CN107058254A - 阿尔茨海默病新致病基因及其医药用途 - Google Patents

阿尔茨海默病新致病基因及其医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种阿尔茨海默病致病基因及其医药用途。具体地，涉及家族性阿尔茨海默病的新的致病基因即DHHC21基因的突变体。更具体地，所示突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示。S‑棕榈酰转移酶21或其编码核酸序列的突变能够导致阿尔茨海默病的发生，具有用于制备治疗和/或预防和/或诊断阿尔茨海默病的潜力。

Description

阿尔茨海默病新致病基因及其医药用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及阿尔茨海默病新致病基因及其医药用途。具体地，涉及一种家族性阿尔茨海默病的新的致病基因，即ZDHHC21基因的突变基因。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是目前最常见的痴呆类型，是一种以进行性的记忆、认知、行为功能损害为特征的致死性神经退行性疾病，给社会和家庭带来沉重的经济负担。然而目前针对AD药物治疗的临床试验屡屡失败，故需要对AD的发病机制进行重新思考。
家族性AD(familial Alzheimer’s disease,FAD)是指家族中至少有连续两代一级亲属成员罹患AD，患者数为3个或者3个以上。流行病学研究显示，FAD约占AD的5％，是相对少见但并不罕见的一种AD类型。FAD是研究AD发病机制的理想模型。Presenilin-1(PSEN1)、presenilin-2(PSEN2)和amyloid precursor protein(APP)基因是迄今为止发现的导致FAD的主要致病基因，共发现突变234个，其中PSEN1突变187个，PSEN2突变14个，APP突变33个。然而，仅有不到50％的FAD家系携带以上基因突变，仍有相当一部分FAD病因不明。
ZDHHC编码的是S-棕榈酰转移酶(S-palmitoyltransferase)，能够识别特定的蛋白质序列，将棕榈酰基结合到半胱氨酸的侧链上，以硫脂键连接。S-棕榈酰转移酶是一个蛋白家族，目前在人类物种共发现23个成员，包括DHHC1-DHHC9以及DHHC11-DHHC24。它们的共同特点是包含4个跨膜结构域以及棕榈酰转移酶的催化中心DHHC模体。催化反应：Palmitoyl-CoA+[protein]-L-cysteine＝[protein]-S-palmitoyl-L-cysteine+CoA。催化结构域为长度约50个氨基酸的富含半胱氨酸的结构域，含有保守的DHHC模体(Asp-His-His-Cys)。每个成员在跨膜结构域的两边(N端和C端)有不同的结构，因此每个成员能够结合的催化底物不同。S-棕榈酰转移酶的底物包括神经元内功能各异的蛋白。棕榈酰化是神经元蛋白最常见的可逆的脂质修饰形式，其他形式还包括豆蔻酸酰化，异戊烯化。S-棕榈酰转移酶蛋白家族基因突变可导致多种疾病。ZDHHC17基因敲除的小鼠可出现类似亨廷顿舞蹈病的行为学和病理表现；ZDHHC8突变导致精神分裂；ZDHHC9和ZDHHC15突变导致X连锁精神发育迟滞。不同的ZDHHC成员导致不同的疾病，提示与每个成员结合不同的底物有关。
ZDHHC21基因位于9号染色体，研究表明，ZDHHC21基因编码棕榈酰转移酶21(Zincfinger DHHC domain-containing protein,DHHC21)，与APP(amyloid precursorprotein，beta淀粉样蛋白前体)存在密切联系，能够使APP棕榈酰化从而增强其疏水性，促进APP向脂筏(lipid raft)转移，更易结合到富含胆固醇的脂筏上。棕榈酰化的APP更容易被β-分泌酶切割(棕榈酰化的sAPPβ升高程度大于sAPPβ)，从而促进beta amyloidAβ的产生，使Aβ40和Aβ42水平都升高[1]。
Aβ的过度产生和积聚是AD发病机制的核心，而DHHC21促进了这一过程。目前，尚需要发现新的阿尔茨海默病致病基因，从而为开发防治阿尔茨海默病的药物提供新的途径。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，通过全外显子测序技术，在2个早发FAD家系和1个散发后部皮质萎缩(posterior cortical atrophy，PCA)患者中发现了2个ZDHHC21的突变基因，这个突变基因在临床中尚未报道，是新发现的FAD致病基因。并且本发明人惊奇地发现，S-棕榈酰转移酶21或其编码核酸序列的突变能够导致或促进阿尔茨海默病的发生，具有用于制备治疗和/或预防和/或诊断阿尔茨海默病的药物或者药物筛选模型的潜力。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种分离的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示。
ZDHHC21R226Q的氨基酸序列(265aa，突变位点用边框标出)：
MGLRIHFVVDPHGWCCMGLIVFVWLYNIVLIPKIVLFPHYEEGHIPGILIIIFYGISIFCLVALVRASITDPGRLPENPKIPHGEREFWELCNKCNLMRPKRSHHCSRCGHCVRRMDHHCPWINNCVGEDNHWLFLQLCFYTELLTCYALMFSFCHYYYFLPLKKRNLDLFVFRHELAIMRLAAFMGITMLVGITGLFYTQLIGIITDTTSIEKMSNCCEDISRP (R> Q)KPWQQTFSEVFGTRWKILWFIPFRQRQPLRVPYHFANHV(SEQ ID NO:1)
其包含的突变的第7外显子编码的氨基酸序列(43aa，突变位点用边框标出)
SRP (R>Q)KPWQQTFSEVFGTRWKILWFIPFRQRQPLRVPYHFANHV(SEQ ID NO:2)
ZDHHC21T209S的氨基酸序列(265aa，突变位点用边框标出)：
MGLRIHFVVDPHGWCCMGLIVFVWLYNIVLIPKIVLFPHYEEGHIPGILIIIFYGISIFCLVALVRASITDPGRLPENPKIPHGEREFWELCNKCNLMRPKRSHHCSRCGHCVRRMDHHCPWINNCVGEDNHWLFLQLCFYTELLTCYALMFSFCHYYYFLPLKKRNLDLFVFRHELAIMRLAAFMGITMLVGITGLFYTQLIGIITD (T>S)TSIEKMSNCCEDISRPRKPWQQTFSEVFGTRWKILWFIPFRQRQPLRVPYHFANHV(SEQ ID NO:3)
其包含的突变的第6外显子编码的氨基酸序列(15aa，突变位点用边框标出)
D (T>S)TSIEKMSNCCEDI(SEQ ID NO:4)
在63个早发FAD家系中，本发明人通过对家系患者和无症状成员的血液DNA样本测序分析，在2个早发FAD的存活患者和1个散发PCA患者中都发现了ZDHHC21基因的罕见错义突变，部分无症状家系成员未携带以上突变，提示这2个基因存在突变与疾病表型共分离现象。
在临床上，ZDHHC基因突变的发现能够为未知基因家系提供新的筛查基因，从而更好地指导FAD家系成员的临床咨询、跟踪随访和诊治方案。
本发明的另一方面涉及一种分离的核酸，其编码氨基酸序列如SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示的蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述的分离的核酸，其碱基序列如SEQ ID NOs:5－8中任一序列所示。
ZDHHC21R226Q的碱基序列(798bp，突变位点用边框标出)：
ATGGGTCTCCGGATTCACTTTGTTGTTGACCCACATGGTTGGTGCTGCATGGGTTTGATTGTCTTTGTTTGGTTATACAATATTGTTTTAATTCCCAAAATTGTCCTCTTTCCTCACTATGAAGAAGGACATATTCCAGGCATATTAATAATAATATTCTATGGCATTTCCATATTCTGTCTGGTTGCCTTAGTGAGGGCCTCCATAACTGATCCAGGAAGACTCCCTGAGAACCCCAAGATCCCACATGGAGAAAGGGAGTTCTGGGAATTATGTAACAAGTGTAATTTGATGAGACCAAAGCGTTCCCATCACTGTAGCCGCTGCGGCCACTGTGTGAGGAGAATGGATCATCACTGTCCATGGATTAACAATTGTGTTGGTGAAGATAATCATTGGCTCTTTCTGCAGTTGTGTTTCTACACTGAACTTCTTACTTGCTACGCACTGATGTTTTCTTTCTGCCACTATTACTATTTTCTTCCACTAAAAAAGCGTAATTTGGACCTCTTTGTTTTTAGACATGAATTGGCCATAATGAGACTAGCAGCCTTTATGGGCATTACTATGTTAGTTGGAATAACTGGACTCTTTTACACTCAACTAATTGGCATCATCACAGATACAACATCTATTGAAAAGATGTCAAACTGTTGTGAAGATATATCGAGGCCCC (G>A)AAAGCCATGGCAGCAGACCTTCTCAGAAGTTTTTGGCACTCGTTGGAAGATCCTGTGGTTCATTCCTTTCAGGCAGAGGCAACCACTGCGAGTTCCCTACCACTTTGCCAATCATGTCTAA(SEQ ID NO:5)
其包含的突变的第7外显子的碱基序列(132bp，突变位点用边框标出)
TCGAGGCCCC (G>A)AAAGCCATGGCAGCAGACCTTCTCAGAAGTTTTTGGCACTCGTTGGAAGATCCTGTGGTTCATTCCTTTCAGGCAGAGGCAACCACTGCGAGTTCCCTACCACTTTGCCAATCATGTCTAA(SEQ IDNO:6)
ZDHHC21T209S的碱基序列(798bp，突变位点用边框标出)：
ATGGGTCTCCGGATTCACTTTGTTGTTGACCCACATGGTTGGTGCTGCATGGGTTTGATTGTCTTTGTTTGGTTATACAATATTGTTTTAATTCCCAAAATTGTCCTCTTTCCTCACTATGAAGAAGGACATATTCCAGGCATATTAATAATAATATTCTATGGCATTTCCATATTCTGTCTGGTTGCCTTAGTGAGGGCCTCCATAACTGATCCAGGAAGACTCCCTGAGAACCCCAAGATCCCACATGGAGAAAGGGAGTTCTGGGAATTATGTAACAAGTGTAATTTGATGAGACCAAAGCGTTCCCATCACTGTAGCCGCTGCGGCCACTGTGTGAGGAGAATGGATCATCACTGTCCATGGATTAACAATTGTGTTGGTGAAGATAATCATTGGCTCTTTCTGCAGTTGTGTTTCTACACTGAACTTCTTACTTGCTACGCACTGATGTTTTCTTTCTGCCACTATTACTATTTTCTTCCACTAAAAAAGCGTAATTTGGACCTCTTTGTTTTTAGACATGAATTGGCCATAATGAGACTAGCAGCCTTTATGGGCATTACTATGTTAGTTGGAATAACTGGACTCTTTTACACTCAACTAATTGGCATCATCACAGAT (A>T)CAACATCTATTGAAAAGATGTCAAACTGTTGTGAAGATATATCGAGGCCCCGAAAGCCATGGCAGCAGACCTTCTCAGAAGTTTTTGGCACTCGTTGGAAGATCCTGTGGTTCATTCCTTTCAGGCAGAGGCAACCACTGCGAGTTCCCTACCACTTTGCCAATCATGTCTAA(SEQ ID NO:7)
其包含的突变的第6外显子的碱基序列(45bp，突变位点用边框标出)
GAT (A>T)CAACATCTATTGAAAAGATGTCAAACTGTTGTGAAGATATA(SEQ ID NO:8)
本发明的再一方面涉及一种核酸构建体，其含有本发明的核酸序列；优选地，所述核酸构建体为重组载体；优选地，所述重组载体为重组表达载体。
本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其表达本发明的蛋白，或者含有本发明的核酸序列或者本发明的核酸构建体。
本发明的再一方面涉及一种组合物，其含有本发明的蛋白、本发明的核酸序列、本发明的核酸构建体或者本发明的重组宿主细胞。
本发明的再一方面涉及本发明的蛋白、本发明的核酸序列、本发明的核酸构建体、本发明的重组宿主细胞或者本发明的组合物在制备治疗和/或预防和/或诊断阿尔茨海默病的药物中的用途；或者在制备降低Aβ水平的药物中的用途；或者在制备降低总tau蛋白磷酸化水平的药物中的用途；或者在制备降低APP棕榈酰化水平的药物中的用途；或者在制备筛选药物的模型例如细胞模型或者动物模型中的用途，所述药物用于治疗和/或预防和/或诊断阿尔茨海默病；
优选地，所述阿尔茨海默病为家族性阿尔茨海默病；
优选地，所述，所述Aβ为Aβ40和/或Aβ42。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防阿尔茨海默病的方法或者一种降低Aβ(例如Aβ40和/或Aβ42)水平的方法或者一种降低总tau蛋白磷酸化水平的方法或者一种降低APP棕榈酰化水平的方法，包括减少或者降低受试者中的SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示蛋白的水平的步骤，或者包括减少或者降低受试者中的SEQ ID NOs:5－8中任一序列所示核酸的水平的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括将SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示的蛋白修正为相应的野生型蛋白的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括将SEQ ID NOs:5－8中任一序列所示的核酸修正为相应的野生型核酸的步骤。
本发明的再一方面涉及一种诊断阿尔茨海默病的方法，包括检测受试者是否存在SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示的蛋白的步骤，或者包括检测受试者是否存在SEQ IDNOs:5－8中任一序列所示的核酸的步骤；如果存在所述蛋白或核酸，则诊断为阳性。
