WO2010047423A1 - 変異遺伝子導入方法、変異導入遺伝子、変異導入カセットならびに変異導入ベクターおよびノックイン非ヒト哺乳動物 - Google Patents

変異遺伝子導入方法、変異導入遺伝子、変異導入カセットならびに変異導入ベクターおよびノックイン非ヒト哺乳動物 Download PDF

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mutant
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伸一 廣瀬
正伸 弟子丸
喜美 荒木
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Definitions

  • the present invention relates to a mutant gene introduction method, a mutation introduction gene, a mutation introduction cassette, a mutation introduction vector, and a knock-in non-human mammal. More specifically, the present invention relates to a mutation gene introduction method, a mutation introduction gene, a production method thereof, and a mutation introduction cassette capable of introducing a desired mutation gene DNA into a target gene simply and quickly with high probability. And a knock-in non-human mammal having a mutagenesis vector and a mutagenesis gene.
  • Known genetically modified model animals include, for example, knockout animals such as knockout mice lacking genes such as metabolic enzymes and receptors, and knockin animals in which a human foreign gene is introduced into an endogenous gene of a laboratory animal such as a mouse. It has been.
  • knockout animals such as knockout mice lacking genes such as metabolic enzymes and receptors
  • knockin animals in which a human foreign gene is introduced into an endogenous gene of a laboratory animal such as a mouse. It has been.
  • genetically modified model animals in which genes related to various diseases are modified have been created.
  • a gene knockout animal is a model animal created so that all or part of its original specific gene has been altered, such as disruption, deletion, or substitution, so that the expression of that gene is suppressed and its function cannot be exerted. .
  • a knockout animal is a very useful experiment for investigating the function of its gene and gene product, or for evaluating its importance, because the original specific gene is modified and the protein corresponding to the mutant gene is not produced. It is a system. However, most of general human genetic diseases are caused not by deletion of the entire gene but by amino acid substitution by point mutation and the like, and knockout animals are not suitable as a model of such gene abnormality.
  • transgenic animals In general transgenic animals, the mutated gene is expressed under the control of a core promoter sequence of several kb, and because the site on the chromosome where the mutated gene is inserted cannot be predicted, the transferred gene is not expressed as expected. Occasionally, this has become a major obstacle to the analysis of gene functions and pathological model development by such transgenic animals. Even if there is a problem in animal experiments using transgenic animals, transgenic animals can be generated in a short period of time and the experimental results can be evaluated quickly. Yes.
  • the normal gene inherent in the animal is replaced with a foreign mutant gene, so that the mutant protein derived from the foreign gene is affected by the normal protein inherent in the animal. It can be said that it is hard to receive. That is, the experimental results for the foreign gene are considered to be derived from the original function of the foreign gene.
  • knock-in animals are created from ES cells using gene targeting, foreign mutant genes can be expressed accurately with endogenous promoter activity, so that the desired animal model can be reliably created. There is also an advantage of being able to.
  • knock-in animals are more advantageous than knock-out animals in order to more accurately mimic the pathology of genetic diseases and to correctly evaluate the effects of mutations.
  • the method for producing the knock-in animal is complicated, and the production requires a long period of 1.5 to 2 years and a large cost.
  • knock-in animals have been created by homologous recombination of a target gene with a foreign gene DNA by homologous recombination between the target gene and the target recombination vector.
  • this method for producing a knock-in animal has a major drawback that the probability of homologous recombination of a desired foreign gene DNA into the gene DNA of the target gene by this homologous recombination is very low, about 10 ⁇ 5 or less. Therefore, there is a demand for the development of a technique that can easily produce knock-in animals in a short time.
  • Non-patent Documents 1-6 Non-patent Documents 1-6
  • This Cre-loxP system is a system that can excise a DNA portion sandwiched between two loxP sites by a recombinase recombinase Cre (cyclization recombinase).
  • the inserted DNA is deleted by a cleavage / recombination event of the loxP sequence by Cre recombinase.
  • the present inventors utilize one or both of two loxP sequences sandwiching DNA so that foreign DNA can be efficiently introduced using the Cre-loxP system having such properties. Mutation is made so that the Cre recombinase cannot recognize or difficult to recognize the lox sequence, and the recombination inserts the foreign DNA sequence site sandwiched between the two lox sequences without being deleted.
  • Cre recombinase is a spacer sequence in the center of one or both of the two loxP strands forming a base pair, if there is a mutant lox sequence in which a mutation is introduced into either the sense strand or the antisense strand. Can be cut and combined. As a result, the foreign DNA sequence site sandwiched between the two lox sequences is recombined and inserted.
  • a knockout animal into which such a trap vector has been introduced is produced together with a trap vector into which a foreign gene such as a reporter gene such as DNA or a luminescent gene has been introduced (for example, see Patent Document 1).
  • a technique for example, see Patent Document 2 has been devised.
  • an acceptor vector into which a lox71 sequence that is a mutant loxP sequence is introduced and a mutant lox sequence of a donor vector into which a lox66 sequence that is another mutant loxP sequence is introduced, and between an acceptor vector and a loxP sequence of a donor vector A technique has also been devised in which a foreign DNA introduced between the lox66 and loxP sequences of a donor vector is stably inserted into the genome by recombination with Cre recombinase (see, for example, Patent Document 3).
  • the present inventors include a target gene into which the foreign mutant DNA is to be introduced and the mutant gene DNA.
  • a target introduction vector containing a mutation introduction cassette prepared from a recombination target gene obtained by homologous recombination with a target recombination vector (targeting vector) so as to contain the mutation gene DNA to be introduced Cre- It is found that gene mutation of a foreign gene can be introduced into a target gene easily and rapidly with high probability by recombination through a mutation lox system, and by using such a mutation introduction cassette, Finding that any mutant gene can be introduced, regardless of type, Invention has been completed. Further, the inventors have found that by using this gene mutation introducing method, a knock-in animal of a non-human mammal, particularly a mouse, can be easily produced in a short time, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides a gene mutation introduction method capable of introducing a foreign gene mutation with high probability into a target gene using a mutation introduction cassette and a Cre-mutation loxP system regardless of the type of the target gene.
  • the purpose is to do.
  • a target DNA sequence contained in a recombination target gene on a chromosome and a mutagenesis cassette of a mutagenesis vector are combined with a mutagenesis cassette sequence region contained in the mutagenesis cassette by an intermediary action of Cre recombinase.
  • the object is to provide a method for introducing a gene mutation to be introduced instead.
  • the present invention has a preferred aspect to provide a gene mutation introducing method comprising obtaining a recombination target gene to be mutagenized by homologous recombination between a target gene and a target recombination vector.
  • the mutation introduction cassette of the mutation introduction vector comprises a mutant DNA sequence sandwiched between a third mutant lox sequence and a fourth mutant lox sequence and a second positive selection marker DNA sequence.
  • An object of the present invention is to provide a gene mutation introducing method comprising a mutation-introducing DNA sequence.
  • the mutant DNA sequence sandwiched between the third mutant lox sequence and the fourth mutant lox sequence contained in the mutagenesis cassette of the mutagenesis vector is assembled by the intermediary action of Cre recombinase.
  • An object of the present invention is to provide a method for introducing a gene mutation comprising recombination with a target DNA sequence sandwiched between a pair of a first mutation lox sequence and a second mutation lox sequence contained in a replaced target gene.
  • each mutant lox sequence has a mutation in the spacer sequence of the loxP sequence or a 5 ′ repeat repeat sequence or 3 ′ repeat repeat sequence thereof, for example, lox71, lox2272, and loxKR3. It aims at providing the gene mutation introduction method which consists of.
  • the mutagenesis obtained by recombination of the recombination target gene and the mutagenesis cassette of the mutagenesis vector is, for example, a fifth mutant lox sequence such as lox71 / KMR3, and lox2272 for example. It is an object of the present invention to provide a gene mutation introducing method comprising a mutated DNA sequence sandwiched in pairs with a sixth mutated lox sequence.
  • the first DNA sequence region of the target gene is homologously recombined with the second DNA sequence region of the target recombinant vector by homologous recombination between the target gene and the target recombinant vector.
  • a recombination step comprising recombining a target DNA sequence contained in the second DNA sequence region to obtain a recombined target gene by recombination of the mutagenesis target exon contained in the sequence region, and a third DNA sequence region of the recombined target gene
  • the Cre-mutant lox system comprising a Cre recombinase and a pair of mutant lox sequences, comprising a pair of a first mutant lox sequence and a second mutant lox sequence, and a mutant target DNA sequence region sandwiched between the pair. Mutagenesis by obtaining a mutagenesis gene by introducing a mutagenesis DNA sequence region by recombination with a mutagenesis cassette by an intervening action When, and its object is to provide a gene mutation introduction method comprising.
  • Another object of the present invention is to provide a mutation introduction method in which a mutation introduction cassette and a mutation DNA sequence contained in a mutation introduction gene are mutation exons.
  • the target gene is derived from a gene of a human autosomal dominant benign familial neonatal seizure (BFNC) -related voltage-gated potassium channel KCNQ2 subunit, and the target mutation of the target gene is
  • An object of the present invention is to provide a gene mutation introducing method comprising Y284C (SEQ ID NO: 1 and 2) or T306A (SEQ ID NO: 3 and 4) of gene KCNQ2.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a mutation-introduced gene comprising producing a mutation-introduced gene by introducing a gene mutation into a target gene by the above-described gene mutation-introducing method.
  • Another object of the present invention is to provide a mutation transgene including a mutant DNA sequence containing a mutant exon sandwiched between a fifth mutant lox sequence and a sixth mutant lox sequence.
  • the present invention provides, as yet another form, a mutation introduction cassette comprising a mutant DNA sequence comprising a mutant exon sandwiched between a third mutant lox sequence and a fourth mutant lox sequence and being variable.
  • the purpose is that.
  • Another object of the present invention is to provide a mutagenesis vector comprising the above-described mutagenesis cassette.
  • the present invention further provides, as another form, a mutant transgene, for example, a mutant gene of a gene derived from the gene KCNQ2 subunit of a human autosomal dominant benign familial neonatal seizure (BFNC) -related voltage-gated potassium channel,
  • a mutant transgene for example, a mutant gene of a gene derived from the gene KCNQ2 subunit of a human autosomal dominant benign familial neonatal seizure (BFNC) -related voltage-gated potassium channel
  • BFNC human autosomal dominant benign familial neonatal seizure
  • the present invention provides a mutant gene in which the mutagenesis gene is derived from the gene KCNQ2 subunit of a human autosomal dominant benign familial neonatal seizure (BFNC) -related voltage-gated potassium channel, for example.
  • BFNC human autosomal dominant benign familial neonatal seizure
  • it is an object to provide knock-in non-human mammals, such as mice, especially having KCNQ2 Y284C or T306A.
  • the present invention provides a target DNA sequence sandwiched between a pair of a first mutant lox sequence and a second mutant lox sequence different from each other contained in a target gene on a chromosome, and mutation of a mutation introduction vector
  • a gene mutation comprising recombining and introducing a mutant DNA sequence sandwiched between a third mutant lox sequence and a fourth mutant lox sequence contained in the mutagenesis cassette by an intermediary action of Cre recombinase.
  • the recombination target gene is a recombinant gene obtained by homologous recombination between the target gene and the target recombination vector, and the first mutant lox sequence and the second mutant lox sequence
  • a gene mutation introducing method comprising a target DNA sequence sandwiched between pairs of
  • the mutation introduction cassette of the mutation introduction vector comprises a mutant DNA sequence sandwiched between a third mutant lox sequence and a fourth mutant lox sequence and a second positive selection marker DNA sequence.
  • the present invention provides a method for introducing a gene mutation.
  • a mutant DNA sequence sandwiched between a pair of the third mutant lox sequence (52) and the fourth mutant lox sequence (56) contained in the mutagenesis cassette of the mutagenesis vector is: Provided is a method for introducing a gene mutation comprising recombination with a target DNA sequence sandwiched between a pair of a first mutant lox sequence and a second mutant lox sequence contained in a recombined target gene by the mediated action of Cre recombinase.
  • the first mutant lox sequence is a mutant lox sequence in which a mutation is present in the 5 ′ repeat repeat of the loxP sequence, for example, lox71
  • the second mutant lox sequence is a spacer sequence of the loxP sequence.
  • the mutant lox sequence in which the mutation is present, for example, lox2272, and the third mutant lox sequence is a mutant lox sequence in which the mutation is present in the 3 ′ repeat repeat of the loxP sequence, for example, loxKR3, and the fourth mutant lox sequence is Provided is a method for introducing a gene mutation comprising a lox sequence having a mutation in the spacer sequence of the loxP sequence, for example, lox2272.
  • the mutation transgene obtained by recombination of the recombined target gene and the mutation introduction cassette of the mutation introduction vector is a pair of the first mutation lox sequence and the second mutation lox sequence, Mutation flanked by a pair of a third mutant lox sequence and a fifth mutant lox sequence obtained by recombination with each pair of the fourth mutant lox sequence, for example, lox71 / KMR3, and a sixth mutant lox sequence, for example, lox2272
  • a method for introducing a gene mutation comprising an introduced DNA sequence region, wherein the mutagenized DNA sequence region comprises a mutated DNA sequence and a second positive selection marker DNA sequence.
  • the gene mutation introduction method is a gene mutation introduction method for introducing a foreign mutation gene into a target gene, wherein homologous recombination between the target gene (10) and the target recombination vector (20).
  • a homologous recombination step comprising recombining the target exon (12) with the target DNA sequence (32) contained in the second DNA sequence region (20a) to obtain a recombined target gene (40); A pair of the first mutant lox sequence (30) and the second mutant lox sequence (36) contained in the third DNA sequence region (40a) of the target gene (40) is sandwiched between the pair.
  • the mutated target DNA sequence region (35) is transferred to the mutagenesis cassette (51) of the mutagenesis vector (50) by the intermediary action of the Cre-mutation lox system comprising Cre recombinase and a pair of mutant lox sequences (A method for introducing a gene mutation comprising: a mutation introduction step for obtaining a mutation-introduced gene (60) into which a mutation-introduced DNA sequence region (54) has been introduced by specific recombination;
  • the target recombination vector (20) comprises a negative selectable marker DNA sequence (22), a first homologous recombination DNA sequence region (24), a target DNA sequence region (26), and a second homologous recombination DNA sequence region ( 34), and the target DNA sequence region (26) comprises a first mutant lox sequence (30), a target DNA sequence (32), a first positive selectable marker DNA sequence (34), and a second mutation including a lox sequence (36) and a poly A addition sequence (38), and the first and second homologous recombination DNA sequence regions (22, 28) have the length of the DNA sequence necessary for homologous recombination ;
  • the third DNA sequence region (40a) of the recombined target gene (40) includes a first homologous recombination DNA sequence region (24), a first mutant lox sequence (30), and a mutant target DNA sequence region (35).
  • a second mutant lox sequence (36) and a second homologous recombination DNA sequence region (28), and the mutant target DNA sequence region (35) comprises a target DNA sequence (32) and a first positive selectable marker A DNA sequence (34);
  • the mutagenesis cassette (51) of the mutagenesis vector (50) includes a third mutant lox sequence (52), a mutagenesis DNA sequence region (54), and a second mutant lox sequence (56), and a mutation
  • the introduced DNA sequence region (54) comprises a mutated DNA sequence (57) and a second positive selectable marker DNA sequence (58);
  • the mutagenesis gene (60) includes a first homologous recombination DNA sequence region (24), a fifth mutation lox sequence (62), a mutagenesis DNA sequence region (54), and a sixth mutation lox sequence (66).
  • a second homologous recombination DNA sequence region (28), and the mutagenized DNA sequence region (54) comprises a mutant DNA sequence (57) and a second positive selectable marker DNA sequence (58).
  • a gene mutation introducing method comprising:
  • the present invention provides a method for introducing a gene mutation, wherein the mutation DNA sequence contained in the mutation introduction cassette or mutation introduction gene of the mutation introduction vector contains a mutation exon.
  • the target gene is derived from the gene of a human autosomal dominant benign familial neonatal seizure (BFNC) -related voltage-gated potassium channel KCNQ2 subunit, and the mutant gene is Y284C of the gene KCNQ2.
  • BFNC human autosomal dominant benign familial neonatal seizure
  • a method for introducing a gene mutation comprising introducing (SEQ ID NOs: 1 and 2) or T306A (SEQ ID NOs: 3 and 4) is provided.
  • the present invention provides a method for producing a mutation-introduced gene comprising producing a mutation-introduced gene by introducing a gene mutation into a target gene by the gene mutation-introducing method described above.
  • the present invention further includes, as another form, a first homologous recombination DNA sequence region, a fifth mutant lox sequence, a mutation-introduced DNA sequence region, a sixth mutant lox sequence, and a second homologous recombination DNA sequence region. And a mutation-introducing DNA sequence region comprising a mutation DNA sequence and a second positive selection marker DNA sequence, and being sandwiched between a pair of a fifth mutation lox sequence and a sixth mutation lox sequence A mutant transgene comprising a transgene is provided.
  • a pair of the fifth mutant lox sequence and the sixth mutant lox sequence is a pair of the first mutant lox sequence and the second mutant lox sequence, a third mutant lox sequence and a fourth mutant lox.
  • a mutagenesis gene obtained by recombination with a pair with a sequence.
