CN107447005A

CN107447005A - p53基因突变与端粒功能异常的用途

Info

Publication number: CN107447005A
Application number: CN201710696782.0A
Authority: CN
Inventors: 李海丽; 罗瑛; 吴晓明; 邵驰浩; 徐莉萍; 李翠; 张永进; 杨举伦
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2017-08-15
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2017-12-08

Abstract

本发明公开了一种p53基因突变和端粒功能异常的新用途，即检测抑癌基因p53突变和端粒功能异常的试剂在制备多囊肾病临床诊断试剂中的应用；或者p53基因突变和端粒功能异常在筛选多囊肾病治疗药物中的应用，实验结果显示：将携带p53N236S突变的小鼠与早老综合症（Werner Syndrome,WS）的小鼠进行杂交，其后代发生了多囊肾病，从而获得一种新型的PKD疾病模型；本发明首次揭示了多囊肾病的发生可能是由于突变p53与衰老信号共同作用引起肾脏细胞异常增殖的一种新现象，这一发现丰富多囊肾病的发病机理，为多囊肾病的临床诊断提供新的生物标志物。

Description

p53基因突变与端粒功能异常的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测p53基因突变与端粒功能异常的试剂在制备多囊肾病诊断试剂中的应用，以及在作为多囊肾病治疗药物筛选靶点中的应用。

背景技术

多囊肾病（polycystic kidney disease，PKD）是一种常见的人类遗传病，常分类为常染色体显性遗传病和隐性遗传病。多发病群体于成年之后，表现为肾脏大小不一、呈现囊肿、充满积液。囊肿会进行性增大，增大囊肿压迫肾实质并引起一系列的症状，肾脏的结构及功能也逐渐被破坏，最终导致肾衰竭。目前研究表明，PKD的发病机制是由PKD基因突变引起，属于单基因病中的遗传病，除肾脏以外，还可累及多个系统。迄今为止，在PKD的发病原因研究中，大多都是关于延缓及逆转PKD的病理进程，尚无十分有效的方法阻止囊肿的形成及肾脏功能的衰退，60%的患者都会不可逆转地发生肾衰竭，导致患者死亡。

目前，对PKD的诊断主要依据双肾的超声、CT等影像学检测手段。多囊是本病的特异性征象，超声检测可以精确的了解肾脏囊腔形态。计算机断层扫描（CT）及核磁共振(MRI)也均有特征性表现，CT可以提供肾脏结构及功能信息，但需要使用造影剂，这对于肾功能损伤的患者则会加快肾功能进展，并且病人也暴露于射线下。MRI诊断不仅可以让医生准确、直观，从三维图像分析，范围定位明确分析病情，也可以让患者避免放射线及造影剂的损伤。由于该病的迟发性特点以及目前的诊断方式的局限性，使得很多患者是确诊时已经病程严重，这给患者的家庭带来了极大的精神压力和经济负担。遗传诊断的方法被证实为更利于无症状、有或无家族史患者的症状前诊断。从基因层面确诊PKD，更利于明确PKD的类型、预后及对预防该疾病的发生起着更为关键的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种p53基因突变和端粒功能异常的新用途，即检测p53基因突变和端粒功能异常的试剂在制备诊断多囊肾病试剂中的应用。

本发明为多囊肾病提供一种新的生物标记物，即突变p53基因与端粒功能异常在多囊肾病临床诊断中的应用，即突变p53与端粒功能异常作为多囊肾病的诊断的指标。

所述p53基因突变是指p53N236S (在人类中是p53N239S，以下简称为p53S)，端粒功能异常是指端粒缩短。

本发明另一目的是将p53基因突变和端粒功能异常应用在筛选多囊肾病治疗药物中，为多囊肾病治疗以及药物筛选提供了新的靶点。

本发明利用p53S小鼠与WS 小鼠进行杂交获得多囊肾动物模型；人类早老综合症（Werner Syndrome，WS）小鼠模型由Dr. Sandy Chang 在世界上首次成功地建立，该模型双重基因敲除了端粒酶的RNA组分mTerc与Wrn基因（mTR ^-/- Wrn ^-/-）（详见图1，mTR ^-/- Wrn ^-/-基因型鉴定），忠实地再现了人类早老综合症的症状。