本发明的再一方面涉及一种筛选治疗和/或预防阿尔茨海默病的药物的方法，包括检测候选药物是否减少或者降低受试者中或者细胞中的SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示的蛋白的水平的步骤，或者包括检候选测药物是否减少或者降低受试者中或者细胞中的SEQ ID NOs:5－8中任一序列所示的核酸的水平的步骤。如果受试者中或者细胞中的所述蛋白或核酸的水平降低或者减少，则作为阳性药物。可选地，以不加入候选药物的细胞作为对照。
本发明的再一方面涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片，其能够特异性地结合本发明的蛋白。
本发明的再一方面涉及一种偶联物，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段以及偶联部分，其中，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包括本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包括本发明的偶联物；
优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
本发明中，
人ZDHHC21基因的核苷酸序列的GenBank登录号是NC_000009.12。
野生型人ZDHHC21基因编码的S-棕榈酰转移酶21的氨基酸序列，如下：(265aa)
MGLRIHFVVDPHGWCCMGLIVFVWLYNIVLIPKIVLFPHYEEGHIPGILIIIFYGISIFCLVALVRASITDPGRLPENPKIPHGEREFWELCNKCNLMRPKRSHHCSRCGHCVRRMDHHCPWINNCVGEDNHWLFLQLCFYTELLTCYALMFSFCHYYYFLPLKKRNLDLFVFRHELAIMRLAAFMGITMLVGITGLFYTQLIGIITDTTSIEKMSNCCEDISRPRKPWQQTFSEVFGTRWKILWFIPFRQRQPLRVPYHFANHV(SEQ ID NO:9)
野生型第7外显子编码的氨基酸序列如下(43aa)
SRPRKPWQQTFSEVFGTRWKILWFIPFRQRQPLRVPYHFANHV(SEQ ID NO:10)
野生型第6外显子编码的氨基酸序列如下(15aa)
DTTSIEKMSNCCEDI(SEQ ID NO:11)
野生型人ZDHHC21基因的编码框的碱基序列如下：(798bp)
ATGGGTCTCCGGATTCACTTTGTTGTTGACCCACATGGTTGGTGCTGCATGGGTTTGATTGTCTTTGTTTGGTTATACAATATTGTTTTAATTCCCAAAATTGTCCTCTTTCCTCACTATGAAGAAGGACATATTCCAGGCATATTAATAATAATATTCTATGGCATTTCCATATTCTGTCTGGTTGCCTTAGTGAGGGCCTCCATAACTGATCCAGGAAGACTCCCTGAGAACCCCAAGATCCCACATGGAGAAAGGGAGTTCTGGGAATTATGTAACAAGTGTAATTTGATGAGACCAAAGCGTTCCCATCACTGTAGCCGCTGCGGCCACTGTGTGAGGAGAATGGATCATCACTGTCCATGGATTAACAATTGTGTTGGTGAAGATAATCATTGGCTCTTTCTGCAGTTGTGTTTCTACACTGAACTTCTTACTTGCTACGCACTGATGTTTTCTTTCTGCCACTATTACTATTTTCTTCCACTAAAAAAGCGTAATTTGGACCTCTTTGTTTTTAGACATGAATTGGCCATAATGAGACTAGCAGCCTTTATGGGCATTACTATGTTAGTTGGAATAACTGGACTCTTTTACACTCAACTAATTGGCATCATCACAGATACAACATCTATTGAAAAGATGTCAAACTGTTGTGAAGATATATCGAGGCCCCGAAAGCCATGGCAGCAGACCTTCTCAGAAGTTTTTGGCACTCGTTGGAAGATCCTGTGGTTCATTCCTTTCAGGCAGAGGCAACCACTGCGAGTTCCCTACCACTTTGCCAATCATGTCTAA(SEQ ID NO:12)
野生型第7外显子的核酸序列如下(132bp)
TCGAGGCCCCGAAAGCCATGGCAGCAGACCTTCTCAGAAGTTTTTGGCACTCGTTGGAAGATCCTGTGGTTCATTCCTTTCAGGCAGAGGCAACCACTGCGAGTTCCCTACCACTTTGCCAATCATGTCTAA(SEQ ID NO:13)
野生型第6外显子的核酸序列如下(45bp)
GATACAACATCTATTGAAAAGATGTCAAACTGTTGTGAAGATATA(SEQ ID NO:14)
本发明中，术语“APP(beta淀粉样蛋白前体，amyloid precursor protein)”编码Aβ前体蛋白，是Aβ的直接来源，APP经β-分泌酶剪切后产生C99，C99继而被γ-分泌酶剪切产生Aβ。PSEN1和PSEN2基因分别编码早老素1和早老素2，是γ-分泌酶的催化亚单位。由此可见，APP、PSEN1、PSEN2基因编码的蛋白都位于APP酶切通路上，突变可能是通过影响APP的酶切位点和早老素蛋白的结构，从而影响APP的酶切过程，导致Aβ生成异常。
本发明中，术语“Aβ”是APP依次经β-分泌酶和γ-分泌酶酶切的代谢产物，是包含约40个氨基酸的多肽[2]。Aβ40(含40个氨基酸)和Aβ42(含42个氨基酸)是Aβ的主要类型，Aβ40约占80％－90％，Aβ42约占5％-10％[3]。Aβ42比Aβ40疏水性更强，更易聚集形成斑块[4]，是形成脑内淀粉样斑块(amyloid plaque)的主要类型[5]。Aβ异常聚集形成淀粉样斑块的核心[2]，是AD的主要病理特征之一。
Aβ40的氨基酸序列如下：(40aa)
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO:15)
Aβ42的氨基酸序列如下：(42aa)
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO:16)
本发明中，术语“核酸构建体”，在文中定义为单链或双链核酸分子，优选是指人工构建的核酸分子。可选地，所述核酸构建体还包含有可操作地连接的1个或多个调控序列。
在本发明中，术语“可操作地连接”是指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。所述“可操作地连接”可以通过基因重组的手段实现。
在本发明中，术语“载体”指的是，可将抑制某蛋白的多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件。
在本发明中，术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
发明的有益效果
本发明首次在FAD家系中发现ZDHHC21基因突变，并发现棕榈酰基转移酶突变促进了棕榈酰化，能促进APP剪切，使Aβ生成增多，在AD发病机制中具有重要作用。本发明的研究表明，棕榈酰化极有可能为AD发病机制中的重要环节，这不仅为AD的发病机制提供了新的思路，也为以棕榈酰基转移酶为靶点的AD新药研发奠定理论基础。