  • the present invention further includes a third mutant lox sequence, for example, a pair of loxKR3 and a fourth mutant lox sequence, for example, lox2272, and a mutant DNA sequence sandwiched between the pair and a second positive selectable marker DNA sequence.
  • a mutagenesis cassette is provided that is variable and variable.
  • This invention provides, as yet another form, a mutagenesis vector comprising the mutagenesis cassette.
  • the present invention provides a non-human mammal, particularly a mouse, into which the mutation transgene has been introduced.
  • the mutant gene is derived from the gene KCNQ2 subunit of a human autosomal dominant benign familial neonatal seizure (BFNC) -related voltage-gated potassium channel, and the mutant gene is Y284C of the mutant gene KCNQ2.
  • BFNC human autosomal dominant benign familial neonatal seizure
  • a knock-in non-human animal such as a knock-in mouse consisting of T306A is provided.
  • the schematic diagram which shows the sequence structure of a target gene, and the sequence structure of the target recombinant vector (20) containing a target DNA sequence (32).
  • the schematic diagram which shows the sequence structure of the recombined target gene obtained by homologous recombination with a target gene and a target recombination vector. Sequence arrangement of the mutagenesis cassette included in the mutagenesis vector, and the sequence of the mutagenesis gene introduced by recombination of the recombination target gene and the mutagenesis cassette by the intermediary action of the Cre-mutation lox sequence system
  • the schematic diagram which shows a structure.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the target gene KCNQ2, the sequence configuration of the targeting vector, and the sequence configuration of the mutation-introducing vector containing the mutation Y284C or T306A as the mutant gene.
  • the schematic diagram which shows the sequence structure of the mutagenesis vector containing the mutation Y284C and T306A of the gene KCNQ2 as a mutant DNA sequence.
  • This invention relates to a gene mutation introducing method for introducing a gene mutation into a target gene.
  • the gene mutation introducing method of the present invention is characterized in that in two steps, a corresponding mutant DNA sequence of a foreign mutant gene is introduced into a mutagenesis exon having a function as a gene contained in a target gene (that is, a target DNA sequence). It is said.
  • the first stage of the method for introducing a gene mutation according to the present invention comprises a recombination of exon DNA sequences (target DNA sequences) targeted for mutation introduction of a target gene so that a target gene mutation can be introduced. This is a homologous recombination step to obtain a replaced target gene.
  • recombination specifically replacing the target DNA sequence of the recombined target gene obtained in the first stage with a target mutant DNA sequence using a mutagenesis vector (that is, a targeting vector). Recombination) process.
  • the homologous recombination step of the gene mutation introducing method of the present invention first, in order to construct the target gene on the chromosome so that the target DNA sequence can be efficiently recombined with the target foreign mutant DNA sequence, A pair of different first mutant lox sequence and second mutant lox sequence which are different from each other is arranged so as to sandwich the DNA sequence portion, and recombination modification is performed.
  • Any recombinant modification method can be used as long as it is a method known in the art, but in general, homologous recombination between a target gene and a target recombinant vector (that is, a targeting vector).
  • the DNA sequence region containing the target DNA sequence of the target gene is preferably constructed by recombination.
  • a target gene is assembled using a homologous recombination method using a target recombination vector called a targeting vector, so-called gene targeting method. It is better to change and modify.
  • a target recombination vector containing a target DNA sequence that is a target for mutagenesis, that is, a targeting vector is introduced into mouse ES cells or the like according to a conventional method by a conventional vector introduction technique such as electroporation. Can be implemented.
  • homologous recombination by this homologous recombination method has a disadvantage that the recombination probability is very low, 0.01% or less.
  • the specific recombination process of the second stage of the gene mutation introducing method of the present invention is configured as follows, thereby achieving the object.
  • the desired gene mutation can be introduced in a short period of time with a very high probability that the mutation introduced gene is introduced.
  • the recombination process in the second stage of the gene mutation introducing method of the present invention comprises recombining the recombination target gene recombined as described above with the use of a mutation introduction vector, and the target DNA of the recombination target gene.
  • the sequence consists of specific recombination with the mutated DNA sequence contained in the mutagenesis vector.
  • the present invention can devise a mutagenesis vector, particularly a mutagenesis cassette, and introduce a target DNA sequence into a recombined target gene so that the target mutant DNA sequence can be introduced with high probability and speed. It is also a great feature that it is built.
  • the present invention has an extremely great feature that it can be applied to any gene regardless of the type of gene.
  • the gene mutation in the first stage, once a recombination target gene is prepared by recombination modification of a mutagenesis target exon (target DNA sequence) with a target recombination vector, in the second stage, the gene mutation can be recombined with high probability and rapidly by a mutation introduction vector in which a mutation introduction cassette containing the target gene mutation is introduced into the exon targeted for introduction of the mutation of the recombination target gene. It can be introduced.
  • the gene mutation can be rapidly and rapidly performed with a mutation introduction vector containing a mutation introduction cassette containing the target gene mutation. Since it can be introduced by recombination, a mutation introduction cassette containing the gene mutation can be prepared in a very short time even if the target gene mutation is changed. It can be introduced with high probability.
  • a mutagenesis cassette containing the target gene mutation and a mutagenesis vector containing the mutagenesis cassette can be produced quickly and in a short time by a conventional method, the objective is finally A knock-in animal having a gene transgene in which a gene mutation has been replaced can be produced quickly and in a short period of time with a very high probability.
  • the present invention can be applied to any gene regardless of the type of gene, even if the target gene is a disease-related gene such as an epilepsy-related gene or a cancer-related gene, it is any other gene. Can be applied in substantially the same manner, and has a very great feature that a mutagenesis gene into which a desired gene mutation has been introduced can be produced with high probability in a short period of time. Similarly, the present invention has the great advantage that a mutant DNA sequence can be introduced substantially in the same manner to any DNA sequence having a function as a gene of any target gene, that is, an exon DNA sequence.
  • FIG. 1 shows a sequence of a target recombination vector (20) comprising a sequence structure of a target gene (10) for introducing a gene mutation and a target DNA sequence (32) recombined by homologous recombination with the target gene (10).
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the sequence structure of the recombination target gene (40) obtained by homologous recombination between the target gene (10) and the target recombination vector (20).
  • FIG. 3 shows that the sequence structure of the mutagenesis cassette (51) contained in the mutagenesis vector (50) according to the present invention, the recombination target gene (40) and the mutagenesis cassette (51) are Cre-mutation lox.
  • FIG. 4 shows the sequence structure of a gene derived from a human autosomal dominant benign familial neonatal seizure (BFNC) -related voltage-gated potassium channel KCNQ2 subunit as a target gene and a targeting vector for homologous recombination. It is a schematic diagram.
  • BFNC human autosomal dominant benign familial neonatal seizure
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the sequence configuration of a target gene KCNQ2 and its targeting vector, and the sequence configuration of a mutation-introducing vector containing the mutation Y284C or T306A as its mutant gene.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the sequence structure of a mutation-introducing vector containing mutations Y284C and T306A. It should be understood that the schematic diagrams shown in the drawings are merely examples for briefly explaining the present invention, and the present invention is not limited by these drawings. is there.
  • the target gene (10) that can be used in the gene mutation introducing method according to the present invention is not particularly limited, and has the great advantage and advantage that it can be applied to any gene. Yes.
  • the epithelial-related gene shown in FIG. 5 is a human autosomal dominant benign familial neonatal seizure (BFNC) -related potential dependence.
  • the gene derived from the sexual potassium channel KCNQ2 subunit will be described as an example, and the mutation Y284C or T306A shown in FIG. 6 will be described as an example of the mutation gene targeted for gene mutation introduction.
  • a target gene (10) targeted for gene mutation introduction is freely selected from any gene having a mutation introduction target exon (12) having a desired function as a gene. Can be selected.
  • target gene and target exon (target DNA sequence) for gene mutation introduction it is naturally advantageous to select from genes and gene mutations that already have known gene mutations. It is.
  • a human autosomal dominant benign familial neonatal seizure (BFNC) -related voltage-gated potassium channel which is an epilepsy-related gene whose gene mutation has already been known.
  • a gene derived from the KCNQ2 subunit is selected, and a known gene mutation Y284C (SEQ ID NO: 1 and 2) or T306A (SEQ ID NO: 3 and 4) is selected as a target DNA sequence from a plurality of exons contained in the gene KCNQ2. Exon 6 in which is present was selected. Of course, other exons can also be selected, and it is natural that the target DNA sequence to be targeted for mutagenesis can be freely selected according to the purpose.
  • the target gene (10) selected as described above is recombinantly modified by a target recombination vector (targeting vector) (20) and a homologous recombination method known in the art, that is, gene targeting method.
  • a target recombination vector containing a target DNA sequence that is a target for mutagenesis, that is, a targeting vector is introduced into mouse ES cells or the like according to a conventional method by a conventional vector introduction technique such as electroporation. Can be implemented.
  • the homologous recombination method is an established technique that is commonly used in this technical field, and therefore, detailed description thereof is omitted here.
  • This target recombinant vector (20) is a vector for introducing a mutation lox sequence for facilitating mutation introduction into a predetermined target gene in genomic DNA of an ES cell such as a mouse, and targets a target mutation.
  • a target recombinant vector In order to be able to be introduced into a gene, it can be prepared by incorporating into a basic plasmid or the like according to a conventional method commonly used in the art.
  • a plasmid is not particularly limited, and any plasmid can be used as long as it is commonly used in the art.
  • plasmids examples include pUCs such as pBluescript II SK +, pGEM, pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, and pUC119, pSPs such as pSP64, pSP65, and pSP73, pGEM-3, pGEM-4, and pGEM-3Z.
  • pGEMs can be mentioned, it is preferable to select them appropriately in consideration of the type and sequence order of restriction enzyme cleavage sites present in the DNA fragment to be inserted later for the construction of the target recombinant vector.
  • the genomic DNA fragment used for the construction of the target recombinant vector of the present invention is obtained from, for example, the DNA base sequence information of the target gene such as the KCNQ2 gene from the genome database, and the mouse bacterial artificial chromosome live based on the information.
  • a necessary region of the gene can be amplified by PCR using a rally (BAC) clone or the like as a template, or can be prepared using a clone isolated from a genomic library.
  • the first homologous recombination DNA sequence region is about 5.5 kb with respect to the exon portion that is the target site for mutagenesis.
  • the homologous recombination DNA sequence region is preferably designed to be a partial fragment of about 2 kb.
  • Each oligonucleotide of the oligonucleotide pair can be prepared by a method commonly used in the art.
  • the first homologous recombination DNA sequence region and the second homologous recombination DNA sequence region for homologous recombination can be prepared individually and combined.
  • target recombination vector used in the present specification is generally referred to as a targeting vector that serves as a carrier for a target DNA sequence introduced into a target gene from the outside.
  • the target recombinant vector of the present invention can be prepared according to a technique commonly used in the art.
  • the DNA sequence of the first homologous recombination DNA sequence region (24) is generally constructed longer than the DNA sequence of the second homologous recombination DNA sequence region (28). Therefore, in the present specification, for convenience of explanation, the first homologous recombination DNA sequence region (24) may be referred to as a “long arm region” or a related term.
  • the homologous recombination DNA sequence region (28) may be referred to as a “short arm region” or a related term in some cases, but is not particularly restricted by these terms. In other words, the first homologous recombination DNA sequence region (24) and the second homologous recombination DNA sequence region (28) are the same even if the former DNA sequence is shorter than the latter DNA sequence or both It may be the same.
  • the target recombination vector (20) is preferably constructed as follows. That is, the target recombinant vector (20) has a target DNA sequence (32) that is substantially the same DNA sequence as the first DNA sequence region (10a) containing the exon (12) to be mutated in the target gene (10).
  • the structure has a second DNA sequence region (20a) and a pair of different first mutant lox sequences (30) and second mutant lox sequences (36) different from each other so as to sandwich the target DNA sequence (32). It is better to build as follows.
  • mutant lox sequence used in the present invention will be described in detail.
  • mutant lox sequence refers to a spacer sequence and / or a 5 ′ repeat repeat and / or a 3 ′ repeat among 8 bases of a spacer sequence located in the center of the loxP sequence. It means a mutant lox sequence in which one or a plurality of bases are replaced with another base among 13 bases of each repetitive sequence.
  • first mutant lox sequence refers to a mutation that is present in the 5 ′ repeat repeat of the loxP sequence and that is located 5 ′ of the target DNA sequence.
  • This is a lox array, for example, lox71.
  • the “second mutant lox sequence” is a mutant lox sequence that is located on the 3 ′ side of the target DNA sequence while the mutation is present in the spacer sequence of the loxP sequence, and includes, for example, lox2272.
  • lox71 is a sequence in which the first 5 base sequences on the 5 'side of 13 bases (ATAACTTCGTATA) of the 5' repeat sequence of the loxP sequence are mutated to TATTG.
  • lox2272 is a mutated lox sequence in which the spacer sequence of the loxP sequence is mutated, in which the second C of the 8 bases (GCATACAT) is substituted with G and the seventh A is substituted with T .
  • the target recombinant vector (20) of the present invention is substantially the same as the first DNA sequence region (10a) of the target gene (10).
  • the second DNA sequence region (20a) having the same DNA sequence, the second DNA sequence region (20a) includes a first homologous recombination DNA sequence region (24), a first mutant lox sequence (30),
  • the target DNA sequence region (26), the second mutant lox sequence (36), the poly A addition sequence (38), and the second homologous recombination DNA sequence region (28) are constructed to have a sequence structure. It is good.
  • the target DNA sequence region (26) sandwiched between pairs of the first mutant lox sequence (30) and the second mutant lox sequence (36) which are different from each other includes the target DNA sequence (32) and the first positive selection marker DNA. It is preferable to have a structure including the array (34). Further, the FRT sequence (39a, 39b) is preferably arranged between the target DNA sequence (32) and the first positive selection marker DNA sequence (34), and 3 ′ of the poly A addition sequence (38). .
  • the DNA sequences of the first homologous recombination DNA sequence region (24) and the second homologous recombination DNA sequence region (28) may generally be about 5 kb and about 2 to 3 kbp, respectively.
  • the 1 homologous recombination DNA sequence region (24) and the second homologous recombination DNA sequence region (28) may each contain an exon DNA sequence and an intron DNA sequence.
  • the negative selectable marker DNA sequence (22) is arranged 5 ′ to the first homologous recombination DNA sequence region (24).
  • a negative selection marker DNA sequence (22) for example, a gene producing a cytotoxin protein such as diphtheria toxin A fragment gene (DT-A) or a toxic substance such as a herpesvirus thymidine kinase gene (HSV-tk) is changed. The gene to be used can be used.
  • the first positive selection marker DNA sequence (34) incorporated in the target DNA sequence region (26) of the target recombinant vector (20) for example, a drug resistance gene marker such as a neomycin resistance gene (Neo R ) is used.
  • a drug resistance gene marker such as a neomycin resistance gene (Neo R ) is used.
  • Neo R neomycin resistance gene
  • the target recombinant vector having the above-described sequence structure can be obtained by, for example, cleaving pBluescript II SK + plasmid with an appropriate restriction enzyme, incorporating DT-A at the cleavage site, and then cleaving with an appropriate restriction enzyme.
  • the target recombinant vector (20) having the sequence configuration as described above is introduced into mouse ES cells and the like according to a conventional method by a conventional vector introduction technique such as electroporation.
  • a conventional vector introduction technique such as electroporation.
  • the target gene (10) undergoes homologous recombination with the target recombination vector (20), and the recombined target gene (32) into which the target DNA sequence (32) that is the target of mutation introduction has been introduced. 40) is obtained.
  • the obtained recombination target gene (40) has a third DNA sequence region (40a) having substantially the same sequence structure as the second DNA sequence region (20a) of the target recombination vector (20). ( Figure 2).
  • the third DNA sequence region (40a) of the recombined target gene (40) includes a negative selectable marker DNA sequence (22), a first homologous recombination DNA sequence (24), and a first mutation.
  • lox sequence (30), mutant target DNA sequence (35), second mutant lox sequence (36), poly A addition sequence (38), FRT sequence (39b), and second homologous recombinant DNA sequence ( 28), and the mutated target DNA sequence (35) includes the target DNA sequence (32), the FRT sequence (39a), and the first positive selection marker DNA sequence (34). It consists of an array configuration.
  • the recombined target gene (40) on the chromosome having such a sequence structure is mediated by the intermediary action of the mutagenesis vector (50) including the mutagenesis cassette (51) and the Cre recombinase-mutation lox system.
  • the mutation target DNA sequence region (35) included in the third DNA sequence region (40a) of the recombined target gene (40) is the mutation introduction DNA sequence region contained in the mutation introduction cassette (51) of the mutation introduction vector (50).
  • the target gene mutation is introduced into the target gene to obtain the mutant transgene (60).
  • the mutation introducing cassette (51) that can be used in the present invention is a tool for introducing a mutant DNA sequence (57) into a target gene, and is not limited to a specific mutant gene. It is a tool that can be applied to mutated genes. Furthermore, this mutation introduction cassette is also characterized in that it is a variable type that can freely change the mutant DNA sequence to be introduced into the target gene. Therefore, since this mutagenesis cassette can be prepared relatively easily and rapidly, if such a variable mutagenesis cassette is prepared for each mutation, the recombination efficiency of the recombination target gene is very high. Even if it is bad, the corresponding mutagenesis gene and non-human animals such as mice introduced with the mutagenesis gene can be easily produced in a short time and with high probability.
