CN113957095A - 一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的构建方法及其核酸组合物和应用 - Google Patents
一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的构建方法及其核酸组合物和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的构建方法及其核酸组合物和应用，涉及基因工程技术领域。本发明通过在目标动物基因组中插入并在脑区特定表达Thy1‑hAPP Swedish、Indiana和Thy1‑hPSEN1 M146V、L286V，获得了一种可稳定遗传、具有自发的阿尔茨海默症(AD)经典表型的动物模型。该动物模型在1.5月龄即出现淀粉样蛋白沉积，且随年龄而增加，呈年龄依赖性。病理上伴随胶质细胞增生，出现时间皆早于常见的AD模型。此外，动物模型在产生大量Aβ沉积的基础上，5月龄即出现认知、记忆能力的减退，为AD相关基因的功能分析、疾病发病机制的研究以及药物研发提供了便利有效的途径。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的构建方法及其核酸组合物和应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又称老年痴呆症，是一种中枢神经系统退行性疾病。该病主要表现为渐进性认知障碍、记忆障碍及语言障碍等神经精神症状，严重影响患者生活质量。根据国际阿尔茨海默病协会发布的《2018世界阿尔茨海默病年度报告》数据显示，2018年全球有超过5000万AD患者，预计到2030年将达到7470万，到2050年将增加至1.315亿人。目前普遍认为中枢神经系统中神经细胞外的淀粉样斑块沉积和神经细胞内的纤维缠结是AD的代表病理特征，但由于阿尔茨海默病的病因及发病机制尚无明确，临床治疗药物仅能缓解部分临床症状，并不能够达到治愈效果。
据中国新药研发检测数据库显示，阿尔茨海默病的36个在研药物中，药物靶点主要为β-淀粉样蛋白、β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)，且多为抗体药物。但是人的蛋白与大鼠或小鼠的蛋白同源性差异较大，直接使用大鼠或小鼠进行药物药效测试，不能真实地反应抗体药物在人体内的药效情况。新药临床前评价多选用转基因动物模型，即将携带AD病人突变的基因序列转入小鼠体内，从而模拟AD疾病病理特征。目前已有成熟的双转基因APP/PS1小鼠(2xAD)和三转基因小鼠(3xTg)模型用于AD研究。APP/PS1小鼠在6月龄出现Aβ沉积，12月龄表现认知功能障碍，拖长了药效评价的时间窗口，不利于临床前药物的快速推进，限制了模型使用。3xTg模型是在含有PSEN1 M146V突变小鼠(原位基因敲入，纯合)的基础上，随机整合了鼠源Thy1启动子驱动人源APP cDNA(携带Swedish突变-KM670/671NL)和人源MAPT基因(携带P301L突变)，见图1。但是，3xTg小鼠症状进展为先出现认知障碍再出现脑部病理变化，不符合AD患者临床疾病进展过程。此外，由于现有的成熟AD模型均由科研机构捐赠给Jackson实验室，因此，需要获得捐赠人的许可且仅对非盈利机构(高校等科研院所)销售，这限制了研究人员尤其是AD医药研发企业对模型的使用。因此，急切需要一种合适的AD模型用于打破市场垄断，推进阿尔茨海默病发病机制研究及药物研发。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物及其方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物，其包括：用于介导第一外源基因和第二外源基因插入目标动物基因组并特定性地在所述目标动物脑区表达的打靶载体。其中，所述第一外源基因的序列包括：Thy1启动子、hAPP5’UTR以及突变型hAPP cDNA，所述突变型hAPP cDNA为携带Swedish突变、Indiana突变的hAPP cDNA。所述第二外源基因的序列包括：Thy1启动子以及突变型hPSEN1 cDNA，突变型hPSEN1 cDNA为携带PSEN1M146L与PSEN1 L286V突变的hPSEN1 cDNA。
第二方面，本发明实施例提供了一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒，所述试剂盒包括：如前述实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物。
第三方面，本发明实施例提供了一种重组细胞，其包括：如前述实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物中的打靶载体。
第四方面，本发明实施例提供了一种阿尔兹海默症动物模型的构建方法，其包括采用如前述实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物、或如前述实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒在目标动物的基因组中插入第一外源基因和第二外源基因。
第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物或如前述实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒在筛选用于预防或治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物在制备用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过基因编辑技术在目标动物基因组中插入并在脑区特定表达Thy1-hAPPSwedish、Indiana和Thy1-hPSEN1 M146V、L286V，获得了一种可稳定遗传、具有自发的阿尔茨海默症(AD)经典表型的动物模型FAD4T。本发明实施例构建获得的动物模型FAD4T在1.5月龄即出现淀粉样蛋白沉积，且随年龄而增加，即呈年龄依赖性，同时病理上伴随胶质细胞增生，且出现时间皆早于市场常见的AD模型。此外，动物模型FAD4T在产生大量Aβ沉积的基础上，5月龄即出现认知、记忆能力的减退，为AD相关基因的功能分析、疾病发病机制的研究以及药物研发提供了便利有效的途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为3xTg模型打靶载体示意图；
图2为5XFAD模型打靶载体示意图；
图3为Thy1-APP和Thy1-PSEN1打靶载体示意图；
图4为GPT000367-Thy1-first质粒图谱；
图5为GPT000368-Thy1-hAPP-TG-a质粒PCR鉴定跑胶图；
图6为GPT000368-Thy1-hAPP-TG-a质粒酶切鉴定跑胶图；
图7为GPT000368-Thy1-hAPP-TG-a质粒图谱；
图8为GPT000368-Thy1-hPSEN1-TG-b质粒PCR鉴定跑胶图；
图9为GPT000368-Thy1-hPSEN1-TG-b质粒酶切鉴定跑胶图；
图10为GPT000368-Thy1-hPSEN1-TG-b质粒图谱；
图11为Thy-hAPP/Thy-hPSEN1 Founder小鼠PCR鉴定跑胶图；
图12为1.5月龄FAD4T小鼠脑区Aβ斑块表达检测结果图；
图13为2-4月龄FAD4T小鼠脑区Aβ斑块表达检测结果图；其中，2mo对应2月龄，3mo对应3月龄，4mo对应4月龄；
图14为FAD4T小鼠脑区胶质细胞状态检测结果图；
图15为Morris水迷宫检测FAD4T小鼠空间学习记忆能力(A为小鼠在导航测试中，到达平台的逃逸延迟时间，B为小鼠穿越平台次数；C为小鼠首次到达平台所用时间)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物，其包括：用于介导第一外源基因和第二外源基因插入目标动物基因组并特定性地在所述目标动物脑区表达的打靶载体。
具体地，所述第一外源基因的序列包括：Thy1启动子、hAPP 5’UTR以及突变型hAPPcDNA，所述突变型hAPP cDNA为携带Swedish突变、Indiana突变的hAPP cDNA，可简写为Thy1-hAPP Swedish、Indiana。其中，“hAPP”是指人β淀粉样蛋白前体蛋白APP。
所述第二外源基因的序列包括：Thy1启动子以及突变型hPSEN1 cDNA，突变型hPSEN1cDNA为携带PSEN1 M146L与PSEN1 L286V突变的hPSEN1 cDNA，简写为Thy1-hPSEN1M146V、L286V。
hAPP Swedish、Indiana和hPSEN1 M146V、L286V的表达均受Thy1启动子调控，将第一外源基因和第二外源基因的序列通过基因编辑的方式随机导入目标动物基因组中，能够使得hAPP Swedish、Indiana和hPSEN1 M146V、L286V特定性地在目标动物大脑区域表达，从而获得一种可稳定遗传、具有自发的阿尔茨海默症经典表型的动物模型FAD4T。小鼠模型FAD4T在1.5月龄即出现淀粉样蛋白沉积，且随年龄而增加，即呈年龄依赖性，同时病理上伴随胶质细胞增生，且出现时间皆早于市场常见的AD模型。此外，FAD4T在产生大量Aβ沉积的基础上，5月龄即出现认知、记忆能力的减退，虽然与现有的5XFAD模型(图2)出现的学习能力障碍月龄类似，但是，FAD4TAβ沉积出现早于5XFAD模型，为AD药物研究以及给药治疗提供了更为有效快捷的途径。
具体地，β淀粉样蛋白前体蛋白APP蛋白主要以APP695，APP751，APP770三种形式存在(转录本不同导致氨基酸长度不同)，其中APP695(NM_201414)在神经元中显著性表达。Swedish突变(Swedish Mutation)也称为瑞典突变，优选为KM595/596NL，是指APP695中的第595位赖氨酸K突变为天门冬酰胺N，第596位蛋氨酸M突变为亮氨酸L，同K670N/M671L(是在APP770转录本上的突变)。突变后的蛋白构象变化使APP蛋白更容易被β分泌酶切割。所述Indiana突变为APP V642F，同APP V717F(是在APP770转录本上的突变)。
优选地，在所述第一外源基因的序列中，所述hAPP 5’UTR以及突变型hAPP cDNA位于Thy1启动子的下游，其表达受Thy1启动子驱动。