附图说明
图1：携带ZDHHC21R226Q突变家系家系图。方框代表男性，圆形代表女性。黑色代表患者，白色代表无症状成员。斜杠代表去世成员。箭头指示先证者。mu/wt代表ZDHHC21杂合突变，wt/wt代表ZDHHC21野生型。
图2：Ⅱ-2患者11C-PIB PET图像。图2A，双侧颞叶皮层可见放射性摄取增加。图2B，双侧额叶、颞叶皮层可见放射性摄取增加。图2C，双侧后扣带及顶叶皮层可见放射性摄取增加。为11C-PIB PET阳性显像。
图3：携带ZDHHC21R226Q突变患者测序图。图3A，Ⅱ-2患者测序图。图3B，Ⅱ-3患者测序图。图中可见第677位碱基出现双峰，碱基G突变成A，导致第226位精氨酸(R)突变成谷氨酰胺(Q)。DNA测序结果来源于患者外周血提取DNA。
图4：携带ZDHHC21T209S突变家系家系图。方框代表男性，圆形代表女性。黑色代表患者，白色代表无症状成员。斜杠代表去世成员。箭头指示先证者。mu/wt代表ZDHHC21杂合突变，wt/wt代表ZDHHC21野生型。
图5：Ⅱ-6患者11C-PIB PET图像。图5A，双侧颞叶、额叶皮层可见放射性摄取增加。图5B，双侧额叶、颞叶皮层可见放射性摄取增加。图5C，双侧后扣带及顶叶皮层可见放射性摄取增加。为11C-PIB PET阳性显像。
图6：携带ZDHHC21T209S突变患者Ⅱ-6测序图。图中可见第625位碱基出现双峰，碱基A突变成T，导致第209位苏氨酸(T)突变成丝氨酸(S)。DNA测序结果来源于患者外周血提取DNA。
图7：携带ZDHHC21R226Q突变家系家系图。方框代表男性，圆形代表女性。黑色代表患者，白色代表无症状成员。斜杠代表去世成员。箭头指示先证者。mu/wt代表ZDHHC21杂合突变，wt/wt代表ZDHHC21野生型。
图8：Ⅱ-2患者11C-PIB PET图像。图8A，双侧颞叶皮层可见放射性摄取增加。图8B，双侧颞叶、顶叶皮层可见放射性摄取增加。图8C，双侧后扣带及顶叶皮层、双侧纹状体及背丘脑可见放射性摄取增加。为11C-PIB PET阳性显像。
图9：携带ZDHHC21R226Q突变患者Ⅱ-2测序图。图中可见第677位碱基出现双峰，碱基G突变成A，导致第226位精氨酸(R)突变成谷氨酰胺(Q)。DNA测序结果来源于患者外周血提取DNA。
图10：DHHC21蛋白结构示意图和突变所在位置。如图所示，DHHC21蛋白包含4个跨膜结构域，N端和C端。包含DHHC模体的催化中心位于第2、3跨膜域之间。T209S和R226Q突变均位于DHHC21蛋白的C端。罗马数字代表跨膜结构域顺序。黄色指示DHHC模体，红色指示突变所在氨基酸位点。
图11：pcDNA3.1质粒转染HEK293-APP695细胞效果图。图11A、11B和11C，转染pcDNA3.1+GFP空载体(MOCK)、ZDHHC21野生型载体(WT)、ZDHHC21R226Q突变载体(R226Q)的细胞绿色荧光蛋白表达情况。图11D、11E和11F，转染pcDNA3.1+GFP空载体(MOCK)、ZDHHC21野生型载体(WT)、ZDHHC21T209S突变载体(T209S)的细胞绿色荧光表达情况。
图12：质粒转染细胞48小时后ZDHHC21基因mRNA表达RT-qPCR定量分析。图12A，MOCK组、WT组和R226Q组ZDHHC21基因mRNA相对表达水平(P>0.05)。图12B，MOCK组、WT组和T209S组ZDHHC21基因mRNA相对表达水平(P>0.05)。RT-qPCR结果采用-ΔΔCT法计算相对表达水平，采用one-way ANOVA进行统计学分析，Tukey’s检验进行组间比较。竖杠代表平均值±标准差。
图13：质粒转染细胞48小时后细胞上清Aβ浓度ELISA定量分析。图13A，MOCK组、WT组和R226Q组上清Aβ40、Aβ42水平。图13B，MOCK组、WT组和T209S组上清Aβ40、Aβ42水平。白色柱代表Aβ40水平，黑色柱代表Aβ42水平，竖杠代表平均值±标准误，*代表P值<0.05。
图14：图14A，磷酸化Tau蛋白(p-tau231位点)、总Tau蛋白以及内参Actin的Western Blot结果。图14B，MOCK组、WT组和R226Q组总Tau蛋白水平数据分析。图14C，MOCK组、WT组和T209S组总Tau蛋白水平数据分析。图14D，MOCK组、WT组和R226Q组磷酸化Tau蛋白水平数据分析。图14E，MOCK组、WT组和T209S组磷酸化Tau蛋白水平数据分析。柱代表平均值±SEMs。*p<0.05。
图15：图15A，棕榈酰化APP、APP蛋白以及内参Actin的Western Blot结果。图15B，MOCK组、WT组和R226Q组APP蛋白水平数据分析。图15C，MOCK组、WT组和T209S组APP蛋白水平数据分析。图15D，MOCK组、WT组和R226Q组棕榈酰化APP蛋白水平数据分析。图15E，MOCK组、WT组和T209S组棕榈酰化APP蛋白水平数据分析。柱代表平均值±SEMs。*p<0.05。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：携带ZDHHC21基因突变的家系情况
(1)携带ZDHHC21R226Q突变家系：
共2代3个患者(图1)
患者情况：
Ⅱ-2:女性，53岁起病，隐匿起病，逐渐加重。表现为记忆力，执行功能下降。CDR＝2分。有高血压、高脂血症病史。脑MRI提示双侧海马萎缩。11C-PIB PET提示大脑皮层弥漫性放射性滞留，考虑为PIB阳性显像(图2A、图2B、图2C)。诊断为AD，中度痴呆期。基因情况：ZDHHC21R226Q突变(图3A)，APOE 4/4。
Ⅱ-3:男性，49岁起病，隐匿起病，逐渐加重。表现为记忆力下降，性格改变。CDR＝0.5分。有高血压、高脂血症、饮酒史。脑MRI提示海马略萎缩。18F-AV45PET为阳性显像。诊断为AD，aMCI期。基因情况：ZDHHC21R226Q突变(图3B)，APOE 4/4。
Ⅰ-1：男性，起病年龄不详，70岁痴呆，75岁去世。血液样本无法获得。
(2)携带ZDHHC21T209S突变家系：
共2代3个患者(图4)
患者情况：
Ⅱ-6:女性，55岁起病，隐匿起病，逐渐加重。表现为记忆力下降、执行功能障碍，语言功能障碍，定向力障碍，小便失禁。58岁时CDR＝3分，既往有3次卒中史。诊断为AD，重度痴呆期。11C-PIB PET提示大脑皮层弥漫性放射性滞留，考虑为PIB阳性显像(图5A、图5B、图5C)。诊断为AD，重度痴呆期。基因情况：ZDHHC21 T209S突变(图6)，APOE 4/3。
Ⅱ-2:男性，70岁左右起病，曾诊断为AD，已去世。血液样本无法获得。
Ⅰ-2:女性，80岁左右去世，去世前有记忆力下降。血液样本无法获得。
(3)携带ZDHHC21R226Q突变的散发PCA患者(图7)：
Ⅱ-2：女性，33岁起病，隐匿起病，逐渐加重。表现为视物不清、迷路、呆滞、眼球固定、言语不流利、命名障碍、肢体失用。CDR＝3分。否认既往病史和家族史。FDG PET提示双侧颞顶区低代谢改变。11C-PIB PET提示大脑皮层弥漫性放射性滞留，考虑为PIB阳性显像(图8A、图8B、图8C)。基因情况：ZDHHC21R226Q突变(图9)，PSEN1P117S突变，APOE 3/2。Ⅰ-2和Ⅱ-1均不携带ZDHHC21R226Q突变和PSEN1P117S突变。
突变情况汇总如下面的表1所示。这些突变情况由下面的实施例2中的方法获得并验证。
表1：突变情况汇总
DHHC21蛋白结构示意图及突变所在位置见图10。
实施例2：外显子测序和一代测序验证
1.人(第一个家系Ⅱ-2、Ⅱ-3，第二个家系Ⅱ-6，第三个家系Ⅰ-2、Ⅱ-1、Ⅱ-2)外周血白细胞DNA提取：
(1)取外周抗凝血(全血)100μl于eppendorf管中，12000rpm离心12min。
(2)弃上清，加双蒸水200μl溶解，摇匀20s。
(3)混匀后加6MNaI溶液200μl，摇匀20s。
(4)加入氯仿/异戊醇(24：1)400μl，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。
(5)取上层液350μl，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。
(6)弃异丙醇，加70％乙醇1ml(不振动)，以15000rpm离心12min。7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干(37℃恒温箱)后，加1xTE溶液30μl，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。
2.全外显子测序：
对4个早发FAD家系和1个散发PCA患者进行全外显子测序。每个家系挑选2个患者和1个无症状者外周血DNA样本进行测序，对于没有无症状者的家系，选择2至3个患者外周血DNA样本进行测序。
利用Illumina Hiseq2500试剂,采用Agilent 50M外显子组捕获芯片，测序深度70×，测序模式为125PE，每个样品产生不低于7.5Gb数据。
建库流程：取2μg基因组DNA，以Bioruptor做机械打断，使片段主带在200bp附近，切胶回收150-250bp片段；对DNA片段做末端修复和3’末端加A；连接测序接头，连接产物纯化后进行PCR扩增，扩增产物纯化为预文库；取一定量预文库以Agilent capture kit中的探针做杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，产物回收即为终文库，琼脂糖凝胶电泳跑小样确认；以qPCR方法对文库进行质控，合格文库安排上机。
测序结果注释：基于测序产生序列与基因组参考序列的比对结果，采用GATK软件Call SNP和INDEL，然后运用ANNOVAR软件对SNP(single nucleotide polymorphism)，INDEL(insertion or deletion)位点进行注释，确定位点对应的基因信息、同义非同义突变、对氨基酸的影响等信息。
测序后的位点筛选方法：①分别按照显性遗传模式和隐性遗传模式筛选位点。a.显性遗传模式：筛选出2个患者携带且1个无症状者不携带的杂合SNP或INDEL，对于没有无症状者的家系，筛选出3个患者共有的杂合SNP或INDEL，且MAF(minor allele frequency)<0.5％。b.隐性遗传模式：筛选出2个患者携带为纯合且1个无症状者不携带或为杂合的SNP或INDEL，对于没有无症状者的家系，筛选出3个患者共有的纯合SNP或INDEL，且MAF(minorallele frequency)<0.5％。②筛选出至少2个家系共有的SNP或INDEL，或1个家系独有的SNP或INDEL。
筛选结果：经筛选后发现1个FAD家系的2个患者和1个散发PCA患者都携带ZDHHC21R226Q突变。
扩大筛查：进一步对另59个早发FAD家系先证者的ZDHHC21基因所有编码外显子行一代测序，在1个家系的先证者中发现ZDHHC21T209S突变，且家系中的2个无症状对照不携带此突变。
3.一代测序
目的是为了验证前面全外显子测序检测出的突变位点是真实存在的还是假阳性(全外显子测序有可能出现假阳性结果)，同时，测得突变序列还可以和野生型序列进行比较。
以人基因组DNA为模板进行PCR扩增，引物和扩增条件如下。
引物序列，如下面的表2所示。
表2：引物序列
表2中设计的7对引物，覆盖了ZDHHC21基因的所有7个外显子的序列。
PCR反应体系：25μl体系
PCR反应条件A：
PCR反应条件B：
PCR反应条件C：
具体引物的PCR反应条件，如下面的表3所示。
表3：PCR反应条件
引物名称 T℃ PCR反应条件
ZDHHC21-1-F/R 53 B
ZDHHC21-2-F/R 55 B
ZDHHC21-3-F/R 53 B
ZDHHC21-4-F/R 57 C
ZDHHC21-5-F/R 57 A
ZDHHC21-6-F/R 57 A
ZDHHC21-7-F/R 53 B
得到7个PCR扩增产物(正向和反向互补)，委托北京睿博兴科生物技术有限公司和北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。测序结果与前面的全外显子测序相符合，并且两个公司的测序结果一致。其中，ZDHHC21T209S在第6外显子(ZDHHC21-6-F/R)，ZDHHC21R226Q在第7外显子(ZDHHC21-7-F/R)。
实施例3：体外细胞实验检测突变对Aβ生成的影响
1.实验目的
采用体外细胞模型验证在FAD家系中发现的2个ZDHHC21基因突变能影响Aβ生成。
2.实验方法
(1)质粒构建：在pcDNA3.1质粒空载体基础上插入GFP和ZDHHC21基因cDNA片段(通过人工合成ZDHHC21基因编码框的碱基序列)构建pcDNA3.1+GFP+ZDHHC21cDNA野生型质粒载体，在野生型质粒基础上采用一步法定点突变构建ZDHHC21R226Q突变、ZDHHC21T209S突变质粒载体。将构建好的质粒转入DH5α感受态大肠杆菌菌株，采用LB+氨苄青霉素(100μg/ml)培养基于37℃摇床中培养12－16小时进行质粒扩增。
(2)质粒提取与鉴定：收集培养好的大肠杆菌，采用质粒提取试剂盒(天根生化科技)提取质粒，采用T7和BGH通用引物进行质粒测序鉴定，测定质粒浓度，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测质粒带型。
(3)细胞培养：HEK293-APP695细胞系置于温箱中培养(温度37℃，5％CO2，湿度80％)，培养基为10％FBS(胎牛血清，Gibco)+DMEM，培养36h后铺6孔板准备转染。HEK293-APP695由首都医科大学教育部神经变性病重点实验室王晓民教授赠予；也可以参考现有技术[6,7]制备。
(4)细胞转染：采用脂质体转染法将pcDNA3.1+GFP空载体(MOCK组)、ZDHHC21野生型载体(WT组)、ZDHHC21突变型载体(R226Q组、T209S组)分别瞬时转染HEK293-APP695细胞。转染复合物，6孔板每孔转染质粒4μg，脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)8μl，转染48小时后收集细胞上清进行后续实验。
(5)ELISA实验：采用双抗夹心ELISA(Aβ1-40/Aβ1-42ELISA Kit，IBL)检测细胞上清中Aβ40、Aβ42浓度，每个样本设置三个复孔，按照试剂盒说明书进行实验操作，比较各组Aβ40、Aβ42浓度的差异。采用oneway ANOVA方法进行统计学分析，Tukey’s检验进行组间比较(P<0.05有统计学意义)。
3.实验结果
