JP4271120B2 - Ｙ染色体標識トランスジェニック非ヒト動物 - Google Patents
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Description
本発明は、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニック非ヒト動物、そのＥＳ細胞、その作出方法、及び該Ｙ染色体上に局在させた標識タンパク質の遺伝子を用いたトランスジェニック非ヒト動物の雌雄判別方法、該Ｙ染色体上に局在させた標識タンパク質の遺伝子を用いた遺伝子ノックアウト非ヒト動物或いはトランスジェニック非ヒト動物の作出方法、及び該Ｙ染色体上に局在させた標識タンパク質の遺伝子を用いたキメラ非ヒト動物の由来判別方法等に関する。
１９８０年にGordonらにより（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:7380-7384,1980）、マウス受精卵の前核に組換えＤＮＡを直接注入する方法でトランスジェニックマウスの作成が報告されて以来、近年の遺伝子操作技術や遺伝子導入技術の進展により、多くのトランスジェニック動物が作出されている。数々の改変遺伝子を導入したトランスジェニックマウスのような遺伝子改変動物は、発生生物学、細胞生物学、免疫学、及び医療などの分野で新たな研究の展開を生み出している。
例えば、遺伝子を導入したトランスジェニック動物や胚性幹細胞（embryonic stem cell:ＥＳ細胞）を用いたジ−ンターゲッティングにより作製したノックアウト動物により、哺乳動物の遺伝子の機能解析が進んでいる。また、哺乳動物の遺伝子の機能解析により、その遺伝子と他の遺伝子の相互作用の解明も行われ、それらの関連から発生する疾病の機序解明に重要な役割を果たしている。また、最近では体細胞を用いた核移植の技術により、ヒツジ（Nature,385:810-813,1997）やウシ（Science,280:1256-1258,1998）の体細胞クローン動物の作製に成功しており、これをヒツジのような家畜のトランスジェニック動物の作製に応用してトランスジェニックヒツジが作出されている（Science,278:2130-2133,1997）。
これまでに作製されたトランスジェニック動物は多岐に渡っており、例えば種々のサイトカイン遺伝子を組込んだトランスジェニック動物について見てみても、ヒトＩＬ−２を発現し、脱毛症や肺炎を高率に発症するトランスジェニックマウス（Int. Immunol. 1:113-120,1989）や、骨組織における骨芽細胞、破骨細胞の活性低下に伴う骨粗鬆症を起こすヒトＩＬ−４を持つトランスジェニックマウス（Cell,62:457-467,1990; Eur. Ｊ．Immunol. 22:1179-1184,1992; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:11618-11622,1993）や、自己免疫疾患や形質細胞腫を引き起こすヒトＩＬ−６導入トランスジェニックマウス（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86:7547-7551,1989; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:232-235,1992）や、各々リンパ腫、好中球の移動障害及び眼房内へのマクロフアージ集積による白内障等を引き起こすヒトＩＬ−７、ヒトＩＬ−８及びヒトＧＭ−ＣＳＦを過剰発現するトランスジェニックマウス（J. Exp. Med. 177:305-316,1993; J. Clin. Invest. 94:1310-1319,1994; Cell 51:675-686,1987）等多くのものが、報告されている。
また、外来遺伝子を導入したトランスジェニック動物を作製することにより、各種の有用な物質を生産する例もある。例えば、ヒツジ胎仔線維芽細胞にヒト血液凝固第IX因子遺伝子を導入し、その細胞核をドナー核として核移植を行い、トランスジェニックヒツジを作製した報告（Science 278:2130-2133,1997）、或いは、ヒツジ乳汁中へのα１−アンチトリプシンの生産を行った報告（Bio/Technology 9:830-834,1991）、ブタ乳汁中へのヒトプロテインＣの生産を行った報告（ＷＯ ９４／０５７９６）、ヤギ乳汁中へのヒト ｔ−ＰＡの生産を行った報告（Bio/Technology 12:699-702,1994）等、トランスジェニック動物を作製して、動物の乳汁中へ有用物質を生産することに関する報告だけでも多数のものがある。その他、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いたジ−ンターゲッティングにより特定の遺伝子をノックアウトして作出した（Molecular Medicine 34,1997）各種のノックアウト動物の報告もなされている。このように現在、種々の目的からトランスジェニック動物が作製されており、遺伝子やそれに関連する疾病の機構の解明やそれを利用した薬剤のスクリーニング、或いは家畜等の動物自体の改良への利用等がなされている。
現在、トランスジェニック動物を作製するために用いられている遺伝子の導入方法としては、一般的には、受精卵の前核内に目的遺伝子をマイクロインジェクションで直接的に導入する方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7380-7384, 1980）、或いは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に目的遺伝子を導入し、キメラ動物を介して次世代の動物に導入する方法（Science, 244:1288-1292, 1989）が用いられている。
更に、最近ではクローン動物作製技術が確立されたことにより、体細胞を用いた遺伝子導入技術を合体させトランスジェニック動物を作製する方法も用いられている。トランスジェニック動物の作製において、目的とする外来遺伝子を組込んだ卵は形質転換卵と呼ばれ、この形質転換卵を偽妊娠させたレシピエント（受容雌）の生殖器道（卵管又は子宮）に移植することにより、成長させることができる。得られた成体のトランスジェニック動物は、外来性遺伝子を自らの染色体に組込んでおり、プロモーター等の適当な調節遺伝子の影響下で外来性遺伝子を発現することができる。こうして取り込まれた外来性遺伝子は、トランスジーン（Transgene）と呼ばれている。トランスジーンは、細胞への遺伝子導入に際して、適切なプロモーター領域の選択等、種々の調節遺伝子を選択して構築される。トランスジェニック動物の染色体内に組込まれたトランスジーンは、その発現によって、該遺伝子がコードするタンパク質をトランスジェニック動物内に生産する。
トランスジェニック動物の作製に際して、トランスジェニック動物がトランスジーンを自らの染色体に取り込んでいるかどうかは、一般的にはＰＣＲ法やサザンブロット法等の解析により確認される。この取り込みが確認された場合、更に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子発現解析、例えば、ノーザンブロット法や免疫抗体法等による解析が行われる。一方、トランスジェニック動物の作製において、遺伝子プロモーター活性の検定、遺伝子発現程度の確認、遺伝子発現部位及び発育ステージの同定に、レポーター遺伝子が用いられる。レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等が用いられる。これらのレポーター遺伝子を標識として、トランスジェニック動物の作製における、遺伝子の取り込み状況、その発現の状況の確認や、遺伝子導入胚の選別等が行われる。