而PSEN1，又称为presenilin 1或早老素1，为14号染色体的基因。所述突变型hPSEN1 cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。优选地，在所述第二外源基因的序列中，所述突变型hPSEN1cDNA位于Thy1启动子的下游，其表达受Thy1启动子驱动。
在可选的实施方式中，介导第一外源基因和第二外源基因插入目标动物基因组并特定性地在所述目标动物脑区表达包括多种：(1)可以通过将含有第一外源基因和第二外源基因的打靶载体同时注射入受精卵中，移植入假孕雌性目标动物体内，获得F0代小鼠，从F0代小鼠中筛选具有第一外源基因和第二外源基因的小鼠作为AD动物模型，还可以将F0代的AD动物模型与背景鼠交配，获得AD动物模型。(2)可以将第一外源基因和第二外源基因分别注射入不同的受精卵中，获得APP突变的动物模型1和PSEN1突变的动物模型2，再通过将动物模型1和2相互交配，获得AD动物模型。将第一外源基因和第二外源基因插入目标动物基因组中的“插入”是指在目标动物基因组中添加整合和/或整合替换，插入的方式可以为随机插入或定点插入，优选为随机插入。随机插入增加了获得不同拷贝数小鼠的可能性，而AD模型需要过表达APP蛋白才有可能获得相应的表型，目前随机插入模型基因拷贝数约30，若将本文提到的打靶载体进行定点插入，最多获得拷贝数为2的小鼠，大概率无法获得AD表型小鼠。定点插入可以基于CRISPR/Cas9系统实施。“脑区”指大脑皮层、海马、嗅球、丘脑和小脑中的至少一种。
优选地，所述打靶载体包括打靶载体1和打靶载体2。其中，所述打靶载体1上包括所述第一外源基因，所述打靶载体2上包括所述第二外源基因。
构建打靶载体1时，包括将hAPP 5’UTR以及突变型hAPP cDNA插入Thy1序列中，5’端启动子的下游(exon2中)，形成打靶载体1，即打靶载体1的序列为Thy启动子-Thy 5’UTR-hAPP5’UTR以及突变型hAPP cDNA-Thy 3’UTR。在优选实施方式中，在Thy1序列中插入hAPP5’UTR以及突变型hAPP cDNA前，还包括敲除掉Thy1编码区的序列(如exon3和exon4)。
构建打靶载体2时，包括将突变型hPSEN1 cDNA插入Thy1序列中，5’端启动子的下游(exon2中)，形成打靶载体2，即打靶载体2的序列为Thy启动子-Thy 5’UTR-突变型hPSEN1cDNA-Thy 3’UTR。在优选实施方式中，在Thy1序列中插入突变型hPSEN1 cDNA前，还包括敲除掉Thy1编码区的序列(如exon3和exon4)。
优选地，所述打靶载体1的序列如SEQ ID No.3所示，所述打靶载体2的序列如SEQID No.4所示，通过将该设定下的打靶载体1～2同时注射入受精卵中，能够获得本发明所声称的AD动物模型。
本发明实施例还提供了一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒，所述试剂盒包括：如前述任意实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物。
在可选的实施方式中，所述试剂盒还可以包括：用于扩增hAPP CDS的引物对和/或用于扩增人PSEN1 CDS的引物对。
在可选的实施方式中，所述试剂盒还包括：用于扩增或鉴定所述第一外源基因和第二外源基因的引物对。
在可选的实施方式中，所述试剂盒还包括CRISPR/Cas组合物。所述CRISPR/Cas组合物包括：Cas蛋白、Cas mRNA、含Cas蛋白编码基因的表达盒的载体中的至少一种以及sgRNA。
本发明实施例还提供了一种重组细胞，其包括：如前述实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物中的打靶载体。
在可选的实施方式中，重组细胞包括但不限于大肠杆菌。本领域技术人员可以选择合适的宿主细胞转化上述打靶载体以便于存放或扩增上述打靶载体，无论选用何种宿主细胞其均是属于本发明的保护范围。
本发明实施例还提供了一种阿尔兹海默症动物模型的构建方法，其包括采用如前述实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物、或如前述实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒在目标动物的基因组中插入第一外源基因和第二外源基因。
可以理解的是，第一外源基因、第二外源基因以及将两个外源基因插入目标动物基因组的方法同前述任意对应的实施例所述，在此不再赘述。
优选地，所述目标动物包括小鼠和/或大鼠，优选为具有免疫缺陷的小鼠。
本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物或如前述任意实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒在筛选用于预防或治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
此外，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物在制备用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种用于构建阿尔茨海默症小鼠模型的构建方法包括：将hAPP 5‘UTR和突变型hAPP cDNA(携带Swedish和Indiana突变)与Thy1.2启动子(Thy1 exon2)连接，组成打靶载体1；将携带M146L、L286V突变的人源PSEN1 cDNA与Thy1.2启动子连接，组成打靶载体2。然后，将打靶载体1和打把载体2与同时注射到C57BL/6J胚胎内，获得FAD4T小鼠模型。具体步骤如下。
1.打靶载体Thy1-APP和Thy1-PSEN1的构建。
将携带Swedish突变、Indiana(V642F)突变的hAPP cDNA(包含APP 5’UTR)以及携带M146L、L286V突变的hPSEN1 cDNA分别克隆到Thy1启动子下游Exon2(外显子2)中，以获得打靶载体Thy1-APP(打靶载体1)和Thy1-PSEN1(打靶载体2)，见图3。
1.1打靶载体Thy1-APP的制备。
(1)以人源APP CDS为模板，使用表1所示引物扩增hAPP CDS目的片段，并回收备用。
表1.人源APP CDS片段扩增引物列表
(2)将GPT000368-hApp1、GPT000368-hApp2与GPT000367-Thy1-first(质粒图谱见图4)进行slic连接，感受态转化，涂板并在37℃培养箱中过夜培养。从平板中挑取单克隆培养，使用表2中引物对菌液进行PCR鉴定，PCR引物序列如表2所示，结果见图5。PCR鉴定获得的阳性克隆再进行酶切鉴定确认，鉴定结果参照表3和图6。鉴定正确的克隆命名为GPT000368-Thy1-hAPP-TG-a(图谱参照图7)。
表2.GPT000368-Thy1-hAPP-TG-a鉴定引物列表
表3.GPT000368-Thy1-hAPP-TG-a质粒酶切鉴定列表
(3)将鉴定正确的4#克隆进行测序确认，使用HpaI酶切GPT000368-Thy1-hAPP-TG-a，回收目的片段(9025bp)片段用于注射，命名为GPT000368-Thy1-hAPP-inj-a。
GPT000368-Thy1-hAPP-inj-a序列(打靶载体1)为(5’-3’)：
下划波浪线为Thy1序列，下划线序列为APP 5’UTR，斜体序列为APP-CDS，斜体下划线序列APP突变位点。
1.2打靶载体Thy1-PSEN1的制备。
(1)以人源PSEN1 CDS为模板，使用表4所示的引物用于扩增目的片段，并回收备用。
表4.人源PSEN1 CDS片段扩增引物列表
(2)将GPT000368-hPSEN1 1、GPT000368-hPSEN1 2、GPT000368-hPSEN1 3与GPT000367-Thy1-first进行slic连接，感受态转化、涂板培养、挑取单克隆并进行PCR鉴定、酶切鉴定，PCR引物序列表见表5，鉴定结果参照图8、图9和表6。鉴定正确的质粒命名为GPT000368-Thy1-hPSEN1-TG-b(见图10)。
表5.GPT000368-Thy1-hPSEN1-TG-b质粒鉴定引物列表
表6.GPT000368-Thy1-hPSEN1-TG-b质粒酶切鉴定列表
(3)将鉴定正确的3#克隆进行测序确认，使用HpaI酶切GPT000368-Thy1-hPSEN1-TG-b，回收目的片段(8194bp)片段用于注射，命名为GPT000368-Thy1-hPSEN1-inj-b。
GPT000368-Thy1-hPSEN1-inj-b序列(打靶载体2)如下(5’-3’)：
其中，波浪下划线为Thy1区域，直线下划线为Kozak序列，斜体字序列为人源PSEN1CDS，斜体字下划线序列为PSEN1突变位点。
1.3小鼠模型的制备。
将GPT000368-Thy1-hAPP-inj-a、GPT000368-Thy1-hPSEN1-inj-b组成注射体系，通过显微注射方式注射至C57BL/6J(B6J)小鼠0.5天的受精卵中，并将胚胎移植至0.5天假孕雌鼠体内。小鼠出生后，剪尾提取基因组，分别对Thy1-hAPP和Thy1-PSEN1进行鉴定，鉴定引物如表7-表8所示。
表7Thy1-hAPP基因PCR鉴定引物列表
表8Thy1-PSEN1基因PCR鉴定引物列表
鉴定结果见图12，经基因鉴定筛选出双阳性小鼠，命名为Thy-hAPP/Thy-hPSEN1。共获得Thy1-hAPP和Thy1-PSEN双阳性小鼠7只(Founder鼠)，小鼠编号分别为6#，7#，9#，10#，18#，25#，31#。以上Founder鼠与背景鼠回交获得F1，经筛选，选取7#小鼠的后代F1小鼠5#进行扩繁建系及后续实验验证(即line5，品系编号为T053302，小鼠名称简称为FAD4T)。
实施例2
2.阿尔茨海默症小鼠模型得病理检测。
2.1FAD4T小鼠(同实施例1)脑区Aβ斑块检测。
取不同周龄的FAD4T小鼠和WT小鼠脑，经脱水、包埋、切片后，进行免疫组化染色，检测小鼠脑区中Aβ斑块表达情况。结果如图12、图13显示：在1.5周龄的FAD4T小鼠脑中皮层区和海马区即可检测到Aβ斑块，且随着周龄增加，Aβ斑块逐渐在增多，即Aβ沉积增多呈年龄依赖性。Aβ斑块从最初的皮层、海马增至丘脑和嗅球区域，中脑出现少量Aβ斑块。