与WT组相比，转染ZDHHC21R226Q突变(图11A、图11B和图11C)和T209S突变(图11D、图11E和图11F)载体的细胞绿色荧光蛋白表达量基本一致，提示WT组和突变组转染效率基本一致。
与MOCK组相比，转染后WT组和R226Q组ZDHHC21基因的mRNA表达量都升高(图12A)，WT组和R226Q组表达量无统计学差异(P>0.05)；与MOCK组相比，转染后WT组和T209S组ZDHHC21基因的mRNA表达量都升高(图12B)，WT组和T209S组表达量无统计学差异(P>0.05)。上述结果提示WT组和突变组的转染效率一致。
与WT组相比，转染了ZDHHC21R226Q突变质粒的细胞上清Aβ40升高了1.44倍(P＝0.003)，Aβ42升高了1.69倍(P＝0.002)(图13A)；转染了ZDHHC21T209S突变质粒的细胞上清Aβ40升高了1.48倍(P＝0.005)，Aβ42升高了2.52倍(P＝0.001)(图13B)。
上述结果表明：ZDHHC21基因的两个突变都能够促进Aβ的生成，因此，这两个突变均能够促进或者导致阿尔茨海默病的发生。
实施例4：Weatern blot检测转染细胞中磷酸化tau(P-tau)以及总tau(T-tau)含 量的改变
1.实验目的
采用体外细胞模型验证在FAD家系中发现的2个ZDHHC21基因突变能否影响tau蛋白磷酸化。
T-tau指细胞内的总tau蛋白(total-tau，T-tau)，Tau蛋白由MAPT基因(Microtubule-associated protein tau)编码，功能为促进微管组装和维持微管蛋白骨架的稳定性。Tau蛋白过度磷酸化形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)，是AD病理的核心之一。
P-tau指发生磷酸化修饰的tau蛋白(phosphorylated tau，P-tau)。
检测T-tau和P-tau能够比较各组细胞的磷酸化tau蛋白水平是否发生变化。P-tau水平升高提示细胞内tau蛋白磷酸化增强，可能促进AD病理过程发展。
Tau蛋白的氨基酸序列如下(441aa)：
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL(SEQ ID NO:31)
人MAPT基因的编码框的碱基序列如下：(1326bp)
ATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAAGTGATGGAAGATCACGCTGGGACGTACGGGTTGGGGGACAGGAAAGATCAGGGGGGCTACACCATGCACCAAGACCAAGAGGGTGACACGGACGCTGGCCTGAAAGAATCTCCCCTGCAGACCCCCACTGAGGACGGATCTGAGGAACCGGGCTCTGAAACCTCTGATGCTAAGAGCACTCCAACAGCGGAAGATGTGACAGCACCCTTAGTGGATGAGGGAGCTCCCGGCAAGCAGGCTGCCGCGCAGCCCCACACGGAGATCCCAGAAGGAACCACAGCTGAAGAAGCAGGCATTGGAGACACCCCCAGCCTGGAAGACGAAGCTGCTGGTCACGTGACCCAAGCTCGCATGGTCAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCGATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATGGTAAAACGAAGATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAGGCCAACGCCACCAGGATTCCAGCAAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGTGAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCGGCAGCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTGGCAGTGGTCCGTACTCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGACAGCCCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAGAATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCTGAAGCACCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAGATAATTAATAAGAAGCTGGATCTTAGCAACGTCCAGTCCAAGTGTGGCTCAAAGGATAATATCAAACACGTCCCGGGAGGCGGCAGTGTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAGGTGGAAGTAAAATCTGAGAAGCTTGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGGTCCCTGGACAATATCACCCACGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCCGCGAGAACGCCAAAGCCAAGACAGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGCCAGTGGTGTCTGGGGACACGTCTCCACGGCATCTCAGCAATGTCTCCTCCACCGGCAGCATCGACATGGTAGACTCGCCCCAGCTCGCCACGCTAGCTGACGAGGTGTCTGCCTCCCTGGCCAAGCAGGGTTTGTGA(SEQ ID NO:32)
2.实验方法
(1)质粒构建：在pcDNA3.1质粒空载体基础上插入MAPT基因cDNA片段(通过提取人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞RNA，逆转录合成MAPT cDNA)构建pcDNA3.1+MAPT cDNA野生型质粒载体。
(2)质粒提取鉴定、细胞培养方法参照前面实施例3进行。
(3)采用脂质体转染法将pcDNA3.1+GFP空载体(MOCK组)、ZDHHC21野生型载体(WT组)、ZDHHC21突变型载体(R226Q组、T209S组)分别瞬时转染HEK293-APP695细胞制备转染复合物，6孔板每孔转染质粒4μg，每孔同时转染pcDNA3.1+MAPT野生型质粒4μg，脂质体(LipofectamineTM2000，Invitrogen)8μl，转染48小时后收集细胞进行后续实验。
(4)细胞总蛋白提取：采用RIPA裂解液(RIPA裂解液(强)，碧云天)+1ⅹ蛋白酶抑制剂(cOmplete，Roche)+1ⅹ磷酸化酶抑制剂(phosSTOP，Roche)裂解细胞，每孔细胞加入200μl，冰上裂解30min，12000rpm 4℃离心30min，收集上清于新的EP管。采用BCA法测定细胞总蛋白浓度。每管细胞加入5ⅹSDS-PAGE蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE Sample LoadingBuffer，5X，碧云天)50μl，置水浴锅中煮沸10min，-80℃冰箱保存。
