JP2010099006A - 変異導入遺伝子およびそれを導入したノックイン非ヒト動物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】変異導入DNA配列に変異導入カセットを導入した標的変異導入遺伝子であって、該変異導入DNA配列が、標的組換えベクター由来の長腕領域−短腕領域を含む配列構成からなり;該変異導入カセットが、5’側第1変異lox配列と3’側第1変異lox配列とからなる第1lox配列因子と、該第1lox配列因子に挟まれている変異導入領域とを含む配列構成からなり、かつ、該変異導入領域が、標的変異DNA配列部分とポジティブ選択マーカーカセットとを含む配列構成からなり;該変異導入領域が、標的組換えベクターの標的組換えカセットと、変異導入ベクターの可変式変異導入カセットとのlox特異的組換えにより導入された標的組換え領域である。
【選択図】なし
Description
Sauer, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5166-5170, 1988 Gu, H., et al., Cell, 73, 1155-1164, 1993 Araki, K., Imaizumi, K., Oike, Y. and Yamamura, K., J. Biochem. (Tokyo), 122, 977-982, 1997 Lakso, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6232-6236, 1992 Rosant, J., et al., Nature Med., 1, 592-594, 1995 Araki, K., Araki, M., and Yamamura, K., Nucleic Acids Res., 2002, Vol. 30, No. 19 e103 Albert, H., et al., Plant J, 7, 649-659, 1995 Araki, K., Araki, M. and Yamamura, K.: Nucleic Acid Res. 25, 868-872, 1997
変異導入DNA配列(20)に変異導入カセット(30)を導入した配列構成からなる標的変異導入遺伝子(10)であって、
該変異導入DNA配列(20)が、標的組換えベクター(14)由来の長腕領域(26a)−短腕領域(26b)を含む配列構成からなり;
該変異導入カセット(30)が、5’側第1変異lox配列(32a)と3’側第1変異lox配列(32b)とからなる第1lox配列因子(32)と、該第1lox配列因子に挟まれている変異導入領域(35)とを含む配列構成からなり、かつ、該変異導入領域(35)が、標的変異DNA配列部分(37)とポジティブ選択マーカーカセット(39)とを含む配列構成からなり;
該変異導入領域(35)が、標的組換えベクター(14)の標的組換えカセット(40)と、変異導入ベクター(16)の可変式変異導入カセット(50)とのlox特異的組換えにより導入された標的組換え領域(29)であること;
からなる標的変異導入遺伝子を提供する。
この発明は、その好ましい態様として、上記標的変異導入遺伝子であって、
5’側第1変異lox配列(32a)が、標的組換えベクター(14)の第2lox配列因子(42)の5’側第2変異lox配列(42a)と、変異導入ベクター(16)の第3lox配列因子(52)の5’側第3変異lox配列(52a)とのlox特異的組換えにより組換えられた変異lox配列であること;また、
3’側第1変異lox配列(32b)が、標的組換えベクター(14)の第2lox配列因子(42)の3’側第2変異lox配列(42b)と、変異導入ベクター(16)の第3lox配列因子(52)の3’側第3変異lox配列(52b)とのlox特異的組換えにより組換えられた変異lox配列であることからなる標的変異導入遺伝子を提供する。
該3’側第1変異lox配列(32b)が、標的組換えベクター(14)の第2lox配列因子(42)の3’側第2変異lox配列(42b)と、変異導入ベクター(16)の第3lox配列因子(52)の3’側第3変異lox配列(52b)とのlox特異的組換えにより組換えられた変異lox配列であること;
からなる標的変異導入遺伝子の作製方法を提供する。
標的組換えベクターは、その 5’-末端側から、プラスミド由来部分と、ネガティブ選択マーカーカセットと、相同組換えのための長腕領域である KCNQ2 遺伝子部分配列と、5’側lox配列因子としてのlox71配列と、ポジティブ選択マーカーカセットと、相同組換えのための短腕領域である遺伝子部分配列と、該ブラスミド由来部分と、ベクター直線化用制限酵素切断部位と、からなる配列構成からなっている。
塩基番号674―2301:DT-Aカセット
塩基番号2316 ―7483:KCNQ2遺伝子部分配列(相同組換えのための長腕領域)
塩基番号7484 ―7517:lox71配列
塩基番号8091 ―10138:PGK/Neoカセット
塩基番号10145 ―11939:KCNQ2遺伝子部分配列(相同組換えのための短腕領域)
塩基番号11940 ―14164:pBluescript II SK+由来部分
塩基番号11950 ―11954:制限酵素Sac II切断部位(ベクター直線化用)
(1−1)プラスミド
基盤としたプラスミドpBluescript II SK+は、大腸菌より抽出した閉環状DNA(2,960 bp: Strategene社)を制限酵素Xho IおよびXba Iで切断して直線化した。
(1−2)ネガティブ選択マーカーカセット(DT-Aカセット)
ネガティブ選択マーカーカセットは、MC1プロモーターと、ジフテリア毒素Aコード領域(DT-A)と、ポリA付加配列(pA)とからなる配列構成からなっている。
(1−3)KCNQ2遺伝子の相同組換えのための長腕領域ならびに短腕領域
相同組換えのための長腕領域と短腕領域となるKCNQ2遺伝子部分配列は、マウスKCNQ2遺伝子のイントロン2からイントロン7に亘る領域となるように設計した。そして、標的遺伝子であるKCNQ2遺伝子の長腕領域と短腕領域は、KCNQ2遺伝子を含むB6マウスBACクローンRPCI23-401L17を鋳型とし、下記配列を持つ長腕−短腕領域増幅用オリゴヌクレオチド対を用いたPCRにより7.4 kbの断片として増幅した。このうち、長腕領域は5’-側5.6 kbの領域に相当し、また短腕領域は3’-側1.8 kbの領域に相当する。
5’-GGGAAGGAGCGGCCGCAGGAAGGGGGTGGAGGGCACTGGACCTG-3’(KQ2-LA5’s)
配列番号7:
5’-GACGGTGCGCGGCCGCCGTGGCAGCCTGGGAAAGGCCAGAAAGAT-3’(KQ2-SA3’a)
なお、上記配列のうち、下線部は制限酵素認識配列を表している。
(1−4)5’側第2変異lox配列因子としてのlox71 配列
5’側第2lox配列因子としてのlox71配列は、loxP配列に相当する34 bpの二本鎖DNAの両末端に、制限酵素Spe I切断部位と相補結合可能な突出配列(5’-CTAG-3’)を付加した配列である。lox71配列は、下記配列を持つlox71配列合成用オリゴヌクレオチド対を、95℃で加熱変性の後室温まで徐冷して塩基対合させ、T4ポリヌクレオチドキナーゼを触媒としてATPをリン酸基供与体として両鎖の5’側末端をリン酸化して調製した。
5’-CTAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTA-3’(lox71s)
配列番号9:
5’-CTAGTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3’(lox71a)
上記配列のうち、ボツクス内の塩基配列はlox71配列に相当する塩基配列である。
ポジティブ選択マーカーカセットは、FRT配列と、PGK/薬物耐性遺伝子マーカーカセットと、3’側lox配列因子としてのlox2272配列と、ポリA付加配列(pA)と、FRT配列と、から構成されるように説計した。ここで、薬物耐性遺伝子マーカーとしてはネオマイシン耐性遺伝子(NeoR)を使用した。
5’-TCGAGCTAGCTAATAACTTCGTATAGCATACA-3’(Nh-loxPs)
配列番号11:
5’-GAATGCTAGCTTGCATGCCTGCAGGT-3’(Nh-FRTa)
上記配列のうち、下線部は制限酵素認識配列である。
(2)標的組換えベクターの作製法
実施例(1−1)において制限酵素Xho IとXba Iで切断したプラスミドpBluescript II SK+に、実施例(1−2)で調製したDT-Aカセットを組み込んだ後、これをNot Iで切断し、その切断部位に実施例(1−3)で調製した長腕−短腕領域断片を組み込んだ。さらに、長腕−短腕領域を組み込んだ断片をSpe Iで切断し、その切断部位に実施例(1−4)で調製したlox71断片を組み込んだ。次に、lox71断片を組み込んだ断片の長腕領域のエクソン6の5’ー末端より約200 bp上流側をXba Iで切断し、その切断部位に実施例(1−5)で調製したNeo カセットを組み込んで標的組換えベクターを作製した。標的組換えベクターが作製されていることは、塩基配列の決定により確認した。このようにして作製した標的組換えベクターはES細胞へ導入される。
2243 - 2277 loxKMR3 配列
2278 - 2847 KCNQ2 遺伝子部分配列(変異を含むexon 6および周辺領域)
2848 - 4243 PGK/Puro カセット
4238 - 4895 pBluescript II SK+ 由来部分
上記KCNQ2遺伝子部分の構成は下記のとおりである。
2472 - 2582 exon 6 (変異を含む)
2583 - 2847 intron 6 (5’末端部分)
2506 変異部位(TAC(Tyr) → TGC(Cys))(pMtKCNQ2YCのみ)
2571 変異部位(GCT(Ala) → ACT(Thr))(pMtKCNQ2ATのみ)
上記PGK/Puroカセットには下記の配列因子が含まれる。
2966 - 3522 PGK遺伝子 プロモーター領域
3523 - 4122 ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ コード領域
4204 - 4237 lox2272配列
(2−1)ブラスミド
基盤としたプラスミド(p3T)は、大腸菌より抽出した閉環状DNA(3,003 bp;MoBiTec社) をHind IIIおよびKpn Iで切断して直線化した。
(2−2)ピューロマイシン耐性遺伝子カセット(Puroカセット)
ピューロマイシン耐性遺伝子カセット(Puroカセット)は、FRT配列-PGKプロモーター(PPGK)-ピューロマイシン耐性遺伝子(PuroR)-lox2272配列からなる配列構成になるように設計した。
5’-AACAAGCTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTAT-3’(Hd-FRTs)
配列番号14:
5’-ATAGGTACCATAACTTCGTATAAAGTATCCTATACGAAGTTA-3’(Kp-lox2272a)
上記配列のうち、下線部は、制限酵素認識配列である。
5’-GCAAAACCAAATTCCGGGCCAGCTCATTC-3’(Neo3’s)
配列番号16:
5’-ATTTGTCCTGCTTCAGTGCTGTATTGGGAT-3’(KQ2CA3’a)
一方、これら増幅産物のDNAについて下記配列を持つプライマー対を用いてPCRを行ったところ、増幅産物は確認されなかったことからに、非相同組換えによる標的組換えベクターの挿入は起きていないと判断できた。つまり、これらのDNAを制限酵素BspH Iおよび Bgl IIで切断し、短腕領域3’側領域をプローブとしてサザンブロット解析を行ったところ、9個のクローンすべてにおいて標的相同組換えの場合に予想された3.2 kbのDNA断片が検出された。このことから、これら9クローンES細胞において期待された標的組換えを確認し、KCNQ2遺伝子に変異導入可能なアクセプターES細胞として凍結保存し、以降の操作に用いた。
配列番号18:5’-TTCTCTTCCAGCTGGATCGGGGTGC-3’(KQ2LA5’a)
エクソン6周辺領域増幅・loxKMR3配列導入用プライマー対は、配列番号19および20で示すように下記配列を有するように設計した。
5’-TAGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACCTTGTTATCTAGTA-3’(BH-KMR/E6s)
配列番号20:
5’-GATAAGCTTAGAATCATTCAGATGGGAAAGCCACA-3’(Hd-E6a)
上記配列において、下線部は制限酵素認識配列、ボックスはloxKMR3配列、ゴシック文字は変異置換部位を示す。
5’-CGACCATTGGCTACGGGGACAAGTGCCCTCA-3’(Y284Cs)
配列番号22:
5’-GCCTCCCGTTCCAGGTCTGAGGGCACTTGT-3’(Y284Ca)
A306A変異導入用プライマー対は、配列番号23および24で示すように下記配列を有するように設計した。
5’-CCCTCATTGGTGTCTCGTTCTTTACTCTTC-3’(A306Ts)
配列番号24:
5’-TCCCAAAATGCCAGCAGGAAGAGTAAAGAA-3’(A306Ta)
12標的組換え遺伝子
14標的組換えベクター
16変異導入ベクター
18標的変異遺伝子
20変異導入 DNA 配列部分
25標的組換え DNA 配列部分
26a長腕領域
26b短腕領域
28a第1制限酵素切断部位
28b第2制限酵素切断部位
29標的組換え領域
30変異導入カセット
32第1lox配列因子
32a5’側第1変異lox配列
32b3’側第1変異lox配列
35変異導入領域
37標的DNA配列部分
39ポジティブ選択マーカーカセット
40標的組換えカセット
42第2lox配列因子
42a5’側第2変異lox配列
42b3’側第2変異lox配列
44ネガティブ選択マーカーカセット
45ポジティブ選択マーカーカセット
47ポリA配列
50可変式変異導入カセット
52第3lox配列因子
52a5’側第3変異lox配列
52b3’側第3変異lox配列
Claims (23)
- 変異導入DNA配列に変異導入カセットを導入した標的変異導入遺伝子であって、
該変異導入DNA配列が、標的組換えベクター由来の長腕領域−短腕領域を含む配列構成からなり;
該変異導入カセットが、5’側第1変異lox配列と3’側第1変異lox配列とからなる第1lox配列因子と、該第1lox配列因子に挟まれている変異導入領域を含む配列構成からなり、かつ、該変異導入領域が、標的変異DNA配列部分とポジティブ選択マーカーカセットとを含む配列構成からなり;
該変異導入領域が、標的組換えベクターの標的組換えカセットと、変異導入ベクターの可変式変異導入カセットとのlox特異的組換えにより導入された標的組換え領域であること;
を特徴とする標的変異導入遺伝子。 - 請求項1に記載の標的変異導入遺伝子において、
該5’側第1変異lox配列が、標的組換えベクターの第2lox配列因子の5’側第2変異lox配列と、変異導入ベクターの第3lox配列因子の5’側第3変異lox配列とのlox特異的組換えにより組換えられた変異lox配列であること;
該3’側第1変異lox配列が、標的組換えベクターの第2lox配列因子の3’側第2変異lox配列と、変異導入ベクターの第3lox配列因子の3’側第3変異lox配列とのlox特異的組換えにより組換えられた変異lox配列であること;
を特徴とする標的変異導入遺伝子。 - 請求項1または2に記載の標的変異導入遺伝子において、該標的組換えカセットが、該5’側第2変異lox配列と該3’側第2変異lox配列とからなる第2lox 配列因子と、該第2lox配列因子に挟まれている標的組換え遺伝子の標的組換えDNA配列部分とポジティブ選択マーカーカセットとを含む配列構成からなっていることを特徴とする標的変異導入遺伝子。
- 請求項1または2に記載の標的変異導入遺伝子において、該可変式変異導入カセットが、該5’側第3変異lox配列と該3’側第3変異lox配列とからなる第3lox配列因子と該第3lox配列因子に挟まれた変異導入領域とを含む配列構成からなっていて、かつ、該変異導入領域が、該標的変異DNA配列部分とポジティブ選択マーカーカセットとを含む配列構成からなっていることを特徴とする標的変異導入遺伝子。
- 請求項1、2または4に記載の標的変異導入遺伝子において、該標的変異DNA配列部分が、標的変異遺伝子の標的変異を含むエクソン配列部分であることを特徴とする標的変異導入遺伝子。
- 請求項5に記載の標的変異導入遺伝子において、該標的変異遺伝子がヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん(BFNC)関連電位依存性カリウムチャンネルKCNQ2サブユニットの遺伝子由来であることを特徴とする標的変異導入遺伝子。
- 請求項5に記載の標的変異導入遺伝子において、該エクソン配列部分がエクソン6であることを特徴とする標的変異導入遺伝子。
- 請求項5ないし7のいずれか1項に記載の標的変異導入遺伝子において、該標的変異遺伝子の標的変異が遺伝子KCNQ2のY284C(配列番号1および2)またはA306T(配列番号3および4)であることを特徴とする標的変異導入遺伝子。
- 請求項1ないし8のいずれか1項に記載の標的変異導入遺伝子の作製方法であって、第2lox配列因子を含む標的組換えベクターを含む配列構成を持つ標的組換えベクターと、第3lox配列因子を含む可変式変異導入カセットを含む配列構成を持つ変異導入ベクターとを、Creリコンビナーゼシステムを用いて、lox特異的組換えにより、該標的組換えベクター中の標的組換えカセットに含まれる標的組換え領域を、該変異導入ベクター中の該可変式変異導入カセットの変位導入領域と組換えることにより、標的変異DNA配列部分が導入されている標的変異導入遺伝子を作製することを特徴とする標的変異導入遺伝子の作製方法。
- 請求項9に記載の標的変異導入遺伝子の作製方法でおいて、
該5’側第1変異lox配列が、標的組換えベクターの第2lox配列因子の5’側第2変異lox配列と、変異導入ベクターの第3lox配列因子の5’側第3変異lox配列とのlox特異的組換えにより組換えられた変異lox配列であること;
該3’側第1変異lox配列が、標的組換えベクターの第2lox配列因子の3’側第2変異lox配列と、変異導入ベクターの第3lox配列因子の3’側第3変異lox配列とのlox特異的組換えにより組換えられた変異lox配列であること;、
を特徴とする標的変異導入遺伝子の作製方法。 - 請求項9または10に記載の標的変異導入遺伝子の作製方法において、該標的組換えカセットが、該5’側第2変異lox配列と該3’側第2変異lox配列とからなる第2lox配列因子と、該第2lox配列因子に挟まれている標的組換え遺伝子の標的組換えDNA配列部分とポジティブ選択マーカーカセットとを含む配列構成からなっていることを特徴とする標的変異導入遺伝子の作製方法。
- 請求項9ないし11のいずれか1項に記載の標的変異導入遺伝子の作製方法において、該可変式変異導入カセットが、該5’側第3変異lox配列と該3’側第3変異lox配列とからなる第3lox配列因子と該第3lox配列因子に挟まれた変異導入領域とを含む配列構成からなっていて、かつ、該変異導入領域が、該標的変異 DNA 配列部分とポジティブ選択マーカーカセットと、を含む配列構成からなっていることを特徴とする標的変異導入遺伝子の作製方法。
- 請求項9ないし12のいずれか1項に記載の標的変異導入遺伝子の作製方法において、該標的変異DNA配列部分が、標的変異遺伝子の標的変異を含むエクソン配列部分であることを特徴とする標的変異導入遺伝子の作製方法。
- 請求項13に記載の標的変異導入遺伝子の作製方法において、該標的変異遺伝子がヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん(BFNC)関連電位依存性カリウムチャンネル KCNQ2 サブユニットの遺伝子由来であることを特徴とする標的変異導入遺伝子の作製方法。
- 請求項13または14に記載の標的変異導入遺伝子の作製方法において、該エクソン配列部分がエクソン6であることを特徴とする標的変異導入遺伝子の作製方法。
- 請求項13ないし15のいずれか1項に記載の標的変異導入遺伝子の作製方法において、該標的変異遺伝子の標的変異が遺伝子KCNQ2のY284C(配列番号1および2)またはA306T(配列番号3および4)であることを特徴とする標的変異導入遺伝子の作製方法。
- 5’側第3変異lox配列と3’側第3変異lox配列とからなる第3lox配列因子と、該第3lox配列因子に挟まれた変異導入領域とを含む配列構成からなっていて、かつ、該変異導入領域が、標的変異遺伝子中の標的変異DNA配列部分とポジティブ選択マーカーカセットとを含む配列構成からなっている可変式変異導入カセットであることを特徴とする可変式変異導入カセット。
- 請求項17に記載のことを特徴とする可変式変異導入カセットにおいて、該標的変異DNA配列部分が、ヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん(BFNC)関連電位依存性カリウムチャンネルの遺伝子KCNQ2サブユニットのY284C(配列番号1および2)またはA306T(配列番号3および4)であることを特徴とする可変式変異導入カセット。
- 請求項1ないし8のいずれか1項に記載の標的変異導入遺伝子が導入されていることを特徴とする変異遺伝子導入ES細胞。
- 請求項1ないし8のいずれか1項に記載の標的変異導入遺伝子が導入されていることを特徴とするノックイン非ヒト動物。
- 請求項20に記載のノックイン非ヒト動物において、該標的変異導入遺伝子がヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん(BFNC)関連電位依存性カリウムチャンネルの遺伝子KCNQ2サブユニット由来であることを特徴とするノックイン非ヒト動物。
- 請求項20または21に記載のノックイン非ヒト動物において、該標的変異導入遺伝子が遺伝子KCNQ2サブユニットのエクソン6であることを特徴とするノックイン非ヒト動物。
- 請求項20、21または22に記載のノックイン非ヒト動物において、該標的変異導入遺伝子が変異遺伝子KCNQ2のY284C(配列番号1および2)またはA306T(配列番号3および4)であることを特徴とするノックイン非ヒト動物。
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