近年、トランスジェニック動物の作製に関する技術として、作出されたトランスジェニック動物の胚や胎児の性の判別や、該判別方法を雌雄の分離等に利用する技術が開示されている。特開平８−１５４６８５号公報には、マウス及びウシの性決定遺伝子Ｓｒｙ関連ＤＮＡの塩基配列を解明し、これを性判別、種同定又はキメラ細胞のキメリズムの決定、或いは染色体のマーカーとして利用することが開示されている。特開平８−２５６７７８号公報には、ウシの雄特異的ＤＮＡ断片、或いは雌雄共通の繰り返し配列等をマーカーとして、種の同定、核と細胞質の別、性染色体と常染色体の別、及び性染色体であればＸ染色体とＹ染色体の別等の同定や特定を行う方法が開示されている。また、特表２００１−５０９３８１号公報には、ウマのＹ染色体に特異的なＤＮＡ配列をプローブとして、ウマ、ウマ胎児、ウマの胚、ウマ細胞の性を決定する方法について開示されている。これらはいずれも、動物の性染色体の特異塩基配列を検知して、動物の胎児や胚の性を決定する方法が採られており、その判定が複雑になっている。したがって、トランスジェニック動物の作製過程等において、逐次、作製された胚や胎児等の性の判別に用いる技術としては不便な点があった。
更に最近、動物の雌雄判別の方法として、Nagyらにより、トランスポーター遺伝子のような標識遺伝子を用いて雌雄の判別を行う方法が報告されている（Nat. Genet. 19:220-222,1998）。この方法は、緑色蛍光タンパク質（green fluorescence protein：ＧＦＰ）を利用した方法であり、非侵襲的（non-invasive）な雌雄判別が可能な方法である。この雌雄の判別方法は、ＧＦＰで標識化したＸGFPＹのオスと野生型のＸＸのメスのマウスを掛け合わせることにより、子供はＸGFPＸのメスとＸＹのオスに別れ、雌雄判別が可能となるものである。しかし、この方法の場合、メスはＸ染色体の不活化が生じ、同じＸGFPＸでも緑色蛍光を発する場合と発しない場合があり、発した場合は必ずメスであるが、発しない場合はオスかメスかの判別ができないという不確実性の問題が生じる。
一方、極く最近に、トランスジェニック動物の作出に関連して、Jaenischらによって、遺伝子破壊胚性幹細胞（ＥＳ細胞）からノックアウトマウスを作製する迅速な方法が報告された（Nat. Biotech. 20:455-459, 2002）。この方法は、４０，ＸＹ ＥＳ細胞から遺伝子破壊ＥＳ細胞を作成し、このＥＳ細胞からＹ染色体の不安定性を用いて３９，ＸＯ ＥＳ細胞を単離する。それぞれのＥＳ細胞からオスとメスのヘテロ接合体マウスを直接作成することが可能となり、次世代でノックアウトマウスのホモ接合体を作成することが可能である。この方法を行うためには、遺伝子破壊４０，ＸＹ ＥＳ細胞から先ずオスのマウスを作成し、そのマウスを親としてオスとメスのヘテロ接合体マウスを作成する。Jaenischらは、このノックアウトマウスを作製する方法の報告において、３９，ＸＯ ＥＳ細胞を選別する方法として、約２００コロニーのＥＳ細胞からＤＮＡを抽出し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ法を用いたことを報告しているように、この方法は、細胞数が多く必要であり、煩雑で時間がかかるという問題を有している。
上記のように、昨今、各種の目的から、多岐に渡りトランスジェニック動物の作出が行われ、その開発の重要性が高まる中で、そのトランスジェニック動物の作出方法や作出過程の判別方法、更にはそれらの利用において、より確実で、容易な技術の更なる開発が望まれているところである。
本発明の課題は、トランスジェニック動物の作出や判別或いはその利用を、より確実で、容易に行うことができる方法及び材料を提供すること、特に、トランスジェニック非ヒト動物の作出過程において、該動物由来の組織や細胞の判別や、雌雄の判別が確実かつ容易な標識化されたトランスジェニック非ヒト動物、そのＥＳ細胞を提供すること、及び、該標識化されたトランスジェニック非ヒト動物の作出方法、該標識化によるトランスジェニック非ヒト動物の雌雄判別方法、該標識遺伝子で標識した胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いた遺伝子ノックアウト非ヒト動物或いはトランスジェニック非ヒト動物の作出方法、更には、該標識を用いたキメラ非ヒト動物の由来判別方法等を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく標識遺伝子を導入したトランスジェニック動物について鋭意研究する中で、緑色蛍光タンパク質（green fluorescence protein：ＧＦＰ）のような標識タンパク質の遺伝子を、サイトメガロウイルス エンハンサー（cytomegalovirus enhancer）とチキンベーターアクチンプロモーター（chicken β-actin promoter）のような調節遺伝子の下流に連結したトランスジーンを構築し、該トランスジ−ンをマウスのような哺乳動物の受精卵の前核に導入することにより、該標識タンパク質の遺伝子をトランスジェニック動物のＹ染色体上に局在させることができ、該Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニック動物を作出することが可能であることを見い出した。また、該トランスジェニック動物の作製法を用いることにより、作製したトランスジェニック動物の雌雄の判別や、作製したトランスジェニック動物の組織、細胞、胚、胎児等の由来の判別をより確実で、容易に行うことができ、更に、該Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニック動物から、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）を構築し、該ＥＳ細胞から標識タンパク質をマーカーにしてＹ染色体が特異的に脱落したクローンを選別し、該ＥＳ細胞のＹ染色体が特異的に脱落した細胞とＹ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させた細胞とを用いて、迅速かつ簡便な方法でトランスジェニック動物或いはノックアウト動物のホモ接合体を作製することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、標識タンパク質の遺伝子がＹ染色体上に局在したトランスジェニック動物及びその作出方法からなる。本発明の、標識タンパク質の遺伝子がＹ染色体上に局在したトランスジェニック動物の作出方法の具体的方法としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質の遺伝子を、サイトメガロウイルス エンハンサーとチキンベーターアクチンプロモーター等の調節遺伝子の下流に連結したトランスジーンを構築し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのような動物の受精卵の前核にマイクロインジェクションして作出する。本発明の具体例としては、１４クローンのラインを作成中、オスだけにＧＦＰが発現するラインを１クローン見い出した。ＦＩＳＨ法にてトランスジーンの局在を検討すると、ＧＦＰ遺伝子はＹ染色体に局在することが確認された。