2.2FAD4T小鼠胶质细胞状态检测。
FAD4T小鼠和WT小鼠脑，经脱水、包埋、切片后，进行GFAP免疫荧光染色，检测小鼠脑区中胶质细胞状态。结果如图14显示：在2.5周龄的FAD4T小鼠脑中胶质细胞呈激活状态，7月龄FAD4T小鼠出现胶质细胞增生。
2.3小鼠行为学检测。
为了检测FAD4T小鼠在Morris水迷宫检测的学习记忆能力，小鼠依次进行定位航行实验(6天)、空间搜索实验，检测小鼠的学习能力与记忆能力(WT，n＝24；FAD4T，n＝39)。实验结果如图14和图15显示：与同窝对照小鼠相比，在定位航行实验中，5月龄FAD4T小鼠潜伏期明显高于同窝对照鼠，即FAD4T小鼠学习能力出现障碍。在空间搜索实验中，5月龄FAD4T小鼠首次到达平台时间明显延长，穿越平台次数显著下降，即FAD4T小鼠出现显著的记忆障碍。以上结果说明，5月龄FAD4T小鼠出现了明显的空间学习与记忆障碍。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏集萃药康生物科技股份有限公司
<120> 一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的构建方法及其核酸组合物和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2097
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccgccacca tgctgcccgg tttggcactg ctcctgctgg ccgcctggac ggctcgggcg 60
ctggaggtac ccactgatgg taatgctggc ctgctggctg aaccccagat tgccatgttc 120
tgtggcagac tgaacatgca catgaatgtc cagaatggga agtgggattc agatccatca 180
gggaccaaaa cctgcattga taccaaggaa ggcatcctgc agtattgcca agaagtctac 240
cctgaactgc agatcaccaa tgtggtagaa gccaaccaac cagtgaccat ccagaactgg 300
tgcaagcggg gccgcaagca gtgcaagacc catccccact ttgtgattcc ctaccgctgc 360
ttagttggtg agtttgtaag tgatgccctt ctcgttcctg acaagtgcaa attcttacac 420
caggagagga tggatgtttg cgaaactcat cttcactggc acaccgtcgc caaagagaca 480
tgcagtgaga agagtaccaa cttgcatgac tacggcatgt tgctgccctg cggaattgac 540
aagttccgag gggtagagtt tgtgtgttgc ccactggctg aagaaagtga caatgtggat 600
tctgctgatg cggaggagga tgactcggat gtctggtggg gcggagcaga cacagactat 660
gcagatggga gtgaagacaa agtagtagaa gtagcagagg aggaagaagt ggctgaggtg 720
gaagaagaag aagccgatga tgacgaggac gatgaggatg gtgatgaggt agaggaagag 780
gctgaggaac cctacgaaga agccacagag agaaccacca gcattgccac caccaccacc 840
accaccacag agtctgtgga agaggtggtt cgagttccta caacagcagc cagtacccct 900
gatgccgttg acaagtatct cgagacacct ggggatgaga atgaacatgc ccatttccag 960
aaagccaaag agaggcttga ggccaagcac cgagagagaa tgtcccaggt catgagagaa 1020
tgggaagagg cagaacgtca agcaaagaac ttgcctaaag ctgataagaa ggcagttatc 1080
cagcatttcc aggagaaagt ggaatctttg gaacaggaag cagccaacga gagacagcag 1140
ctggtggaga cacacatggc cagagtggaa gccatgctca atgaccgccg ccgcctggcc 1200
ctggagaact acatcaccgc tctgcaggct gttcctcctc ggcctcgtca cgtgttcaat 1260
atgctaaaga agtatgtccg cgcagaacag aaggacagac agcacaccct aaagcatttc 1320
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cacctccgtg tgatttatga gcgcatgaat cagtctctct ccctgctcta caacgtgcct 1440
