CN111484981A

CN111484981A - 一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法和应用

Info

Publication number: CN111484981A
Application number: CN202010337902.XA
Authority: CN
Inventors: 杨正林; 朱献军; 李姝锦; 杨牧
Original assignee: Sichuan Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Sichuan Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2020-04-26
Filing date: 2020-04-26
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2040-04-26
Also published as: CN111484981B

Abstract

本发明公开了一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法和应用，涉及生物技术领域。具体地，该方法通过基因编辑技术对目标动物血管内皮细胞中的Ctnna1基因进行基因敲除，或通过RNAi技术沉默目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的表达，使目标动物表现出典型的视网膜新生血管性疾病的特征，该疾病模型既可作为新生视网膜血管的疾病模型，又为研究视网膜新生血管疾病的发病过程及机制的研究提供了便利，还为该疾病的治疗或预防提供了新的靶标。

Description

一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法和应用。

背景技术

视网膜新生血管(Retinal neovascularization,RNV)相关性眼部疾病是一类以病理性视网膜新生血管为主要特征的疾病，主要包括增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)、早产儿视网膜病变(retinopathy ofprematurity，ROP)和视网膜静脉阻塞(central retinal vein occlusion，RVO)等。该类疾病的发病率高、治疗预后差，故具有较高的致盲率，严重危害人类的视力健康。

目前，临床上针对RNV的治疗，除了疾病早期进行的激光光凝、眼内注射抗血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)药物以外，尚无更加有效的治疗方法。并且，研究表明抗VEGF治疗并非对所有患者均有效，同时抗VEGF治疗存在价格昂贵、需反复注射增加患者感染风险等诸多缺点，导致其临床运用受限。因此，在进行RNV发病机理研究的同时，构建有效的动物模型以寻求新的有效治疗手段或治疗靶点，是亟待解决的医学问题。

目前，尚且缺乏可用于RNV治疗方法研究的动物模型。鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法和应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，实施例提供了一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，其包括：通过基因编辑技术对目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因进行基因敲除，以敲除掉Ctnnal基因的第二个外显子序列，或通过RNAi技术沉默目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的表达。

第二方面，实施例提供了前述实施例提供的用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法得到的视网膜新生血管疾病模型在筛选用于预防或治疗视网膜新生血管相关疾病的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供了一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，通过基因编辑技术敲除目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因，或通过RNAi技术沉默目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的表达，使目标动物表现出典型的视网膜新生血管性疾病的特征，该疾病模型既可作为新生视网膜血管的疾病模型，又为研究视网膜新生血管疾病的发病过程及机制的研究提供了便利，还为该疾病的治疗或预防提供了新的靶标。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中Ctnna1基因敲除型小鼠的构建图；

图2为实施例1中Ctnna1基因敲除型小鼠的繁育路线图；

图3为试验例1中Ctnna1在小鼠血管中的敲除效率研究结果图；

图4为试验例2中Ctnna1基因敲除型小鼠的视网膜铺片的检测结果图；

图5为试验例3中Ctnna1基因敲除型小鼠眼球切片和玻璃体血管免疫组化染色结果；

图6为试验例4中Ctnna1基因敲除型小鼠的血管内皮细胞的增殖实验及其统计结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

具体实施方案

本申请实施例提供了一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，通过基因编辑技术对目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因进行基因敲除，以敲除掉Ctnnal基因的第二个外显子序列，或通过RNAi技术沉默目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的表达。

Ctnnal1基因位于五号染色体上，编码α-catenin蛋白，它是连环蛋白家族的成员之一，定位于细胞膜粘附连接区域，它通过与钙黏蛋白和细胞骨架蛋白的相互作用，调控钙黏蛋白-肌动蛋白丝连接的配置。

经发明人研究发现，Ctnnal基因与视网膜新生血管疾病相关，通过基因编辑技术敲除目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的第二个外显子序列，或通过RNAi技术沉默目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的表达，使Ctnnal基因在目标动物血管内皮细胞中丧失功能，得到表现出典型视网膜新生血管疾病特征的动物模型。

