KR101917346B1 - Thrsp 과발현 형질전환 동물모델 및 이의 용도 - Google Patents
Thrsp 과발현 형질전환 동물모델 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101917346B1 KR101917346B1 KR1020170025742A KR20170025742A KR101917346B1 KR 101917346 B1 KR101917346 B1 KR 101917346B1 KR 1020170025742 A KR1020170025742 A KR 1020170025742A KR 20170025742 A KR20170025742 A KR 20170025742A KR 101917346 B1 KR101917346 B1 KR 101917346B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- thrsp
- adhd
- transgenic animal
- gene
- human transgenic
- Prior art date
Links
- 101150071549 Thrsp gene Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 title description 8
- 208000006096 Attention Deficit Disorder with Hyperactivity Diseases 0.000 claims abstract description 71
- 208000036864 Attention deficit/hyperactivity disease Diseases 0.000 claims abstract description 68
- 208000015802 attention deficit-hyperactivity disease Diseases 0.000 claims abstract description 66
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 55
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 42
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 101000802091 Homo sapiens Thyroid hormone-inducible hepatic protein Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102100034700 Thyroid hormone-inducible hepatic protein Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 20
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 13
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 claims description 11
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 claims description 11
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 10
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000012346 open field test Methods 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 abstract description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 35
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 101001073216 Homo sapiens Period circadian protein homolog 2 Proteins 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 102100035787 Period circadian protein homolog 2 Human genes 0.000 description 13
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 13
- 108010032953 Ataxin-7 Proteins 0.000 description 11
- 102000007368 Ataxin-7 Human genes 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 8
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 7
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 5
- 238000011632 ADHD animal model Methods 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101150074181 PER2 gene Proteins 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101710168705 Protamine-1 Proteins 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011699 spontaneously hypertensive rat Methods 0.000 description 2
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N (S)-amphetamine Chemical compound C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 206010002820 Antisocial behaviour Diseases 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 208000020925 Bipolar disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108091027757 Deoxyribozyme Proteins 0.000 description 1
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 description 1
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 1
- 206010013654 Drug abuse Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 206010021567 Impulsive behaviour Diseases 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- DUGOZIWVEXMGBE-UHFFFAOYSA-N Methylphenidate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C(=O)OC)C1CCCCN1 DUGOZIWVEXMGBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 206010039203 Road traffic accident Diseases 0.000 description 1
- 102100040435 Sperm protamine P1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229940025084 amphetamine Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 208000024823 antisocial personality disease Diseases 0.000 description 1
- 208000013404 behavioral symptom Diseases 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004578 fetal growth Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 201000003723 learning disability Diseases 0.000 description 1
- 230000006742 locomotor activity Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 208000024714 major depressive disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960001344 methylphenidate Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012806 monitoring device Methods 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 210000002442 prefrontal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000007879 vasectomy Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 Thrsp (Thyroid hormone responsive SPOT 14) 유전자를 과발현하는, 주의력 결핍 과잉행동장애 (ADHD) 질환 동물모델, 이의 제조방법 및 상기 동물모델을 이용한 주의력 결핍 과잉행동장애 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 Thrsp 과발현 형질전환 ADHD 동물은 과잉행동 증가, 집중력 및 주의력 감소, 충동성 증가 등 인간에서 ADHD (attention deficit / hyperactivity disorder)와 유사한 질환 조건을 제공함으로써, ADHD 질환 연구 및 치료제 개발에 적합한 동물 모델을 제공하여, 해당 질환의 연구 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 Thrsp 과발현 형질전환 ADHD 동물은 과잉행동 증가, 집중력 및 주의력 감소, 충동성 증가 등 인간에서 ADHD (attention deficit / hyperactivity disorder)와 유사한 질환 조건을 제공함으로써, ADHD 질환 연구 및 치료제 개발에 적합한 동물 모델을 제공하여, 해당 질환의 연구 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 Thrsp (Thyroid hormone responsive SPOT 14) 유전자를 과발현하는, 주의력 결핍 과잉행동장애 (ADHD) 질환 동물모델, 이의 제조방법 및 상기 동물모델을 이용한 주의력 결핍 과잉행동장애 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
주의력 결핍 과잉행동장애 (Attention Deficit Hyperactivity Disorder, ADHD)는 지속적인 주의력 결핍, 특정 자극에 대한 과도한 집중, 충동적 성향 등의 증상을 보이는 만성 발달 장애이다. 이러한 장애는 3 내지 10 %의 아동 및 1 내지 6 %의 성인에서 존재하며, 50 내지 66 %의 아동이 ADHD에 의해 영향을 받는 것으로 확인되었다.
ADHD 환자는 핵심 증상에 수반하는 학습장애, 품행장애, 우울증, 수면장애 등의 정신과적 장애를 동반하고, 불순종, 공격성, 반사회적인 행동을 보이기 때문에 사회적인 적응이 어렵고 양육 스트레스를 유발하여 가정과 사회에서 상호관계의 악순환을 유발한다. 뿐만 아니라 ADHD 환아는 주의가 산만하고 집중력의 지속성이 감소되어 있으므로, 교통사고 등 사고에 취약하며 공격적이고 반항적 행동을 보여 청소년 비행이나 약물남용을 유발할 수 있고 왕따 등의 사회적 문제와도 연결되어 있다. 또한, ADHD 증세가 있는 경우 정상적인 사회관계 정립 및 학습능력에도 문제를 드러내며 성인도 약물 중독 및 실행 능력 부족 등의 문제를 보이며 특히, 일반 성인에 비하여 흡연율이 높게 나타난다. ADHD는 성인기까지 지속되는 비율이 40 - 60 %로 직업 유지 및 결혼생활의 어려움을 겪을 수 있다. 이에 따라 환자 1 인당 평생 손실액이 1 억원, 부모의 작업 손실액이 1 조 6 천억원에 달하며, 대상질환의 규모 및 심각성, 개입효과가 소아청소년 질환 중 제1순위로 가장 높다. 이와 같은 높은 사회경제적 비용과 일생에 걸친 영향에도 불구하고 다른 주요정신질환인 우울증이나 정신분열병에 비해 ADHD에 대한 국가사회적 대책은 미흡한 실정이다. 이에, 기존에 ADHD 치료를 위해 메칠페니데이트, 암페타민, 아토목세틴 등 다수의 ADHD 치료제들이 개발되었으나, 보다 효과적인 치료제의 개발의 필요성이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다. 따라서, ADHD의 병리학적 기전을 연구하고 효과적인 치료제를 개발하기 위하여, ADHD와 임상적으로 유사한 동물모델의 개발은 학문적산업적 측면에서 상당히 중요하다고 할 수 있다.
ADHD 동물 모델의 설정에서 가장 어려운 점은 다양하게 발현되는 인간행동에 대하여 동등한 동물행동들을 모두 포함할 수 있게 하는 것으로, ADHD의 주된 증상군인 집중력 또는 주의력결핍, 충동성 및 과잉행동 그리고 수반되는 인지기능의 결손 등의 증상들이 확인될 필요가 있다. 이와 관련하여, 자발성고혈압 쥐 (Spontaneously Hypertensive Rat, 이하 SHR)은 지금까지 가장 많이 연구되고 있으나, 여러 연구에서 도파민성 및 노르에피네프린성 신경계에 문제가 있는 것으로 밝혀졌다. 위에 서술한 모델을 포함하여 ADHD 연구를 위해 유전자 조작 및 선택적 교배 방법에 의한 유전적 모델과 환경적 조작으로 인한 후천성 환경모델 등 약 23 종의 다양한 동물모델들이 개발되어 사용되고 있으나 ADHD 원인의 다양성과 마찬가지로 모든 조건을 완벽히 만족하는 동물 모델이 존재하지 않았다.
관련하여 본 발명자들은 ADHD 행동특성인 과잉 행동, 집중력 또는 주의력 결핍 및 충동 행동과 관련된 유전자 변화를 탐색하여, 전전뇌 피질에서 ADHD 주요 증상에 유의성 있는 증가 혹은 감소를 보이는 유전자들을 보고한 바 있다 (대한민국 등록특허 제10-1633998호). 이에, 상기 결과를 기반으로, 본 발명자들은 ADHD와 유사한 임상적 표현형을 가지는 동물모델을 제조하기 위해 예의 노력한 결과, Thrsp 유전자를 과발현하는 형질전환 동물이 과잉행동, 집중력 저하 및 충동성이 모두 나타나 ADHD 동물모델로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 Thrsp (Thyroid hormone responsive SPOT 14) 유전자를 과발현하도록 Thrsp 유전자로 형질전환되고, 주의력 결핍 과잉행동장애 (ADHD) 질환이 유발된, 비인간 형질전환 동물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 비인간 형질전환 동물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비인간 형질전환 동물을 이용한 주의력 결핍 과잉행동장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 Thrsp (Thyroid hormone responsive SPOT 14) 유전자의 과발현이 ADHD 증상과 관련이 있음을 확인하고, Thrsp 과발현 형질전환 동물 모델을 개발하여 ADHD 유사 행동 증상을 확인함으로써 임상적으로 다양한 ADHD 관련 증상을 수반하는 신규 ADHD 동물모델을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, Thrsp (Thyroid hormone responsive SPOT 14) 유전자를 과발현하도록 Thrsp 유전자로 형질전환되고, 주의력 결핍 과잉행동장애 (ADHD) 질환이 유발된, 비인간 형질전환 동물이다.
본 발명에 있어서, Thrsp 유전자는 마우스의 경우 7 번 염색체에 존재하는 EntrezGene ID 번호가 21835인 유전자이며, 마우스의 Thrsp 유전자에 대한 cDNA는 GenBank accession number NM_009381로 알려져 있다. 인간의 경우에는 염색체 11 번에 존재하며 EntrezGene ID 번호는 7069로 알려져 있다. 상기 언급된 레퍼런스의 서열은 모두 본 명세서에 참조로 포함되며, 상기 Thrsp 유전자는 구체적으로 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 알려진 Thrsp 유전자 서열은 모두 본 발명에서 언급하는 Thrsp에 포함될 수 있다.
본 발명에서 주의력 결핍 과잉행동장애 질환 (Attention defict/hyperactivity, ADHD)은 품행장애, 반항성장애, 주요우울장애, 불안장애, 양극성장애, 학습장애 및 약물 남용 등을 포함하는 지속적으로 주의력이 부족하여 산만하고 과다활동, 충동성을 보이는 상태를 말한다.
본 발명에서 용어, “형질전환 동물”은 유전자를 재조합하여 이를 동물의 염색체 상에 인공적으로 삽입시킴으로써 그 형질의 일부가 변화된 동물을 의미하며, 동물의 종류는 자연계의 포유류라면 제한 없이 생산 가능하다. 바람직하게 상기 동물은 인간을 제외한 것일 수 있다.
상기와 같이 제조된 형질전환 동물은 체내에서 Thrsp의 발현량이 크게 증가할 수 있다. 바람직하게, Neuronal 특이적 발현 프로모터를 사용하여 장기 중 뇌 및/또는 신경 조직에 특이적으로 Thrsp 발현량이 크게 증가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 발현은 mRNA 수준뿐만 아니라 단백질 수준 모두에서 높은 발현 양상을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환 동물은 Thrsp 단백질을 코딩하는 ORF (open reading frame)를 포함하며, 단백질의 동일한 유형 내 서열변이가 나타내는 ORF도 본 발명의 범주에 포함된다. 이들 서열을 포함하는 발현 벡터 등의 주입 등을 통해 형질전환됨으로써 주의력 결핍 과잉행동장애 (ADHD) 질환이 유발된 동물이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 Thrsp 단백질을 과발현하도록 하는 Thrsp 유전자의 ORF는 서열번호 2의 염기서열을 가지나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이와 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 또는 99 % 이상의 상동성을 가지면서 이와 동일한 기능을 하는 단백질을 코딩하는 ORF의 경우에도 모두 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 Thrsp 유전자가 형질전환 동물 개체에서 과발현되는 경우 (즉, 정상 대조군과 대비하여 Thrsp 형질전환에 의해 Thrsp의 mRNA 및/또는 단백질 발현 수준이 증가하는 경우), 예컨대 과잉행동 증가, 집중력 또는 주의력 감소, 및 충동성 증가 등의 증상을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 용어, “벡터”란 상기 벡터가 도입된 세포에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 벡터 내 도입된 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 특히 본 발명에서 상기 벡터는 Thrsp 유전자를 포함하는 발현 벡터이며, 상기 발현 벡터를 이용하여 이를 수정란 등에 도입함으로써, 형질전환된 수정란 등을 제조할 수 있다. 즉, 형질전환 동물의 제조를 위해 본 발명에 따른 Thrsp 단백질을 코딩하는 염기서열을 적합한 유전자 운반체 (gene carrier)에 탑재시켜 수정란 등의 형질전환에 이용할 수 있다.
상기 발현 벡터에서, Thrsp 단백질을 코딩하는 염기 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, “작동 가능하게 연결”되었다는 것은 핵산 발현 조절 서열 (예컨대, 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사 조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 프로모터는 당업계에서 통상적으로 사용되는 발현벡터를 제조하기 위한 프로모터 서열을 제한 없이 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 프로모터는 예컨대, CMV 프로모터, NSE (neuron-specific enolase) 프로모터, SP6 프로모터, T3 프로모터, 또는 T7 프로모터 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 프로모터 서열이 제한되는 것은 아니다. 당업자는 필요에 따라 조직 특이적으로 발현시키기 위한 특정 프로모터를 사용할 수 있다. 바람직하게, 신경 특이적 프로모터로 NSE 프로모터를 사용함으로서 뇌 및 신경 특이적으로 Thrsp의 발현을 크게 증가시킬 수 있다. 상기 NSE 프로모터는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 바람직하게 본 발명의 폴리아데닐화 서열은 통상적으로 사용되는 폴리아데닐화 서열, 예를 들면 SV40 폴리 아데닐화 서열, 인간 성장호르몬 폴리아데닐화 서열, 마우스 프로타민-1 유전자 폴리아데닐화 서열 (protamine-1 poly A signal), 라지 T 항원 폴리 A 영역 (large T antigen poly A region)으로부터 유래된 폴리아데닐화 서열, 토끼 β-글로빈 (β-globin)으로부터 유래된 폴리아데닐화 서열 또는 소태아 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 등이 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 벡터는, 단백질 분리 정제 또는 확인용 태그 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 태그 서열의 예로는 GFP, GST (glutathione S-transferase)-tag, HA, His-tag, Myc-tag, T7-tag, Flag-tag 등이 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 태그 서열이 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 이용될 수 있는 발현 벡터 백본은 당업계에 공지된 것으로 Thrsp 유전자의 발현에 적합한 다양한 벡터로부터 필요에 따라 선택할 수 있다. 예를 들어, pHY92 벡터, pRC CMV 벡터, pIRES2-EGFP 발현벡터, SV40 벡터, 파필로마 바이러스 벡터, YIp5 벡터, YCp19 벡터, 엡스테인-바 바이러스 벡터, pMSG 벡터, pAV009/A+ 벡터, pMAMneo-5 벡터, 배큘로바이러스 pDSVE 벡터, pSecTag2B 벡터, pEGFP-N3 또는 yT&A 벡터가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게 본 발명에서 사용되는 발현 벡터 및 이의 제조에 대해서는 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 발현 벡터는 pEGFP-N3 벡터일 수 있으며, 상기 벡터는 CMV 프로모터 서열을 대신하여 NSE 프로모터 서열, mThrsp 및 선택적으로 tag 서열 (바람직하게 Flag-tag)을 포함한 벡터일 수 있다. 상기 제조된 Thrsp 발현 벡터는 제한효소로 필요 없는 부분을 잘라 선형 DNA 형태로 주입될 수 있고, 상기 Thrsp 발현 벡터는 서열번호 7의 염기서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 형질전환 동물의 제조는 당업계에 공지된 동물 형질전환 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면 WO 2005/089539; Nagy et al., Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1986, 1994, 2002); 및 Wang et al., (2005) Journal of Hepatology 43: 836844 등에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
통상적으로 상기 형질전환 동물은 외인성 유전자를 포함하는 표적 벡터를 수정란 또는 배아줄기세포 (Embryonic stem cell, ES 세포)에 미세주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등의 방법을 전달한다.
즉, 본 발명에 따른 Thrsp 유전자를 수정란 또는 배아줄기세포에 전달하고, 가임신된 동물을 준비한 후, 상기 수정란을 상기 가임신된 동물의 자궁에 이식한 다음 상기 수정란으로부터 새끼가 태어나도록 동물을 기르고, 자손을 수득하여 Thrsp 발현여부를 선별하는 단계를 수행하여 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환 동물에 사용되는 동물은 인간을 제외한 다양한 포유류를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 소, 돼지, 양, 토끼, 설치류 등이 사용될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 동물은 쥣과 (murine) 동물, 예를 들면 래트 (Mus musculus) 또는 마우스일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, (a) 프로모터 및 Thrsp (Thyroid hormone responsive SPOT 14)의 ORF (open reading frame)을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 제조한 발현 벡터를 수정란에 도입하는 단계; 및 (c) 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 수득하는 단계;를 포함하는 Thrsp 유전자를 과발현하도록 Thrsp 유전자로 형질전환되고, 주의력 결핍 과잉행동장애 (ADHD) 질환이 유발된, 비인간 형질전환 동물의 제조방법이다.
상기 (a) 단계의 벡터는 Thrsp의 ORF를 수득하고 상기 유전자를 증폭시킨 후, 벡터에 삽입함으로써 제조될 수 있다. Thrsp의 ORF는 cDNA 라이브러리로부터 클로닝하여 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서는 마우스의 뇌로부터 cDNA를 합성하고 이로부터 PCR을 통해 Thrsp의 ORF를 수득하였다.
상기 (b) 단계는 Thrsp의 ORF 발현에 필요한 부위를 제외한 벡터의 나머지 부분을 제거한 뒤 수정란에 도입되는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서는 AflIII 및 DrdI 효소로 벡터를 절단한 후, 약 3.2 kb의 선형 DNA (서열번호 7)를 마우스의 수정란에 도입하였다.
또한 상기 벡터의 수정란에 도입하는 방법은, 상술한 바와 같이 미세주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등의 방법을 제한 없이 이용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시양태에 따르면 미세주입법에 의해 수정란을 제조하였다.
마지막 단계로서, 상기와 같이 형질전환된 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 생산할 수 있다. 수정란으로부터 새끼가 태어나도록 동물을 기르고, 자손을 수득하여 Thrsp 발현여부에 따라 형질전환 동물을 선별할 수 있다.
상기와 같이 제조된 형질전환 동물은 Thrsp의 mRNA 및 단백질 발현량이 증가한 것으로, 과잉행동 증가, 집중력 또는 주의력 감소, 및 충동성 증가 등의 ADHD 질환의 증상이 나타날 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, (a) Thrsp (Thyroid hormone responsive SPOT 14) 유전자를 과발현하도록 Thrsp 유전자로 형질전환되고, 주의력 결핍 과잉행동장애 (ADHD) 질환이 유발된, 비인간 형질전환 동물에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 시험 물질 처리 후 비인간 형질전환 동물에서 주의력 결핍 과잉행동장애 질환의 경감 또는 치료 정도를 평가하는 단계;를 포함하는, 주의력 결핍 과잉행동장애 치료제의 스크리닝 방법이다.
