸洗5分钟，1％高碘酸氧化5分钟，蒸馏水换洗3次，每次5分钟；Schiff试剂室温染色15分钟；亚硫酸冲洗液换洗3次，每次2分钟，流水冲洗10分钟，蒸馏水浸洗5分钟；Mayer苏木素复染2分钟，流水冲15分钟；逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察拍照，拍照结果如图9-12，Image J分析定量。结果表明，与对照组相比，STZ组小鼠的内皮细胞数量、周细胞数、外周细胞数以及无细胞血管数升高，差异有统计学意义，ANGPLT3敲除组小鼠的外周细胞数、无细胞血管数降低，差异有统计学意义，结果如图13-16.
实施例4阻断血管生成素样蛋白3可修复细胞连接蛋白
将小鼠眼球经电镜组织固定液固定后，分离出视网膜后，观察小鼠视网膜的紧密连接蛋白情况。结果表明，与对照组相比，STZ组的紧密连接蛋白破损，细胞间通道被打开，ANGPTL3敲除后，紧密连接蛋白修复，通道闭合，结果如图17-20所示。
本发明采用了敲除或阻断血管生成素样蛋白3，达到减少视网膜微血管通透性的效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (9)
1.一种糖尿病视网膜病变模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
通过缺失修饰使得细胞基因组中的Angptl3基因不表达，且所述细胞基因组来源于小鼠。
2.如权利要求1所述的糖尿病视网膜病变模型的建立方法，其特征在于，通过基因工程使的Angptl3第1-7外显子不表达或者表达受到抑制。
3.如权利要求2所述的糖尿病视网膜病变模型的建立方法，其特征在于，所述基因工程为基因编辑技术、基因敲除技术和RNA干扰技术中的任意一种技术或多种技术的组合。
4.如权利要求3所述的糖尿病视网膜病变模型的建立方法，其特征在于，所述建立方法为通过CRISPR技术使Angptl3基因的第1外显子到第7外显子序列在小鼠模型中不表达或表达受到抑制，获得Angptl3基因被敲除的小鼠。
5.如权利要求4所述的糖尿病视网膜病变模型的建立方法，其特征在于，Angptl3基因被敲除的小鼠获取方法包括：
选取gRNA靶点体外转录成RNA，与CAS蛋白一起注射到小鼠受精卵中，得到发生基因突变的小鼠。
6.如权利要求5所述的糖尿病视网膜病变模型的建立方法，其特征在于，所述CAS蛋白为spCas91.1蛋白。
7.如权利要求4所述的糖尿病视网膜病变模型的建立方法，其特征在于，所述的Angptl3基因为Angptl3-201。
8.如权利要求4所述的糖尿病视网膜病变模型的建立方法，其特征在于，CRISPR敲除时，目标靶向序列如SEQ ID No:1所示；
SEQ ID No:1ATTTCCACTGGGCAAAAGAGG。
9.使用权利要求1-8任一所述的糖尿病视网膜病变模型的建立方法得到的动物模型在研究糖尿病视网膜病变模型中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311314820.3A CN117535353A (zh) | 2023-10-11 | 2023-10-11 | 一种糖尿病视网膜病变模型的建立方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311314820.3A CN117535353A (zh) | 2023-10-11 | 2023-10-11 | 一种糖尿病视网膜病变模型的建立方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117535353A true CN117535353A (zh) | 2024-02-09 |
Family
ID=89784961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311314820.3A Pending CN117535353A (zh) | 2023-10-11 | 2023-10-11 | 一种糖尿病视网膜病变模型的建立方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117535353A (zh) |
-
2023
- 2023-10-11 CN CN202311314820.3A patent/CN117535353A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kleinberger et al. | Mechanisms of granulin deficiency: lessons from cellular and animal models | |
| US20200375157A1 (en) | Construction method for animal model for retinitis pigmentosa diseases and application | |
| CN110100788B (zh) | 基于基因操作策略构建疾病模型的方法和应用 | |
| CN113621649B (zh) | 一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用 | |
| CN105056208B (zh) | Creg蛋白用于预防或治疗心肌梗死的医药用途 | |
| CN107287243A (zh) | 一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型及其构建方法 | |
| CN104335970B (zh) | 一种构建人银屑病小鼠模型的方法及其应用 | |
| CN110178792A (zh) | 一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法 | |
| CN113957074B (zh) | 一种小脑共济失调疾病模型的构建方法及应用 | |
| CN114916502A (zh) | 一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法和应用 | |
| CN111484981A (zh) | 一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法和应用 | |
| CN105031619B (zh) | 分泌因子grem2在制备2型糖尿病治疗药物中的应用 | |
| Parry | Elimination of natural scrapie in sheep by sire genotype selection | |
| CN105238793A (zh) | 引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因及其应用 | |
| CN117535353A (zh) | 一种糖尿病视网膜病变模型的建立方法及应用 | |
| CN107447005A (zh) | p53基因突变与端粒功能异常的用途 | |
| CN114934113B (zh) | Alpk1基因在白内障诊断治疗及构建动物模型中的应用 | |
| KR102177174B1 (ko) | Pde6b 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법 | |
| KR102634464B1 (ko) | 망막변성증 동물 모델의 제조 방법 | |
| CN110755427A (zh) | 一种治疗视网膜退行性疾病的药物 | |
| CN107974464A (zh) | Slc6a12基因及其蛋白的用途 | |
| CN111621500B (zh) | 一种基于myl4基因编辑的心房颤动/心房心肌病大鼠模型及其构建方法 | |
| CN115029346B (zh) | 用于靶向敲降Htra2转录本的sgRNA、CRISPR/CasRx系统及应用 | |
| JP7372713B2 (ja) | ヤツメウナギｌｉｐタンパク質の肥満治療及び耐寒性向上のための食品及び薬品の製造における使用 | |
| CN114146180B (zh) | 抑制chchd2活性的物质在制备治疗nash和肝损伤所致肝纤维化的产品中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |