CN116103292B - Zdhhc21基因突变动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于通过CRISPR‑Cas9系统、特异性靶向ZDHHC21基因的sgRNA，基于该sgRNA制备ZDHHC21基因突变动物模型的方法，以及所构建的动物模型作为阿尔茨海默病动物模型的应用；本发明的构建ZDHHC21基因突变的阿尔茨海默病动物模型的方法，可获得较高的成功率，所构建的ZDHHC21基因突变动物模型可以阿尔茨海默病的动物模型，这对于阿尔茨海默病的发生、发展机制(特别是研究ZDHHC21基因在阿尔茨海默病的发生发展中所起的作用)或筛选阿尔茨海默病的治疗药物具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于CRISPR/Cas9技术的ZDHHC21基因突变动物模型的构建方法及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种神经系统退行性疾病，是老年痴呆中最常见的一种类型，其临床表现以记忆障碍为主要特征，通常伴有失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等表现；其典型病理特征是淀粉样蛋白沉积和神经原纤维缠结。AD疾病的致病机制尚不明确，并且尚无明显延缓或逆转疾病进程的干预和治疗手段。
动物模型是发病机制研究和新药研发的重要基础。目前，AD疾病的发病机制研究主要采用家族性AD致病基因突变转基因动物，例如，常用的单转基因动物模型Tg2576小鼠、多转基因动物模型APP/PS1小鼠、3×Tg小鼠、5×FAD小鼠等；这些动物模型所使用的APP、PSEN1基因突变来自家族性AD，这些基因突变能够影响β-分泌酶、γ-分泌酶分解淀粉样前体蛋白作用，使Aβ水平升高，或提高Aβ42/Aβ40比率，从而导致Aβ蛋白沉积，进一步引发tau磷酸化、神经炎症、记忆能力下降等AD相关表型；所使用的MAPT基因突变包括P301S和P301L，是来自家族性额颞叶痴呆患者，能够加速tau聚集，进而形成神经原纤维缠结样结构，导致记忆能力下降等认知障碍，这些MAPT基因突变与家族性AD无关，虽然引起的病理和表型与AD疾病相似，但不能完全阐释AD的发生机制。除APP、PSEN1这些家族性AD致病基因突变外，也有研究将BACE1、TREM2基因和APOEε4等位基因作为AD风险基因来构建AD动物模型，这些风险基因突变能够起到加速Aβ生成或tau聚集的作用。尽管已报道APP、PSEN1、PSEN2、TREM2基因突变超过530个，中国家族性AD仍有超过80％的患者家系不携带这些已知致病基因突变，研究其他致病基因突变将利于解释这些家族性AD的发病机制，目前缺乏基于来自家族性AD的其他风险基因突变所构建的动物模型。
ZDHHC21基因位于人9号染色体，编码棕榈酰转移酶21(Zincfinger DHHC domain-containing protein,DHHC21)；ZDHHC21蛋白上第209位氨基酸T向氨基酸S的突变(简称ZDHHC21 T209S)是来自家族性AD的一个新致病基因突变，这一突变可以促进棕榈酰化和APP剪切，使Aβ生成增多，从而导致阿尔茨海默病的发生。目前，还没有任何关于ZDHHC21基因突变的阿尔茨海默病模型的构建方法的报道，因此，开发ZDHHC21基因突变的阿尔茨海默病模型以研究阿尔茨海默病的发生、发展机制并进行阿尔茨海默病的治疗药物筛选是当前情势所需。
CRISPR/Cas9系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高效。2013年，科学家首次报道CRISPR/Cas9系统在细胞上应用成功，随后，在斑马鱼、果蝇、小鼠、大鼠、猪中迅速得到应用。CRISPR/Cas9系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基因功能研究、疾病模型、基因治疗等领域得到广泛的应用。目前尚未见到基于CRISPR/Cas9系统构建ZDHHC21基因突变动物模型的报道。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种用于通过CRISPR-Cas9系统、特异性靶向ZDHHC21基因的sgRNA，基于该sgRNA的CRISPR-Cas9基因打靶系统，及其在制备ZDHHC21基因突变的细胞或动物模型中的应用，以及利用该sgRNA或者该基因打靶系统通过CRISPR-Cas9技术向ZDHHC21基因中引入目的突变的方法，构建ZDHHC21基因突变小鼠模型的方法，以及所构建的ZDHHC21基因突变小鼠模型作为阿尔茨海默病模型在研究阿尔茨海默病的发生、发展机制或筛选阿尔茨海默病的治疗药物中的应用。
解决方案
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于通过CRISPR-Cas9系统、特异性靶向ZDHHC21基因的sgRNA，所述sgRNA对应的DNA序列如下：
TCAAAGGTAGTCAAACAGTATGG(即，SEQ ID NO：1)。
第二方面，本发明提供了一种用于构建ZDHHC21基因突变的细胞或动物模型的CRISPR-Cas9基因打靶系统，所述CRISPR-Cas9基因打靶系统包括如上述第一方面所述的特异性靶向ZDHHC21基因的sgRNA、Cas9 mRNA和含有ZDHHC21突变位点的donor DNA序列。
在可行的实施方案中，所述ZDHHC21基因突变为导致ZDHHC21蛋白第209位氨基酸T→S的基因突变；
优选地，所述ZDHHC21突变位点为ZDHHC21基因第8号外显子中第4位核苷酸A→T的突变；
进一步优选地，所述含有ZDHHC21突变位点的donor DNA序列如下：
Caatcgggtatcctcaaaggttgtaatcaaatgaaatagttcttggagagatgtttgatattttagtagttcactgatttttttatatgat
agaatgttaattttatttttctaagaggatttcagaatgtgtattgatatataaacttgttaaaagtatttataaatttgttacatctgaatataattttt
tgtttttaatagGATtCAACATCTATTGAAAAAATGTCAAATTGTTGTGAAGAAATgtaagtattaa
gttatagtgatcttatttaaaaatagaaaccatactgtttgactacctttgagaatcatgtgcctatgttaatagtaggaaactaatatgttgatt
tttttttcttggtgtcctgtctgaggcccaagctagacaggcgtatcccagtcttactgtaggggtctttcagccatgC(即，SEQ ID
NO：2，其中下划线部分显示的是ZDHHC21基因第8号外显子，其中的小写“t”为突变位点，为核苷酸A→T的突变)。
在具体实施方案中，Cas9 mRNA为基因工程领域的常规工具序列(例如，在Mali P,Yang L,Esvelt KM,Aach J,Guell M,et al.(2013)RNA-guided human genomeengineering via Cas9.Science 339:823-826中报道的)，可以识别的PAM序列是5'-NGG-3'。
第三方面，本发明提供了一种利用CRISPR-Cas9技术向ZDHHC21基因中引入目的突变的方法，所述方法使用如上述第一方面所述的特异性靶向ZDHHC21基因的sgRNA，或者如上述第二方面所述的CRISPR-Cas9基因打靶系统。
第四方面，本发明提供了如上述第一方面所述的特异性靶向ZDHHC21基因的sgRNA，或者如上述第二方面所述的CRISPR-Cas9基因打靶系统在制备ZDHHC21基因突变的细胞或动物模型中的应用；
优选地，所述动物为小鼠，更优选为C57BL/6J小鼠。
第五方面，本发明提供了一种构建ZDHHC21基因突变小鼠模型的方法，所述方法包括：
(1)构建同源重组载体，所述同源重组载体中包含含有ZDHHC21突变位点的donorDNA序列；
(2)将步骤1)所构建的同源重组载体与Cas9 mRNA、如权利要求1所述的sgRNA一起显微注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植入假孕受体母鼠进行孕育，获得F0代ZDHHC21基因突变小鼠；
(3)将F0代ZDHHC21基因突变小鼠与野生型小鼠杂交，获得F1代ZDHHC21基因突变杂合子小鼠；以及
任选地，(4)使步骤(3)所得F1代ZDHHC21基因突变杂合子小鼠自交，获得F2代ZDHHC21基因突变纯合子小鼠。
对于上述构建方法：
在一种可行的实施方案中，所述ZDHHC21基因突变为导致ZDHHC21蛋白第209位氨基酸T→S的基因突变。
优选地，步骤(1)中，所述ZDHHC21突变位点为ZDHHC21基因第8号外显子中第4位核苷酸A→T的突变；进一步优选地，所述含有ZDHHC21突变位点的donor DNA序列如SEQ IDNO：2所示；
此外，优选地，所述同源重组载体还包含5’同源臂和3’同源臂；进一步优选地，所述5’同源臂具有如SEQ ID NO:5所示的序列，所述3’同源臂具有如SEQ ID NO:6所示的序列。
在一种可行的实施方案中，步骤(2)中，小鼠和母鼠的品系为C57BL/6J；
优选地，步骤(2)中还包括提取F0代小鼠的基因组DNA进行PCR扩增、测序，以进行基因型鉴定的步骤；
进一步优选地，用于所述PCR扩增的引物组包括DNA序列分别如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示的引物，用于所述测序的引物组包括DNA序列分别如SEQ ID NO:9、10、11所示的引物。
在一种可行的实施方案中，步骤(3)或步骤(4)中还分别包括提取F1代或F2代小鼠的基因组DNA进行PCR扩增、测序，以进行基因型鉴定的步骤；
优选地，用于所述PCR扩增的引物组包括DNA序列分别如SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:13所示的引物，用于所述测序的引物组包括DNA序列如SEQ ID NO:14所示的引物。
第六方面，本发明提供了根据上述第五方面所述的方法构建的ZDHHC21基因突变小鼠模型作为阿尔茨海默病模型在研究阿尔茨海默病的发生、发展机制或筛选阿尔茨海默病的治疗药物中的应用。
有益效果
本发明提供的特异性靶向ZDHHC21基因的sgRNA可用于通过CRISPR-Cas9技术向ZDHHC21基因中引入特定的目的突变，从而可用于构建ZDHHC21基因突变(例如ZDHHC21T209S)的细胞或动物模型；根据本发明的构建ZDHHC21基因突变的细胞或动物模型的方法具有较高的成功率，并且，通过该方法构建的ZDHHC21 T209S突变的小鼠模型，经行为学、形态学、分子生物学检测证实，其在认知功能、脑组织病理及分子水平方面均表现出阿尔茨海默病的早期特征性表型，因此可以作为阿尔茨海默病的动物模型用于研究阿尔茨海默病的发生、发展机制(特别是研究ZDHHC21基因在阿尔茨海默病的发生发展中所起的作用)或筛选阿尔茨海默病的治疗药物，具有重大的产业价值。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
以下所有附图中，WT代表野生型小鼠，T209S代表ZDHHC21T209S/T209S小鼠。
图1显示实施例1中构建ZDHHC21 T209S定点突变小鼠模型所采用的构建策略示意图；
图2显示分别通过定量PCR和Western blot法检测的实施例1中所获得的ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的ZDHHC21的mRNA水平(图2a)和蛋白水平(图2b)的结果图；
图3显示实施例1中所获得的ZDHHC21T209S/T209S小鼠模型的水迷宫实验结果，其中，图3a显示的是小鼠在水迷宫实验中前5天逃逸潜伏期，图3b显示的是第6天穿越平台次数，图3c显示的是穿越目标象限次数；
图4显示通过Aβ免疫组化法检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内(海马和大脑皮层)的Aβ水平相对于野生型小鼠的变化；
图5显示通过ELISA方法检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的Aβ42(图5b)、Aβ40(图5a)表达水平以及二者的比值(图5c)相对于野生型小鼠的变化；
图6显示通过P-tau 231免疫组化方法检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内(海马和大脑皮层)的P-tau 231水平相对于野生型小鼠的变化；
图7显示通过Western blot法检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的P-tau(包括P-tau396、P-tau 181、P-tau 231)和T-tau水平相对于野生型小鼠的变化，其中，Actin作为内参蛋白；图7a为蛋白凝胶电泳图，图7b-d分别为P-tau 396、P-tau 181、P-tau 231蛋白条带灰度的柱状统计图；
图8显示通过NeuN免疫组化方法和TUNEL法进行荧光共染检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内神经元损伤情况，其中，NeuN荧光强度反映了神经元数量，TUNEL荧光强度反映了细胞死亡数量；
图9显示通过电镜下观察检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的突触数量相对于野生型小鼠的变化，其中，图9a显示的是ZDHHC21T209S/T209S小鼠和野生型小鼠的脑内突触的电镜图片，图9b显示的是两种小鼠的每100μm2视野面积内的突触数量(即，密度)统计结果；
图10显示通过高尔基染色方法检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内神经元树突棘密度、树突长度和分支数量情况；其中，图10a为野生型小鼠和ZDHHC21T209S/T209S小鼠海马的高尔基染色代表性图像，图10b为野生型小鼠和ZDHHC21T209S/T209S高尔基染色海马锥体神经元代表性图像，图10c为量化每组3只小鼠的4个神经元从体细胞每一给定距离的树突分支数量，图10d为量化每组3只小鼠的3个神经元树突棘数量；
图11显示通过电生理学检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠海马长时程增强相对于野生型小鼠的变化；其中，图11a为野生型小鼠和ZDHHC21T209S/T209S小鼠急性海马切片诱导LTP记录，图11b为诱导后50-60min fEPSP定量，数值表示为每组3只小鼠的10个切片的平均值±标准差；
图12显示通过ABE棕榈酰化实验方法检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠模型海马中APP棕榈酰化水平相对于野生型小鼠的变化；其中，左侧为蛋白凝胶电泳图，右侧为蛋白条带灰度的柱状统计图；
图13显示通过Western blot方法检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠模型海马膜蛋白中APP蛋白水平相对于野生型小鼠的变化；其中，左侧为蛋白凝胶电泳图，右侧为柱状统计图；
图14显示通过ABE棕榈酰化实验方法检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠模型海马中FYN棕榈酰化水平相对于野生型小鼠的变化；其中，左侧为蛋白凝胶电泳图，右侧为柱状统计图；
图15显示通过Western blot方法检测的、ZDHHC21T209S/T209S小鼠模型海马膜蛋白中FYN蛋白水平相对于野生型小鼠的变化；其中，左侧为蛋白凝胶电泳图，右侧为柱状统计图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
下面通过实施例来进一步说明本发明；以下实施例中，除非特别说明，所使用的生物、化学材料均为市售产品。
实施例1：ZDHHC21 T209S定点突变小鼠模型的构建
本实施例中，采用CRISPR/Cas9技术，利用同源重组修复的方式，引入目的点突变ZDHHC21T209S，具体策略见图1；如图1所示，实现该定点突变的同源重组区域为ZDHHC21基因的8号外显子，通过在8号外显子中引入A>T突变，实现ZDHHC21基因的T209S突变。
本实施例中，采用C57BL/6J小鼠，进行ZDHHC21 T209S定点突变动物模型的构建；所用C57BL/6J小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司，周龄为8周龄。
具体构建过程如下：
(1)通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA(其序列参考Mali P,Yang L,EsveltKM,Aach J,Guell M,et al.(2013)RNA-guided human genome engineering viaCas9.Science 339:823-826中报道的)和small guide RNA(简称sgRNA，其序列如SEQ IDNO:1所示)；
(2)通过In-Fusion cloning方法(具体实验方法参考Takara公司In-Fusioncloning HD kits说明书)，构建同源重组载体(donor vector)；骨架来源是Cloningvector pBR322，将5’同源臂、ZDHHC21 T209S donor DNA序列、3’同源臂引入其中，即得同源重组载体；其中，ZDHHC21 T209S donor DNA序列如SEQ ID NO:2所示，其含有导致ZDHHC21T209S突变的8号外显子中第4位核苷酸A向核苷酸T的突变，具体如下所示：
野生型8号外显子序列如下(即，SEQ ID NO:3)：
GATACAACATCTATTGAAAAAATGTCAAATTGTTGTGAAGAAAT；
突变的8号外显子序列如下(即，SEQ ID NO:4)：
GATTCAACATCTATTGAAAAAATGTCAAATTGTTGTGAAGAAAT；
并且，其中，5’同源臂如SEQ ID NO:5所示，3’同源臂如SEQ ID NO:6所示；
(3)将Cas9 mRNA、sgRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，然后将受精卵移植入代孕鼠输卵管中，获得Founder小鼠；然后，提取小鼠的基因组DNA进行PCR扩增及PCR产物测序，确认获得4只正确同源重组的F0代ZDHHC21基因突变小鼠；
表1、用于鉴定F0代小鼠的PCR反应体系的引物
表2、用于鉴定F0代小鼠的PCR产物测序引物
| Primer | Sequence(5’-3’) |
| 测序引物1 | ACACTCTGAAGACTGTTGTTGGAAGC(SEQ ID NO:9) |
| 测序引物2 | TATATGATAGAATGTTAA(SEQ ID NO:10) |
| 测序引物3 | GCACTGTAGATATGAAGGGGTTGC(SEQ ID NO:11) |
(4)将F0代ZDHHC21基因突变小鼠与野生型小鼠杂交，对获得的小鼠提取基因组DNA以进行PCR扩增及PCR产物测序，确认获得8只阳性的F1代ZDHHC21基因突变杂合子小鼠；
表3、用于鉴定F1代小鼠的PCR反应体系的引物
| Primer | Sequence(5’→3’) |
| P1 | TAAAGGTTTGGTTTGTTCATTGGG(SEQ ID NO:12) |
| P2 | GTGATTGGCAAAGTGGTAGGGA(SEQ ID NO:13) |
表4、用于鉴定F1代小鼠的PCR产物测序引物
| Primer | Sequence(5’-3’) |
| 测序引物 | TATATGATAGAATGTTAA(SEQ ID NO:14) |
(5)使F1代ZDHHC21基因突变杂合子小鼠自交，对获得的小鼠提取基因组DNA以进行PCR扩增及PCR产物测序，确认获得F2代ZDHHC21基因突变纯合子(即，ZDHHC21T209S/T209S)小鼠；
用于鉴定F2代小鼠的PCR反应体系的引物和PCR产物的测序引物与上述鉴定F1代小鼠的相同。
实施例2：ZDHHC21 T209S定点突变小鼠模型的分子生物学鉴定
