JP2014171413A - トランスジェニック非ヒト哺乳動物 - Google Patents
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Abstract
【課題】新たな特性を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。
【解決手段】Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβをコードする遺伝子が非ヒト哺乳動物に導入されてなる、長寿命化されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。当該ｐ８５調節サブユニットβとして、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。非ヒト哺乳動物はげっ歯類、例えばマウスであることが好ましい。長寿命化に加えて巨大化したものであってもよい。
【選択図】図４
【解決手段】Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβをコードする遺伝子が非ヒト哺乳動物に導入されてなる、長寿命化されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。当該ｐ８５調節サブユニットβとして、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。非ヒト哺乳動物はげっ歯類、例えばマウスであることが好ましい。長寿命化に加えて巨大化したものであってもよい。
【選択図】図４
Description
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に関し、さらに詳細には、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβをコードする遺伝子が導入されてなる、長寿命化されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
ホスホイノシチド−３キナーゼ（以下、「ＰＩ３Ｋ」と略記することがある）は、イノシトールリン脂質のイノシトール環３位のヒドロキシル基をリン酸化する酵素である。細胞膜の構成成分の１つであるイノシトールリン脂質は、ＰＩ３Ｋ等のキナーゼの作用によってリン酸化され、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化する（ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路）。すなわち、ＰＩ３ＫはＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化する作用を有する。
ＰＩ３Ｋは、ｐ１１０触媒サブユニット（α、β、δ）とｐ８５調節サブユニット（α、β）から構成されている。ｐ８５調節サブユニットのうち、αサブユニットについてはこれまでに詳細な研究がなされているが、βサブユニット（以下、「ｐ８５β」と略記することがある）については不明な点が多い。
Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ＰＩ３Ｋが知られている。例えば、特許文献１には、ｐ８５βにアミノ酸置換による変異が導入された、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ＰＩ３Ｋ、及び、当該変異が導入されたｐ８５βをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）が開示されている。そして、ｐ８５βを発現している細胞に前記アミノ酸置換による変異を導入することにより、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ＰＩ３Ｋを発現する細胞を作出する技術が記載されている。
上記のように、細胞レベルにおいて、前記変異ＰＩ３Ｋの細胞に対する作用等が調べられている。しかし、生物個体レベルにおいては、前記変異ＰＩ３Ｋの作用等は明らかでない。そこで本発明は、前記変異ＰＩ３Ｋやその遺伝子を生物個体に適用することを包含する新しい技術を提供することを目的とする。
本発明者らは、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβ（変異ｐ８５β）をコードするＤＮＡをベクターに組み込み、当該ベクターをマウスの受精卵に導入することにより、新規のトランスジェニックマウスを作製した。そして、当該トランスジェニックマウスが、通常のマウスと比較して長い寿命を有しており、長寿命化の特性を獲得していることを見出した。なお、サーチェイン遺伝子を除き、受容体以外の遺伝子導入で哺乳動物の長寿命化に成功した例は、過去に見当たらない。
上記した知見に基づいて完成された本発明の１つの様相は、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβをコードする遺伝子が非ヒト哺乳動物に導入されてなる、長寿命化されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物である。
本発明において「長寿命化された」とは、通常の非ヒト哺乳動物と比較して寿命が１０％以上長いことを指す。
本発明における「Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼ」には、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）の活性化が全く観察されない変異ホスホイノシチド−３キナーゼの他、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）の活性化が極めて弱く、活性化は実質的に起こっていないと判断される変異ホスホイノシチド−３キナーゼも含まれる。
好ましくは、前記遺伝子は、下記（i）〜（iii）のいずれかの蛋白質をコードする遺伝子である。