본 발명에서 "치료" 또는 "경감"이란 시험 물질 또는 후보 물질의 투여로 ADHD 질환의 증세를 치료, 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 ADHD 치료용 후보 화합물 (또는 시험 물질)은 단일 화합물, 화합물들의 혼합물 (예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품 (예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme)이다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
ADHD 질환이 유발된 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, ADHD 동물 모델에 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여 또는 경피 투여 등의 방법이 포함될 수 있고, 사료 또는 음용수에 포함시켜 경구투여 형태로 섭식시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
ADHD 동물 모델에서 ADHD 질환의 경감 또는 치료 여부는 예를 들어, 과잉행동, 집중력, 주의력 및 충동성 등의 변화를 측정함으로써 평가할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 시험 물질이 ADHD 질환의 경감 또는 치료에 효과가 있는지 평가하기 위해서 대조군을 이용한 스크리닝이 함께 수행될 수 있다. 대조군이란 시험 물질 처리 후 유의한 변화를 관찰하기 적합한 동물 모델 실험군을 의미하는 것으로, 비형질전환 동물, 시험물질로 처리되지 않은 형질전환 동물모델, 기존의 알려진 ADHD 질환 치료제로 처리한 형질전환 동물모델, 다른 유전자 혹은 유도방법을 통해 ADHD 질환이 유발된 동물모델 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 측면에서 본 발명의 방법은 대조군 동물모델을 제조하는 단계, 대조군 샘플에 후보 화합물을 처리하는 단계 및 후보 화합물이 ADHD 질환 치료 또는 경감의 효과가 있는지를 대조군과 비교 평가하여 선정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 평가는 본 발명의 Thrsp 유전자를 과발현시킨 형질전환 동물모델에 대해 시험 물질을 처리한 경우의 과잉행동, 집중력, 주의력 및/또는 충동성을 시험 물질을 처리하지 않은 경우와 비교하여 유의적 변화가 있는 것인지를 평가하는 것일 수 있고, 혹은 Thrsp 유전자를 과발현시킨 형질전환 동물모델에 시험 물질을 처리하여 정상 대조군과 과잉행동, 집중력, 주의력 및/또는 충동성 수준이 유사해지는지 여부를 평가하는 것일 수 있다. 이를 통해 ADHD 질환 치료 또는 경감 효과를 보이는 경우 ADHD 질환의 치료제 후보 물질로 선별할 수 있다.
본 발명의 Thrsp 과발현 형질전환 ADHD 동물은 과잉행동 증가, 집중력 및 주의력 감소, 충동성 증가 등 인간에서 ADHD (attention deficit / hyperactivity disorder)와 유사한 질환 조건을 제공함으로써, ADHD 질환 연구 및 치료제 개발에 적합한 동물 모델을 제공하여, 해당 질환의 연구 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 Thrsp 과발현에 사용되는 발현 벡터 및 이의 제조에 대해서 기술한 모식도이다.
도 2는 Thrsp 과발현에 사용된 벡터의 구체적인 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 Thrsp 발현 벡터를 AflIII 및 DrdI으로 절단하여 약 3.2 kb 크기의 선형벡터가 제조된 것을 확인한 것이다.
도 4는 Thrsp 발현 벡터로 형질전환하여 제조된 형질전환 동물의 유전체 DNA로부터 형질전환 여부를 확인한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 Thrsp 과발현 형질전환 마우스에서 일반운동 활성시험에 의한 과잉행동 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스, 양성 대조군으로 Atxn7 과발현 형질전환 마우스를 사용하였다.
도 6은 본 발명에 따른 Thrsp 과발현 형질전환 마우스에서 Y-미로 시험에 의한 주의력 및 집중력 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스, 양성 대조군으로 Atxn7 과발현 형질전환 마우스를 사용하였다.
도 7은 본 발명에 따른 Thrsp 과발현 형질전환 마우스에서 상승된 십자미로 시험에 의한 충동성 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스, 양성 대조군으로 Atxn7 과발현 형질전환 마우스를 사용하였다.
도 8은 PER2 과발현에 사용되는 발현 벡터 및 이의 제조에 대해서 기술한 모식도이다.
도 9는 PER2 과발현 형질전환 마우스 (TG male)에서 일반운동 활성시험에 의한 과잉행동 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스를 사용하였다.
도 10은 PER2 과발현 형질전환 마우스 (TG male)에서 Y-미로 시험에 의한 주의력 및 집중력 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스를 사용하였다.
도 11은 PER2 과발현 형질전환 마우스 (TG male)에서 상승된 십자미로 시험에 의한 충동성 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스를 사용하였다.
도 2는 Thrsp 과발현에 사용된 벡터의 구체적인 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 Thrsp 발현 벡터를 AflIII 및 DrdI으로 절단하여 약 3.2 kb 크기의 선형벡터가 제조된 것을 확인한 것이다.
도 4는 Thrsp 발현 벡터로 형질전환하여 제조된 형질전환 동물의 유전체 DNA로부터 형질전환 여부를 확인한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 Thrsp 과발현 형질전환 마우스에서 일반운동 활성시험에 의한 과잉행동 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스, 양성 대조군으로 Atxn7 과발현 형질전환 마우스를 사용하였다.
도 6은 본 발명에 따른 Thrsp 과발현 형질전환 마우스에서 Y-미로 시험에 의한 주의력 및 집중력 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스, 양성 대조군으로 Atxn7 과발현 형질전환 마우스를 사용하였다.
도 7은 본 발명에 따른 Thrsp 과발현 형질전환 마우스에서 상승된 십자미로 시험에 의한 충동성 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스, 양성 대조군으로 Atxn7 과발현 형질전환 마우스를 사용하였다.
도 8은 PER2 과발현에 사용되는 발현 벡터 및 이의 제조에 대해서 기술한 모식도이다.
도 9는 PER2 과발현 형질전환 마우스 (TG male)에서 일반운동 활성시험에 의한 과잉행동 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스를 사용하였다.
도 10은 PER2 과발현 형질전환 마우스 (TG male)에서 Y-미로 시험에 의한 주의력 및 집중력 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스를 사용하였다.
도 11은 PER2 과발현 형질전환 마우스 (TG male)에서 상승된 십자미로 시험에 의한 충동성 평가 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군으로 비형질전환 마우스를 사용하였다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예
1:
Thrsp
(Thyroid hormone responsive SPOT 14) 또는
Atxn7
(
ataxin
7) 유전자 과발현 형질전환 동물모델 제작
본 발명자들은 기존에 ADHD의 주요 증상과 관련하여 모두 유의성 있는 증가를 보이는 유전자로 Atxn7, PER2, Thrsp 등을 보고한바 있다 (대한민국 등록특허 제10-1633998호). 이에, C57BL/6 마우스를 이용하여 Thrsp 또는 Atxn7 유전자 과발현 형질전환 동물을 제작하고 이들이 ADHD와 유사한 증상을 보이는지, 즉 ADHD에 대한 질병동물모델로서 사용될 수 있는지를 확인하고자 하였다. 상기 동물 모델을 제작하기 위해 다음과 같은 과정을 수행하였다.
1-1.