(5)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blot)步骤如下：
①SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备：根据目的蛋白分子量，配制10％聚丙烯酰胺分离胶，4％聚丙烯酰胺浓缩胶。
②样品的处理及上样：从冰箱中取出样品，置水浴锅中水浴煮沸3－5min。用微量加样器取样品加入各个泳道，加样体积视不同组蛋白含量而定，以保证各组加样蛋白总量一致。蛋白上样总量为40μg。
③蛋白的电泳分离：加样后先用恒流(10mA/胶)电泳约30min，待溴酚蓝指示剂电泳至浓缩胶与分离胶交界处成以线状时，改为恒压(100V)电泳约60min至溴酚蓝到凝胶底部。电泳缓冲液为：50mM Tris-Cl(pH8.3)，250mM甘氨酸，0.1％SDS。
④电转移：将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至NC膜上，转移电流为276mA,转移时间为1h。转移缓冲液：25mM Tris-Cl(pH8.3),192mM甘氨酸，20％甲醇。
⑤免疫印迹显色(ECL法)：将NC膜用含5％脱脂奶粉的TBS封闭液于室温振荡封闭1h；取出NC膜，加入适当稀释的T-tau(稀释倍数1:250，ab80579,Abcam)和P-tau(AT8)(稀释倍数1:1000，MN1020,Pierce)，室温孵育2h或4℃过夜；TBST缓冲液(50mM Tris-Cl，pH7.4，100mM NaCl，0.2％Tween-20)洗膜3次，每次5min；根据抗体特性滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗小鼠二抗(稀释倍数1:5000)，室温孵育1h；TBST缓冲液洗膜3次，每次5min；准备工作液(将ECL试剂中增强液和稳定的过氧化酶溶液按1:1比例进行混合)；滴加工作液于NC膜上，室温反应30s－90s min；显色。
⑥采用Quantity one软件(Quantity one software，Bio-Rad)进行条带定量测量，采用oneway ANOVA方法进行统计学分析，Tukey’s检验进行组间比较(P<0.05有统计学意义)。
3.实验结果
实验结果：如图14A－图14E所示。
与WT组相比，转染了ZDHHC21R226Q突变和T209S突变质粒的细胞T-tau无明显变化(图14A、图14B和图14C)，P-tau分别升高1.32倍(P＝0.002)和2.36倍(P＝0.000)，(图14A、图14D和图14E)。
上述结果表明：ZDHHC21基因的两个突变都能够促进tau蛋白磷酸化，极有可能促进阿尔茨海默病的发生。
实施例5：ABE(Acyl-BiotinExchange，ABE)法检测转染细胞中APP和棕榈酰化APP (palmitoylatedamyloidprecursorprotein,pal-APP)含量的改变。
1.实验目的
采用体外细胞模型验证在FAD家系中发现的2个ZDHHC21基因突变能否影响APP棕榈酰化。
2.实验方法
(1)细胞总蛋白提取：用ZDHHC21R226Q突变和T209S突变转染HEK293-APP695细胞，48小时后收集细胞，采用裂解液LB(lysis buffer，50mM Tris-Cl，150mM NaCl,5mM EDTA，pH7.45)+2％Triton-X100+1ⅹ蛋白酶抑制剂(cOmplete，Roche)+10mM NEM(N-乙基马来酰亚胺，N-Ethylmaleimide)裂解细胞，每孔细胞加入200μl，冰上裂解30min，12000rpm 4℃离心30min，收集上清于新的EP管。采用BCA法测定细胞总蛋白浓度。
(2)甲醇-氯仿沉淀蛋白
取100μl上清加入600μl甲醇，涡旋振荡混匀，加入150μl氯仿，涡旋振荡混匀，加入450μl双蒸水，涡旋振荡混匀。14000rpm离心10min，吸去上层液体，加入450μl甲醇，上下温和翻转混匀，使蛋白层沉入管底。14000rpm离心15min，吸去上层液体，静置晾干3－5min。
(3)每管蛋白加入150μl 4％SDS buffer(4％SDS，50mM Tris-Cl，5mM EDTA，pH7.4)+10mM NEM，37℃水浴锅水浴15－20min，使蛋白充分溶解。加入450μl LB+0.2％Triton-X100+1ⅹ蛋白酶抑制剂+1mM NEM，4℃摇床震荡24h。
(4)甲醇-氯仿沉淀蛋白，重复3次。
(5)每管蛋白加入240μl 4％SDS buffer(4％SDS，50mM Tris-Cl，5mM EDTA，pH7.4)，37℃水浴锅水浴15－20min，使蛋白充分溶解。加入960μl HA buffer(0.7M羟胺(hydroxylamine)，0.3mM HPDP–biotin,0.2％Triton X-100,pH7.4)+1ⅹ蛋白酶抑制剂,室温摇床震荡1h。
(6)甲醇-氯仿沉淀蛋白，重复3次。
(7)每管蛋白加入60μl 2％SDS buffer(2％SDS，50mM Tris-Cl，5mM EDTA，pH7.4)，37℃水浴锅水浴15－20min，使蛋白充分溶解。加入1140μl LB+0.2％Triton-X100+1ⅹ蛋白酶抑制剂，室温摇床震荡30min。14000rpm离心15min。
(8)将上清移入含有15μl链霉亲和素-琼脂糖珠(streptavidin–agarose beads)的EP管中(加入之前链霉亲和素-琼脂糖珠需要预平衡),震荡混匀，室温摇床震荡90min。预平衡方法：15μl链霉亲和素-琼脂糖珠加入300μl 0.1％SDS buffer(0.1％SDS，50mM Tris-Cl，5mM EDTA，0.2％Triton X-100，pH7.4)，震荡混匀，14000rpm离心3min，吸去上清液。重复3次。
(9)14000rpm离心5min，吸去上清液。加入1ml 0.1％SDS buffer，14000rpm离心5min，吸去上清液。重复4次。
(10)加入80μl 0.1％SDS buffer+1％β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)，震荡混匀，37℃水浴锅水浴15－20min，加入5ⅹSDS-PAGE蛋白上样缓冲液20μl，置水浴锅中煮沸5min，-80℃冰箱保存。
(11)SDS-PAGE和Western blot检测pal-APP含量，步骤同前。SDS-PAGE前蛋白样本需14000rpm离心3min。
(12)另取100μl样本检测APP含量。SDS-PAGE和Western blot步骤同前。APP一抗稀释倍数1:5000(1:5000，ab32136，Abcam)。
3.实验结果
如图15A－图15E所示。
与WT组相比，转染了ZDHHC21R226Q突变和T209S突变质粒的细胞APP无明显变化(图15A、图15B和图15C)。转染了ZDHHC21R226Q突变质粒的细胞pal-APP无明显变化(P>0.05)，转染了T209S突变质粒的细胞pal-APP升高(P＝0.000)，(图15A、图15D和图15E)。
上述结果表明：ZDHHC21基因T209S突变能够促进APP的棕榈酰化，T209S突变可能通过促进APP棕榈酰化导致Aβ升高。
参考文献：