在可选实施方式中，所述基因编辑技术选自：CRISPR/Cas9技术、ZFN技术、TALENs技术和Cre-loxp基因敲除技术中的任意一种。

在可选实施方式中，所述基因编辑技术为Cre-loxp基因敲除技术。

在可选实施方式中，对目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因进行基因敲除，以敲除掉Ctnnal基因的第二个外显子序列是指：仅敲除目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的第二个外显子序列或敲除的序列中含有Ctnnal基因的第二个外显子序列。具体地，敲除的序列中含有Ctnnal基因的第二个外显子序列是指：敲除掉第一外显子和第二外显子的情况等。只要敲除了Ctnnal基因的第二个外显子序列用于制备视网膜新生血管疾病模型，则落入本申请的保护范围。

在可选实施方式中，敲除目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的外显子序列或Ctnnal基因的全序列。即也可以通过将Ctnnal基因的外显子序列或Ctnnal基因的全序列进行敲除，以达到使Ctnnal基因功能丧失的效果。

需要说明的是，所述目标动物为哺乳动物。

优选地，所述目标动物为非人哺乳动物。

优选地，所述目标动物选自小鼠、大鼠、狗、猪、兔、牛、马、羊、猴和猿中的任意一种。

在可选的实施方式中，所述方法还包括：将进行了Ctnnal基因敲除或基因沉默的目标动物进行交配或体外受精。

即，在进行了Ctnnal基因敲除或基因沉默的基础上，进行进一步地操作，如将基因敲除或基因沉默的动物进行交配或体外受精，获取的子代作为动物模型也属于本申请的保护范围。

此外，本发明实施例还提供了如前述任一实施方式所述的用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法构建的视网膜新生血管疾病模型在筛选用于预防或治疗视网膜新生血管相关疾病的药物中的应用。

在可选的实施方式中，所述视网膜新生血管相关疾病包括：糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞和视网膜静脉周围炎中的任意一种。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，其包括利用Cre-loxp基因敲除技术，敲除目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的第二个外显子，以构建视网膜新生血管疾病模型，具体如下。

将携带loxp序列的小鼠(Ctnna1^loxp/loxp)与携带Pdgfb-Cre的小鼠进行交配，获得同时携带loxp序列和Cre的小鼠，记为Ctnna1^loxp/+-Pdgfb-Cre小鼠。随后，将Ctnna1^loxp/loxp小鼠与Ctnna1^loxp/+-Pdgfb-Cre小鼠进行交配，以获得Ctnna1^loxp/loxp-Pdgfb-Cre小鼠。结合附图理解，利用Cre-loxp技术将小鼠血管内皮细胞中的Ctnna1第二个外显子敲除的示意图请参照图1中A，Ctnna1基因敲除型小鼠的繁育路线图请参照图2。

Ctnna1^loxp/loxp-Pdgfb-Cre小鼠在出生后第1、2、3和5天进行腹腔注射50μg他莫昔芬(Tamoxifen)，以诱导Ctnnal基因的敲除(他莫昔芬的诱导时间和小鼠处理时间请参照附图1中C)，敲除后记为Ctnnal^iECKO小鼠。

其中，诱导的具体操作为：配置10mg/mL他莫昔芬的无水乙醇溶液，于4℃避光保存。使用前，将他莫昔芬的无水乙醇溶液与玉米油混合(腹腔注射需要玉米油当溶剂)，混合体积为1：9，混匀后，将1mL注射器对小鼠进行腹腔注射。

待Ctnna1^loxp/loxp-Pdgfb-Cre小鼠出生后5天(T5)进行编号，用5μL的40mMNaOH溶液95℃煮40min溶解组织以提取DNA，冷却后，加入等体积40mM Tris-HCl(pH 5.5)溶液调节pH，调节后，进行PCR反应进行基因型的鉴定(鉴定凝胶电泳图见图1中B)。

其中，PCR的反应条件为：94℃2min，(94℃20s，60℃20s，72℃20s)×34个循环，4℃备用；鉴定PCR反应的引物如表1所示。

表1引物序列

试验例1

验证实施例1构建的视网膜新生血管疾病模型在出生后第25天肺组织中Ctnna1蛋白的表达情况。

1.蛋白检测

获取同窝野生型和Ctnna1基因敲除型小鼠(实施例1构建的)的肺组织，置于含有蛋白酶抑制剂的1ⅹPBS中，于冰上超声裂解10min；16000ⅹg，4℃离心10min，离心后，取上清转移至另一干净的离心管中，加入蛋白上样缓冲液，混匀后95℃加热5min。

冷却后，分别取20μL蛋白样品，采用10％分离胶，70V恒压电泳25min，160V电泳40min。电泳后进行转膜，转膜的条件为：0.3A恒流转移1h30min，然后，去离子水润洗膜一遍，用5％脱脂牛奶封闭液室温封闭1h。将膜放入一抗，4℃摇床孵育过夜。次日，用1ⅹTBST润洗3次，每次5min，加入HRP标记的二抗，室温孵育1h。

向膜上加入适量的化学发光底物，利用化学发光检测仪观察蛋白条带，蛋白条带灰度用ImageJ检测，并用t检验进行统计学差异分析。检测结果请参照附图3。

图3中，图3中A为出生后第25天的野生型小鼠和Ctnna1基因敲除型小鼠肺裂解液免疫印迹实验结果(Ctnna1为实验组，Gapdh为内参)；图3中B为Ctnna1蛋白免疫印迹的统计结果。

由图3中B可知，Ctnna1的蛋白水平在Ctnna1基因敲除型小鼠的肺组织中下降了85％左右。

2.mRNA检测

获取出生后第25天的野生型和Ctnna1基因敲除型小鼠(实施例1构建的)肺组织中的总RNA，利用cDNA合成试剂盒(Invitrogen，Waltham，MA，USA)合成cDNA。

然后，根据Ctnna1的cDNA序列设计引物，引物序列如表2所示。

表2引物序列

	序列5’-3’	SEQ ID No.
			Q-ms-Ctnna1-F1	AAGTCTGGAGATTAGGACTCTGG	5
Q-ms-Ctnna1-R1	ACGGCCTCTCTTTTTATTAGACG	6

。

以提取的cDNA为模板，Gapdh为内参，采用ABI 7500机器进行实时荧光定量PCR，以检测Ctnna1基因的mNRA表达情况。

检测结果参照图3中C，相对于野生型小鼠，出生后第25天的Ctnna1基因敲除型小鼠肺中的Ctnna1mRNA水平显著下降了约83％。

试验例2

检测实施例1构建的视网膜新生血管疾病模型的视网膜血管发育情况。

获取实施例1构建的Ctnna1基因敲除型小鼠，将小鼠处死后，取其眼球置于4％PFA溶液中室温固定20min，随后，于1×PBS中浸泡15min。用30G针头在角膜的中心扎孔，将整个角膜去除，并获取晶体。随后，用镊子将整个巩膜撕开，得到内层视网膜，并将之剪为四叶草形状，铺平去掉多余的组织后，吸入4％PFA，于4℃固定24h。第二天将whole-mount(视网膜铺片)转移至0.4％PFA中，4℃保存。

将获得的whole-mount进行染色：取出whole-mount，用1×PBS清洗3次，一次5min。随后用100μL封闭液(5％胎牛血清，0.3％TritonX-100，0.03％叠氮钠的PBS溶液)室温封闭1h。将红细胞特异性抗体Ter-119与Isolectin B4(特异性识别血管结构)按照适当的稀释比例配置成混合溶液，加入封闭好的whole-mount中(每个whoule-mount 100μL)，4℃孵育过夜。次日取出whoule-mount，用1×PBS清洗3次，一次5min，加入提前配置好的荧光二抗(每个100μL)，室温孵育4h。最后，用1×PBS清洗3次，一次5min，封片观察荧光染色结果，检测结果请参照附图4。