Thrsp
과발현 형질전환 마우스 제작
(1) Thrsp 과발현 벡터 제작
백본 벡터인 pEGFP-N3 벡터의 CMV 프로모터를 뉴런 특이적 프로모터인 NSE (neuron-specific enolase, 서열번호 1) 프로모터로 대체하였다. 일반형 생쥐의 뇌를 추출한 후 cDNA를 합성하고 합성된 cDNA에서 PCR을 통해 목표 유전자인 Thrsp의 ORF (open reading frame, 서열번호 2)를 확보하였다. 상기 PCR을 위해 다음의 프라이머를 사용하였다.
Thrsp-2F: 5'-CCA TGC AAG TGC TAA CGA AA-3' (서열번호 3)
Thrsp-2R: 5'-CAC TCA GAG GGA GAC GGA AG-3' (서열번호 4)
NSE 프로모터로 대체된 백본 벡터를 HindIII/NotI으로 자르고 상기 유전자 ORF를 벡터에 삽입하고 적합한 세포주 (E. coli)에 이식 후 카나마이신을 포함한 배양액에서 배양하여 상기 벡터를 다량 확보하였다 (도 1 및 도 2). 이후 마우스 신경모세포종 (neuroblastoma) 세포주인 NB41A3에 상기 벡터를 이식한 후 RT-PCR을 통하여 Thrsp의 mRNA가 과발현되는 것을 확인하였다. RT-PCT에는 다음의 프라이머를 사용하였다.
Thrsp-3F: 5'-CTC TGC GCC GAA GCT TAT GCA AGT GCT AAC GAA AC-3' (서열번호 5)
Thrsp-3R: 5'-TCT AGA GTC GCG GCC GCC TAC TTG TCA TCG TCA TCC TTG TAA TCC AGA ACC TGC CCT GTC AT-3' (서열번호 6)
(2) 형질 전환 마우스 제작
확보한 벡터는 AflIII/DrdI 효소로 필요 없는 부분을 잘라내고 선형 DNA (서열번호 7)로 만든 후 젤 추출법을 통하여 ~3.2 kb의 주입용 벡터를 준비하였다 (도 3). C57BL/6 암컷 마우스는 3 일 전에 PMSG (Pregnant mare's serum gonadotropin)를, 1 일 전에는 hCG (human chorionic gonadotropin)를 각각 복강 주사하여 과배란 상태를 유도한 후 임신시켰다. 임신이 된 암컷에서 난자를 채란하고 미세주입법을 수행하여 상기 제조한 주입용 벡터를 삽입하였다. 대리모 역할을 할 ICR 마우스는 정관 수술을 한 수컷 생쥐와 교배시켜 가임신을 유도한 다음, 상기 미세주입한 난자를 대리모에 이식하여 착상시켰다.
(3) Thrsp 과발현 마우스 확인
태어난 마우스가 3-4 주령이 되었을 때, 꼬리에서 조직을 조금 잘라 튜브에 담은 후 적절한 양의 용해 완충액과 proteinase K를 넣고 오븐에서 조직을 충분히 녹였다. phenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1)을 용해 완충액과 동일 부피로 추가하여 원심분리한 뒤, 그 상층액을 다시 동일 부피의 Chloroform을 추가해 섞어준 다음 다시 원심분리하였다. 이후, 이소프로판올, 70 % 에탄올을 이용한 유전체 DNA 추출 프로토콜을 통해 DNA를 추출하였다.
PCR을 통해 유전형질동물만 가지는 염기서열 부분을 포함한 특정 서열이 증폭된 것을 확인하고자 하였다. PCR은 94 5 min (94 1 min 56 1 min 72 1 min) x 35 cycles 72 10 min 4℃ 조건으로 수행하였고, 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.
Thrsp-1F: 5'- CAG GGA GCG GAA AGA-3' (서열번호 8)
Thrsp-1R: 5'- CAT ACC ACA TTT GTA GAG GT-3' (서열번호 9)
그 결과, Thrsp 과발현 마우스는 총 79마리 중 6마리에서 확인되었다 (도 4).
1-2.
Atxn7
과발현 형질전환 마우스 제작
본 발명자들은 상기 실시예 1-1.과 동일한 방식으로 Atxn7 과발현 형질전환 마우스를 제조하였다. 상기 마우스의 구체적인 제조방법은 대한민국 특허출원 제10-2015-0173576호에 개시되어 있으며, 본 명세서는 상기 특허출원 명세서에 기재된 내용을 참조로 모두 포함한다. 본 발명에서 Atx7 과발현 형질전환 마우스는 Thrsp 과발현 마우스에 대한 양성 대조군으로서 사용되었다.
실시예
2: 형질전환 동물모델의 행동 평가
Thrsp 또는 Atxn7 과발현 형질전환 마우스가 4 주령이 되었을 때 다음의 방법으로 행동평가를 수행하였다. 음성 대조군으로 동일 연령의 C57BL/6 생쥐를 이용하였다.
2-1. 과잉행동 평가: 일반 운동 활성 시험
ADHD의 대표적 증상 중 하나인 과잉행동을 평가하기 위하여 일반 운동 활성시험 (open field test) (Choi et al., 2008, Biomolecules & Therapeutics 16(2), 118-125)을 수행하였다. EthoVision system (Noldus IT b.v.: 행동 관찰 장치) 및 그 프로그램 셋트를 이용하여 실험을 수행하였으며, 해당 장치에서 10 분간 1 회 이상 생쥐를 적응시켰다.
시험 박스 중앙에 실험동물을 놓고 10 분간 행동 양상 관찰 및 분석하였다. 총 이동 거리 (Total movement distance) 및 이동시간 (movement duration)을 측정하였다. 실험결과 Thrsp 또는 Atxn7 과발현 형질전환 마우스는 대조군에 비해서 과잉행동 활성이 현저하게 증가하였다 (도 5).
2-2. 주의력 및 집중력 측정 (Y-미로 시험)
ADHD의 대표적 증상 중 하나인 주의력 및 집중력 감소를 평가하기 위하여, Thrsp 또는 Atxn7 과발현 형질전환 마우스에서 공간 지각력 및 비-특이적 집중력 검색을 수행하기 위한 Y-미로 시험을 수행하였다.
이 시험에 사용된 장치는 3 개의 가지로 구성되어 있다. 각 가지 (arm)는 길이 42 cm, 넓이 3 cm, 높이 12 cm이고 세 팔이 접하는 각도는 120 °이며, 모든 실험 장치는 검정색의 폴리비닐 플라스틱으로 구성되어 있다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 생쥐를 조심스럽게 놓고 8 분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 생쥐가 들어간 가지를 기록하였으며, 세 개의 다른 가지에 차례로 들어간 경우 1점 (실제 변경, actual alternation) 씩을 부여한 뒤, 하기 수학식 1로 그 변경 행동력을 계산하여 집중 정도를 평가하였다.