本实施例中，通过定量PCR和Western blot法检测实施例1中所获得的ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的ZDHHC21蛋白的转录和表达水平，具体过程如下：
分别提取同龄的野生型C57BL/6J小鼠和ZDHHC21T209S/T209S小鼠的脑部的RNA和总蛋白，然后，通过如下程序分别进行ZDHHC21的定量PCR和Western blot检测。
定量PCR
用细胞、组织RNA柱式提取试剂盒(RC112-01,Vazyme)提取小鼠脑组织中的总RNA。用反转录试剂盒(R233-01,Vazyme)合成cDNA，反应体系共20μL，其中total RNA 1μg；将反转录体系混匀，快速离心(2000rpm，离心1min)。反应条件如下：42℃，2min；50℃，15min；85℃，5sec；4℃。获得cDNA置于-20℃冰箱冻存。然后，使用定量PCR试剂盒(Q511-02,Vazyme)进行ZDHHC21的定量检测，取0.2ml灭菌EP管，反应液配置在冰上进行，每管反应体系如下：
表5、PCR扩增体系
上述表5中，用于扩增ZDHHC21的引物如下：
Forward Primer:5’-ATGGGTCTTCGGATTCATTCTTTG-3’(SEQ ID NO:15)
Reverse Primer:5’-CCCTCAGCTAAGGCAAGG-3’(SEQ ID NO:16)
将上述各成分加入EP管后，混匀，离心，进行Real Time PCR反应，反应程序：95℃5min,95℃ 10sec,60℃ 30sec，40个循环。CT值代表RNA水平。
Western
blot
采用BCA方法进行蛋白定量；然后，取20μg总蛋白上样，在12％ SDS-PAGE上进行凝胶电泳，然后将电泳分离的蛋白质条带电转移至膜上，5％脱脂奶粉封闭1-2h，TBST洗膜后加入anti-ZDHHC21(1:200,PA5-25096，Invitrogen)及β-actin(TA-09，中杉金桥)相应多克隆抗体，4℃过夜，用TBST清洗3次，每次10min。加入HRP标记的山羊抗兔抗体(1:2500，ZB5301，中杉金桥)，室温孵育1h，最后用TBST震荡清洗3次，每次10min。加入ECL(WBKlS0500，Millipore)显色，观察条带，凝胶成像系统扫描处理。
结果如图2所示，图2a显示的是野生型C57BL/6J小鼠和ZDHHC21T209S/T209S小鼠的脑内的ZDHHC21 mRNA水平，图2b显示的是野生型C57BL/6J小鼠和ZDHHC21T209S/T209S小鼠的脑内的ZDHHC21蛋白水平。
由图2可以看出：ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的ZDHHC21蛋白的mRNA水平和蛋白水平均与野生型小鼠相当，这说明：T209S突变不影响ZDHHC21蛋白表达的水平。
实施例3：ZDHHC21 T209S定点突变小鼠模型的AD相关表型鉴定
(一)ZDHHC21T209S/T209S小鼠认知功能
本实施例中，通过水迷宫实验，评价ZDHHC21T209S/T209S小鼠的认知功能；其中，前五天逃逸潜伏期和第六天穿越平台次数、穿越目标象限次数是常用评价指标，反映了小鼠学习和空间记忆能力。
水迷宫实验的具体操作如下：
(1)第1天：可见平台试验
1.将受试小鼠转移至水迷宫测试房间，使其在无法看到水迷宫设备及其相关空间定位线索的情况下，适应新环境30分钟左右。
2.平台位于水面上1cm，可以在平台上放一小旗增加辨识度。
3.挑选计划好的入水点(表6)，提起小鼠尾巴，使其面向池壁入水。实验人员快速离开。
4.如果小鼠在60秒内登上平台，则允许它在平台停留5秒(如果在平台停留时间不足5秒而又重新入水，则将其放回平台计时至5秒，以确保每只小鼠有相同的时间来观察和获取空间信息)，如果小鼠在60秒内未能找到目标象限中的平台，则手动引导其至平台，并使其在平台保持停留20秒。
5.第一天进行4次上述实验过程，每次的平台位置及入水点需不同，每次间隔约30分钟，连续训练5天(同一只小鼠同一天入水的象限顺序应不同)。利用自由录像系统记录小鼠找到平台的时间和游泳路径。每日以小鼠4次训练潜伏期(未在60秒内到达平台的潜伏期记为60秒)的平均值作为小鼠当日的学习成绩。
表6、平台位置及入水点顺序
说明：第1天注意平台位置和起始方向的变化，而在第2-5天平台位置保持不变，起始方向改变。第6天，无平台的单一入水点试验。第6天的起始方向选择距离平台位置(NW)最远的点S或E，使得小鼠在到达先前学习的平台象限之前必须行进一段距离。
6.在每次试验结束后，将小鼠从池中取出擦干并放回到加热垫上分钟左右以防止温度损失。
(2)第2-5天：水下平台试验
1.将平台置于水下1cm，从水面看不到水下平台。
2.同步骤(1)3～(1)6。
(3)第6天：探察试验
1.将平台从水池中移走。
2.同步骤(1)3～(1)6。
3.记录小鼠穿越平台区次数和目标象限停留时间百分比，一般要进行2次取平均值，这样可避免部分小鼠在改变条件后迷失方向而产生的实验偏差。但重复次数不宜超过2次以避免目标象限活动减少，结果不准确。
水迷宫实验使用Smart3.0视频跟踪系统记录轨迹。
水迷宫实验结果如图3所示，其中，图3a、3b、3c分别显示了ZDHHC21T209S/T209S小鼠模型在水迷宫实验中前5天逃逸潜伏期、第6天穿越平台次数、穿越目标象限次数；由图3可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠的学习和记忆能力与同龄野生型小鼠相比显著降低。
(二)ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内Aβ水平
本实施例中，通过Aβ免疫组化法，检测ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内(海马和大脑皮层)的Aβ水平相对于野生型小鼠的变化，具体程序如下：
用PBS经心脏灌流解剖后，用4％多聚甲醛固定每只小鼠的左半脑，用乙醇和二甲苯脱水，并包埋在石蜡中保存。用石蜡切片机将脑组织切片至5μm厚，贴于聚赖氨酸涂层的载玻片上。经二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡至水，使用10mM柠檬酸钠(pH6.0)，15分钟微波加热，进行抗原修复。用PBS洗涤后，用过氧化氢酶封闭液预处理切片10分钟，以阻断内源性过氧化物活性。用蛋白封闭液孵育切片10分钟。用PBS洗涤后，在37℃下，将切片在含有10％正常山羊血清的PBS中封闭30分钟，然后在37℃与Aβ抗体(1:2000，ab201060，Abcam)孵育1小时。将切片与生物素标记的二抗(goat anti-rabbit IgG H&L(biotin)，1:2000，ab6720，Abcam)在室温下孵育30分钟，用PBS洗涤后，滴加ABC HRP试剂(PK-6100，Vectastain)孵育30分钟，用Mayer苏木素复染细胞核，甘油封片，并用显微镜成像(Olympus CX33，Olympus)。