  • the mutation-introducing cassette (51) that can be variably constructed in this way is used to efficiently recombine with the target DNA sequence (32) of the recombined target gene (40).
  • the sequence (57) and the second positive selectable marker DNA sequence (58) located 3 ′ of the mutant DNA sequence (57) are divided into a third mutant lox sequence (52) and a fourth mutant lox sequence (56 It is better to build a structure sandwiched between Further, an FRT sequence (39c) is preferably arranged between the third mutant lox sequence (52) and the second positive selection marker DNA sequence (58).
  • the mutagenesis cassette (51) having such a sequence configuration can be prepared by conventional means commonly used in the art.
  • mutant lox sequence represented by “third mutant lox sequence” is a mutant lox sequence that is located on the 5 ′ side of the mutant DNA sequence while the mutation is present in the 3′-repeat repeat sequence of the loxP sequence.
  • mutant lox sequence represented by “fourth mutant lox sequence” is similar to the second mutant lox sequence, and the mutation exists in the spacer sequence of the loxP sequence. This is a mutant lox sequence located on the 3 ′ side, and examples thereof include lox2272.
  • the loxKR3 as the third mutant lox sequence (52) is a 3 base sequence (5′-GAA) from the 3 ′ side repeat sequence of the 3 ′ side end of the loxP sequence.
  • 5′-CGG) is a mutated lox sequence.
  • lox2272 is a mutant lox sequence in which a mutation exists in the spacer sequence of the loxP sequence, similar to the second mutant lox sequence, and the second C of its 8 bases (GCATACAT) is set to G, and the seventh It has a sequence in which A is replaced with T.
  • the second positive selection marker DNA sequence (58) contained in the mutation-introducing cassette (51) is preferably designed to comprise a drug resistance gene such as a puromycin resistance gene.
  • a drug resistance gene such as a puromycin resistance gene.
  • Such a positive selectable marker DNA sequence was artificially added to the 5 ′ and 3 ′ ends after amplification as a fragment of a predetermined length by PCR using a predetermined plasmid as a template and an appropriate oligonucleotide pair. It can be prepared by cleaving a restriction enzyme recognition site.
  • the mutant DNA sequence (57) of the mutagenesis cassette (51) is constructed so as to be a DNA sequence containing a mutant exon.
  • mutant exons include Y284C and T306A, which are mutant portions present in the exon 6 portion of the gene KCNQ2 subunit of the voltage-gated potassium channel associated with human autosomal dominant benign familial neonatal seizure (BFNC).
  • BFNC human autosomal dominant benign familial neonatal seizure
  • the mutation introduction cassette is designed. Good. This can be similarly applied to other mutant genes.
  • the nucleotide sequence of mutation Y284C of this gene KCNQ2 subunit is a mutation nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) in which 23rd A of exon 6 of KCNQ2 gene is replaced by G, and the 8th tyrosine of exon 6 is It is a mutated amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) substituted with cysteine.
  • the base sequence of gene mutation T306A is a mutant base sequence (SEQ ID NO: 3) in which the 100th G of exon 6 of the KCNQ2 gene is replaced with A, and the mutation in which the 34th alanine of exon 6 is replaced with threonine It is an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4).
  • a mutant DNA sequence containing a gene mutation that can be used in the present invention introduces mutation Y284C or A306T into a DNA fragment containing exon 6 of the mouse KCNQ2 gene, and further has a 5 ′ end. To which a loxKR3 sequence is added.
  • a KCNQ2 gene fragment containing the Y284C mutation of exon 6 of the mouse KCNQ2 gene was used as an exon 6 peripheral region amplification / loxKR3 sequence-introducing oligonucleotide pair for introducing a Y284C mutation using the KCNQ2 gene peripheral part of exon 6 as a template.
  • a 5′-side fragment and a 3′-side fragment containing a base substitution to become Y284C were amplified by PCR, respectively.
  • These two fragments can be obtained as a fragment of a predetermined length by ligation and amplification by the ligation-independent cloning method and PCR using the oligonucleotide pair for exon 6 peripheral region amplification / loxKR3 sequence introduction.
  • the KCNQ2 gene fragment containing the A306T mutation can be prepared in substantially the same manner as the KCNQ2 gene fragment containing the Y284C mutation.
  • exons containing other mutations or other genes can be prepared in substantially the same manner.
  • the mutagenesis cassette (51) having the above-described sequence configuration can be introduced into the mutagenesis vector (50) according to conventional means commonly used in the art.
  • a mutagenesis vector for example, a vector similar to that used for the target recombinant vector can be used.
  • plasmids such as pBR322, pUC (pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, etc.), pBluescript II, pSP (pSP64, pSP65, etc.), pGEM (pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, etc.) You can use vectors.
  • KCNQ2 gene fragment containing the above mutation for example, by incorporating a second positive selection marker DNA sequence region such as a puromycin resistance gene into an appropriate plasmid cleaved with a restriction enzyme, cleaved with a restriction enzyme, It is possible to construct a mutagenesis vector having the above-described sequence structure by incorporating it into the cleavage site.
  • a second positive selection marker DNA sequence region such as a puromycin resistance gene
  • the mutagenesis vector (50) into which the mutagenesis cassette (51) has been introduced as described above is obtained by reacting the recombination target gene (40) with the mediated action of Cre recombinase.
  • a recombination target gene (40) is recombined with a pair of the third mutation lox sequence (52) and the fourth mutation lox sequence (56) and a mutation-introduced DNA sequence (54) sandwiched between the pair.
  • the mutation transgene (60) is obtained.
  • the mutation-introduced DNA sequence region (35) of the recombined target gene (40) is converted into the mutation-introducing vector by the reaction of the recombined target gene (40) and the mutation-introducing vector (50) via the Cre recombinase. It is replaced with the mutagenesis cassette (51) of (50).
  • the target mutagenesis gene (60) into which the mutant DNA sequence (57) having the target gene mutation is introduced is obtained by replacing the DNA sequence (57).
  • the reaction mediated by the Cre recombinase-mutant lox system can be performed according to a known method.
  • the obtained mutagenesis gene (60) includes a first homologous recombination DNA sequence (24), a fifth mutagenesis lox sequence (64), a mutagenesis DNA sequence region (54), It includes a structure consisting of a sequence structure including a sixth mutant lox sequence (66), a poly A addition sequence (38), an FRT sequence (39b), and a second homologous recombinant DNA sequence (28).
  • the mutation-introduced DNA sequence region (54) has a sequence structure including a mutant DNA sequence (57), an FRT sequence (39c), and a second positive selection marker DNA sequence (58).
  • the FRT sequence (39b) and FRT sequence (39c) arranged in the obtained mutagenesis gene (60) are for removing a drug gene after mouse creation, for example. That is, the FRT DNA is bred by mating a pup mouse (F1) born by mating a male mouse having the created mutagenesis gene (60) and a wild-type female mouse with a mouse expressing Flp recombinase. Pups that have lost the sequence region can be calculated. After that, it is possible to pass the state without this area as a complete type.
  • the fifth mutant lox sequence (64) and the sixth mutant lox sequence (66) of the mutagenesis gene (60) will be described.
  • the fifth mutant lox sequence (64) is composed of the first mutant lox sequence (30) of the recombined target gene (40) and the third mutant lox sequence (52) of the mutagenesis cassette (51). Since it is a mutant lox sequence obtained by recombination, it consists of both the first mutant lox sequence and the third mutant lox sequence. Accordingly, the fifth mutant lox sequence (64) has a mutation in the 5′-repeat repeat sequence of the loxP sequence, similarly to the first mutant lox sequence, and 3 ′ of the loxP sequence, similar to the third mutant lox sequence.
  • the fifth mutant lox sequence (64) is a mutant lox sequence having a mutation between the first mutant lox sequence and the third mutant lox sequence in the 5'-side and 3'-side repeated repeat sequences of the loxP sequence.
  • the sixth mutant lox sequence (66) also includes the second mutant lox sequence (36) of the recombined target gene (40) and the fourth mutant lox of the mutagenesis cassette (51). Since it is a mutant lox sequence obtained by recombination with the sequence (56), it consists of both the second mutant lox sequence and the fourth mutant lox sequence.
  • the reaction between the recombined target gene (40) and the mutagenesis vector (50) mediated by the Cre recombinase-mutation lox system can be performed according to a known method. That is, among the cells into which the target recombination vector has been introduced by a conventional vector introduction method such as electroporation, the cells in which homologous recombination has occurred are selected by the expression of the marker gene arranged in the vector. For example, if the marker gene is a drug resistance gene, it can be selected by culturing the cell in the presence of the drug.
  • cells in which the target recombinant vector has been incorporated are suspended in an appropriate medium such as KSR-GMEM medium, and then replaced with a G418-containing medium to culture non-recombinant cells and non-homologous recombinant cells. They can be killed and their cells removed. This makes it possible to isolate and select homologous recombination ES cells that have survived and formed colonies in a G418-containing medium.
  • the isolated ES cells can be cultured, and can be selected by PCR or Southern hybridization using DNA extracted from the cells.
  • PCR uses a pair of Neo-resistant gene-short arm region downstream oligonucleotides for detection of homologous recombination to detect the 3 'end portion of the Neo resistant gene and the short arm region of the target recombinant vector.
  • An amplified DNA product can be obtained by performing a reaction of amplifying a fragment between the KCNQ2 gene adjacent to the downstream side of the 3 ′ end.
  • the amplified DNA product thus obtained was cleaved with an appropriate restriction enzyme, and a Southern blot analysis was performed using the 3 ′ region of the short arm region as a probe to confirm that a DNA fragment was produced by target homologous recombination.
  • this cloned ES cell is preferably cryopreserved as an acceptor ES cell capable of introducing a mutation into the KCNQ2 gene and used for the subsequent operations.
  • the gene mutation contained in the mutation introduction vector can be introduced into a target gene such as the KCNQ2 gene by lox-specific recombination using the Cre-mutation lox system.
  • a target gene such as the KCNQ2 gene
  • Cre-mutation lox system the Cre-mutation lox system.
  • a clone of the acceptor ES cell line is used, and the mutation introduction vector and the Cre recombinase expression vector are introduced into the acceptor ES cell by a conventional method such as electroporation. Can be done by.
  • the mutagenesis vector into the acceptor ES cell and infecting the Cre expression vector in which the Cre recombinase gene is incorporated into the plasmid, it is sandwiched between the lox sequence elements in the target recombinant vector DNA introduced into the acceptor ES cell.
  • the target DNA sequence portion can be introduced into the KCNQ2 gene in the acceptor ES cell by specific recombination by the interaction of the Cre recombinase expressed from the Cre expression vector and the lox sequence.
  • cells in which mutagenesis has occurred by specific recombination can be selected based on antibiotic resistance.
  • the neomycin resistance gene of the target recombination vector is removed, and instead it has a puromycin resistance gene. Therefore, non-recombinant cells are killed by culturing in an appropriate culture medium containing the antibiotic puromycin, and cells mutated by specific recombination can be selected. After surviving cell colonies are isolated and further cultured, DNA can be extracted from a portion and introduction of mutation can be confirmed by PCR or Southern hybridization.
  • the knock-in non-human mammal according to the present invention can be produced by introducing the ES cell into which the target mutant DNA sequence portion has been inserted by recombination as described above into a mammal other than the human being, which is the target animal.
  • the target animal can be selected from, for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, dogs, cats, sheep, pigs, goats, cows, monkeys, etc., preferably mice, rats, guinea pigs, hamsters, It is a rodent such as a rabbit, and a mouse is particularly preferable.
  • the ES cells into which the target mutant DNA sequence portion has been inserted by recombination as described above are injected into wild type mouse blastocysts or 8-cell stage host embryos by the aggregation method or microinjection method, and the blastocyst stage Then, it is transplanted into the uterus of a temporary parent animal such as a temporary parental mouse in a pseudo-pregnant state to give birth and a chimeric animal can be produced.
  • mice female mice subjected to superovulation treatment with hormone agents such as PSG having FSH-like action and hCG having LH-like action are mated with male mice.
  • hormone agents such as PSG having FSH-like action and hCG having LH-like action
  • blastocysts or 8-cell stage embryos are collected from the uterus and oviduct, respectively.
  • the homologous recombination ES cells are injected in vitro into the embryos thus collected to produce a chimeric embryo.
  • a pseudopregnant female mouse for use as a temporary parent can be created by mating a female mouse with a normal cycle with a male mouse treated with vagina ligation or the like.
  • a chimeric mouse can be produced by transplanting the chimeric embryo produced by the above-mentioned method into the uterus to the produced pseudopregnant mouse, and allowing it to become pregnant and give birth.
  • the female mouse from which the fertilized egg is collected and the pseudopregnant mouse serving as the foster parent are preferably produced from a group of female mice in the same sexual cycle.
  • this chimeric mouse is mated with a pure-line mouse, and the ES cells are used as a marker for various ES cell-derived traits that appear in the next-generation individuals. It can be confirmed that it has been introduced to the line. Considering the ease of confirmation, ES cell-derived hair color appears in the next-generation individual obtained by mating the chimeric mouse with a pure-type mouse. It is preferable to confirm that has been introduced into the germline.
  • hair colors such as wild mouse color (Agouti color), black color, ocher color, chocolate color, white color, etc. are known.
  • the mouse to be mated with the chimeric mouse It is good to select a system
  • an individual in which the target mutant gene is expressed can be obtained.
  • a homozygous mouse into which the target mutant gene has been introduced can be obtained.
  • the heterozygote or homozygote carrying the generated mutant gene has the gene mutation stably in all germ cells and somatic cells, so that the mutation can be efficiently transferred to offspring animals by mating etc. Can communicate.
  • the target recombination vector is a plasmid-derived portion, a negative selection marker cassette, and a first homologous recombination DNA sequence region (long arm region) from the 5'-end side.
  • This target recombinant vector (pTgKCNQ2) was constructed based on the pBluescript II SK + plasmid so as to have a DNA sequence of 14,164 bp (SEQ ID NO: 5) in full length.
  • the sequence structure is as follows, and the plasmid map is shown in FIG.
  • Base number 1-673 part derived from pBluescript II SK +
  • Base number 674-2301 DT-A cassette
  • Base number 2316-7383 Partial sequence of KCNQ2 gene (long arm region for homologous recombination)
  • Base number 7484-7517 lox71 sequence
  • Base number 8091-10138 PGK / Neo cassette
  • Base number 10145-11939 Partial sequence of KCNQ2 gene (short arm region for homologous recombination)
  • Base number 11940-14164 part derived from pBluescript II SK +
  • Base number 11950-11954 restriction enzyme Sac II cleavage site (for vector linearization)
  • the base plasmid pBluescript II SK + was linearized by cleaving closed circular DNA extracted from E. coli (2,960 bp: Strategene) with restriction enzymes Xho I and Xba I.
  • Negative selection marker cassette (DT-A cassette)
  • the negative selectable marker cassette has a sequence structure consisting of MC1 promoter, diphtheria toxin A coding region (DT-A), and poly A addition sequence (pA).
  • the plasmid pDT / ApA (distributed by Yoshimi Araki) was purified by digesting the 5′-side with Xho I and the 3′-side with Spe I, and purifying it as a 1.6 kb fragment.
  • the KCNQ2 gene partial sequence that becomes the long arm region and the short arm region for homologous recombination is intron 2 to intron of mouse KCNQ2 gene. It was designed to be an area spanning seven.
  • the long arm region and the short arm region of the target gene KCNQ2 gene are B6 mouse BAC clone RPCI23-401L17 containing KCNQ2 gene, and a long arm-short arm region amplification oligonucleotide pair having the following sequence is used.
  • the long arm region corresponds to a 5′-side 5.6 kb region
  • the short arm region corresponds to a 3′-side 1.8 kb region.
  • the long arm-short arm region amplification oligonucleotide pairs were designed to have the following base sequences as shown in SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively.
  • the underlined portion represents a restriction enzyme recognition sequence.
  • the lox71 sequence as the first mutant lox sequence is complementary to the restriction enzyme Spe I cleavage site at both ends of the double-stranded DNA of 34 bp corresponding to the loxP sequence. This is a sequence to which a possible overhanging sequence (5′-CTAG-3 ′) is added.
  • the lox71 sequence is composed of an oligonucleotide pair for synthesizing lox71 sequence having the following sequence, heat-denatured at 95 ° C. and then slowly cooled to room temperature, followed by base pairing, using T4 polynucleotide kinase as a catalyst and ATP as a phosphate group donor. It was prepared by phosphorylating the 5 ′ end of both strands.
  • the lox71 sequence synthesis oligonucleotide pairs shown above were designed to have the following base sequences as shown in SEQ ID NOs: 8 and 9, respectively.
  • the base sequence in the box is a base sequence corresponding to the lox71 sequence.
  • the positive selectable marker DNA sequence is composed of an FRT sequence, a PGK / drug resistance gene marker cassette, a lox2272 sequence as a fourth mutant lox sequence, a poly A addition sequence (pA), and an FRT sequence.
  • pA poly A addition sequence
  • FRT sequence a neomycin resistance gene (Neo R ) was used as a drug resistance gene marker.
