JP3483552B2 - 新規時計遺伝子プロモーター - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、体内時計遺伝子のプロモーター、前記プロ
モーター及びレポーター遺伝子を含むコンストラクト、
前記コンストラクトを含む細胞、前記コンストラクトを
組み込んだトランスジェニック動物、並びに体内時計遺
伝子の発現及び／または発現振動を制御する物質のスク
リーニング方法に関する。 背景技術 多くの生物が約２４時間の概日リズムを生みだす機構
を体内に有することが知られている（文献１）。哺乳類
において、概日リズム発振機構は、睡眠覚醒リズム、血
圧、体温、及び一部のホルモン分泌リズムを制御してい
る（文献２，文献３）。概日リズムに起因する疾患とし
て、睡眠覚醒リズム障害（DSPS、非２４時間行動）、季
節性うつ病、時差症候群（JET−LAG）、昼夜交代勤務労
働者における睡眠障害、痴呆老人にみられる夜間徘徊、
及びせん妄などが報告されている（文献４〜文献７）。
更に、社会問題となっている不登校又は不出社の一部
は、概日リズム障害に起因するとの報告がある（文献
８）。高齢化と社会構造のグローバル化が進むことによ
り、今後リズム障害患者の増加が予想されるが、確実な
リズム障害改善薬が存在しないのが実状である。一方、
早朝に５０００ルクス程度の光を数時間見続けることを
含む高照度光療法は、痴呆老人の夜間徘徊、せん妄、あ
るいはDSPSなどのリズム障害の症状に対し、良好な治療
療効果を示すとの報告がある（文献６，文献７，文献９
〜文献１２）。しかしながら、高ルクスの光源の前に長
時間にわたって拘束される高照度光療法は、患者とその
介護者にとって苦痛あるいは負担であることから、この
光療法を代替する薬剤への期待は高い。 組織破壊及び組織移植実験から、哺乳類のリズムセン
ターは視交叉上核（SCN）に存在することが１９７２年
に明らかにされた（文献１３，文献１４）。しかし、リ
ズム発振の分子メカニズムについては近年まで不明であ
った（文献１５）。一方、遺伝学的手法からショウジョ
ウバエのリズム変異体［ピリオド（Period）変異体］が
作出され、続いて、ショウジョウバエのピリオド遺伝子
がクローニングされた（文献１６，文献１７）。ショウ
ジョウバエにおいて、翻訳されたピリオドタンパク質
（PERIOD）は核内へ移行し、自身の発現転写を抑制する
こと（ネガティブフィードバック機構）によって、約２
４時間の発現振動が達成されており、これによって最終
的に概日リズム表現型（行動、羽化）が現われると考え
られている（文献１８，文献１９）。一方、哺乳類にお
いては、１９９７年に、ショウジョウバエピリオド遺伝
子のホモログとして、ヒト及びマウスのピリオド１遺伝
子（Period１；Per１）がそれぞれクローニングされた
（文献２０，文献２１）。その後、マウスのピリオド２
遺伝子（Period２；Per２）（文献２２，文献２３）及
びマウスのピリオド３遺伝子（Period３；Per３）（文
献２４，文献２５）がクローニングされた。この他、哺
乳類時計遺伝子として、マウスのクロック遺伝子（Cloc
k）（文献２６）及びマウスのビーマル１遺伝子（Bmal
１）（文献２７）が報告されている。このようにリズム
発振機構について、現在は分子レベルでの理解が可能で
ある。実際に、クロック遺伝子、ビーマル１遺伝子が時
計遺伝子の概日振動に重要であること（文献４４、文献
４５）、クロック遺伝子でコードされるタンパク質、ビ
ーマル１遺伝子でコードされるタンパク質は時計遺伝子
のCACGTG型E-boxに結合し、該時計遺伝子の転写を活性
化すること、即ち、クロック、ビーマル１による転写活
性化にはCACGTG型E-box配列が必須であること（文献２
７）が明らかにされている。 ２０００年に、マウスの時計遺伝子であるピリオド１
遺伝子（mPer１）の上流配列をルシフェラーゼ遺伝子に
つないだDNAをラットに導入したトランスジェニックラ
ット（mPer１：lucトランスジェニックラット）が報告
された（文献２８）。極微弱発光計数装置（フォトマ
ル）を用いてルシフェラーゼ活性をリアルタイムに測定
することで、視交叉上核のみならず、体の末梢組織でも
またピリオド１が発現振動していることが報告されてい
る（文献２８）。また、ピリオド１遺伝子の上流配列を
ルシフェラーゼ遺伝子につないだDNAをラットに導入し
たトランスジェニックマウス（mPer１：lucトランスジ
ェニックマウス）についても同様の結果が報告されてい
る（文献４３）。 ピリオド遺伝子の３つのホモログのうち、ピリオド２
遺伝子は人為的遺伝子変異マウスにおいて概日リズムが
消失することから、リズム発振に重要な役割を持つこと
が示唆されている（文献２９）。また、体内リズム疾患
の一つである睡眠相前進症候群（ASPS）を示す１家系の
原因はピリオド２遺伝子の点突然変異であることが報告
された（文献３０）。このようにピリオド２遺伝子は遺
伝子変異マウスがリズム異常を示すだけでなく、ヒトの
リズム疾患にも関与することまで証明された遺伝子であ
る。 ピリオド２遺伝子の上流領域に関する唯一の報告は、
マウス配列についてのＷＯ０１／０７６５４であり、当
該特許には、マウスのピリオド２転写制御配列と定義し
てDNA配列が記載され、Per２制御配列−レポーター遺伝
子を含む細胞を供給、試験化合物を導入、レポーター遺
伝子の転写をアッセイすることからなるピリオド２転写
阻害化合物を同定する方法について述べられている。し
かしながら、マウスピリオド２転写制御配列と記載され
ている前記DNA配列を現実に取得したという具体的な実
施例はなく、取得できるように記載されてもいない。ま
た、転写開始点を決定した、あるいは転写活性を測定し
たという具体的な実施例もない。更に、開示されたDNA
配列には塩基が特定できていない箇所があり、ピリオド
２遺伝子の上流配列に関する配列情報は具体的に開示さ
れていなかった。 なお、ピリオド１遺伝子上流配列の解析については数
々の報告があるが、ピリオド１とピリオド２は染色体上
の位置も異なり、共通する特徴的な配列もないので、ピ
リオド２プロモーター配列を推定する情報とはならなか
った。 体内時計遺伝子の発現を制御することを作用機序とす
る、リズム障害改善薬として有用な物質を得るためのス
クリーニングに用いるツール、及び、体内時計遺伝子の
発現を制御する物質のスクリーニング方法が待望されて
いる。 発明の開示 本発明者らは、鋭意研究を行った結果、ヒトピリオド
２遺伝子の転写活性を制御する領域であり、発現振動に
寄与する領域であるヒトピリオド２遺伝子プロモーター
配列を初めて決定し、前記プロモーター及びレポーター
遺伝子を含むコンストラクト、並びに前記コンストラク
トを含む細胞を取得した。また、マウスピリオド２遺伝
子プロモーター配列を決定し、前記プロモーター及びレ
ポーター遺伝子を含むコンストラクト、並びに前記コン
ストラクトを含む細胞を取得した。更に、前記コンスト
ラクトを組み込んだトランスジェニック動物を作製し
た。次いで、マウスに由来する本発明のピリオド２プロ
モーターにはCACGTG型E−box配列が含まれていないにも
関わらず、意外にも、マウスビーマル１遺伝子でコード
されるタンパク質とマウスクロック遺伝子でコードされ
るタンパク質とからなるヘテロダイマー（BMAL1/CLOCK
ヘテロダイマー）によりピリオド２遺伝子が転写活性化
および発現振動することを見出した。また、本遺伝子プ
ロモーター活性を簡便に検出することができる系を構築
した。この結果、ピリオド２遺伝子プロモーター、該プ
ロモーター及びレポーター遺伝子を含むコンストラク
ト、前記コンストラクトを含む細胞、並びに前記コンス
トラクトを組み込んだトランスジェニック動物を、体内
時計遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質で
あるリズム障害改善薬をスクリーニングするために有用
なツールとして提供し、また、簡便なリズム障害改善薬
スクリーニング方法を提供し、本発明を完成した。な
お、本明細書中、コンストラクトとは、目的となる機能
を有するようにDNAを組み合わせて構築したDNAからなる
構築物をいう。 ピリオド遺伝子のホモログの一つであるマウスピリオ
ド１遺伝子の第一エクソンの上流には５箇所のCACGTG型
E-boxが存在しており、基本転写活性領域は、これら５
箇所のCACGTG型E-boxを含まない第一エクソン周辺配列
と第一イントロン中のヒト・マウス間で保存されている
領域にある。BMAL1/CLOCKヘテロダイマーはCACGTG型E-b
oxに結合してマウスピリオド１遺伝子の転写を活性化す
るが、CACGTG型E-boxを含まない基本転写活性領域は、B
MAL1/CLOCKヘテロダイマーによる転写活性を殆んど増強
しない（文献２７）。また、マウスピリオド１遺伝子の
５箇所のCACGTG型E-boxに変異を入れると、基本転写活
性と同程度の転写活性になる（文献３４）。これらのこ
とから、BMAL1/CLOCKヘテロダイマーはCACGTG型E-boxを
介してマウスピリオド１遺伝子の転写活性化を引き起こ
すと考えられている。一方、ビーマル1ノックアウトマ
ウスでは、恒暗条件下でピリオド１及びピリオド２遺伝
子の概日振動が消失することが報告され（文献４４）、
クロック遺伝子のミュータントマウスは、恒暗条件下で
ピリオド１及びピリオド２遺伝子の概日振動が極度に減
弱することが報告されている（文献４５）。即ち、ビー
マル1及びクロックが振動に重要であることが明らかと
なっている。これらのことからすると、前記ＷＯ０１／
０７６５４でマウスのピリオド２転写制御配列と定義さ
れたDNA配列（即ち、本発明のDNA塩基配列である配列番
号１で表される塩基配列の第４４１５番目〜第７９３１
番目の塩基からなる配列の一部（第６０５０番目〜７７
６１番目）に相当するが、数箇所において配列が不一致
である配列）はCACGTG型E-boxを含んでいないため、単
なる基本転写活性領域を示しているにすぎない。また同
様にCACGTG型E-boxを含まない本発明のピリオド２遺伝
子のDNAが、BMAL1/CLOCKヘテロダイマーによる転写活性
増強を示すとは考えられず、更には、発現振動に寄与す
るとは予想もされなかった。しかしながら、意外にも、
CACGTG型E-boxを含まない本発明のDNAがBMAL1/CLOCKヘ
テロダイマーによる転写活性増強を示し、更には発現振
動に寄与すること、すなわち発現振動に必須な領域であ
ることを見出し、発現振動を測定する簡便な系を構築し
た。即ち、CACGTG型E-boxを含むマウスピリオド２遺伝
子配列（即ち本明細書のpCH1）よりも、本発明のピリオ
ド２プロモーターの方が高い活性を示したことから、本
発明のDNAを用いることにより、より検出の容易な系が
構築でき、より有用なリズム改善薬を得る方法を提供
し、本発明を完成した。 即ち本発明は、 [１]ベーサルのプロモーター活性を保持し、かつBMAL1/
CLOCKヘテロダイマーにより転写活性化されるプロモー
ター活性を示す、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）、又は（ｅ）に記載の塩基配列を含むDNA、 （ａ）配列番号１で表される塩基配列における第７４６
３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｂ）配列番号１で表される塩基配列における第６４１
７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｃ）配列番号１で表される塩基配列における第５２４
９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｄ）配列番号１で表される塩基配列における第４４１
５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｅ）配列番号２で表される塩基配列における第３８２
０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列。 [２] [１]の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は
（ｅ）に記載の塩基配列からなるDNA、 [３] [１]または[２]に記載のDNAとレポーター遺伝子と
を含むコンストラクト、 [４] [３]に記載のコンストラクトを含む細胞、 [５] [４]に記載の細胞と被検物質とを接触させる工
程、及び レポーター活性を測定する工程 を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現を制
御する物質のスクリーニング法、 [６] [３]に記載のコンストラクトを導入したトランス
ジェニック動物、 [７]前記動物がラットである[６]に記載のトランスジェ
ニック動物、 [８] [４]に記載の細胞、あるいは[６]または[７]に記
載のトランスジェニック動物の視交叉上核切片若しくは
末梢組織に被検物質を作用させる工程、及び 発現振動を測定する工程 を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現及び
／又は発現振動を制御する物質のスクリーニング法、 [９] [６]又は[７]に記載のトランスジェニック動物に
被検物質を投与し、前記動物の視交叉上核の発現振動を
測定する工程 を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現及び
／又は発現振動を制御する物質のスクリーニング法、 [１０]ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振動を制
御する物質が、リズム障害改善用である、[５]、[８]、
又は[９]のいずれか一項に記載のスクリーニング法 に関する。 図面の簡単な説明 図１は、マウスピリオド２遺伝子及びヒトピリオド２遺
伝子（hPer２）上流を比較した結果を示すグラフであ
る。 図２は、マウスとヒトとの間で高度に保存されている６
つの領域の塩基配列を示す説明図である。 図３は、マウスピリオド２遺伝子上流領域のベーサルの
プロモーター活性を示すグラフである。 図４は、マウスピリオド２遺伝子上流領域を含むベクタ
ーpCH3に対する、転写因子BMAL1/CLOCKヘテロダイマー
の作用を示すグラフである。 図５は、測定開始から１０日間にわたる視交叉上核切片
における自動発光測定の結果を示すグラフである。 図６は、図５に示すグラフを、縦軸方向にのみ拡大し、
その一部を示すグラフである。 図７は、測定開始から１０日間にわたる肝臓片における
自動発光測定の結果を示すグラフである。 図８は、測定開始から１０日間にわたる肺片における自
動発光測定の結果を示すグラフである。 図９は、測定開始から１０日間にわたる眼球における自
動発光測定の結果を示すグラフである。 図１０は、測定開始から４日間にわたるpCH3導入培養細
胞における自動発光測定の結果を示すグラフである。 図１１は、測定開始から５日間にわたるpTM15導入培養
細胞における自動発光測定の結果を示すグラフである。 図１２は、マウスピリオド２遺伝子上流領域のベーサル
活性、及び同領域を含むベクターに対する転写因子BMAL
1/CLOCKヘテロダイマーの作用を示すグラフである。 図１３は、測定開始から６日間にわたるpCH3-D3導入培
養細胞における自動発光測定の結果を示すグラフであ
る。 発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を詳細に説明する。 [本発明のDNA] 本発明のDNAは、（ａ）配列番号１で表される塩基配
列における第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基から
なる配列、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列におけ
る第６４１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配
列、（ｃ）配列番号１で表される塩基配列における第５
２４９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列における第４４１
５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、又は、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列における第３８２
０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列を含み、ピ
リオド２遺伝子プロモーター活性を示す。 本明細書において「ピリオド２遺伝子プロモーター活
性」とは、配列番号１で表される塩基配列における第４
４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列からな
るDNAとしてのベーサルのプロモーター活性が少なくと
も保持されており（すなわち、配列番号１で表される塩
基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基
からなる配列からなるDNAのベーサルなプロモータ活性
の少なくとも５０％の活性を有しており、好ましくはDN
Aのベーサルなプロモータ活性と実質的に同じである
か、あるいは、優れており）、しかも、BMAL1/CLOCKヘ
テロダイマーにより、転写活性化される（即ち発現振動
に寄与する）プロモーター活性を意味する。 ここで、「ベーサルのプロモーター活性」とは、何も
刺激しない状態で所定時間（例えば、４８時間）経過し
たときのプロモーター活性を意味し、「何も刺激しない
状態」とは、具体的には、実施例３に示すように、BMAL
1/CLOCKヘテロダイマー不在下の状態を意味する。ま
た、前記「BMAL1/CLOCKヘテロダイマー」は、ピリオド
１遺伝子、ピリオド２遺伝子、及びピリオド３遺伝子の
各転写を制御する転写因子である。 あるDNAが「ピリオド２遺伝子プロモーター活性」を
示すか否かの判定方法は、特に限定されるものではない
が、例えば、実施例３に示すように、BMAL1/CLOCKヘテ
ロダイマー不在下の状態でベーサルのプロモーター活性
を測定することにより、配列番号１で表される塩基配列
における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からな
る配列からなるDNAのプロモータ活性と実質的に同じで
あるか、あるいは、優れていることを確認し、更に、実
施例３に記載の条件下で、用量依存的なBMAL1/CLOCKヘ
テロダイマーによる転写活性化を示すか否かを確認する
ことにより、判定することができる。 本発明の好ましいDNAとしては、例えば、配列番号１
で表される塩基配列における第７４６３番目〜第７９３
１番目の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基
配列における第６４１７番目〜第７９３１番目の塩基か
らなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第
５２４９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、配
列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜
第７９３１番目の塩基からなる配列からなるDNA、又は
配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目
〜第６０６８番目の塩基からなる配列からなるDNAなど
を挙げることができるが、配列番号１で表される塩基配
列における第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基から
なる配列、配列番号１で表される塩基配列における第６
４１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、配列
番号１で表される塩基配列における第５２４９番目〜第
７９３１番目の塩基からなる配列、配列番号１で表され
る塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の
塩基からなる配列からなるDNA、又は配列番号２で表さ
れる塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目
の塩基からなる配列を含み、ピリオド２遺伝子プロモー
ター活性を示すDNAであれば本発明のDNAに含まれる。 配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番
目〜第７９３１番目の塩基からなる配列は、後述の実施
例１に示すように、マウスピリオド２の上流領域であ
り、また、後述の実施例３に示すように、ピリオド２遺
伝子プロモーター活性を示す。 配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番
目〜第６０６８番目の塩基からなる配列からなるDNA
は、後述の実施例１に示すように、ヒトピリオド２の上
流領域である。マウス遺伝子の実験結果（後述の実施例
１及び実施例３）から、マウスのプロモーター活性を示
したDNA（すなわち、配列番号１で表される塩基配列に
おける第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる
配列からなるDNA）は、ヒト／マウス間の７つの保存領
域の内、第一イントロン側の保存領域（ＩＶ、Ｖ、ＶＩ
及びＶＩＩ）を除いたDNAであることが判明した。従っ
て、ヒト／マウス間の７つの保存領域の内、第一イント
ロン側の保存領域（ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩ）を除い
たDNAに対応するヒトのDNA、すなわち、配列番号２で表
される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番
目の塩基からなる配列からなるDNAも、ピリオド２遺伝
子プロモーター活性を有すると考えられる。 本発明のDNAは、特に限定されるものではないが、例
えば、（１）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を利用す
ることにより、あるいは、（２）ファージライブラリー
をスクリーニングすることにより、調製することができ
る。 （１）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法 PCR法を利用して本発明のDNAを調製する場合には、ま
ず、配列番号１又は２で表される各塩基配列の情報に基
づいて、本発明のDNAを増幅することのできるプライマ
ーセットを設計する。 マウスピリオド２遺伝子プロモーターである、配列番
号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７
９３１番目の塩基からなる配列を含む本発明のDNAの場
合には、配列番号１で表される塩基配列の情報に基づい
て、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５
番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列を含むが、保
存領域ＩＶ（第８５３４番目）以降を含まないように、
増幅するプライマーセットを設計する。また、ヒトピリ
オド２遺伝子プロモーターである、配列番号２で表され
る塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の
塩基からなる配列を含む本発明のDNAの場合には、配列
番号２で表される塩基配列の情報に基づいて、配列番号
２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０
６８番目の塩基からなる配列を含むが、保存領域ＩＶ
（第６５３１番目）以降を含まないように、増幅するプ
ライマーセットを設計する。 設計した前記プライマーセットと、鋳型であるゲノム
DNAとを用いてPCRを実施することにより、本発明のDNA
を得ることができる。 （２）ファージライブラリースクリーニング法 ファージライブラリー（例えば、Maniatis, T.