其结果如图4所示；由图4可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠海马和大脑皮层的Aβ水平与野生型小鼠相比均显著升高。
此外，还通过ELISA方法，分别检测ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的Aβ42和Aβ40水平相对于野生型小鼠的变化，具体程序如下：
AβELISA试剂盒分别用于测量Aβ42(CSB-E10787m,Cusabio)和Aβ40(CSB-E08300m,Cusabio)水平。在PBS缓冲液中超声裂解组织，并在4℃下以12000rpm离心20分钟。将裂解物的上清液转移至96孔板。将其与二抗在室温下孵育1小时，并在450nm处测量光密度。
其结果如图5所示；由图5可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的Aβ42和Aβ40水平与野生型小鼠相比均显著升高，Aβ42与Aβ40的比值也显著升高。
(三)ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内P-tau水平
本实施例中，通过P-tau 231免疫组化方法，检测ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内(海马和大脑皮层)的P-tau 231水平相对于野生型小鼠的变化，具体程序如下：
使用5μm小鼠脑组织石蜡切片，经二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡至水，使用10mM柠檬酸钠(pH6.0)，15分钟微波加热，进行抗原修复。用PBS洗涤后，用过氧化氢酶封闭液预处理切片10分钟，以阻断内源性过氧化物活性。在37℃下将切片在含有3％牛血清白蛋白的PBS中封闭30分钟，并在室温下与重组Anti-Tau(phospho T231)抗体[EPR2488](1:500,ab151559，Abcam)孵育1小时。将切片与辣根酶标记的二抗(goat anti-rabbit IgG[H&L](HRP),1:2000,ab205718,Abcam)在室温下孵育30分钟。使用DAB试剂盒(DA1010,Solarbio)观察阳性信号。切片用Mayer苏木精溶液(G1080,Solarbio)染色30秒，在乙醇和二甲苯中脱水，用中性胶固定，并用显微镜成像(Olympus CX33,Olympus)。
其结果如图6所示；由图6可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠海马和大脑皮层的P-tau231水平与野生型小鼠相比均显著升高。
此外，还通过Western blot法，分别检测ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的P-tau(包括P-tau 396、P-tau 181、P-tau 231)和T-tau水平相对于野生型小鼠的变化，具体操作如下：
取20μg总蛋白上样，在12％SDS-PAGE凝胶上进行电泳，然后将电泳分离的蛋白条带电转移至膜上，5％脱脂奶粉封闭1-2h，TBST洗膜后加入待测蛋白的一抗(1：1000)及β-actin相应多克隆抗体，4℃过夜，用TBST清洗3次，每次10min。加入相应的二抗，室温孵育1h，最后用TBST震荡清洗3次，每次10min。加入ECL显色，观察条带，凝胶成像系统扫描处理。
上述程序中，所使用的一抗包括：Tau(D1M9X)Rabbit mAb(46687，CST)、Phospho-Tau(Ser396)(PHF13)Mouse mAb(9632，CST)、Phospho-Tau(Thr181)RecombinantRabbit Monoclonal Antibody(5H9L11)(701530，Invitrogen)、重组Anti-Tau(phosphoT231)抗体[EPR2488](ab151559，Abcam)；所使用的二抗包括：山羊抗小鼠IgG/HRP(ZB5305，中杉金桥)、山羊抗兔IgG/HRP(ZB5301，中杉金桥)。
其结果如图7所示；由图7可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的P-tau 396、P-tau181、P-tau 231水平与野生型小鼠相比均显著升高。
(四)ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内神经元损伤
本实施例中，通过NeuN免疫组化方法和TUNEL法进行荧光共染，检测ZDHHC21T209S /T209S小鼠脑内神经元损伤情况，其中，NeuN荧光强度反映了神经元数量，TUNEL荧光强度反映了细胞死亡数量；具体程序如下：
使用小鼠脑的5μm石蜡包埋切片进行免疫染色，首先在二甲苯和梯度无水乙醇中渗透和脱水，然后用柠檬酸钠(pH6.0)进行免疫抗原修复。随后进行NeuN抗体和TUNEL共染色：向切片中加入40μL TUNEL检测溶液(11684817910，Roche，Switzerland)，切片在37℃下孵育2小时，切片在4℃下与anti-NeuN抗体(1:1000，ab279295，Abcam)孵育过夜。切片在PBS中洗涤，与山羊抗兔IgG H&L预吸附二抗(1:300，ab6939，Abcam)孵育，并使用DAPI(40728ES03，Yeasen)进行核染色。用抗荧光猝灭密封溶液密封脑切片，并使用激光共焦显微镜(Zeiss LSM 980，Zeiss，Germany)成像。
结果如图8所示，由图8可以看出，与野生型小鼠相比，ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内神经元死亡、神经元数量均显著减少。
(五)ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内突触数量
本实施例中，通过电镜下观察，检测ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的突触数量相对于野生型小鼠的变化。
具体地，用4％多聚甲醛经心脏灌流解剖后，取小鼠海马组织在冷的1％OsO4中固定1小时。根据电镜标准程序制备和测试样本。超薄切片(90nm)用乙酸铀酰和乙酸铅染色，并在透射电子显微镜(Tecnai G2 20Twin,FEI,USA)下观察成像。根据突触囊泡和突触后密度确定突触数量。
结果如图9，图9a显示的是ZDHHC21T209S/T209S小鼠和野生型小鼠的脑内突触的电镜图片，图9b显示的是两种小鼠的每100μm2视野面积内的突触数量(即，密度)；由图9可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内的神经元突触数量、密度与野生型小鼠相比显著减少。