gcagtggccg aggagattca ggatgaagtt gatgagctgc ttcagaaaga gcaaaactat 1500
tcagatgacg tcttggccaa catgattagt gaaccaagga tcagttacgg aaacgatgct 1560
ctcatgccat ctttgaccga aacgaaaacc accgtggagc tccttcccgt gaatggagag 1620
ttcagcctgg acgatctcca gccgtggcat tcttttgggg ctgactctgt gccagccaac 1680
acagaaaacg aagttgagcc tgttgatgcc cgccctgctg ccgaccgagg actgaccact 1740
cgaccaggtt ctgggttgac aaatatcaag acggaggaga tctctgaagt gaatctggat 1800
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catggtgtgg tggaggttga cgccgctgtc accccagagg agcgccacct gtccaagatg 2040
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<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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cctataacgt tgctgtggac tacattactg ttgcactcct gatctggaat tttggtgtgg 4740
tgggaatgat ttccattcac tggaaaggtc cacttcgact ccagcaggca tatctcatta 4800
tgattagtgc cctcatggcc ctggtgttta tcaagtacct ccctgaatgg actgcgtggc 4860
tcatcttggc tgtgatttca gtatatgatt tagtggctgt tttgtgtccg aaaggtccac 4920
ttcgtatgct ggttgaaaca gctcaggaga gaaatgaaac gctttttcca gctgtcattt 4980
actcctcaac aatggtgtgg ttggtgaata tggcagaagg agacccggaa gctcaaagga 5040
gagtatccaa aaattccaag tataatgcag aaagcacaga aagggagtca caagacactg 5100
ttgcagagaa tgatgatggc gggttcagtg aggaatggga agcccagagg gacagtcatc 5160
tagggcctca tcgctctaca cctgagtcac gagctgctgt ccaggaactt tccagcagta 5220
tcctcgctgg tgaagaccca gaggaaaggg gagtaaaact tggattggga gatttcattt 5280
tctacagtgt tctggttggt aaagcctcag caacagccag tggagactgg aacacaacca 5340
tagcctgttt cgtagccata ttaattggtt tgtgccttac attattactc cttgccattt 5400
tcaagaaagc attgccagct cttccaatct ccatcacctt tgggcttgtt ttctactttg 5460
ccacagatta tcttgtacag ccttttatgg accaattagc attccatcaa ttttatatct 5520
agtcgaggtc cttcctctgc agaggtcttg cttctcccgg tcagctgact ccctccccaa 5580
gtccttcaaa tatctcagaa catggggaga aacggggacc ttgtccctcc taaggaaccc 5640
cagtgctgca tgccatcatc ccccccaccc tcgcccccac ccccgccact tctccctcca 5700
tgcataccac tagctgtcat tttgtactct gtatttattc cagggctgct tctgattatt 5760
tagtttgttc tttccctgga gacctgttag aacataaggg cgtatggtgg gtaggggagg 5820
caggatatca gtccctgggg cgagttcctc cctgccaacc aagccagatg cctgaaagag 5880
atatggatga gggaagttgg actgtgcctg tacctggtac agtcatactc tgttgaaaga 5940