  • the positive selection marker was amplified as a 2.1 kb fragment by PCR using plasmid p03 (provided by Yoshimi Araki) as a template and an oligonucleotide pair for Neo R cassette amplification having the following sequence. Thereafter, the restriction enzyme recognition sites artificially added to both ends were cleaved with Nhe I and removed.
  • the oligonucleotide pair for Neo R cassette amplification was designed to have the following sequences as shown in SEQ ID NOs: 10 and 11, respectively.
  • the underlined portion is a restriction enzyme recognition sequence.
  • Example (1-2) (2) Method for preparing target recombinant vector
  • the DT-A cassette prepared in Example (1-2) was incorporated into plasmid pBluescript II SK + cleaved with restriction enzymes Xho I and Xba I in Example (1-1). Thereafter, this was cut with Not I, and the long arm-short arm region fragment prepared in Example (1-3) was incorporated into the cut site. Furthermore, the fragment incorporating the long arm-short arm region was cleaved with Spe I, and the lox71 fragment prepared in Example (1-4) was incorporated into the cleavage site.
  • the target recombinant vector was produced by integration.
  • the production of the target recombinant vector was confirmed by determination of the base sequence.
  • the target recombinant vector thus prepared is introduced into ES cells.
  • This example relates to a mutagenesis vector used for homologous recombination with the target recombination vector prepared in Example 1.
  • KCNQ2 mutagenesis vectors pMtKCNQ2YC and pMtKCNQ2AT
  • pMtKCNQ2YC and pMtKCNQ2AT are two types of vectors for introducing nucleotide substitutions such as Tyr 284 ⁇ Cys or Ala 306 ⁇ Thr into the KCNQ2 gene of acceptor ES cells by specific recombination. is there.
  • the loxKR3 sequence was placed at the 5 ′ end of the 570 bp KCNQ2 gene fragment (exon 6 and before and after) containing any of the above nucleotide substitutions, and the puromycin resistance gene (PuroR) and lox2272 sequence were placed at the 3 ′ end.
  • the region between lox71 and lox2272 arranged on the KCNQ2 gene of the acceptor ES cell is replaced with the mutant KCNQ2 sequence with high efficiency by the action of Cre recombinase. . Since the substituted cells become puromycin resistant, positive selection is possible.
  • KCNQ2 mutagenesis vectors (pMtKCNQ2YC and pMtKCNQ2AT) are all 4895 bp (SEQ ID NO: 12), the sequence structure is as follows, and the plasmid map is as shown in FIG.
  • the structure of the KCNQ2 gene portion is as follows. 2278-2471 intron5 (3 ′ end portion) 2472-2582 exon6 (including mutation) 2583-2847 intron6 (5 ′ end portion) 2506 mutation site (T A C (Tyr) ⁇ T G C (Cys)) (pMtKCNQ2YC only) 2571 mutation site (GCT (Ala) ⁇ A CT (Thr)) (pMtKCNQ2AT only)
  • the PGK / Puro cassette includes the following sequence factors. 2850-2949 FRT sequence 2966-3522 PGK gene promoter region 3523-4122 puromycin-N-acetyltransferase coding region 4204-4237 lox2272 sequence
  • the base plasmid (p3T) was linearized by cutting closed circular DNA (3,003 bp; MoBiTec) extracted from E. coli with Hind III and Kpn I.
  • Puromycin resistance gene cassette (Puro cassette) was designed to have a sequence structure consisting of FRT sequence-PGK promoter (PPGK) -puromycin resistance gene (Puro R ) -lox2272 sequence.
  • the Puro cassette was amplified as a 1.5 kb fragment by PCR using plasmid p04 (provided by Yoshimi Araki) as a template and the following oligonucleotide pairs. Thereafter, restriction enzyme recognition sites artificially added to the 5′- and 3′-ends were cleaved with Hind III and Kpn I.
  • the oligonucleotide cassette for Puro cassette amplification was designed to have the following sequences as shown in SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively. Among the above sequences, the underlined portion is a restriction enzyme recognition sequence.
  • This example relates to the construction of an acceptor ES cell that can be mutated into the KCNQ2 gene.
  • acceptor ES cells were constructed as follows (see FIG. 7). Mouse ES cells were subcultured into two dishes, and semi-confluent mouse ES cells (feeder-free KPTU strain) were detached from the dish by trypsin treatment and suspended in PBS to a total volume of 1.6 ml. To this, 20 ⁇ g of the target recombinant vector prepared in Example 1 linearized was added, cooled on ice for 10 minutes, and transferred equally to two electroporation cuvettes, and Gene Pulser (Bio-Rad) was transferred. The DNA was introduced by discharging each time under the conditions of 0.8 kV and 3.0 ⁇ F.
  • the target recombinant vector was introduced into mouse ES cells by electroporation, and the sequence element was introduced into the KCNQ2 locus on the chromosome by target recombination.
  • a mouse ES cell line into which such a sequence factor has been introduced has neomycin (G418) so that only cells into which the target recombinant vector containing the neomycin resistance gene (Neo R ) has been stably inserted can survive.
  • Mouse ES cells were cultured and selected according to the contained medium.
  • the mouse ES cell line into which such a sequence factor has been introduced is obtained by suspending cells after electroporation in 60 ml of KSR-GMEM medium, cultivating them in six equal portions, and cultivating 200 ⁇ g / ml after 24 hours.
  • the medium was replaced with a G418-containing medium, and then the G418-containing medium was changed once every two days, followed by culturing for 7 days.
  • cells in which the target recombinant vector was inserted at a position other than the KCNQ2 locus by non-homologous recombinant cells were excluded by lethal toxin expressed from the DT-A gene arranged outside the long arm region.
  • homologous recombinant ES cells were isolated and selected from the ES cells that survived in the G418-containing medium and formed colonies as described above. As a result of selecting ES cells with the G418-containing medium as described above, a total of about 500 ES cells survived and formed colonies in the G418-containing medium. Of these cells, 144 cells were isolated and cultured as candidates for cells that had undergone targeted homologous recombination, DNA was extracted from them, and the extracted DNA was used for selection by PCR.
  • This PCR is performed by using an oligonucleotide pair for amplification between the Neo resistance gene-short arm region downstream side having the following sequence for detecting homologous recombination, and the 3 'end portion of the Neo resistance gene and the short arm of the target recombination vector.
  • a reaction was carried out to amplify a 2.0 kb fragment between the KCNQ2 gene partial sequence adjacent to the downstream side of the 3 ′ end of the region.
  • amplification products were confirmed in 9 clones.
  • the oligonucleotide pair for amplification between the Neo resistance gene-short arm region downstream side was designed to have the following base sequence as shown in SEQ ID NOs: 15 and 16.
  • the primer pair for amplification between the DT-A gene and the long arm upstream side for detection of heterologous recombination was designed to have the following sequences as shown in SEQ ID NOs: 17 and 18.
  • the primer pair for exon 6 peripheral region amplification / loxKR3 sequence introduction was designed to have the following sequences as shown in SEQ ID NOs: 19 and 20.
  • the underlined portion indicates a restriction enzyme recognition sequence
  • the box indicates a loxKR3 sequence
  • the Gothic character indicates a mutation substitution site.
  • the Y284C mutagenesis primer pair was designed to have the following sequences as shown in SEQ ID NOs: 21 and 22.
  • the A306A mutagenesis primer pair was designed to have the following sequences as shown in SEQ ID NOS: 23 and 24.
  • the mutant acceptor ES cell line clone prepared and isolated in Example 3 was co-pumped with the mutagenesis vector obtained in Example 2 and the Cre recombinase expression vector by electroporation under the conditions of 400 V and 125 ⁇ F. Then, whether or not the mutated sequence was introduced between the two lox sequences of the KCNQ2 gene on the chromosome, and the mutated mutant ES cells were selected and isolated by the puromycin resistance gene. That is, the cells after electroporation as described above are suspended in 60 ml of KSR-GMEM medium, cultured in six 10 cm dishes, and after 24 hours, cultured in a medium containing 2 ⁇ g / ml puromycin. Exchanged. Thereafter, the puromycin-containing medium was changed once every two days and cultured for 7 days to confirm that colonies were formed only in the cells in which the two lox sequences were replaced with the mutant gene sequences (FIG. 8). reference).
  • the KCNQ2 mutant ES cells obtained above were isolated and confirmed.
  • a plurality of puromycin-resistant cell lines that formed colonies as described above were isolated and cryopreserved as candidates for KCNQ2 mutant ES cells.
  • DNA was extracted from a part of the cells, the region containing the mutation was amplified by PCR, and the introduction of the mutation was confirmed by determining the nucleotide sequence.
  • KCNQ2 mutant ES cells established as described above were injected into mice to produce knock-in mice according to a conventional method. That is, KCNQ2 mutant ES cell clones were aggregated with mulberry embryos derived from ICR mice and cultured overnight, and then mixed embryos in which ES cells and mulberry embryos were aggregated were selected. This chimeric embryo was transplanted into the uterus of a pseudopregnant female (temporary parent). From the offspring born about 17 days later, a chimeric mouse having a coat color of KCNQ2 cell-derived tissue was selected.
  • variable mutagenesis vector according to the present invention can be applied to mutations in any gene, and can quickly produce knock-in non-human mammals such as knock-in mice having a mutant gene into which a desired gene mutation has been introduced. can do.
  • knock-in non-human mammal of the present invention can greatly contribute to researches such as the elucidation of the cause and development of all diseases, a great contribution can be expected particularly in the medical field.

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Abstract

　この発明の遺伝子変異導入方法は、変異導入対象の標的遺伝子と標的組換えべクターとの相同組換えによって標的遺伝子の変異導人対象エキソンと標的組換えべクターの標的ＤＮＡ配列とを置換する相同組換え工程と、得られた組換え済み標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列を、変異エキソンを含む変異ＤＮＡ配列を持つ変異導人ベクターの変異導入カセットとのＣｒｅリコンビナーゼの介在作用による特異的組換えにより、変異導入カセットの変異ＤＮＡで置換して、変異ＤＮＡ配列を導入した変異導入遺伝子を得る変異導入工程からなっている。さらに、この発明は、この変異導入遺伝子を持つノックインマウスなどのノックイン非ヒト動物を作出できる。

Description

変異遺伝子導入方法、変異導入遺伝子、変異導入カセットならびに変異導入ベクターおよびノックイン非ヒト哺乳動物
　この発明は、変異遺伝子導入方法、変異導入遺伝子、変異導入カセットならびに変異導入ベクターおよびノックイン非ヒト哺乳動物に関するものである。更に詳細には、この発明は、標的遺伝子に、所望の変異遺伝子ＤＮＡを簡便かつ迅速に、その上高確率で導入することができる変異遺伝子導入方法、変異導入遺伝子、その作製方法、変異導入カセットならびに変異導入ベクターおよび変異導入遺伝子を有するノックイン非ヒト哺乳動物に関するものである。
　生物は、遺伝子という遺伝情報を保持する「設計図」によって、その生命を維持するためのあらゆる機能が制御されていると言っても過言ではない。この遺伝子の全ての遺伝情報は、ＤＮＡと言われる４塩基からなる塩基対の組合せによって制御されている。この塩基対の組合せに何らかの原因で異変が発生して遺伝子に変異が生じると、その遺伝情報が正常に機能しなくなり、様々な疾患などを発症することになる。
　例えば、ヒトの疾患の起因や発症などのメカニズムを解明するためには、ヒトの体内でどの遺伝子がかかる疾患の起因や発症などの発現に関与しているかを調べることが重要である。しかしながら、ヒトの生体を利用して疾患の起因や発症などの発現に関与している遺伝子を調べることは不可能であり、またヒトの組織を使用して直接調べることも倫理上問題である。
　ところが、ヒトを含む動物のゲノム解析が進んだ結果、ヒトゲノムは、マウスなどの実験動物のゲノムと大部分が共通していて、ヒトと類似した生理機能を持っていることが判ってきている。そこで、ヒトの遺伝子変異をマウスなどの実験動物の遺伝子に導入して、その遺伝子変異に関与する遺伝子を発現することができれば、その遺伝子発現による実験動物の生理機能のメカニズムなどを解明することで、ヒトの遺伝子機能を調べることができることになる。当然のことながら、実験動物は、ヒトとは異なる生理機能を有しているので、その動物実験から得られた結果をそのままヒトに応用することはできない。そこで、その動物実験から得られた結果をヒトに応用することができるように、実験動物の内在性遺伝子をヒトの遺伝子に改変して、ヒトの疾患などのメカニズムを解明するための遺伝子改変モデル動物が作出されている。
　遺伝子改変モデル動物としては、例えば、代謝酵素や受容体などの遺伝子を欠損させたノックアウトマウス等のノックアウト動物、マウスなどの実験動物の内在性遺伝子にヒトの外来遺伝子を導入したノックイン動物などが知られている。現在では、様々な疾患に関わる遺伝子を改変した遺伝子改変モデル動物が作出されている。
　遺伝子ノックアウト動物は、その本来の特定遺伝子の全部もしくは一部が破壊、欠損、置換などの改変がされて、その遺伝子の発現が抑制され、その機能を発揮できないように作出されたモデル動物である。ノックアウト動物は、その本来の特定遺伝子が改変されて、その変異遺伝子に対応するタンパク質は産生されないことから、その遺伝子および遺伝子産物の機能の調査、あるいは重要性の評価のために非常に有用な実験系である。しかし、ヒトの一般的な遺伝子疾患の大部分は遺伝子全体の欠失ではなく点変異によるアミノ酸置換等に起因するものであり、そのような遺伝子異常のモデルとしてノックアウト動物は適切ではない。
　一般的なトランスジェニック動物では、変異遺伝子を数ｋｂのコアプロモーター配列の制御下で発現させ、また、変異遺伝子が挿入される染色体上の部位が予測できないため、移入した遺伝子が期待通りに発現しない場合が頻繁に起こり、かかるトランスジェニック動物による遺伝子機能の解析、病態モデル開発の大きな障害になってきた。このようにトランスジェニック動物を使用した動物実験には問題があるとしても、トランスジェニック動物は、短期間で作出でき実験結果を早く評価することができることから、非常に多くの研究に現在利用されている。
　一方、ノックイン動物においては、その動物が本来内在して持つ正常遺伝子を外来の変異遺伝子で置換することから、その外来遺伝子に由来する変異タンパク質は、その動物に本来内在している正常タンパク質の影響を受けにくいといえる。すなわち、その外来遺伝子についての実験結果は、その外来遺伝子本来の機能に由来しているものと考えられる。
　しかしながら、ノックイン動物は、遺伝子ターゲッテイングを利用してＥＳ細胞から作出されることから、外来変異遺伝子を内在性のプロモーター活性で正確に発現させることができるので、目的の動物モデルを確実に作出することができるという利点もある。
　このことから、遺伝子疾患の病態をより忠実に模倣し突然変異の影響を正しく評価するためには、ノックイン動物がノックアウト動物よりも有利であると言える。しかしながら、このノックイン動物の作出方法は確立しているものの、ノックイン動物を作出するには、その作出手法が煩雑で、作出には１．５~２年という長期間と、多額の費用を必要とするという問題がある。つまり、これまでノックイン動物は、標的遺伝子と標的組換えベクターとの相同組換えにより標的遺伝子の遺伝子ＤＮＡを、外来遺伝子ＤＮＡで相同組換えをして置換することによって作出されてきた。しかしながら、このノックイン動物の作出方法は、この相同組換えにより標的遺伝子の遺伝子ＤＮＡへ所望の外来遺伝子ＤＮＡを相同組換えされる確率が約１０−５以下と非常に低いという大きな欠点がある。そこで、ノックイン動物を簡便にかつ短期間に作出できる手法の開発が要請されている。
　そこで、本発明者らは、マウスなどの細胞や遺伝子操作のための最も有用なツールの一つであるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステム（非特許文献１−６）に着目して、ノックイン動物を簡便にかつ短期間に作出できる手法の開発を試みた。このＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムは、２個のｌｏｘＰ部位に挟まれたＤＮＡ部分を組換え酵素リコンビナーゼＣｒｅ（ｃｙｃｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）によって切除することができるシステムである。このＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムの２個のｌｏｘＰ部位間に外来遺伝子などのＤＮＡを挿入すると、ＣｒｅリコンビナーゼによるｌｏｘＰ配列の切断・組換え（ｃｙｃｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）事象により、その挿入ＤＮＡが削除されることになる。
　本発明者らは、このような性質を持つＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用して、外来ＤＮＡを効率的に導入することができるように、ＤＮＡを挟んでいる２個のｌｏｘＰ配列の一方もしくは両方を変異させて、Ｃｒｅリコンビナーゼがそのｌｏｘ配列を認識できないようにまたは認識し難いようにするとともに、組換えによって２個のｌｏｘ配列に挟まれている外来ＤＮＡ配列部位が削除されずに挿入されるように工夫した（例えば、非特許文献６~８ならびに特許文献１、２参照）。つまり、Ｃｒｅリコンビナーゼは、塩基対を形成するｌｏｘＰの２本鎖の一方または両方に、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかに変異を導入した変異ｌｏｘ配列が存在すれば、その中央部のスペーサ配列を切断・結合することができる。その結果、その２個のｌｏｘ配列に挟まれていた外来ＤＮＡ配列部位が組み換えられて挿入されることになる。
　このような変異型ｌｏｘＰ配列を利用して、ＤＮＡや発光遺伝子等のレポーター遺伝子などの外来遺伝子を導入したトラップベクター（例えば、特許文献１参照）と共に、かかるトラップベクターを導入したノックアウト動物を作出する手法（例えば、特許文献２参照）が考案されている。また、変異型ｌｏｘＰ配列であるｌｏｘ７１配列を導入したアクセプターベクターと別の変異型ｌｏｘＰ配列であるｌｏｘ６６配列を導入したドナーベクターの変異ｌｏｘ配列同士、またアクセプターベクターとドナーベクターのｌｏｘＰ配列同士がＣｒｅリコンビナーゼによる組換えにより、ドナーベクターのｌｏｘ６６配列とｌｏｘＰ配列との間に導入した外来ＤＮＡをゲノムに安定的に挿入する技術も考案されている（例えば、特許文献３参照）。しかし、これらの先行技術はいずれも、相同組換えを起こす確率を改善させる方法ではなく、従来通りの非常に低い相同組換え確率で外来ＤＮＡを相同組換えによって導入する手法には変わりはなかった。
Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５１６６−５１７０，１９８８ Ｇｕ，Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７３，１１５５−１１６４，１９９３ Ａｒａｋｉ，Ｋ．，Ｉｍａｉｚｕｍｉ，Ｋ．，Ｏｉｋｅ，Ｙ．ａｎｄ　Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１２２，９７７−９８２，１９９７ Ｌａｋｓｏ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，６２３２−６２３６，１９９２ Ｒｏｓａｎｔ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．，１，５９２−５９４，１９９５ Ａｒａｋｉ，Ｋ．，Ａｒａｋｉ，Ｍ．，ａｎｄ　Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２００２，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．１９　ｅ１０３ Ａｌｂｅｒｔ，Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｊ，７，６４９−６５９，１９９５ Ａｒａｋｉ，Ｋ．，Ａｒａｋｉ，Ｍ．ａｎｄ　Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２５，８６８−８７２，１９９７ 国際公開番号ＷＯ０１／０５９８７Ａ１号公報 特開２００２−３４５４７７号公報 特開２００６−３３３７４２号公報
　そこで、本発明者らは、標的遺伝子に外来遺伝子変異を高確率で導入することができる技術を確立すべく鋭意研究した結果、外来変異遺伝子ＤＮＡを導入したい標的遺伝子と、該変異遺伝子ＤＮＡを含む標的組換えベクター（ターゲテイングベクター）との相同組換えによって得られた組換え済み標的遺伝子を、導入対象の変異遺伝子ＤＮＡを含むように作製した変異導入カセットを含む標的導入ベクターを用いてＣｒｅ−変異ｌｏｘシステムを介在させて組換えることによって標的遺伝子に外来遺伝子の遺伝子変異を高確率で簡便にかつ迅速に導入することができることを見出すとともに、かかる変異導入カセットを利用することによって、標的遺伝子の種類に関係なく、あらゆる変異遺伝子を導入することができることを見出して、この発明を完成した。また、この遺伝子変異導入方法を利用すると、非ヒト哺乳動物のノックイン動物、特にマウスを短期間にかつ簡便に作出できることを見出して、この発明を完成した。
　したがって、この発明は、標的遺伝子の種類に関係なく、標的遺伝子に変異導入カセットとＣｒｅ−変異ｌｏｘＰシステムとを利用して外来遺伝子の変異を高確率で導入することができる遺伝子変異導入方法を提供することを目的としている。
　この発明は、染色体上の組換え済み標的遺伝子に含まれる標的ＤＮＡ配列と、変異導入ベクターの変異導入カセットによって、変異導入カセットに含まれる変異導入ＤＮＡ配列領域とを、Ｃｒｅレコンビナーゼの介在作用によって組換えて導入する遺伝子変異導入方法を提供することを目的としている。
　この発明は、好ましい態様として、標的遺伝子と標的組換えベクターとの相同組換えによって変異導入対象の組換え済み標的遺伝子を得ることからなる遺伝子変異導入方法を提供することを目的としている。
　この発明は、さらに好ましい態様として、変異導入ベクターの変異導入カセットが、第３変異ｌｏｘ配列と第４変異ｌｏｘ配列との対に挟まれた変異ＤＮＡ配列と第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列とを含む変異導入ＤＮＡ配列を含むことからなる遺伝子変異導入方法を提供することを目的としている。
　この発明は、さらに好ましい態様として、変異導入ベクターの変異導入カセットに含まれる第３変異ｌｏｘ配列と第４変異ｌｏｘ配列との対に挟まれた変異ＤＮＡ配列が、Ｃｒｅレコンビナーゼの介在作用によって、組換え済み標的遺伝子に含まれる第１変異ｌｏｘ配列と第２変異ｌｏｘ配列との対で挟まれた標的ＤＮＡ配列と組換わることからなる遺伝子変異導入方法を提供することを目的としている。
　この発明は、さらに好ましい態様として、各変異ｌｏｘ配列が、ｌｏｘＰ配列のスペーサー配列またはその５’側反復繰り返し配列もしくは３’側反復繰り返し配列に変異をそれぞれ有する変異ｌｏｘ配列、例えばｌｏｘ７１、ｌｏｘ２２７２ならびにｌｏｘＫＲ３などであることからなる遺伝子変異導入方法を提供することを目的としている。
　この発明は、さらに好ましい態様として、組換え済み標的遺伝子と変異導入ベクターの変異導入カセットとの組換えにより得られた変異導入遺伝子が、例えばｌｏｘ７１／ＫＭＲ３などの第５変異ｌｏｘ配列と、例えばｌｏｘ２２７２などの第６変異ｌｏｘ配列との対で挟まれた変異ＤＮＡ配列を含むことからなる遺伝子変異導入方法を提供することを目的としている。
　この発明は、さらに好ましい態様として、標的遺伝子と標的組換えベクターとの相同組換えによって、標的遺伝子の第１ＤＮＡ配列領域を、標的組換えベクターの第２ＤＮＡ配列領域と相同組換えして、第１ＤＮＡ配列領域に含まれる変異導入対象エキソンを、第２ＤＮＡ配列領域に含まれる標的ＤＮＡ配列で組換えて組換え済み標的遺伝子を得ることからなる組換え工程と、組換え済み標的遺伝子の第３ＤＮＡ配列領域に含まれる第１変異ｌｏｘ配列と第２変異ｌｏｘ配列の対と、その対で挟まれた変異標的ＤＮＡ配列領域とを、Ｃｒｅレコンビナーゼと１対の変異型ｌｏｘ配列からなるＣｒｅ−変異ｌｏｘシステムの介在作用によって、変異導入カセットで組換えて変異導入ＤＮＡ配列領域を導入した変異導入遺伝子を得る変異導入工程と、からなる遺伝子変異導入方法を提供することを目的としている。
　この発明は、さらに好ましい別の態様として、変異導入カセットならびに変異導入遺伝子に含まれる変異ＤＮＡ配列が変異エキソンである遺伝子変異導入方法を提供することを目的としている。
　この発明は、さらに好ましい別の態様として、標的遺伝子がヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）関連電位依存性カリウムチャンネルＫＣＮＱ２サブユニットの遺伝子由来であり、また標的遺伝子の標的変異が遺伝子ＫＣＮＱ２のＹ２８４Ｃ（配列番号１および２）またはＴ３０６Ａ（配列番号３および４）であることからなる遺伝子変異導入方法を提供することを目的としている。
　この発明は、別の形態として、上記遺伝子変異導入方法によって標的遺伝子に遺伝子変異を導入して変異導入遺伝子を作製することからなる変異導入遺伝子の作製方法を提供することを目的としている。
　この発明は、さらに別の形態として、第５変異ｌｏｘ配列と第６変異ｌｏｘ配列との対で挟まれた変異エキソンを含む変異ＤＮＡ配列を含む変異導入遺伝子を提供することを目的としている。
　この発明は、さらに別の形態として、第３変異ｌｏｘ配列と第４変異ｌｏｘ配列との対で挟まれた変異エキソンを含む変異ＤＮＡ配列を含み、かつ、可変式である変異導入カセットを提供することを目的としている。
　この発明は、さらにその別の形態として、上記変異導入カセットを含む変異導入ベクターを提供することを目的としている。
　この発明は、さらに別の形態として、変異導入遺伝子が、例えば、ヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）関連電位依存性カリウムチャンネルの遺伝子ＫＣＮＱ２サブユニット由来である遺伝子の変異遺伝子、例えば、ＫＣＮＱ２のＹ２８４ＣまたはＴ３０６Ａであることからなる変異遺伝子導入ＥＳ細胞を提供することを目的としている。
　この発明は、さらに別の形態として、上記変異導入遺伝子が、例えば、ヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）関連電位依存性カリウムチャンネルの遺伝子ＫＣＮＱ２サブユニット由来である遺伝子の変異遺伝子、例えば、ＫＣＮＱ２のＹ２８４ＣまたはＴ３０６Ａを有する特にマウスなどのノックイン非ヒト哺乳動物を提供することを目的としている。
　上記目的を達成するために、この発明は、染色体上の標的遺伝子に含まれる互いに異なる第１変異ｌｏｘ配列と第２変異ｌｏｘ配列との対で挟まれた標的ＤＮＡ配列と、変異導入ベクターの変異導入カセットによって、変異導入カセットに含まれる第３変異ｌｏｘ配列と第４変異ｌｏｘ配列との対で挟まれた変異ＤＮＡ配列とを、Ｃｒｅレコンビナーゼの介在作用によって組換えて導入することからなる遺伝子変異導入方法を提供する。
　この発明は、その好ましい態様として、組換え済み標的遺伝子が、標的遺伝子と標的組換えベクターとの相同組換えで得られた組換え遺伝子であって、第１変異ｌｏｘ配列および第２変異ｌｏｘ配列の対で挟まれた標的ＤＮＡ配列を含んでいることからなる遺伝子変異導入方法を提供する。
　この発明は、さらに好ましい態様として、変異導入ベクターの変異導入カセットが、第３変異ｌｏｘ配列と第４変異ｌｏｘ配列との対で挟まれた変異ＤＮＡ配列と第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列とを含むことからなる遺伝子変異導入方法遺伝子変異導入方法を提供する。
　この発明は、さらに好ましい態様として、変異導入ベクターの変異導入カセットに含まれる第３変異変異ｌｏｘ配列（５２）と第４変異変異ｌｏｘ配列（５６）との対で挟まれた変異ＤＮＡ配列が、Ｃｒｅレコンビナーゼの介在作用によって、組換え済み標的遺伝子に含まれる第１変異ｌｏｘ配列と第２変異ｌｏｘ配列との対で挟まれた標的ＤＮＡ配列と組換わることからなる遺伝子変異導入方法を提供する。