[수학식 1]
변경 행동력 (alternation)% = (변경의 수)x100 / (총 가지 진입-2)(total arm entries-2)
그 결과 Thrsp 과발현 형질전환 마우스는 대조군 보다 변경 행동력이 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 6). Atxn7 과발현 형질전환 마우스도 대조군 보다 변경 행동력이 다소 감소하긴 하였으나, Thrsp 과발현 마우스에서는 이러한 경향이 더욱 두드러지게 나타났다. 이는 Thrsp 과발현 형질전환 마우스의 주의력이 현저히 감소함을 나타낸다.
2-3. 충동성 평가 (
상승된
십자미로
)
ADHD의 대표적 증상 중 하나인 충동성을 평가하기 위하여 Thrsp 또는 Atxn7 과발현 형질전환 마우스에서 상승된 십자미로 실험을 수행하였다. 십자미로는 바닥에서 50 cm 높이에 2 개의 열린 가지(30 x 6 cm)와 2 개의 닫힌 가지(30 x 6 cm)로 이루어져 있으며 닫힌 가지의 벽은 20 cm 높이로 이루어져있다. 실험동물을 십자미로의 중심부에서 열린 가지 쪽을 바라보게 한 후 열린 가지에서 머문 시간을 5 분간 기록하였다.
그 결과, Atxn7 과발현 형질전환 마우스는 대조군 보다 열린가지에서 머문 시간이 감소하여 충동성의 증가가 확인되지 않았으나, Thrsp 과발현 형질전환 마우스는 대조군 보다 열린 가지에서 머문 시간이 증가하였다 (도 7). 이는 Thrsp 과발현 형질전환 마우스가 충동성이 증가하는 것을 나타낸다.
비교예
1:
PER2
과발현 형질전환 마우스의 제조
다음으로, 본 발명에서는 음성 대조군으로서 PER2 과발현 형질전환 마우스를 제조하였다. PER2 유전자는 Thrsp 및 Atxn7 유전자와 마찬가지로 ADHD와 상관관계가 있는 것으로 보고된 것이지만, PER2 유전자 과발현 마우스는 ADHD 동물모델로서 적합하지 않은 것으로 확인되었다. PER2 유전자 과발현 마우스는 PER2 유전자의 ORF를 사용하였다는 점을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 제조되었다 (도 8).
비교예
2:
PER2
과발현 형질전환 마우스의 행동평가
PER2 과발현 형질전환 마우스에 대하여, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 과잉행동, 집중력 저하 및 충동성을 평가하고 이를 야생형 마우스와 비교하였다. 그 결과, PER2 과발현 마우스는 과잉행동을 보였으나 (도 9), 집중력은 오히려 증가하였고 (도 10), 충동성에는 별 다른 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다 (도 11). 따라서, PER2 과발현 마우스는 PER2 유전자가 ADHD에서 유의적으로 증가하는 유전자임에도 불구하고 ADHD의 동물모델로는 적합하지 않은 것으로 판단되었다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명에 따른 Thrsp 과발현 형질전환 마우스는 과잉행동, 집중력 저하 및 충동성이 모두 나타나 상기 세 가지 증상이 모두 나타나는 경우에 적용할 수 있는 동물모델로서 매우 유용하게 사용될 수 있음이 확인되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Sahmyook University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> A transgenic animal model overexpressing Thrsp gene and a use
thereof
<130> P17-004-SYU
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1693
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NSE promoter
<400> 1
gctctgagct cctcctctgc tcgcccaatc cttccaaccc cctatggtgg tatggctgac 60
acagaaaatg tctgctcctg tatgggacat ttgcccctct tctccaaata taagacagga 120
tgaggcctag cttttgctgc tccaaagttt taaaagaaca cattgcacgg catttaggga 180
ctctaaaggg tggaggagga atgagggaat tgcatcatgc caaggctggt cctcatccat 240
cactgcttcc agggcccaga gtggcttcca ggaggtattc ttacaaagga agcccgatct 300
gtagctaaca ctcagagccc attttcctgc gttaacccct cccgacctca tatacaggag 360
taacatgatc agtgacctgg gggagctggc caaactgcgg gacctgccca agctgagggc 420
cttggtgctg ctggacaacc cctgtgccga tgagactgac taccgccagg aggccctggt 480
gcagatggca cacctagagc gcctagacaa agagtactat gaggacgagg accgggcaga 540
agctgaggag atccgacaga ggctgaagga ggaacaggag caagaactcg acccggacca 600
agacatggaa ccgtacctcc cgccaactta gtggctcctc tagcctgcag ggacagtaaa 660
ggtgatggca ggaaggcagc ccccggagtc aaaggctggg cacgcgggag gagaggccag 720
agtcagaggc tgcgggtatc tcagatatga aggaaagatg agagaggctc aggaagaggt 780
aagaaaagac acaagagacc agagaaggga gaagaattag agagggaggc agaggaccgc 840
tgtctctaca gacatagctg gtagagactg ggaggaaggg atgaaccctg agcgcatgaa 900
gggaaggagg tggctggtgg tatatggagg atgtagctgg ggccagggaa aagatcctgc 960
actaaaaatc tgaagctaaa aataacagga cacggggtgg agaggcgaaa ggagggcaga 1020
gtgaggcaga gagactgaga ggcctgggga tgtgggcatt ccggtagggc acacagttca 1080
cttgtcttct ctttttccag gaggccaaag atgctgacgt caagaactca taatacccca 1140
gtggggacca ccgcattcat agccctgtta caagaagtgg gagatgttcc tttttgtccc 1200
agactggaaa tccgttacat cccgaggctc aggttctgtg gtggtcatct ctgtgtggct 1260
tgttctgtgg gcctacctaa agtcctaagc acagctctca agcagatccg aggcgactaa 1320
gatgctagta ggggttgtct ggagagaaga gccgaggagg tgggctgtga tggatcagtt 1380
cagctttcaa ataaaaaggc gtttttatat tctgtgtcga gttcgtgaac ccctgtggtg 1440
ggcttctcca tctgtctggg ttagtacctg ccactatact ggaataaggg gacgcctgct 1500
tccctcgagt tggctggaca aggttatgag catccgtgta cttatggggt tgccagcttg 1560
gtcctggatc gcccgggccc ttcccccacc cgttcggttc cccaccacca cccgcgctcg 1620
tacgtgcgtc tccgcctgca gctcttgact catcggggcc cccgggtcac atgcgctcgc 1680
tcggctctat agg 1693
<210> 2
<211> 450
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrsp ORF
<400> 2
atgcaagtgc taacgaaacg ctatcccaag aactgcctgc tgacagtcat ggatcggtac 60
tccgcggtgg tgcggaacat ggagcaggtg gtgatgatcc ccagccttct gagggatgtg 120
cagctgagtg ggcctggggg ctcggtccag gacggagccc ctgatctcta tacctacttc 180
accatgctca agagcatctg tgtagaagtg gaccacgggc tgctgccaag ggaggaatgg 240
caggccaagg tggctggcaa cgaaaccagc gaggctgaga acgacgctgc tgaaacggag 300
gaggccgaag aagacaggat ctcggaggag ctggacctag aagcccagtt ccacctgcac 360
ttctgcagcc tccatcacat ccttacccac ctgacccgga aagcacagga ggtgacgcgg 420
aaataccagg aaatgacagg gcaggttctg 450
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrsp-2F
<400> 3
ccatgcaagt gctaacgaaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrsp-2R
<400> 4
cactcagagg gagacggaag 20
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrsp-3F
<400> 5
ctctgcgccg aagcttatgc aagtgctaac gaaac 35
<210> 6