atcatcgggg aggggggggg gctcaagagg ggagagctct gctgagcctt tgtggaccat 6000
ccaatgagga tgagggctta gattctacca ggtcattctc agccaccaca cacaagcgct 6060
ctgccatcac tgaagaagcc ccctagggct cttgggccag ggcacactca gtaaagatgc 6120
aggttcagtc agggaatgat ggggaaaggg gtaggaggtg ggggagggat caccccctcc 6180
tctaaaacac gagcctgctg tctccaaagg cctctgcctg tagtgagggt ggcagaagaa 6240
gacaaggagc cagaactctg actccaggat ctaagtccgt gcaggaaggg gatcctagaa 6300
ccatctggtt ggacccagct taccaaggga gagcctttat tcttctttcc cttgcccctc 6360
tgtgccagcc cctcttgctg tccctgatcc cccagacagc gagagtcttg caacctgcct 6420
cttccaagac ctcctaatct caggggcagg cggtggagtg agatccggcg tgcacacttt 6480
ttggaagata gctttcccaa ggatcctctc ccccactggc agctctgcct gtcccatcac 6540
catgtataat accaccactg ctacagcatc tcaccgagga aagaaaactg cacaataaaa 6600
ccaagcctct ggagtgtgtc ctggtgtctg tctcttctgt gtcctggcgt ctgtctcttc 6660
tgtgttcttc caaggtcaga aacaaaaacc acacacttca acctggatgg ctcggctgag 6720
cacttctgtg tgcagaaggt ccaaccagac tctggggtac cccggccctc cctattccct 6780
tgcctcctgt ctcccgcttt ttatagctcc ctatgctggg cttctctgga gagtgaaatc 6840
tttgcccaaa tcaatgcgca ttctctctgc tgagtcatct ggcgacagca gttgagttca 6900
cccgccaaca catgggccca gctatgtagc cgaaccctgg ctctggaagt gccagggact 6960
ttgtgcataa gtatgtacca tgcccttttt tcacagtcct agctctgcag aagtgcagcc 7020
tgaaggcctg tctgctgaga ggacatgccc tggagccctg aaacaggcac agtgggagga 7080
ggaacggagg atgacaggca tcaggccctc agtccaaaag caaccacttg agaatgggct 7140
ggagtacgaa acatggggtc ccgtccctgg atccctcctc aaagagtaat aagtaaaata 7200
taaacaggta ccccaggccg ttctgggttt gggttgtaat gggatccatt tgcagagaac 7260
tattgagaca gcccagccgt actgtgacag gcaatgtggg ggaggaggtt gaatcacttg 7320
gtatttagca tgaatagaat aattccctga acatttttct taaacatcca tatctaaatt 7380
accaccactc gctcccagtc ttcctgcctt tgcgccagcc tcctgtctgg ccatgcctga 7440
agaaggctgg agaagccacc cacctcaggc catgacactg ccagccactt ggcaggtgca 7500
gccaaacctg agctgtccca gaaagggaca ttctcaagac ccaggcaccc tgatcagcac 7560
tgacttggag ctacaagtgt catgccagaa aagtctctaa gaaaaccttt tcagggaaaa 7620
gggggtgact caacaccggg caagtttggg aagccccacc cttcgagtga tggaagagca 7680
gataggaagc ctcagaagag agacaccggc acccaggtaa cgttcctcat gtggtctctg 7740
tcacactagg tgctcttccc tggacatctc cgtgaccaca ctctcagttc ttagggagat 7800
gcgggtgctc tctgaggcta tctcagagtt gcagattctg aggcctagag tgactacagt 7860