[1]Bhattacharyya R,Barren C,Kovacs DM.Palmitoylation of amyloidprecursor protein regulates amyloidogenic processing in lipid rafts.JNeurosci.2013Jul 3；33(27):11169-83.doi:10.1523/JNEUROSCI.4704-12.2013.
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尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 贾建平
<120> 阿尔茨海默病致病基因及其医药用途
<130> IDC160079
<160> 32
<170> PatentIn version 3.2
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atcccacatg gagaaaggga gttctgggaa ttatgtaaca agtgtaattt gatgagacca 300
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340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 32
<211> 1326
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
atggctgagc cccgccagga gttcgaagtg atggaagatc acgctgggac gtacgggttg 60
ggggacagga aagatcaggg gggctacacc atgcaccaag accaagaggg tgacacggac 120
gctggcctga aagaatctcc cctgcagacc cccactgagg acggatctga ggaaccgggc 180
tctgaaacct ctgatgctaa gagcactcca acagcggaag atgtgacagc acccttagtg 240
gatgagggag ctcccggcaa gcaggctgcc gcgcagcccc acacggagat cccagaagga 300
accacagctg aagaagcagg cattggagac acccccagcc tggaagacga agctgctggt 360
cacgtgaccc aagctcgcat ggtcagtaaa agcaaagacg ggactggaag cgatgacaaa 420
aaagccaagg gggctgatgg taaaacgaag atcgccacac cgcggggagc agcccctcca 480
ggccagaagg gccaggccaa cgccaccagg attccagcaa aaaccccgcc cgctccaaag 540
acaccaccca gctctggtga acctccaaaa tcaggggatc gcagcggcta cagcagcccc 600
ggctccccag gcactcccgg cagccgctcc cgcaccccgt cccttccaac cccacccacc 660
cgggagccca agaaggtggc agtggtccgt actccaccca agtcgccgtc ttccgccaag 720
agccgcctgc agacagcccc cgtgcccatg ccagacctga agaatgtcaa gtccaagatc 780
ggctccactg agaacctgaa gcaccagccg ggaggcggga aggtgcagat aattaataag 840
aagctggatc ttagcaacgt ccagtccaag tgtggctcaa aggataatat caaacacgtc 900
ccgggaggcg gcagtgtgca aatagtctac aaaccagttg acctgagcaa ggtgacctcc 960
aagtgtggct cattaggcaa catccatcat aaaccaggag gtggccaggt ggaagtaaaa 1020
tctgagaagc ttgacttcaa ggacagagtc cagtcgaaga ttgggtccct ggacaatatc 1080
acccacgtcc ctggcggagg aaataaaaag attgaaaccc acaagctgac cttccgcgag 1140
aacgccaaag ccaagacaga ccacggggcg gagatcgtgt acaagtcgcc agtggtgtct 1200
ggggacacgt ctccacggca tctcagcaat gtctcctcca ccggcagcat cgacatggta 1260
gactcgcccc agctcgccac gctagctgac gaggtgtctg cctccctggc caagcagggt 1320
ttgtga 1326

Claims (10)

1.一种分离的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示。
2.一种分离的核酸，其编码权利要求1所述的蛋白。
3.一种分离的核酸，其如SEQ ID NOs:5－8中任一序列所示。
4.一种核酸构建体，其含有权利要求2或3所述的核酸序列；优选地，所述核酸构建体为重组载体；优选地，所述重组载体为重组表达载体。
5.一种重组宿主细胞，其表达权利要求1所述的蛋白，或者含有权利要求2或3所述的核酸序列或者权利要求4所述的核酸构建体。
6.一种组合物，其含有权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的核酸序列、权利要求4所述的核酸构建体或者权利要求5所述的重组宿主细胞。
7.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的核酸序列、权利要求4所述的核酸构建体、权利要求5所述的重组宿主细胞或者权利要求6所述的组合物在制备治疗和/或预防和/或诊断阿尔茨海默病的药物中的用途；或者在制备降低Aβ水平的药物中的用途；或者在制备降低总tau蛋白磷酸化水平的药物中的用途；或者在制备降低APP棕榈酰化水平的药物中的用途；或者在制备筛选药物的模型例如细胞模型或者动物模型中的用途，所述药物用于治疗和/或预防和/或诊断阿尔茨海默病；
优选地，所述阿尔茨海默病为家族性阿尔茨海默病；
优选地，所述，所述Aβ为Aβ40和/或Aβ42。
8.单克隆抗体或其抗原结合片段，其能够特异性地结合权利要求1所述的蛋白。
9.偶联物，其包括权利要求8所述的单克隆抗体或其抗原结合片段以及偶联部分，其中，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
10.试剂盒，其包括权利要求8所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包括权利要求9所述的偶联物；
优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
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