ら，”Molecular Cloning−A Laboratory Manua
l”，Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982）
をスクリーニングすることにより本明のDNAを調製する
場合には、まず、配列番号１又は２で表される各塩基配
列の情報に基づいて、本発明のDNAを含むファージクロ
ーンをスクリーニングすることのできるプローブを設計
する。 マウスピリオド２遺伝子プロモーターである、配列番
号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７
９３１番目の塩基からなる配列を含む本発明のDNAの場
合には、配列番号１で表される塩基配列における第４４
１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列の情報に
基づいて、プローブを設計する。また、ヒトピリオド２
遺伝子プロモーターである、配列番号２で表される塩基
配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基か
らなる配列を含む本発明のDNAの場合には、配列番号２
で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６
８番目の塩基からなる配列の情報に基づいて、プローブ
を設計する。 設計した前記プローブを使用して、ファージライブラ
リーをスクリーニングすることにより、本発明のDNAを
含むファージクローンを得ることができる。得られたフ
ァージクローンを、適当な制限酵素で処理した後、適当
な精製手段（例えば、アガロースゲル電気泳動法）を用
いて所望のDNA断片を精製することにより、本発明のDNA
を得ることができる。 [本発明のコンストラクト及び細胞] 本発明のコンストラクトは、本発明のDNAとレポータ
ー遺伝子とを含む。前記レポーター遺伝子としては、細
胞内において遺伝子発現の指標として使用することので
きる公知のレポータータンパク質をコードする遺伝子を
用いることができる。前記レポータータンパク質として
は、例えば、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファ
ターゼ（SEAP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、
β−グルクロニダーゼ（GUS）、β−D−ガラクトシダー
ゼ、又はエクオリンなどを挙げることができる。本発明
のコンストラクトにおいては、レポーター遺伝子とし
て、ルシフェラーゼ遺伝子を用いることが好ましい。 本発明のコンストラクトでは、本発明のDNAの下流で
あって、しかも、本発明のDNAのプロモーター活性の調
節下にあるように、レポーター遺伝子を配置する限り、
本発明のDNA及びレポーター遺伝子の配置位置は限定さ
れるものではない。また、本発明のコンストラクトは、
本発明のDNAとレポーター遺伝子とを少なくとも含む限
り、特に限定されるものではないが、ベクター領域を更
に含むことが好ましい。 本発明のコンストラクトは、特に限定されるものでは
ないが、本発明のDNA及びレポーター遺伝子に加え、ベ
クター領域を更に含む本発明のコンストラクトは、例え
ば、本発明のDNAを適当なレポーターベクター（すなわ
ち、レポーター遺伝子を含むベクター）のマルチクロー
ニングサイトに導入することにより調製することができ
る。前記レポーターベクターとしては、例えば、ルシフ
ェラーゼをコードする遺伝子を含むベクターpGL３−bas
ic（プロメガ社）、SEAPをコードする遺伝子を含むベク
ターpSEP２−basicベクター（クロンテック社）、ある
いは、GFPの不安定型をコードする遺伝子を含むベクタ
ーpd１EGFP（クロンテック社）を挙げることができる。 より具体的には、PCR法を利用して得られた本発明のD
NAを、レポーターベクターのマルチクローニングサイト
に導入することにより、本発明のコンストラクトを調製
することができる。 あるいは、ファージライブラリーをスクリーニングす
ることにより得られたファージクローンを、適当な制限
酵素で処理した後、適当な精製手段（例えば、アガロー
スゲル電気泳動法）を用いて精製した本発明のDNAを、
所望に応じて平滑末端化した後、レポーターベクターの
マルチクローニングサイトに導入することにより、本発
明のコンストラクトを調製することができる。例えば、
ヒトピリオド２遺伝子プロモーターである、配列番号２
で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６
８番目の塩基からなる配列を含むファージクローンの場
合には、そのファージクローンを適当な制限酵素（例え
ば、第３５１３番目の位置で切断する制限酵素Aor51HI
と、第６４４７番目の位置で切断する制限酵素PshBIと
の組み合わせ）で処理した後、適当な精製手段（例え
ば、アガロースゲル電気泳動法）を用いて精製すること
により、２９３５bpのDNA断片を取得し、このDNA断片を
平滑末端化した後、レポーターベクターのマルチクロー
ニングサイトに導入することにより、ヒトピリオド２遺
伝子プロモーターを含む本発明のコンストラクトを調製
することができる。本発明のDNAを含むデリーションコ
ンストラクトは、例えば、上記手段で得た本発明のDNA
のうち、より長いDNAを適当な制限酵素で処理した後、
適当な精製手段を用いて精製することにより、所望のDN
A断片を取得し、セルフライゲーションすることにより
得ることができる。より具体的には実施例１０に記載の
方法により得ることができる。 本発明の細胞は、本発明のコンストラクトを含む。本
発明の細胞は、特に限定されるものではないが、適当な
宿主細胞（好ましくは真核生物）を、本発明のコンスト
ラクト（好ましくは、本発明のDNA及びレポーター遺伝
子に加え、ベクター領域を更に含む本発明のコンストラ
クト）で形質転換することにより、調製することができ
る。 真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母
等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、マ
ウスNIH3T3細胞、サルCOS細胞（文献３７）、チャイニ
ーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO）のジヒドロ葉酸レダ
クターゼ欠損株（文献３８）、マウスL細胞、マウスA9
細胞、又はサルBS-C-1細胞などを挙げることができ、マ
ウスNIH3T3細胞を用いることが好ましい。 本発明のコンストラクトは、例えば、DEAE−デキスト
ラン法（文献３９）、リン酸カルシウム−DNA共沈殿法
（文献４０）、市販のトランスフェクション試薬［例え
ば、リポフェクタミン２０００（GIBCO−BRL社）、FuGE
NETM6 Transfection Reagent（Roche Diagnostics
社）］を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（文
献４１）等により、宿主細胞に取り込ませることができ
る。 本発明の細胞は、常法に従って培養することができ
る。前記培養に用いることのできる培地としては、採用
した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択
することができる。例えば、NIH3T3細胞の場合には、DM
EM（Dulbecco' s modified Eagle' s miedium）に、
グルコース（最終濃度＝4.5g/L）と子ウシ血清（最終濃
度＝10％）とを加えた培地を使用することができる。 [本発明のトランスジェニック動物] 本発明のトランスジェニック動物は、本発明のコンス
トラクトが導入されている限り、特に限定されるもので
はないが、例えば、導入するDNAとして、本発明のコン
ストラクトを使用すること以外は、従来公知の方法（例
えば、文献３５）に基づいて作製することができる。具
体的には、例えば、後述の実施例４に記載の手順に基づ
いて作製することができる。 なお、本明細書において「動物」とは、ヒトを除く動
物（すなわち、非ヒト動物）を意味し、例えば、ヒトを
除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、
サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、イルカ、又
はウマ）、鳥類（例えば、ニワトリ又はウズラ）、両生
類（例えば、カエル）、爬虫類、又は昆虫（例えば、シ
ョウジョウバエ）などを挙げることができるが、ラット
又はマウスが好ましく、特にはラットが好ましい。 [本発明のスクリーニング方法] 本発明のスクリーニング法では、本発明の細胞、本発
明のトランスジェニック動物の視交叉上核切片又は末梢
組織、あるいは、本発明のトランスジェニック動物それ
自体を用いて実施することができる。スクリーニングに
使用する被検物質としては、特に限定されるものではな
いが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミ
カルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプ
チドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術
（文献３１）によって得られた化合物群、微生物の培養
上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出
物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択さ
れた化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に
修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができ
る。 本発明の細胞を用いる本発明のスクリーニング法で
は、本発明の細胞と被検物質とを接触させ、レポーター
活性を測定（すなわち、レポーターアッセイ）すること
により、ピリオド２遺伝子の発現を制御する物質、すな
わち、転写活性を修飾する物質を選択することができ
る。 本発明の細胞と被検物質とを接触させる場合には、コ
ンストラクトを一時的あるいは安定的に導入された細胞
を調製し、薬物（即ち被検物質）刺激を行なう。薬物
（即ち被検物質）刺激から一定時間後にレポーターアッ
セイを行なうことでピリオド２遺伝子の発現制御を可能
とする物質をスクリーニングすることができる。 レポーターアッセイは、使用するレポータータンパク
質の種類に応じて、公知のアッセイ方法により実施する
ことができる。例えば、レポータータンパク質としてホ
タルルシフェラーゼを使用する場合には、その基質とし
て、化学発光基質ルシフェリンを用いることができ、シ
ーパンジー（sea pansy）ルシフェラーゼを使用する場
合には、その基質として、化学発光基質セランテラジン
を用いることができる。また、SEAPを使用する場合に
は、その基質として、化学発光基質CSPD［disodium 3-
（４-methoxyspiro（1,2-dioxetane-3,2‘−（5’-chol
oro）tricyclo［3.3.1.13.7］decan）-4-yI）phenyl p
hosphate］又は蛍光基質MUP（4-methylunbelliferyl p
hosphate）を用いることができる。レポーターアッセイ
としては、ルシフェラーゼアッセイが好ましく、ルシフ
ェラーゼアッセイは、好ましくは、後述の実施例３に記
載の条件で実施することができる。 ピリオド２遺伝子の発現を促進する物質及び抑制する
物質のいずれもが、リズム障害改善薬として有用であ
り、ピリオド２遺伝子の発現を抑制する物質をスクリー
ニングするためには、BMAL1/CLOCKヘテロダイマーのよ
うな公知のピリオド２遺伝子の転写活性化因子共存下で
アッセイを行なうことにより、スクリーニングが可能で
ある。昼の同調因子は、ピリオド２遺伝子の転写を促進
する又は転写阻害を解除する（結果的に転写促進）よう
な性質を持ち、昼に作用させるとリズムを同調させるこ
とができ、夜に作用させると位相変位をおこす。また、
夜の同調因子は、ピリオド遺伝子の転写を抑制する、又
は、転写促進を解除する（結果的に転写を抑制）ような
性質を持ち、夜に作用させるとリズムを同調させること
ができ、昼に作用させると、位相変位を起こすことを確
認している。従って、ピリオド２遺伝子の転写を促進す
る薬物であれば昼に飲めば、リズムを同調させることが
でき、逆に、ピリオド２の転写を抑制する薬物であれば
夜に飲めば、リズムを同調させることができる。 本発明の細胞、又はトランスジェニック動物の視交叉
上核切片若しくは末梢組織を用いる本発明のスクリーニ
ング法では、本発明の細胞、又はトランスジェニック動
物の視交叉上核切片若しくは末梢組織に被検物質を作用
させ、発現振動を測定することにより、ピリオド２遺伝
子の発現を制御する物質を選択することができる。 mPer１：lucトランスジェニックラットにおいて、培
養下の視交叉上核切片あるいは末梢組織からの発光量を
極微弱発光計数装置（フォトマル）を用いて自動計測す
ることで２４時間ごとの発光振動曲線が得られるとの報
告がある（文献２８）。この方法を用いて、ピリオド２
遺伝子プロモーター活性を示すDNAとレポーター遺伝子
を含むコンストラクトを導入したトランスジェニック動
物の視交叉上核切片又は末梢組織における発光の振動を
自動計測し、発光振動が安定した頃、一方では、被検物
質（例えば、本発明の細胞を用いる本発明のスクリーニ
ング法でスクリーニングされてきた体内リズム改善薬候
補等の被検物質）を、前記トランスジェニック動物の視
交叉上核切片又は末梢組織に作用させ、他方では、コン
トロールとして、被検物質の溶媒［例えば、ジメチルス
ルホキシド（DMSO）などだけを視交叉上核切片又は末梢
組織に作用させ、自動計測を継続する。トランスジェニ
ック動物としては、トランスジェニックラットが好まし
い。被検物質（例えば、体内リズム障害を改善する候補
の被検物質）処理群から得られた発光振動曲線と、コン
トロールの未処理群から得られた発光振動曲線とを比較
することで、位相変位（振動ピーク又はボトムの位置変
化）即ち発現振動を評価することができる。このように
して、理想の位相変位を示す物質をスクリーニングする
ことにより、ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振
動を制御する物質を選択することができる。また、視交
叉上核切片や末梢組織の替わりに、本発明の細胞、即ち
マウスピリオド２遺伝子の上流配列をレポーター遺伝子
につないだDNAを導入した細胞を用い、細胞群を同調さ
せることにより上記スクリーニングを行うことができ
る。細胞群は、高濃度の血清あるいはデキサメサゾン
（DEX）で刺激することによって同調させることができ
るが、好ましくは実施例６に記載の方法で同調させるこ
とができる。 例えば、後述の実施例５に記載した方法で、マウスピ
リオド２遺伝子の上流配列をルシフェラーゼ遺伝子につ
ないだDNAをラットに導入したトランスジェニックラッ
ト（mPer２：lucトランスジェニックラット）の視交叉
上核切片又は末梢組織（例えば、肝臓、腎臓、肺又は眼
球）に対する自動発光測定を行ない、被検物質処理群か
ら得られた発光振動曲線と、未処理群（コントロール）
から得られた発光振動曲線とを比較することで、位相変
位を評価し、ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振
動を制御する物質を選択することができる。実施例５に
記載の方法で行なう場合は、視交叉上核切片について、
発現振動が認められる測定開始３〜９日目のいずれかの
時において、一方はコントロールとして溶媒（例えば、
DMSO等）のみを添加した新しい培地に交換し、他方は溶
媒（DMSO等）に溶解した被検物質を添加した新しい培地
に交換し、被検物質添加後の振動をコントロールと比較
することにより、被検物質のリズムに対する作用を評価
することが可能である。また、末梢組織についても、例
えば、肝臓、肺、及び眼球は、それぞれ、振動が認めら
れる測定開始４〜５日目の間、測定開始１〜５日目の
間、及び測定開始１〜３日目の間に、同様に被検物質を
含む培地に交換すること（コントロールは溶媒のみ）に
よって、被検物質のスクリーニングが可能である。 また、後述の実施例５に示すように、末梢組織では、
数回の振動リズムを示した後、細胞間脱同調により減衰
した（図７〜図９参照）が、この減衰を抑制する薬剤を
スクリーニングすることにより、高齢者の減弱した活動
リズム及び／又は睡眠リズムを改善する作用を示す薬物
を得ることが可能となる。 なお、大きな末梢組織（例えば、肝臓又は肺等）をス
クリーニングに用いる場合は、末梢組織片を用いること
が好ましい。 本発明のトランスジェニック動物を用いる本発明のス
クリーニング法では、本発明のトランスジェニック動物
に被検物質を投与し、前記動物の視交叉上核の発現振動
を測定することにより、ピリオド２遺伝子の発現及び／
又は発現振動を制御する物質を選択することができる。 具体的には、被検物質（例えば、本発明の細胞を用い
る本発明のスクリーニング法でスクリーニングされてき
た体内リズム改善薬候補等の被検物質）を、ピリオド２
プロモーター活性を示すDNAとレポーター遺伝子を含む
コンストラクトを導入したトランスジェニック動物に投
与する。レポータータンパク質としてルシフェラーゼを
使用する場合には、頭頂部から視交叉上核近傍へ細管を
通してルシフェリンを供給し、同時に視交叉上核直上に
挿入した微小光ファイバーで個体を生かしたまま、連続
的に発光を測定する方法（文献４２）を用いることで、
リズムセンター視交叉上核の振動への作用を評価して化
合物のスクリーニングをすることが可能である。 実施例 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、
これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、
特に断らない限り、公知の方法（例えば、Maniatis, T.
ら，“Molecular Cloning−A Laboratory Manua
l”，Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982；
及びHille, B. , lonic Channels of Excitable Me
mbranes, 2nd Ed. , Sinauer Associates Inc. , M
A, 1992）に従って実施した。 （実施例１） 《マウス及びヒトピリオド２上流のDNA配列取得と比較
解析》 マウスピリオド２の上流配列取得は、マウスゲノムDN
Aファージライブラリーを用いたスクリーニングと、ゲ
ノムウォーカーキット（クロンテック社）とを用いて行
なった。 はじめに、マウスピリオド２遺伝子（GenBank AF036
893）の既報の配列から、マウスピリオド２遺伝子のcDN
Aにおける第２１８番目〜第７２３番目の間を増幅する
ことのできるプライマーセット、すなわち、配列番号３
で表される塩基配列［マウスピリオド２遺伝子のcDNA
（GenBank AF036893）の第２１８番目〜第２３９番目
の配列］からなるフォワードプライマーと、配列番号４
で表される塩基配列［マウスピリオド２遺伝子のcDNA
（GenBank AF036893）の第７０２番目〜７２３番目の
配列に対して相補的な配列］からなるリバースプライマ
ーとを作成し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行なっ
た。なお、前記PCRは、酵素としてTaqポリメラーゼ（Am
pliTaq Gold；アプライドバイオシステムズ社）を用
い、９５℃（１０分間）の保温の後、９４℃（１５秒
間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（１分間）とからな
るサイクルを４０回繰り返すことにより実施した。 得られた増幅断片（５０５bp）をプローブとして、マ
ウスゲノムDNAのファージライブラリー（クロンテック
社）からスクリーニングを行なった。その結果、第二エ
クソンから上流６．０kbのマウスピリオド２遺伝子の第
一イントロンを含むクローンを得た。取得したファージ
DNAに対して、DNAシーケンス試薬（BigDye Terminator
Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit；ア
プライドバイオシステムズ社）を用い、マニュアルに従
ってシーケンス反応を実施した後、DNAシーケンサー（A
BI PRISM ３７７；アプライドバイオシステムズ社）
でDNA塩基配列を解析したところ、配列番号１で表され
る塩基配列の第１０１０４番目〜第１７００４番目の塩
基からなる配列が得られた。 続いて、ファージのDNA配列から更に上流の配列を取
得するため、ゲノムウォーカーキット（クロンテック
社）を用いて、上流配列の取得を進めた。ゲノムウォー
カーキットの鋳型としては、キット付属のライブラリー
MDL１〜MDL５を使用し、PCRの酵素としては、Taq DNA
ポリメラーゼ（Advantage Genomic polymerase Mi
x；クロンテック社）を使用した。 最初に、プライマーセットとして、キット付属のAP１
と、配列番号５で表される塩基配列（配列番号１で表さ
れる塩基配列の第１３００５番目〜第１３０３４番目の
塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるファ
ーストプライマーとを使用し、５％ジメチルスルホキシ
ド（DMSO）存在下で、９４℃（２秒間）と７２℃（３分
間）とからなるサイクルを７回、続いて、９４℃（２秒
間）と６７℃（３分間）とからなるサイクルを３６回繰
り返し、最後に６７℃で４分間保温することにより、PC
Rを実施した。続いて、得られた反応生成物の５０倍希
釈液１μLを鋳型として使用し、キット付属のAP2と、配
列番号６で表される塩基配列（配列番号１で表される塩
基配列の第１２４２９番目〜第１２４５８番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプ
ライマーとをプライマーセットとして使用し、９４℃
（２秒間）と７２℃（３分間）とからなるサイクルを５
回、続いて、９４℃（２秒間）と６７℃（３分間）とか
らなるサイクルを２４回繰り返し、最後に６７℃で４分
間保温することにより、PCRを実施した。 前記の２段階PCRにより得られた増幅バンドのシーク
エンシング解析を行なうことにより、配列番号１で表さ
れる塩基配列の第９８７４番目〜第１２４５８番目の塩
基からなる配列が得られた。この配列に基づいて、更に
上流の配列を得るためのプライマーセット、すなわち、
配列番号７で表される塩基配列（配列番号１で表される
塩基配列の第１０１０３番目〜第１０１３２番目の塩基
からなる配列に対して相補的な配列）からなるファース
トプライマーと、配列番号８で表される塩基配列（配列
番号１で表される塩基配列の第１００２１番目〜第１０
０５０番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）
からなるセカンドプライマーとを作製した。 配列番号５で表される塩基配列からなるファーストプ
ライマー及び配列番号６で表される塩基配列からなるセ
カンドプライマーの代わりに、配列番号７で表される塩
基配列からなるファーストプライマー及び配列番号８で
表される塩基配列からなるセカンドプライマーを用いる
こと以外は、前記の２段階PCRを繰り返し、得られた増
幅バンドのシークエンシング解析を行なうことにより、
配列番号１で表される塩基配列の第９１４６番目〜第１
００５０番目の塩基からなる配列が得られた。 以下、順次、更なる上流の配列を得るために、前記の
操作、すなわち、ファーストプライマー及びセカンドプ
ライマーの作製、２段階PCR、並びに得られた増幅バン
ドのシークエンシング解析を繰り返した。各２段階PCR
に使用したファーストプライマーとセカンドプライマー
との組み合わせは、 配列番号９で表される塩基配列（配列番号１で表される
塩基配列の第９３５５番目〜第９３８４番目の塩基から
なる配列に対して相補的な配列）からなるファーストプ
ライマーと 配列番号１０で表される塩基配列（配列番号１で表され
る塩基配列の第９３０７番目〜第９３３６番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプ
ライマーとの組み合わせ； 配列番号１１で表される塩基配列（配列番号１で表され
る塩基配列の第７８３８番目〜第７８５７番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列）からなるファースト
プライマーと 配列番号１２で表される塩基配列（配列番号１で表され
る塩基配列の第７８１８番目〜第７８３７番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプ
ライマーとの組み合わせ；及び 配列番号１３で表される塩基配列（配列番号１で表され
る塩基配列の第２２３４番目第２２６３番目の塩基から
なる配列に対して相補的な配列）からなるファーストプ
ライマーと 配列番号１４で表される塩基配列（配列番号１で表され
る塩基配列の第２１３４番目〜第２１６３番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプ
ライマーとの組み合わせ であり、この順に使用した。 なお、配列番号９で表される塩基配列からなるファー
ストプライマーと配列番号１０で表される塩基配列から
なるセカンドプライマーとの組み合わせを用いた２段階
PCRにより増幅されたDNAバンドのシークエンシング解析
の結果得られた、配列番号１で表される塩基配列の第８
９１８番目〜第９３３６番目の塩基からなる配列に基づ
いて設計したプライマーを用いた２段階PCRでは、更な
る上流の配列が取得できなかった。そこで、更に上流配
列を取得するために、第一エクソンの配列に基づいて設
計した配列番号１１で表される塩基配列からなるファー
ストプライマーと配列番号１２で表される塩基配列から
なるセカンドプライマーとの組み合わせを用いて、２段
階PCRを実施した。 これまでの解析の結果、配列番号１で表される塩基配
列の第１番目〜第１７００４番目の塩基からなる配列
（但し、第７８５８番目〜第９１４５番目の塩基からな
る配列を除く）が得られた。前記の第７８５８番目〜第
９１４５番目の塩基からなる未決定配列に相当する第一
エクソンと第一イントロンとの間のギャップを埋めるた
めに、鋳型としてマウスゲノムDNAを使用し、酵素とし
てTaq DNAポリメラーゼ（Advantage Genomic polyme
rase Mix；クロンテック社）を使用し、２段階のPCR
［ネスティド（nested）PCR］を実施した。第１回目のP
CRは、プライマーセットとして、配列番号１５で表され
る塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第７５１
６番目〜７５４５番目の塩基からなる配列）からなるフ
ォワードプライマーと、配列番号１６で表される塩基配
列（配列番号１で表される塩基配列の第９０６３番目〜
９０９２番目の塩基からなる配列に対して相補的な配
列）からなるリバースプライマーとを使用し、５％DMSO
存在下で、９５℃で１分間保温した後、９５℃（１５秒
間）と６０℃（３０秒間）と６８℃（５分間）とからな
るサイクルを３５回繰り返し、最後に６８℃で１０分間
保温することにより、実施した。第２回目のPCRは、プ
ライマーセットとして、配列番号１７で表される塩基配
列（配列番号１で表される塩基配列の第７５５６番目〜
７５８５番目の塩基からなる配列）からなるフォワード
プライマーと、配列番号１８で表される塩基配列（配列
番号１で表される塩基配列の第８９７７番目〜９００６
番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からな
るリバースプライマーとを使用すること以外は、第１回
目のPCRと同じ条件で実施した。 前記の２段階PCRの結果、１．４kbpのDNA断片が得ら
れ、その配列解析により、第一エクソンと第一イントロ
ンとの間のギャップを埋めることができた。 以上の解析の結果を全てまとめると、配列番号１で表
される塩基配列が得られた。配列番号１で表される塩基
配列には、第一エクソン（第７７３６番目〜第７８５７
番目）及び第二エクソン（第１６１５８番目〜第１６３
９６番目）と、第一イントロン（第７８５８番目〜第１
６１５７番目）とが含まれており、マウスピリオド２の
翻訳開始点は、第二エクソン（第１６１７６番目）に存
在することが明らかとなった。また、転写開始点は、第
７７３６番目に存在する（後述の実施例２参照）。 マウスとヒトとの遺伝子上流の配列比較を行なった場
合、遺伝子発現制御に重要な領域は種間で保存されてい
ることが予想されることから、ヒトピリオド２遺伝子
（GenBank NM_003894）の上流配列の取得を試みた。ド
ラフトシーケンスをネット［BLAST２；National Cente
r for Biotechnology Information（NCBI）］上で検
索した結果、ヒトピリオド２遺伝子の上流領域を含むク
ローン（GenBank ACO13400.5；188.2kbp；フェーズ
１）を見出した。 このドラフトシーケンスクローンACO13400.5は、第一
イントロンと第二エクソンとの間にギャップがあったた
め、ヒトゲノムDNA（クロンテック社）を鋳型として、P
CRを実施した。前記PCRは、プライマーセットとして、
配列番号１９で表される塩基配列（配列番号２で表され
る塩基配列の第１４５７７番目〜第１４６０６番目の塩
基からなる配列）からなるフォワードプライマーと、配
列番号２０で表される塩基配列［配列番号２で表される
塩基配列の第１５８５５番目〜第１５８８４番目の塩基
からなる配列に対して相補的な配列］からなるリバース
プライマーとを使用し、酵素として、Taq DNAポリメラ
ーゼ（AmpliTaq Gold；アプライドバイオシステムズ
社）を使用し、９５℃で１０分間保温した後、９４℃
（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（２分間）
とからなるサイクルを４０回繰り返すことにより実施
し、ギャップを含むDNA断片（約１．２kbp）のDNA配列
を解析した。 一方、その後、新しいクローン（GenBank ACO12485.1
3;168.7kbp；フェーズ3完全配列）がネット上に登録さ
れたことを見出したので、前述のマウスのゲノム配列
１７００４bpに相当する領域を、クローンGenBank ACO1
2485.13 から１７１１２bp（GenBank ACO12485.13の３
５３５４番目から５２４６５番目に対して相補的な配
列）抽出し配列番号２として示した。得られたヒトピリ
オド２遺伝子の上流配列の解析から、マウスと同様にヒ
トの翻訳開始点も第二エクソンに存在することが明らか
となった。以上、マウスピリオド２遺伝子及びヒトピリ
オド２遺伝子の約１７kbpにおよぶ第二エクソンから上
流約１７kbpの配列情報を取得した。 取得したマウスピリオド２遺伝子及びヒトピリオド２
遺伝子の約１７kbpにおよぶ上流領域付近の配列情報に
対し、相同性比較（解析条件はデフォルト値）を、NCBI
のBLAST２ SEQUENCES（http：／／www. ncbi. nlm. ni
h. gov／blast／bl２seq／bl２．html）VERSION BLASTN
２．２．１ AUG-1-2001プログラムにて解析した。Expec
tがe−３以下の確度の高い領域を保存性があるとした。
その解析結果を図１に示す。図１に示すように、ヒトと
マウスとの間には、第一エクソンの前後に断片的に保存
された領域（Ｉ〜ＶＩＩ）が７つ存在することが明らか
となった。 図２に、保存された領域内のそれぞれの配列を示す。
図２において、記号「H」はヒトの配列を示し、記号
「M」はマウスの配列を示し、ヒト配列とマウス配列と
の間の「縦棒」は、ヒト及びマウスの両方で塩基の種類
が一致した箇所を表す。 以上の解析の結果を全てまとめると、配列番号２で表
される塩基配列には、第一イントロン（第６０６９番目
〜第１６４６１番目）と第二エクソン（第１６４６２番
目〜第１６７１０番目）とが含まれており、ヒトピリオ
ド２の翻訳開始点は、第１６４８１番目に存在すること
が明らかとなった。 ゲノムDNAを鋳型とするPGRにより、上流領域DNA断片
を取得した場合には、遺伝子変異が生じる可能性があ
る。マウスゲノムのファージライブラリー（クロンテッ
ク社）のマニュアルに従って、１×１０6のファージか
ら、変異のない上流領域DNA断片を含むファージのクロ
ーニングを試みた。 プローブ調製のために、先に得られたマウスピリオド
２遺伝子の上流の配列情報を基に、配列番号１７で表さ
れる塩基配列からなるプライマーと、配列番号１８で表
される塩基配列からなるプライマーとを設計した。PCR
は、鋳型としてマウスゲノムDNA（クロンテック社）を
使用し、酵素としてTaq DNAポリメラーゼ（Advantage
Genomic DNA polymerase Mix；クロンテック社）を
使用し、９５℃で１分間保温した後、９５℃（１５秒
間）と６０℃（３０秒間）と６８℃（２分間）とからな
るサイクルを３５回繰り返すことにより実施し、１．４
kbのDNA断片を取得した。 得られたDNA断片をプラスミド（pBluescript；STRATA
GENE社）のEcoRV部位にクローニングし、増幅した。こ
のプラスミドに制限酵素Not I／Sal I処理を行ない、ア
ガロースゲル電気泳動によりプローブ用DNA断片を取得
した。次いで、プローブ用DNA断片を、ラベリングキッ
ト（BcaBESTラベリングキット：宝酒造株式会社）のマ
ニュアルに従って、［α−32P］dCTP（Amersham Pharm
acia Biotech社）を用いて標識した。このプローブを
用いたマウスゲノムファージライブラリーのスクリーニ
グの結果、ヒトとマウスとの間の６つの保存領域を含む
クローンを取得した。マニュアルに従って、このファー
ジクローンを大量調製し、上流領域を含むファージDNA
を、ファージDNA抽出キット（QIAGEN社）を用いて調製
した。 ７つの保存領域を含むDNA断片を取得するため、得ら
れたファージゲノムを制限酵素EcoT２２Ｉ／Nhe Iで切
り出し、アガロースゲル電気泳動を行うことにより、
６．４kbのDNA断片のバンドを抽出精製した。前記DNA断
片の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の第４
４１５番目〜第１０８７７番目の塩基からなる配列であ
る。精製したDNA断片をDNAブランティングキット（宝酒
造株式会社）にて平滑末端化を行なった。 ルシフェラーゼベクターpGL３−basic（プロメガ社；
以下、pGL３−bと略称する）は、プロモータ配列を持た
ないレポーターベクターであり、上流断片のプロモータ
活性を評価することができる。このベクターpGL３−bを
制限酵素Sma I で切断した後に、先に平滑末端化したマ
ウス上流断片を組み込むことにより、ベクターpCH1を作
製した。次いで、前記ベクターpCH1に対して制限酵素Xh
o I／SnaB I処理を行なった後、アガロースゲル電気泳
動でDNA断片を除き、セルフライゲーションを行なうこ
とにより、ベクターpCH1から第一イントロン側の保存領
域（ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ）を除いたベクターpCH3を
作製した。前記ベクターpCH3の内、マウスピリオド２遺
伝子の上流域部分の配列は、配列番号１で表される塩基
配列の第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる
配列に該当する。 （実施例２） 《マウスピリオド２の転写開始点の同定》 前記実施例１で取得したマウスピリオド２遺伝子上流
領域断片を含むベクターpCH1及びベクターpCH3が、プロ
モーター領域を含むか否かは、転写開始点を含んでいる
かを調べることで確かめることができる。転写開始点同
定のため、オリゴキャップ法により作製されたマウス全
脳のcDNAライブラリー（文献３２，文献３３）を用い
て、キャップ部位の同定を試みた。
モーター及びレポーター遺伝子を含むコンストラクト、
前記コンストラクトを含む細胞、前記コンストラクトを
組み込んだトランスジェニック動物、並びに体内時計遺
伝子の発現及び／または発現振動を制御する物質のスク
リーニング方法に関する。 背景技術 多くの生物が約２４時間の概日リズムを生みだす機構
を体内に有することが知られている（文献１）。哺乳類
において、概日リズム発振機構は、睡眠覚醒リズム、血
圧、体温、及び一部のホルモン分泌リズムを制御してい
る（文献２，文献３）。概日リズムに起因する疾患とし
て、睡眠覚醒リズム障害（DSPS、非２４時間行動）、季
節性うつ病、時差症候群（JET−LAG）、昼夜交代勤務労
働者における睡眠障害、痴呆老人にみられる夜間徘徊、
及びせん妄などが報告されている（文献４〜文献７）。
更に、社会問題となっている不登校又は不出社の一部
は、概日リズム障害に起因するとの報告がある（文献
８）。高齢化と社会構造のグローバル化が進むことによ
り、今後リズム障害患者の増加が予想されるが、確実な
リズム障害改善薬が存在しないのが実状である。一方、
早朝に５０００ルクス程度の光を数時間見続けることを
含む高照度光療法は、痴呆老人の夜間徘徊、せん妄、あ
るいはDSPSなどのリズム障害の症状に対し、良好な治療
療効果を示すとの報告がある（文献６，文献７，文献９
〜文献１２）。しかしながら、高ルクスの光源の前に長
時間にわたって拘束される高照度光療法は、患者とその
介護者にとって苦痛あるいは負担であることから、この
光療法を代替する薬剤への期待は高い。 組織破壊及び組織移植実験から、哺乳類のリズムセン
ターは視交叉上核（SCN）に存在することが１９７２年
に明らかにされた（文献１３，文献１４）。しかし、リ
ズム発振の分子メカニズムについては近年まで不明であ
った（文献１５）。一方、遺伝学的手法からショウジョ
ウバエのリズム変異体［ピリオド（Period）変異体］が
作出され、続いて、ショウジョウバエのピリオド遺伝子
がクローニングされた（文献１６，文献１７）。ショウ
ジョウバエにおいて、翻訳されたピリオドタンパク質
（PERIOD）は核内へ移行し、自身の発現転写を抑制する
こと（ネガティブフィードバック機構）によって、約２
４時間の発現振動が達成されており、これによって最終
的に概日リズム表現型（行動、羽化）が現われると考え
られている（文献１８，文献１９）。一方、哺乳類にお
いては、１９９７年に、ショウジョウバエピリオド遺伝
子のホモログとして、ヒト及びマウスのピリオド１遺伝
子（Period１；Per１）がそれぞれクローニングされた
（文献２０，文献２１）。その後、マウスのピリオド２
遺伝子（Period２；Per２）（文献２２，文献２３）及
びマウスのピリオド３遺伝子（Period３；Per３）（文
献２４，文献２５）がクローニングされた。この他、哺
乳類時計遺伝子として、マウスのクロック遺伝子（Cloc
k）（文献２６）及びマウスのビーマル１遺伝子（Bmal
１）（文献２７）が報告されている。このようにリズム
発振機構について、現在は分子レベルでの理解が可能で
ある。実際に、クロック遺伝子、ビーマル１遺伝子が時
計遺伝子の概日振動に重要であること（文献４４、文献
４５）、クロック遺伝子でコードされるタンパク質、ビ
ーマル１遺伝子でコードされるタンパク質は時計遺伝子
のCACGTG型E-boxに結合し、該時計遺伝子の転写を活性
化すること、即ち、クロック、ビーマル１による転写活
性化にはCACGTG型E-box配列が必須であること（文献２
７）が明らかにされている。 ２０００年に、マウスの時計遺伝子であるピリオド１
遺伝子（mPer１）の上流配列をルシフェラーゼ遺伝子に
つないだDNAをラットに導入したトランスジェニックラ
ット（mPer１：lucトランスジェニックラット）が報告
された（文献２８）。極微弱発光計数装置（フォトマ
ル）を用いてルシフェラーゼ活性をリアルタイムに測定
することで、視交叉上核のみならず、体の末梢組織でも
またピリオド１が発現振動していることが報告されてい
る（文献２８）。また、ピリオド１遺伝子の上流配列を
ルシフェラーゼ遺伝子につないだDNAをラットに導入し
たトランスジェニックマウス（mPer１：lucトランスジ
ェニックマウス）についても同様の結果が報告されてい
る（文献４３）。 ピリオド遺伝子の３つのホモログのうち、ピリオド２
遺伝子は人為的遺伝子変異マウスにおいて概日リズムが
消失することから、リズム発振に重要な役割を持つこと
が示唆されている（文献２９）。また、体内リズム疾患
の一つである睡眠相前進症候群（ASPS）を示す１家系の
原因はピリオド２遺伝子の点突然変異であることが報告
された（文献３０）。このようにピリオド２遺伝子は遺
伝子変異マウスがリズム異常を示すだけでなく、ヒトの
リズム疾患にも関与することまで証明された遺伝子であ
る。 ピリオド２遺伝子の上流領域に関する唯一の報告は、
マウス配列についてのＷＯ０１／０７６５４であり、当
該特許には、マウスのピリオド２転写制御配列と定義し
てDNA配列が記載され、Per２制御配列−レポーター遺伝
子を含む細胞を供給、試験化合物を導入、レポーター遺
伝子の転写をアッセイすることからなるピリオド２転写
阻害化合物を同定する方法について述べられている。し
かしながら、マウスピリオド２転写制御配列と記載され
ている前記DNA配列を現実に取得したという具体的な実
施例はなく、取得できるように記載されてもいない。ま
た、転写開始点を決定した、あるいは転写活性を測定し
たという具体的な実施例もない。更に、開示されたDNA
配列には塩基が特定できていない箇所があり、ピリオド
２遺伝子の上流配列に関する配列情報は具体的に開示さ
れていなかった。 なお、ピリオド１遺伝子上流配列の解析については数
々の報告があるが、ピリオド１とピリオド２は染色体上
の位置も異なり、共通する特徴的な配列もないので、ピ
リオド２プロモーター配列を推定する情報とはならなか
った。 体内時計遺伝子の発現を制御することを作用機序とす
る、リズム障害改善薬として有用な物質を得るためのス
クリーニングに用いるツール、及び、体内時計遺伝子の
発現を制御する物質のスクリーニング方法が待望されて
いる。 発明の開示 本発明者らは、鋭意研究を行った結果、ヒトピリオド
２遺伝子の転写活性を制御する領域であり、発現振動に
寄与する領域であるヒトピリオド２遺伝子プロモーター
配列を初めて決定し、前記プロモーター及びレポーター
遺伝子を含むコンストラクト、並びに前記コンストラク
トを含む細胞を取得した。また、マウスピリオド２遺伝
子プロモーター配列を決定し、前記プロモーター及びレ
ポーター遺伝子を含むコンストラクト、並びに前記コン
ストラクトを含む細胞を取得した。更に、前記コンスト
ラクトを組み込んだトランスジェニック動物を作製し
た。次いで、マウスに由来する本発明のピリオド２プロ
モーターにはCACGTG型E−box配列が含まれていないにも
関わらず、意外にも、マウスビーマル１遺伝子でコード
されるタンパク質とマウスクロック遺伝子でコードされ
るタンパク質とからなるヘテロダイマー（BMAL1/CLOCK
ヘテロダイマー）によりピリオド２遺伝子が転写活性化
および発現振動することを見出した。また、本遺伝子プ
ロモーター活性を簡便に検出することができる系を構築
した。この結果、ピリオド２遺伝子プロモーター、該プ
ロモーター及びレポーター遺伝子を含むコンストラク
ト、前記コンストラクトを含む細胞、並びに前記コンス
トラクトを組み込んだトランスジェニック動物を、体内
時計遺伝子の発現及び／又は発現振動を制御する物質で
あるリズム障害改善薬をスクリーニングするために有用
なツールとして提供し、また、簡便なリズム障害改善薬
スクリーニング方法を提供し、本発明を完成した。な
お、本明細書中、コンストラクトとは、目的となる機能
を有するようにDNAを組み合わせて構築したDNAからなる
構築物をいう。 ピリオド遺伝子のホモログの一つであるマウスピリオ
ド１遺伝子の第一エクソンの上流には５箇所のCACGTG型
E-boxが存在しており、基本転写活性領域は、これら５
箇所のCACGTG型E-boxを含まない第一エクソン周辺配列
と第一イントロン中のヒト・マウス間で保存されている
領域にある。BMAL1/CLOCKヘテロダイマーはCACGTG型E-b
oxに結合してマウスピリオド１遺伝子の転写を活性化す
るが、CACGTG型E-boxを含まない基本転写活性領域は、B
MAL1/CLOCKヘテロダイマーによる転写活性を殆んど増強
しない（文献２７）。また、マウスピリオド１遺伝子の
５箇所のCACGTG型E-boxに変異を入れると、基本転写活
性と同程度の転写活性になる（文献３４）。これらのこ
とから、BMAL1/CLOCKヘテロダイマーはCACGTG型E-boxを
介してマウスピリオド１遺伝子の転写活性化を引き起こ
すと考えられている。一方、ビーマル1ノックアウトマ
ウスでは、恒暗条件下でピリオド１及びピリオド２遺伝
子の概日振動が消失することが報告され（文献４４）、
クロック遺伝子のミュータントマウスは、恒暗条件下で
ピリオド１及びピリオド２遺伝子の概日振動が極度に減
弱することが報告されている（文献４５）。即ち、ビー
マル1及びクロックが振動に重要であることが明らかと
なっている。これらのことからすると、前記ＷＯ０１／
０７６５４でマウスのピリオド２転写制御配列と定義さ
れたDNA配列（即ち、本発明のDNA塩基配列である配列番
号１で表される塩基配列の第４４１５番目〜第７９３１
番目の塩基からなる配列の一部（第６０５０番目〜７７
６１番目）に相当するが、数箇所において配列が不一致
である配列）はCACGTG型E-boxを含んでいないため、単
なる基本転写活性領域を示しているにすぎない。また同
様にCACGTG型E-boxを含まない本発明のピリオド２遺伝
子のDNAが、BMAL1/CLOCKヘテロダイマーによる転写活性
増強を示すとは考えられず、更には、発現振動に寄与す
るとは予想もされなかった。しかしながら、意外にも、
CACGTG型E-boxを含まない本発明のDNAがBMAL1/CLOCKヘ
テロダイマーによる転写活性増強を示し、更には発現振
動に寄与すること、すなわち発現振動に必須な領域であ
ることを見出し、発現振動を測定する簡便な系を構築し
た。即ち、CACGTG型E-boxを含むマウスピリオド２遺伝
子配列（即ち本明細書のpCH1）よりも、本発明のピリオ
ド２プロモーターの方が高い活性を示したことから、本
発明のDNAを用いることにより、より検出の容易な系が
構築でき、より有用なリズム改善薬を得る方法を提供
し、本発明を完成した。 即ち本発明は、 [１]ベーサルのプロモーター活性を保持し、かつBMAL1/
CLOCKヘテロダイマーにより転写活性化されるプロモー
ター活性を示す、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）、又は（ｅ）に記載の塩基配列を含むDNA、 （ａ）配列番号１で表される塩基配列における第７４６
３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｂ）配列番号１で表される塩基配列における第６４１
７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｃ）配列番号１で表される塩基配列における第５２４
９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｄ）配列番号１で表される塩基配列における第４４１
５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｅ）配列番号２で表される塩基配列における第３８２
０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列。 [２] [１]の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は
（ｅ）に記載の塩基配列からなるDNA、 [３] [１]または[２]に記載のDNAとレポーター遺伝子と
を含むコンストラクト、 [４] [３]に記載のコンストラクトを含む細胞、 [５] [４]に記載の細胞と被検物質とを接触させる工
程、及び レポーター活性を測定する工程 を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現を制
御する物質のスクリーニング法、 [６] [３]に記載のコンストラクトを導入したトランス
ジェニック動物、 [７]前記動物がラットである[６]に記載のトランスジェ
ニック動物、 [８] [４]に記載の細胞、あるいは[６]または[７]に記
載のトランスジェニック動物の視交叉上核切片若しくは
末梢組織に被検物質を作用させる工程、及び 発現振動を測定する工程 を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現及び
／又は発現振動を制御する物質のスクリーニング法、 [９] [６]又は[７]に記載のトランスジェニック動物に
被検物質を投与し、前記動物の視交叉上核の発現振動を
測定する工程 を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現及び
／又は発現振動を制御する物質のスクリーニング法、 [１０]ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振動を制
御する物質が、リズム障害改善用である、[５]、[８]、
又は[９]のいずれか一項に記載のスクリーニング法 に関する。 図面の簡単な説明 図１は、マウスピリオド２遺伝子及びヒトピリオド２遺
伝子（hPer２）上流を比較した結果を示すグラフであ
る。 図２は、マウスとヒトとの間で高度に保存されている６
つの領域の塩基配列を示す説明図である。 図３は、マウスピリオド２遺伝子上流領域のベーサルの
プロモーター活性を示すグラフである。 図４は、マウスピリオド２遺伝子上流領域を含むベクタ
ーpCH3に対する、転写因子BMAL1/CLOCKヘテロダイマー
の作用を示すグラフである。 図５は、測定開始から１０日間にわたる視交叉上核切片
における自動発光測定の結果を示すグラフである。 図６は、図５に示すグラフを、縦軸方向にのみ拡大し、
その一部を示すグラフである。 図７は、測定開始から１０日間にわたる肝臓片における
自動発光測定の結果を示すグラフである。 図８は、測定開始から１０日間にわたる肺片における自
動発光測定の結果を示すグラフである。 図９は、測定開始から１０日間にわたる眼球における自
動発光測定の結果を示すグラフである。 図１０は、測定開始から４日間にわたるpCH3導入培養細
胞における自動発光測定の結果を示すグラフである。 図１１は、測定開始から５日間にわたるpTM15導入培養
細胞における自動発光測定の結果を示すグラフである。 図１２は、マウスピリオド２遺伝子上流領域のベーサル
活性、及び同領域を含むベクターに対する転写因子BMAL
1/CLOCKヘテロダイマーの作用を示すグラフである。 図１３は、測定開始から６日間にわたるpCH3-D3導入培
養細胞における自動発光測定の結果を示すグラフであ
る。 発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を詳細に説明する。 [本発明のDNA] 本発明のDNAは、（ａ）配列番号１で表される塩基配
列における第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基から
なる配列、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列におけ
る第６４１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配
列、（ｃ）配列番号１で表される塩基配列における第５
２４９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列における第４４１
５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、又は、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列における第３８２
０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列を含み、ピ
リオド２遺伝子プロモーター活性を示す。 本明細書において「ピリオド２遺伝子プロモーター活
性」とは、配列番号１で表される塩基配列における第４
４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列からな
るDNAとしてのベーサルのプロモーター活性が少なくと
も保持されており（すなわち、配列番号１で表される塩
基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基
からなる配列からなるDNAのベーサルなプロモータ活性
の少なくとも５０％の活性を有しており、好ましくはDN
Aのベーサルなプロモータ活性と実質的に同じである
か、あるいは、優れており）、しかも、BMAL1/CLOCKヘ
テロダイマーにより、転写活性化される（即ち発現振動
に寄与する）プロモーター活性を意味する。 ここで、「ベーサルのプロモーター活性」とは、何も
刺激しない状態で所定時間（例えば、４８時間）経過し
たときのプロモーター活性を意味し、「何も刺激しない
状態」とは、具体的には、実施例３に示すように、BMAL
1/CLOCKヘテロダイマー不在下の状態を意味する。ま
た、前記「BMAL1/CLOCKヘテロダイマー」は、ピリオド
１遺伝子、ピリオド２遺伝子、及びピリオド３遺伝子の
各転写を制御する転写因子である。 あるDNAが「ピリオド２遺伝子プロモーター活性」を
示すか否かの判定方法は、特に限定されるものではない
が、例えば、実施例３に示すように、BMAL1/CLOCKヘテ
ロダイマー不在下の状態でベーサルのプロモーター活性
を測定することにより、配列番号１で表される塩基配列
における第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からな
る配列からなるDNAのプロモータ活性と実質的に同じで
あるか、あるいは、優れていることを確認し、更に、実
施例３に記載の条件下で、用量依存的なBMAL1/CLOCKヘ
テロダイマーによる転写活性化を示すか否かを確認する
ことにより、判定することができる。 本発明の好ましいDNAとしては、例えば、配列番号１
で表される塩基配列における第７４６３番目〜第７９３
１番目の塩基からなる配列、配列番号１で表される塩基
配列における第６４１７番目〜第７９３１番目の塩基か
らなる配列、配列番号１で表される塩基配列における第
５２４９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、配
列番号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜
第７９３１番目の塩基からなる配列からなるDNA、又は
配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番目
〜第６０６８番目の塩基からなる配列からなるDNAなど
を挙げることができるが、配列番号１で表される塩基配
列における第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基から
なる配列、配列番号１で表される塩基配列における第６
４１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列、配列
番号１で表される塩基配列における第５２４９番目〜第
７９３１番目の塩基からなる配列、配列番号１で表され
る塩基配列における第４４１５番目〜第７９３１番目の
塩基からなる配列からなるDNA、又は配列番号２で表さ
れる塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目
の塩基からなる配列を含み、ピリオド２遺伝子プロモー
ター活性を示すDNAであれば本発明のDNAに含まれる。 配列番号１で表される塩基配列における第４４１５番
目〜第７９３１番目の塩基からなる配列は、後述の実施
例１に示すように、マウスピリオド２の上流領域であ
り、また、後述の実施例３に示すように、ピリオド２遺
伝子プロモーター活性を示す。 配列番号２で表される塩基配列における第３８２０番
目〜第６０６８番目の塩基からなる配列からなるDNA
は、後述の実施例１に示すように、ヒトピリオド２の上
流領域である。マウス遺伝子の実験結果（後述の実施例
１及び実施例３）から、マウスのプロモーター活性を示
したDNA（すなわち、配列番号１で表される塩基配列に
おける第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる
配列からなるDNA）は、ヒト／マウス間の７つの保存領
域の内、第一イントロン側の保存領域（ＩＶ、Ｖ、ＶＩ
及びＶＩＩ）を除いたDNAであることが判明した。従っ
て、ヒト／マウス間の７つの保存領域の内、第一イント
ロン側の保存領域（ＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＶＩＩ）を除い
たDNAに対応するヒトのDNA、すなわち、配列番号２で表
される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番
目の塩基からなる配列からなるDNAも、ピリオド２遺伝
子プロモーター活性を有すると考えられる。 本発明のDNAは、特に限定されるものではないが、例
えば、（１）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を利用す
ることにより、あるいは、（２）ファージライブラリー
をスクリーニングすることにより、調製することができ
る。 （１）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法 PCR法を利用して本発明のDNAを調製する場合には、ま
ず、配列番号１又は２で表される各塩基配列の情報に基
づいて、本発明のDNAを増幅することのできるプライマ
ーセットを設計する。 マウスピリオド２遺伝子プロモーターである、配列番
号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７
９３１番目の塩基からなる配列を含む本発明のDNAの場
合には、配列番号１で表される塩基配列の情報に基づい
て、配列番号１で表される塩基配列における第４４１５
番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列を含むが、保
存領域ＩＶ（第８５３４番目）以降を含まないように、
増幅するプライマーセットを設計する。また、ヒトピリ
オド２遺伝子プロモーターである、配列番号２で表され
る塩基配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の
塩基からなる配列を含む本発明のDNAの場合には、配列
番号２で表される塩基配列の情報に基づいて、配列番号
２で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０
６８番目の塩基からなる配列を含むが、保存領域ＩＶ
（第６５３１番目）以降を含まないように、増幅するプ
ライマーセットを設計する。 設計した前記プライマーセットと、鋳型であるゲノム
DNAとを用いてPCRを実施することにより、本発明のDNA
を得ることができる。 （２）ファージライブラリースクリーニング法 ファージライブラリー（例えば、Maniatis, T.