具体地，图4中A为Ctnna1基因敲除型小鼠视网膜铺片染色结果(共孵育IsolectinB4和Ter119抗体；其中，箭头代表渗漏出血管的红细胞)；图4中B为Ctnna1基因敲除型小鼠视网膜铺片中表层血管长度发育的统计分析图；图4中C为Ctnna1基因敲除型小鼠视网膜铺片中表层血管密度的统计分析图；图4中D为Ctnna1基因敲除型小鼠视网膜铺片中红细胞渗漏的统计分析图。

通过视网膜铺片的Isolectin B4和Ter119染色结果表明，Ctnna1基因敲除型小鼠的视网膜血管发育迟缓，血管辐射半径约为野生型的64％，相比于野生型小鼠明显降低；血管密度约为野生型的1.5倍，相较于野生型小鼠出现了显著增加的现象，表明Ctnna1基因敲除型小鼠血管发育的紊乱。

另外，Ctnna1基因敲除型小鼠的血管出现红细胞的局部渗漏，表现为血管外出现大量Ter119信号(图4中D)。

试验例3

对实施例1构建的视网膜新生血管疾病模型进行眼球冰冻切片染色和玻璃体血管(hyaloid)分离染色实验。

(1)眼球冰冻切片的制备：

将同窝野生型(Ctrl)和实施例1构建的Ctnna1基因敲除型小鼠(Ctnnal^iECKO)处死后，获取眼球置于4％PFA溶液中室温固定20min，随后用30G针头在角膜的中心扎孔，并将整个角膜剪掉。将固定好的眼球用1×PBS润洗一次，置于30％的1×PBS蔗糖溶液中，4℃脱水2h。随后将眼球的晶体取出，吸干水分，将眼球以相同方向置于装有OCT的冰冻切片包埋盒中，-80℃凝固后，于-20℃保存。切片厚度为10μm。

(2)玻璃体血管的分离：

取Ctrl小鼠和Ctnnal^iECKO小鼠的眼球，置于装有4％PFA的24孔板中室温固定15min，随后将角膜扎孔并完全去除角膜，于4％PFA 4℃固定2h。将固体明胶配置成5％的PBS溶液，50℃煮至明胶完全溶解。

将去角膜的眼球用1×PBS润洗一遍，然后浸泡在装有5％明胶溶液的24孔板中，37℃孵育过夜。次日取出24孔板，4℃冷藏至明胶凝固。然后，取出包裹有固体凝胶的眼球，用制备whole-mount的方法将巩膜撕去，留下内部晶体和视网膜部分。随后，在预冷的载玻片上小心去除晶体和视网膜，留下hyaloid血管。最后，将hyaloid血管剪成四叶草形，整个载玻片置于50℃金属浴上，并用免疫组化笔在hyaloid血管周围画圈。在50℃金属浴上用1×PBS对hyaloid血管进行润洗，去除残余明胶。

(3)冰冻切片和玻璃体血管的染色：

用免疫组化笔在前述步骤得到的眼球冰冻切片/玻璃体血管周围画圈，37℃烘干后，放入免疫组化湿盒中，用1×PBS润洗3次，一次5min。1张眼球冰冻切片滴加50μL封闭液，室温封闭30min。随后加入一抗，4℃孵育过夜。次日取出湿盒，弃一抗，用1×PBS润洗3次，一次5min。加入荧光二抗(封闭液中的)，室温孵育1h。取出切片，弃二抗，用1×PBS润洗3次，一次5min，每个切片滴加10μL荧光封片剂，盖上盖玻片，观察荧光，结果请参照附图5。

具体地，图5中A为出生后第九天的野生型和Ctnna1基因敲除型小鼠的视网膜切片结果；图5中B为出生后第九天的野生型和Ctnna1基因敲除型小鼠的玻璃体血管退化结果。