（i）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質、
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質。
（i）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質、
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質。
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、ＰＣ１２細胞のｐ８５調節サブユニットβのアミノ酸配列（配列番号４）における６６０番目のリジンがアルギニンに置換されたものに相当する。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、特許文献１に記載されている。
好ましくは、前記遺伝子は、下記（iv）又は（v）のＤＮＡからなる遺伝子である。
（iv）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（v）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（iv）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（v）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
配列番号１で表される塩基配列は、ＰＣ１２細胞のｐ８５調節サブユニットβのｃＤＮＡ（配列番号３）における２８５番目の塩基が「ｇ」から「ａ」に、１９７９番目の塩基が「ａ」から「ｇ」に、それぞれ置換したものに相当する。配列番号１で表される塩基配列は、特許文献１に記載されている。
好ましくは、前記非ヒト哺乳動物は、げっ歯類である。
好ましくは、前記非ヒト哺乳動物は、マウスである。
上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、長寿命化に加えて巨大化したものであってもよい。
ここで「巨大化」とは、通常の非ヒト哺乳動物と比較して体重が１０％以上大きいことを指す。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、寿命に関する研究に有用である。その他、寿命や巨大化に関係する疾患のモデル動物としても有用である。
以下、本発明の実施するための形態について具体例を挙げながら説明する。なお、以下の説明において、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を「Ａｋｔ」と略記することがある。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、「Ａｋｔを活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のｐ８５調節サブユニットβ（ｐ８５β）」をコードする遺伝子が導入されたものである。
前述したとおり、本発明における「Ａｋｔを活性化しない変異ＰＩ３Ｋ」には、Ａｋｔの活性化が全く観察されない変異ＰＩ３Ｋの他、Ａｋｔの活性化が極めて弱く、活性化は実質的に起こっていないと判断される変異ＰＩ３Ｋも含まれる。
前述したとおり、本発明における「Ａｋｔを活性化しない変異ＰＩ３Ｋ」には、Ａｋｔの活性化が全く観察されない変異ＰＩ３Ｋの他、Ａｋｔの活性化が極めて弱く、活性化は実質的に起こっていないと判断される変異ＰＩ３Ｋも含まれる。
前記ｐ８５調節サブユニットβ（ｐ８５β）をコードする遺伝子としては、「（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質」をコードする遺伝子が挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、ＰＣ１２細胞のｐ８５βのアミノ酸配列（配列番号４）における６６０番目のリジンがアルギニンに置換されたものに相当する。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、特許文献１に記載されている。
なお、ＰＣ１２細胞のｐ８５βに前記アミノ酸置換（リジン→アルギニン）を導入すると、当該ＰＣ１２細胞は、神経成長因子（ＮＧＦ）を作用させてもＡｋｔを活性化しない特性と、ＮＧＦを作用させても神経分化が誘導されない特性を備えたものとなる。
さらに、当該遺伝子の例として、以下の（ii）又は（iii）の蛋白質をコードする遺伝子が挙げられる。
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質、
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質。
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質、
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質。
上記（ii）において、欠失等されたアミノ酸の数は、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個である。また上記（iii）において、アミノ酸配列の相同性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴデータベースを用いて調べることができる。
さらに、当該遺伝子の例として、下記（iv）又は（v）のＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
（iv）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（v）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（iv）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（v）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