ら，”Molecular Cloning−A Laboratory Manua
l”，Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982）
をスクリーニングすることにより本明のDNAを調製する
場合には、まず、配列番号１又は２で表される各塩基配
列の情報に基づいて、本発明のDNAを含むファージクロ
ーンをスクリーニングすることのできるプローブを設計
する。 マウスピリオド２遺伝子プロモーターである、配列番
号１で表される塩基配列における第４４１５番目〜第７
９３１番目の塩基からなる配列を含む本発明のDNAの場
合には、配列番号１で表される塩基配列における第４４
１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列の情報に
基づいて、プローブを設計する。また、ヒトピリオド２
遺伝子プロモーターである、配列番号２で表される塩基
配列における第３８２０番目〜第６０６８番目の塩基か
らなる配列を含む本発明のDNAの場合には、配列番号２
で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６
８番目の塩基からなる配列の情報に基づいて、プローブ
を設計する。 設計した前記プローブを使用して、ファージライブラ
リーをスクリーニングすることにより、本発明のDNAを
含むファージクローンを得ることができる。得られたフ
ァージクローンを、適当な制限酵素で処理した後、適当
な精製手段（例えば、アガロースゲル電気泳動法）を用
いて所望のDNA断片を精製することにより、本発明のDNA
を得ることができる。 [本発明のコンストラクト及び細胞] 本発明のコンストラクトは、本発明のDNAとレポータ
ー遺伝子とを含む。前記レポーター遺伝子としては、細
胞内において遺伝子発現の指標として使用することので
きる公知のレポータータンパク質をコードする遺伝子を
用いることができる。前記レポータータンパク質として
は、例えば、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファ
ターゼ（SEAP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、
β−グルクロニダーゼ（GUS）、β−D−ガラクトシダー
ゼ、又はエクオリンなどを挙げることができる。本発明
のコンストラクトにおいては、レポーター遺伝子とし
て、ルシフェラーゼ遺伝子を用いることが好ましい。 本発明のコンストラクトでは、本発明のDNAの下流で
あって、しかも、本発明のDNAのプロモーター活性の調
節下にあるように、レポーター遺伝子を配置する限り、
本発明のDNA及びレポーター遺伝子の配置位置は限定さ
れるものではない。また、本発明のコンストラクトは、
本発明のDNAとレポーター遺伝子とを少なくとも含む限
り、特に限定されるものではないが、ベクター領域を更
に含むことが好ましい。 本発明のコンストラクトは、特に限定されるものでは
ないが、本発明のDNA及びレポーター遺伝子に加え、ベ
クター領域を更に含む本発明のコンストラクトは、例え
ば、本発明のDNAを適当なレポーターベクター（すなわ
ち、レポーター遺伝子を含むベクター）のマルチクロー
ニングサイトに導入することにより調製することができ
る。前記レポーターベクターとしては、例えば、ルシフ
ェラーゼをコードする遺伝子を含むベクターpGL３−bas
ic（プロメガ社）、SEAPをコードする遺伝子を含むベク
ターpSEP２−basicベクター（クロンテック社）、ある
いは、GFPの不安定型をコードする遺伝子を含むベクタ
ーpd１EGFP（クロンテック社）を挙げることができる。 より具体的には、PCR法を利用して得られた本発明のD
NAを、レポーターベクターのマルチクローニングサイト
に導入することにより、本発明のコンストラクトを調製
することができる。 あるいは、ファージライブラリーをスクリーニングす
ることにより得られたファージクローンを、適当な制限
酵素で処理した後、適当な精製手段（例えば、アガロー
スゲル電気泳動法）を用いて精製した本発明のDNAを、
所望に応じて平滑末端化した後、レポーターベクターの
マルチクローニングサイトに導入することにより、本発
明のコンストラクトを調製することができる。例えば、
ヒトピリオド２遺伝子プロモーターである、配列番号２
で表される塩基配列における第３８２０番目〜第６０６
８番目の塩基からなる配列を含むファージクローンの場
合には、そのファージクローンを適当な制限酵素（例え
ば、第３５１３番目の位置で切断する制限酵素Aor51HI
と、第６４４７番目の位置で切断する制限酵素PshBIと
の組み合わせ）で処理した後、適当な精製手段（例え
ば、アガロースゲル電気泳動法）を用いて精製すること
により、２９３５bpのDNA断片を取得し、このDNA断片を
平滑末端化した後、レポーターベクターのマルチクロー
ニングサイトに導入することにより、ヒトピリオド２遺
伝子プロモーターを含む本発明のコンストラクトを調製
することができる。本発明のDNAを含むデリーションコ
ンストラクトは、例えば、上記手段で得た本発明のDNA
のうち、より長いDNAを適当な制限酵素で処理した後、
適当な精製手段を用いて精製することにより、所望のDN
A断片を取得し、セルフライゲーションすることにより
得ることができる。より具体的には実施例１０に記載の
方法により得ることができる。 本発明の細胞は、本発明のコンストラクトを含む。本
発明の細胞は、特に限定されるものではないが、適当な
宿主細胞（好ましくは真核生物）を、本発明のコンスト
ラクト（好ましくは、本発明のDNA及びレポーター遺伝
子に加え、ベクター領域を更に含む本発明のコンストラ
クト）で形質転換することにより、調製することができ
る。 真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母
等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、マ
ウスNIH3T3細胞、サルCOS細胞（文献３７）、チャイニ
ーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO）のジヒドロ葉酸レダ
クターゼ欠損株（文献３８）、マウスL細胞、マウスA9
細胞、又はサルBS-C-1細胞などを挙げることができ、マ
ウスNIH3T3細胞を用いることが好ましい。 本発明のコンストラクトは、例えば、DEAE−デキスト
ラン法（文献３９）、リン酸カルシウム−DNA共沈殿法
（文献４０）、市販のトランスフェクション試薬［例え
ば、リポフェクタミン２０００（GIBCO−BRL社）、FuGE
NETM6 Transfection Reagent（Roche Diagnostics
社）］を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（文
献４１）等により、宿主細胞に取り込ませることができ
る。 本発明の細胞は、常法に従って培養することができ
る。前記培養に用いることのできる培地としては、採用
した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択
することができる。例えば、NIH3T3細胞の場合には、DM
EM（Dulbecco' s modified Eagle' s miedium）に、
グルコース（最終濃度＝4.5g/L）と子ウシ血清（最終濃
度＝10％）とを加えた培地を使用することができる。 [本発明のトランスジェニック動物] 本発明のトランスジェニック動物は、本発明のコンス
トラクトが導入されている限り、特に限定されるもので
はないが、例えば、導入するDNAとして、本発明のコン
ストラクトを使用すること以外は、従来公知の方法（例
えば、文献３５）に基づいて作製することができる。具
体的には、例えば、後述の実施例４に記載の手順に基づ
いて作製することができる。 なお、本明細書において「動物」とは、ヒトを除く動
物（すなわち、非ヒト動物）を意味し、例えば、ヒトを
除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、
サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、イルカ、又
はウマ）、鳥類（例えば、ニワトリ又はウズラ）、両生
類（例えば、カエル）、爬虫類、又は昆虫（例えば、シ
ョウジョウバエ）などを挙げることができるが、ラット
又はマウスが好ましく、特にはラットが好ましい。 [本発明のスクリーニング方法] 本発明のスクリーニング法では、本発明の細胞、本発
明のトランスジェニック動物の視交叉上核切片又は末梢
組織、あるいは、本発明のトランスジェニック動物それ
自体を用いて実施することができる。スクリーニングに
使用する被検物質としては、特に限定されるものではな
いが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミ
カルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプ
チドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術
（文献３１）によって得られた化合物群、微生物の培養
上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出
物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択さ
れた化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に
修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができ
る。 本発明の細胞を用いる本発明のスクリーニング法で
は、本発明の細胞と被検物質とを接触させ、レポーター
活性を測定（すなわち、レポーターアッセイ）すること
により、ピリオド２遺伝子の発現を制御する物質、すな
わち、転写活性を修飾する物質を選択することができ
る。 本発明の細胞と被検物質とを接触させる場合には、コ
ンストラクトを一時的あるいは安定的に導入された細胞
を調製し、薬物（即ち被検物質）刺激を行なう。薬物
（即ち被検物質）刺激から一定時間後にレポーターアッ
セイを行なうことでピリオド２遺伝子の発現制御を可能
とする物質をスクリーニングすることができる。 レポーターアッセイは、使用するレポータータンパク
質の種類に応じて、公知のアッセイ方法により実施する
ことができる。例えば、レポータータンパク質としてホ
タルルシフェラーゼを使用する場合には、その基質とし
て、化学発光基質ルシフェリンを用いることができ、シ
ーパンジー（sea pansy）ルシフェラーゼを使用する場
合には、その基質として、化学発光基質セランテラジン
を用いることができる。また、SEAPを使用する場合に
は、その基質として、化学発光基質CSPD［disodium 3-
（４-methoxyspiro（1,2-dioxetane-3,2‘−（5’-chol
oro）tricyclo［3.3.1.13.7］decan）-4-yI）phenyl p
hosphate］又は蛍光基質MUP（4-methylunbelliferyl p
hosphate）を用いることができる。レポーターアッセイ
としては、ルシフェラーゼアッセイが好ましく、ルシフ
ェラーゼアッセイは、好ましくは、後述の実施例３に記
載の条件で実施することができる。 ピリオド２遺伝子の発現を促進する物質及び抑制する
物質のいずれもが、リズム障害改善薬として有用であ
り、ピリオド２遺伝子の発現を抑制する物質をスクリー
ニングするためには、BMAL1/CLOCKヘテロダイマーのよ
うな公知のピリオド２遺伝子の転写活性化因子共存下で
アッセイを行なうことにより、スクリーニングが可能で
ある。昼の同調因子は、ピリオド２遺伝子の転写を促進
する又は転写阻害を解除する（結果的に転写促進）よう
な性質を持ち、昼に作用させるとリズムを同調させるこ
とができ、夜に作用させると位相変位をおこす。また、
夜の同調因子は、ピリオド遺伝子の転写を抑制する、又
は、転写促進を解除する（結果的に転写を抑制）ような
性質を持ち、夜に作用させるとリズムを同調させること
ができ、昼に作用させると、位相変位を起こすことを確
認している。従って、ピリオド２遺伝子の転写を促進す
る薬物であれば昼に飲めば、リズムを同調させることが
でき、逆に、ピリオド２の転写を抑制する薬物であれば
夜に飲めば、リズムを同調させることができる。 本発明の細胞、又はトランスジェニック動物の視交叉
上核切片若しくは末梢組織を用いる本発明のスクリーニ
ング法では、本発明の細胞、又はトランスジェニック動
物の視交叉上核切片若しくは末梢組織に被検物質を作用
させ、発現振動を測定することにより、ピリオド２遺伝
子の発現を制御する物質を選択することができる。 mPer１：lucトランスジェニックラットにおいて、培
養下の視交叉上核切片あるいは末梢組織からの発光量を
極微弱発光計数装置（フォトマル）を用いて自動計測す
ることで２４時間ごとの発光振動曲線が得られるとの報
告がある（文献２８）。この方法を用いて、ピリオド２
遺伝子プロモーター活性を示すDNAとレポーター遺伝子
を含むコンストラクトを導入したトランスジェニック動
物の視交叉上核切片又は末梢組織における発光の振動を
自動計測し、発光振動が安定した頃、一方では、被検物
質（例えば、本発明の細胞を用いる本発明のスクリーニ
ング法でスクリーニングされてきた体内リズム改善薬候
補等の被検物質）を、前記トランスジェニック動物の視
交叉上核切片又は末梢組織に作用させ、他方では、コン
トロールとして、被検物質の溶媒［例えば、ジメチルス
ルホキシド（DMSO）などだけを視交叉上核切片又は末梢
組織に作用させ、自動計測を継続する。トランスジェニ
ック動物としては、トランスジェニックラットが好まし
い。被検物質（例えば、体内リズム障害を改善する候補
の被検物質）処理群から得られた発光振動曲線と、コン
トロールの未処理群から得られた発光振動曲線とを比較
することで、位相変位（振動ピーク又はボトムの位置変
化）即ち発現振動を評価することができる。このように
して、理想の位相変位を示す物質をスクリーニングする
ことにより、ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振
動を制御する物質を選択することができる。また、視交
叉上核切片や末梢組織の替わりに、本発明の細胞、即ち
マウスピリオド２遺伝子の上流配列をレポーター遺伝子
につないだDNAを導入した細胞を用い、細胞群を同調さ
せることにより上記スクリーニングを行うことができ
る。細胞群は、高濃度の血清あるいはデキサメサゾン
（DEX）で刺激することによって同調させることができ
るが、好ましくは実施例６に記載の方法で同調させるこ
とができる。 例えば、後述の実施例５に記載した方法で、マウスピ
リオド２遺伝子の上流配列をルシフェラーゼ遺伝子につ
ないだDNAをラットに導入したトランスジェニックラッ
ト（mPer２：lucトランスジェニックラット）の視交叉
上核切片又は末梢組織（例えば、肝臓、腎臓、肺又は眼
球）に対する自動発光測定を行ない、被検物質処理群か
ら得られた発光振動曲線と、未処理群（コントロール）
から得られた発光振動曲線とを比較することで、位相変
位を評価し、ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現振
動を制御する物質を選択することができる。実施例５に
記載の方法で行なう場合は、視交叉上核切片について、
発現振動が認められる測定開始３〜９日目のいずれかの
時において、一方はコントロールとして溶媒（例えば、
DMSO等）のみを添加した新しい培地に交換し、他方は溶
媒（DMSO等）に溶解した被検物質を添加した新しい培地
に交換し、被検物質添加後の振動をコントロールと比較
することにより、被検物質のリズムに対する作用を評価
することが可能である。また、末梢組織についても、例
えば、肝臓、肺、及び眼球は、それぞれ、振動が認めら
れる測定開始４〜５日目の間、測定開始１〜５日目の
間、及び測定開始１〜３日目の間に、同様に被検物質を
含む培地に交換すること（コントロールは溶媒のみ）に
よって、被検物質のスクリーニングが可能である。 また、後述の実施例５に示すように、末梢組織では、
数回の振動リズムを示した後、細胞間脱同調により減衰
した（図７〜図９参照）が、この減衰を抑制する薬剤を
スクリーニングすることにより、高齢者の減弱した活動
リズム及び／又は睡眠リズムを改善する作用を示す薬物
を得ることが可能となる。 なお、大きな末梢組織（例えば、肝臓又は肺等）をス
クリーニングに用いる場合は、末梢組織片を用いること
が好ましい。 本発明のトランスジェニック動物を用いる本発明のス
クリーニング法では、本発明のトランスジェニック動物
に被検物質を投与し、前記動物の視交叉上核の発現振動
を測定することにより、ピリオド２遺伝子の発現及び／
又は発現振動を制御する物質を選択することができる。 具体的には、被検物質（例えば、本発明の細胞を用い
る本発明のスクリーニング法でスクリーニングされてき
た体内リズム改善薬候補等の被検物質）を、ピリオド２
プロモーター活性を示すDNAとレポーター遺伝子を含む
コンストラクトを導入したトランスジェニック動物に投
与する。レポータータンパク質としてルシフェラーゼを
使用する場合には、頭頂部から視交叉上核近傍へ細管を
通してルシフェリンを供給し、同時に視交叉上核直上に
挿入した微小光ファイバーで個体を生かしたまま、連続
的に発光を測定する方法（文献４２）を用いることで、
リズムセンター視交叉上核の振動への作用を評価して化
合物のスクリーニングをすることが可能である。 実施例 以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、
これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、
特に断らない限り、公知の方法（例えば、Maniatis, T.
ら，“Molecular Cloning−A Laboratory Manua
l”，Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982；
及びHille, B. , lonic Channels of Excitable Me
mbranes, 2nd Ed. , Sinauer Associates Inc. , M
A, 1992）に従って実施した。 （実施例１） 《マウス及びヒトピリオド２上流のDNA配列取得と比較
解析》 マウスピリオド２の上流配列取得は、マウスゲノムDN
Aファージライブラリーを用いたスクリーニングと、ゲ
ノムウォーカーキット（クロンテック社）とを用いて行
なった。 はじめに、マウスピリオド２遺伝子（GenBank AF036
893）の既報の配列から、マウスピリオド２遺伝子のcDN
Aにおける第２１８番目〜第７２３番目の間を増幅する
ことのできるプライマーセット、すなわち、配列番号３
で表される塩基配列［マウスピリオド２遺伝子のcDNA
（GenBank AF036893）の第２１８番目〜第２３９番目
の配列］からなるフォワードプライマーと、配列番号４
で表される塩基配列［マウスピリオド２遺伝子のcDNA
（GenBank AF036893）の第７０２番目〜７２３番目の
配列に対して相補的な配列］からなるリバースプライマ
ーとを作成し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行なっ
た。なお、前記PCRは、酵素としてTaqポリメラーゼ（Am
pliTaq Gold；アプライドバイオシステムズ社）を用
い、９５℃（１０分間）の保温の後、９４℃（１５秒
間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（１分間）とからな
るサイクルを４０回繰り返すことにより実施した。 得られた増幅断片（５０５bp）をプローブとして、マ
ウスゲノムDNAのファージライブラリー（クロンテック
社）からスクリーニングを行なった。その結果、第二エ
クソンから上流６．０kbのマウスピリオド２遺伝子の第
一イントロンを含むクローンを得た。取得したファージ
DNAに対して、DNAシーケンス試薬（BigDye Terminator
Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit；ア
プライドバイオシステムズ社）を用い、マニュアルに従
ってシーケンス反応を実施した後、DNAシーケンサー（A
BI PRISM ３７７；アプライドバイオシステムズ社）
でDNA塩基配列を解析したところ、配列番号１で表され
る塩基配列の第１０１０４番目〜第１７００４番目の塩
基からなる配列が得られた。 続いて、ファージのDNA配列から更に上流の配列を取
得するため、ゲノムウォーカーキット（クロンテック
社）を用いて、上流配列の取得を進めた。ゲノムウォー
カーキットの鋳型としては、キット付属のライブラリー
MDL１〜MDL５を使用し、PCRの酵素としては、Taq DNA
ポリメラーゼ（Advantage Genomic polymerase Mi
x；クロンテック社）を使用した。 最初に、プライマーセットとして、キット付属のAP１
と、配列番号５で表される塩基配列（配列番号１で表さ
れる塩基配列の第１３００５番目〜第１３０３４番目の
塩基からなる配列に対して相補的な配列）からなるファ
ーストプライマーとを使用し、５％ジメチルスルホキシ
ド（DMSO）存在下で、９４℃（２秒間）と７２℃（３分
間）とからなるサイクルを７回、続いて、９４℃（２秒
間）と６７℃（３分間）とからなるサイクルを３６回繰
り返し、最後に６７℃で４分間保温することにより、PC
Rを実施した。続いて、得られた反応生成物の５０倍希
釈液１μLを鋳型として使用し、キット付属のAP2と、配
列番号６で表される塩基配列（配列番号１で表される塩
基配列の第１２４２９番目〜第１２４５８番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプ
ライマーとをプライマーセットとして使用し、９４℃
（２秒間）と７２℃（３分間）とからなるサイクルを５
回、続いて、９４℃（２秒間）と６７℃（３分間）とか
らなるサイクルを２４回繰り返し、最後に６７℃で４分
間保温することにより、PCRを実施した。 前記の２段階PCRにより得られた増幅バンドのシーク
エンシング解析を行なうことにより、配列番号１で表さ
れる塩基配列の第９８７４番目〜第１２４５８番目の塩
基からなる配列が得られた。この配列に基づいて、更に
上流の配列を得るためのプライマーセット、すなわち、
配列番号７で表される塩基配列（配列番号１で表される
塩基配列の第１０１０３番目〜第１０１３２番目の塩基
からなる配列に対して相補的な配列）からなるファース
トプライマーと、配列番号８で表される塩基配列（配列
番号１で表される塩基配列の第１００２１番目〜第１０
０５０番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）
からなるセカンドプライマーとを作製した。 配列番号５で表される塩基配列からなるファーストプ
ライマー及び配列番号６で表される塩基配列からなるセ
カンドプライマーの代わりに、配列番号７で表される塩
基配列からなるファーストプライマー及び配列番号８で
表される塩基配列からなるセカンドプライマーを用いる
こと以外は、前記の２段階PCRを繰り返し、得られた増
幅バンドのシークエンシング解析を行なうことにより、
配列番号１で表される塩基配列の第９１４６番目〜第１
００５０番目の塩基からなる配列が得られた。 以下、順次、更なる上流の配列を得るために、前記の
操作、すなわち、ファーストプライマー及びセカンドプ
ライマーの作製、２段階PCR、並びに得られた増幅バン
ドのシークエンシング解析を繰り返した。各２段階PCR
に使用したファーストプライマーとセカンドプライマー
との組み合わせは、 配列番号９で表される塩基配列（配列番号１で表される
塩基配列の第９３５５番目〜第９３８４番目の塩基から
なる配列に対して相補的な配列）からなるファーストプ
ライマーと 配列番号１０で表される塩基配列（配列番号１で表され
る塩基配列の第９３０７番目〜第９３３６番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプ
ライマーとの組み合わせ； 配列番号１１で表される塩基配列（配列番号１で表され
る塩基配列の第７８３８番目〜第７８５７番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列）からなるファースト
プライマーと 配列番号１２で表される塩基配列（配列番号１で表され
る塩基配列の第７８１８番目〜第７８３７番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプ
ライマーとの組み合わせ；及び 配列番号１３で表される塩基配列（配列番号１で表され
る塩基配列の第２２３４番目第２２６３番目の塩基から
なる配列に対して相補的な配列）からなるファーストプ
ライマーと 配列番号１４で表される塩基配列（配列番号１で表され
る塩基配列の第２１３４番目〜第２１６３番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列）からなるセカンドプ
ライマーとの組み合わせ であり、この順に使用した。 なお、配列番号９で表される塩基配列からなるファー
ストプライマーと配列番号１０で表される塩基配列から
なるセカンドプライマーとの組み合わせを用いた２段階
PCRにより増幅されたDNAバンドのシークエンシング解析
の結果得られた、配列番号１で表される塩基配列の第８