また、本発明は、本発明のＹ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニック動物の作製に用いるトランスジーンを用いて樹立したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を包含する。
更に、本発明は、本発明のＹ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニック動物の標識を用いて、該動物の受精卵から発生する胚や胎児等の雌雄の判別を行う方法を包含する。本標識タンパク質の遺伝子の発現は、蛍光顕微鏡下で胚盤胞期から確認できる。本発明は、標識タンパク質遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質を用いたために、非侵襲的（non-invasive）な雌雄判別が可能であり、本標識タンパク質遺伝子がＹ染色体上に局在しているために、胚盤胞期以降では非侵襲的、かつ容易に、雌雄の判別を行うことが可能である。
因みに、性染色体を標識化したトランスジェニック動物の例として、Nagyらの報告した、Ｘ染色体にＧＦＰを局在させたトランスジェニックマウスの例がある（Nat. Genet. 19:220-222, 1998）。この報告のものでは、ＧＦＰで標識化した、ＸGFPＹのオスと野生型ＸＸのメスのマウスを掛け合わせることにより、子供はＸGFPＸのメスとＸＹのオスに別れ、雌雄判別が可能であると報告されている。しかし、メスの場合Ｘ染色体の不活化が生じ、同じＸGFPＸでも緑色蛍光を発する場合と発しない場合があり、緑色蛍光を発した場合は必ずメスではあるが、発しない場合はオスかメスか判別できないと言う問題がある。本発明のごとく、Ｙ染色体に局在する標識遺伝子（例えばＧＦＰ，ＲＦＰ，ＣＦＰ，ＢＦＰなどの蛍光タンパク質やＬａｃＺやルシフェラーゼなど簡便に検出できるタンパク質をコードする遺伝子）は、オスであれば必ず発現するため、確実な雌雄判別が可能である。
また、本発明は、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニック動物から樹立した胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて、トランスジェニック動物或いはノックアウト動物のホモ接合体を迅速かつ簡便な方法で作出する方法を包含する。
すなわち、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニックマウス或いはノックアウトマウスのような動物から、ＥＳ細胞を樹立することが可能である。本発明では、一実施例としてＸＹGFPマウスの胚盤胞からＥＳ細胞を樹立した。このＥＳ細胞は緑色蛍光を発し、核型は４０，ＸＹである。３代継代後、共焦点レーザー顕微鏡下で緑色蛍光陽性細胞と陰性細胞をおのおのクローン化した。それぞれの核型は、緑色蛍光陽性細胞が４０，ＸＹ、緑色蛍光陰性細胞が３９，ＸＯであった。単離した緑色蛍光陽性クローンは、継代１代目では１００％陽性であったが、継代３代目では約１．７％で陰性細胞が観察された。以上から、Ｙ染色体は他の染色体より不安定であり、継代が進むにつれ脱落しやすいこと、また、Ｙ染色体を標識したトランスジーンをマーカーにすることで、Ｙ染色体が特異的に脱落した３９，ＸＯの核型のクローンを容易に単離が可能であることを示した。
最近、このようなＹ染色体の不安定性を用いて、ノックアウトマウスを作成する迅速な方法としてJaenischらが、遺伝子破壊ＥＳ細胞からノックアウトマウスを作成する迅速な方法を報告した（Nat. Biotech. 20:455-459,2002）。この方法は、４０，ＸＹ ＥＳ細胞から遺伝子破壊ＥＳ細胞を作成し、このＥＳ細胞からＹ染色体の不安定性を用いて３９，ＸＯ ＥＳ細胞を容易に単離する。それぞれのＥＳ細胞からオスとメスのヘテロ接合体マウスを直接作成することが可能となり、次世代でノックアウトマウスのホモ接合体を作成することが可能となる。通常の方法であれば、遺伝子破壊４０，ＸＹ ＥＳ細胞から先ずオスのマウスを作成し、そのマウスを親としてオスとメスのヘテロ接合体マウスを作成する。
この方法では、遺伝子破壊４０、ＸＹ ＥＳ細胞から３９，ＸＯ ＥＳ細胞を単離し、後者の細胞からメスのヘテロ接合体マウスを作成することで、通常の方法より一世代短縮することが可能である。しかし、Jaenischらの方法は、本発明におけるような標識タンパク質の遺伝子を用いた方法でなかったため、簡便に行うことが可能な方法ではなかった。すなわち、Jaenischらは、３９，ＸＯ ＥＳ細胞を選別する方法として、約２００コロニーのＥＳ細胞からＤＮＡを抽出し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ法を用いた。この方法では、細胞数が多く必要であり、煩雑で時間がかかる。これに対して、本発明の方法では、Ｙ染色体のマーカーとして標識タンパク質を識別し、容易にＹ染色体が特異的に脱落した３９、ＸＯ ＥＳ細胞を選別することが可能であるため、容易かつ迅速なホモ接合体の作出が可能となる。
更に、本発明は、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させた標識を用いて、キメラ非ヒト動物の由来判別を行う方法を包含する。キメラ個体作成の際には、１）Ｙ染色体を標識したトランスジェニックマウスから樹立したＥＳ細胞を用いて作成した遺伝子改変ＥＳ細胞を野生型胚に注入する場合、または２）通常の遺伝子改変ＥＳ細胞をＹ染色体標識トランスジェニックマウスの胚へ注入する場合が考えられる。いずれの場合にも、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させた標識を用いて、作成したキメラ個体の子供を産生させることで、遺伝子改変ＥＳ細胞の生殖細胞への伝播を容易に検討することが可能である。
本発明は、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたことを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物（１）や、標識タンパク質が、蛍光タンパク質であることを特徴とする上記（１）記載のトランスジェニック非ヒト動物（２）や、蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質であることを特徴とする上記（２）記載のトランスジェニック非ヒト動物（３）や、サイトメガロウィルスエンハンサー及びチキンベーターアクチンプロモーターのＤＮＡ配列の下流に、上記（１）〜（３）のいずれか記載の標識タンパク質の遺伝子を連結したトランスジーンを構築し、該トランスジーンを導入して、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたことを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物（４）や、トランスジェニック非ヒト動物が、トランスジェニックマウスであることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のトランスジェニック非ヒト動物（５）や、サイトメガロウィルスエンハンサー及びチキンベーターアクチンプロモーターのＤＮＡ配列の下流に、標識タンパク質の遺伝子を連結してトランスジーンを構築し、このトランスジーンを、非ヒト動物の受精卵の前核に導入し、発生させて、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子が局在したトランスジェニック非ヒト動物を取得することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物の作出方法（６）や、標識タンパク質の遺伝子が、蛍光タンパク質の遺伝子であることを特徴とする上記（６）記載のトランスジェニック非ヒト動物の作出方法（７）に関する。
また本発明は、上記（１）〜（５）のいずれか記載のトランスジェニック非ヒト動物の作出に用いるトランスジーンを、非ヒト動物の受精卵の前核に導入し、発生させたトランスジェニック非ヒト動物の胚盤胞から樹立したことを特徴とするＹ染色体上に標識タンパク質の遺伝子が局在したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞（８）や、トランスジェニック非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする上記（８）記載のＹ染色体上に標識タンパク質の遺伝子が局在したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞（９）や、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させた上記（１）〜（５）記載のトランスジェニック非ヒト動物を親として交配し、受精させたトランスジェニック非ヒト動物の受精卵から発生する胚及び胎児の雌雄の判別を、該標識タンパク質の標識を検知することにより行うことを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物の雌雄判別方法（１０）や、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子が局在したトランスジェニック非ヒト動物の胚から樹立した胚性幹細胞の遺伝子を改変し、該遺伝子改変胚性幹細胞を野生型胚に注入して作製したキメラ非ヒト動物、或いは遺伝子改変胚性幹細胞を、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子が局在したトランスジェニック非ヒト動物の胚に注入して作製したキメラ非ヒト動物において、該遺伝子改変胚性幹細胞の生殖細胞への伝播をＹ染色体上に局在させた標識タンパク質の標識により検知することを特徴とするキメラ非ヒト動物の由来判別方法に関する。
すなわち本発明は具体的には、サイトメガロウィルスエンハンサー及びチキンベーターアクチンプロモーターのＤＮＡ配列の下流に、標識タンパク質の遺伝子を連結したトランスジーンを構築し、該トランスジーンを、非ヒト動物の受精卵の前核に導入し、発生させ、トランスジェニック非ヒト動物の胚盤胞からＹ染色体上に標識タンパク質の遺伝子が局在したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞を樹立し、該トランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞を継代培養し、該標識タンパク質の標識をマーカーに、Ｙ染色体が特異的に脱落したクローンを単離することを特徴とするＹ染色体が特異的に脱落したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞の取得方法（請求項１）や、標識タンパク質が、緑色蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のＹ染色体が特異的に脱落したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞の取得方法（請求項２）や、Ｙ染色体が標識された胚性幹細胞を用いて特定遺伝子をノックアウトした胚性幹細胞を作成し、該胚性幹細胞を継代培養し、該標識タンパク質の標識をマーカーに、Ｙ染色体が特異的に脱落したクローンを単離することにより、Ｙ染色体が特異的に脱落したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞を取得し、該Ｙ染色体が特異的に脱落し、特定遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞と、Ｙ染色体を保持し、特定遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞とを用い、ホモ接合体を作製することを特徴とする遺伝子ノックアウト非ヒト動物の作出方法（請求項３）や、Ｙ染色体が標識された胚性幹細胞を用いて特定遺伝子を導入した胚性幹細胞を作成し、該胚性幹細胞を継代培養し、該標識タンパク質の標識をマーカーに、Ｙ染色体が特異的に脱落したクローンを単離することにより、Ｙ染色体が特異的に脱落したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞を取得し、該Ｙ染色体が特異的に脱落し、特定遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞と、Ｙ染色体を保持し、特定遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞とを用い、ホモ接合体を作製することを特徴とする遺伝子トランスジェニック非ヒト動物の作出方法（請求項４）からなる。
近年の遺伝子操作技術や遺伝子導入技術の進展により、多くのトランスジェニック動物が作出されており、遺伝子機能を改変した動物や新しい機能を持ったトランスジェニック動物の作製が行われている。また、最近の、ジーントラップ法や相同性組換え法などの技術の進歩により、これらの方法を用いて遺伝子を破壊し作製されたノックアウト動物は、個体レベルでの遺伝子機能の解析や疾病の機構の解明、更には、それを利用した薬剤のスクリーニング等に利用されている。
このように、昨今、各種の目的から、多岐に渡りトランスジェニック動物の作出が行われ、その開発の重要性が高まる中で、本発明は、そのトランスジェニック動物の作出方法や作出過程の判別方法、更にはそれらの利用において、より確実で、容易な技術を提供することができ、発生生物学、細胞生物学、免疫学、及び医療などの分野でトランスジェニック動物を利用する新たな研究及び技術の展開に大いなる貢献が期待される。
本発明により、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニック非ヒト動物、及びそれから樹立されたＥＳ細胞を調製することにより、トランスジェニック非ヒト動物の作出過程において、該動物由来の組織や細胞の判別や、雌雄の判別が確実かつ容易に行うことができ、トランスジェニック動物の作出や判別或いはその利用を、より確実で、容易に行うことができる。また、本発明により、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニック非ヒト動物から樹立されたＥＳ細胞及び該細胞からＹ染色体が特異的に脱落したＥＳ細胞を作製することにより、該ＥＳ細胞を用いて容易かつ迅速なホモ接合体の作出が可能となる。更に、本発明において標識化されたＥＳ細胞は、例えば再生医療に用いられるＥＳ細胞の基礎研究用マウスＥＳ細胞のような基礎研究用動物細胞の樹立を容易にする。
本発明は、蛍光タンパク質のような標識タンパク質の遺伝子をＹ染色体上に局在させたトランスジェニック非ヒト動物を作出することからなる。