　この発明は、さらに好ましい態様として、第１変異ｌｏｘ配列がｌｏｘＰ配列の５’側反復繰り返し配列に変異が存在する変異ｌｏｘ配列、例えばｌｏｘ７１であり、第２変異ｌｏｘ配列がｌｏｘＰ配列のスペーサー配列に変異が存在する変異ｌｏｘ配列、例えばｌｏｘ２２７２であること、および第３変異ｌｏｘ配列がｌｏｘＰ配列の３’側反復繰り返し配列に変異が存在する変異ｌｏｘ配列、例えばｌｏｘＫＲ３であり、第４変異ｌｏｘ配列がｌｏｘＰ配列のスペーサー配列に変異が存在する変異ｌｏｘ配列、例えばｌｏｘ２２７２であることからなる遺伝子変異導入方法を提供する。
　この発明は、さらに好ましい態様として、組換え済み標的遺伝子と変異導入ベクターの変異導入カセットとの組換えにより得られた変異導入遺伝子が、第１変異ｌｏｘ配列ならびに第２変異ｌｏｘ配列の対と、第３変異ｌｏｘ配列ならびに第４変異ｌｏｘ配列の対とのそれぞれの組換えによって得られる第５変異ｌｏｘ配列、例えばｌｏｘ７１／ＫＭＲ３、と第６変異ｌｏｘ配列、例えばｌｏｘ２２７２との対で挟まれた変異導入ＤＮＡ配列領域を含み、ならびに該変異導入ＤＮＡ配列領域が変異ＤＮＡ配列と第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列を含むことからなる遺伝子変異導入方法を提供する。
　この発明は、さらに好ましい態様として、遺伝子変異導入方法が、標的遺伝子に外来変異遺伝子を導入する遺伝子変異導入方法であって、標的遺伝子（１０）と標的組換えベクター（２０）との相同組換えによって、標的遺伝子（１０）の第１ＤＮＡ配列領域（１０ａ）を、標的組換えベクター（２０）の第２ＤＮＡ配列領域（２０ａ）と相同組換えして、第１ＤＮＡ配列領域（１０ａ）に含まれる変異導入対象エキソン（１２）を、第２ＤＮＡ配列領域（２０ａ）に含まれる標的ＤＮＡ配列（３２）で組換えて組換え済み標的遺伝子（４０）を得ることからなる相同組換え工程と、組換え済み標的遺伝子（４０）の第３ＤＮＡ配列領域（４０ａ）に含まれる第１変異ｌｏｘ配列（３０）と第２変異ｌｏｘ配列（３６）の対と、その対で挟まれた変異標的ＤＮＡ配列領域（３５）とを、Ｃｒｅレコンビナーゼと１対の変異型ｌｏｘ配列からなるＣｒｅ−変異ｌｏｘシステムの介在作用によって、変異導入ベクター（５０）の変異導入カセット（５１）で（特異的）組換えにて変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）を導入した変異導入遺伝子（６０）を得る変異導入工程と、からなる遺伝子変異導入方法とからなり、
　標的組換えベクター（２０）が、ネガティブ選択マーカーＤＮＡ配列（２２）と、第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）と、標的ＤＮＡ配列領域（２６）と、第２相同組換えＤＮＡ配列領域（３４）とを含むこと、および標的ＤＮＡ配列領域（２６）が、第１変異ｌｏｘ配列（３０）と、標的ＤＮＡ配列（３２）と、第１ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（３４）と、第２変異ｌｏｘ配列（３６）と、ポリＡ付加配列（３８）とを含み、ならびに第１および第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２２、２８）が相同組換えに必要なＤＮＡ配列の長さを有すること；
　組換え済み標的遺伝子（４０）の第３ＤＮＡ配列領域（４０ａ）が、第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）と、第１変異ｌｏｘ配列（３０）と、変異標的ＤＮＡ配列領域（３５）と、第２変異ｌｏｘ配列（３６）と、第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２８）とを含み、および変異標的ＤＮＡ配列領域（３５）が、標的ＤＮＡ配列（３２）と、第１ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（３４）とを含むこと；
　変異導入ベクター（５０）の変異導入カセット（５１）が、第３変異ｌｏｘ配列（５２）と、変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）と、第２変異ｌｏｘ配列（５６）と、を含み、ならびに変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）が変異ＤＮＡ配列（５７）と、第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）とを含むこと；および
　変異導入遺伝子（６０）が、第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）と、第５変異ｌｏｘ配列（６２）と、変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）と、第６変異ｌｏｘ配列（６６）と、第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２８）と、を含み、ならびに変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）が、変異ＤＮＡ配列（５７）と、第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）とを含むこと、
からなる遺伝子変異導入方法を提供する。
　この発明は、さらに好ましい態様として、変異導入ベクターの変異導入カセットまたは変異導入遺伝子に含まれる変異ＤＮＡ配列が変異エキソンを含むことからなる遺伝子変異導入方法を提供する。
　この発明は、さらに好ましい別の態様として、標的遺伝子がヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）関連電位依存性カリウムチャンネルＫＣＮＱ２サブユニットの遺伝子由来に、変異遺伝子として、遺伝子ＫＣＮＱ２のＹ２８４Ｃ（配列番号１および２）またはＴ３０６Ａ（配列番号３および４）を導入することからなる遺伝子変異導入方法を提供する。
　この発明は、さらに別の形態として、上記遺伝子変異導入方法によって標的遺伝子に遺伝子変異を導入して変異導入遺伝子を作製することからなる変異導入遺伝子の作製方法を提供する。
　この発明は、さらに別の形態として、第１相同組換えＤＮＡ配列領域と、第５変異ｌｏｘ配列と、変異導入ＤＮＡ配列領域と、第６変異ｌｏｘ配列と、第２相同組換えＤＮＡ配列領域と、を含み、ならびに変異導入ＤＮＡ配列領域が、変異ＤＮＡ配列と、第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列とを含み、かつ、第５変異ｌｏｘ配列と第６変異ｌｏｘ配列との対で挟まれている変異導入遺伝子であることからなる変異導入遺伝子を提供する。
　この発明は、好ましい態様として、第５変異ｌｏｘ配列と第６変異ｌｏｘ配列との対が、第１変異ｌｏｘ配列と第２変異ｌｏｘ配列との対と、第３変異ｌｏｘ配列と第４変異ｌｏｘ配列との対との組換えによって得られることからなる変異導入遺伝子を提供する。
　この発明は、さらに別の形態として、第３変異ｌｏｘ配列、例えばｌｏｘＫＲ３と第４変異ｌｏｘ配列、例えばｌｏｘ２２７２との対およびその対で挟まれた変異ＤＮＡ配列ならびに第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列とを含み、かつ、可変式である変異導入カセットを提供する。
　この発明は、さらに別の形態として、上記変異導入カセットを含む変異導入ベクターを提供する。
この発明は、さらに別の形態として、上記変異導入遺伝子が導入されている非ヒト哺乳動物、特にマウスを提供する。さらに、この発明の好ましい態様として、変異遺伝子がヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）関連電位依存性カリウムチャンネルの遺伝子ＫＣＮＱ２サブユニット由来であり、また変異遺伝子が変異遺伝子ＫＣＮＱ２のＹ２８４ＣまたはＴ３０６Ａであることからなるノックインマウスなどのノックイン非ヒト動物を提供する。
標的遺伝子の配列構成と、標的ＤＮＡ配列（３２）を含む標的組換えベクター（２０）の配列構成とを示す模式図。 標的遺伝子と標的組換えベクターとの相同組換えにより得られる組換え済み標的遺伝子の配列構成を示す模式図。 変異導入ベクターに含まれる変異導入カセットの配列構成と、組換え済み標的遺伝子と変異導入カセットとが、Ｃｒｅ−変異ｌｏｘ配列システムによる介在作用により組み換えられて遺伝子変異が導入された変異導入遺伝子の配列構成を示す模式図。 ヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）関連電位依存性カリウムチャンネルＫＣＮＱ２サブユニット由来の遺伝子である標的遺伝子と、相同組換えするためのターゲテイングベクターの配列構成を示す模式図。 標的遺伝子ＫＣＮＱ２と、そのターゲテイングベクターの配列構成および変異遺伝子として変異Ｙ２８４ＣまたはＴ３０６Ａを含む変異導入ベクターの配列構成を示す模式図。 変異ＤＮＡ配列としての遺伝子ＫＣＮＱ２の変異Ｙ２８４ＣおよびＴ３０６Ａを含む変異導入ベクターの配列構成を示す模式図。 この発明の標的組換えベクターをマウスＥＳ細胞に導入してＫＣＮＱ２遺伝子ＤＮＡ配列部分を導入したのマウスＥＳ細胞の作製手順を示す図。 図７で作製したマウスＥＳ細胞と変異導入ベクターとの相同組換えによりＫＣＮＱ２遺伝子の変異ＤＮＡ配列部分が導入されたマウス変異ＥＳ細胞の作製手順を示す図。 図８で作製したマウス変異ＥＳ細胞から変異ノックインマウスを作出する手順を示す図。
　この発明は、標的遺伝子に遺伝子変異を導入する遺伝子変異導入方法に関する。この発明の遺伝子変異導入方法は、２段階で、標的遺伝子に含まれる遺伝子としての機能を有する変異導入対象エキソン（つまり標的ＤＮＡ配列）に、外来変異遺伝子の対応変異ＤＮＡ配列を導入することを特徴としている。
　この発明に係る遺伝子変異導入方法の第１段階は、標的遺伝子の変異導入の標的とする変異導入対象エキソンＤＮＡ配列（標的ＤＮＡ配列）を、目的とする遺伝子変異を導入できるように組換えた組換え済み標的遺伝子を得る相同組換え工程である。その第２段階は、第１段階で得られた組換え済み標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列を、変異導入ベクター（つまりターゲテイングベクター）を用いて目的とする変異ＤＮＡ配列と置換する組換え（特異的組換え）工程である。
　この発明の遺伝子変異導入方法の相同組換え工程では、まず、染色体上の標的遺伝子を、その標的ＤＮＡ配列が目的とする外来変異ＤＮＡ配列と効率よく組換えできるように構築するために、その標的ＤＮＡ配列部分を挟むように互いに異なる第１変異ｌｏｘ配列と第２変異ｌｏｘ配列との対を配置して組み換え改変する。この組換え改変方法は、当該技術分野で公知の方法であれば、いずれも使用することができるが、一般的には、標的遺伝子と標的組換えベクター（つまりターゲテイングベクター）との相同組換えにより、標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列領域を組換えて構築するのがよい。
　そこで、この発明の遺伝子変異導入方法の第１段階の組換え工程においては、ターゲテイングベクターといわれる標的組換えベクターを用いた相同組換え法、いわゆるジーンターゲテイング法を用いて、標的遺伝子を組換え改変するのがよい。この相同組換え法は、変異導入の標的となる標的ＤＮＡ配列を含む標的組換えベクター、つまりターゲテイングベクターを、エレクトロポレーションなどの慣用のベクター導入技術でマウスＥＳ細胞などに常法に従って導入することによって実施することができる。ただし、この相同組換え法による相同組換えは、その組換え確率が０．０１％以下という非常に低いという欠点がある。
　そこで、この発明においては、この相同組換え法の欠点を補完するために、この発明の遺伝子変異導入方法の第２段階の特異的組換え工程を以下のような構成にすることによって、目的とする遺伝子変異を導入した変異導入遺伝子を非常に高い確率でかつ短期間で所望の遺伝子変異を導入できる。
　この発明の遺伝子変異導入方法の第２段階の組換え工程は、上記のように組換え改変した組換え済み標的遺伝子を、変異導入ベクターを用いてさらに組み換えて、組換え済み標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列を、変異導入ベクターに含まれる変異ＤＮＡ配列で特異的に組み換えることからなっている。この組換え工程によって、変異導入ベクターに含まれる変異ＤＮＡ配列を、組換え済み標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列とほぼ１００％という極めて高い組換え確率で導入できる。つまり、この発明は、変異導入ベクター、特に変異導入カセットを工夫して、組換え済み標的遺伝子に標的ＤＮＡ配列を導入して、目的とする変異ＤＮＡ配列を高確率にかつ迅速に導入できるように構築しているのも大きな特長である。
　この発明の遺伝子変異導入方法を以上のように２段階で実施することによって、この発明は、遺伝子の種類に関係なくあらゆる遺伝子に適用できるという極めて大きな特長を有している。この発明では、第１段階で、変異導入対象の標的遺伝子の変異導入対象エキソン（標的ＤＮＡ配列）を標的組換えベクターによって組換え改変して組換え済み標的遺伝子を一旦作製しておけば、次の第２段階で、その組換え済み標的遺伝子の変異導入対象エキソンに、目的とする遺伝子変異を含む変異導入カセットを導入した変異導入ベクターによって、その遺伝子変異を極めて高確率でかつ迅速に組み換えて導入することができることになる。換言すると、この発明では、その第１段階での組換え済み標的遺伝子の作製を従来技術の相同組換え法で実施することから、その組換え済み標的遺伝子の組換え確率が非常に低いとしても、かかる組換え済み標的遺伝子を一旦作製しておけば、次の第２段階で、目的とする遺伝子変異を含む変異導入カセットを含む変異導入ベクターによって、その遺伝子変異を極めて高確率でかつ迅速に組み換えて導入することができることから、目的とする遺伝子変異を代えてもその遺伝子変異を含む変異導入カセットを極めて短期間に作製することができことから、その遺伝子変異を迅速に、短期間にかつ高確率で導入することができることになる。さらに、目的とする遺伝子変異を含む変異導入カセットおよびその変異導入カセットを含む変異導入ベクターの作製は、従来方法によって迅速にかつ短期間に作製することができることから、最終的には、目的とする遺伝子変異を代えた遺伝子導入遺伝子を持つノックイン動物を迅速にかつ短期間に、その上極めて高い確率で作製することができることになる。
　したがって、この発明は、遺伝子の種類に関係なくあらゆる遺伝子に適用できることから、その標的遺伝子が、例えばてんかん関連遺伝子やがん関連遺伝子などの疾患関連遺伝子であっても、その他のあらゆる遺伝子であっても実質的に同様に適用することができ、所望の遺伝子変異を導入した変異導入遺伝子を高確率でかつ短期間に作製することができるという極めて大きな特長がある。また、同様に、この発明は、あらゆる標的遺伝子の遺伝子としての機能を有するあらゆるＤＮＡ配列、つまりエキソンＤＮＡ配列に対しても変異ＤＮＡ配列を実質的に同様に導入できるという大きな特長がある。
　以下、この発明を図１~６を参照しながら詳細に説明する。なお、この発明は、図面に表現された形態や態様などに一切限定されるものではなく、また図面はこの発明を限定する意図で表現されたものでは一切ないことも理解されるべきである。さらに、図面に表現されている形態や態様などから派生するあらゆる改良や修飾なども全てこの発明に包含されるものと理解されるべきである。
　そこで、図１は、遺伝子変異を導入する標的遺伝子（１０）の配列構成と、標的遺伝子（１０）との相同組換えにより組み換えられる標的ＤＮＡ配列（３２）を含む標的組換えベクター（２０）の配列構成とを示す模式図である。図２は、標的遺伝子（１０）と標的組換えベクター（２０）との相同組換えにより得られる組換え済み標的遺伝子（４０）の配列構成を示す模式図である。図３は、この発明に係る変異導入ベクター（５０）に含まれる変異導入カセット（５１）の配列構成と、組換え済み標的遺伝子（４０）と変異導入カセット（５１）とが、Ｃｒｅ−変異ｌｏｘ配列システムによる介在作用により組み換えられて遺伝子変異が導入された変異導入遺伝子（６０）の配列構成を示す模式図である。図４は、標的遺伝子としてのヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）関連電位依存性カリウムチャンネルＫＣＮＱ２サブユニット由来の遺伝子と、相同組換えのためのターゲテイングベクターの配列構成を示す模式図である。図５は、標的遺伝子ＫＣＮＱ２と、そのターゲテイングベクターの配列構成をそれぞれ示すとともに、その変異遺伝子として変異Ｙ２８４ＣまたはＴ３０６Ａを含む変異導入ベクターの配列構成を示す模式図である。図６は、変異Ｙ２８４ＣおよびＴ３０６Ａを含む変異導入ベクターの配列構成を示す模式図である。なお、各図に示す模式図は、この発明を簡潔に説明するための例示に過ぎないものであって、この発明は、これらの図面によって制限されるものではないことを十分に理解すべきである。
　まず、この発明に係る遺伝子変異導入方法に使用できる標的遺伝子（１０）は、上述したように、その種類が特に限定されるものではなく、あらゆる遺伝子に適用できるという大きな利点と長所を有している。本明細書では、説明を簡潔にするために、図１で示す標的遺伝子（１０）として、図５で示すてんかん関連遺伝子であるヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）関連電位依存性カリウムチャンネルＫＣＮＱ２サブユニット由来の遺伝子を例として挙げて説明するとともに、遺伝子変異導入の目的とする変異遺伝子としては、図６で示す変異Ｙ２８４ＣまたはＴ３０６Ａを例として挙げて説明する。
　この発明の遺伝子変異導入方法においては、遺伝子変異導入の標的とする標的遺伝子（１０）を、あらゆる遺伝子の中から、遺伝子として所望の機能を有する変異導入対象エキソン（１２）を持つ遺伝子を自由に選定することができる。遺伝子変異導入の標的とする標的遺伝子ならびに変異導入対象エキソン（標的ＤＮＡ配列）を選定するに当たっては、当然のことながら、遺伝子変異の存在が既に知られている遺伝子ならびに遺伝子変異から選定するのが有利である。この発明においては、具体的には、図５で示すように、既に遺伝子変異が知られているてんかん関連遺伝子であるヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）関連電位依存性カリウムチャンネルＫＣＮＱ２サブユニット由来の遺伝子を選択すると共に、標的ＤＮＡ配列として、その遺伝子ＫＣＮＱ２に含まれる複数のエキソンの中から、既知の遺伝子変異Ｙ２８４Ｃ（配列番号１および２）またはＴ３０６Ａ（配列番号３および４）が存在するエキソン６を選定した。勿論、その他のエキソンを選定することも可能であり、目的に応じて変異導入の標的とする標的ＤＮＡ配列を自由に選定できることは当然である。
　上記のようにして選択された標的遺伝子（１０）は、標的組換えベクター（ターゲテイングベクター）（２０）と、当該技術分野で既知の相同組換え法、つまりジーンターゲテイング法によって組換え改変される。この相同組換え法は、変異導入の標的となる標的ＤＮＡ配列を含む標的組換えベクター、つまりターゲテイングベクターをエレクトロポレーションなどの慣用ベクター導入技術でマウスＥＳ細胞などに常法に従って導入することによって実施することができる。なお、相同組換え法は、当該技術分野では慣用されている確立した技術であるので、ここではその詳細についての説明は省略する。
　この標的組換えベクター（２０）は、マウスなどのＥＳ細胞のゲノムＤＮＡ中の所定の標的遺伝子に変異導入を容易にするための変異ｌｏｘ配列を導入するベクターであって、目的とする変異を標的遺伝子に導入することができるように、基盤となるプラスミドなどに当該技術分野で慣用されている常法に従って組み込んで作製することができる。かかるプラスミドとしては、特に限定されるものではなく、いずれも使用することができ、当該技術分野で慣用されているものであれば使用することができる。かかるプラスミドとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋、ｐＧＥＭ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等のｐＵＣ類、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＳＰ７３等のｐＳＰ類、ｐＧＥＭ−３、ｐＧＥＭ−４、ｐＧＥＭ−３Ｚ等のｐＧＥＭ類などを挙げることができるが、標的組換えベクター構築のために後に挿入されるＤＮＡ断片に存在する制限酵素切断部位の種類および配列順序を考慮し適宜選択するのがよい。
　また、この発明の標的組換えベクターの構築に用いるゲノムＤＮＡ断片は、例えばＫＣＮＱ２遺伝子などの標的とする遺伝子のＤＮＡ塩基配列情報をゲノムデータベースより入手し、その情報を基にしてマウスバクテリア人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）クローン等を鋳型として遺伝子の必要な領域をＰＣＲで増幅するか、またはゲノムライブラリーから単離したクローンを用いて作製することができる。このように増幅して得られたＫＣＮＱ２遺伝子の塩基配列断片のうち、変異導入の標的部位であるエキソン部分に対して、例えば、第１相同組換えＤＮＡ配列領域は約５．５ｋｂ、また第２相同組換えＤＮＡ配列領域は約２ｋｂの部分断片となるように設計するのがよい。また、オリゴヌクレオチド対のそれぞれのオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で慣用されている方法で作製することができる。また、相同組換えのための第１相同組換えＤＮＡ配列領域ならびに第２相同組換えＤＮＡ配列領域を個々に作成して結合させて作製することも可能である。
　さらに、本明細書で使用する「標的組換えベクター」という用語は、外部から標的遺伝子に導入する標的ＤＮＡ配列の運び役として働く一般にターゲテイングベクターと称されるものである。この発明の標的組換えベクターは、当該技術分野に慣用されている手法に従って作製することができる。
　なお、標的組換えベクター（２０）において、その第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）のＤＮＡ配列が第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２８）のＤＮＡ配列より長く構築することが一般的であることから、本明細書においては、単に説明の便宜のために、第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）を「長腕領域」もしくはこれに関連する用語を用いる場合もあり、また第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２８）を「短腕領域」もしくはこれに関連する用語を用いる場合もあるが、特にこれらの用語に拘束されるものではない。換言すると、第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）と第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２８）とは、前者のＤＮＡ配列が後者のＤＮＡ配列よりも短くても、または両者のＤＮＡ配列は同じであってもよい。
　かかる変異導入を組換えによって効果的に行うためには、標的組換えベクター（２０）を次のように構築するのがよい。つまり、標的組換えベクター（２０）は、標的遺伝子（１０）の変異導入対象エキソン（１２）を含む第１ＤＮＡ配列領域（１０ａ）と実質的に同一のＤＮＡ配列である標的ＤＮＡ配列（３２）を持つ第２ＤＮＡ配列領域（２０ａ）を有すると共に、標的ＤＮＡ配列（３２）を挟むように互いに異なる第１変異ｌｏｘ配列（３０）と第２変異ｌｏｘ配列（３６）との対を配置する構造になるように構築するのがよい。
　なお、本明細書において使用する「実質的には同一」という用語は、完全に同一の場合の他に、その元来の性質や特長などが損なわれない程度にその同一性が保持されている場合をも包含した意味として使用している。
　また、ここで、この発明において使用する用語「変異ｌｏｘ配列」について詳細に説明する。本明細書で使用する用語「変異ｌｏｘ配列」とは、ｌｏｘＰ配列の中央部に位置するスペーサー配列の８塩基のうち、スペーサー配列および／またはこの５’側反復繰り返し配列ならびに／もしくは３’側反復繰り返し配列のそれぞれ１３塩基のうち、その１個もしくは複数個の塩基が別の塩基で置換されている変異ｌｏｘ配列を意味している。
　さらに具体的には、本明細書で使用する用語「第１変異ｌｏｘ配列」とは、変異がｌｏｘＰ配列の５’側反復繰り返し配列に存在するとともに、標的ＤＮＡ配列の５’側に位置する変異ｌｏｘ配列であり、例えばｌｏｘ７１などが挙げられる。「第２変異ｌｏｘ配列」は、変異がｌｏｘＰ配列のスペーサー配列に存在するとともに、標的ＤＮＡ配列の３’側に位置する変異ｌｏｘ配列であり、例えばｌｏｘ２２７２などが挙げられる。ｌｏｘ７１は、ｌｏｘＰ配列の５’側反復繰り返し配列の１３塩基（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ）のうち５’側の最初の５個の塩基配列がＴＡＴＴＧに変異している配列である。ｌｏｘ２２７２は、ｌｏｘＰ配列のスペーサ配列が変異している変異ｌｏｘ配列であって、その８塩基（ＧＣＡＴＡＣＡＴ）の２番目のＣがＧに、また７番目のＡがＴに置換している配列である。
　この発明の標的組換えベクター（２０）の詳細な配列構成を図１を参照して説明すると、標的組換えベクター（２０）は、標的遺伝子（１０）の第１ＤＮＡ配列領域（１０ａ）と実質的に同一のＤＮＡ配列を持つ第２ＤＮＡ配列領域（２０ａ）を持つと共に、第２ＤＮＡ配列領域（２０ａ）は、第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）と、第１変異ｌｏｘ配列（３０）と、標的ＤＮＡ配列領域（２６）と、第２変異ｌｏｘ配列（３６）と、ポリＡ付加配列（３８）と、第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２８）とを含む配列構成を持つように構築するのがよい。また、互いに異なる第１変異ｌｏｘ配列（３０）と第２変異ｌｏｘ配列（３６）との対によって挟まれた標的ＤＮＡ配列領域（２６）は、標的ＤＮＡ配列（３２）と第１ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（３４）とを含む構造を有するのがよい。さらに、ＦＲＴ配列（３９ａ、３９ｂ）を、標的ＤＮＡ配列（３２）と第１ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（３４）との間と、ポリＡ付加配列（３８）の３’側に配置するのがよい。また、第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）と第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２８）のＤＮＡ配列は、一般的には、それぞれ５ｋｂ程度と２~３ｋｂｐ程度であればよく、また第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）ならびに第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２８）には、エキソンＤＮＡ配列とイントロンＤＮＡ配列とがそれぞれ含まれていてもよい。
　さらに、この発明の標的組換えベクター（２０）には、その第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）の５’側にネガティブ選択マーカーＤＮＡ配列（２２）が配置される。ネガティブ選択マーカーＤＮＡ配列（２２）としては、例えば、ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子（ＤＴ−Ａ）など細胞毒タンパク質を産生する遺伝子や、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）など毒性物質の代謝を変化させる遺伝子を使用することができる。一方、標的組換えベクター（２０）の標的ＤＮＡ配列領域（２６）に組み込まれた第１ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（３４）としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）などの薬物耐性遺伝子マーカーを挙げることができる。このような薬物耐性遺伝子マーカーを配置することにより、ベクターを細胞に導入した際に、そのベクターがゲノムＤＮＡの標的部位と相同組換えを起こした細胞だけを選択することになる。
　上記のような配列構成を有する標的組換えベクターは、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋プラスミドを適切な制限酵素で切断し、その切断部位にＤＴ−Ａを組み込んだ後に、次に適切な制限酵素で切断し、その切断部位に長腕—短腕断片を組み込み、つぎにその長腕−短腕断片を適切な制限酵素で切断し、その切断部位にｌｏｘ７１配列断片を組み込んだ後、長腕領域の所定のエキソンの末端より約２００ｂｐ上流側を切断し、その切断部位に薬物耐性遺伝子マーカーなどを組み込み、その後ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫを含む所定部分を切断して直鎖化することによって作製することができる。上記のようにして作製した標的組換えベクターは塩基配列の決定により確認することができる。
　上述したような配列構成を持つ標的組換えベクター（２０）は、エレクトロポレーションなどの慣用のベクター導入技術でマウスＥＳ細胞などに常法に従って導入される。これにより、染色体上で、標的遺伝子（１０）が標的組換えベクター（２０）と相同組換えを起こして、変異導入の標的となる標的ＤＮＡ配列（３２）が導入された組換え済み標的遺伝子（４０）が得られる。その結果、得られた組換え済み標的遺伝子（４０）は、標的組換えベクター（２０）の第２ＤＮＡ配列領域（２０ａ）と実質的に同一の配列構成を持つ第３ＤＮＡ配列領域（４０ａ）を有ることになる（図２）。
　図２に示すように、組換え済み標的遺伝子（４０）の第３ＤＮＡ配列領域（４０ａ）は、ネガティブ選択マーカーＤＮＡ配列（２２）と、第１相同組換えＤＮＡ配列（２４）と、第１変異ｌｏｘ配列（３０）と、変異標的ＤＮＡ配列（３５）と、第２変異ｌｏｘ配列（３６）と、ポリＡ付加配列（３８）と、ＦＲＴ配列（３９ｂ）と、第２相同組換えＤＮＡ配列（２８）とを含む配列構成になっているとともに、変異標的ＤＮＡ配列（３５）が、標的ＤＮＡ配列（３２）と、ＦＲＴ配列（３９ａ）と、第１ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（３４）とを含む配列構成からなっている。
　次に、このような配列構成を持つ染色体上の組換え済み標的遺伝子（４０）は、変異導入カセット（５１）を含む変異導入ベクター（５０）と、Ｃｒｅレコンビナーゼ−変異ｌｏｘシステムの介在作用によって、組換え済み標的遺伝子（４０）の第３ＤＮＡ配列領域（４０ａ）に含まれる変異標的ＤＮＡ配列領域（３５）が、変異導入ベクター（５０）の変異導入カセット（５１）に含まれる変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）と組換えられて、目的とする遺伝子変異が標的遺伝子に導入されて変異導入遺伝子（６０）が得られる。
　この発明で使用できる変異導入カセット（５１）は、標的遺伝子に変異ＤＮＡ配列（５７）を導入するツールであって、特定の変異遺伝子に限定されるものではなく、変異を有する遺伝子であればいずれの変異遺伝子に対して適用することができるツールである。さらに、この変異導入カセットは、標的遺伝子に導入する変異ＤＮＡ配列を自由に変えることができる可変式であることも大きな特長である。したがって、この変異導入カセットは比較的容易にかつ迅速に作製できることから、このような可変式の変異導入カセットを変異毎に作製しておけば、たとえ組換え済み標的遺伝子の組換え効率が非常に悪いとしても、対応する変異導入遺伝子ならびにこの変異導入遺伝子を導入したマウスなどの非ヒト動物は容易に、短期間にかつ高確率で作製できるという大きな特長がある。
　図３で示すように、このように可変式に構築できる変異導入カセット（５１）は、組換え済み標的遺伝子（４０）の標的ＤＮＡ配列（３２）と効率的に組換わるために、その変異ＤＮＡ配列（５７）と、変異ＤＮＡ配列（５７）の３’側に位置する第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）とを、互いに異なる第３変異ｌｏｘ配列（５２）と第４変異ｌｏｘ配列（５６）とで挟んだ構造に構築するのがよい。さらに、第３変異ｌｏｘ配列（５２）と第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）との間に、ＦＲＴ配列（３９ｃ）を配置するのがよい。このような配列構成を持つ変異導入カセット（５１）は、当該技術分野で慣用されている常套手段によって作製することができる。
　ここで、「第３変異ｌｏｘ配列」で表される変異ｌｏｘ配列は、変異がｌｏｘＰ配列の３’側反復繰り返し配列に存在するとともに、変異ＤＮＡ配列の５’側に位置する変異ｌｏｘ配列であり、例えばｌｏｘＫＲ３などが挙げられ、また「第４変異ｌｏｘ配列」で表される変異ｌｏｘ配列は、第２変異ｌｏｘ配列と同様に、変異がｌｏｘＰ配列のスペーサー配列に存在するとともに、変異ＤＮＡ配列の３’側に位置する変異ｌｏｘ配列であり、例えばｌｏｘ２２７２などが挙げられる。
　第３変異ｌｏｘ配列（５２）としてのｌｏｘＫＲ３は、ｌｏｘＰ配列の３’側反復繰り返し配列が、その３’側末端から５番目から７番目の３塩基配列（５’−ＧＡＡ）を３塩基配列（５’−ＣＧＧ）に置換した変異ｌｏｘ配列である。一方、ｌｏｘ２２７２は、第２変異ｌｏｘ配列と同様に、ｌｏｘＰ配列のスペーサ配列に変異が存在する変異ｌｏｘ配列であって、その８塩基（ＧＣＡＴＡＣＡＴ）の２番目のＣをＧに、また７番目のＡをＴに置換した配列を有している。
　また、変異導入カセット（５１）に含まれる第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）としては、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子などの薬物耐性遺伝子から構成するように設計するのがよい。これにより、所望の変異ＤＮＡ配列を持つＥＳ細胞を選択して得ることができる。このようなポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列は、所定のプラスミドを鋳型とし、適切なオリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲにより所定の長さの断片として増幅した後、５’末端および３’末端に人工付加された制限酵素認識部位を切断することによって調製することができる。このような薬物耐性遺伝子マーカーを配置することにより、ベクターを細胞に導入した際に、そのベクターがゲノムＤＮＡの標的部位と相同組換えを起こした細胞だけを選択することになる。
　この発明においては、変異導入カセット（５１）の変異ＤＮＡ配列（５７）は、変異エキソンを含むＤＮＡ配列となるように構築する。かかる変異エキソンとしては、例えば、ヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）に関連する電位依存性カリウムチャンネルの遺伝子ＫＣＮＱ２サブユニットのエキソン６部分に存在する変異部分であるＹ２８４ＣおよびＴ３０６Ａを含むように構築することができる。一方、ＫＣＮＱ２遺伝子に存在するその他の遺伝子変異を標的にする場合には、エキソン６を含む下流側すべてのエキソンをイントロンを除き連結したｃＤＮＡ断片に該当する変異を導入し、変異導入カセットを設計するとよい。このことは、その他の変異遺伝子についても同様に適用することができる。
　この遺伝子ＫＣＮＱ２サブユニットの変異Ｙ２８４Ｃの塩基配列は、ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン６の２３番目のＡがＧに置換している変異塩基配列（配列番号１）であり、またエキソン６の８番目のチロシンをシステインに置換している変異アミノ酸配列（配列番号２）である。一方、遺伝子変異Ｔ３０６Ａの塩基配列は、ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン６の１００番目のＧがＡに置換した変異塩基配列（配列番号３）であり、またエキソン６の３４番目のアラニンをスレオニンに置換した変異アミノ酸配列（配列番号４）である。
　この発明において使用できる遺伝子変異（Ｙ２８４Ｃ変異またはＡ３０６Ｔ変異等の遺伝子変異）を含む変異ＤＮＡ配列は、例えば、マウスＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン６を含むＤＮＡ断片に変異Ｙ２８４ＣまたはＡ３０６Ｔを導入し、さらに５’末端にｌｏｘＫＲ３配列を付加したものである。
　例えば、マウスＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン６のＹ２８４Ｃ変異を含むＫＣＮＱ２遺伝子断片は、ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン６周辺部分を鋳型とし、エクソン６周辺領域増幅・ｌｏｘＫＲ３配列導入用−Ｙ２８４Ｃ変異導入用オリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲによりＹ２８４Ｃとなる塩基置換を含む５’側断片および３’側断片をそれぞれ増幅した。これらの２つの断片を、上記エキソン６周辺領域増幅・ｌｏｘＫＲ３配列導入用オリゴヌクレオチド対を用いてＬｉｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｌｏｎｉｎｇ法およびＰＣＲにより連結・増幅して所定の長さの断片として得ることができる。
　また、Ａ３０６Ｔ変異を含むＫＣＮＱ２遺伝子断片は、上記Ｙ２８４Ｃ変異を含むＫＣＮＱ２遺伝子断片と実質的に同様にして作製することができる。さらに、その他の変異を含むエキソンにしても、またその他の遺伝子にしても、実質的に同様にして作製することができる。
　上記のような配列構成を持つ変異導入カセット（５１）は、当該技術分野で慣用されている常套手段に従って変異導入ベクター（５０）に導入することができる。変異導入ベクターとしては。例えば、標的組換えベクターに使用したものと同様のベクターを使用することが可能である。このためには、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ、ｐＳＰ（ｐＳＰ６４，ｐＳＰ６５等）、ｐＧＥＭ（ｐＧＥＭ−３、ｐＧＥＭ−４、ｐＧＥＭ−３Ｚ等）などのプラスミドベクターを使用できる。このように作製した上記変異を含むＫＣＮＱ２遺伝子断片は、例えば、制限酵素で切断した適切なプラスミドにピューロマイシン耐性遺伝子などの第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列領域を組み込んで、制限酵素で切断した後、その切断部位に組み込んで上記の配列構成を持つ変異導入ベクターを構築することができる。
　次に、上記のようにして変異導入カセット（５１）を導入した変異導入ベクター（５０）は、組換え済み標的遺伝子（４０）と、Ｃｒｅレコンビナーゼの介在作用による反応によって、変異導入カセット（５１）に含まれる第３変異ｌｏｘ配列（５２）と第４変異ｌｏｘ配列（５６）との対と、その対で挟まれた変異導入ＤＮＡ配列（５４）とが組換え済み標的遺伝子（４０）に組み換えられて変異導入遺伝子（６０）が得られる。
　つまり、組換え済み標的遺伝子（４０）と変異導入ベクター（５０）とのＣｒｅレコンビナーゼを介在させた反応によって、組換え済み標的遺伝子（４０）の変異導入ＤＮＡ配列領域（３５）が、変異導入ベクター（５０）の変異導入カセット（５１）と置換される。その結果、組換え済み標的遺伝子（４０）の変異導入ＤＮＡ配列領域（３５）に含まれる標的ＤＮＡ配列（３２）と、変異導入ベクター（５０）の変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）に含まれる変異ＤＮＡ配列（５７）とが置換されて、目的とする遺伝子変異を持つ変異ＤＮＡ配列（５７）が導入された目的とする変異導入遺伝子（６０）が得られる。このＣｒｅレコンビナーゼ−変異ｌｏｘシステムを介在させた反応は、公知の方法に従って実施できる。
　さらに、上述した組換え済み標的遺伝子（４０）と変異導入ベクター（５０）とのＣｒｅレコンビナーゼを介在させた反応では、標的ＤＮＡ配列と変異ＤＮＡ配列の置換ばかりではなく、組換え済み標的遺伝子（４０）の第１変異ｌｏｘ配列（３０）と変異導入カセット（５１）の第３変異ｌｏｘ配列（５２）との組換えも発生して、組換え済み標的遺伝子（４０）の第２変異ｌｏｘ配列（３６）と変異導入カセット（５１）の第４変異ｌｏｘ配列（５６）との組換えもそれぞれ起こって、第５変異ｌｏｘ配列（６４）と第６変異ｌｏｘ配列（６６）に組換わる。