ここで、上記（v）における「ストリンジェントな条件」とは、０．１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム、からなる）、１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、６５℃、２４時間の条件をいう。なお配列番号１は、配列番号３（ＰＣ１２細胞のｐ８５β遺伝子）において、２８５番目の塩基「ｇ」が「ａ」に、１９７９番目の塩基「ａ」が「ｇ」に、それぞれ置換された塩基配列に相当する。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の動物種としては特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等を採用することができる。好ましくはげっ歯類であり、マウスが特に好ましい。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、長寿命化された特性を有している。上述のように、「長寿命化された」とは、通常の非ヒト哺乳動物と比較して寿命が１０％以上長いことを指し、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上、特に好ましくは２５％以上である。長寿命化の有無は、例えば、変異ｐ８５βをコードする遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物）と、当該遺伝子を導入されていない非ヒト哺乳動物とを並行して飼育し、その生存期間を比較することにより判断することができる。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物には、長寿命化に加えて、巨大化した特性を備えたものも含まれる。上述したように、「巨大化」とは、通常の非ヒト哺乳動物と比較して体重が１０％以上大きいことを指し、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上、特に好ましくは２５％以上である。巨大化の有無は、例えば、変異ｐ８５βをコードする遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物）と、当該遺伝子を導入されていない非ヒト哺乳動物とを並行して飼育し、その体重を比較することにより判断することができる。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製は、公知のトランスジェニック動物作製技術を利用して行うことができる。以下、ＤＮＡマイクロインジェクションによるトランスジェニックマウスの作製を例として説明する。
まず、受精卵移植用（仮親用）雌マウスに偽妊娠を誘発するための、精管を切除した雄マウスを作製する。そして、成体雌マウスと精管切除雄マウスとを交配し、仮親（偽妊娠）マウスを作製する。
一方、受精卵採取のために、雌マウスにホルモン剤を投与して過剰排卵誘発処理を行う。この過排卵誘発処理した雌マウスを雄マウスと交配し、前核期受精卵を採取する。
一方、受精卵採取のために、雌マウスにホルモン剤を投与して過剰排卵誘発処理を行う。この過排卵誘発処理した雌マウスを雄マウスと交配し、前核期受精卵を採取する。
マイクロインジェクションにより、前核期受精卵に目的遺伝子（変異ｐ８５β遺伝子）を導入する。目的遺伝子を導入した受精卵を、仮親マウスの卵管内に移植する。その後、自然分娩により出産させ、保育させる。
得られた子マウスの尻尾からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法等で導入遺伝子の検定を行い、目的遺伝子が導入されたマウス（Ｆ０マウス）を選抜する。Ｆ０マウスを成熟させた後、野生型マウスと交配し、Ｆ１マウスを作製する。これにより、変異ｐ８５β遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスを得ることができる。その後、長寿命化の特性を有する個体をさらに選抜することにより、長寿命化されたトランスジェニックマウスを得ることができる。
なお、マイクロインジェクションに用いる遺伝子（導入用遺伝子、導入用ＤＮＡ）は、例えば、哺乳動物細胞用の発現ベクターに目的遺伝子を組み込むことにより調製することができる。哺乳動物細胞用の発現ベクターとしては、各種の市販品を用いることができる。例えば、エンハンサー／プロモーター、遺伝子導入部位、及びポリアデニル化シグナルがこの順番に配置されたベクターを用いる。そして、当該遺伝子導入部位に目的遺伝子を導入した発現ベクターを、受精卵に導入するための導入用遺伝子として用いることができる。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、様々の用途に適用することができる。例えば、長寿命化モデル動物として、寿命に関する基礎研究に用いることができる。その他、寿命や巨大化に関係する疾患のモデル動物として、医薬候補化合物等のスクリーニングに用いることができる。当該疾患の例として、肥満や脳卒中等の慢性疾患が考えられる。さらに、畜産分野への応用として、巨大化したトランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、ブタやウシ）から畜肉を効率よく得られる可能性がある。すなわち、１つの個体からより多くの畜肉を得られる可能性がある。
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．変異ｐ８５β遺伝子を組み込んだ発現ベクターの作製