(六)ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内神经元树突棘密度、树突长度和分支数量
通过高尔基染色方法，检测ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内神经元树突棘密度、树突长度和分支数量，具体程序如下：
通过FD快速高尔基斯坦试剂盒(PK-401,FD NeuroTechnologies,USA)，按照说明书的操作，进行高尔基染色。简言之，溶液A和B提前24小时混合。将组织浸入该混合物中2周，转移至溶液C中5天，浸入异戊烷(M108172，Aladdin,China)，与干冰混合冷冻，嵌入冷冻包埋剂(TFM-5,Sakura,USA)，并在-80℃冷冻保存。然后，将组织用冰冻切片机切成100μm的切片进行银染色，并在梯度酒精中脱水。在二甲苯液体中除去背景，并用中性胶(36313ES60,Yeasen)密封切片。在正向荧光显微镜(Nikon DS-Ri2,Nikon,Japan)下观察组织切片。
对于树突棘和分支的统计分析，我们使用Sholl分析(通过Fiji图像处理软件包)。简言之，首先，我们将图像转换为8bit，设置比例并保存；其次，我们打开图像，跟踪神经元的轨迹，测量神经元的长度，并使用插件“Neuron J”进行神经元跟踪；最后，我们使用插件“Sholl分析”在神经元周围形成等距距离的同心圆。我们计算了树突和同心圆的交点数量，因为这些交点间接反映了树突的长度和分支的数量。
结果如图10所示，图10a为野生型小鼠和ZDHHC21T209S/T209S小鼠海马的高尔基染色代表性图像，图10b为野生型小鼠和ZDHHC21T209S/T209S高尔基染色海马锥体神经元代表性图像，图10c为量化每组3只小鼠的4个神经元从体细胞每一给定距离的树突分支数量，图10d为量化每组3只小鼠的3个神经元树突棘数量；由图10可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内神经元树突棘密度、树突长度和分支数量与野生型小鼠相比均显著减少。
(七)ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内神经元突触功能
通过电生理学，检测ZDHHC21T209S/T209S小鼠海马长时程增强，强场兴奋性突触后电位(fEPSPs)反映了突触间传导功能，具体程序如下：
使用振动切片机(Leica VT2000S,Leica Biosystems,Germany)在充有95％O2和5％CO2(26mM NaHCO3、1.25mM NaH2PO4、2.5mM KCl、0.5mM CaCl2、4mM MgCl2、10mM葡萄糖和206mM蔗糖)的冰冷切片缓冲液中制备小鼠脑组织的冠状海马切片(400μm)。切片在室温下浸入含氧人工脑脊液(125mM NaCl、26mM NaHCO3、1.25mM NaH2PO4、2.5mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2和10mM葡萄糖)中1小时。使用MultiClamp 700B微电极放大器和Digidata 1440A低噪声数据采集系统(Molecular Devices，USA)采集记录。通过双极钨电极刺激Schaffer侧支，在CA1放射层诱发fEPSP，并在30℃下用人工脑脊液填充玻璃移液管(电阻<1MΩ)记录。将基线反应设置为最大反应的40％，并记录15分钟。一次100Hz强直流(1s)诱发长时程增强。使用Clampfit10软件(Molecular Devices)分析数据。fEPSP的峰值振幅作为突触强度的指标进行测量，并表示为基线平均值的百分比。
结果如图11所示，其中，图11a为野生型小鼠和ZDHHC21T209S/T209S小鼠急性海马切片诱导LTP记录，图11b为诱导后50-60min fEPSP定量，数值表示为每组3只小鼠的10个切片的平均值±标准差；由图11可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠脑内神经元突触功能与野生型小鼠相比显著降低。
实施例4：ZDHHC21 T209S定点突变小鼠模型的脑内APP棕榈酰化水平检测
本实施例中，通过ABE棕榈酰化实验方法，检测ZDHHC21T209S/T209S小鼠模型海马中APP棕榈酰化水平，具体程序如下：
利用酰基-生物素置换法(Acyl-biotinyl exchange，ABE)对棕榈酰化蛋白质的检测，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解小鼠海马组织，将蛋白质浓度调至1.0μg/μl。用甲醇-氯仿沉淀至少500μg的总蛋白溶于硼酸锂缓冲液，在4℃下10mM N-乙基马来酰亚胺(N-ethylmaleimide，NEM)处理过夜。用氯仿-甲醇沉淀三轮后，用羟胺(HA)将棕榈酸从蛋白质上的半胱氨酸中裂解，以没有HA裂解作为阴性对照。所有蛋白质在室温下翻转混匀45分钟。随后使用1μM生物素BMCC标记蛋白质上半胱氨酸的游离巯基，在4℃下翻转混匀45分钟。使用链霉亲和素琼脂糖珠捕获生物素缀合的靶蛋白，并用含有β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液洗脱。通过Western blot检测APP的棕榈酰化。
Western blot所使用一抗为重组Anti-Amyloid Precursor蛋白抗体[Y188](ab32136,Abcam)，所使用的二抗是山羊抗兔IgG/HRP(ZB5301，中杉金桥)。
结果如图12所示，由图12可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠海马中APP棕榈酰化水平与野生型小鼠相比显著升高。
此外，还通过Western blot方法，检测ZDHHC21T209S/T209S小鼠模型海马膜蛋白中APP水平，具体程序如下：
用细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(P0033，碧云天)提取小鼠海马组织中的细胞膜蛋白。取约100毫克组织，用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片。加入1毫升临用前添加了PMSF的膜蛋白抽提试剂A，轻轻悬浮组织碎片，冰浴放置10-15分钟。4℃，700g离心10分钟，小心收集上清液至一新的离心管中。4℃，14000g离心30分钟，以沉淀细胞膜碎片。吸取上清即为细胞浆蛋白。剩余30-50微升上清，4℃，14000g离心10秒，尽最大努力吸尽上清。可以轻轻触碰到沉淀，甚至吸走很少量的沉淀。加入膜蛋白抽提试剂B 200微升，最高速剧烈Vortex 5秒重悬沉淀，冰浴5-10分钟。重复前述步骤的vortex和冰浴孵育1-2次，以充分抽提膜蛋白。随后，4℃，14000g离心5分钟，收集上清即为细胞膜蛋白溶液。