由图5中A可知，在小鼠出生后第9天，野生型小鼠的视网膜血管已开始向深层发育，而Ctnna1基因敲除型小鼠血管发育局限于血管表面，发育明显迟缓。

由图5中B可知，在小鼠出生后第9天，Ctnna1基因敲除型小鼠的玻璃体血管多于野生型小鼠，表明其退化减缓。

试验例4

检测实施例1构建的视网膜新生血管疾病模型的进行视网膜血管内皮细胞增殖情况。

取同窝野生型(Ctrl)和实施例1构建的敲除型目标小鼠(Ctnnal^iECKO)，于小鼠的腹腔分别注射2μM的EdU 50μL，3h后取视网膜铺片(同试验例3)，案子视网膜铺片染色的方法进行EdU二抗染色，对比野生型小鼠和Ctnna1基因敲除型小鼠视网膜内皮细胞的增殖情况，结果请参照附图6。

具体地，图6中A为小鼠视网膜血管内皮细胞的EdU染色结果，图6中B为小鼠视网膜血管内皮细胞的EdU染色的统计结果。

由图6可知，相对于野生型小鼠而言，Ctnna1基因敲除型小鼠的视网膜血管中处于增殖期的血管内皮细胞数目明显增加，即Ctnna1基因敲除型小鼠的视网膜血管内皮细胞增殖加速。

综上，本发明实施例1～5以小鼠为例，通过Cre-loxP基因敲除技术在小鼠血管内皮细胞中特异性敲除Ctnna1基因，使小鼠表现出表层和深层视网膜血管发育迟缓、血管密度增高、局部渗漏和玻璃体血管退化减缓等表型，这些特征都是视网膜新生血管疾病的典型特征。

由此充分说明，在血管内皮细胞条件性敲除Ctnna1基因，可以使目标动物表现出视网膜新生血管疾病。血管内皮细胞条件性敲除Ctnna1基因的动物，可以作为视网膜新生血管疾病模型。该疾病模型可以用于视网膜新生血管性疾病研究等领域中，为该疾病的研究例如发病过程、机制以及相关药物的筛选提供一种新的模型。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省人民医院

<120> 一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法和应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catttctgtc acccccaaag acac 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaaaatgat ccagcgtcct ggg 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gccgccggga tcactctcg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccagccgccg tcgcaactc 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagtctggag attaggactc tgg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acggcctctc tttttattag acg 23

Claims

1.一种用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，其特征在于，其包括：通过基因编辑技术对目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因进行基因敲除，以敲除掉Ctnnal基因的第二个外显子序列，或通过RNAi技术沉默目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的表达。

2.根据权利要求1所述的用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自：CRISPR/Cas9技术、ZFN技术、TALE Ns技术和Cre-loxp基因敲除技术中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，其特征在于，所述基因编辑技术为Cre-loxp基因敲除技术。

4.根据权利要求1～3任一项所述的用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，其特征在于，对目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因进行基因敲除是指：仅敲除目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的第二个外显子序列或敲除的序列中含有Ctnnal基因的第二个外显子序列。

5.根据权利要求1～3任一项所述的用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，其特征在于，对目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因进行基因敲除是指：敲除目标动物血管内皮细胞中的Ctnnal基因的外显子序列或Ct nnal基因的全序列。

6.根据权利要求5所述的用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，其特征在于，所述目标动物为哺乳动物；

优选地，所述目标动物为非人哺乳动物。

7.根据权利要求6所述的用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，其特征在于，所述目标动物选自小鼠、大鼠、狗、猪、兔、牛、马、羊、猴以及猿中的任意一种。

8.根据权利要求1所述的用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法，其特征在于，所述方法还包括：将进行了Ctnnal基因敲除或基因沉默的目标动物进行交配或体外受精。

9.如权利要求1～8任一项所述的用于构建视网膜新生血管疾病模型的方法构建的视网膜新生血管疾病模型在筛选用于预防或治疗视网膜新生血管相关疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述视网膜新生血管相关疾病包括：糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞和视网膜静脉周围炎中的任意一种。