９１８番目〜第９３３６番目の塩基からなる配列に基づ
いて設計したプライマーを用いた２段階PCRでは、更な
る上流の配列が取得できなかった。そこで、更に上流配
列を取得するために、第一エクソンの配列に基づいて設
計した配列番号１１で表される塩基配列からなるファー
ストプライマーと配列番号１２で表される塩基配列から
なるセカンドプライマーとの組み合わせを用いて、２段
階PCRを実施した。 これまでの解析の結果、配列番号１で表される塩基配
列の第１番目〜第１７００４番目の塩基からなる配列
（但し、第７８５８番目〜第９１４５番目の塩基からな
る配列を除く）が得られた。前記の第７８５８番目〜第
９１４５番目の塩基からなる未決定配列に相当する第一
エクソンと第一イントロンとの間のギャップを埋めるた
めに、鋳型としてマウスゲノムDNAを使用し、酵素とし
てTaq DNAポリメラーゼ（Advantage Genomic polyme
rase Mix；クロンテック社）を使用し、２段階のPCR
［ネスティド（nested）PCR］を実施した。第１回目のP
CRは、プライマーセットとして、配列番号１５で表され
る塩基配列（配列番号１で表される塩基配列の第７５１
６番目〜７５４５番目の塩基からなる配列）からなるフ
ォワードプライマーと、配列番号１６で表される塩基配
列（配列番号１で表される塩基配列の第９０６３番目〜
９０９２番目の塩基からなる配列に対して相補的な配
列）からなるリバースプライマーとを使用し、５％DMSO
存在下で、９５℃で１分間保温した後、９５℃（１５秒
間）と６０℃（３０秒間）と６８℃（５分間）とからな
るサイクルを３５回繰り返し、最後に６８℃で１０分間
保温することにより、実施した。第２回目のPCRは、プ
ライマーセットとして、配列番号１７で表される塩基配
列（配列番号１で表される塩基配列の第７５５６番目〜
７５８５番目の塩基からなる配列）からなるフォワード
プライマーと、配列番号１８で表される塩基配列（配列
番号１で表される塩基配列の第８９７７番目〜９００６
番目の塩基からなる配列に対して相補的な配列）からな
るリバースプライマーとを使用すること以外は、第１回
目のPCRと同じ条件で実施した。 前記の２段階PCRの結果、１．４kbpのDNA断片が得ら
れ、その配列解析により、第一エクソンと第一イントロ
ンとの間のギャップを埋めることができた。 以上の解析の結果を全てまとめると、配列番号１で表
される塩基配列が得られた。配列番号１で表される塩基
配列には、第一エクソン（第７７３６番目〜第７８５７
番目）及び第二エクソン（第１６１５８番目〜第１６３
９６番目）と、第一イントロン（第７８５８番目〜第１
６１５７番目）とが含まれており、マウスピリオド２の
翻訳開始点は、第二エクソン（第１６１７６番目）に存
在することが明らかとなった。また、転写開始点は、第
７７３６番目に存在する（後述の実施例２参照）。 マウスとヒトとの遺伝子上流の配列比較を行なった場
合、遺伝子発現制御に重要な領域は種間で保存されてい
ることが予想されることから、ヒトピリオド２遺伝子
（GenBank NM_003894）の上流配列の取得を試みた。ド
ラフトシーケンスをネット［BLAST２；National Cente
r for Biotechnology Information（NCBI）］上で検
索した結果、ヒトピリオド２遺伝子の上流領域を含むク
ローン（GenBank ACO13400.5；188.2kbp；フェーズ
１）を見出した。 このドラフトシーケンスクローンACO13400.5は、第一
イントロンと第二エクソンとの間にギャップがあったた
め、ヒトゲノムDNA（クロンテック社）を鋳型として、P
CRを実施した。前記PCRは、プライマーセットとして、
配列番号１９で表される塩基配列（配列番号２で表され
る塩基配列の第１４５７７番目〜第１４６０６番目の塩
基からなる配列）からなるフォワードプライマーと、配
列番号２０で表される塩基配列［配列番号２で表される
塩基配列の第１５８５５番目〜第１５８８４番目の塩基
からなる配列に対して相補的な配列］からなるリバース
プライマーとを使用し、酵素として、Taq DNAポリメラ
ーゼ（AmpliTaq Gold；アプライドバイオシステムズ
社）を使用し、９５℃で１０分間保温した後、９４℃
（１５秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（２分間）
とからなるサイクルを４０回繰り返すことにより実施
し、ギャップを含むDNA断片（約１．２kbp）のDNA配列
を解析した。 一方、その後、新しいクローン（GenBank ACO12485.1
3;168.7kbp；フェーズ3完全配列）がネット上に登録さ
れたことを見出したので、前述のマウスのゲノム配列
１７００４bpに相当する領域を、クローンGenBank ACO1
2485.13 から１７１１２bp（GenBank ACO12485.13の３
５３５４番目から５２４６５番目に対して相補的な配
列）抽出し配列番号２として示した。得られたヒトピリ
オド２遺伝子の上流配列の解析から、マウスと同様にヒ
トの翻訳開始点も第二エクソンに存在することが明らか
となった。以上、マウスピリオド２遺伝子及びヒトピリ
オド２遺伝子の約１７kbpにおよぶ第二エクソンから上
流約１７kbpの配列情報を取得した。 取得したマウスピリオド２遺伝子及びヒトピリオド２
遺伝子の約１７kbpにおよぶ上流領域付近の配列情報に
対し、相同性比較（解析条件はデフォルト値）を、NCBI
のBLAST２ SEQUENCES（http：／／www. ncbi. nlm. ni
h. gov／blast／bl２seq／bl２．html）VERSION BLASTN
２．２．１ AUG-1-2001プログラムにて解析した。Expec
tがe−３以下の確度の高い領域を保存性があるとした。
その解析結果を図１に示す。図１に示すように、ヒトと
マウスとの間には、第一エクソンの前後に断片的に保存
された領域（Ｉ〜ＶＩＩ）が７つ存在することが明らか
となった。 図２に、保存された領域内のそれぞれの配列を示す。
図２において、記号「H」はヒトの配列を示し、記号
「M」はマウスの配列を示し、ヒト配列とマウス配列と
の間の「縦棒」は、ヒト及びマウスの両方で塩基の種類
が一致した箇所を表す。 以上の解析の結果を全てまとめると、配列番号２で表
される塩基配列には、第一イントロン（第６０６９番目
〜第１６４６１番目）と第二エクソン（第１６４６２番
目〜第１６７１０番目）とが含まれており、ヒトピリオ
ド２の翻訳開始点は、第１６４８１番目に存在すること
が明らかとなった。 ゲノムDNAを鋳型とするPGRにより、上流領域DNA断片
を取得した場合には、遺伝子変異が生じる可能性があ
る。マウスゲノムのファージライブラリー（クロンテッ
ク社）のマニュアルに従って、１×１０6のファージか
ら、変異のない上流領域DNA断片を含むファージのクロ
ーニングを試みた。 プローブ調製のために、先に得られたマウスピリオド
２遺伝子の上流の配列情報を基に、配列番号１７で表さ
れる塩基配列からなるプライマーと、配列番号１８で表
される塩基配列からなるプライマーとを設計した。PCR
は、鋳型としてマウスゲノムDNA（クロンテック社）を
使用し、酵素としてTaq DNAポリメラーゼ（Advantage
Genomic DNA polymerase Mix；クロンテック社）を
使用し、９５℃で１分間保温した後、９５℃（１５秒
間）と６０℃（３０秒間）と６８℃（２分間）とからな
るサイクルを３５回繰り返すことにより実施し、１．４
kbのDNA断片を取得した。 得られたDNA断片をプラスミド（pBluescript；STRATA
GENE社）のEcoRV部位にクローニングし、増幅した。こ
のプラスミドに制限酵素Not I／Sal I処理を行ない、ア
ガロースゲル電気泳動によりプローブ用DNA断片を取得
した。次いで、プローブ用DNA断片を、ラベリングキッ
ト（BcaBESTラベリングキット：宝酒造株式会社）のマ
ニュアルに従って、［α−32P］dCTP（Amersham Pharm
acia Biotech社）を用いて標識した。このプローブを
用いたマウスゲノムファージライブラリーのスクリーニ
グの結果、ヒトとマウスとの間の６つの保存領域を含む
クローンを取得した。マニュアルに従って、このファー
ジクローンを大量調製し、上流領域を含むファージDNA
を、ファージDNA抽出キット（QIAGEN社）を用いて調製
した。 ７つの保存領域を含むDNA断片を取得するため、得ら
れたファージゲノムを制限酵素EcoT２２Ｉ／Nhe Iで切
り出し、アガロースゲル電気泳動を行うことにより、
６．４kbのDNA断片のバンドを抽出精製した。前記DNA断
片の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の第４
４１５番目〜第１０８７７番目の塩基からなる配列であ
る。精製したDNA断片をDNAブランティングキット（宝酒
造株式会社）にて平滑末端化を行なった。 ルシフェラーゼベクターpGL３−basic（プロメガ社；
以下、pGL３−bと略称する）は、プロモータ配列を持た
ないレポーターベクターであり、上流断片のプロモータ
活性を評価することができる。このベクターpGL３−bを
制限酵素Sma I で切断した後に、先に平滑末端化したマ
ウス上流断片を組み込むことにより、ベクターpCH1を作
製した。次いで、前記ベクターpCH1に対して制限酵素Xh
o I／SnaB I処理を行なった後、アガロースゲル電気泳
動でDNA断片を除き、セルフライゲーションを行なうこ
とにより、ベクターpCH1から第一イントロン側の保存領
域（ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ）を除いたベクターpCH3を
作製した。前記ベクターpCH3の内、マウスピリオド２遺
伝子の上流域部分の配列は、配列番号１で表される塩基
配列の第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基からなる
配列に該当する。 （実施例２） 《マウスピリオド２の転写開始点の同定》 前記実施例１で取得したマウスピリオド２遺伝子上流
領域断片を含むベクターpCH1及びベクターpCH3が、プロ
モーター領域を含むか否かは、転写開始点を含んでいる
かを調べることで確かめることができる。転写開始点同
定のため、オリゴキャップ法により作製されたマウス全
脳のcDNAライブラリー（文献３２，文献３３）を用い
て、キャップ部位の同定を試みた。
【００５１】
キャップ部位には配列番号２１で表される塩基配列か
らなるアダプターがついているので、前記アダプターに
対しては、配列番号２２で表される塩基配列（配列番号
２１で表される塩基配列の第１番目〜第２１番目の塩基
からなる配列）からなるプライマー及び配列番号２３で
表される塩基配列（配列番号２１で表される塩基配列の
第１１番目〜第３０番目の塩基からなる配列）からなる
プライマーを作製した。一方、マウスピリオド２遺伝子
に対しては、配列番号２４で表される塩基配列［マウス
ピリオド２遺伝子のcDNA（GenBank AFO36893）の第４
３９番目〜第４５９番目の塩基からなる配列に対して相
補的な配列］からなるプライマー、配列番号２５で表さ
れる塩基配列［マウスピリオド２遺伝子のcDNA（GenBan
k AFO36893）の第３７７番目〜第３９８番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマ
ー、及び配列番号２６で表される塩基配列［マウスピリ
オド２遺伝子のcDNA（GenBank AFO36893）の第３００
番目〜第３１９番目の塩基からなる配列に対して相補的
な配列］からなるプライマーを作製した。 配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマー
及び配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマ
ーを用いる第１回目のPCRと、配列番号２３で表される
塩基配列からなるプライマー及び配列番号２５で表され
る塩基配列からなるプライマーを用いる第２回目のPCR
とからなるネスティドPCRを実施したところ、キャップ
部位を含む４１４bpのDNA断片が得られた。また、配列
番号２２で表される塩基配列からなるプライマー及び配
列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーを用
いる第１回目のPCRと、配列番号２３で表される塩基配
列からなるプライマー及び配列番号２６で表される塩基
配列からなるプライマーを用いる第２回目のPCRとから
なるネスティドPCRを実施したところ、キャップ部位を
含む３３５bpのDNA断片が得られた。 これらのDNA断片に対するシークエンス解析の結果、
転写開始点は、翻訳開始点（配列番号１で表される塩基
配列の第１６１７６番目の塩基）から８４４０bp上流
（配列番号１で表される塩基配列の第７７３６番目の塩
基）に存在することが明らかとなった。このことから、
構築したベクターpCH1及びベクターpCH3に転写開始点が
含まれ、ベクターpCH1は、マウスピリオド２遺伝子の−
３３２１〜＋３１４２（転写開始点を「＋１」する）の
塩基を有し、ベクターpCH3は、マウスピリオド２遺伝子
の−３３２１〜＋１９６の塩基を有することを確認し
た。 （実施例３） 《マウスピリオド２上流領域のプロモータ活性とエンハ
ンサー活性の解析》 マウス培養細胞NIH3T3を、ルシフェラーゼアッセイの
前日に、６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０5
ずつ撒いた。トランスフェクション試薬としてリポフェ
クタミン2000（GIBCO−BRL社）を用い、各種レポーター
ベクター１μgとインターナルコントロールベクター（P
RL−SV４０；プロメガ社）２０ngとを用いて、マニュア
ルに従ってトランスフェクションを行なった。前記レポ
ーターベクターとしては、前記実施例１で取得したベク
ターpCH1及びベクターpCH3、ネガティブコントロールと
してプロモーター活性を有しないベクターpGL３−b（プ
ロメガ社）、そして、ポジティブコントロールとして、
ルシフェラーゼの上流にSV４０プロモーターが連結され
ているベクターpGL３−promoter（プロメガ社；以下、p
GL３−pと略称する）を使用した。 なお、インターナルコントロールベクター（PRL−SV
４０）以外のベクター（すなわち、ベクターpGL３−b、
ベクターpCH1、ベクターpCH3、及びベクターpGL３−p）
に含まれるルシフェラーゼ遺伝子が、ホタル由来である
のに対して、インターナルコントロールベクター（PRL
−SV４０）に含まれるルシフェラーゼ遺伝子は、シーパ
ンジー（sea pansy）由来である。 トランスフェクションから４８時間経過後に、細胞を
リン酸緩衝用液（PBS）で１回洗浄した後、アッセイキ
ット（ピッカジーンデュアルレポーターアッセイキッ
ト；ニッポンジーン社）を用いて、マニュアルに従って
アッセイを行なった。発光測定は、マイクロタイタール
ミノメーターML3000（Dynatech Labratories社）を用
いて行なった。 結果を図３に示す。図３において「BLK」は、トラン
スフェクションを実施していない宿主細胞における発光
量を意味する。また、図３に示す「ルシフェラーゼ相対
活性（標準化）」は、インターナルコントロールベクタ
ー（PRL−SV４０）に由来するルシフェラーゼ発現量に
基づいて、標準化した値を意味する。図３に示すよう
に、ベクターpCH1のベーサルのプロモーター活性は、低
い活性（ベクターpGL３−pの７％）であったのに対し、
ベクターpCH3は、ベクターpGL３−pの５５％のプロモー
ター活性を示した。 保存された７つの領域（Ｉ〜ＶＩＩ）の内、第一エク
ソン上流の３つの保存領域（Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ）を
含むベクターpCH3が機能的であるかどうかを評価するた
め、ピリオドの転写活性化因子であるBMAL1/CLOCKヘテ
ロダイマーにより転写活性化されるか否かを検討した。 すなわち、ベクターpCH3（１０ng）と一緒に、pCI−n
eo−Baml 1及びpCI−neo−Clockを、それぞれ、２５n
g、５０ng、又は２５０ngずつ加えて、リポフェクタミ
ン2000（GIBCO−BRL社）を用いてトランスフェクション
を行なった。なお、前記ベクターpCI−neo−Baml 1及び
ベクターpCI−neo−Clockは、pCI−neoベクター（プロ
メガ社）に、それぞれ、マウスビーマル1又はマウスク
ロックを導入したもの（文献３４）であり、マウスビー
マル1及びマウスクロックは、培養細胞内で構成的に発
現される。また、前記トランスフェクションの際には、
インターナルコントロールとしてpRL−CMV（プロメガ
社）０．５ngを加え、更に、トランスフェクションする
DNAが全量で１μgになるように、pCI−neoベクター（プ
ロメガ社）で調整した。 トランスフェクションから４８時間経過後に、前記操
作と同様に、アッセイキット（ピッカジーンデュアルレ
ポーターアッセイキット；ニッポンジーン社）を用いて
発光測定を行なった。 結果を図４に示す。図４における「BLK」は、図３に
示す「BLK」と同じ意味である。図４に示すように、用
量依存的なBMAL1/CLOCKヘテロダイマーによる転写活性
化を確認した。この結果から、構築したマウスピリオド
２遺伝子上流を含むルシフェラーゼベクターが機能的で
あることが判明した。 （実施例４） 《mPer２：lucトランスジェニックラットの作製》 前記実施例３で実施したイン・ビトロの実験結果か
ら、ベクターpCH3がピリオド２遺伝子本来の発現を示す
のに充分な要素を含むことが考えられることから、これ
を用いてmPer２：Lucトランスジェニックラットの作製
を試みた。 まず、遺伝子導入ラットを作製するにあたり、ベクタ
ー自身に由来する配列（例えば、複製開始Ori及びアン
ピシリン耐性遺伝子など）を制限酵素Sall／Mlul処理に
続くアガロースゲル電気泳動により除いた。目的の断片
の精製は、ゲルバンド精製キット（QlAquick；QIAGEN
社）を用いて行ない、フェノール／クロロホルム処理を
実施した後、滅菌TEバッファー［１０mmol／L−Tris−C
l（pH８．０），１mmol／L−EDTA（pH８．０）］１００
μLに溶解することによりDNA溶液（濃度＝７５ng／μ
L）を調製した。前記DNA断片には、配列番号１で表され
る塩基配列の第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基か
らなる配列と、ルシフェラーゼをコードする遺伝子とが
含まれる。 トランスジェニックラットを作製するため、日本チャ
ールスリバーからWistarラットを購入した。トランスジ
ェニックラットの作製操作は、基本的には公知方法（文
献３５）に基づいて実施し、ラット前核期受精卵への注
入用DNA溶液のマイクロインジェクションは、以下の要
領で行なった。 すなわち、性成熟した８週齢のWistarラットを、明暗
サイクル１２時間（４：００〜１６：００を明時間とし
た）、温度２３±２℃、及び湿度５５±５％の条件下で
飼育し、膣スメアにより雌の性周期を観察して、ホルモ
ン処理日を選択した。まず、雌ラットに妊馬血清性性腺
刺激ホルモン［PMS全薬（pregnant mare serum gonad
otropin；PMSG）；日本ゼンヤク社］１５０IU／kgを腹
腔内投与して過剰排卵処理を行ない、その４８時間後に
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン［プベローゲン（human c
horionic gonadotropin；hCG）；三共臓器社］７５IU
／kgを投与した後、雄との同居により交配を行なった。
hCG投与から３２時間経過後に、卵管灌流により前核期
受精卵を採取した。卵管灌流及び卵の培養にはmKRB液
（文献３６）を使用した。採取した受精卵を、０．１％
ヒアルロニダーゼ（Hyaluronidase Typel−S；シグマ
社）を含むmKRB液中で、３７℃にて５分間の酵素処理を
行ない、卵丘細胞を除去した後、mKRB液で３回洗浄して
酵素を除去し、DNA注入操作までCO2−インキュベーター
内（５％CO2，３７℃，飽和湿度）に保存した。このよ
うにして準備したラット受精卵の雄性前核に、先に調製
したDNA溶液を注入した。５２５個の胚に注入操作を実
施し、生き残った４３１個の胚の内、形態的正常胚４２
０個を偽妊娠誘起した仮親雌の卵管内に移植した。 ラットに外来DNA（ルシフェラーゼ遺伝子を含む）が
導入されたか否かを調べるために、ルシフェラーゼ遺伝
子に対するPCRプライマーとして、配列番号２７で表さ
れる塩基配列［クローニングベクターpGL３−b（GenBan
k U47295）の第４１０番目〜第４３２番目の塩基から
なる配列］からなるプライマー及び配列番号２８で表さ
れる塩基配列［クローニングベクターpGL３−b（GenBan
k U47295）の第９８０番目〜第１０００番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマー
を設計した。これらのプライマーを用いたPCRにより増
幅されるDNA産物（５９１bp）の有無により、外来DNA
（ルシフェラーゼ遺伝子を含む）の導入を確認すること
ができる。 ４２０個の胚移植により６５匹のラットが生まれた。
３週齢時に、産子の尾の先１cm程度を小直剪刀にて切断
し、リシス溶液８００μLを加えて５５℃恒温槽内で一
晩振とうすることによって尾を溶解した。なお、前記リ
シス溶液は、リシスバッファー［最終濃度として、Tris
−HCl（pH８．０）が５０mmol／Lであり、EDTA（pH８．
０）が１００mmol／Lであり、NaClが１００mmol／Lであ
り、SDSが１％である溶液］の中に、アクチナーゼEとプ
ロテアーゼKとを、最終濃度がともに１０mg／mLになる
ように溶解して調製した。 続いて、フェノール処理を２度行ない、遠心後の上部
水層を採取し、イソプロパノールの入ったチューブに移
した。混和後、現れた糸状ゲノムDNAを、加工したガラ
ス製のマイクロピペットの先で巻き取り、それを７０％
エタノールで５分間、続いて１００％エタノールに５分
間つけ、最後にTEをつけて溶解し、各個体のゲノムDNA
の調製を行なった。 各個体ゲノムDNAを鋳型としたPCRは、Taq DNAポリメ
ラーゼ（ロッシュダイアグノスティック社）を用い、９
４℃で１分間保温した後、９４℃（３０秒）と５７℃
（３０秒）と７２℃（６０秒）とからなるサイクルを４
０回繰り返すことにより実施した。その結果、生まれた
６５匹のラットの内、８匹がmPer２：Lucトランスジェ
ニックラットであることが明らかとなった。 更に、７週齢時に、８匹のmPer２：Lucトランスジェ
ニックラットの尾の先５mm程度を小直剪刀により切断し
た。切断面にルシフェリン溶液を塗り、切断面を上にし
て極微弱発計数装置［フォトマル（型名LM−300Y2） ；
浜松フォトニクス社］で発光量を測定した。なお、前記
ルシフェリン溶液は、フェノールレッドを含まないDMEM
培地（cat. 13000-054；GIBCO−BRL社）に、HEPES（pH
７．２；最終濃度＝１０mmol／L）、ペニシリン抗生物
質（最終濃度＝２５U／mL）、ストレプトマイシン抗生
物質（最終濃度＝２５μg／mL）、炭酸水素ナトリウム
（NaHCO3；最終濃度＝０．３g／L）、及びルシフェリン
［Cat. E1601（プロメガ社）；最終濃度＝０．１mmol／
L］を加えて調製した。 その結果、８匹中、４匹のラットの尾が、それぞれ９
２３cps、４３９２cps、１１２２cps、及び８６５cpsを
示した。これらの発光量は、コントロール（野生型ラッ
トの尾）の１００cps前後に比べて、有意な発光量であ
り、ルシフェラーゼが生体内で機能するmPer２：Lucト
ランスジェニックラット４匹を取得したことを確認し
た。 これらの４匹のメスのトランスジェニックラット（F
O）の内、尻尾の発光量が最も高かったライン（４３９
２cps）と野生型のオスとを交配させ、F１ラット１１匹
を取得した（オス５匹及びメス６匹）。 （実施例５） 《mPer２：lucトランスジェニックラットの視交叉上核
切片及び末梢組織（肝臓片、肺片、及び眼球）に対する
自動発光測定の実施》 実施例４で取得したF１ラットは、野生型とヘテロ・
トランスジェニックラットとの交配であるため、その嫡
出子F１には、野生型と、ヘテロのトランスジェニック
ラットとが含まれる。本実施例で実験に供するトランス
ジェニックラットを、前記F１ラットの中から選択する
ために、前記F１ラット（すなわち、実施例４で取得し
た尻尾の発光量が最も高かったラインと野生型との交配
から得たF１ラット）の尻尾を６週齢時に切断し、実施
例４と同様にして発光を示すかどうかを検討した。その
結果、有意な発光を示すF１のトランスジェニックラッ
トは８匹であることが明らかとなった（オス４匹及びメ
ス４匹）。この８匹のトランスジェニックラットの内、
１匹のメス（７週齢）から、以下に示す手順に従って、
リズムセンターである視交叉上核切片と、末梢組織（肝
臓片、肺片、及び眼球）とをそれぞれ調製し、リアルタ
イム振動測定を実施した。 まず、視交叉上核切片の調製については、以下のよう
にして実施した。すなわち、ジエチルエーテルによりト
ランスジェニックラットを麻酔し、頸椎脱臼による屠殺
の後、光による入力を遮断するため、両眼を切除し、全
脳の摘出を行なった。全脳の内、余分な側頭部、前頭葉
部、及び小脳をメス刃で切除し、氷冷したスライサー台
に接着剤（アロンアルファ２０１；東亞合成株式会社）
にて固定した。スライサー台に固定した脳に、ハンクス
バッファー［最終濃度として、１×Hanks Buffer（GIB