本発明で使用する標識タンパク質の遺伝子としては、トランスポータータンパク質の遺伝子として用いられている、ＬａｃＺやルシフェラーゼ、或いは蛍光タンパク質の遺伝子等を用いることができるが、その発現を簡便かつ明瞭に検出することができる蛍光タンパク質の遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein:ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescent Protein：ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein:ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein:ＹＦＰ）（Gene,111:229-233,1992; Nat. Biotech. 17: 969-973, 1999; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:462-467, 2001; Annu. Rev. Biochem. 67:509-544）を用いるのが好ましく、その中でもＧＦＰが特に好ましい。また、増強した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（enhanced green fluorescent protein：ＥＧＦＰ）（Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:707-711, 1996）のような蛍光タンパク質も好適に用いることができる。
本発明において、標識タンパク質の遺伝子をＹ染色体上に導入する具体的方法としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質の遺伝子を、サイトメガロウイルス エンハンサーとチキンベーターアクチンプロモーター等の調節遺伝子の下流に連結して、トランスジーンを構築し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのような動物の受精卵の前核にマイクロインジェクションして作出する（J. Biol. Chem. 275:15992-16001）。本発明において、Ｙ染色体上のトランスジーンの局在の確認は、ＦＩＳＨ法（Cytogenet. Cell Genet. 71:179-181, 1995; Cytogenet. Cell Genet. 77:180-181, 1997）により確認することができる。
本発明における標識タンパク質の遺伝子の発現は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質の遺伝子を用いることにより、蛍光顕微鏡下で胚盤胞期から確認することができる。本発明においては、標識タンパク質の遺伝子がＹ染色体上に局在しているために、胚盤胞期以降では非侵襲的に容易にその発現を検知することが可能である。
本発明の方法を用いて、遺伝子の改変されたトランスジェニック動物を作製するには、本発明の方法によって作製した、Ｙ染色体を局在的に標識化したトランスジェニック動物の受精卵の前核内に、公知の方法によって目的とする遺伝子をマイクロインジェクションで直接的に注入し、目的とする遺伝子が導入された標識化されたトランスジェニック動物を作製するか、或いは、本発明の方法によって作製した、Ｙ染色体を局在的に標識化したトランスジェニック動物からＥＳ細胞を樹立し、このＥＳ細胞に公知の方法により、目的とする遺伝子を導入するか或いは改変し、遺伝子の改変された或いは目的とする遺伝子の導入された標識化されたトランスジェニック動物を作製するか、更には、該ＥＳ細胞の特定遺伝子を相同組換え法やジーントラップ方のようなジーンターゲッティングにより破壊して、目的とする遺伝子が破壊されかつ標識化されたノックアウト動物を作製する。
本発明において、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニック動物のＥＳ細胞（胚性幹細胞）を樹立するには、それ自体公知の方法で樹立することができる。すなわち、まず、本発明の方法によって作製したマウスのようなトランスジェニック動物の胚盤胞から内部細胞塊（inner cell mass:ICM）を分離する。内部細胞塊の分離方法としては、免疫外科手術法（Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72:5099-5102,1975）、機械的分離法（J. Embryol. Exp. Morph. 28:279-312,1972）及びカルシウムイオノフォア処理法（J. Embryol. Exp. Morph. 45:237-247,1978）がある。分離した内部細胞塊を、適切な条件下で培養し、細胞を未分化な状態を維持しながら増殖させる。この内部細胞塊由来細胞を未分化な状態で更に継代培養し、ＥＳ細胞株を樹立する。通常、ＥＳ細胞の培養は、マウス胎仔線維芽細胞やＳＴＯ細胞（株化されたマウス胎仔線維芽細胞）などのフィーダー細胞上で行われる。樹立された細胞がＥＳ細胞であるかどうかを確認するには、直接的には、樹立した細胞を初期胚に導入し、キメラを作出して確認することができる。
本発明のＹ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニック動物によって、確実な雌雄の判別が可能となる。本発明において、標識タンパク質の遺伝子の発現は、蛍光顕微鏡下で胚盤胞期から確認できる。更に、本発明において、標識タンパク質遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質を用いれば、非侵襲的（non-invasive）な雌雄判別が可能であり、本標識タンパク質遺伝子がＹ染色体上に局在しているために、胚盤胞期以降では、例えば、受精卵から発生する胚や胎児等の雌雄の判別が非侵襲的、かつ容易に行うことが可能である。また、本発明においてはＹ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたために、染色体の不活化の問題を生ずることがなく、Ｘ染色体を標識化した従来例のように、メスの場合にＸ染色体の不活化が生じ、同じＸGFPＸでも緑色蛍光を発する場合と発しない場合があるような不確実性の問題が生ずる余地がない。
本発明の方法により、トランスジェニック動物或いはノックアウト動物のホモ接合体を迅速かつ簡便な方法で作出することができる。
すなわち、本発明の方法により、トランスジェニック動物或いはノックアウト動物のホモ接合体を作出するには、まず、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させたトランスジェニックマウス或いはノックアウトマウスのような動物から、ＥＳ細胞を樹立する。例えば、ＧＦＰでＹ染色体を標識化したＸＹGFPマウスの胚盤胞からＥＳ細胞を樹立した。このＥＳ細胞は緑色蛍光を発し、核型は４０，ＸＹとなる。３代継代後、共焦点レーザー顕微鏡下で緑色蛍光陽性細胞と陰性細胞をおのおのクローン化する。それぞれの核型は、緑色蛍光陽性細胞が４０，ＸＹ、緑色蛍光陰性細胞が３９，ＸＯとなる。単離した緑色蛍光陽性クローンは、例えば、継代１代目では１００％陽性となるが、継代３代目では約１．７％のような割合で、陰性細胞が観察される。すなわち、Ｙ染色体は他の染色体より不安定であり、継代が進むにつれ脱落しやすいこと、及び、該Ｙ染色体を標識したトランスジーンをマーカーにすることで、Ｙ染色体が特異的に脱落した３９，ＸＯの核型のクローンを容易に単離することが可能となる。