配列番号１に示す変異ｐ８５β遺伝子のｍ−ＲＮＡから作製したＰＣＲ産物をTOPO PCRクローニングベクター（TOPO PCR-XL-TOPO，インビトロジェン社）に組み込み、増幅した。増幅産物をＥｃｏＲＩで切断後、発現ベクターpcDNA3.1（インビトロジェン社）のＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ（図１）。正方向に組み込まれたものを増幅して、ＳａｌＩとＮｕａＩの２つの制限酵素によって切断した（ＤＮＡ溶液）。このＤＮＡ溶液を、以下のＤＮＡマイクロインジェクションに用いた。
なお、変異ｐ８５β遺伝子（ｃＤＮＡ）が組み込まれた発現ベクターは、図１に示すように、ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ）とＢＧＨポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）を有しているので、変異ｐ８５β蛋白質が効率よくトランスジェニックマウスの細胞で作られるようになっている。
配列番号１に示す変異ｐ８５β遺伝子のｍ−ＲＮＡから作製したＰＣＲ産物をTOPO PCRクローニングベクター（TOPO PCR-XL-TOPO，インビトロジェン社）に組み込み、増幅した。増幅産物をＥｃｏＲＩで切断後、発現ベクターpcDNA3.1（インビトロジェン社）のＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ（図１）。正方向に組み込まれたものを増幅して、ＳａｌＩとＮｕａＩの２つの制限酵素によって切断した（ＤＮＡ溶液）。このＤＮＡ溶液を、以下のＤＮＡマイクロインジェクションに用いた。
なお、変異ｐ８５β遺伝子（ｃＤＮＡ）が組み込まれた発現ベクターは、図１に示すように、ＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ）とＢＧＨポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）を有しているので、変異ｐ８５β蛋白質が効率よくトランスジェニックマウスの細胞で作られるようになっている。
以下、上記発現ベクターをマウスの受精卵に導入することによって、変異ｐ８５β遺伝子が組み込まれたトランスジェニックＦ０マウスを作製し、自然死するまで飼育してマウスの寿命延長があるかどうかについて検討した。すべてのトランスジェニックマウス作製実験に、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスを使用した。
２．変異ｐ８５β遺伝子トランスジェニックＦ０マウスの作製
正常なＣ５７ＢＬ／６マウスの雌より、ＤＮＡマイクロインジェクションに用いる前核期受精卵を胚操作用キャピラリーで集めた。集めた前核期受精卵をＰＢ１培養液で洗浄後、Ｍ１６培養液（Sigma, M-7292）を用いてＣＯ2インキュベーターで培養した。受精卵へのＤＮＡマイクロインジェクションは、倒立顕微鏡下でマイクロマニュピュレーターにセットしたマイクロキャピラリーを用いて、受精卵前核に上記のＤＮＡ溶液を注入して行った。ＤＮＡの注入を終えた受精卵を新しい培養液に移し、ＣＯ2インキュベーターで培養した。
正常なＣ５７ＢＬ／６マウスの雌より、ＤＮＡマイクロインジェクションに用いる前核期受精卵を胚操作用キャピラリーで集めた。集めた前核期受精卵をＰＢ１培養液で洗浄後、Ｍ１６培養液（Sigma, M-7292）を用いてＣＯ2インキュベーターで培養した。受精卵へのＤＮＡマイクロインジェクションは、倒立顕微鏡下でマイクロマニュピュレーターにセットしたマイクロキャピラリーを用いて、受精卵前核に上記のＤＮＡ溶液を注入して行った。ＤＮＡの注入を終えた受精卵を新しい培養液に移し、ＣＯ2インキュベーターで培養した。
１回目の実験では、ＤＮＡをマイクロインジェクションした受精卵２６３個を１０〜２０個ずつに分け、２０匹の偽妊娠を誘導した雌マウスの卵管にそれぞれ移植し、８匹の産仔を得ることができた。得られた８匹のマウスは尾よりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によって導入遺伝子を増幅後、電気泳動にて検出を行った。陽性対照としてゲノムＤＮＡと導入遺伝子の混合物を、陰性対照としてゲノムＤＮＡのみを用い、同様の操作を行った。結果を図２に示す。図２中、レーン１〜３は雌マウス、レーン４〜８は雄マウス、レーン９，１０は陽性対照、レーン１１は陰性対照をそれぞれ示す。すなわち、雌３匹の内１匹が陽性を示し（レーン２）、雄５匹中１匹が陽性であった（レーン８）。この内、陽性の雄をＦ１マウス作製に使用し、陰性のマウスを寿命実験の対照に用いた。
２回目のＦ０マウス作製実験では、ＤＮＡをマイクロインジェクションした受精卵１２８個に対して同様に移植し、５匹の産仔を得ることができた。得られた５匹のマウスについて、同様にＰＣＲ法によって導入遺伝子の検出を行った結果、雌３匹の内１匹が陽性を示し、雄２匹中２匹が陰性であった。
３．変異ｐ８５β遺伝子トランスジェニックＦ１マウスの作製
変異ｐ８５β遺伝子陽性のトランスジェニックＦ０マウスの雄より手術によって精子を取り出し、正常なＣ５７ＢＬ／６マウスの雌の卵子と人工授精を行ってＦ１マウスを作製した。方法としては、正常なＣ５７ＢＬ／６マウスの雌３０匹より６３０個の卵子を得、ＣＯ2インキュベーターで培養した。人工授精を行って得られた８０個の２Ｃｅｌｌを４匹のレシピエントマウスに移植した。自然分娩及び帝王切開によって４８匹のトランスジェニックＦ１マウスを得ることができた。得られた８匹のマウスの尾よりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によって導入遺伝子の検出を行った。その結果、雌２４匹の内１５匹が陽性を示し、雄２４匹中１１匹が陽性であった。
変異ｐ８５β遺伝子陽性のトランスジェニックＦ０マウスの雄より手術によって精子を取り出し、正常なＣ５７ＢＬ／６マウスの雌の卵子と人工授精を行ってＦ１マウスを作製した。方法としては、正常なＣ５７ＢＬ／６マウスの雌３０匹より６３０個の卵子を得、ＣＯ2インキュベーターで培養した。人工授精を行って得られた８０個の２Ｃｅｌｌを４匹のレシピエントマウスに移植した。自然分娩及び帝王切開によって４８匹のトランスジェニックＦ１マウスを得ることができた。得られた８匹のマウスの尾よりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によって導入遺伝子の検出を行った。その結果、雌２４匹の内１５匹が陽性を示し、雄２４匹中１１匹が陽性であった。
４．変異ｐ８５β遺伝子を導入したマウスの寿命の検出
変異ｐ８５β遺伝子トランスジェニックＦ１マウス２６匹を、自然死に至るまで飼い続けてそれらの寿命を調べた。対照として、変異ｐ８５β遺伝子陰性の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスを並行して飼育した。結果を図３〜図５に示す。
図３はマウスの生存日数を表すグラフ、図４は各グループの平均寿命と標準偏差を表すグラフ、図５はマウスの生存率曲線を表すグラフである。図３と図４において、「ＷＴ」は変異ｐ８５β遺伝子陰性の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス、「Ｐ８５βＭ−ｔｇ（−）」は変異ｐ８５β遺伝子を導入したが変異ｐ８５β遺伝子が発現しなかったマウス、「Ｐ８５βＭ−ｔｇ（＋）」は変異ｐ８５β遺伝子を導入し、当該変異ｐ８５β遺伝子が発現したマウスを表す。
変異ｐ８５β遺伝子トランスジェニックＦ１マウス２６匹を、自然死に至るまで飼い続けてそれらの寿命を調べた。対照として、変異ｐ８５β遺伝子陰性の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスを並行して飼育した。結果を図３〜図５に示す。
図３はマウスの生存日数を表すグラフ、図４は各グループの平均寿命と標準偏差を表すグラフ、図５はマウスの生存率曲線を表すグラフである。図３と図４において、「ＷＴ」は変異ｐ８５β遺伝子陰性の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス、「Ｐ８５βＭ−ｔｇ（−）」は変異ｐ８５β遺伝子を導入したが変異ｐ８５β遺伝子が発現しなかったマウス、「Ｐ８５βＭ−ｔｇ（＋）」は変異ｐ８５β遺伝子を導入し、当該変異ｐ８５β遺伝子が発現したマウスを表す。
図３、図４に示すように、正常マウス（ＷＴ）の平均寿命は７７０日であった。一方、変異ｐ８５β遺伝子トランスジェニックＦ１マウス（２６匹）では、１７匹（Ｐ８５βＭ−ｔｇ（−））は正常マウスと同様の正常な平均寿命を示したが、６匹（Ｐ８５βＭ−ｔｇ（＋））の平均寿命が９４０日となり、約２２％の長寿を示した。なお、３匹は事故で死亡した。
また図４に示すように、変異ｐ８５β遺伝子が発現したマウス（Ｐ８５βＭ−ｔｇ（＋））は他の２群（ＷＴ及びＰ８５βＭ−ｔｇ（−））と比較して有意に寿命が延長した。
図５に示すように、変異ｐ８５β遺伝子が発現したマウス（太線）は正常マウス（細線）と比較して有意に生存率が高かった。
また図４に示すように、変異ｐ８５β遺伝子が発現したマウス（Ｐ８５βＭ−ｔｇ（＋））は他の２群（ＷＴ及びＰ８５βＭ−ｔｇ（−））と比較して有意に寿命が延長した。
図５に示すように、変異ｐ８５β遺伝子が発現したマウス（太線）は正常マウス（細線）と比較して有意に生存率が高かった。
また、長寿を示した変異ｐ８５β遺伝子トランスジェニックＦ１マウスは、いずれも、対照と比較して１．５倍程度大きい体重を示した。すなわち、変異ｐ８５β遺伝子トランスジェニックＦ１マウスは、長寿化に加えて巨大化の特性も備えていた。
Claims (6)
- Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβをコードする遺伝子が非ヒト哺乳動物に導入されてなる、長寿命化されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記遺伝子は、下記（i）〜（iii）のいずれかの蛋白質をコードする遺伝子である請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（i）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ii）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質、
（iii）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質。 - 前記遺伝子は、下記（iv）又は（v）のＤＮＡからなる遺伝子である請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（iv）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（v）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβとしての活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。 - 前記非ヒト哺乳動物は、げっ歯類である請求項１〜３のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記非ヒト哺乳動物は、マウスである請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 長寿命化に加えて巨大化したものである請求項１〜５のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
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| WO2011111595A1 (ja) * | 2010-03-09 | 2011-09-15 | 学校法人順正学園 | 細胞の作出方法、細胞、改変ｐｃ１２細胞、遺伝子、並びに、変異ホスホイノシチド－３キナーゼ |
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