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrsp-3R
<400> 6
tctagagtcg cggccgccta cttgtcatcg tcatccttgt aatccagaac ctgccctgtc 60
at 62
<210> 7
<211> 3297
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linear DNA for Thrsp
<400> 7
acatgttctt aattaaattt ttcaaaagta gttgacaatt aatcatcggc atagtatatc 60
ggcatagtat aatacgactc actataggag ggccatcatg gccaagttga ccagtgctgt 120
cccagtgctc acagccaggg atgtggctgg agctgttgag ttctggactg acaggttggg 180
gttctccaga gattttgtgg aggatgactt tgcaggtgtg gtcagagatg atgtcaccct 240
gttcatctca gcagtccagg accaggtggt gcctgacaac accctggctt gggtgtgggt 300
gagaggactg gatgagctgt atgctgagtg gagtgaggtg gtctccacca acttcaggga 360
tgccagtggc cctgccatga cagagattgg agagcagccc tgggggagag agtttgccct 420
gagagaccca gcaggcaact gtgtgcactt tgtggcagag gagcaggact gaggataaga 480
attgtaacaa aaaaccccgc cccggcgggg ttttttgtta attaacctgc agggcccact 540
agtagctctg agctcctcct ctgctcgccc aatccttcca accccctatg gtggtatggc 600
tgacacagaa aatgtctgct cctgtatggg acatttgccc ctcttctcca aatataagac 660
aggatgaggc ctagcttttg ctgctccaaa gttttaaaag aacacattgc acggcattta 720
gggactctaa agggtggagg aggaatgagg gaattgcatc atgccaaggc tggtcctcat 780
ccatcactgc ttccagggcc cagagtggct tccaggaggt attcttacaa aggaagcccg 840
atctgtagct aacactcaga gcccattttc ctgcgttaac ccctcccgac ctcatataca 900
ggagtaacat gatcagtgac ctgggggagc tggccaaact gcgggacctg cccaagctga 960
gggccttggt gctgctggac aacccctgtg ccgatgagac tgactaccgc caggaggccc 1020
tggtgcagat ggcacaccta gagcgcctag acaaagagta ctatgaggac gaggaccggg 1080
cagaagctga ggagatccga cagaggctga aggaggaaca ggagcaagaa ctcgacccgg 1140
accaagacat ggaaccgtac ctcccgccaa cttagtggct cctctagcct gcagggacag 1200
taaaggtgat ggcaggaagg cagcccccgg agtcaaaggc tgggcacgcg ggaggagagg 1260
ccagagtcag aggctgcggg tatctcagat atgaaggaaa gatgagagag gctcaggaag 1320
aggtaagaaa agacacaaga gaccagagaa gggagaagaa ttagagaggg aggcagagga 1380
ccgctgtctc tacagacata gctggtagag actgggagga agggatgaac cctgagcgca 1440
tgaagggaag gaggtggctg gtggtatatg gaggatgtag ctggggccag ggaaaagatc 1500
ctgcactaaa aatctgaagc taaaaataac aggacacggg gtggagaggc gaaaggaggg 1560
cagagtgagg cagagagact gagaggcctg gggatgtggg cattccggta gggcacacag 1620
ttcacttgtc ttctcttttt ccaggaggcc aaagatgctg acgtcaagaa ctcataatac 1680
cccagtgggg accaccgcat tcatagccct gttacaagaa gtgggagatg ttcctttttg 1740
tcccagactg gaaatccgtt acatcccgag gctcaggttc tgtggtggtc atctctgtgt 1800
ggcttgttct gtgggcctac ctaaagtcct aagcacagct ctcaagcaga tccgaggcga 1860
ctaagatgct agtaggggtt gtctggagag aagagccgag gaggtgggct gtgatggatc 1920
agttcagctt tcaaataaaa aggcgttttt atattctgtg tcgagttcgt gaacccctgt 1980
ggtgggcttc tccatctgtc tgggttagta cctgccacta tactggaata aggggacgcc 2040
tgcttccctc gagttggctg gacaaggtta tgagcatccg tgtacttatg gggttgccag 2100
cttggtcctg gatcgcccgg gcccttcccc cacccgttcg gttccccacc accacccgcg 2160
ctcgtacgtg cgtctccgcc tgcagctctt gactcatcgg ggcccccggg tcacatgcgc 2220
tcgctcggct ctataggcgc cgccccctgc ccaccccccg cccgcgctgg gagccgcagc 2280
cgccgccact cctgctctct ctgcgccgaa gcttcgaatt ccagggagcg gaaagaatgc 2340
aagtgctaac gaaacgctat cccaagaact gcctgctgac agtcatggat cggtactccg 2400
cggtggtgcg gaacatggag caggtggtga tgatccccag ccttctgagg gatgtgcagc 2460
tgagtgggcc tgggggctcg gtccaggacg gagcccctga tctctatacc tacttcacca 2520
tgctcaagag catctgtgta gaagtggacc acgggctgct gccaagggag gaatggcagg 2580
ccaaggtggc tggcaacgaa accagcgagg ctgagaacga cgctgctgaa acggaggagg 2640
ccgaagaaga caggatctcg gaggagctgg acctagaagc ccagttccac ctgcacttct 2700
gcagcctcca tcacatcctt acccacctga cccggaaagc acaggaggtg acgcggaaat 2760
accaggaaat gacagggcag gttctggatt acaaggatga cgatgacaag tgagaattct 2820
gcagtcgacg gtaccgcggg cccgggatcc atcgccacct aaagcggccg cgactctaga 2880
tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc 2940
tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag 3000
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 3060
cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaaggc gtaaattgta 3120
agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac 3180
caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg 3240
agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtc 3297
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrsp-1F
<400> 8
cagggagcgg aaaga 15
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thrsp-1R
<400> 9
cataccacat ttgtagaggt 20
Claims (14)
- Thrsp (Thyroid hormone responsive SPOT 14) 유전자를 과발현하도록 Thrsp 유전자로 형질전환되고, 주의력 결핍 과잉행동장애 (ADHD) 질환이 유발된, 비인간 형질전환 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 Thrsp 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 비인간 형질전환 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 비인간 형질전환 동물은 서열번호 7의 염기서열로 Thrsp 유전자를 과발현시킨 것인, 비인간 형질전환 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 비인간 형질전환 동물은 정상 대조군과 대비하여 과잉행동 증가, 집중력 저하, 및 충동성 증가로부터 선택되는 어느 하나 이상의 특성을 나타내는, 비인간 형질전환 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 비인간 형질전환 동물은 설치류인, 비인간 형질전환 동물.