用Western blot检测APP蛋白水平，所使用一抗为重组Anti-Amyloid Precursor蛋白抗体[Y188](ab32136,Abcam)，内参蛋白为E-cadherin(AF0138，碧云天)，所使用的二抗是山羊抗兔IgG/HRP(ZB5301，中杉金桥)、山羊抗鼠IgG/HRP(ZB5305，中杉金桥)。
结果如图13所示，由图13可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠海马膜蛋白中APP水平与野生型小鼠相比显著升高。
实施例5：ZDHHC21 T209S定点突变小鼠模型的脑内FYN棕榈酰化水平检测
本实施例中，通过ABE棕榈酰化实验方法，检测ZDHHC21T209S/T209S小鼠模型海马中FYN棕榈酰化水平，具体程序如下：
利用酰基-生物素置换法(Acyl-biotinyl exchange，ABE)对棕榈酰化蛋白质的检测，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解小鼠海马组织，将蛋白质浓度调至1.0μg/μl。用甲醇-氯仿沉淀至少500μg的总蛋白溶于硼酸锂缓冲液，在4℃下10mM N-乙基马来酰亚胺(N-ethylmaleimide，NEM)处理过夜。用氯仿-甲醇沉淀三轮后，用羟胺(HA)将棕榈酸从蛋白质上的半胱氨酸中裂解，以没有HA裂解作为阴性对照。所有蛋白质在室温下翻转混匀45分钟。随后使用1μM生物素BMCC标记蛋白质上半胱氨酸的游离巯基，在4℃下翻转混匀45分钟。使用链霉亲和素琼脂糖珠捕获生物素缀合的靶蛋白，并用含有β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液洗脱。通过Western blot检测FYN蛋白的棕榈酰化。Western blot所使用一抗为Anti-Fyn抗体[FYN-01](ab1881,Abcam)，所使用的二抗是山羊抗鼠IgG/HRP(ZB5305，中杉金桥)。
结果如图14所示，由图14可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠海马中FYN棕榈酰化水平与野生型小鼠相比显著升高。
此外，还通过Western blot方法，检测ZDHHC21T209S/T209S小鼠模型海马膜蛋白中FYN水平，具体程序如下：
用细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(P0033，碧云天)提取小鼠海马组织中的细胞膜蛋白。取约100毫克组织，用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片。加入1毫升临用前添加了PMSF的膜蛋白抽提试剂A，轻轻悬浮组织碎片，冰浴放置10-15分钟。4℃，700g离心10分钟，小心收集上清液至一新的离心管中。4℃，14000g离心30分钟，以沉淀细胞膜碎片。吸取上清即为细胞浆蛋白。剩余30-50微升上清，4℃，14000g离心10秒，尽最大努力吸尽上清。可以轻轻触碰到沉淀，甚至吸走很少量的沉淀。加入膜蛋白抽提试剂B 200微升，最高速剧烈Vortex 5秒重悬沉淀，冰浴5-10分钟。重复前述步骤的vortex和冰浴孵育1-2次，以充分抽提膜蛋白。随后，4℃，14000g离心5分钟，收集上清即为细胞膜蛋白溶液。
用Western blot检测FYN蛋白水平，所使用一抗为Anti-Fyn抗体[FYN-01](ab1881,Abcam)，内参蛋白为E-cadherin(AF0138，碧云天)，所使用的二抗是山羊抗鼠IgG/HRP(ZB5305，中杉金桥)。
结果如图15所示，由图15可以看出，ZDHHC21T209S/T209S小鼠海马膜蛋白中FYN水平与野生型小鼠相比显著升高。
综合上述，根据本发明的方法可成功构建ZDHHC21 T209S定点突变小鼠模型，并且该模型小鼠在认知功能、脑组织病理及分子水平等方面均表现出阿尔茨海默病的早期特征性表型，因此可以作为阿尔茨海默病的动物模型用于研究阿尔茨海默病的发生、发展机制或筛选阿尔茨海默病的治疗药物。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (11)
1.一种用于构建ZDHHC21基因突变的小鼠细胞或小鼠动物模型的CRISPR-Cas9基因打靶系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas9基因打靶系统包括特异性靶向ZDHHC21基因的sgRNA、Cas9 mRNA和含有ZDHHC21突变位点的donor DNA序列；
其中，所述sgRNA对应的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；
所述ZDHHC21突变位点为第8号外显子中第4位核苷酸A→T的突变；并且，
所述含有ZDHHC21突变位点的donor DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种利用CRISPR-Cas9技术向小鼠ZDHHC21基因中引入目的突变的方法，其特征在于，所述方法使用如权利要求1所述的CRISPR-Cas9基因打靶系统。
3.如权利要求1所述的CRISPR-Cas9基因打靶系统在制备ZDHHC21基因突变的小鼠细胞或小鼠动物模型中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述小鼠为C57BL/6J小鼠。
5.一种构建ZDHHC21基因突变小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）构建同源重组载体，所述同源重组载体中包含含有ZDHHC21突变位点的donor DNA序列；
（2）将步骤（1）所构建的同源重组载体与Cas9 mRNA、特异性靶向ZDHHC21基因的sgRNA一起显微注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植入假孕受体母鼠进行孕育，获得F0代ZDHHC21基因突变小鼠；
（3）将F0代ZDHHC21基因突变小鼠与野生型小鼠杂交，获得F1代ZDHHC21基因突变杂合子小鼠；以及
任选地，（4）使步骤（3）所得F1代ZDHHC21基因突变杂合子小鼠自交，获得F2代ZDHHC21基因突变纯合子小鼠；
其中，所述ZDHHC21突变位点为ZDHHC21基因第8号外显子中第4位核苷酸A→T的突变；所述特异性靶向ZDHHC21基因的sgRNA对应的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；并且，所述含有ZDHHC21突变位点的donor DNA序列如SEQ ID NO：2所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述同源重组载体还包含5’同源臂和3’同源臂，所述5’同源臂具有如SEQ ID NO:5所示的序列，所述3’同源臂具有如SEQID NO:6所示的序列。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，小鼠和母鼠的品系为C57BL/6J；
和/或，步骤（2）中还包括提取F0代小鼠的基因组DNA进行PCR扩增、测序，以进行基因型鉴定的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，用于所述PCR扩增的引物组包括DNA序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物，用于所述测序的引物组包括DNA序列分别如SEQ ID NO:9、10、11所示的引物。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）或步骤（4）中还分别包括提取F1代或F2代小鼠的基因组DNA进行PCR扩增、测序，以进行基因型鉴定的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，用于所述PCR扩增的引物组包括DNA序列分别如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的引物，用于所述测序的引物组包括DNA序列如SEQ ID NO:14所示的引物。
11.根据权利要求5-10任一项所述的方法构建的ZDHHC21基因突变小鼠模型作为阿尔茨海默病模型在研究阿尔茨海默病的发生、发展机制或筛选阿尔茨海默病的治疗药物中的应用。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103388006A (zh) * | 2013-07-26 | 2013-11-13 | 华东师范大学 | 一种基因定点突变的构建方法 |
| CN107058254A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-08-18 | 贾建平 | 阿尔茨海默病新致病基因及其医药用途 |
| CN109735501A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-05-10 | 新乡医学院 | 敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒 |
| CN110891417A (zh) * | 2017-03-21 | 2020-03-17 | 杰克逊实验室 | 表达人APOE4和小鼠Trem2 p.R47H的遗传修饰小鼠及其使用方法 |
| CN111936628A (zh) * | 2018-03-20 | 2020-11-13 | 清华大学 | 阿尔茨海默病动物模型及其应用 |
| CN112899280A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-06-04 | 中国药科大学 | 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建方法和应用 |
| CN113957095A (zh) * | 2021-10-22 | 2022-01-21 | 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 | 一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的构建方法及其核酸组合物和应用 |
| CN114958760A (zh) * | 2021-02-23 | 2022-08-30 | 南京启真基因工程有限公司 | 一种构建阿尔兹海默症模型猪的基因编辑技术及其应用 |
-
2022
- 2022-11-25 CN CN202211497740.1A patent/CN116103292B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103388006A (zh) * | 2013-07-26 | 2013-11-13 | 华东师范大学 | 一种基因定点突变的构建方法 |
| CN107058254A (zh) * | 2017-02-27 | 2017-08-18 | 贾建平 | 阿尔茨海默病新致病基因及其医药用途 |
| CN110891417A (zh) * | 2017-03-21 | 2020-03-17 | 杰克逊实验室 | 表达人APOE4和小鼠Trem2 p.R47H的遗传修饰小鼠及其使用方法 |
| CN111936628A (zh) * | 2018-03-20 | 2020-11-13 | 清华大学 | 阿尔茨海默病动物模型及其应用 |
| CN109735501A (zh) * | 2019-03-04 | 2019-05-10 | 新乡医学院 | 敲除zDHHC17基因的N2a细胞系及其构建方法和试剂盒 |
| CN114958760A (zh) * | 2021-02-23 | 2022-08-30 | 南京启真基因工程有限公司 | 一种构建阿尔兹海默症模型猪的基因编辑技术及其应用 |
| CN112899280A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-06-04 | 中国药科大学 | 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的AD细胞模型及其构建方法和应用 |
| CN113957095A (zh) * | 2021-10-22 | 2022-01-21 | 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 | 一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的构建方法及其核酸组合物和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Aberrant palmitoylation caused by a ZDHHC21 mutation contributes to pathophysiology of Alzheimer’s disease;Wenwen Li et al.;《BMC Medicine》;1-17 * |
| NCBI Reference Sequence：NC_000070.7;Church，D. M. et al.;《GenBank》;序列部分 * |
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