CO−BRL社；cat. 14060-057）及び１０mmol／L−HEPES
（pH７．２）（GIBCO−BRL社；cat. 15630-080）］を加
えて満たし、氷冷しながらスライサー（Microslicer D
TK−1000；堂阪イーエム株式会社）にて、切片（４００
μm厚）調製を行なった。視交叉上核を含む切片を実体
顕微鏡（SMZ645；ニコン社）観察にて選択した。更に、
実体顕微鏡下で、この切片から第三脳室下の視交叉上核
だけを、メス刃を用いて切り取ることにより、視交叉上
核切片の調製を行なった。 一方、ルシフェリンを含む測定用培地［フェノールレ
ッド不含のDMEM（Dulbecco' s modified Eagle' s m
edium；GIBCO−BRL社；cat. 13000-054）の中に、最終
濃度が１０mmol／L−HEPES（pH７．２）（GIBCO−BRL
社；cat.15630-080）、０．１mmol／Lルシフェリン・カ
リウム塩（プロメガ社）、抗生物質（２５U／mLペニシ
リン及び２５μg／mLストレプトマイシン；GIBCO−BRL
社）、及び０．３g／L−NaHCO3（和光純薬株式会社）と
なるように調製した］１．２mLを３５mmディッシュの中
に加え、その培地中にメンブレンフィルター（MiliCell
CM；ミリポア社；cat. PICMORG50）を浮かべた。下から
培地が供給される、このメンブレンフィルターの上に、
先に調製した視交叉上核切片を乗せ、培養中に培地が乾
燥しないように、３５mmディッシュの上にスライドガラ
スカバー（４０mm×５０mm；松浪硝子工業株式会社）を
乗せ、その間をシリコングリースコンパウンド（東レ・
ダウコーニングシリコーン株式会社）を塗ることによっ
て密封した。このようにして準備した視交叉上核切片入
り３５mmディッシュを、コンピューターに接続した極微
弱発計数装置（LM−300Y2；浜松フォトニクス社）内に
セットし、自動発光測定（リアルタイムモニター）を実
施した。自動発光測定は２０日間にわたって継続し、そ
の間に１回だけ（測定開始から１０日目）測定用培地を
交換した。 末梢組織については、トランスジェニックラットから
肝臓、肺、及び眼球をそれぞれ摘出した。その後、肝臓
及び肺については、メス刃により約１mm角の組織片を調
製し、以下の測定を行なった。一方、眼球については、
摘出したそのままの組織を用いて以下の測定を行なっ
た。視交叉上核切片の培養に使用したのと同じ前記ルシ
フェリン含有測定用培地の中へ、成長促進剤B−２７添
加物（５０×）［B−２７ Supplement（５０×）；GIB
CO−BRL社］を最終濃度が２％（１×）になるように加
えた培地を調製し、この中に直接、末梢組織（肝臓片、
肺片、又は眼球）を入れ、カバーガラスで密封し、視交
叉上核切片と同様に極微弱発計数装置により自動発光測
定を実施した。自動発光測定は２０日間にわたって継続
し、その間に１回だけ（測定開始から１０日目）測定用
培地を交換した。 視交叉上核切片における最初の１０日間（すなわち、
測定開始から１０日間経過後まで）の自動発光測定の結
果を図５及び図６に示し、末梢組織（肝臓片、肺片、及
び眼球）における最初の１０日間の自動発光測定の結果
をそれぞれ、図７、図８、及び図９に示す。図５〜図９
において、横軸は、測定開始からの日数（測定開始日を
０日とした）を表わし、縦軸は発光量（cpm）を表わ
す。なお、図６は、図５に示すグラフを、縦軸方向にの
み拡大し、その一部を示すグラフである。 図５及び図６に示すように、視交叉上核切片の発光量
は、測定開始から３日目の約９時間後には振動ピークを
示し、その後、約２４時間ごとの振動リズムが認められ
た。なお、この振動は、測定開始から２０日目まで継続
した。 肝臓片の発光量は、図７に示すように、測定開始３日
目の約１８時間後と、４日目の約１８時間後に振動のピ
ークを示したが、その後の振動は減衰により認められな
かった。また、測定開始１０日目の培地交換によって、
４回まで振動リズムが回復したことから、振動リズムの
減衰は細胞の死滅によるものではなく、細胞間の脱同調
によるものであると考えられる。 肺片の発光量は、図８に示すように、急激な変化を伴
いながらも測定開始日から計５回の振動リズムが認めら
れた。 眼球の発光量は、図９に示すように、測定開始１日目
の約１４時間後をピークとする振動リズムがみられ、そ
の後、振幅は小さいものの３回の振動リズムが認められ
た。 以上、視交叉上核及び末梢組織（肝臓、肺、及び眼
球）は、各組織ごとに振動位相や振動の継続回数に差異
はあるものの、全ての組織において約２４時間の振動リ
ズムが認められた。本発明のトランスジェニックラッ
ト、又はその視交叉上核切片若しくは末梢組織を用いた
ピリオド２遺伝子発現自動モニター系により、ピリオド
２遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニングが可能
となると考えられる。 （実施例６） 《培養細胞系におけるマウスピリオド２プロモーターの
振動誘導能確認》 ラット培養細胞Rat-1を高濃度のウマ血清あるいはDEX
で刺激すると、細胞群が同調し、時計遺伝子および時計
遺伝子に制御される遺伝子群がいっせいに２４時間間隔
の発現振動を開始し数日に渡って継続し、その後減衰す
ることが報告されている（文献２）。 マウスピリオド２遺伝子上流領域をルシフェラーゼベ
クターに連結した、前述のpCH3コンストラクトを、Rat-
1細胞にトランジェントに導入し、その後DEX刺激を行
い、ルシフェラーゼを含む培地に交換して、そこからの
発光を、前述の極微弱発光計測装置にてリアルタイムに
計測することを試みた。具体的な方法を以下に記述す
る。まず、Rat-1細胞（ATCCより購入：Designation＝
Rat１−R１２；ATCC Number＝CRL−2210）を、２２５c
m2フラスコ（イワキ社）の中で10％FBS（Fetal Bovine
Serum；JRHバイオサイエンス社）を含む培地［フェノ
ールレッドを含むDMEM（cat. 11965-092）の中に、最終
濃度が抗生物質（１００U／mLペニシリン及び１００μg
／mLストレプトマイシン；GIBCO−BRL社）となるように
調製した］2mL存在下、5％CO2、37度環境下で培養維持
した。トランスフェクション前日に、３５mm ディッシ
ュ（ファルコン社）に、１ウェルあたり、１．２×１０
6の細胞数になるようにRat-1細胞を撒き、5％FBSを含む
前記培地2mLにて培養を継続した。翌日、１マイクログ
ラムのpCH3コンストラクトをトランスフェクション試薬
であるリポフェクタミン2000（GIBCO−BRL社）を用い、
添付のマニュアルに従ってトランスフェクションした。
トランスフェクションの３時間後に、新鮮な10％FBSを
含む前記培地2mLに交換し培養を継続した。トランスフ
ェクション１６時間後に、最終濃度0.1マイクロmol／L
のDEX（SIGMA社；cat. D-8893）を含む前記培地（10％F
BS含む）に交換して刺激を開始した。DEX刺激２時間後
にルシフェリンを含む測定用培地（最終濃度0.1ミリmol
／Lのルシフェリン・カリウム塩（プロメガ社）を含む
前記培地（10％FBSを含む））2mLに交換した。ルシフェ
リンを含む測定用培地添加後、スライドガラスカバーを
のせ、シリコングリースコンパウンドにて密封し、コン
ピューターに接続した極微弱発計数装置内にセットし
て、自動発光測定（リアルタイムモニター）を実施し
た。 結果を図１０に示す。図１０の横軸は、測定開始から
の日数（測定開始日を０日とした）を表わし、縦軸は発
光量（cpm）を表わす。図１０のように、２４時間ごと
の発光の振動が観察された。このことから、我々がクレ
ームするマウスピリオド２遺伝子上流領域（配列番号１
で表される塩基配列の第４４１５番目〜７９３１番目）
は、培養細胞においても振動能を有することが確認され
た。したがって、この領域を用いることで、培養細胞に
おいて振動を変化させる物質のスクリーニングが可能で
あると考えられる。 （実施例７） 《ルシフェラーゼベクターにヒトピリオド２上流配列を
連結したコンストラクトpTM15の構築》 実施例３および、実施例５のマウスプロモーター活性
の解析結果から、７つの保存領域のうち、振動に十分で
あると考えられるのは、Ｉ〜ＩＩＩの領域であると示唆
された。そこでヒトのＩ〜ＩＩＩの領域（配列番号２で
表される塩基配列の第３８２０番目〜６０６８番目）を
含むDNA断片を取得するために、鋳型としてヒトゲノムD
NA（クロンテック社）を使用し、酵素としてTaqポリメ
ラーゼ（Advantage−GC Genomic polymerase Mix；ク
ロンテック社）を使用し、PCRを実施した。PCRは、配列
番号２９で表される塩基配列（配列番号２で表される塩
基配列の第３６４４番目〜３６７１番目の塩基からなる
配列）からなるフォワードプライマーと、配列番号３０
で表される塩基配列（配列番号２で表される塩基配列の
第６４０２番目〜６４２９番目の塩基からなる配列に対
して相補的な配列）からなるリバースプライマーとを使
用し、９４℃で１分間保温した後、９４℃（１５秒間）
と５８℃（３０秒間）と６８℃（４分間）とからなるサ
イクルを３５回繰り返し、最後に６８℃で１０分間保温
することにより、実施した。PCRの結果、２．８kbpのDN
A断片が得られた。一般的に、Taqポリメラーゼにより増
幅されたPCR断片は３’末端にヌクレオチドAが付加され
ることから、Aが付加されたDNA断片を効率よくクローニ
ングするために、ルシフェラーゼベクターpGL３−basic
のSma IサイトにヌクレオチドTを付加したクローニング
ベクターの作製を試みた。すなわちpGL３−basicを制限
酵素Sma I で処理して切断した後、１％アガロースゲル
で電気泳動を行い、ゲルから切断されたベクターを抽出
し、Taqポリメラーゼ（ロッシュダイアグノスティック
社）を含むPCR反応液に加えて７０度で２時間保温し、S
ma I 切断部位へのオリゴヌクレオチドT付加を行った。
このようにして作製したPGL３−basic TAベクターは、P
CR断片を効率よくSma I 部位にクローニングできる。PG
L３−basic TAベクターに先述のPCRにより取得した２．
８kbpのPCR断片を組み込むことによって、レポーターベ
クターpTM15を作製した。ベクターpTM15の内、ヒトピリ
オド２遺伝子の上流域部分の配列は、配列番号２で表さ
れる塩基配列の第３６４４番目〜６４２９番目の塩基か
らなる配列に該当し、保存領域Ｉ〜ＩＩＩ（配列番号２
で表される第３８２０番目〜第６０６８番目）を含む。 （実施例８） 《ヒトピリオド２の転写開始点の同定》 実施例２において、マウスピリオド２の転写開始点がＩ
〜ＩＩＩ保存領域内に存在すること明らかにしたが、ヒ
トピリオド２の転写開始点に関する情報はない。そこ
で、ヒトピリオド２の転写開始点同定のため、オリゴキ
ャップ法により作製されたヒト小脳のcDNAライブラリー
（ソースとなるTotal RNAはクロンテック社（cat. 6403
5-1）から入手；文献３２，文献３３）を用いて、キャ
ップ部位の同定を試みた。すなわち、配列番号２２で表
される塩基配列からなるプライマー及び、配列番号３１
で表される塩基配列［ヒトピリオド２遺伝子のcDNA（Ge
nBank NM_003894.1）の第４８０番目〜５０１番目の塩
基からなる配列に対して相補的な配列］からなるプライ
マーを用いる第１回目のPCRと、配列番号２３で表され
る塩基配列からなるプライマー及び配列番号３２で表さ
れる塩基配列［ヒトピリオド２遺伝子のcDNA（GenBank
NM_003894.1）の第１２２番目〜第１４３番目の塩基
からなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマ
ーを用いる第２回目のPCRとからなるネスティドPCRを実
施したところ、キャップ部位を含む２０９bpと３２３bp
の二つのDNA断片が得られた。これら２つのDNA断片に対
するシークエンス解析の結果、ヒトピリオド２遺伝子の
第一エクソンは二種類（便宜的にエクソン１A、エクソ
ン１Bとする）存在し、これが第二エクソン（配列番号
２で表される塩基配列の第１６４６２番目〜１６７１０
番目）にそれぞれ独立して連結することが明らかとなっ
た。エクソン１Aは配列番号２で表される塩基配列の第
５６２５番目〜５７７３番目であり、エクソン１Bは配
列番号２で表される塩基配列の第５８０６番目〜６０６
８番目である。このように、ヒトピリオド２遺伝子の転
写開始点は二つ存在し、配列番号２で表される塩基配列
の第５６２５番目（エクソン１A）と第５８０６番目
（エクソン１B）に存在することを明らかにした。この
ことから、構築したベクターベクターpTM15に転写開始
点が含まれることを確認した。 （実施例９） 《培養細胞系における、ヒトピリオド２プロモーターの
振動誘導能確認》 実施例６と同様の方法により、培養細胞におけるヒト
ピリオド２プロモーターベクターpTM15の振動誘導能を
調べた結果、図１１に示す有意な振動を確認した。図１
１の横軸は、測定開始からの日数（測定開始日を０日と
した）を、縦軸は発光量（cpm）を表わす。我々がクレ
ームするヒトピリオド２遺伝子上流領域（配列番号２で
表される第３８２０番目〜６０６８番目）を含むDNA断
片が培養細胞においても振動能を示したことから、この
領域を用いることで、培養細胞において振動を変化させ
る物質のスクリーニングが可能であると考えられる。 （実施例１０） 《ルシフェラーゼベクターにマウスピリオド2上流配列
を連結したデリーションコンストラクトの作製》 実施例 1で取得したマウスピリオド２遺伝子上流領域
断片で第一エクソン上流の３つの保存領域（Ｉ、ＩＩ、
及びＩＩＩ）を含むベクターｐＣＨ３（配列番号１で表
される塩基配列の第４４１５番目から第７９３１番目の
塩基からなる配列を含む）が、実施例３の図３に示すよ
うに強いプロモーター活性を有し、且つ、図４に示すよ
うにピリオドの転写活性化因子であるBAML1/CLOCKヘテ
ロダイマーにより転写活性化されることが明らかとなっ
ている。マウスピリオド２遺伝子のベーサルプロモータ
ー活性に重要な領域及びBMAL1/CLOCKヘテロダイマーに
よる転写活性化に重要な領域が、３つの保存領域のどこ
に存在するのかを明らかにするために保存領域デリーシ
ョンコンストラクトを作製して検討した。まず、保存領
域Ｉ，ＩＩ，及びＩＩＩ（それぞれ、配列番号１で表さ
れる塩基配列の第５９３２番目から第６０４３番目の、
第６０８７番目から第６１７９番目の、及び第７５１８
番目から第７７３５番目の塩基からなる配列に該当す
る）を全て含むより短い塩基配列からなるデリーション
コンストラクトを作製した。前記ベクターｐＣＨ３に対
して制限酵素Ｍｌｕｉ／ＢａｌＩ処理を行ない、切断し
たＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により除去し
た。このようにしてデリーションＤＮＡ断片を欠失させ
たものについてセルフライゲーションを行なうことによ
り、ベクターｐＣＨ３からベクターｐＣＨ３−Ｄ１を作
製した。ベクターｐＣＨ３−Ｄ１の内、マウスピリオド
２遺伝子の上流領域部分の配列は、配列番号１で表され
る塩基配列の第５２４９番目〜第７９３１番目の塩基か
らなる配列（転写開始点を「+１」とすると-２４８７〜
+１９６の塩基配列）に該当する。次いで、保存配列Ｉ
及びＩＩを欠失させたデリーションコンストラクトを作
製した。ベクターｐＣＨ３に対して制限酵素ＭｌｕＩ／
ＥｃｏＲＩ処理処理を行ない、切断したＤＮＡ断片をア
ガロースゲル電気泳動により除去した。このようにして
デリーションＤＮＡ断片を欠失させたものについてセル
フライゲーションを行なうことにより、ベクターｐＣＨ
３からベクターｐＣＨ３−Ｄ２を作製した。ベクターｐ
ＣＨ３−Ｄ２の内、マウスピリオド２遺伝子の上流領域
部分の配列は、配列番号１で表される塩基配列の第６４
１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列（転写開
始点を「+1」とすると-１３１９〜+１９６の塩基配列）
に該当する。更に、主に保存領域ＩＩＩのみを含むベク
ターを構築するために、ベクターｐＣＨ３に対して制限
酵素ＭｌｕＩ／ＢｓｔＸＩ処理を行ない、切断したＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動により除去した。この
ようにしてデリーションＤＮＡ断片を欠失させたものに
ついてセルフライゲーションを行なうことにより、ベク
ターｐＣＨ３からベクターｐＣＨ３−Ｄ３を作製した。
ベクターｐＣＨ３−Ｄ３の内、マウスピリオド２遺伝子
の上流領域部分の配列は、配列番号１で表される塩基配
列の第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配
列（転写開始点を「+1」とすると-２７３〜+１９６の塩
基配列）に該当する。 （実施例１１） 《マウスピリオド２上流領域デリーションコンストラク
トのプロモータ活性とエンハンサー活性の解析》 マウス培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３を、ルシフェラーゼアッ
セイの前日に、６ウェルプレートに１ウェル当たり１×
１０5ずつ撒いた。トランスフェクション試薬としてリ
ポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用
い、各種レポーターベクター１μgとインターナルコン
トロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０；プロメガ社）２
０ngとを用いて、マニュアルに従ってトランスフェクシ
ョンを行なった。前記レポーターベクターとしては、前
記実施例１０で取得したベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベク
ターｐＣＨ３−Ｄ２、ベクターｐＣＨ３−Ｄ３、ネガテ
ィブコントロールとしてプロモーター活性を有しないベ
クターｐＧＬ３−ｂ（プロメガ社）、そして、ポジティ
ブコントロールとして、ベクターｐＣＨ３を使用した。 なお、インターナルコントロールベクター（ＰＲＬ−
ＳＶ４０）以外のベクター（すなわち、ベクターｐＣＨ
３−Ｄ１、ベクターｐＣＨ３−Ｄ２、ベクターｐＣＨ３
−Ｄ３及びベクターｐＣＨ３）に含まれるルシフェラー
ゼ遺伝子が、ホタル由来であるのに対して、インターナ
ルコントロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０）に含まれ
るルシフェラーゼ遺伝子は、シーパンジー（ｓｅａ ｐ
ａｎｓｙ）由来である。 トランスフェクションから４８時間経過後に、細胞を
リン酸緩衝用液（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、アッセイ
キット（ピッカジーンデュアルレポーターアッセイキッ
ト；ニッポンジーン社）を用いて、マニュアルに従って
アッセイを行なった。発光測定は、マイクロタイタール
ミノメーターＭＬ３０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて行なった。 結果を図１２に示す。図１２において「ＢＬＫ」は、
トランスフェクションを実施していない宿主細胞におけ
る発光量を意味する。また、図１２に示す「ルシフェラ
ーゼ相対活性（標準化）」は、インターナルコントロー
ルベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０）に由来するルシフェラ
ーゼ発現量に基づいて、標準化した値を意味する。図１
２に示すように、ベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベクターｐ
ＣＨ−Ｄ２のベーサルのプロモーター活性は、ベクター
ｐＣＨ３の約６０％のプロモーター活性を示した。ベク
ターｐＣＨ３−Ｄ３のベーサルのプロモーター活性は、
ベクターｐＣＨ３の約８０％のプロモーター活性を示し
た。以上のことからマウスピリオド２のベーサルプロモ
ーター活性を担う領域は、配列番号１で表される塩基配
列の第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配
列の中に存在することが示唆された。この領域中に転写
開始点及び保存領域ＩＩＩが含まれることを考慮する
と、保存領域ＩＩＩがベーサルプロモーター活性の発現
に重要であると考えられる。 次に、ピリオド２が転写活性化因子BMAL1/CLOCKヘテ
ロダイマーによって転写活性化を受けるために必要な領
域について検討した。 前記ベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベクターｐＣＨ３−Ｄ
２、ベクターｐＣＨ３−Ｄ３或いはベクターｐＣＨ３の
１０ngと一緒にｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｂｍａｌ１及びｐＣＩ
−ｎｅｏ−Ｃｌｏｃｋを、それぞれ２５０ngずつ加え
て、リポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ
社）を用いてトランスフェクションを行なった。トラン
スフェクションの際には、インターナルコントロールと
してｐＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ社）０．５ngを加え、更
に、トランスフェクションするＤＮＡが全量で１μgに
なるように、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（プロメガ社）で
調整した。 トランスフェクションから４８時間経過後に、前記操
作と同様に、アッセイキット（ピッカジーンデュアルレ
ポーターアッセイキット；ニッポンジーン社）を用いて
発光測定を行なった。 結果を図１２に示す。図１２における「ＢＬＫ」は、
図４に示す「ＢＬＫ」と同じ意味である。図１２に示す
ように、ベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベクターｐＣＨ３−
Ｄ２、ベクターｐＣＨ３−Ｄ３及びベクターｐＣＨ３
は、全てビーマル1 遺伝子及びクロック遺伝子のコトラ
ンスフェクションにより転写がそれぞれおよそ５．０
倍、５．６倍、７．１倍及び５．６倍活性化されたこと
から、BMAL1/CLOCKヘテロダイマーにより転写活性化を
受けたものと考えられた。この結果から、マウスピリオ
ド２が転写活性化因子BMAL1/CLOCKヘテロダイマーによ
って転写活性化を受けるのに重要な配列は、配列番号１
で表される塩基配列の第７４６３番目〜第７９３１番目
の塩基からなる配列の中に存在することが示唆された。
この領域中に保存領域ＩＩＩが含まれることから保存領
域ＩＩＩの中に、BMAL1/CLOCKヘテロダイマーが機能す
るための応答配列が存在するものと考えられる。 （実施例１２） 《マウスピリオド２上流領域デリーションコンストラク
トの振動誘導能の解析》 実施例６と同様の方法により、実施例１０で作成した
ベクターｐＣＨ３−Ｄ３を用いて培養細胞における振動
誘導能を調べた結果、図１３に示す有意な振動を確認し
た。図１３の横軸は、測定開始からの日数（測定開始日
を０日とした）を、縦軸は発光量（cpm）を表わす。マ
ウスピリオド２遺伝子上流領域のうち保存領域ＩＩＩの
みを含むＤＮＡ断片（配列番号１で表される塩基配列の
第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列に
該当する）が、培養細胞において振動能を示したことか
ら、マウスピリオド２の保存領域ＩＩＩの中に発現振動
に重要な配列が存在すると考えられ、この領域を用いる
ことで、培養細胞において振動を変化させる物質のスク
リーニングが可能であると考えられる。 産業上の利用可能性 本発明のピリオド２遺伝子プロモーター、前記プロモ
ーター及びレポーター遺伝子を含む本発明のコンストラ
クト、本発明の細胞、本発明のトランスジェニック動
物、又はその視交叉上核切片若しくは末梢組織を用い
て、体内時計遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニ
ング系を構築することができる。前記スクリーニング系
により選択された物質は、概日リズム疾患（例えば、概
日リズム異常に起因する、睡眠傷害、うつ病、又は老年
性痴呆患者の行動異常）を改善する薬剤の候補物質とし
て有用である。 ＜文献リスト＞ 1. J. C. Dunlap, Cell, 96, 271-90（1999）． 2. A. Balsalobreら，Science, 289, 2344−7（200
0）． 3. S. S. Campbell, P. J. Murphy, Science, 279, 396
−9（1998）． 4. P. M. Sedgwick, Postgrad Med. J. , 74, 134−8.
（1988）． 5. N. Kajimura, K. Takahashi, Nippon Rinsho, 56,
404−9. （1988）． 6. K. Mishimaら，Acta Psychiatr Soand, 89, 1−7
（1994）． 7. A. Satlin, L. Volicer, V. Ross, L. Herz, S. Cam
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7）． 9. C. A. Czeisierら，Science, 233, 667−71（198
6）． 10. N. E. Rosenthalら，Sleep, 13, 354−61. （199
0）． 11. L. Wetterberg, J. Intern. Med. , 235, 5−19.