早老细胞（早老综合症 G5mTR ^-/- Wrn ^-/-小鼠胚胎培养出的成纤维母细胞）在逃逸衰老，形成永生化细胞克隆时，部分永生化细胞克隆可以在重症免疫缺陷小鼠（SCID mouse）体内形成ALT（alternative lengthening of telomere）肿瘤。这些ALT肿瘤细胞株中出现了同一个p53突变基因p53N236S的高表达。随后，本实验室建立了p53N236S基因敲入小鼠模型（详见图1，p53N236S基因型鉴定）。

进一步，我们通过小鼠杂交的策略，将携带抑癌基因p53N236S突变（p53 ^S/S）的小鼠与WS小鼠进行杂交，从而将p53S突变引入WS 小鼠中，探索具有致癌潜质的突变p53N236S对早老综合征小鼠个体衰老表型及肿瘤发生的调控作用，以研究衰老与肿瘤发生之间的内在联系。

实验结果表明，前期代数（G1/G2）mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S小鼠的肿瘤发病率明显低于p53 ^S/S小鼠，但是随着小鼠端粒的不断缩短，在后期代数（G3）mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S小鼠的肿瘤的发病率明显上升（图2，mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S小鼠肿瘤发病统计）。令我们惊奇的是，在mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S背景下的小鼠第三代（G3），伴随小鼠肿瘤发生率的增加，我们发现了患有PKD的小鼠。这提示我们，在mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S小鼠不断衰老的背景下，伴随着致癌因素的不断活化，使得DNA损伤程度达到高负荷累积，进而伴随了PKD的产生。

目前为止，PKD的病理研究中，还没有出现由于p53的突变或p53相关原因引起的多囊肾的现象。这就提示了我们，多囊肾的产生可能跟端粒功能的紊乱及突变p53N236S导致的DNA损伤累积和DNA损伤应激通路失调有关，即在端粒功能紊乱及p53突变的背景下，多囊肾的发生可能是由于衰老或者是突变p53N236S引起恶性增殖的一种现象；这种恶性增殖伴随出现肿瘤的概率比较高，多囊肾的发生也属于其中一种。本发明揭示了突变p53癌基因特性的一个新的病理生理研究方向，可能为PKD的临床诊断、提供新的生物标志物和治疗靶点。

同时，本发明提供了一种p53突变（p53N236S）与端粒功能异常导致多囊肾病的小鼠动物模型，此小鼠模型的基因型为端粒酶基因、Wrn基因双敲除，并带有p53S基因突变（G3mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S），发病时间多为约4月龄的成年小鼠。发病小鼠表现为腹部明显异常、肿大。解剖发现肾脏异常，双侧肾脏外观大小不一，内部充满积液。随着年龄的增大，肾脏囊肿的程度逐渐加重，肾功能逐渐下降，最终小鼠死于肾衰竭（见图3，PKD小鼠肾脏表型）。对收集的肾脏样本进行HE染色和病理分析，可以发现小鼠左侧肾脏出现肾小球发育不良，右侧肾脏内部充满积液，体积庞大，是正常肾脏体积的2-3倍，肾脏外观几乎没有原有结构，内部病理切片显示出多个大小不等，形状不规则的囊肿，囊肿被覆扁平或立方上皮，囊壁之间可见受压萎缩的肾小球(见图3，小鼠肾脏HE染色结果)。病理分析结果表明，此基因型背景的小鼠肾脏的异常表型明显。即使在尚未发生PKD症状的肾脏，也观察到了肾小球发育不良，说明此基因型背景下的小鼠伴随肾脏异常发育的现象。这些数据表明，本发明为PKD提供了一种新型的小鼠模型。可用于分子、细胞、个体水平上对多囊肾病的基础生物学研究，以期找到和发现影响囊肿形成的分子机理。

本发明为PKD的研究提供创新的理论及合适的动物模型，可以为PKD的临床诊断提供新的生物标志物，有很好的科学意义及临床应用价值。

附图说明

图1是小鼠的基因型鉴定；图中，mTR野生型（mTR ^+/+）扩增条带为210bp，杂合子（mTR ^+/-）扩增出的条带为210bp、180bp，mTR敲除型（mTR ^-/-）扩增条带为180bp；Wrn野生型（Wrn ^+/+）扩增条带为150bp，杂合子（Wrn ^+/-）扩增出的条带为150bp、250bp， Wrn敲除型（Wrn ^-/-）扩增条带为250bp；p53S野生型（p53Swt）的等位基因扩增出的条带为458bp；杂合子（去除Neo后，p53S/+）扩增出的条带为：294bp、458bp、634bp三条；纯合突变型（去除Neo后，p53S/S）等位基因的条带则为：294bp、634bp；

图2是不同代数小鼠的肿瘤发病率结果示意图；

图3是G3mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S小鼠PKD病例结果；其中，A图为小鼠外观腹部肿大；B图解剖后发现左右侧肾脏有明显的大小差异，其右侧肾脏结构已经完全失去结构，外观呈现透明状态，内部充满积液；C图、D图是HE染色结果，显示右侧肾脏已经完全失去结构，伴随有多个形状不规则的囊肿（箭头所示）；E图为囊壁之间可见受压迫的肾小球（箭头所示），放大倍数X10。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。

实施例1：多囊肾动物模型的构建

p53S小鼠与WS （mTR ^-/- Wrn ^-/-）小鼠进行杂交获得多囊肾动物模型；人类早老综合症（Werner Syndrome，WS）是一种常染色体隐性突变遗传病，表现为明显的提早衰老及寿命缩短。对WS病因的研究发现，WS是由于Wrn基因突变引起的。Wrn基因编码的WRN蛋白属于DNA解旋酶RecQ家族，参与DNA复制、重组及DNA损伤修复，因此在维持染色体的稳定性方面起着关键作用。Wrn蛋白功能的缺失本身即可导致端粒DNA复制异常。因此，WS小鼠模型是我们研究端粒功能异常与人类衰老发生及其维持机制的很好模型。为证实端粒功能异常是导致早老综合症的关键，Dr. Sandy Chang 在世界上首次成功地建立了WS的小鼠模型，该模型双重基因敲除了端粒酶的RNA组分mTerc与Wrn基因（mTR ^-/- Wrn ^-/-）（图1，mTR ^-/- Wrn ^-/-基因型鉴定），忠实地再现了人类早老综合症的症状，如端粒快速缩短，毛发变白、脱落，白内障、Ⅱ型糖尿病、骨质疏松，缺血性心脏病，骨肉瘤等等。从早老综合症 G5mTR ^-/- Wrn ^-/-小鼠胚胎培养出的成纤维母细胞也表现出WS病人的成纤维母细胞的特征，体外培养的细胞很快进入衰老。然而，这种衰老细胞易于逃逸衰老，形成永生化细胞克隆，部分永生化细胞克隆可以在重症免疫缺陷小鼠（SCID mouse）体内形成ALT（alternative lengthening of telomere）肿瘤。

为了研究WS细胞从衰老，到逃逸衰老而永生化进程中的分子调控机理，我们比较研究了三株产生ALT肿瘤（ALT tumorigenic）的永生化细胞与四株不产生ALT肿瘤（Non-ALTtumorigenic）的永生化细胞。在实验室前期研究中，我们发现在几株ALT肿瘤细胞株中出现了同一个p53突变基因p53N236S (在人类中是p53 N239S )的高表达。后来本实验室建立了p53 ^N236S基因敲入小鼠模型（图1，p53S基因型鉴定），从而在动物整体水平上，研究 p53S 的功能获得。我们对p53S敲入小鼠的研究发现：p53S 敲入小鼠中 p53S获得了新的癌基因功能，这就提示了p53S可能是一个较为严重有致癌潜能的突变。进一步，我们通过小鼠杂交的策略，将携带抑癌基因p53N236S突变的小鼠与WS小鼠进行杂交，从而将p53S突变引入WS 小鼠中，探索具有致癌潜质的突变p53N236S对早老综合征小鼠个体衰老表型及肿瘤发生的调控作用，以研究衰老与肿瘤发生之间的内在联系。

由于p53 ^S/S基因型的母鼠的受孕概率很低，因此在让小鼠杂交的过程中会尽量排除利用基因型p53 ^S/S的母鼠进行杂交。为了得到mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S小鼠，我们利用p53S小鼠与WS 小鼠进行杂交，即p53 ^S/S小鼠× mTR ^-/- Wrn ^-/-小鼠杂交，后代基因型为mTR ^-/+ Wrn ^+/- p53 ^S ^/+。随后自交mTR ^-/+ Wrn ^+/- p53 ^S/+（♂）×mTR ^-/+ Wrn ^+/- p53 ^S/+（♀）。后代小鼠，通过基因型鉴定（图1），筛选得到mTR ^-/+ Wrn ^-/- p53 ^S/S和mTR ^-/+ Wrn ^-/- p53 ^S/+小鼠。

mTR ^-/+ Wrn ^-/- p53 ^S/S（♂）×mTR ^-/+ Wrn ^-/- p53 ^S/+（♀）杂交的后代具有1/8 的概率得到基因型为mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S小鼠，我们记为G1代；G1mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S（♂）×G1mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S ^/+（♀）杂交的后代具有1/2 的概率得到基因型为mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S小鼠，我们记为G2代；G2mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S（♂）×G2mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/+（♀）杂交的后代具有1/2 的概率得到基因型为mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S小鼠，我们记为G3代，以此类推进行杂交，利用此方法就会得到大量基因型为G3mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S的目的基因小鼠。

实施例2：mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S小鼠基因型鉴定

后代出生后21天，按照小鼠的性别进行分笼。同时，对小鼠进行编号，剪小鼠尾巴约1cm，提取小鼠DNA，DNA提取过程如下：

1）在含有小鼠尾巴的 Doff 管中加入 500μL Tail-lysis buffer，并加入 10μL 蛋白酶K，混匀后放到 55℃恒温箱反应过夜；

2）Doff 管中加入 500μL Tris-饱和酚用以抽提蛋白；

3）13000rpm，4℃离心 10min；

4）取上清液约400μL到另一干净的Doff管中，并加等体积的异丙醇；

5）13000rpm， 4℃离心 10分钟，弃上清；

6）在 Doff 管中加入 1mL 预冷的 70%的酒精；

7）13000rpm ，4℃离心 10分钟，弃上清；

8）晾干 Doff 管，加 100μL 灭菌的超纯水溶解 DNA；

9）待 DNA 完全溶解，4℃保存。

PCR过程如下：

1）PCR 引物序列如下：

p53S引物序列：

Neo-F 5’ -CTG CAC CCT ACG AGA ACTGAC TT-3’

Neo-R 5’ -GGG ATG AAG TGA TGG GAGCTA G-3’

F3 5’ -GCA TAA GCT TGG ATC CGT TCTTCG GAC-3’

mTR 引物序列：

common primer :5’ -TTC TGA CCA CCA CCA ACT TCA AT-3’

wild type primer :5’ -CTA AGC CGG CAC TCC TTA CAA G-3’

KO-primer:5’ -GGG GCT GCT AAA GCG CAT -3’

Wrn 引物序列：

pSL3093-wrn：5’-GCC TGC AGC TGG CGC CAT C-3’

common-wrn： 5’-CAA TAA CCA ATG GAA TTC TAA GC-3’

WT1-wrn：5’-TAC ATT TGC CAT TTT AAG GTG GC-3’；

2）PCR 反应体系：

p53S 基因型鉴定 PCR 反应体系：

mTR基因型鉴定 PCR 反应体系：

Wrn基因型鉴定 PCR 反应体系：

3）PCR 反应条件：

p53S 基因型鉴定 PCR 反应条件：

mTR基因型鉴定 PCR 反应条件：

Wrn基因型鉴定 PCR 反应条件：

。

4）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

PCR 反应结束之后，使用 2%的琼脂糖凝胶，水平电泳检测 PCR 产物。

电泳的条件：200mA，120V 恒压。

电泳时间：45min。

实施例3：不同代数小鼠肿瘤发病率统计

在小鼠饲育过程中，发现小鼠长瘤便记为一例。在G1mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S的小鼠种群中，共有11只小鼠衰老死亡，其中患肿瘤死亡的小鼠3只； G2mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S的小鼠种群中衰老死亡小鼠8只，其中患肿瘤死亡的小鼠1只； G3mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S的小鼠种群中衰老死亡小鼠29只，其中患肿瘤死亡的小鼠20只，即为不同代数小鼠的肿瘤发病率（图2）。