このようにしてＹ染色体の不安定性を用いて単離した、Ｙ染色体が特異的に脱落した３９，ＸＯ ＥＳ細胞と、Ｙ染色体が標識化された４０，ＸＹ ＥＳ細胞からホモ接合体を迅速かつ容易に作出することができる。特に、本発明の方法では、Ｙ染色体のマーカーとして標識タンパク質を識別し、容易にＹ染色体が特異的に脱落した３９、ＸＯ ＥＳ細胞を選別することが可能であるため、従来の方法に比べて、容易かつ迅速なホモ接合体の作出が可能となる。
本発明は、キメラ個体を作製する際に、生殖細胞の由来の判別に用いることができる。本発明のＹ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させた標識を用いて、キメラ非ヒト動物の由来判別を行う場合としては、１）Ｙ染色体を標識したトランスジェニックマウスから樹立したＥＳ細胞を用いて作成した遺伝子改変ＥＳ細胞を野生型胚に注入する場合、または２）通常の遺伝子改変ＥＳ細胞をＹ染色体標識トランスジェニックマウスの胚へ注入する場合があるが、いずれの場合にも、Ｙ染色体上に標識タンパク質の遺伝子を局在させた標識を用いて、作成したキメラ個体の子供を産生させ、遺伝子改変ＥＳ細胞の生殖細胞への伝播を判別する。本発明において、標識タンパク質遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質を用いれば、非侵襲的（non-invasive）な雌雄判別が可能であり、容易にその由来の確認を行うことができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（Ｙ染色体上にＧＦＰ遺伝子が挿入されたトランスジェニックマウスの作製）
標識タンパク質遺伝子がＹ染色体上に局在して挿入されたトランスジェニックマウスを作製した。標識遺伝子の一実施例として、蛍光輝度が高く熱安定性の高い二重点変異（Ｓ６５Ｔ／Ｓ１４７Ｐ）を持つ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をサイトメガロウイルス エンハンサーとチキン β−アクチンプロモーターの下流、およびグロビンのポリＡ付加シグナルの上流に連結したものをトランスジーンとして用いた。すなわち、発現ベクターｐＭＧ２（Biochem. Biophys. Res. Commun. 232:69-73, 1997）を、Ｓａｌ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで消化した。次いで、精製したＧＦＰ ＤＮＡ断片を混合し、トランスジーンを構築した。このトランスジーンを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵の前核にマイクロインジェクションし、１４クローンのトランスジェニックマウスのラインを作成したところ、オスだけにＧＦＰが発現するラインを１クローンのみ見い出した。確認のためにオスのＧＦＰマウスとメスの野生型マウスを掛け合わせてみると、オスにのみＧＦＰの蛍光が確認された。また、ＧＦＰ遺伝子をプローブとして、ＧＦＰマウス由来の線維芽細胞を用いてＦＩＳＨ法にてトランスジーンの局在を検討すると、ＧＦＰ遺伝子はＹ染色体に局在した（図１：図は、ＦＩＳＨ法によるトランスジーンの染色体座位の検討結果を示す。矢印で示されるように、ＧＦＰに対するシグナルはＹ染色体上に局在している。）。以上から、作製されたマウスはＹ染色体上に標識タンパク質ＧＦＰの遺伝子を局在するトランスジェニックマウスであることが示された。
標識タンパク質遺伝子がＹ染色体上に局在して挿入されたトランスジェニックマウスを作製した。標識遺伝子の一実施例として、蛍光輝度が高く熱安定性の高い二重点変異（Ｓ６５Ｔ／Ｓ１４７Ｐ）を持つ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をサイトメガロウイルス エンハンサーとチキン β−アクチンプロモーターの下流、およびグロビンのポリＡ付加シグナルの上流に連結したものをトランスジーンとして用いた。すなわち、発現ベクターｐＭＧ２（Biochem. Biophys. Res. Commun. 232:69-73, 1997）を、Ｓａｌ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで消化した。次いで、精製したＧＦＰ ＤＮＡ断片を混合し、トランスジーンを構築した。このトランスジーンを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵の前核にマイクロインジェクションし、１４クローンのトランスジェニックマウスのラインを作成したところ、オスだけにＧＦＰが発現するラインを１クローンのみ見い出した。確認のためにオスのＧＦＰマウスとメスの野生型マウスを掛け合わせてみると、オスにのみＧＦＰの蛍光が確認された。また、ＧＦＰ遺伝子をプローブとして、ＧＦＰマウス由来の線維芽細胞を用いてＦＩＳＨ法にてトランスジーンの局在を検討すると、ＧＦＰ遺伝子はＹ染色体に局在した（図１：図は、ＦＩＳＨ法によるトランスジーンの染色体座位の検討結果を示す。矢印で示されるように、ＧＦＰに対するシグナルはＹ染色体上に局在している。）。以上から、作製されたマウスはＹ染色体上に標識タンパク質ＧＦＰの遺伝子を局在するトランスジェニックマウスであることが示された。
（ＧＦＰタンパク質の発現と胎児の雌雄判別）
Ｙ染色体連鎖ＧＦＰトランスジェニックマウスのＧＦＰタンパク質の時期的・空間的発現を検討した。着床前の胚のＧＦＰタンパク質を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討したところ、早期胚盤胞期で初めてＧＦＰの蛍光が観察された。一般に、受精卵における精子由来の遺伝子は一細胞期ではメチル化により不活化されており、二細胞期から発現しはじめる。ＧＦＰの発現時期は二細胞期からずれているが、その理由としてＧＦＰタンパク質の蛍光の検出限界などの影響が考えられる。常染色体上に局在するＧＦＰトランスジェニックマウスでは受精卵からＧＦＰの発現が検出できるので、Ｙ染色体連鎖ＧＦＰトランスジェニックマウスの発現パターンはＧＦＰ遺伝子の上流にあるプロモーターの特性ではないと考えられる。本マウスにおけるＧＦＰは胚盤胞期以降ずっと検出できるので、各時期における非侵襲的な雌雄判別が容易に可能である（図２：図は、トランスジーンの発現と雌雄判別の結果を示す。Ａ，Ｂは胚盤胞期、Ｃ，Ｄは胎令１０．５日、Ａ、Ｃは透過像、Ｂ，Ｄは蛍光像を示す。）。
Ｙ染色体連鎖ＧＦＰトランスジェニックマウスのＧＦＰタンパク質の時期的・空間的発現を検討した。着床前の胚のＧＦＰタンパク質を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討したところ、早期胚盤胞期で初めてＧＦＰの蛍光が観察された。一般に、受精卵における精子由来の遺伝子は一細胞期ではメチル化により不活化されており、二細胞期から発現しはじめる。ＧＦＰの発現時期は二細胞期からずれているが、その理由としてＧＦＰタンパク質の蛍光の検出限界などの影響が考えられる。常染色体上に局在するＧＦＰトランスジェニックマウスでは受精卵からＧＦＰの発現が検出できるので、Ｙ染色体連鎖ＧＦＰトランスジェニックマウスの発現パターンはＧＦＰ遺伝子の上流にあるプロモーターの特性ではないと考えられる。本マウスにおけるＧＦＰは胚盤胞期以降ずっと検出できるので、各時期における非侵襲的な雌雄判別が容易に可能である（図２：図は、トランスジーンの発現と雌雄判別の結果を示す。Ａ，Ｂは胚盤胞期、Ｃ，Ｄは胎令１０．５日、Ａ、Ｃは透過像、Ｂ，Ｄは蛍光像を示す。）。
（Ｙ染色体が標識されたＥＳ細胞の確立）
Ｙ染色体連鎖ＧＦＰトランスジェニックマウスの胚盤胞から、免疫外科手術法（Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72:5099-5102, 1975）または機械的分離法（J. Embryol. Exp. Morph. 28:279-312, 1972）を用いて、内部細胞塊（ＩＣＭ）を分離し、これをマウス胎仔線維芽細胞を用いたフィーダー細胞上で、ＬＩＦを含むＥＳ細胞樹立・継代用培地を用いて継代培養し、ＧＦＰの蛍光を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を樹立した（図３：図は、４０，ＸＹGFPＥＳ細胞の樹立について示す。Ａは透過像、Ｂはスライス像、Ｃは投影像を示し、いずれも共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。）。このＥＳ細胞の核型を検討したところ、４０，ＸＹであった。
Ｙ染色体連鎖ＧＦＰトランスジェニックマウスの胚盤胞から、免疫外科手術法（Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72:5099-5102, 1975）または機械的分離法（J. Embryol. Exp. Morph. 28:279-312, 1972）を用いて、内部細胞塊（ＩＣＭ）を分離し、これをマウス胎仔線維芽細胞を用いたフィーダー細胞上で、ＬＩＦを含むＥＳ細胞樹立・継代用培地を用いて継代培養し、ＧＦＰの蛍光を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を樹立した（図３：図は、４０，ＸＹGFPＥＳ細胞の樹立について示す。Ａは透過像、Ｂはスライス像、Ｃは投影像を示し、いずれも共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。）。このＥＳ細胞の核型を検討したところ、４０，ＸＹであった。
（４０，ＸＹと３９，ＸＯの核型をもつＥＳ細胞のクローン化）
４０，ＸＹGFPＥＳ細胞を６ｃｍ径細胞培養用ディッシュに培養し、共焦点レーザー顕微鏡にて、各コロニーの蛍光を検出した（図４：図は、４０，ＸＹGFPＥＳ細胞のＧＦＰ蛍光の脱落と細胞のクローン化について示す。Ａ，Ａ’，Ｂ，Ｂ’は蛍光の完全脱落と部分脱落を矢印で示す。Ｃ，Ｄは単離したＧＦＰ蛍光陰性クローン（＃１）、Ｅ，Ｆは単離したＧＦＰ陽性クローン（＃１６）を示す。）。顕微鏡下で、蛍光陽性および陰性のコロニーを単離した。それぞれの核型を検出したところ、蛍光陽性のコロニーは４０，ＸＹであり、蛍光陰性のコロニーはＹ染色体の脱落した３９，ＸＯであった（図５：図は、単離したＧＦＰ蛍光陰性クローン（＃１）とＧＦＰ陽性クローン（＃１６）の核型の検討の結果を示す。Ａは＃１の核型（３９，ＸＯ）、Ｂは＃１６の核型（４０，ＸＹ）。なお矢印はＹ染色体を示す。）。以上のごとく、極小スケールで４０，ＸＹGFPＥＳ細胞からＹ染色体の脱落した３９，ＸＯの核型を有するコロニーを、簡便に単離することができる。
４０，ＸＹGFPＥＳ細胞を６ｃｍ径細胞培養用ディッシュに培養し、共焦点レーザー顕微鏡にて、各コロニーの蛍光を検出した（図４：図は、４０，ＸＹGFPＥＳ細胞のＧＦＰ蛍光の脱落と細胞のクローン化について示す。Ａ，Ａ’，Ｂ，Ｂ’は蛍光の完全脱落と部分脱落を矢印で示す。Ｃ，Ｄは単離したＧＦＰ蛍光陰性クローン（＃１）、Ｅ，Ｆは単離したＧＦＰ陽性クローン（＃１６）を示す。）。顕微鏡下で、蛍光陽性および陰性のコロニーを単離した。それぞれの核型を検出したところ、蛍光陽性のコロニーは４０，ＸＹであり、蛍光陰性のコロニーはＹ染色体の脱落した３９，ＸＯであった（図５：図は、単離したＧＦＰ蛍光陰性クローン（＃１）とＧＦＰ陽性クローン（＃１６）の核型の検討の結果を示す。Ａは＃１の核型（３９，ＸＯ）、Ｂは＃１６の核型（４０，ＸＹ）。なお矢印はＹ染色体を示す。）。以上のごとく、極小スケールで４０，ＸＹGFPＥＳ細胞からＹ染色体の脱落した３９，ＸＯの核型を有するコロニーを、簡便に単離することができる。
（クローン化した４０，ＸＹ ＥＳ細胞の継代数とＹ染色体の脱落の頻度）
ノックアウトやジーントラップしたＥＳ細胞は、基本的にクローン化されている。このようにクローン化したＥＳ細胞からＹ染色体が脱落するかどうかを、クローン化した４０，ＸＹGFPＥＳ細胞を用いて検討した。クローン化した４０，ＸＹGFPＥＳ細胞の継代数が１世代目の場合は、ほぼ１００％のコロニーでＧＦＰの蛍光が陽性であったのに対し、３世代の継代を重ねると、ＧＦＰ陰性のコロニーが約１．７％検出できた。すなわち、クローン化したオスＥＳ細胞でも継代を重ねるにつれＹ染色体が脱落すること、そして脱落したコロニーを容易に単離できることを示した。
ノックアウトやジーントラップしたＥＳ細胞は、基本的にクローン化されている。このようにクローン化したＥＳ細胞からＹ染色体が脱落するかどうかを、クローン化した４０，ＸＹGFPＥＳ細胞を用いて検討した。クローン化した４０，ＸＹGFPＥＳ細胞の継代数が１世代目の場合は、ほぼ１００％のコロニーでＧＦＰの蛍光が陽性であったのに対し、３世代の継代を重ねると、ＧＦＰ陰性のコロニーが約１．７％検出できた。すなわち、クローン化したオスＥＳ細胞でも継代を重ねるにつれＹ染色体が脱落すること、そして脱落したコロニーを容易に単離できることを示した。
（１２９ＸＢ６−ＹＧＦＰマウス由来ＥＳ細胞の作成とＹ染色体脱落の頻度）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ純系マウス由来のＥＳ細胞は、一般に交雑系マウス由来のＥＳ細胞に比べ個体を形成しにくいことが知られている。そこで１２９マウスの雌と、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＹＧＦＰマウスの雄を掛け合わせた雄マウス１２９×Ｂ６−ＹＧＦＰの胚盤胞から、ＧＦＰの蛍光を有するＥＳ細胞を樹立した。この１２９×Ｂ６−ＹＧＦＰのＥＳ細胞を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察すると、約３．２％ （４／１５６コロニー）の割合でＧＦＰ陰性のＥＳ細胞が確認された。クローン化したＥＳ細胞は、Ｙ染色体に存在するＺｆｙ遺伝子のＰＣＲによって検討し、ＧＦＰ陽性コロニーはＺｆｙ遺伝子が陽性、ＧＦＰ陰性コロニーはＺｆｙ遺伝子が陰性であることを確認した。即ちＧＦＰ陰性コロニーはＹ染色体が脱落し３９，ＸＯの核型を持つと考えられた。以上の結果から、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＹＧＦＰ純系マウス由来のＥＳ細胞のみならず、１２９マウスなどとの交雑マウス由来のＥＳ細胞でも、Ｙ染色体が同程度の頻度での脱落することを示した。交雑系マウス由来のＥＳ細胞は、純系に比べてより個体を形成しやすいため、本ＥＳ細胞を用いてより効率的にノックアウトマウスを作成することが可能である。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ純系マウス由来のＥＳ細胞は、一般に交雑系マウス由来のＥＳ細胞に比べ個体を形成しにくいことが知られている。そこで１２９マウスの雌と、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＹＧＦＰマウスの雄を掛け合わせた雄マウス１２９×Ｂ６−ＹＧＦＰの胚盤胞から、ＧＦＰの蛍光を有するＥＳ細胞を樹立した。