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2）． 42. 岡村均ら，2000年度時間生物学会会誌，第42頁． 43. Nature 409, 684（2001） 44. Cell, 103, 1009−1017（2000） 45. Cell, 96, 57−68（1999） 配列表フリーテキスト 以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artifi
cial Sequence」の説明を記載する。具体的には、配列
表の配列番号２１の配列で表される塩基配列は、オリゴ
キャップのアダプター配列である。配列表の配列番号２
２の配列で表される塩基配列は、配列表の配列番号２１
の配列で表される塩基配列における第１番目〜第２１番
目の塩基からなる配列である。配列表の配列番号２３の
配列で表される塩基配列は、配列表の配列番号２１の配
列で表される塩基配列における第１１番目〜第３０番目
の塩基からなる配列である。配列表の配列番号２７の配
列で表される塩基配列は、クローニングベクターpGL３
−b（GenBank U47295）の第４１０番目〜第４３２番目
の塩基からなる配列である。配列表の配列番号２８の配
列で表される塩基配列は、クローニングベクターpGL３
−b（GenBank U47295）の第９８０番目〜第１０００番
目の塩基からなる配列に対して相補的な配列である。 以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業
者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。 SEQUENCE LISTING 〈110〉Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. 〈120〉Novel clock gene promoter 〈130〉Y0212PCT 〈150〉JP 2001-107467 〈151〉2001-04-05 〈150〉JP 2001-183087 〈151〉2001-06-18 〈150〉JP 2001-383743 〈151〉2001-12-17 〈160〉32 〈210〉1 〈211〉17004 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉1 〈210〉2 〈211〉17112 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉2 〈210〉3 〈211〉22 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉3 〈210〉4 〈211〉22 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉4 〈210〉5 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉5 〈210〉6 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉6 〈210〉7 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉7 〈210〉8 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉8 〈210〉9 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉9 〈210〉10 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉10 〈210〉11 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉11 〈210〉12 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉12 〈210〉13 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉13 〈210〉14 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉14 〈210〉15 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉15 〈210〉16 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉16 〈210〉17 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉17 〈210〉18 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉18 〈210〉19 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉19 〈210〉20 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉20 〈210〉21 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉 〈223〉Description of Artificial Sequence: an adap
tor sequence of an oligo cap 〈400〉21 〈210〉22 〈211〉21 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉 〈223〉Description of Artificial Sequence: the seq
uence of the 1st to 21st bases in the base sequenc
e of SEQ ID No: 21 〈400〉22 〈210〉23 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉 〈223〉Description of Artificial Sequence: the seq
uence of the 11th to 30th bases in the base sequen
ce of SEQ ID No: 21 〈400〉23 〈210〉24 〈211〉21 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉24 〈210〉25 〈211〉22 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉25 〈210〉26 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉26 〈210〉27 〈211〉23 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉 〈223〉Description of Artificial Sequence: the seq
uence of the 410th to 432nd bases in cloning vecto
r pGL3-b（GenBank U47295） 〈400〉27 〈210〉28 〈211〉21 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉 〈223〉Description of Artificial Sequence: the seq
uence complementary to the sequence of the 980th t
o 1000th bases in cloning vector pGL3-b（GenBank U
47295） 〈400〉28 〈210〉29 〈211〉28 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉29 〈210〉30 〈211〉28 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉30 〈210〉31 〈211〉22 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉31 〈210〉32 〈211〉22 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉32
らなるアダプターがついているので、前記アダプターに
対しては、配列番号２２で表される塩基配列（配列番号
２１で表される塩基配列の第１番目〜第２１番目の塩基
からなる配列）からなるプライマー及び配列番号２３で
表される塩基配列（配列番号２１で表される塩基配列の
第１１番目〜第３０番目の塩基からなる配列）からなる
プライマーを作製した。一方、マウスピリオド２遺伝子
に対しては、配列番号２４で表される塩基配列［マウス
ピリオド２遺伝子のcDNA（GenBank AFO36893）の第４
３９番目〜第４５９番目の塩基からなる配列に対して相
補的な配列］からなるプライマー、配列番号２５で表さ
れる塩基配列［マウスピリオド２遺伝子のcDNA（GenBan
k AFO36893）の第３７７番目〜第３９８番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマ
ー、及び配列番号２６で表される塩基配列［マウスピリ
オド２遺伝子のcDNA（GenBank AFO36893）の第３００
番目〜第３１９番目の塩基からなる配列に対して相補的
な配列］からなるプライマーを作製した。 配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマー
及び配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマ
ーを用いる第１回目のPCRと、配列番号２３で表される
塩基配列からなるプライマー及び配列番号２５で表され
る塩基配列からなるプライマーを用いる第２回目のPCR
とからなるネスティドPCRを実施したところ、キャップ
部位を含む４１４bpのDNA断片が得られた。また、配列
番号２２で表される塩基配列からなるプライマー及び配
列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーを用
いる第１回目のPCRと、配列番号２３で表される塩基配
列からなるプライマー及び配列番号２６で表される塩基
配列からなるプライマーを用いる第２回目のPCRとから
なるネスティドPCRを実施したところ、キャップ部位を
含む３３５bpのDNA断片が得られた。 これらのDNA断片に対するシークエンス解析の結果、
転写開始点は、翻訳開始点（配列番号１で表される塩基
配列の第１６１７６番目の塩基）から８４４０bp上流
（配列番号１で表される塩基配列の第７７３６番目の塩
基）に存在することが明らかとなった。このことから、
構築したベクターpCH1及びベクターpCH3に転写開始点が
含まれ、ベクターpCH1は、マウスピリオド２遺伝子の−
３３２１〜＋３１４２（転写開始点を「＋１」する）の
塩基を有し、ベクターpCH3は、マウスピリオド２遺伝子
の−３３２１〜＋１９６の塩基を有することを確認し
た。 （実施例３） 《マウスピリオド２上流領域のプロモータ活性とエンハ
ンサー活性の解析》 マウス培養細胞NIH3T3を、ルシフェラーゼアッセイの
前日に、６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０5
ずつ撒いた。トランスフェクション試薬としてリポフェ
クタミン2000（GIBCO−BRL社）を用い、各種レポーター
ベクター１μgとインターナルコントロールベクター（P
RL−SV４０；プロメガ社）２０ngとを用いて、マニュア
ルに従ってトランスフェクションを行なった。前記レポ
ーターベクターとしては、前記実施例１で取得したベク
ターpCH1及びベクターpCH3、ネガティブコントロールと
してプロモーター活性を有しないベクターpGL３−b（プ
ロメガ社）、そして、ポジティブコントロールとして、
ルシフェラーゼの上流にSV４０プロモーターが連結され
ているベクターpGL３−promoter（プロメガ社；以下、p
GL３−pと略称する）を使用した。 なお、インターナルコントロールベクター（PRL−SV
４０）以外のベクター（すなわち、ベクターpGL３−b、
ベクターpCH1、ベクターpCH3、及びベクターpGL３−p）
に含まれるルシフェラーゼ遺伝子が、ホタル由来である
のに対して、インターナルコントロールベクター（PRL
−SV４０）に含まれるルシフェラーゼ遺伝子は、シーパ
ンジー（sea pansy）由来である。 トランスフェクションから４８時間経過後に、細胞を
リン酸緩衝用液（PBS）で１回洗浄した後、アッセイキ
ット（ピッカジーンデュアルレポーターアッセイキッ
ト；ニッポンジーン社）を用いて、マニュアルに従って
アッセイを行なった。発光測定は、マイクロタイタール
ミノメーターML3000（Dynatech Labratories社）を用
いて行なった。 結果を図３に示す。図３において「BLK」は、トラン
スフェクションを実施していない宿主細胞における発光
量を意味する。また、図３に示す「ルシフェラーゼ相対
活性（標準化）」は、インターナルコントロールベクタ
ー（PRL−SV４０）に由来するルシフェラーゼ発現量に
基づいて、標準化した値を意味する。図３に示すよう
に、ベクターpCH1のベーサルのプロモーター活性は、低
い活性（ベクターpGL３−pの７％）であったのに対し、
ベクターpCH3は、ベクターpGL３−pの５５％のプロモー
ター活性を示した。 保存された７つの領域（Ｉ〜ＶＩＩ）の内、第一エク
ソン上流の３つの保存領域（Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ）を
含むベクターpCH3が機能的であるかどうかを評価するた
め、ピリオドの転写活性化因子であるBMAL1/CLOCKヘテ
ロダイマーにより転写活性化されるか否かを検討した。 すなわち、ベクターpCH3（１０ng）と一緒に、pCI−n
eo−Baml 1及びpCI−neo−Clockを、それぞれ、２５n
g、５０ng、又は２５０ngずつ加えて、リポフェクタミ
ン2000（GIBCO−BRL社）を用いてトランスフェクション
を行なった。なお、前記ベクターpCI−neo−Baml 1及び
ベクターpCI−neo−Clockは、pCI−neoベクター（プロ
メガ社）に、それぞれ、マウスビーマル1又はマウスク
ロックを導入したもの（文献３４）であり、マウスビー
マル1及びマウスクロックは、培養細胞内で構成的に発
現される。また、前記トランスフェクションの際には、
インターナルコントロールとしてpRL−CMV（プロメガ
社）０．５ngを加え、更に、トランスフェクションする
DNAが全量で１μgになるように、pCI−neoベクター（プ
ロメガ社）で調整した。 トランスフェクションから４８時間経過後に、前記操
作と同様に、アッセイキット（ピッカジーンデュアルレ
ポーターアッセイキット；ニッポンジーン社）を用いて
発光測定を行なった。 結果を図４に示す。図４における「BLK」は、図３に
示す「BLK」と同じ意味である。図４に示すように、用
量依存的なBMAL1/CLOCKヘテロダイマーによる転写活性
化を確認した。この結果から、構築したマウスピリオド
２遺伝子上流を含むルシフェラーゼベクターが機能的で
あることが判明した。 （実施例４） 《mPer２：lucトランスジェニックラットの作製》 前記実施例３で実施したイン・ビトロの実験結果か
ら、ベクターpCH3がピリオド２遺伝子本来の発現を示す
のに充分な要素を含むことが考えられることから、これ
を用いてmPer２：Lucトランスジェニックラットの作製
を試みた。 まず、遺伝子導入ラットを作製するにあたり、ベクタ
ー自身に由来する配列（例えば、複製開始Ori及びアン
ピシリン耐性遺伝子など）を制限酵素Sall／Mlul処理に
続くアガロースゲル電気泳動により除いた。目的の断片
の精製は、ゲルバンド精製キット（QlAquick；QIAGEN
社）を用いて行ない、フェノール／クロロホルム処理を
実施した後、滅菌TEバッファー［１０mmol／L−Tris−C
l（pH８．０），１mmol／L−EDTA（pH８．０）］１００
μLに溶解することによりDNA溶液（濃度＝７５ng／μ
L）を調製した。前記DNA断片には、配列番号１で表され
る塩基配列の第４４１５番目〜第７９３１番目の塩基か
らなる配列と、ルシフェラーゼをコードする遺伝子とが
含まれる。 トランスジェニックラットを作製するため、日本チャ
ールスリバーからWistarラットを購入した。トランスジ
ェニックラットの作製操作は、基本的には公知方法（文
献３５）に基づいて実施し、ラット前核期受精卵への注
入用DNA溶液のマイクロインジェクションは、以下の要
領で行なった。 すなわち、性成熟した８週齢のWistarラットを、明暗
サイクル１２時間（４：００〜１６：００を明時間とし
た）、温度２３±２℃、及び湿度５５±５％の条件下で
飼育し、膣スメアにより雌の性周期を観察して、ホルモ
ン処理日を選択した。まず、雌ラットに妊馬血清性性腺
刺激ホルモン［PMS全薬（pregnant mare serum gonad
otropin；PMSG）；日本ゼンヤク社］１５０IU／kgを腹
腔内投与して過剰排卵処理を行ない、その４８時間後に
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン［プベローゲン（human c
horionic gonadotropin；hCG）；三共臓器社］７５IU
／kgを投与した後、雄との同居により交配を行なった。
hCG投与から３２時間経過後に、卵管灌流により前核期
受精卵を採取した。卵管灌流及び卵の培養にはmKRB液
（文献３６）を使用した。採取した受精卵を、０．１％
ヒアルロニダーゼ（Hyaluronidase Typel−S；シグマ
社）を含むmKRB液中で、３７℃にて５分間の酵素処理を
行ない、卵丘細胞を除去した後、mKRB液で３回洗浄して
酵素を除去し、DNA注入操作までCO2−インキュベーター
内（５％CO2，３７℃，飽和湿度）に保存した。このよ
うにして準備したラット受精卵の雄性前核に、先に調製
したDNA溶液を注入した。５２５個の胚に注入操作を実
施し、生き残った４３１個の胚の内、形態的正常胚４２
０個を偽妊娠誘起した仮親雌の卵管内に移植した。 ラットに外来DNA（ルシフェラーゼ遺伝子を含む）が
導入されたか否かを調べるために、ルシフェラーゼ遺伝
子に対するPCRプライマーとして、配列番号２７で表さ
れる塩基配列［クローニングベクターpGL３−b（GenBan
k U47295）の第４１０番目〜第４３２番目の塩基から
なる配列］からなるプライマー及び配列番号２８で表さ
れる塩基配列［クローニングベクターpGL３−b（GenBan
k U47295）の第９８０番目〜第１０００番目の塩基か
らなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマー
を設計した。これらのプライマーを用いたPCRにより増
幅されるDNA産物（５９１bp）の有無により、外来DNA
（ルシフェラーゼ遺伝子を含む）の導入を確認すること
ができる。 ４２０個の胚移植により６５匹のラットが生まれた。
３週齢時に、産子の尾の先１cm程度を小直剪刀にて切断
し、リシス溶液８００μLを加えて５５℃恒温槽内で一
晩振とうすることによって尾を溶解した。なお、前記リ
シス溶液は、リシスバッファー［最終濃度として、Tris
−HCl（pH８．０）が５０mmol／Lであり、EDTA（pH８．
０）が１００mmol／Lであり、NaClが１００mmol／Lであ
り、SDSが１％である溶液］の中に、アクチナーゼEとプ
ロテアーゼKとを、最終濃度がともに１０mg／mLになる
ように溶解して調製した。 続いて、フェノール処理を２度行ない、遠心後の上部
水層を採取し、イソプロパノールの入ったチューブに移
した。混和後、現れた糸状ゲノムDNAを、加工したガラ
ス製のマイクロピペットの先で巻き取り、それを７０％
エタノールで５分間、続いて１００％エタノールに５分
間つけ、最後にTEをつけて溶解し、各個体のゲノムDNA
の調製を行なった。 各個体ゲノムDNAを鋳型としたPCRは、Taq DNAポリメ
ラーゼ（ロッシュダイアグノスティック社）を用い、９
４℃で１分間保温した後、９４℃（３０秒）と５７℃
（３０秒）と７２℃（６０秒）とからなるサイクルを４
０回繰り返すことにより実施した。その結果、生まれた
６５匹のラットの内、８匹がmPer２：Lucトランスジェ
ニックラットであることが明らかとなった。 更に、７週齢時に、８匹のmPer２：Lucトランスジェ
ニックラットの尾の先５mm程度を小直剪刀により切断し
た。切断面にルシフェリン溶液を塗り、切断面を上にし
て極微弱発計数装置［フォトマル（型名LM−300Y2） ；
浜松フォトニクス社］で発光量を測定した。なお、前記
ルシフェリン溶液は、フェノールレッドを含まないDMEM
培地（cat. 13000-054；GIBCO−BRL社）に、HEPES（pH
７．２；最終濃度＝１０mmol／L）、ペニシリン抗生物
質（最終濃度＝２５U／mL）、ストレプトマイシン抗生
物質（最終濃度＝２５μg／mL）、炭酸水素ナトリウム
（NaHCO3；最終濃度＝０．３g／L）、及びルシフェリン
［Cat. E1601（プロメガ社）；最終濃度＝０．１mmol／
L］を加えて調製した。 その結果、８匹中、４匹のラットの尾が、それぞれ９
２３cps、４３９２cps、１１２２cps、及び８６５cpsを
示した。これらの発光量は、コントロール（野生型ラッ
トの尾）の１００cps前後に比べて、有意な発光量であ
り、ルシフェラーゼが生体内で機能するmPer２：Lucト
ランスジェニックラット４匹を取得したことを確認し
た。 これらの４匹のメスのトランスジェニックラット（F
O）の内、尻尾の発光量が最も高かったライン（４３９
２cps）と野生型のオスとを交配させ、F１ラット１１匹
を取得した（オス５匹及びメス６匹）。 （実施例５） 《mPer２：lucトランスジェニックラットの視交叉上核
切片及び末梢組織（肝臓片、肺片、及び眼球）に対する
自動発光測定の実施》 実施例４で取得したF１ラットは、野生型とヘテロ・
トランスジェニックラットとの交配であるため、その嫡
出子F１には、野生型と、ヘテロのトランスジェニック
ラットとが含まれる。本実施例で実験に供するトランス
ジェニックラットを、前記F１ラットの中から選択する
ために、前記F１ラット（すなわち、実施例４で取得し
た尻尾の発光量が最も高かったラインと野生型との交配
から得たF１ラット）の尻尾を６週齢時に切断し、実施
例４と同様にして発光を示すかどうかを検討した。その
結果、有意な発光を示すF１のトランスジェニックラッ
トは８匹であることが明らかとなった（オス４匹及びメ
ス４匹）。この８匹のトランスジェニックラットの内、
１匹のメス（７週齢）から、以下に示す手順に従って、
リズムセンターである視交叉上核切片と、末梢組織（肝
臓片、肺片、及び眼球）とをそれぞれ調製し、リアルタ
イム振動測定を実施した。 まず、視交叉上核切片の調製については、以下のよう
にして実施した。すなわち、ジエチルエーテルによりト
ランスジェニックラットを麻酔し、頸椎脱臼による屠殺
の後、光による入力を遮断するため、両眼を切除し、全
脳の摘出を行なった。全脳の内、余分な側頭部、前頭葉
部、及び小脳をメス刃で切除し、氷冷したスライサー台
に接着剤（アロンアルファ２０１；東亞合成株式会社）
にて固定した。スライサー台に固定した脳に、ハンクス
バッファー［最終濃度として、１×Hanks Buffer（GIB
CO−BRL社；cat. 14060-057）及び１０mmol／L−HEPES
（pH７．２）（GIBCO−BRL社；cat. 15630-080）］を加
えて満たし、氷冷しながらスライサー（Microslicer D
TK−1000；堂阪イーエム株式会社）にて、切片（４００
μm厚）調製を行なった。視交叉上核を含む切片を実体
顕微鏡（SMZ645；ニコン社）観察にて選択した。更に、
実体顕微鏡下で、この切片から第三脳室下の視交叉上核
だけを、メス刃を用いて切り取ることにより、視交叉上
核切片の調製を行なった。 一方、ルシフェリンを含む測定用培地［フェノールレ
ッド不含のDMEM（Dulbecco' s modified Eagle' s m
edium；GIBCO−BRL社；cat. 13000-054）の中に、最終
濃度が１０mmol／L−HEPES（pH７．２）（GIBCO−BRL
社；cat.15630-080）、０．１mmol／Lルシフェリン・カ
リウム塩（プロメガ社）、抗生物質（２５U／mLペニシ
リン及び２５μg／mLストレプトマイシン；GIBCO−BRL
社）、及び０．３g／L−NaHCO3（和光純薬株式会社）と
なるように調製した］１．２mLを３５mmディッシュの中
に加え、その培地中にメンブレンフィルター（MiliCell
CM；ミリポア社；cat. PICMORG50）を浮かべた。下から
培地が供給される、このメンブレンフィルターの上に、
先に調製した視交叉上核切片を乗せ、培養中に培地が乾
燥しないように、３５mmディッシュの上にスライドガラ
スカバー（４０mm×５０mm；松浪硝子工業株式会社）を
乗せ、その間をシリコングリースコンパウンド（東レ・
ダウコーニングシリコーン株式会社）を塗ることによっ
て密封した。このようにして準備した視交叉上核切片入
り３５mmディッシュを、コンピューターに接続した極微
弱発計数装置（LM−300Y2；浜松フォトニクス社）内に
セットし、自動発光測定（リアルタイムモニター）を実
施した。自動発光測定は２０日間にわたって継続し、そ
の間に１回だけ（測定開始から１０日目）測定用培地を
交換した。 末梢組織については、トランスジェニックラットから
肝臓、肺、及び眼球をそれぞれ摘出した。その後、肝臓
及び肺については、メス刃により約１mm角の組織片を調
製し、以下の測定を行なった。一方、眼球については、
摘出したそのままの組織を用いて以下の測定を行なっ
た。視交叉上核切片の培養に使用したのと同じ前記ルシ
フェリン含有測定用培地の中へ、成長促進剤B−２７添
加物（５０×）［B−２７ Supplement（５０×）；GIB
CO−BRL社］を最終濃度が２％（１×）になるように加
えた培地を調製し、この中に直接、末梢組織（肝臓片、
肺片、又は眼球）を入れ、カバーガラスで密封し、視交
叉上核切片と同様に極微弱発計数装置により自動発光測
定を実施した。自動発光測定は２０日間にわたって継続
し、その間に１回だけ（測定開始から１０日目）測定用
培地を交換した。 視交叉上核切片における最初の１０日間（すなわち、
測定開始から１０日間経過後まで）の自動発光測定の結
果を図５及び図６に示し、末梢組織（肝臓片、肺片、及
び眼球）における最初の１０日間の自動発光測定の結果
をそれぞれ、図７、図８、及び図９に示す。図５〜図９
において、横軸は、測定開始からの日数（測定開始日を
０日とした）を表わし、縦軸は発光量（cpm）を表わ
す。なお、図６は、図５に示すグラフを、縦軸方向にの
み拡大し、その一部を示すグラフである。 図５及び図６に示すように、視交叉上核切片の発光量
は、測定開始から３日目の約９時間後には振動ピークを
示し、その後、約２４時間ごとの振動リズムが認められ
た。なお、この振動は、測定開始から２０日目まで継続
した。 肝臓片の発光量は、図７に示すように、測定開始３日
目の約１８時間後と、４日目の約１８時間後に振動のピ
ークを示したが、その後の振動は減衰により認められな
かった。また、測定開始１０日目の培地交換によって、
４回まで振動リズムが回復したことから、振動リズムの
減衰は細胞の死滅によるものではなく、細胞間の脱同調
によるものであると考えられる。 肺片の発光量は、図８に示すように、急激な変化を伴
いながらも測定開始日から計５回の振動リズムが認めら
れた。 眼球の発光量は、図９に示すように、測定開始１日目
の約１４時間後をピークとする振動リズムがみられ、そ
の後、振幅は小さいものの３回の振動リズムが認められ
た。 以上、視交叉上核及び末梢組織（肝臓、肺、及び眼
球）は、各組織ごとに振動位相や振動の継続回数に差異
はあるものの、全ての組織において約２４時間の振動リ
ズムが認められた。本発明のトランスジェニックラッ
ト、又はその視交叉上核切片若しくは末梢組織を用いた
ピリオド２遺伝子発現自動モニター系により、ピリオド
２遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニングが可能
となると考えられる。 （実施例６） 《培養細胞系におけるマウスピリオド２プロモーターの
振動誘導能確認》 ラット培養細胞Rat-1を高濃度のウマ血清あるいはDEX
で刺激すると、細胞群が同調し、時計遺伝子および時計
遺伝子に制御される遺伝子群がいっせいに２４時間間隔
の発現振動を開始し数日に渡って継続し、その後減衰す
ることが報告されている（文献２）。 マウスピリオド２遺伝子上流領域をルシフェラーゼベ
クターに連結した、前述のpCH3コンストラクトを、Rat-
1細胞にトランジェントに導入し、その後DEX刺激を行
い、ルシフェラーゼを含む培地に交換して、そこからの
発光を、前述の極微弱発光計測装置にてリアルタイムに
計測することを試みた。具体的な方法を以下に記述す
る。まず、Rat-1細胞（ATCCより購入：Designation＝
Rat１−R１２；ATCC Number＝CRL−2210）を、２２５c
m2フラスコ（イワキ社）の中で10％FBS（Fetal Bovine
Serum；JRHバイオサイエンス社）を含む培地［フェノ
ールレッドを含むDMEM（cat. 11965-092）の中に、最終
濃度が抗生物質（１００U／mLペニシリン及び１００μg
／mLストレプトマイシン；GIBCO−BRL社）となるように
調製した］2mL存在下、5％CO2、37度環境下で培養維持
した。トランスフェクション前日に、３５mm ディッシ
ュ（ファルコン社）に、１ウェルあたり、１．２×１０
6の細胞数になるようにRat-1細胞を撒き、5％FBSを含む
前記培地2mLにて培養を継続した。翌日、１マイクログ
ラムのpCH3コンストラクトをトランスフェクション試薬
であるリポフェクタミン2000（GIBCO−BRL社）を用い、
添付のマニュアルに従ってトランスフェクションした。
トランスフェクションの３時間後に、新鮮な10％FBSを
含む前記培地2mLに交換し培養を継続した。トランスフ
ェクション１６時間後に、最終濃度0.1マイクロmol／L
のDEX（SIGMA社；cat. D-8893）を含む前記培地（10％F
BS含む）に交換して刺激を開始した。DEX刺激２時間後
にルシフェリンを含む測定用培地（最終濃度0.1ミリmol
／Lのルシフェリン・カリウム塩（プロメガ社）を含む
前記培地（10％FBSを含む））2mLに交換した。ルシフェ
リンを含む測定用培地添加後、スライドガラスカバーを
のせ、シリコングリースコンパウンドにて密封し、コン
ピューターに接続した極微弱発計数装置内にセットし
て、自動発光測定（リアルタイムモニター）を実施し
た。 結果を図１０に示す。図１０の横軸は、測定開始から
の日数（測定開始日を０日とした）を表わし、縦軸は発
光量（cpm）を表わす。図１０のように、２４時間ごと
の発光の振動が観察された。このことから、我々がクレ
ームするマウスピリオド２遺伝子上流領域（配列番号１
で表される塩基配列の第４４１５番目〜７９３１番目）
は、培養細胞においても振動能を有することが確認され
た。したがって、この領域を用いることで、培養細胞に
おいて振動を変化させる物質のスクリーニングが可能で
あると考えられる。 （実施例７） 《ルシフェラーゼベクターにヒトピリオド２上流配列を
連結したコンストラクトpTM15の構築》 実施例３および、実施例５のマウスプロモーター活性
の解析結果から、７つの保存領域のうち、振動に十分で
あると考えられるのは、Ｉ〜ＩＩＩの領域であると示唆
された。そこでヒトのＩ〜ＩＩＩの領域（配列番号２で
表される塩基配列の第３８２０番目〜６０６８番目）を
含むDNA断片を取得するために、鋳型としてヒトゲノムD
NA（クロンテック社）を使用し、酵素としてTaqポリメ
ラーゼ（Advantage−GC Genomic polymerase Mix；ク
ロンテック社）を使用し、PCRを実施した。PCRは、配列
番号２９で表される塩基配列（配列番号２で表される塩
基配列の第３６４４番目〜３６７１番目の塩基からなる
配列）からなるフォワードプライマーと、配列番号３０
で表される塩基配列（配列番号２で表される塩基配列の
第６４０２番目〜６４２９番目の塩基からなる配列に対
して相補的な配列）からなるリバースプライマーとを使
用し、９４℃で１分間保温した後、９４℃（１５秒間）
と５８℃（３０秒間）と６８℃（４分間）とからなるサ
イクルを３５回繰り返し、最後に６８℃で１０分間保温
することにより、実施した。PCRの結果、２．８kbpのDN
A断片が得られた。一般的に、Taqポリメラーゼにより増
幅されたPCR断片は３’末端にヌクレオチドAが付加され
ることから、Aが付加されたDNA断片を効率よくクローニ
ングするために、ルシフェラーゼベクターpGL３−basic
のSma IサイトにヌクレオチドTを付加したクローニング
ベクターの作製を試みた。すなわちpGL３−basicを制限
酵素Sma I で処理して切断した後、１％アガロースゲル
で電気泳動を行い、ゲルから切断されたベクターを抽出
し、Taqポリメラーゼ（ロッシュダイアグノスティック
社）を含むPCR反応液に加えて７０度で２時間保温し、S
ma I 切断部位へのオリゴヌクレオチドT付加を行った。
このようにして作製したPGL３−basic TAベクターは、P
CR断片を効率よくSma I 部位にクローニングできる。PG
L３−basic TAベクターに先述のPCRにより取得した２．
８kbpのPCR断片を組み込むことによって、レポーターベ
クターpTM15を作製した。ベクターpTM15の内、ヒトピリ
オド２遺伝子の上流域部分の配列は、配列番号２で表さ
れる塩基配列の第３６４４番目〜６４２９番目の塩基か
らなる配列に該当し、保存領域Ｉ〜ＩＩＩ（配列番号２
で表される第３８２０番目〜第６０６８番目）を含む。 （実施例８） 《ヒトピリオド２の転写開始点の同定》 実施例２において、マウスピリオド２の転写開始点がＩ
〜ＩＩＩ保存領域内に存在すること明らかにしたが、ヒ
トピリオド２の転写開始点に関する情報はない。そこ
で、ヒトピリオド２の転写開始点同定のため、オリゴキ
ャップ法により作製されたヒト小脳のcDNAライブラリー
（ソースとなるTotal RNAはクロンテック社（cat. 6403
5-1）から入手；文献３２，文献３３）を用いて、キャ
ップ部位の同定を試みた。すなわち、配列番号２２で表
される塩基配列からなるプライマー及び、配列番号３１
で表される塩基配列［ヒトピリオド２遺伝子のcDNA（Ge
nBank NM_003894.1）の第４８０番目〜５０１番目の塩
基からなる配列に対して相補的な配列］からなるプライ
マーを用いる第１回目のPCRと、配列番号２３で表され
る塩基配列からなるプライマー及び配列番号３２で表さ
れる塩基配列［ヒトピリオド２遺伝子のcDNA（GenBank
NM_003894.1）の第１２２番目〜第１４３番目の塩基
からなる配列に対して相補的な配列］からなるプライマ
ーを用いる第２回目のPCRとからなるネスティドPCRを実
施したところ、キャップ部位を含む２０９bpと３２３bp
の二つのDNA断片が得られた。これら２つのDNA断片に対
するシークエンス解析の結果、ヒトピリオド２遺伝子の
第一エクソンは二種類（便宜的にエクソン１A、エクソ
ン１Bとする）存在し、これが第二エクソン（配列番号
２で表される塩基配列の第１６４６２番目〜１６７１０
番目）にそれぞれ独立して連結することが明らかとなっ
た。エクソン１Aは配列番号２で表される塩基配列の第
５６２５番目〜５７７３番目であり、エクソン１Bは配
列番号２で表される塩基配列の第５８０６番目〜６０６
８番目である。このように、ヒトピリオド２遺伝子の転
写開始点は二つ存在し、配列番号２で表される塩基配列
の第５６２５番目（エクソン１A）と第５８０６番目
（エクソン１B）に存在することを明らかにした。この
ことから、構築したベクターベクターpTM15に転写開始
点が含まれることを確認した。 （実施例９） 《培養細胞系における、ヒトピリオド２プロモーターの
振動誘導能確認》 実施例６と同様の方法により、培養細胞におけるヒト
ピリオド２プロモーターベクターpTM15の振動誘導能を
調べた結果、図１１に示す有意な振動を確認した。図１
１の横軸は、測定開始からの日数（測定開始日を０日と
した）を、縦軸は発光量（cpm）を表わす。我々がクレ
ームするヒトピリオド２遺伝子上流領域（配列番号２で
表される第３８２０番目〜６０６８番目）を含むDNA断
片が培養細胞においても振動能を示したことから、この
領域を用いることで、培養細胞において振動を変化させ
る物質のスクリーニングが可能であると考えられる。 （実施例１０） 《ルシフェラーゼベクターにマウスピリオド2上流配列
を連結したデリーションコンストラクトの作製》 実施例 1で取得したマウスピリオド２遺伝子上流領域
断片で第一エクソン上流の３つの保存領域（Ｉ、ＩＩ、
及びＩＩＩ）を含むベクターｐＣＨ３（配列番号１で表
される塩基配列の第４４１５番目から第７９３１番目の
塩基からなる配列を含む）が、実施例３の図３に示すよ
うに強いプロモーター活性を有し、且つ、図４に示すよ
うにピリオドの転写活性化因子であるBAML1/CLOCKヘテ
ロダイマーにより転写活性化されることが明らかとなっ
ている。マウスピリオド２遺伝子のベーサルプロモータ
ー活性に重要な領域及びBMAL1/CLOCKヘテロダイマーに
よる転写活性化に重要な領域が、３つの保存領域のどこ
に存在するのかを明らかにするために保存領域デリーシ
ョンコンストラクトを作製して検討した。まず、保存領
域Ｉ，ＩＩ，及びＩＩＩ（それぞれ、配列番号１で表さ
れる塩基配列の第５９３２番目から第６０４３番目の、
第６０８７番目から第６１７９番目の、及び第７５１８
番目から第７７３５番目の塩基からなる配列に該当す
る）を全て含むより短い塩基配列からなるデリーション
コンストラクトを作製した。前記ベクターｐＣＨ３に対
して制限酵素Ｍｌｕｉ／ＢａｌＩ処理を行ない、切断し
たＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により除去し
た。このようにしてデリーションＤＮＡ断片を欠失させ
たものについてセルフライゲーションを行なうことによ
り、ベクターｐＣＨ３からベクターｐＣＨ３−Ｄ１を作
製した。ベクターｐＣＨ３−Ｄ１の内、マウスピリオド
２遺伝子の上流領域部分の配列は、配列番号１で表され
る塩基配列の第５２４９番目〜第７９３１番目の塩基か
らなる配列（転写開始点を「+１」とすると-２４８７〜
+１９６の塩基配列）に該当する。次いで、保存配列Ｉ
及びＩＩを欠失させたデリーションコンストラクトを作
製した。ベクターｐＣＨ３に対して制限酵素ＭｌｕＩ／
ＥｃｏＲＩ処理処理を行ない、切断したＤＮＡ断片をア
ガロースゲル電気泳動により除去した。このようにして
デリーションＤＮＡ断片を欠失させたものについてセル
フライゲーションを行なうことにより、ベクターｐＣＨ
３からベクターｐＣＨ３−Ｄ２を作製した。ベクターｐ
ＣＨ３−Ｄ２の内、マウスピリオド２遺伝子の上流領域
部分の配列は、配列番号１で表される塩基配列の第６４
１７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列（転写開
始点を「+1」とすると-１３１９〜+１９６の塩基配列）
に該当する。更に、主に保存領域ＩＩＩのみを含むベク
ターを構築するために、ベクターｐＣＨ３に対して制限
酵素ＭｌｕＩ／ＢｓｔＸＩ処理を行ない、切断したＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動により除去した。この
ようにしてデリーションＤＮＡ断片を欠失させたものに
ついてセルフライゲーションを行なうことにより、ベク
ターｐＣＨ３からベクターｐＣＨ３−Ｄ３を作製した。
ベクターｐＣＨ３−Ｄ３の内、マウスピリオド２遺伝子
の上流領域部分の配列は、配列番号１で表される塩基配
列の第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配
列（転写開始点を「+1」とすると-２７３〜+１９６の塩
基配列）に該当する。 （実施例１１） 《マウスピリオド２上流領域デリーションコンストラク
トのプロモータ活性とエンハンサー活性の解析》 マウス培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３を、ルシフェラーゼアッ
セイの前日に、６ウェルプレートに１ウェル当たり１×
１０5ずつ撒いた。トランスフェクション試薬としてリ
ポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用
い、各種レポーターベクター１μgとインターナルコン
トロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０；プロメガ社）２
０ngとを用いて、マニュアルに従ってトランスフェクシ
ョンを行なった。前記レポーターベクターとしては、前
記実施例１０で取得したベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベク
ターｐＣＨ３−Ｄ２、ベクターｐＣＨ３−Ｄ３、ネガテ
ィブコントロールとしてプロモーター活性を有しないベ
クターｐＧＬ３−ｂ（プロメガ社）、そして、ポジティ
ブコントロールとして、ベクターｐＣＨ３を使用した。 なお、インターナルコントロールベクター（ＰＲＬ−
ＳＶ４０）以外のベクター（すなわち、ベクターｐＣＨ
３−Ｄ１、ベクターｐＣＨ３−Ｄ２、ベクターｐＣＨ３
−Ｄ３及びベクターｐＣＨ３）に含まれるルシフェラー
ゼ遺伝子が、ホタル由来であるのに対して、インターナ
ルコントロールベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０）に含まれ
るルシフェラーゼ遺伝子は、シーパンジー（ｓｅａ ｐ
ａｎｓｙ）由来である。 トランスフェクションから４８時間経過後に、細胞を
リン酸緩衝用液（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、アッセイ
キット（ピッカジーンデュアルレポーターアッセイキッ
ト；ニッポンジーン社）を用いて、マニュアルに従って
アッセイを行なった。発光測定は、マイクロタイタール
ミノメーターＭＬ３０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて行なった。 結果を図１２に示す。図１２において「ＢＬＫ」は、
トランスフェクションを実施していない宿主細胞におけ
る発光量を意味する。また、図１２に示す「ルシフェラ
ーゼ相対活性（標準化）」は、インターナルコントロー
ルベクター（ＰＲＬ−ＳＶ４０）に由来するルシフェラ
ーゼ発現量に基づいて、標準化した値を意味する。図１
２に示すように、ベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベクターｐ
ＣＨ−Ｄ２のベーサルのプロモーター活性は、ベクター
ｐＣＨ３の約６０％のプロモーター活性を示した。ベク
ターｐＣＨ３−Ｄ３のベーサルのプロモーター活性は、
ベクターｐＣＨ３の約８０％のプロモーター活性を示し
た。以上のことからマウスピリオド２のベーサルプロモ
ーター活性を担う領域は、配列番号１で表される塩基配
列の第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配
列の中に存在することが示唆された。この領域中に転写
開始点及び保存領域ＩＩＩが含まれることを考慮する
と、保存領域ＩＩＩがベーサルプロモーター活性の発現
に重要であると考えられる。 次に、ピリオド２が転写活性化因子BMAL1/CLOCKヘテ
ロダイマーによって転写活性化を受けるために必要な領
域について検討した。 前記ベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベクターｐＣＨ３−Ｄ
２、ベクターｐＣＨ３−Ｄ３或いはベクターｐＣＨ３の
１０ngと一緒にｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｂｍａｌ１及びｐＣＩ
−ｎｅｏ−Ｃｌｏｃｋを、それぞれ２５０ngずつ加え
て、リポフェクタミン２０００（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ
社）を用いてトランスフェクションを行なった。トラン
スフェクションの際には、インターナルコントロールと
してｐＲＬ−ＣＭＶ（プロメガ社）０．５ngを加え、更
に、トランスフェクションするＤＮＡが全量で１μgに
なるように、ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（プロメガ社）で
調整した。 トランスフェクションから４８時間経過後に、前記操
作と同様に、アッセイキット（ピッカジーンデュアルレ
ポーターアッセイキット；ニッポンジーン社）を用いて
発光測定を行なった。 結果を図１２に示す。図１２における「ＢＬＫ」は、
図４に示す「ＢＬＫ」と同じ意味である。図１２に示す
ように、ベクターｐＣＨ３−Ｄ１、ベクターｐＣＨ３−
Ｄ２、ベクターｐＣＨ３−Ｄ３及びベクターｐＣＨ３
は、全てビーマル1 遺伝子及びクロック遺伝子のコトラ
ンスフェクションにより転写がそれぞれおよそ５．０
倍、５．６倍、７．１倍及び５．６倍活性化されたこと
から、BMAL1/CLOCKヘテロダイマーにより転写活性化を
受けたものと考えられた。この結果から、マウスピリオ
ド２が転写活性化因子BMAL1/CLOCKヘテロダイマーによ
って転写活性化を受けるのに重要な配列は、配列番号１
で表される塩基配列の第７４６３番目〜第７９３１番目
の塩基からなる配列の中に存在することが示唆された。
この領域中に保存領域ＩＩＩが含まれることから保存領
域ＩＩＩの中に、BMAL1/CLOCKヘテロダイマーが機能す
るための応答配列が存在するものと考えられる。 （実施例１２） 《マウスピリオド２上流領域デリーションコンストラク
トの振動誘導能の解析》 実施例６と同様の方法により、実施例１０で作成した
ベクターｐＣＨ３−Ｄ３を用いて培養細胞における振動
誘導能を調べた結果、図１３に示す有意な振動を確認し
た。図１３の横軸は、測定開始からの日数（測定開始日
を０日とした）を、縦軸は発光量（cpm）を表わす。マ
ウスピリオド２遺伝子上流領域のうち保存領域ＩＩＩの
みを含むＤＮＡ断片（配列番号１で表される塩基配列の
第７４６３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列に
該当する）が、培養細胞において振動能を示したことか
ら、マウスピリオド２の保存領域ＩＩＩの中に発現振動
に重要な配列が存在すると考えられ、この領域を用いる
ことで、培養細胞において振動を変化させる物質のスク
リーニングが可能であると考えられる。 産業上の利用可能性 本発明のピリオド２遺伝子プロモーター、前記プロモ
ーター及びレポーター遺伝子を含む本発明のコンストラ
クト、本発明の細胞、本発明のトランスジェニック動
物、又はその視交叉上核切片若しくは末梢組織を用い
て、体内時計遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニ
ング系を構築することができる。前記スクリーニング系
により選択された物質は、概日リズム疾患（例えば、概
日リズム異常に起因する、睡眠傷害、うつ病、又は老年
性痴呆患者の行動異常）を改善する薬剤の候補物質とし
て有用である。 ＜文献リスト＞ 1. J. C. Dunlap, Cell, 96, 271-90（1999）． 2. A. Balsalobreら，Science, 289, 2344−7（200
0）． 3. S. S. Campbell, P. J. Murphy, Science, 279, 396
−9（1998）． 4. P. M. Sedgwick, Postgrad Med. J. , 74, 134−8.
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7）． 9. C. A. Czeisierら，Science, 233, 667−71（198
6）． 10. N. E. Rosenthalら，Sleep, 13, 354−61. （199
0）． 11. L. Wetterberg, J. Intern. Med. , 235, 5−19.
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nd Suppl. , 377, 41−5（1994）． 13. F. K. Stephan, I. Zucker, Proc. Natl. Acad. Sc
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Cell, 91, 1055−64（1997）． 24. T. Takumiら，Embo J. , 17, 4753−9（1998）． 25. M. J. Zylka, L. P. Shearman, D. R. Weaver, S.
M. Reppert, Neuron, 20, 1103−10（1998）． 26. D. P. Kingら，Cell, 89, 641−53（1997）． 27. N. Gekakisら，Science, 280, 1564−9（1998）． 28. S. Yamazakiら，Science, 288, 682−5（2000）． 29. B. Zhengら，Nature, 400, 169−73（1999）． 30. K. L. Tohら，Science, 291, 1040−3（2001）． 31. N. K. Terrett. M. Gardner, D. W. Gordon, R. J.
Kobylecki, J. Steele, Tetrahedron, 51, 8135−73
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（1994）． 33. Y. Suzuki, K. Yoshitomo−Nakagawa, K. Maruyam
a, A. Suyama, S. Sugano, Gene, 200, 149−56. （19
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Biotechnology, 1, 175−84（1990）． 36. Y. Toyoda, M. C. Chang, J. Reprod. Fertil. , 3
6, 9−22（1974）． 37. Gluzman, Y. , Cell, 23, 175−182（1981）． 38. Urlaub, G. , Chasin, L. A. , Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77, 4216−4220（1980）． 39. Luthman, H. , Magnusson, G. , Nucleic Acids
Res. , 11, 1295−1308（1983）． 40. Graham, F. L. , van der Ed, A. J. , Virolog
y, 52, 456−457（1973）． 41. Neumann, E. ら，EMBO J. , 1, 841−845（198
2）． 42. 岡村均ら，2000年度時間生物学会会誌，第42頁． 43. Nature 409, 684（2001） 44. Cell, 103, 1009−1017（2000） 45. Cell, 96, 57−68（1999） 配列表フリーテキスト 以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artifi
cial Sequence」の説明を記載する。具体的には、配列
表の配列番号２１の配列で表される塩基配列は、オリゴ
キャップのアダプター配列である。配列表の配列番号２
２の配列で表される塩基配列は、配列表の配列番号２１
の配列で表される塩基配列における第１番目〜第２１番
目の塩基からなる配列である。配列表の配列番号２３の
配列で表される塩基配列は、配列表の配列番号２１の配
列で表される塩基配列における第１１番目〜第３０番目
の塩基からなる配列である。配列表の配列番号２７の配
列で表される塩基配列は、クローニングベクターpGL３
−b（GenBank U47295）の第４１０番目〜第４３２番目
の塩基からなる配列である。配列表の配列番号２８の配
列で表される塩基配列は、クローニングベクターpGL３
−b（GenBank U47295）の第９８０番目〜第１０００番
目の塩基からなる配列に対して相補的な配列である。 以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業
者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。 SEQUENCE LISTING 〈110〉Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. 〈120〉Novel clock gene promoter 〈130〉Y0212PCT 〈150〉JP 2001-107467 〈151〉2001-04-05 〈150〉JP 2001-183087 〈151〉2001-06-18 〈150〉JP 2001-383743 〈151〉2001-12-17 〈160〉32 〈210〉1 〈211〉17004 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉1 〈210〉2 〈211〉17112 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉2 〈210〉3 〈211〉22 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉3 〈210〉4 〈211〉22 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉4 〈210〉5 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉5 〈210〉6 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉6 〈210〉7 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉7 〈210〉8 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉8 〈210〉9 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉9 〈210〉10 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉10 〈210〉11 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉11 〈210〉12 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉12 〈210〉13 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉13 〈210〉14 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉14 〈210〉15 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉15 〈210〉16 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉16 〈210〉17 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉17 〈210〉18 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉18 〈210〉19 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉19 〈210〉20 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉20 〈210〉21 〈211〉30 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉 〈223〉Description of Artificial Sequence: an adap
tor sequence of an oligo cap 〈400〉21 〈210〉22 〈211〉21 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉 〈223〉Description of Artificial Sequence: the seq
uence of the 1st to 21st bases in the base sequenc
e of SEQ ID No: 21 〈400〉22 〈210〉23 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉 〈223〉Description of Artificial Sequence: the seq
uence of the 11th to 30th bases in the base sequen
ce of SEQ ID No: 21 〈400〉23 〈210〉24 〈211〉21 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉24 〈210〉25 〈211〉22 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉25 〈210〉26 〈211〉20 〈212〉DNA 〈213〉Mus sp. 〈400〉26 〈210〉27 〈211〉23 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉 〈223〉Description of Artificial Sequence: the seq
uence of the 410th to 432nd bases in cloning vecto
r pGL3-b（GenBank U47295） 〈400〉27 〈210〉28 〈211〉21 〈212〉DNA 〈213〉Artificial Sequence 〈220〉 〈223〉Description of Artificial Sequence: the seq
uence complementary to the sequence of the 980th t
o 1000th bases in cloning vector pGL3-b（GenBank U
47295） 〈400〉28 〈210〉29 〈211〉28 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉29 〈210〉30 〈211〉28 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉30 〈210〉31 〈211〉22 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉31 〈210〉32 〈211〉22 〈212〉DNA 〈213〉Homo sapiens 〈400〉32
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ
早期審査対象出願
(56)参考文献 国際公開01／07654（ＷＯ，Ａ１)
Ｓｃｉｅｎｃｅ，2001 Ｆｅｂ．，
Ｖｏｌ．291， ｐｐ．1040−1043
Ｎａｔｕｒｅ，2001 Ｆｅｂ．， Ｖ
ｏｌ．409， ｐ．684
Ｃｅｌｌ，1997， Ｖｏｌ．91， ｐ
ｐ．1055−1064
Ｓｃｉｅｎｃｅ，1998， Ｖｏｌ.
280， ｐｐ．1584−1589
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65， ｐｐ．224−233
Ｃｅｌｌ，1999， Ｖｏｌ．96， ｐ
ｐ．57−68
和光純薬時報，1998， Ｖｏｌ．66,
Ｎｏ．３， ｐｐ．10−13
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09
C12Q 1/02
A01K 67/027
Claims (10)
- 【請求項１】ベーサルのプロモーター活性を保持し、か
つBMAL1/CLOCKヘテロダイマーにより転写活性化される
プロモーター活性を示す、下記（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）に記載の塩基配列を含むDN
A。 （ａ）配列番号１で表される塩基配列における第７４６
３番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｂ）配列番号１で表される塩基配列における第６４１
７番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｃ）配列番号１で表される塩基配列における第５２４
９番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｄ）配列番号１で表される塩基配列における第４４１
５番目〜第７９３１番目の塩基からなる配列。 （ｅ）配列番号２で表される塩基配列における第３８２
０番目〜第６０６８番目の塩基からなる配列。 - 【請求項２】請求の範囲１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）、又は（ｅ）に記載の塩基配列からなるDNA。 - 【請求項３】請求の範囲１または２に記載のDNAとレポ
ーター遺伝子とを含むコンストラクト。 - 【請求項４】請求の範囲３に記載のコンストラクトを含
む細胞。 - 【請求項５】請求の範囲４に記載の細胞と被検物質とを
接触させる工程、及び レポーター活性を測定する工程 を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現を制
御する物質のスクリーニング法。 - 【請求項６】請求の範囲３に記載のコンストラクトを導
入したトランスジェニック動物。 - 【請求項７】前記動物がラットである請求の範囲６に記
載のトランスジェニック動物。 - 【請求項８】請求の範囲４に記載の細胞、あるいは請求
の範囲６又は請求の範囲７に記載のトランスジェニック
動物の視交叉上核切片若しくは末梢組織に被検物質を作
用させる工程、及び 発現振動を測定する工程 を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現及び
／又は発現振動を制御する物質のスクリーニング法。 - 【請求項９】請求の範囲６又は請求の範囲７に記載のト
ランスジェニック動物に被検物質を投与し、前記動物の
視交叉上核の発現振動を測定する工程 を含むことを特徴とする、ピリオド２遺伝子の発現及び
／又は発現振動を制御する物質のスクリーニング法。 - 【請求項１０】ピリオド２遺伝子の発現及び／又は発現
振動を制御する物質が、リズム障害改善用である、請求
の範囲５、請求の範囲８、又は請求の範囲９のいずれか
一項に記載のスクリーニング法。
Applications Claiming Priority (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001107467 | 2001-04-05 | ||
| JP2001-107467 | 2001-04-05 | ||
| JP2001107467 | 2001-04-05 | ||
| JP2001-183087 | 2001-06-18 | ||
| JP2001183087 | 2001-06-18 | ||
| JP2001183087 | 2001-06-18 | ||
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