- (a) 프로모터 및 Thrsp (Thyroid hormone responsive SPOT 14)의 ORF (open reading frame)을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 제조한 발현 벡터를 수정란에 도입하는 단계; 및
(c) 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 수득하는 단계;를 포함하는 Thrsp 유전자를 과발현하도록 Thrsp 유전자로 형질전환되고, 주의력 결핍 과잉행동장애 (ADHD) 질환이 유발된, 비인간 형질전환 동물의 제조 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 (a) 단계의 프로모터는 뉴런 특이적 프로모터인, 비인간 형질전환 동물의 제조 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 뉴런 특이적 프로모터는 서열번호 1의 NSE (neuron-specific enolase) 프로모터인, 비인간 형질전환 동물의 제조 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 (b) 단계의 수정란 도입단계는 미세주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 도입되는 것인, 비인간 형질전환 동물의 제조 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 (b) 단계의 수정란 도입단계는 서열번호 7의 염기서열이 도입되는 것인, 비인간 형질전환 동물의 제조 방법.
- (a) Thrsp (Thyroid hormone responsive SPOT 14) 유전자를 과발현하도록 Thrsp 유전자로 형질전환되고, 주의력 결핍 과잉행동장애 (ADHD) 질환이 유발된, 비인간 형질전환 동물에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 시험 물질 처리 후 비인간 형질전환 동물에서 주의력 결핍 과잉행동장애 질환의 경감 또는 치료 정도를 평가하는 단계;를 포함하는, 주의력 결핍 과잉행동장애 치료제의 스크리닝 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 (b) 단계의 질환의 경감 또는 치료 정도의 평가는 상기 비인간 형질전환 동물에 시험 물질의 처리 전후 과잉행동, 집중력, 및 충동성으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 특성 변화를 확인하는 것인, 주의력 결핍 과잉행동장애 치료제의 스크리닝 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 주의력 결핍 과잉행동장애 질환의 경감 또는 치료 정도의 평가는 대조군으로서 기존의 주의력 결핍 과잉행동장애 질환 치료제를 처리한 경우 또는 시험 물질로 치료하지 않은 경우와 비교하는 단계를 추가로 포함하여 수행되는, 주의력 결핍 과잉행동장애 치료제의 스크리닝 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 (b) 단계의 질환의 경감 또는 치료 정도의 평가는 일반 운동 활성시험 (open field test), Y-미로 시험 및 상승된 십자 미로 시험으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 수행하여 평가되는 것인, 주의력 결핍 과잉행동장애 치료제의 스크리닝 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170025742A KR101917346B1 (ko) | 2017-02-27 | 2017-02-27 | Thrsp 과발현 형질전환 동물모델 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170025742A KR101917346B1 (ko) | 2017-02-27 | 2017-02-27 | Thrsp 과발현 형질전환 동물모델 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180098935A KR20180098935A (ko) | 2018-09-05 |
| KR101917346B1 true KR101917346B1 (ko) | 2019-01-24 |
Family
ID=63594691
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170025742A KR101917346B1 (ko) | 2017-02-27 | 2017-02-27 | Thrsp 과발현 형질전환 동물모델 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101917346B1 (ko) |
-
2017
- 2017-02-27 KR KR1020170025742A patent/KR101917346B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Cell Tissue Res (2013) vol.354, pp.259-271. |
| Front Biol (Beijing). 2016 Jun, vol.11(3), pp.151-167. |
| Nature. 2013, vol.493, pp.226-230. |
| Stem Cell Reports. 2014, vol.3, pp.735-742. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180098935A (ko) | 2018-09-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3679403B2 (ja) | トランスジェニック動物 | |
| CN106282122B (zh) | 一种非人哺乳动物恐惧症或其相关疾病动物模型的建立方法及其用途 | |
| JPH06507782A (ja) | アルツハイマー病のアミロイド形成開症状を示すヒト以外の組換え哺乳動物 | |
| JP2007534323A (ja) | アルツハイマー病のトランスジェニックモデル及び種々の神経変性疾患の治療におけるその使用 | |
| JP4468429B2 (ja) | ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ２−サブユニットの調節配列及びこれをコードする配列を含むゲノムＤＮＡ断片、及びこれらの断片又は突然変異断片を用いて作製されたトランスジェニック動物 | |
| CN113957095A (zh) | 一种用于构建阿尔兹海默症动物模型的构建方法及其核酸组合物和应用 | |
| KR20010040330A (ko) | 유전자 변이동물 | |
| KR101917346B1 (ko) | Thrsp 과발현 형질전환 동물모델 및 이의 용도 | |
| WO2013088110A1 (en) | Annexin-a1 transgenic animals | |
| CN106282123B (zh) | 一种非人哺乳动物认知障碍或其相关疾病动物模型的建立方法及其用途 | |
| US5776762A (en) | Obesity associated genes | |
| KR102659588B1 (ko) | Gng8 유전자를 결손시킨 뇌신경발달장애 동물 모델 | |
| JP2006288387A (ja) | 気分障害又は関連障害による疾患症状を改善させる方法 | |
| KR100734815B1 (ko) | Ｈｔａｕ24 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스 및 그제조방법 | |
| Yamanaka | Animal models for neurodegenerative disorders | |
| WO2018012497A1 (ja) | 疾患モデル動物および疾患治療剤 | |
| JP5088786B2 (ja) | 変異型ｔｒｐｖ３遺伝子導入トランスジェニックマウス又はトランスジェニックラット | |
| JP2006320201A (ja) | 気分障害又は関連障害による疾患症状を改善させる方法 | |
| KR100635878B1 (ko) | ｈＮＣＴｍ 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스 | |
| JP3483552B2 (ja) | 新規時計遺伝子プロモーター | |
| JP5054519B2 (ja) | Ａｄａｍ１１遺伝子が破壊された非ヒト遺伝子破壊動物 | |
| CN114480491A (zh) | 一种grin2a基因突变认知障碍小鼠模型的构建和应用 | |
| US20040241683A1 (en) | Hsst and angiogenesis | |
| JP2006158397A (ja) | ｓｃａ２遺伝子の病原性変異体を発現するＦ０６６トランスジェニックマウス | |
| JP6078383B2 (ja) | トランスジェニック非ヒト哺乳動物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |