JPWO2002013602A1 - トランスジェニック非ヒト哺乳動物及びその作製方法、動物疾患モデル、並びに遺伝子機能の解明方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、遺伝子の機能解明に有用な、トランスジェニック非ヒト哺乳動物及びその作製方法、動物疾患モデルの作製方法並びに遺伝子機能の解明方法に関する。
背景技術
現在、ヒトをふくむ各種生物でのゲノム解析が、急速な勢いで世界的に進められている。各種生物においてゲノム解析が完了すれば、遺伝子疾患の原因追究やその治療法および医薬品の開発、進化の歴史の解明など、バイオテクノロジー及び生命科学に応用することが可能になると期待されている。
しかしながら、配列情報だけから遺伝子の機能を知るには限界があり、多くの遺伝子の機能は未解明である。これらの遺伝子を有効利用するためには機能解明が必須であり、機能未解明の遺伝子の機能を解明することが、今後の課題として残されている。
遺伝子の機能を理解するための研究では、細胞の相同的組み換えの特質を利用して、機能的な対立遺伝子をその不活性化したコピーで置き換えることによって、目的とする遺伝子を特異的に破壊する方法(Ruvkun et Ausubel;Nature,289:85−88(1981))などが知られる。
トランスジェニック非ヒト哺乳動物もまた、遺伝子機能の解明に用いられてきた。トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、外来遺伝子を受精卵や初期胚の段階で導入し、該動物の内在性染色体に組み込むことで作製される。特定遺伝子のみを欠損又は付加等操作することにより、遺伝子欠損又は強制発現と個体レベルの表現型との関係を明らかにしようとするものである。
トランスジェニックマウスを作製するための一般的な技術は、国際公開WO91−13150(Ludwig Inst.Cancer Res.)に記載されている。米国特許第4,873,191号(Wagner et al.)は、哺乳動物接合体へのDNAのマイクロインジェクションによって得られた、外因性DNAを有する哺乳動物を教示している。
更に、転位性遺伝因子(トランスポゾン)を内因性DNAに挿入或いは更に転位させることで、該DNAの構造変化を起こしてこれを不活性化させ、動植物等の変異体を効率的に作出する方法が研究されてきている。また、トランスポゾンを利用した、染色体への特定遺伝子の導入・付加等が可能となってきている。
ここでトランスポゾンとは、染色体上のある部位から別の部位に移動(転位)し得るDNAセグメント(DNA型トランスポゾン)である。DNA型トランスポゾン(以下、本明細書では単に「トランスポゾン」という)は、トランスポゼースにより活性化されて転位する。
トランスポゾンは、通常両末端に反復配列(以下、本明細書では「トランスポゾン配列」という)を有し、これがトランスポゼースの認識部位である。該トランスポゾン配列は、トランスポゼースの作用により転位可能であれば、不完全な繰り返し部分を含み得る。
トランスポゾンが挿入されるDNA中の、トランスポゾンに特有な長さの挿入認識サイトは標的配列と呼ばれる。例えばSleeping Beauty(SB)トランスポゾンシステム(Z.Ivics et al.;Cell,91:501−510(1997))の場合、標的配列はTAであり、トランスポゾン挿入後の配列はTA−トランスポゾン−TAである(図5参照)。トランスポゾンの標的配列としては、例えばTA、ATAT,TATATA、TACAなどが知られている。該文献(Z.Ivics et al.;Cell,91:501−510(1997))は培養細胞でのトランスポゾンシステムの発現に関するものであり、成熟した哺乳動物個体又はその臓器、器官等ではトランスポゾンシステムの効果は確認されていない。
動物細胞においては、ショウジョウバエの1種Drosophila mauritianaからmarinerトランスポゾンが単離され、これを用いてベクターが構築されている。例えばDrosophila melanogasterのP因子トランスポゾンを用いて種々の異種生物染色体DNAへの組み込みが試みられたが、種特異性の理由から、P因子ベクターの機能は維持されなかった。Drosophila以外のイエバエ、ハヤトビバエ、ノミバエ等のハエを用いた実験では、いずれの場合もP因子の転位活性が維持されなかった(Handler et al.;Arch.Insect Biochem.Physiol.,22:373−384(1993))。P因子及びリポーター遺伝子が組み込まれたトランスジェニックゼブラフィッシュは、遺伝的に安定した発現が得られなかった(Gibbs et al.;Mol.Mar.Biol.Biotech.,3:317−326(1994))。
一方、最も研究された真核生物トランスポゾンであるTc1/marinerトランスポゾンを異種生物で用いた場合、それらの種特異性は比較的低く転位が起こり易いことが知られている(Z.Ivics et al.;Cell,91:501−510(1997))。
このTc1/mariner−likeトランスポゾンより再構築されるトランスポゾン及びトランスポゼースを含むトランスポゾンシステムの例に、SBトランスポゾン及びSBトランスポゼースを含む前記Sleeping Beauty(SB)transposon systemがある。このSBトランスポゾンをヒトのHela細胞とマウスのLMTK細胞へ導入した例(Z.Ivics et al.;Cell,91:501−510(2000))、マウスの胚性幹(embryonic stem:ES)細胞へ導入した例(G.Luo et al.;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:10769−10773(1998))、ヒト培養細胞に導入した線虫(Caenorhabditis elegans)由来Tc1トランスポゾンに活性がみられた例(G.Schouten et al.;Nucleic Acids Res.,26:3013−3017(1998))が報告されている。しかしながら、例えばマウスの胚性幹細胞へSBトランスポゾンを導入した上記例においては、トランスポゾンの転位頻度は外来遺伝子が導入された細胞あたり最大でも3.5×10−5と極めて低く、所望の細胞を得るためには大量の細胞を扱う必要があった。また、ヒトHela培養細胞に導入した例は、動物個体には適用できない。
哺乳動物におけるトランスポゾンの導入については、SBトランスポゾン及びSBトランスポゼース遺伝子を体細胞ゲノム中に血液を介して導入して得られる、トランスポゾンが転位したマウス(SR Yant et al.;Nature Genetics,25:35−41(2000))が報告されている。しかしながら、この場合のトランスポゾン転位頻度は、該遺伝子が導入された肝臓細胞中わずか約5−6%であり、この方法では遺伝子導入の効率が悪く、系統的にトランスジェニック動物を得ることもできない。
また、これまでの方法では、1動物個体の体内で数多くの遺伝子にランダムに変異を導入することが困難であり、その発現頻度も低いものであった。従って、遺伝子変異誘発のための一般的な方法を設計する必要があった。
従って、こうした課題を解決し、ヒト以外の哺乳動物における効率の良い遺伝子導入の技術を確立することが望まれていた。また、こうした技術によって、ヒト疾患モデル動物として病因解明、治療および予防等の研究、創薬開発に利用可能であり、臓器提供用ドナーとしても有用なトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作出することが望まれていた。
本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物及びその作製方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は、遺伝子機能の解明方法を提供することを目的とする。
さらにまた本発明は、動物疾患モデルの作製方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、疾患に関連する遺伝子及びタンパク分子を同定することをも目的とする。
発明の開示
本発明者は上述した如き課題に鑑みて、鋭意研究を重ねた結果、トランスポゾンコンストラクト及び/又はトランスポゼース遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物およびその作製方法、非ヒト哺乳動物疾患モデル並びに遺伝子機能の解明方法を見出し、ここに本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の項1〜項28に関する。
項1.ほぼ全細胞に少なくとも1つの非自己完結型トランスポゾン及び少なくとも1つのシグニチャー部位からなる群から選ばれる少なくとも1種を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項2.ほぼ全細胞に(i)少なくとも1つのトランスポゼース遺伝子及び少なくとも1つの非自己完結型トランスポゾン或いは自己完結型トランスポゾン並びに(ii)少なくとも1つのシグニチャー部位を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項3.トランスポゼースを発現する形態でトランスポゼース遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項4.前記非自己完結型トランスポゾン内に少なくとも1つのマーカー遺伝子及び少なくとも1つの遺伝子発現調節配列からなる群から選ばれる少なくとも1種を有する、請求項1又は2に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項5.前記マーカー遺伝子がグリーン蛍光蛋白質(GFP)遺伝子、イエロー蛍光蛋白質(YFP)遺伝子、レッド蛍光蛋白質(RFP)遺伝子、ブルー蛍光蛋白質(BFP)遺伝子、シアン蛍光蛋白質(CFP)遺伝子、lacZ遺伝子、luciferase遺伝子、又はChloramphenicol Acetyl Transferase(CAT)遺伝子である請求項4に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項6.前記遺伝子発現調節配列が、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー、スプライスアクセプター部位又はスプライスドナー部位からなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項4に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項7.少なくともいずれかの組織中で、シグニチャー部位の合計数が、細胞の合計数の0.1%以上、好ましくは1%以上、より好ましくは10%以上である、請求項2に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項8.前記非ヒト哺乳動物がマウス又はラットである、請求項1〜3のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項9.動物幹細胞又は受精卵に非自己完結型トランスポゾンを導入し、該動物幹細胞又は該受精卵から非自己完結型トランスポゾン含有非ヒト哺乳動物を得ることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
項10.動物幹細胞又は受精卵にトランスポゼース遺伝子を導入し、該動物幹細胞又は該受精卵からトランスポゼース含有非ヒト哺乳動物を得ることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
項11.非自己完結型トランスポゾン含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物とトランスポゼース遺伝子含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物を交配することを特徴とする、非自己完結型トランスポゾンおよびトランスポゼース遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
項12.請求項11の方法で得ることができる、請求項2に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項13.非自己完結型トランスポゾンおよびトランスポゼース遺伝子を有し、前記非自己完結型トランスポゾンを転位可能な状態で含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物とトランスポゼース遺伝子を含まない非ヒト哺乳動物とを交配することを特徴とする、非自己完結型トランスポゾン又はシグニチャー部位を含みトランスポジションがFIXされたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。項14.請求項13の方法で得ることができる、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項15.(1)動物幹細胞又は受精卵に非自己完結型トランスポゾンを導入して得られた非自己完結型トランスポゾン含有非ヒト哺乳動物と、
(2)動物幹細胞又は受精卵にトランスポゼース遺伝子を導入して得られたトランスポゼース含有非ヒト哺乳動物
とを交配することを特徴とする、非自己完結型トランスポゾンおよびトランスポゼース遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
項16.請求項15の方法で得ることができる、請求項2に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項17.前記マーカー遺伝子がグリーン蛍光蛋白質(GFP)遺伝子、イエロー蛍光蛋白質(YFP)遺伝子、レッド蛍光蛋白質(RFP)遺伝子、ブルー蛍光蛋白質(BFP)遺伝子、シアン蛍光蛋白質(CFP)遺伝子、lacZ遺伝子、luciferase遺伝子、又はChloramphenicol Acetyl Transferase(CAT)遺伝子である請求項16に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項18.前記遺伝子発現調節配列が、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー、スプライスアクセプター部位又はスプライスドナー部位からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項16に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項19.少なくともいずれかの組織中で、シグニチャー部位の合計数が、細胞の合計数の0.1%以上、好ましくは1%以上、より好ましくは10%以上である、請求項16に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項20.前記非ヒト哺乳動物がマウス又はラットである、請求項16に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項21.A)(1)動物幹細胞又は受精卵に非自己完結型トランスポゾンを導入して得られた非自己完結型トランスポゾン含有非ヒト哺乳動物と、
(2)動物幹細胞又は受精卵にトランスポゼース遺伝子を導入して得られたトランスポゼース含有非ヒト哺乳動物とを交配させる工程、
B)工程A)で得られた非自己完結型トランスポゾンおよびトランスポゼース遺伝子を有し前記非自己完結型トランスポゾンを転位可能な状態で含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物と、トランスポゼース遺伝子を含まない非ヒト哺乳動物とを交配する工程
を含むことを特徴とする、非自己完結型トランスポゾン又はシグニチャー部位を含みトランスポジションがFIXされたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
項22.請求項21の方法で得ることができる、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項23.前記マーカー遺伝子がグリーン蛍光蛋白質(GFP)遺伝子、イエロー蛍光蛋白質(YFP)遺伝子、レッド蛍光蛋白質(RFP)遺伝子、ブルー蛍光蛋白質(BFP)遺伝子、シアン蛍光蛋白質(CFP)遺伝子、lacZ遺伝子、luciferase遺伝子、又はChloramphenicol Acetyl Transferase(CAT)遺伝子である請求項22に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項24.前記遺伝子発現調節配列が、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー、スプライスアクセプター部位又はスプライスドナー部位からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項22に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項25.前記非ヒト哺乳動物がマウス又はラットである、請求項21に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
項26.請求項14に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の疾患に関連する表現型を調べて疾患又は病的状態を有する非ヒト哺乳動物を選抜することを特徴とする、非ヒト哺乳動物疾患モデルの作製方法。
項27.請求項1、2、4〜8、12、14、16〜20、22〜25及び28のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の表現型変化、並びに非自己完結型トランスポゾン又は自己完結型トランスポゾンの挿入位置及び/又はシグニチャー部位を調べることを特徴とする遺伝子機能の解明方法。
項28.Bloom遺伝子の発現効率を調節する手段とトランスポゾンシステムとを組み合わせ、両アレルに変異を導入することを特徴とする、表現型が変化したトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
定義
明細書及び図面の簡単な説明では、「GFP」はグリーン蛍光タンパク質(Green Fluorescence Protein)を意味し、対応する遺伝子は「GFP遺伝子」と記載する。図中においては、「GFP]はGFP遺伝子を意味する。
明細書及び図面の簡単な説明では、Sleeping Beauty(SB)トランスポゾンシステムにおけるトランスポゾンはSBトランスポゾン、トランスポゼースはSBトランスポゼースと記載される。一方、図中においては、「SB」はSleeping Beautyトランスポゼース遺伝子を意味する。
本発明で用いられる要素
本発明において、動物疾患モデル作製及び/又は遺伝子機能解明の対象とし得る非ヒト哺乳動物は、例えば、ブタ、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、又はハムスター等であり、より好ましくは、マウス又はラットである。ここで本発明の非ヒト哺乳動物には、哺乳動物個体だけでなく個体の一部及び個体の有する臓器、器官も包含される。これらはヒト疾患モデルとして、また臓器移植用ドナーとして有用である。
トランスポゾン配列に挟まれる部分には、様々なDNA配列(例えば、マーカー遺伝子、遺伝子発現調節配列、所望の遺伝子など)を挿入することができ、トランスポゾン配列の他に必要に応じて種々の構成要素を組み合わせたトランスポゾンコンストラクトを構築することができる。
本発明において、トランスポゾンコンストラクト又はトランスポゼース遺伝子を導入する対象となる細胞は、非ヒト哺乳動物個体に分化し得るポテンシャルをもつ細胞であればよく、そのような細胞としては例えば動物幹細胞又は受精卵がある。本明細書において「動物幹細胞」なる語は、非ヒト哺乳動物個体になり得るこうした細胞を包含し、好ましくはES細胞を利用できる。また、受精卵として核移植された未受精卵を利用できる。ここで用いるES細胞としては、例えばライフテックオリエンタル社より商業的に入手し得るものが挙げられる。また、核移植された未受精卵に関しては、除核した卵母細胞に成熟マウス体細胞由来の核を導入し、これが分化した例が知られている(T.Wakayama et al.;Nature,394:369−374(1998))。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物には、トランスポゾンコンストラクト及びトランスポゼースの一方又は両方を含むfounder(第1世代)だけでなく、該founderを基に確立されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の系統も当然に包含される。更に、上記トランスジェニック非ヒト哺乳動物系統由来の臓器、組織、卵、精子、および受精卵、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の系統から確立される株化細胞、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の系統から作出される非ヒト哺乳動物クローン個体もまた本発明の範疇に含まれる。
本発明のトランスポゾンコンストラクトは、トランスポゾン配列の他に種々の構成要素を組み合わせて構築され、動物幹細胞又は受精卵等に導入することができる。
本発明において「トランスポゾン配列」は、トランスポゼースにより認識され非ヒト哺乳動物細胞内で転位可能な天然または人工トランスポゾンDNA配列を指す。
本発明において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に用いられるトランスポゾン配列及びトランスポゼース遺伝子は、内因性のものでも外来性のものでも制限なく使用できるが、好ましくは外来性のトランスポゾン配列及びトランスポゼース遺伝子を用いることができる。
本発明のトランスポゾンとしては、DNA型のトランスポゾンを用いる。
トランスポゾンには、自らの転位を触媒できる活性な酵素トランスポゼースを内部にコードしている自己完結型と、トランスポゼース活性を欠損した非自己完結型がある。トランスポゾン配列又はトランスポゼース遺伝子を各々有する非ヒト哺乳動物を交配させて、トランスポゾン配列及びトランスポゼース遺伝子を有する非ヒト哺乳動物を得る場合、或いは、トランスポジションがFIXされたトランスポゾン配列を有する(トランスポゼース遺伝子を含まない)非ヒト哺乳動物を得る場合、非自己完結型のトランスポゾンを用いる。トランスポゾン及びトランスポゼースを両方含む非ヒト哺乳動物又はシグニチャー部位を含みトランスポゾン及びトランスポゼース遺伝子を含まない非ヒト哺乳動物を得る場合、自己完結型、非自己完結型の両方のトランスポゾンが利用できる。
自己完結型トランスポゾンは、後述するCre/loxPシステムを用いて、即ちloxP配列をトランスポゼース遺伝子の両側に有する非ヒト哺乳動物とCreを有する非ヒト哺乳動物を交配することによりトランスポゼースを切り出すことで、非自己完結型に変換できる。
更に、トランスポゾンには宿主依存型のものと宿主非依存型のものがあり、これらをいずれも用い得る。一般的には宿主非依存型のものを用い得る。
本発明においては、トランスポゾン及びトランスポゼース遺伝子を含むトランスポゾンシステムよりトランスポゾンのみ及び/又はトランスポゼースのみを切り出して用いるか、又はトランスポゼースを不活性化させて、トランスポゾンを非自己完結型として用い得る。本発明の実施に有用なトランスポゾンシステムは、非ヒト哺乳動物細胞で転位可能な任意の配列を包含するものであり、好ましくは、Tc1/marinerスーパーファミリーのメンバーを用い得る。例として、Tc1、SB、Minos、Txr、Tc3等のTc1トランスポゾンファミリー、Caenorhabditis elegans、Mos1、Hyalophora cecropia等のmarinerトランスポゾンファミリー、Pogo、Tigger、Tc4等のPogoトランスポゾンファミリーが挙げられる(RH Plasterk et al;Trends in genetics,15:No.8:326−332(1999))。最も好ましくは、SB(Sleeping Beauty)トランスポゾンを用い得る。非自己完結型トランスポゾンは、自己完結型トランスポゾンのトランスポゼース遺伝子を除去又は不活性化することにより得ることができる。
一般的なトランスポゾンシステムの入手については、例えばSBトランスポゾンシステムは(Z.Ivics et al.;Cell,91:501−510(2000))、Minosトランスポゾンシステムは(A.G.Klinakis et al.;EMBO Reports 1,5:416−421(2000))等の文献を参照できる。
以下においては、トランスポゾンとして非自己完結型トランスポゾンを用いた例を示すが、非自己完結型トランスポゾン及びトランスポゼースの代わりに、トランスポゼース遺伝子を含む自己完結型トランスポゾンを用いることも可能である。
本発明で用いるトランスポゾンコンストラクトの成分は、限定されるものではないが、トランスポゾン配列の他に、トランスポゾンコンストラクトを構築するために用いるベクター由来の配列(pBluescriptなど);1種以上のマーカー遺伝子(レポーター遺伝子及び選択マーカー遺伝子を含む);シグナル配列(核移行シグナル、膜結合シグナルなどを含む)、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、スプライスアクセプター、スプライスドナー、loxP、FRT、ポリAシグナル、転写停止配列などの遺伝子発現調節配列;のうち1種以上を含み得る。トランスポゾンコンストラクトには、トランスポゾン配列のみから構成されるものも当然に包含される。また、トランスポゾンコンストラクトとして、トランスポゼース遺伝子を含む、自己完結型トランスポゾンに対応するトランスポゾンコンストラクトを用いることもできる。
トランスポゾンコンストラクトにおいて、トランスポゾン配列内には他の構成要素を組み込む必要は必ずしもないが、GFP、イエロー蛍光タンパク質(YFP)などのレポーター遺伝子、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子が挙げられ、これらの遺伝子の5’側にプロモーター、3’側にポリA配列を連結するのが好ましい。
例えば転位の結果トランスポゾン配列が遺伝子のエクソン部分に挿入された場合や、トランスポゾン配列中に遺伝子発現調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスアクセプター部位又はスプライスドナー部位などが挿入されている場合には、トランスポゾン挿入部位における遺伝子の機能が破壊、低下又は活性化される。
トランスポゾン配列は、同一の染色体内で転位することが多い。よって、トランスポゾンコンストラクトにおいて、例えば、loxP配列をトランスポゾン配列の内外に1つずつ導入しておき、トランスポゼースによりトランスポゾン配列を転位させる。次にCreリコンビネースを作用させることで、トランスポゾン配列外側のloxP配列とトランスポゾン内側のloxP配列との間の染色体領域を欠失できる。この領域には、通常は一対存在する遺伝子が1つしか存在しなくなることから、更に変異を導入して劣性の遺伝をスクリーニングすることが容易となる(図6参照)。
本発明のトランスポゼース遺伝子はトランスポゼース遺伝子の他に種々の構成要素を組み合わせたトランスポゼースコンストラクトとして受精卵等の細胞に導入することができる。本発明において「トランスポゼース遺伝子」とは、該遺伝子により発現されたトランスポゼースがトランスポゾン転位活性を有するものを指す。該遺伝子はトランスポゼースを発現できる状態で動物幹細胞、受精卵等に導入されるのが好ましい。
本発明で用いることのできるトランスポゼースコンストラクトの成分は、限定されるものではないが、トランスポゼース遺伝子の他に、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリAシグナル等を含む。トランスポゼース遺伝子の5’側には、プロモーターが好ましく組み込まれるが、トランスポゼース遺伝子の3’側にプロモーターが存在する場合もあり、プロモーターは必須ではない。本発明において、好ましいトランスポゼースコンストラクトは、5’側からプロモーター、トランスポゼース遺伝子、ポリAをこの順に含むものである。
本発明において、「シグニチャー部位」とは、トランスポゾン配列が切り出されて転位した結果として現れる部位を指す。例えば本発明でSBトランスポゾンを用いた場合、シグニチャー部位は、標的配列であるTAの重複の間にトランスポゾン末端配列の3塩基が挿入された「TAcagTA」或いは「TActgTA」という配列を含む(図2d参照)。但し、トランスポゾンが移動してもシグニチャー部位が上記特定の完全な配列を有しない場合もあり、本発明においては、こうした不完全な配列を含む部位もシグニチャー部位と見なす。
請求項28において、「両アレルに変異を導入する」とは、トランスポゾンがゲノムから切り出されゲノム上の異なる箇所へ転位したことによる場合と、シグニチャー部位による場合の両方を指す。
本発明で用いるマーカー遺伝子に包含される選択マーカー遺伝子ないしレポーター遺伝子としては、例えば、抗生物質耐性を付与するNeomycin耐性遺伝子、Puromycin耐性遺伝子、Hygromycin耐性遺伝子、グリーン蛍光蛋白質(GFP)遺伝子、イエロー蛍光蛋白質(YFP)遺伝子、レッド蛍光蛋白質(RFP)遺伝子、ブルー蛍光蛋白質(BFP)遺伝子、シアン蛍光蛋白質(CFP)遺伝子、lacZ遺伝子、luciferase遺伝子、又はChloramphenicol Acetyl Transferase(CAT)遺伝子等があり、目的及び必要に応じて適宜選択し得る。
本発明で用いる用語「プロモーター」は、転写開始点から上流の、そして転写を開始するためのRNAポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与するDNA領域をいう。
本発明において用い得るプロモーターは、非ヒト哺乳動物の細胞又は組織で活性なプロモーターであれば特に限定されない。例として、PGKプロモーター、CAGプロモーター、PolIIプロモーターが挙げられる。
プロモーターの基礎転写活性はエンハンサー配列の存在により増加できる。その機構は明らかにされていないが、ある種の明らかにされたエンハンサー調節配列はプロモーターの近くに存在する場合、プロモーターの転写速度を増加させることが当業者には知られている。
本発明において用い得るエンハンサーは、非ヒト哺乳動物の細胞又は組織で活性なエンハンサーであれば特に限定されない。例として、ヒトサイトメガロウィルス(HCMV)エンハンサー等が目的及び必要に応じて適宜選択し得る。
また、ホルモン或いはテトラサイクリン等の抗生物質に依存して発現誘導性をもつプロモーター或いはエンハンサーをトランスポゼースコンストラクトに用いた場合、ホルモン或いはテトラサイクリン等の抗生物質の投与又は非投与により、トランスポゾンの転位を時期特異的にも組織特異的にも調節することができる。
本発明において用い得るサイレンサーは、非ヒト哺乳動物の細胞又は組織で活性なサイレンサーであれば特に限定されない。本発明の1実施態様においては、トランスポゾン配列内の成分としてサイレンサーを用いることにより、変異の発現を抑制し得る。サイレンサーの例としては、(S.Sawada et al.;Cell,77:917−929(1994))等を参考とし得る。
本発明において用い得るインスレーターは、非ヒト哺乳動物の細胞又は組織で活性の高いインスレーターであれば特に限定されない。本発明の1実施態様においては、トランスポゾン配列内の成分としてインスレーターを用いることにより、トランスポゾン配列挿入部位の周囲の配列等に依存せずにトランスポゾン配列内の遺伝子の発現を行うことができる。インスレーターの例としては、(JH.Chung et al.;Cell,74:505−514(1993))等を参考とし得る。
本発明の1実施態様によれば、転写停止配列を含むトランスポゾン配列を非ヒト哺乳動物に導入し得る。転写停止配列としては、例としてC2 termination signal(R.Ashfield et al.;EMBO J,10:4197−4207(1991))が挙げられる。
本発明において用い得るシグナル配列は、目的とする細胞又は組織で活性の高いシグナル配列であれば特に限定されない。本発明の1実施態様においては、トランスポゾンコンストラクト内の成分としてシグナル配列(例えばトランスメンブレンシグナル)を用いることにより、遺伝子の機能が修飾された細胞において、マーカー(例えばGFP)を目的とする部位(例えば膜表面)に集めることが可能であり、遺伝子機能の分析をより効率の良いものにし得る。
本発明の1実施態様によれば、活性の強い又は弱いスプライスアクセプター部位を含むトランスポゾン配列を非ヒト哺乳動物に導入し得る。スプライスアクセプター部位としては、例えばRNAスプライシングで働くイントロンの3’末端にあり、AG配列を含むヌクレオチド配列が例示される。
本発明の1実施態様によれば、活性の強い又は弱いスプライスドナー部位を含むトランスポゾン配列を非ヒト哺乳動物に導入し得る。スプライスドナー部位としては、例えばRNAスプライシングで働くイントロンの5’末端にあり、GT配列を含むヌクレオチド配列が例示される。スプライスアクセプター及びスプライスドナーの強弱は、例えばスプライシング可能なイントロン配列の長さにより評価することができる。
トランスポゾンの転位はランダムであるが、本発明の1実施態様においては、細胞が重度の成長障害を起こすなど、トランスポゾンの転位に基づく変異が致死的に及ぶことを防ぐために、トランスポゼースコンストラクト内に種々の程度の発現誘導性をもつプロモーター或いはエンハンサーを用いて、転位発現率の調整を行ない得る。このようにすることで、生命に必須の遺伝子の機能を解明することができる。
また、トランスポゾンコンストラクトにおける遺伝子発現調節配列(スプライスアクセプター、スプライスドナー、エンハンサーなど)の作用性の強弱を調整することで、遺伝子機能の破壊の程度を調整し得る。
更に、遺伝子改変をより柔軟かつ精巧に行うために、必須成分としてスプライスアクセプター、スプライスドナー、polyA付加シグナル、プロモーターを含む遺伝子トラップベクターを構築し、本願におけるトランスポゾンコンストラクトとして適用し得る。
1実施例として、該トラップベクターは、トランスポゾン配列間に上流からスプライスアクセプター、IRES(internal ribosome entry site)配列、lacZマーカー、polyA付加シグナル、CAGプロモーター、GFPマーカー、スプライスドナーをこの順で含む(図7参照)。ここでスプライスアクセプター及びスプライスドナーは、内在性の遺伝子をキャッチするために用いられる。IRES配列は、lacZ遺伝子を内在遺伝子とは独立に発現させる配列である。該トラップベクターに含まれる成分の替わりとして、同様の機能をもつ上述の成分を代用し得る。このベクターでは、GFP遺伝子がubiquitousで強力なCAGプロモーターで制御されており、且つ、その下流にスプライスドナーが存在するため、遺伝子がトラップされていれば発光によりこれを検出できる。同時に、3’末端のRNAを用いて3’RACEを行うことにより、トラップされた遺伝子を同定できる。スプライスアクセプターも同時に存在するため、その下流にあるlacZ遺伝子の発現を解析することで、トラップされた遺伝子の発現部位を特定できる。
本発明において、非ヒト哺乳動物になり得る細胞(ES細胞、受精卵等)へのトランスポゾン配列またはトランスポゼース遺伝子導入のために用いる方法としては公知の方法が使用できる。好ましくは、例えばES細胞への導入法としてレトロウィルスベクター又はエレクトロポレーション、受精卵への導入法としてマイクロインジェクションなどが挙げられる。マイクロインジェクション法を用いたトランスジェニック動物作製に関する基本特許として米国特許第4,873,191号(Wagner et al.)が挙げられる。
トランスポゾン配列またはトランスポゼース遺伝子が導入されたES細胞は、非ヒト哺乳動物の胚盤胞へ注入され、さらに偽妊娠の雌非ヒト哺乳動物の子宮へ移植される。例えば非ヒト哺乳動物がマウス又はラットの場合、その後2週間強でキメラマウスが誕生する。また、受精卵を用いる場合には、受精卵の雄性前核へトランスポゾン配列またはトランスポゼース遺伝子を注入し、その注入された受精卵を偽妊娠の雌非ヒト哺乳動物の卵管へ移植する。例えば非ヒト哺乳動物がマウスである場合、その後20日前後でfounderマウスが産まれる。
本発明の方法の特徴
本発明の方法の1実施態様として図3に例示するように、本発明において、「トランスポゼース遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物」と「非自己完結型トランスポゾン含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物」とを交配して、「トランスポゼース遺伝子及びトランスポゾン含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物」を得ることができる。この方法によると、同様の親を交配させることにより、同一遺伝子をもつ仔哺乳動物を新たに得ることができる。この方法によれば、トランスポゾンコンストラクトのみが導入されたことによる哺乳動物における表現型に与える影響をあらかじめ知ることができる。同様に、トランスポゼースコンストラクトのみが導入されたことによる哺乳動物における表現型に与える影響をあらかじめ知ることができる。
或いは、トランスポゼース遺伝子及びトランスポゾンを初めから導入した、交配によらない「トランスポゼース遺伝子及びトランスポゾン含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物」を得ることもできる。この方法によれば親同士を交配する必要がないため、手間や時間、コスト面で効率がよい。
この「トランスポゼース遺伝子及びトランスポゾン含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物」において、トランスポゾンは転位可能な状態で含まれるため染色体上の任意の部位に転位可能であり、この転位により染色体上の任意部位の遺伝子機能を破壊、低下ないし活性化することが可能である。
更に、「トランスポゼース遺伝子及びトランスポゾン配列含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物」と[トランスポゼースを含まない非ヒト哺乳動物」を交配して、「トランスポゾンを有するがトランスポゼース遺伝子を有しない非ヒト哺乳動物」を得ることができる。トランスポゼースがloxPで挟まれている場合、Creを含む非ヒト哺乳動物と交配してもよい。
1実施態様として図3を参照すると、本発明の項2の「ほぼ全細胞に(i)少なくとも1つのトランスポゼース遺伝子及び少なくとも1つの非自己完結型トランスポゾン或いは自己完結型トランスポゾン並びに(ii)少なくとも1つのシグニチャー部位を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物」は、「GFPを任意成分として内部に含むトランスポゾン配列(TP)とトランスポゼース遺伝子(SB)を両方有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物(以下、「TP−SB哺乳動物」ということがある)」に対応し、「GFPを任意成分として内部に含むトランスポゾン配列(TP)を有するがトランスポゼース遺伝子(SB)を有しない非ヒト哺乳動物(以下、「TP哺乳動物」ということがある)」と、「トランスポゼース遺伝子(SB)を有するがトランスポゾン配列を有しない非ヒト哺乳動物(以下、「SB哺乳動物」ということがある)」を交配して得られるものである。
項2の非ヒト哺乳動物はトランスポゾン或いはシグニチャー部位を有する動物幹細胞又は受精卵から誘導されているので、本質的に全ての細胞においてトランスポゼース遺伝子を有するはずであるが、トランスポゾンが切り出される際にシグニチャー部位を残さず且つ転位しないこともあり得るので、「ほぼ全細胞」と表現した。「ほぼ全細胞」はこのような特別な細胞を除く全細胞を意味する。上記非ヒト哺乳動物は、その各細胞においてトランスポゾンがランダムに転位しており、そのため、トランスポゾンにより導入された遺伝子変異に関して個体全体として統一的な変異が見いだされないものである。
一方、項1のトランスジェニック哺乳動物のうち「TP−SB哺乳動物」と「トランスポゼースを含まない非ヒト哺乳動物」を交配して得られるものは、「TP−SB哺乳動物」のシグニチャー配列に基づく遺伝子変異が受精卵の段階で既に存在し、哺乳動物個体のほぼ全細胞で共通のシグニチャー部位を含むものである。項1の「ほぼ全細胞」も、項2と同様な意味である。
本発明においては、所望のトランスジェニック非ヒト哺乳動物をプレスクリーニングし得る。プレスクリーニングの方法としては、例えばgenetrap法を用いることができる(Zambrowicz et al.;Nature,392:608−611(1998);Gossler,A.et al.;Science,244:463−465(1989);Skarnes,W.C.et al.;Genes Dev,6:903−918(1992);Friedrich,G.et al.;Genes Dev,5:1513−1523(1991))。
このように、プレスクリーニングを行うことにより遺伝子機能の解明に有望なトランスジェニック非ヒト哺乳動物を予め選抜し、その後2世代以上の交配或いはその他適宜の手段により、1対の染色体の両遺伝子が変異したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。
遺伝子破壊してその表現型を解析する手法は、遺伝子機能を解明するための有効な手段である。哺乳動物個体、特にマウスで網羅的に遺伝子破壊を起こし表現型を解析するためには、克服しなければいけない大きな問題点が二つある。一番目は、網羅的に遺伝子破壊を起こし表現型を目安に遺伝子機能を探る手法、いわゆるフォワードジェネティックスが整備されていないことである。二番目は、遺伝子が一対(両アレル)あるために片側の遺伝子を破壊しただけでは表現型が現れないことである。両アレル変異を導入するためには、現在のところ片側の遺伝子が破壊された個体同士の交配に依存している。つまり、両アレル変異導入個体を得るための交配に長時間をかける必要性がある。
一番目の問題点は、本発明において新たに開発したトランスポゾンシステムで克服できる。二番目の問題点は、迅速な両アレル変異導入法により克服できる。
二番目の問題点を克服するための具体的手段として、両アレル変異を有する細胞が高頻度に現れるBloom遺伝子ノックアウトマウスを用いることができる(G.Luo et al.;Nature Genetics,26:424−429(2000))。但し、完全なBloom遺伝子ノックアウトマウスは致死性であり(N.Chester et al.;Genes and Dev.,12:3382−3393(1998))、二番目の問題点を克服できない可能性がある。
そこで、本発明者らは、Bloom遺伝子の発現を自由に調節できうる様なマウスをtetOFFのシステム(CT.Bond et al.;Science,289:1942−1946(2000))を用いて作製中である(図8参照)。Bloom遺伝子はDNA helicaseをコードし、その活性が欠損すると、sister chromatid exchange(SCE)が起こり、同時に別のchromatidとの交換も起こる。従って、Bloom遺伝子を欠損させると、4倍体の状態で組換えが起こり、一対の遺伝子が両方とも変異した細胞を、個体の一部で生じさせ得る。
例としてBloom遺伝子のON/OFFをテトラサイクリン依存的に行うようにしておくと(A.Kistner et al.;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:10933−10938(1996))、テトラサイクリンを与える又は与えない時期を調節することで、時期特異的に、より多くの組換えを誘発し、一対の変異遺伝子を有する細胞に導くことができる。従って、交配を繰り返すことなく、一対の遺伝子の変異した非ヒト哺乳動物を得ることができる。時期特異的に変異を導入するには、例えば、ペレット(pellet)を持続的に非ヒト哺乳動物母体に経口投与することで、一対の遺伝子の変異した胎児を得ることができる。
Bloom遺伝子を調節可能に発現させるための一例としてのテトラサイクリンレギュレータブルユニット(tetracyclin regulatable unit)のような手段の導入は、トランスポゾンシステムと組み合わせて行う。例えば、トランスポゾンコンストラクト、トランスポゼース、自己完結型トランスポゾンなどが導入される受精卵等に予めBloom遺伝子を調節可能に発現する手段を導入しておいて交配を行う。得られたトランスポゾン転位部位が導入されたマウスに、Bloom遺伝子の発現を抑制する手段(例えばテトラサイクリンの投与)を実施することで、トランスポゾンシステムにより得られた遺伝子の変異を両アレルに導入し、表現型の確認を迅速に行うことができる。
本発明において選択マーカー遺伝子を用いない場合は、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の細胞からDNAを抽出し、サザンブロット法により転位の有無を調べることで、スクリーニングを行ない得る。
本発明によれば、動物体内で、効率のよいトランスポゾン配列の転位を達成することができる。トランスポゾンを用いた変異の導入法によれば、他の方法に比べ、多種多様な表現型をもつ非ヒト哺乳動物を効率よく且つランダムに得ることが可能となる。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、遺伝子機能研究において、多様な遺伝子変異を導入することにより、複雑な生命現象を解明するためのツールとしてきわめて有用である。
また、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,vol.95:10769−10773,1998に記載されるように、細胞におけるトランスポゾンの発現頻度は細胞あたり最大で3.5×10−5と極めて低い。これに対して、本発明による個体でのトランスポゾン発現率は、例えば実施例においては全マウス中42%、GFP遺伝子陽性マウス中最大80%であり、著しく高いという特徴をもつ。このようにトランスポゾン発現システムが動物またはその組織、器官などの細胞集合体となることでトランスポゾンの転位効率が飛躍的に高まったのは、本発明において初めて見出された知見である。
本発明の1実施態様によれば、遺伝子機能を解明する手段として、ランダムにトランスポゾンコンストラクトを導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物群の中から、マーカー或いは他の手段によりランダムに導入された変異を有する個体を見出すことが可能である。
遺伝子機能を網羅的に解析するには、トランスポゾンがゲノムのより多くの部位へ転位する必要がある。本発明の項2によれば、「ほぼ全細胞に(i)少なくとも1つのトランスポゼース遺伝子及び少なくとも1つの非自己完結型トランスポゾン或いは自己完結型トランスポゾン並びに(ii)少なくとも1つのシグニチャー部位を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物」を得ることができる。例えばマウスを対象とした本願実施例によると、細胞10個当たり1個以上の割合でシグニチャー部位を導入することができ、その結果種々雑多な細胞をモザイク状にもつそのような「種マウス」が得られ、該マウスは1個体当たり約1万以上の転位部位を有するとの結果を得ている。従って、異なる種マウスから変異マウスを作製することにより、約3万以上あるとされる遺伝子のほぼ全てについて網羅的に変異導入することも可能である。このように、変異を有する非ヒト哺乳動物個体を解析する際、本発明では遺伝子変異の発現頻度が極めて高いので、複数の変異をもつ非ヒト哺乳動物が1個体得られれば、多くの変異の機能変化を一度で分析することができ、遺伝子機能の解明を極めて効率的に行うことができる。
また、変異導入の対象としてマウスを例にとると、従来のES細胞への変異導入法であれば、1つの細胞からわずか1匹のトランスジェニックマウスしか得られなかった。一方、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物作製方法によれば、得られた「ほぼ全細胞に少なくとも1つの非自己完結型トランスポゾン及び少なくとも1つのシグニチャー部位からなる群から選ばれる少なくとも1種を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物(例えばマウス)」を種マウスとすると、1匹の個体から10万種類のトランスジェニック個体を産ませることができる(図9参照)。即ち、1匹のマウスから膨大な種類のトランスポジションをもつ子が産まれるとの利点があり、生命現象を解明するために種々雑多な変異個体を得ることができる。
本発明によれば、得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を交配することで、トランスポジションがFIXされた遺伝子解明上有用な非ヒト哺乳動物を得ることが可能である。ここで「トランスポジションがFIXされた」とは、活性なトランスポゼースを有さないためトランスポゾンの転位によるシグニチャー部位数が増加しないことを意味する。具体的には、少なくとも1つのシグニチャー部位を有しトランスポゾンが存在するがトランスポゼースが存在しない又は不活性である場合、少なくとも1つのシグニチャー部位を有するがトランスポゾンが存在しない場合のいずれかを指す。
このようなトランスジェニック哺乳動物個体が得られれば、1個体を調べることで、対応する1種の遺伝子機能をシンプルに解析することができる。また、特定の変異を有する個体について、その成長過程に伴い該変異の影響を調べることができる。また、こうした非ヒト哺乳動物の中で何らかの機能を欠損したものについて、例えばスプライスアクセプターを含むトランスポゾン配列を用い、トランスポゼースをその受精卵に加えるか或いはトランスポゼースを有する非ヒト哺乳動物と交配することで該トランスポゾン配列を除去し、その結果機能が回復するかどうかを見ることにより、特定の機能に関与する原因遺伝子を確認することができる。
本発明では、トランスポゾンにより変異を導入しているため、突然変異誘発物質などを用いて変異を導入するのと比較して、どこに変異が導入されたのかをシグニチャー配列或いはトランスポゾンコンストラクト由来の配列を利用してPCR等の適当な方法により、容易に検出することができる。
また、本発明の実施態様においては、培養細胞でなく個体の非ヒト哺乳動物で遺伝子変異を導入することにより、個体レベルでの遺伝子機能の解析が可能である。また、非ヒト哺乳動物個体を生存させたままの状態では操作が困難な組織に対しても、外部から手を加えることなしに、個体体内で遺伝子変異を導入し得る。
さらに、同じ組織内であっても転位部位が異なり、従って遺伝的に異なる一群の細胞が存在するので、血液系、免疫系などの任意の組織・臓器・器官で、増殖、分化等における細胞系譜を系統的に調べることができる。
本願発明の第2の態様によれば、本発明の新規な非ヒト哺乳動物、特にマウスは、遺伝子機能解明のための便利なモデルシステムを提供する。本発明のこの実施態様は、生きた動物モデルにおいて遺伝性疾患の研究のための疾患モデルシステムを提供し得る。該システムにおいて、動物モデルに導入される疾患遺伝子としては、ヒト疾患原因遺伝子、または非ヒト哺乳動物におけるその相同遺伝子がcDNAの遺伝子全長、cDNAの遺伝子断片、ゲノムDNAの遺伝子全長、或いはゲノムDNAの遺伝子断片であるものが挙げられる。疾患原因遺伝子は、非ヒト哺乳動物に導入して、得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物をヒト疾患モデル動物として研究に供し得るものであればいずれでも良く、特に限定されないが、ヒト疾患原因遺伝子であるのが好適である。
本発明の1実施態様によれば、種々のエンハンサーを含むトランスポゾンがガン原遺伝子の近傍に転位した場合、これらを包含する細胞においては結果的にガンが発現するため、これによりガン原遺伝子をスクリーニングできる。特に、トランスポゾン配列とトランスポゼース遺伝子を両方含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いた場合、ガン原遺伝子の発現はクローナルであるため、ガンは組織だけでなく全体に転移し得る。また同時に、各動物細胞内で転位による遺伝子機能の低下、破壊ないし活性化がランダムに進行しているので、複数のガンが同一個体内で発生することも予測され、ガンに関与する遺伝子機能の解明を効率よく進めることができる。更に、同一個体内で複数のガンを認めた場合、各々のガン細胞においてトランスポゾンベクターの挿入部位が同じかどうかを調べることによって、ガン細胞が同一の細胞に由来しているかどうかを調べることができ、ガンの転移のメカニズム研究に寄与し得る。
本願発明の第3の態様として、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を臓器提供用ドナーとして使用することができる。例えば、ヒトへの異種間臓器移植のドナーとして考えられる臓器として、具体的には神経細胞、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、角膜、皮膚などが挙げられる。この場合、導入される遺伝子は、例えば異種間での臓器移植において、拒絶反応を低減し得る機能を有する遺伝子或いは生着率の上昇を期待し得る機能を有する遺伝子が好ましい。
以下、本発明で用いる発現ベクターの作製方法を具体例を挙げて説明する。なお、この具体例で用いられる出発プラスミド、プロモーター等の構成要素を同等のもので置き換えて実施することは当業者にとって容易である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の内容を実施例を用いてより具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
方法
・サザンブロット分析
ゲノムDNAは、制限酵素で消化され、0.7%アガロースゲルで分画し、Hybond−N+ナイロンメンブレン(Amersham)に移した。EGFPを含むpCX−EGFP(Okabe M.et al.FEBS Lett 407,313−9(1997))の0.7kb EcoRI断片をトランスポゾン特異的バンドを検出するためのプローブとして使用した。ハイブリダイゼーション及び洗浄を標準的な方法(J.Sambrook st al.;Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY)(1989))により行った。トランスジェニックマウスのトランスポゾンコピー数を評価するために、テイルDNAのバンド強度をBio imaging system BAS2500(Fujifilm)を用いてトランスポゾンの単一コピーを含むES細胞クローンに由来するゲノムDNAのものと比較した。
・PCR分析
トランスポゾンの切り出しは、以下のプライマーセットを用いたPCRにより検出した:TgTP−2L,5’−ACA CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT ACG−3’及びTgTP−1U,5’−GAC CGC TTC CTC GTG CTT TAC GGT ATC−3’。各プライマーは、それぞれpTransCX−GFP:NeoのIR/DR(R)及びIR/DR(L)の外側に位置する。PCRは、HotStarTaq system(Qiagen)を用い、以下の条件下に行った:95℃15分、50サイクル(94℃1分、59℃1分、72℃1分)、次いで最終工程で72℃10分の1サイクル。
トランスジェニックマウスの遺伝子型は、以下のプライマー対を用いて決定した:GFP遺伝子に関して(EGFP−1U,5’−CAC CCT CGT GAC CAC CCT GAC CTA−3’及びEGFP−1L,5’−CTT GAT GCC GTT CTT CTG CTT GTC G−3’)及びSBトランスジーンに関して(SB−2U,5’−TCC TAG AGA TGA ACG TAC TTT GGT−3’およびSB−1L,5’−ATC CAC ATA ATT TTC CTT CCT CAT G−3’)。PCR条件は、アニーリング温度を55℃とし、サイクル数を30とした以外は、上記と同じであった。得られたPCR産物は、GFP遺伝子に関し313bp及びSBトランスジーンに関し466bpであった。トランスポゾンの新規組込部位でのフランキング配列は、既述のようにPCR増幅した(Ivics,Z.et al.,Cell 91,501−10(1997))。PCR産物はダイターミネーター(dye terminator)及びABI373A DNAシークエンサー(Applied Biosystems)を用いて直接配列決定した。
・GFP発現の測定
出生直後のマウスの尾の先端を切除し、直ちにGFP−specified filter(オリンパス、東京、日本)及びオリンパス蛍光倒立顕微鏡を用いてx40の倍率で蛍光強度を観察する。尾全体にGFP発現を有するマウスをポジティブと判定した。
実施例1プラスミド作製とトランスジェニックマウス樹立
(1)SBトランスジェニックマウスの樹立
a)SBトランスジェニックマウスの樹立のためのpCX−SBコンストラクトの作製(図1b・下)
pSB10プラスミド(Z.Ivics et al.;Cell,91:501−510(1997))からSBを制限酵素SacIIで切断後、平滑化した。そのSB−DNA断片をpCX−EGFPプラスミド(M.Okabe et al.;FEBS Letter,407:313−319(1997))の平滑化されたEcoRIサイトにEGFP断片と入れ換える状態で挿入した後、SBの向きを確認した。
b)pCX−SBコンストラクトからSBトランスジェニックマウスの樹立
プロモーター・SB・PolyA付加シグナルを含むユニットDNA断片をpCX−SBコンストラクトから制限酵素SalI−BamHIで切断し、その後電気泳動して精製する。このDNA断片約5fgをB6C3F2マウス受精卵に移入したのち偽妊娠マウスの卵管に移植することにより、その後20日前後でSBトランスジェニックマウスを樹立する(図3右上・「SB」マウス)。
得られたSBトランスジェニックマウス(Founder)の系統を樹立するために、野生型マウスと交配したが、SBトランスポゼース遺伝子を含有するマウスを得るには多数の交配を要した。また、2匹のFounderマウスのうち、系統を樹立できたのは一方のみであった。
(2)トランスポゾン配列含有トランスジェニックマウスの樹立
a)トランスポゾンコンストラクトpTransCX−GFP:Neoの作製(図1b・上)
pTransCX−GFPは多段階により作製した。pT/Neoプラスミド(Z.Ivics et al;Cell 91:501−510,1997)から383塩基対のIR/DR(R)断片を、BamHIで切断平滑化、さらにEcoRIで切断後単離し、pBluescriptII(Strategene社)のHincII・EcoRIサイトにクローニングしてpBS−IR/DR(R)を得た。同様にpT/Neoプラスミドから363塩基対のIR/DR(L)断片を、SacIで切断、平滑化、さらにBamHIで切断後単離し、pBS−IR/DR(R)のXbaI−BamHIサイトにXbaI部位を平滑化後クローニングしてpBS−IR/DR(R,L)を得た。マウスPiga遺伝子(K.Kawagoe et al.;Genomics,23:566−574(1994))のエクソン2及びイントロン2を含む約1.3k塩基対のSpeI−SacI断片をpBluescriptIIのSpeI−SacIサイトにクローニングしてpPigaを得、CAGプロモーターを含む約1.7k塩基対のSalI−EcoRI断片をpCX−EGFPプラスミドから切り出し、pPigaのSalI−EcoRIサイトにクローニングしてpCX−Pigaを得た。pCX−EGFPプラスミドからEcoRIで切り出したEGFP断片をpCX−PigaのEcoRIサイトにクローニングしてpCX−EGFP−Pigaを得た。CAGプロモーターを含むpCX−EGFP−PigaをSalI−SacIで切り出し、その断端を平滑化する。そしてその断片を、EcoRI及びBamHI部位の両方を平滑化した後、IR/DR(R)とIR−DR(L)の間に位置するpBS−IR/DR(R,L)のEcoRI−BamHI部位にクローニングしてpTransCX−GFPを得た。最後に2つのloxP部位ではさまれたPGK−Neoカセット(Y.Nakano et al.;Eur.J.of Nuerosci.,11:2577−2581(1999))の2.3kb NotI断片をpTransCX−GFPのユニークなNotIサイトにクローニングしてpTransCX−GFP:Neoを作製した。なお、図面において、ポリAシグナルを「pA」と略す。ロングバージョンの断片をマイクロインジェクションすることにより、トランスジェニックマウスを作製した。ロングバージョン断片は、PGK−Neoカセット及びpBluescriptIIベクター骨格を有する全長のSacI断片である。
b)pTransCX−GFP:Neoコンストラクトからのトランスポゾントランスジェニックマウスの樹立
一カ所しか存在しないSacIでpTransCX−GFP:Neoを直線化し、このDNA断片約5fgをB6C3F2マウス受精卵に移入したのち偽妊娠マウスの卵管に移植することにより、その後20日前後でトランスポゾン配列含有トランスジェニックマウスを樹立する(図3左上・「GFP」マウス)。
得られたトランスポゾン配列含有マウス(Founder)は、SBトランスジェニックマウスと異なり、野生型マウスと1回交配しただけで、トランスポゾン配列が1/2の確率で発現するマウスを得ることができた。また、得られたマウスは、トランスポゾン配列内にGFP遺伝子を有しているにもかかわらず、グリーンの蛍光を発しなかった。
(3)トランスジェニックマウスのスクリーニング(図3)
a)pTransCX−GFP:Neo及びpCX−SBを両方有するマウス (1)のSBトランスジェニックマウスと(2)のトランスポゾン配列含有トランスジェニックマウスを交配する。得られた出生直後のマウスの尾から採取したDNAをPCR法により分析し、pTransCX−GFP:Neo及びpCX−SBを両方有するトランスジェニックマウスを選抜する(図3「SB−GFP」マウス)。pTransCX−GFP:Neo及びpCX−SBを両方有するトランスジェニックマウスは、グリーンの蛍光を発しなかった。
b)トランスポゼースによりトランスポゾン配列が転位しグリーンの蛍光を発するマウス
上記a)のpTransCX−GFP:Neo及びpCX−SBを両方有するトランスジェニックマウス(B系統;雄及び雌、A系統;雄のみ)と野生型ICRマウスをそれぞれ交配する。得られた出生直後のマウスの尾を切除し、GFP−specified filter(オリンパス、東京、日本)及びオリンパス蛍光倒立顕微鏡を用いて40倍で蛍光強度を観察する。GFPが発現しグリーン蛍光に光る個体を、トランスポゼースによりトランスポゾン配列が転位したマウスとして選抜する(図3写真「Mice with fluorescence」)。結果を表1に示す。
【表1】
表1中、GFPシグナル陽性マウスの数をGFP遺伝子陽性マウスの数で割って、GFP活性型マウスの頻度を算出した。GFP活性型マウスの頻度は、トランスポゾンシステムによりトランスポゾンが移動してGFP遺伝子が活性化し、グリーン蛍光を呈する率を示している。
B系統オスについて得られた36個体のGFP遺伝子陽性マウス中、23匹がグリーンの蛍光を発し、A系統オスについて得られた19個体のGFP遺伝子陽性マウス中、10匹がグリーンの蛍光を発していた。また、得られた個体についてDNAをサザンブロット法により解析すると、転位部位に特異的と考えられるバンドを認めた(図4bの1−5、1−8、1−9、2−14)。更に、トランスポゾン配列の周辺領域をPCR法で増幅して解析すると、転位部位に特異的なTA−トランスポゾン配列−TAの配列と、pTransCX−GFP:Neoに存在しない転位部位のゲノム由来の配列が同定できた(図5の1−8,1−9)。
また、グリーンの蛍光を発していない(GFP遺伝子が不活性の)マウスについても転位部位の有無を調べたところ、サザンブロッティングによる実験結果から、転位部位を有しないマウスも存在するが(図4bの1−1)、転位部位を複数有するマウスも存在することが確認された(図4bの3−8)。従って、GFP活性型マウスの頻度を示す上記表1の結果は過小評価であることが判明した。
産業上の利用の可能性
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物又はfounder由来の卵、精子、もしくは受精卵などを用いれば、その系統、更には株化細胞を確立することができ、病態解析及び薬剤スクリーニングなどの研究上有用なツールとなり得る。即ち、用いる非ヒト哺乳動物の病原性に関わる蛋白質をコードする遺伝子に、効率よくランダムに変異を導入できるため、遺伝子の機能が同定されれば、該遺伝子或いは該遺伝子がコードする蛋白質を用いて、遺伝子発現やタンパク質機能を調節できる治療薬をスクリーニングすることができる。所望の系統を確立するためにクローン個体を作成した場合には、一層効率的な研究が期待できる。
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物からは、特定の遺伝子機能が喪失、低下ないし活性化しており、表現型が変化した疾患動物モデルを容易に得ることができ、医学、薬学などの分野における実験動物として有用である。
更に、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、神経細胞、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、角膜、皮膚などの臓器提供用ドナーとしても有用であり、実際的には、ヒトと類似した大きさの臓器を持つブタなどの哺乳動物が、ヒトの臓器移植の際に極めて役立つと考えられる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1aは、一実施態様としてグリーン蛍光タンパク質(green fluorescence protein;GFP)遺伝子とトランスポゾン及びSleeping Beautyトランスポゼースを組み合わせた、トランスポゾンの転位検出システムを示す説明図である。
図1aの左に、両端をトランスポゾンの末端反復配列(「GFP」両側の矢印で示される)で挟まれたGFP遺伝子(「GFP」と示される)が複数つながった、GFP発現ユニットを示す。この状態では、トランスポゾン配列の両側に存在する配列の影響によりGFP遺伝子は不活性であるが、「SB」と示すSBトランスポゼースの作用によりトランスポゾン配列が転位すると、トランスポゾン配列両側の配列が切り離され、これによってGFP遺伝子が発現し、グリーン蛍光を呈する(図1aの右側)。
図1bは、実施例1で得られたトランスポゾンコンストラクトpTransCX−GFP:Neo(上)及びトランスポゼースコンストラクトpCX−SB(下)の概略的説明図である。
図1bにおいて、トランスポゾンコンストラクトpTransCX−GFP:Neoは、Creタンパク質を利用して染色体の組換えを誘発するためのloxP配列、マーカー遺伝子neo発現を制御するPGKプロモーター(PGK)、細胞レベルでトランスポゾン配列を導入する際の薬剤耐性マーカー、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo)、IR配列(Inverted Repeat:IR)の間に直列反復配列(Direct Repeat:DR)を含むSBトランスポゾンの末端反復配列(IR/DRs:逆向きの2つの太い矢印)、GFP遺伝子発現を制御するCAGプロモーター(CAG)、GFP遺伝子、GFP遺伝子安定発現のためのPigaジーンフラグメント由来PolyA付加シグナル(pA)、及びプラスミド配列pBluescriptを含む。
なお、本発明者は、図1bにおいて示されるKpnIで消化された4.5kbの短い配列をマウスの受精卵に導入した場合、ゲノムへの挿入部位に関わらずグリーンの蛍光を有するマウスが得られることを確認した。
トランスポゼースコンストラクトpCX−SBは、SBトランスポゼース発現ベクターであり、SBトランスポゼース遺伝子発現のためのCAGプロモーター(CAG)、SBトランスポゼース遺伝子(SB)、SBトランスポゼース遺伝子安定発現のためのPolyA付加シグナル(pA)を含む。
図1cは、GFPプローブを用いたサザンブロッティングによるトランスポゾンコピー数の分析結果を示す図である。
図1cの結果より、トランスポゾンコンストラクトpTransCX−GFP:Neoをマイクロインジェクションで受精卵に導入したトランスジェニックマウス(lTRA−GFP)には、約20コピーのpTransCX−GFP:Neoが導入されていることが明らかになった。なお、図1c中、4.5kbのバンドはトランスジェニックマウスのpTransCX−GFP:Neoに由来し、3.5kbのバンドはGFPを1コピーのみ有する細胞(ES/GFP)の5μgのDNAに由来する。
図2aは、pTransCX−GFP:Neo及びpCX−SBの両方を有するトランスジェニックマウスにおける、トランスポゾン切除前後を示す説明図である。トランスポゾンの切除前には、PCRプライマー同士は4.8kb離れておりPCR許容範囲を超えている。トランスポゾンの切除が起こると、プライマー同士が近づきPCRで増幅可能になる。
図2bは、pTransCX−GFP:Neo及びpCX−SBの両方又はいずれか一方を有するトランスジェニックマウスDNAについての、トランスポゾン切除の有無を示すPCR分析結果である。図中の+、−は、サンプルコンストラクト内のSBトランスポゼース遺伝子又はGFP遺伝子の有(+)無(−)を示す。
pTransCX−GFP:Neoのみを有するマウス(GFP+SB−)では358bpのバンドは確認されず、pTransCX−GFP:Neo及びpCX−SBの両方を有するマウスサンプル(GFP+SB+)についてはトランスポゾン切除後(図2a下)の358bpDNA断片のバンドが現れていることから、トランスポゾンの切除はSBトランスポゼースにより媒介されることが示される。
図2cは、pTransCX−GFP:Neo及びpCX−SBの両方を有するマウスサンプルについて、尾(tail)及び血液(blood)由来DNAを繰返し10倍希釈してPCRを行い、トランスポゾン配列の切除の頻度を調べた結果である。
図2cのバンドはトランスポゾン配列の切除に特異的であり、該マウスサンプルの細胞合計数のうち尾においては少なくとも10%以上、血液においては少なくとも1%以上と、極めて高頻度でトランスポゾン配列の切除が起こることを示唆する。
図2dは、トランスポゾン転位後に残る、標的配列TAに3塩基が挟まれたシグニチャー配列(TAcagTA又はTActgTA)を示す。
図3は、トランスジェニックマウスの作製フローの1例を示す概略図である。それぞれの作製方法例を実施例1に示す。
図の左上から、「GFP」はSBトランスポゾンコンストラクト(実施例1ではpTransCX−GFP:Neo)を有するトランスジェニックマウス、「SB」はSBトランスポゼース遺伝子(実施例1ではpCX−SB)を有するトランスジェニックマウス、「SB−GFP」マウスはトランスポゾン配列及びトランスポゼース遺伝子の両方を有するトランスジェニックマウス、wtは野生型マウスを示す。GFPマウス及びSB−GFPマウスは、グリーン蛍光を呈さない。写真はトランスポゾンが転位してGFP遺伝子が発現し、グリーン蛍光を呈するトランスジェニックマウスを示す。
図4aは、転位前組込部位(Parental integration site)及び新規組込部位(Novel integration site)の制限地図である。
トランスポゾンコンストラクト(pTransCX−GFP:Neo)が最初に挿入された部位を転位前組込部位(Parental integration site)、また、トランスポゼースの作用により転位したトランスポゾン配列の別の挿入部位を新規組込部位(Novel integration site)として示す。AseI及びKpnI両方の消化により、最初の挿入部位では4kbのフラグメントを得られ、次からの新たな挿入部位では4kbより大きなバンドを得る。
図4bは、サザンブロットハイブリダイゼーションによる新規組込部位の検出結果を示す。
AseI及びKpnIにより消化されたマウスの尾DNAについて、GFPプローブを用いて分析する。トランスポゾン及びトランスポゼースの両方を有するトランスジェニックマウス(GFP+SB+)、トランスポゾンのみを有するマウス(GFP+SB−)、GFP+SB+マウスと野生型マウスを交配した子孫であるGFPの蛍光を発したマウス4個体(1−5,1−8,1−9,2−14)及びGFPの蛍光を発しないマウス2個体(1−1,3−8)のDNAをサンプルとして用いる。
GFPシグナル(グリーン蛍光)の有無を図の下部に+、−で示す。図中矢印で示した4kbより大きなバンドは、トランスポゾン転位部位に由来すると考えられる。4kbの強いバンドは、最初にトランスポゾン配列が複数組込まれた部位に対応する。GFP蛍光陽性マウスでは、全てに4kbより大きなバンドが存在し、転位が起こったことがわかる。各バンドのサイズが異なっていることから、転位は異なる染色体部位で起こったことがわかる。
図5は、転位前(vector)及び転移後新規組込部位(1−8,1−9)の周辺領域の塩基配列、及び転位の標的部位の塩基配列を示す。トランスポゾン配列の両端フランキング配列であり、標的部位に位置するジヌクレオチドTAを太字で示す。
図6は、本発明の1実施例としてのSBトランスポゾン及びCre/loxPシステムを用いた一連の染色体欠失を示す。図中A、B、C、D、Eは、染色体上の領域を表わす。
loxP配列をトランスポゾン配列(逆方向の矢印で示される)の内外に1つずつ導入しておき、トランスポゼース(SBと示される)によりトランスポゾン配列を転位させる。次にCreリコンビネース(Creと示される)を作用させることで、トランスポゾン配列外側のloxP配列(図中左側のloxP)とトランスポゾン内側のloxP配列(図中右側のloxP)との間の染色体領域を欠失できる。図中、上段の配列においては領域Bが、中段の配列においては領域B及びCが、下段の配列においては領域B、C及びDが欠失される。
図7は、逆方向の矢印(IR/DR−L及び−R)で示すトランスポゾン配列間に上流からスプライスアクセプター、IRES(internal ribosome entry site)配列、lacZマーカー、polyA付加シグナル(pA)、CAGプロモーター(P)、GFPマーカー、スプライスドナーをこの順で含む遺伝子トラップベクターを示す。
図8aおよび図8bは、非ヒト哺乳動物においてBloom遺伝子発現のON/OFFをテトラサイクリン依存的に調節するシステムの具体例を示す。
図8aは、Bloom genomeへtargeting vectorを挿入してrecombinant(組換え体)を取得する手順を示す。図中に示す[(tTA−SV40polyA)−(LoxP−TKNEOpolyA−LoxP)−(hGHpolyA−teto)]のコンストラクトをtetracyclin regulatable unitとしてBloom genomeに挿入し、テトラサイクリン依存的に転写活性を調節され得る組換え体Bloom genomeを得る。
図8bは、該組換え体においてテトラサイクリン依存的に転写がON/OFFされるしくみを示す。図中1のテトラサイクリン非存在下では、tetracyclin regulatable unitにおいて楕円で示したタンパクが合成され、これが該unit下流に結合して転写反応が進行する。一方、図中2のテトラサイクリン添加時には、該タンパクのunit下流への結合をテトラサイクリンが阻害するため、Bloom遺伝子の転写が阻害される。
図9は、GFP陽性トランスジェニックマウスにおけるトランスポゾンの転位頻度を示す。
本発明の実施例で作製されたGFPシグナル陽性マウス(トランスポゼースを有さずトランスポジションがFIXされたマウス)について、トランスポゾン配列挿入部位のフランキング配列をligation−mediated PCRで同定する。その後、挿入部位に特異的なプライマーでnested PCRを行うと、この挿入部位に特異的なバンドが増幅される(図上)。
上記マウス由来のゲノムDNAを薄めると、0.15−1.5個の細胞に相当する1−10pgのtemplate DNAにおいてもバンドが増幅された(図右下)ことから、挿入部位を含むDNAが1分子のみ存在しても、検出できると考えられる。
上記マウスの親であるGFP+SB+マウスのkidney(腎臓)、spleen(脾臓)、liver(肝臓)、tail(尾)、及びtestis(精巣)由来のDNAをtemplateにしてPCRを行う。0.1μgのtestis DNAからはバンドが検出されなかったが、1μgのtestis DNAからはバンドが増幅された(図左下)。
0.1μgのDNAは1.5×104のdiploid cellに、1μgのDNAは1.5×105のdiploid cellに相当する。PCRの検出感度を考慮すると、上記マウス個体において、トランスポゾン挿入部位を有する細胞は約10万個の細胞に1つと考えられる。Testisでは1細胞当たり平均して約1つの割合でトランスポゾンが転位していることが既に分かっていることから、トランスポゾンの挿入部位は約10万種類存在すると推定される。即ち、1匹の個体からおよそ10万種類の挿入部位が見出され得ることが示される。
Claims (28)
- ほぼ全細胞に少なくとも1つの非自己完結型トランスポゾン及び少なくとも1つのシグニチャー部位からなる群から選ばれる少なくとも1種を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- ほぼ全細胞に(i)少なくとも1つのトランスポゼース遺伝子及び少なくとも1つの非自己完結型トランスポゾン或いは自己完結型トランスポゾン並びに(ii)少なくとも1つのシグニチャー部位を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- トランスポゼースを発現する形態でトランスポゼース遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記非自己完結型トランスポゾン内に少なくとも1つのマーカー遺伝子及び少なくとも1つの遺伝子発現調節配列からなる群から選ばれる少なくとも1種を有する、請求項1又は2に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記マーカー遺伝子がグリーン蛍光蛋白質(GFP)遺伝子、イエロー蛍光蛋白質(YFP)遺伝子、レッド蛍光蛋白質(RFP)遺伝子、ブルー蛍光蛋白質(BFP)遺伝子、シアン蛍光蛋白質(CFP)遺伝子、lacZ遺伝子、luciferase遺伝子、又はChloramphenicol Acetyl Transferase(CAT)遺伝子である請求項4に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記遺伝子発現調節配列が、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー、スプライスアクセプター部位又はスプライスドナー部位からなる群から選ばれる少なくとも1種である請求項4に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 少なくともいずれかの組織中で、シグニチャー部位の合計数が、細胞の合計数の0.1%以上、好ましくは1%以上、より好ましくは10%以上である、請求項2に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記非ヒト哺乳動物がマウス又はラットである、請求項1〜3のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 動物幹細胞又は受精卵に非自己完結型トランスポゾンを導入し、該動物幹細胞又は該受精卵から非自己完結型トランスポゾン含有非ヒト哺乳動物を得ることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
- 動物幹細胞又は受精卵にトランスポゼース遺伝子を導入し、該動物幹細胞又は該受精卵からトランスポゼース含有非ヒト哺乳動物を得ることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
- 非自己完結型トランスポゾン含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物とトランスポゼース遺伝子含有トランスジェニック非ヒト哺乳動物を交配することを特徴とする、非自己完結型トランスポゾンおよびトランスポゼース遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
- 請求項11の方法で得ることができる、請求項2に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 非自己完結型トランスポゾンおよびトランスポゼース遺伝子を有し、前記非自己完結型トランスポゾンを転位可能な状態で含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物とトランスポゼース遺伝子を含まない非ヒト哺乳動物とを交配することを特徴とする、非自己完結型トランスポゾン又はシグニチャー部位を含みトランスポジションがFIXされたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
- 請求項13の方法で得ることができる、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- (1)動物幹細胞又は受精卵に非自己完結型トランスポゾンを導入して得られた非自己完結型トランスポゾン含有非ヒト哺乳動物と、
(2)動物幹細胞又は受精卵にトランスポゼース遺伝子を導入して得られたトランスポゼース含有非ヒト哺乳動物
とを交配することを特徴とする、非自己完結型トランスポゾンおよびトランスポゼース遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。 - 請求項15の方法で得ることができる、請求項2に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記マーカー遺伝子がグリーン蛍光蛋白質(GFP)遺伝子、イエロー蛍光蛋白質(YFP)遺伝子、レッド蛍光蛋白質(RFP)遺伝子、ブルー蛍光蛋白質(BFP)遺伝子、シアン蛍光蛋白質(CFP)遺伝子、lacZ遺伝子、luciferase遺伝子、又はChloramphenicol Acetyl Transferase(CAT)遺伝子である請求項16に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記遺伝子発現調節配列が、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー、スプライスアクセプター部位又はスプライスドナー部位からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項16に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 少なくともいずれかの組織中で、シグニチャー部位の合計数が、細胞の合計数の0.1%以上、好ましくは1%以上、より好ましくは10%以上である、請求項16に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記非ヒト哺乳動物がマウス又はラットである、請求項16に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- A)(1)動物幹細胞又は受精卵に非自己完結型トランスポゾンを導入して得られた非自己完結型トランスポゾン含有非ヒト哺乳動物と、
(2)動物幹細胞又は受精卵にトランスポゼース遺伝子を導入して得られたトランスポゼース含有非ヒト哺乳動物とを交配させる工程、
B)工程A)で得られた非自己完結型トランスポゾンおよびトランスポゼース遺伝子を有し前記非自己完結型トランスポゾンを転位可能な状態で含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物と、トランスポゼース遺伝子を含まない非ヒト哺乳動物とを交配する工程
を含むことを特徴とする、非自己完結型トランスポゾン又はシグニチャー部位を含みトランスポジションがFIXされたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。 - 請求項21の方法で得ることができる、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記マーカー遺伝子がグリーン蛍光蛋白質(GFP)遺伝子、イエロー蛍光蛋白質(YFP)遺伝子、レッド蛍光蛋白質(RFP)遺伝子、ブルー蛍光蛋白質(BFP)遺伝子、シアン蛍光蛋白質(CFP)遺伝子、lacZ遺伝子、luciferase遺伝子、又はChloramphenicol Acetyl Transferase(CAT)遺伝子である請求項22に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記遺伝子発現調節配列が、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー、スプライスアクセプター部位又はスプライスドナー部位からなる群から選ばれる少なくとも1種である、請求項22に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記非ヒト哺乳動物がマウス又はラットである、請求項21に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 請求項14に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の疾患に関連する表現型を調べて疾患又は病的状態を有する非ヒト哺乳動物を選抜することを特徴とする、非ヒト哺乳動物疾患モデルの作製方法。
- 請求項1、2、4〜8、12、14、16〜20、22〜25及び28のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の表現型変化、並びに非自己完結型トランスポゾン又は自己完結型トランスポゾンの挿入位置及び/又はシグニチャー部位を調べることを特徴とする遺伝子機能の解明方法。
- Bloom遺伝子の発現効率を調節する手段とトランスポゾンシステムとを組み合わせ、両アレルに変異を導入することを特徴とする、表現型が変化したトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
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