实施例4： PKD病理检测

在G3mTR ^-/- Wrn ^-/- p53 ^S/S背景下，伴随小鼠肿瘤发生率的增加，我们发现了患有PKD的小鼠。此类小鼠腹部异常肿大。制备小鼠病例组织石蜡切片。其过程：组织取材-固定-流水冲洗-脱水-透明-浸蜡-组织包埋-切片-展片-烘片-脱蜡复水-染色-脱水-透明-封片。

1）组织取材、固定、流水冲洗：

小鼠进行断颈处死后，解剖取出脏器（肾脏等），10%甲醛溶液固定12小时左右。固定后的样本，流水冲洗过夜。样本可在放于70%的乙醇保存，或进行后续实验。

2）脱水：

70% 乙醇， 1h；

80% 乙醇， 1h；

95% 乙醇， 1h；

100% 乙醇， 45h；

100% 乙醇， 0.5h；

3）透明：

二甲苯I， 20min；

二甲苯II， 20min;

二甲苯:石蜡（1:1），5min

4）浸蜡、组织包埋：

石蜡: 1h x 3

石蜡包埋，放置冷台冷却。

5）切片、展片、烘片：

将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，标记样本，一般为3微米厚。切下的薄片往往皱折，可放到40℃的热水中烫平，再贴到载玻片上，放62℃恒温箱中烘干。

6）脱蜡复水：

二甲苯 10min ×2

无水乙醇：3min × 2

95% 乙醇：3min

80% 乙醇， 3min；

70% 乙醇， 3min

7）染色：

脱蜡复水后的片子放置于ddH₂O 中3min，苏木精中染色5min，在自来水下冲洗1min；放入1% 的盐酸乙醇中分化10s；自来水冲洗1min；放入0.2% 氨水中返蓝10s；自来水冲洗1min；复染伊红50s；

8）脱水、透明：

染色后的切片经梯度纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。

9）封片

将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，切片标本镜检。

结果见图3：发病小鼠表现为腹部明显异常、肿大。解剖发现肾脏异常，双侧肾脏外观大小不一，内部充满积液。随着年龄的增大，肾脏囊肿的程度逐渐加重，肾功能逐渐下降，最终小鼠死于肾衰竭（PKD小鼠肾脏表型）。对收集的肾脏样本进行HE染色和病理分析，可以发现小鼠左侧肾脏出现肾小球发育不良，右侧肾脏内部充满积液，体积庞大，是正常肾脏体积的2-3倍，肾脏外观几乎没有原有结构，内部病理切片显示出多个大小不等，形状不规则的囊肿，囊肿被覆扁平或立方上皮，囊壁之间可见受压萎缩的肾小球(小鼠肾脏HE染色结果)。病理分析结果表明，此基因型背景的小鼠肾脏的异常表型明显。即使在尚未发生PKD症状的肾脏，也观察到了肾小球发育不良，说明此基因型背景下的小鼠伴随肾脏异常发育的现象。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> p53基因突变与端粒功能异常的用途

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgcacccta cgagaactga ctt 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggatgaagt gatgggagct ag 22

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcataagctt ggatccgttc ttcggac 27

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttctgaccac caccaacttc aat 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctaagccggc actccttaca ag 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggggctgcta aagcgcat 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcctgcagct ggcgccatc 19

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caataaccaa tggaattcta agc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tacatttgcc attttaaggt ggc 23

Claims

1.检测p53基因突变和端粒功能异常的试剂在制备诊断多囊肾病试剂中的应用。

2.p53基因突变和端粒功能异常在筛选多囊肾病治疗药物中的应用。