cagcctagga agccacagag gactgtggac caggagggca gaagaggaga agggaagaaa 7920
aaccatcaga taggacttgc aatgaaacta acccaagaca atcataatgc agacaggaat 7980
gttaaaggcg ttcagcagct ggccatgaca cccatctgtc cctctggcca agtcagcaag 8040
cctggaagac ctgggactcc tgcccatatg tcctaagctc cccacccacc cactcgttca 8100
ctgtccttat tctctctcta ccttcagcca cttagtttcc taccttaagt cctagaattg 8160
atcctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgat 8194
Claims (10)
1.一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物，其特征在于，其包括：用于介导第一外源基因和第二外源基因插入目标动物基因组并特定性地在所述目标动物脑区表达的打靶载体；
所述第一外源基因的序列包括：Thy1启动子、hAPP 5’UTR以及突变型hAPP cDNA，所述突变型hAPP cDNA为携带Swedish突变、Indiana突变的hAPP cDNA；
所述第二外源基因的序列包括：Thy1启动子以及突变型hPSEN1 cDNA，突变型hPSEN1cDNA为携带PSEN1 M146L与PSEN1 L286V突变的hPSEN1 cDNA。
2.根据权利要求1所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物，其特征在于，所述Swedish突变为APP KM595/596NL，所述Indiana突变为APP V642F；
优选地，所述突变型hAPP cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
优选地，在所述第一外源基因的序列中，所述hAPP 5’UTR以及突变型hAPP cDNA位于Thy1启动子的下游。
3.根据权利要求1所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物，其特征在于，所述突变型hPSEN1 cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
优选地，在所述第二外源基因的序列中，所述突变型hPSEN1 cDNA位于Thy1启动子的下游。
4.根据权利要求1～3任一项所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物，其特征在于，所述插入为随机插入和/或定点插入；
优选的，所述打靶载体包括打靶载体1和打靶载体2；所述打靶载体1上包括所述第一外源基因，所述打靶载体2上包括所述第二外源基因；
优选地，所述打靶载体1的序列如SEQ ID No.3所示，所述打靶载体2的序列如SEQ IDNo.4所示。
5.一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1～4任一项所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物。
6.一种重组细胞，其特征在于，其包括：如权利要求1～4任一项所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物中的打靶载体。
7.一种阿尔兹海默症动物模型的构建方法，其特征在于，其包括采用如权利要求1～4任一项所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物、或如权利要求5所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒在目标动物的基因组中插入第一外源基因和第二外源基因。
8.根据权利要求7所述的阿尔兹海默症动物模型的构建方法，其特征在于，所述插入为随机插入；
优选地，在目标动物的基因组中随机插入第一外源基因和第二外源基因的步骤包括：将注射有核酸组合物中打靶载体的受精卵移植入假孕雌性目标动物体内，筛选获得阿尔兹海默症动物模型；
优选地，所述目标动物包括小鼠和大鼠；
优选地，所述构建方法还包括：将阿尔兹海默症动物模型与背景鼠交配，获得阿尔兹海默症动物模型。
9.如权利要求1～4任一项所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物或如权利要求5所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒在筛选用于预防或治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
10.如权利要求1～4任一项所述的用于构建阿尔兹海默症动物模型的核酸组合物在制备用于构建阿尔兹海默症动物模型的试剂盒中的应用。
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