この１２９×Ｂ６−ＹＧＦＰのＥＳ細胞を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察すると、約３．２％ （４／１５６コロニー）の割合でＧＦＰ陰性のＥＳ細胞が確認された。クローン化したＥＳ細胞は、Ｙ染色体に存在するＺｆｙ遺伝子のＰＣＲによって検討し、ＧＦＰ陽性コロニーはＺｆｙ遺伝子が陽性、ＧＦＰ陰性コロニーはＺｆｙ遺伝子が陰性であることを確認した。即ちＧＦＰ陰性コロニーはＹ染色体が脱落し３９，ＸＯの核型を持つと考えられた。以上の結果から、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＹＧＦＰ純系マウス由来のＥＳ細胞のみならず、１２９マウスなどとの交雑マウス由来のＥＳ細胞でも、Ｙ染色体が同程度の頻度での脱落することを示した。交雑系マウス由来のＥＳ細胞は、純系に比べてより個体を形成しやすいため、本ＥＳ細胞を用いてより効率的にノックアウトマウスを作成することが可能である。
「ＰＣＲの条件」
ＥＳ細胞コロニーそれぞれ３個から、Proteinase Kを用いてＤＮＡを抽出して以下
のＰＣＲに使用した。ＰＣＲ用のZfy primer setは論文Kay GF, et al. Cell, 72:171-182, 1993のを参照し、5’-gac tag aca tgt ctt aac atc tgt cc-3’及び5’-cct att gca tgg aca gca gct tat g-3’を用いた。ＰＣＲの条件は、９５℃ ５ｍｉｎ、（９５℃ １ｍｉｎ、５５℃ １ｍｉｎ、７２℃ ２ｍｉｎ）× ３５ ｃｙｃｌｅｓ、７２℃７ｍｉｎとした。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲルにて電気泳動した。
ＥＳ細胞コロニーそれぞれ３個から、Proteinase Kを用いてＤＮＡを抽出して以下
のＰＣＲに使用した。ＰＣＲ用のZfy primer setは論文Kay GF, et al. Cell, 72:171-182, 1993のを参照し、5’-gac tag aca tgt ctt aac atc tgt cc-3’及び5’-cct att gca tgg aca gca gct tat g-3’を用いた。ＰＣＲの条件は、９５℃ ５ｍｉｎ、（９５℃ １ｍｉｎ、５５℃ １ｍｉｎ、７２℃ ２ｍｉｎ）× ３５ ｃｙｃｌｅｓ、７２℃７ｍｉｎとした。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲルにて電気泳動した。
「１２９ｘＢ６−Ｙｌｉｎｋ ＧＦＰ ＥＳ細胞の性判別」
上記方法により、ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルにて電気泳動し、１２９ｘＢ６−Ｙｌｉｎｋ ＧＦＰ ＥＳ細胞の性判別を行った結果を、図６に示す。図中、「１〜５」の数字は、それぞれ、１．１２９ｘＢ６−ＹＧＦP，ＧＦＰ（−）ＥＳ colony−４；２．１２９ｘＢ６−ＹＧＦＰ，ＧＦＰ（−）ＥＳ colony−８；３．１２９ｘＢ６−ＹＧＦＰ，ＧＦＰ（−）ＥＳ colony−１０；４．１２９ｘＢ６−ＹＧＦＰ，ＧＦＰ（−）ＥＳ colony−１４；５．１２９ｘＢ６−ＹＧＦＰ，ＧＦＰ（−）ＥＳ colony−４；１．１２９ｘＢ６−ＹＧＦＰ♂ＥＳ、ＧＦＰ（＋）（ポジコン）を、「Ｍ」は、１００ｂｐ ＤＮＡ ladder markerを示す。ピックアップしたＥＳ細胞４ラインは、全て核型がＸＯであることが判明した。
上記方法により、ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルにて電気泳動し、１２９ｘＢ６−Ｙｌｉｎｋ ＧＦＰ ＥＳ細胞の性判別を行った結果を、図６に示す。図中、「１〜５」の数字は、それぞれ、１．１２９ｘＢ６−ＹＧＦP，ＧＦＰ（−）ＥＳ colony−４；２．１２９ｘＢ６−ＹＧＦＰ，ＧＦＰ（−）ＥＳ colony−８；３．１２９ｘＢ６−ＹＧＦＰ，ＧＦＰ（−）ＥＳ colony−１０；４．１２９ｘＢ６−ＹＧＦＰ，ＧＦＰ（−）ＥＳ colony−１４；５．１２９ｘＢ６−ＹＧＦＰ，ＧＦＰ（−）ＥＳ colony−４；１．１２９ｘＢ６−ＹＧＦＰ♂ＥＳ、ＧＦＰ（＋）（ポジコン）を、「Ｍ」は、１００ｂｐ ＤＮＡ ladder markerを示す。ピックアップしたＥＳ細胞４ラインは、全て核型がＸＯであることが判明した。
Claims (4)
- サイトメガロウィルスエンハンサー及びチキンベーターアクチンプロモーターのＤＮＡ配列の下流に、標識タンパク質の遺伝子を連結したトランスジーンを構築し、該トランスジーンを、非ヒト動物の受精卵の前核に導入し、発生させ、トランスジェニック非ヒト動物の胚盤胞からＹ染色体上に標識タンパク質の遺伝子が局在したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞を樹立し、該トランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞を継代培養し、該標識タンパク質の標識をマーカーに、Ｙ染色体が特異的に脱落したクローンを単離することを特徴とするＹ染色体が特異的に脱落したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞の取得方法。
- 標識タンパク質が、緑色蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のＹ染色体が特異的に脱落したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞の取得方法。
- Ｙ染色体が標識された胚性幹細胞を用いて特定遺伝子をノックアウトした胚性幹細胞を作成し、該胚性幹細胞を継代培養し、該標識タンパク質の標識をマーカーに、Ｙ染色体が特異的に脱落したクローンを単離することにより、Ｙ染色体が特異的に脱落したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞を取得し、該Ｙ染色体が特異的に脱落し、特定遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞と、Ｙ染色体を保持し、特定遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞とを用い、ホモ接合体を作製することを特徴とする遺伝子ノックアウト非ヒト動物の作出方法。
- Ｙ染色体が標識された胚性幹細胞を用いて特定遺伝子を導入した胚性幹細胞を作成し、該胚性幹細胞を継代培養し、該標識タンパク質の標識をマーカーに、Ｙ染色体が特異的に脱落したクローンを単離することにより、Ｙ染色体が特異的に脱落したトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞を取得し、該Ｙ染色体が特異的に脱落し、特定遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞と、Ｙ染色体を保持し、特定遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物の胚性幹細胞とを用い、ホモ接合体を作製することを特徴とする遺伝子トランスジェニック非ヒト動物の作出方法。
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