　図３に示すように、得られた変異導入遺伝子（６０）は、第１相同組換えＤＮＡ配列（２４）と、第５変異ｌｏｘ配列（６４）と、変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）と、第６変異ｌｏｘ配列（６６）と、ポリＡ付加配列（３８）と、ＦＲＴ配列（３９ｂ）と、第２相同組換えＤＮＡ配列（２８）とを含む配列構成からなる構造を含んでいる。変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）は、変異ＤＮＡ配列（５７）と、ＦＲＴ配列（３９ｃ）と、第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）とを含む配列構成からなっている。
　また、得られた変異導入遺伝子（６０）に配置されるＦＲＴ配列（３９ｂ）とＦＲＴ配列（３９ｃ）とは、例えばマウス創出後に薬物遺伝子を除去するためのものである。つまり、創出された変異導入遺伝子（６０）を持つ雄マウスと、野生型の雌マウスとを交配して生まれた仔マウス（Ｆ１）をＦｌｐリコンビナーゼを発現するマウスと交配することによりＦＲＴ間のＤＮＡ配列領域が抜けた仔マウスを算出することができる。その後は、この領域を持たない状態を完成型とした継代していくことができる。
　ここで、変異導入遺伝子（６０）の第５変異ｌｏｘ配列（６４）と第６変異ｌｏｘ配列（６６）について説明する。上記したように、第５変異ｌｏｘ配列（６４）は、組換え済み標的遺伝子（４０）の第１変異ｌｏｘ配列（３０）と変異導入カセット（５１）の第３変異ｌｏｘ配列（５２）との組換えによって得られる変異ｌｏｘ配列であるところから、第１変異ｌｏｘ配列と第３変異ｌｏｘ配列の両方の構成からなることになる。したがって、第５変異ｌｏｘ配列（６４）は、第１変異ｌｏｘ配列と同様に、ｌｏｘＰ配列の５’側反復繰り返し配列に変異を有すると共に、第３変異ｌｏｘ配列と同様に、ｌｏｘＰ配列の３’側反復繰り返し配列にも変異を有する変異ｌｏｘ配列であり、例えばｌｏｘ７１／ＫＭＲ３などが挙げられる。換言すると、第５変異ｌｏｘ配列（６４）は、ｌｏｘＰ配列の５’側および３’側反復繰り返し配列に第１変異ｌｏｘ配列と、第３変異ｌｏｘ配列との変異を併せ持つ変異ｌｏｘ配列である。また、第６変異ｌｏｘ配列（６６）も、第５変異ｌｏｘ配列と同様に、組換え済み標的遺伝子（４０）の第２変異ｌｏｘ配列（３６）と変異導入カセット（５１）の第４変異ｌｏｘ配列（５６）との組換えによって得られる変異ｌｏｘ配列であるところから、第２変異ｌｏｘ配列と第４変異ｌｏｘ配列の両方の構成からなることになる。
　この発明において、組換え済み標的遺伝子（４０）と変異導入ベクター（５０）とのＣｒｅレコンビナーゼ−変異ｌｏｘシステムを介在させた反応は、公知の方法に従って実施できる。
　つまり、エレクトロポレーションなどの慣用のベクター導入方法により標的組換えベクターを導入した細胞のうち、相同組換えが起きた細胞は、そのベクター内に配置したマーカー遺伝子の発現により選択する。例えば、マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子であれば、その細胞をその薬剤の存在下で培養することによって選択することができる。つまり、標的組換えベクターを組み込んだ細胞は、例えば、ＫＳＲ−ＧＭＥＭ培地などの適切な培地に懸濁した後、Ｇ４１８含有培地に交換し培養することにより非組換え細胞および非相同組換え細胞を死滅させてそれらの細胞の除去を行うことができる。これにより、Ｇ４１８含有培地中で生存してコロニーを形成した相同組換え済みＥＳ細胞の単離と選別を行うことができる。これによりの単離したＥＳ細胞を培養し、それから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲやサザンハイブリダイゼーション法などによって選別することができる。このうち、ＰＣＲは、相同組換え検出をするためのＮｅｏ耐性遺伝子−短腕領域下流側間増幅用オリゴヌクレオチド対を用いてＮｅｏ耐性遺伝子の３’末端部分と標的組換えベクターの短腕領域の３’末端の下流側に隣接するＫＣＮＱ２遺伝子の部分配列との間の断片を増幅する反応を行うことによって増幅ＤＮＡ産物を得ることができる。このようにして得られた増幅ＤＮＡ産物を適切な制限酵素で切断し、短腕領域の３’側領域をプローブとしてサザンブロット解析を行って、標的相同組換えによってＤＮＡ断片が作製されたことを確認して、このクローンＥＳ細胞を、ＫＣＮＱ２遺伝子に変異導入可能なアクセプターＥＳ細胞として凍結保存し、以降の操作に用いるのがよい。
　このようにして得られたアクセプターＥＳ細胞を用いて、変異導入ベクターに含まれる遺伝子変異を、Ｃｒｅ−変異ｌｏｘシステムを用いたｌｏｘ特異的組換えによってＫＣＮＱ２遺伝子などの標的遺伝子へ導入することができる。このＫＣＮＱ２遺伝子への遺伝子変異導入は、上記アクセプターＥＳ細胞株のクローンを用い、そのアクセプターＥＳ細胞に、上記変異導入ベクターとＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクターとを、エレクトロポレーション法などの常法によって導入することによって行うことができる。このようにアクセプターＥＳ細胞に変異導入ベクターを組み込むと共に、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子をプラスミドに組み込んだＣｒｅ発現ベクターを感染させることによって、アクセプターＥＳ細胞に導入された標的組換えベクターＤＮＡ中のｌｏｘ配列因子に挟まれている標的ＤＮＡ配列部分が、Ｃｒｅ発現ベクターから発現したＣｒｅリコンビナーゼとｌｏｘ配列の相互作用による特異的組換えによってアクセプターＥＳ細胞中のＫＣＮＱ２遺伝子に導入できる。
　上記のようにして変異導入ベクターが導入されたアクセプターＥＳ細胞のうち、特異的組換えにより変異導入が起きた細胞は、抗生物質耐性により選別することができる。Ｃｒｅによる特異的組換えにより変異導入カセットが導入された細胞では、標的組換えベクターのネオマイシン耐性遺伝子が除去され、その代わりにピューロマイシン耐性遺伝子をもつ。そのため、抗生物質ピューロマイシンを含む適切な培養液中で培養することにより、非組換えの細胞は死滅し、特異的組換えにより変異導入された細胞を選別することができる。生存した細胞コロニーを単離し、さらに培養後、一部からＤＮＡを抽出してＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法により変異の導入を確定することができる。
　この発明に係るノックイン非ヒト哺乳動物は、上記のようにして組換えにより標的変異ＤＮＡ配列部分を挿入したＥＳ細胞を、対象動物であるヒト以外の哺乳動物に導入することによって作出することができる。対象動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、サルなどから選択することができるが、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の齧歯類動物であり、特に好ましくはマウスである。
　上記のようにして組換えにより標的変異ＤＮＡ配列部分を挿入したＥＳ細胞は、野生型マウスの胚盤胞または８細胞期の宿主胚に凝集法やマイクロインジュクション法により注入し、胚盤胞期まで発生させた後、これを偽妊娠状態の仮親マウス等の仮親動物の子宮に移植し出産させてキメラ動物を作製することができる。
　マウスの場合には、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧやＬＨ様作用を有するｈＣＧ等のホルモン剤により過排卵処理を施した雌マウスを雄マウスと交配させる。受精後適当な時期に胚盤胞または８細胞期胚をそれぞれ子宮や卵管から初期発生胚を回収する。このようにして回収した胚に対して、上記相同組換えＥＳ細胞をインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において注入し、キメラ胚を作製する。
　一方、仮親とするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを精管結紮などの処置をした雄マウスと交配することにより作出することができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上記の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠、出産させることによりキメラマウスを作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするため、受精卵を採取する雌マウスと仮親となる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にある雌マウス群から作出するのが好ましい。
　上記ＥＳ細胞に由来する生殖細胞を持つマウス個体については、このキメラマウスを純系のマウスと交配して、次世代個体に現れるＥＳ細胞由来の様々な形質を指標として、そのＥＳ細胞がキメラマウス生殖系列に導入されたことを確認することができる。かかる確認の容易さを考慮すると、上記キメラマウスを純系のマウスと交配して得られる次世代個体にＥＳ細胞由来の被毛色が現れることから、その次世代個体の被毛色を指標として、ＥＳ細胞が生殖系列へ導入されたことを確認することが好ましい。マウスにおいては、野ネズミ色（アグーチ色）、黒色、黄土色、チョコレート色、白色などの被毛色が知られているが、使用するＥＳ細胞の由来系統を考慮して、キメラマウスと交配させるマウス系統を適宜選択することがよい。また、体の尾部先端などからＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行うことにより選抜を行うことも可能である。
　上記のようにして、胚内に移植された組換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された動物を選択し、そのキメラ動物を繁殖させることにより、目的変異遺伝子が発現した個体を得ることができる。得られたヘテロ接合体マウス同士を交配させることにより、目的変異遺伝子が導入されたホモ接合マウスを得ることができる。作出された変異遺伝子を保有するヘテロ接合体またはホモ接合体は、生殖細胞および体細胞のすべてに安定的にその遺伝子変異を有していることから、交配等により効率よくその変異を子孫動物に伝達することができる。
　以下、この発明を、実施例により更に詳細に説明する。ただし、下記実施例は、ヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）で発見された、電位依存性カリウムチャンネルの遺伝子ＫＣＮＱ２サブユニットの２種類の遺伝子変異（Ｙ２８４ＣおよびＴ３０６Ａ）を例にしたものであるが、この発明を具体的に説明するためだけに記載するのであって、この発明を一切限定するためでなく、あくまでもこの発明の具体的説明のための例示に過ぎないことと理解しておくべきである。
（１）標的組換えベクターの配列構成
　標的組換えベクターは、その５’−末端側から、プラスミド由来部分と、ネガティブ選択マーカーカセットと、第１相同組換えＤＮＡ配列領域（長腕領域）であるＫＣＮＱ２遺伝子部分配列と、第１変異ｌｏｘ配列としてのｌｏｘ７１配列と、ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列と、第２変異ｌｏｘ配列としてのｌｏｘ２２７２配列と、第２相同組換えＤＮＡ配列領域（短腕領域）と、ベクター直線化用制限酵素切断部位と、からなる配列構成からなっている。
　この標的組換えベクター（ｐＴｇＫＣＮＱ２）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋プラスミドを基盤として、全長が１４，１６４ｂｐ（配列番号５）のＤＮＡ配列を有するように構築した。その配列構成は次の通りであり、プラスミドマップを図４に示す。
　塩基番号１—６７３：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋由来部分
　塩基番号６７４—２３０１：ＤＴ−Ａカセット
　塩基番号２３１６—７４８３：ＫＣＮＱ２遺伝子部分配列（相同組換えのための長腕領域）
　塩基番号７４８４—７５１７：ｌｏｘ７１配列
　塩基番号８０９１—１０１３８：ＰＧＫ／Ｎｅｏカセット
　塩基番号１０１４５—１１９３９：ＫＣＮＱ２遺伝子部分配列（相同組換えのための短腕領域）
　塩基番号１１９４０—１４１６４：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋由来部分
　塩基番号１１９５０—１１９５４：制限酵素Ｓａｃ　ＩＩ切断部位（ベクター直線化用）
（１−１）プラスミド
　基盤としたプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋は、大腸菌より抽出した閉環状ＤＮＡ（２，９６０ｂｐ：Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）を制限酵素Ｘｈｏ　ＩおよびＸｂａ　Ｉで切断して直線化した。
（１−２）ネガティブ選択マーカーカセット（ＤＴ−Ａカセット）
　ネガティブ選択マーカーカセットは、ＭＣ１プロモーターと、ジフテリア毒素Ａコード領域（ＤＴ−Ａ）と、ポリＡ付加配列（ｐＡ）とからなる配列構成からなっている。
　プラスミドｐＤＴ／ＡｐＡ（荒木喜美氏より分与）を５’−側をＸｈｏ　Ｉ、また３’−側をＳｐｅ　Ｉで切断し、１．６ｋｂの断片として精製した。
（１−３）ＫＣＮＱ２遺伝子の相同組換えのための長腕領域ならびに短腕領域
　相同組換えのための長腕領域と短腕領域となるＫＣＮＱ２遺伝子部分配列は、マウスＫＣＮＱ２遺伝子のイントロン２からイントロン７に亘る領域となるように設計した。そして、標的遺伝子であるＫＣＮＱ２遺伝子の長腕領域と短腕領域は、ＫＣＮＱ２遺伝子を含むＢ６マウスＢＡＣクローンＲＰＣＩ２３−４０１Ｌ１７を鋳型とし、下記配列を持つ長腕−短腕領域増幅用オリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲにより７．４ｋｂの断片として増幅した。このうち、長腕領域は５’−側５．６ｋｂの領域に相当し、また短腕領域は３’−側１．８ｋｂの領域に相当する。
　上記長腕−短腕領域増幅用オリゴヌクレオチド対は、配列番号６および７に表わすような下記塩基配列をそれぞれ有するように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　なお、上記配列のうち、下線部は制限酵素認識配列を表している。
（１−４）第１変異ｌｏｘ配列としてのｌｏｘ７１配列
　第１変異ｌｏｘ配列としてのｌｏｘ７１配列は、ｌｏｘＰ配列に相当する３４ｂｐの二本鎖ＤＮＡの両末端に、制限酵素Ｓｐｅ　Ｉ切断部位と相補結合可能な突出配列（５’−ＣＴＡＧ−３’）を付加した配列である。ｌｏｘ７１配列は、下記配列を持つｌｏｘ７１配列合成用オリゴヌクレオチド対を、９５℃で加熱変性の後室温まで徐冷して塩基対合させ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを触媒としてＡＴＰをリン酸基供与体として両鎖の５’側末端をリン酸化して調製した。
　上記に示すｌｏｘ７１配列合成用オリゴヌクレオチド対は、配列番号８および９で示すような下記塩基配列をそれぞれ有するように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　上記配列のうち、ボックス内の塩基配列はｌｏｘ７１配列に相当する塩基配列である。
　（１−５）ポジティブ選択マーカー（ＮｅｏＲカセット）
　ポジティブ選択マーカーカＤＮＡ配列は、ＦＲＴ配列と、ＰＧＫ／薬物耐性遺伝子マーカーカセットと、第４変異ｌｏｘ配列としてのｌｏｘ２２７２配列と、ポリＡ付加配列（ｐＡ）と、ＦＲＴ配列と、から構成されるように説計した。ここで、薬物耐性遺伝子マーカーとしてはネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）を使用した。
　ポジティブ選択マーカーは、プラスミドｐ０３（荒木喜美氏より分与）を鋳型とし、下記配列をもつＮｅｏＲカセット増幅用オリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲにより２．１ｋｂの断片として増幅した。その後、両末端に人工付加した制限酵素認識部位をＮｈｅ　Ｉで切断して除去した。
　ＮｅｏＲカセット増幅用オリゴヌクレオチド対は、配列番号１０および１１でそれぞれ示すような下記配列を有するように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　上記配列のうち、下線部は制限酵素認識配列である。
（２）標的組換えベクターの作製法
　実施例（１−１）において制限酵素Ｘｈｏ　ＩとＸｂａ　Ｉで切断したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋に、実施例（１−２）で調製したＤＴ−Ａカセットを組み込んだ後、これをＮｏｔ　Ｉで切断し、その切断部位に実施例（１−３）で調製した長腕−短腕領域断片を組み込んだ。さらに、長腕−短腕領域を組み込んだ断片をＳｐｅ　Ｉで切断し、その切断部位に実施例（１−４）で調製したｌｏｘ７１断片を組み込んだ。次に、ｌｏｘ７１断片を組み込んだ断片の長腕領域のエキソン６の５’−末端より約２００ｂｐ上流側をＸｂａ　Ｉで切断し、その切断部位に実施例（１−５）で調製したＮｅｏカセットを組み込んで標的組換えベクターを作製した。標的組換えベクターが作製されていることは、塩基配列の決定により確認した。このようにして作製した標的組換えベクターはＥＳ細胞へ導入される。
　本実施例は、実施例１で作製した標的組換えベクターとの相同組換えに使用される変異導入ベクターに関するものである。
　このＫＣＮＱ２変異導入ベクター（ｐＭｔＫＣＮＱ２ＹＣおよびｐＭｔＫＣＮＱ２ＡＴ）は、アクセプターＥＳ細胞のＫＣＮＱ２遺伝子に、特異的組換えによりＴｙｒ２８４→ＣｙｓあるいはＡｌａ３０６→Ｔｈｒとなるようなヌクレオチド置換を導入するための２種類のベクターである。上記いずれかのヌクレオチド置換を含む５７０ｂｐのＫＣＮＱ２遺伝子断片（ｅｘｏｎ６およびその前後）の５’末端にｌｏｘＫＲ３配列を、３’末端にピューロマイシン耐性遺伝子（ＰｕｒｏＲ）およびｌｏｘ２２７２配列を配置した。これらのベクターをＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクターと共にアクセプターＥＳ細胞へ導入すると、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用により、アクセプターＥＳ細胞のＫＣＮＱ２遺伝子上に配置されたｌｏｘ７１−ｌｏｘ２２７２間の領域が変異ＫＣＮＱ２配列と高効率で置換される。置換された細胞はピューロマイシン耐性となるため、ポジティブ選択が可能となる。このＫＣＮＱ２変異導入ベクター（ｐＭｔＫＣＮＱ２ＹＣおよびｐＭｔＫＣＮＱ２ＡＴ）は、いずれも４８９５ｂｐ（配列番号１２）で、配列構成は以下のとおり、またプラスミドマップは図６に示すとおりである。
　１−２２４３　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋　由来部分
　２２４３−２２７７　ｌｏｘＫＲ３　配列
　２２７８−２８４７　ＫＣＮＱ２　遺伝子部分配列（変異を含むｅｘｏｎ６および周辺領域）
　２８４８−４２４３　ＰＧＫ／Ｐｕｒｏ　カセット
　４２３８−４８９５　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋　由来部分
　上記ＫＣＮＱ２遺伝子部分の構成は下記のとおりである。
　２２７８−２４７１　ｉｎｔｒｏｎ５　（３’末端部分）
　２４７２−２５８２　ｅｘｏｎ６　（変異を含む）
　２５８３−２８４７　ｉｎｔｒｏｎ６　（５’末端部分）
　２５０６　　　　　　変異部位（ＴＡＣ（Ｔｙｒ）→ＴＧＣ（Ｃｙｓ））（ｐＭｔＫＣＮＱ２ＹＣのみ）
　２５７１　　　　　　変異部位（ＧＣＴ（Ａｌａ）→ＡＣＴ（Ｔｈｒ））（ｐＭｔＫＣＮＱ２ＡＴのみ）
　上記ＰＧＫ／Ｐｕｒｏカセットには下記の配列因子が含まれる。
　２８５０−２９４９　ＦＲＴ　配列
　２９６６−３５２２　ＰＧＫ遺伝子　プロモーター領域
　３５２３−４１２２　ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ　コード領域
　４２０４−４２３７　ｌｏｘ２２７２配列
（２−１）プラスミド
　基盤としたプラスミド（ｐ３Ｔ）は、大腸菌より抽出した閉環状ＤＮＡ（３，００３ｂｐ；ＭｏＢｉＴｅｃ社）をＨｉｎｄ　ＩＩＩおよびＫｐｎ　Ｉで切断して直線化した。
（２−２）ピューロマイシン耐性遺伝子カセット（Ｐｕｒｏカセット）
　ピューロマイシン耐性遺伝子カセット（Ｐｕｒｏカセット）は、ＦＲＴ配列−ＰＧＫプロモーター（ＰＰＧＫ）−ピューロマイシン耐性遺伝子（ＰｕｒｏＲ）−ｌｏｘ２２７２配列からなる配列構成になるように設計した。
　Ｐｕｒｏカセットは、プラスミドｐ０４（荒木喜美氏より分与）を鋳型とし、下記オリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲにより１．５ｋｂの断片として増幅した。その後、５’−および３’−末端に人工付加された制限酵素認識部位をＨｉｎｄ　ＩＩＩおよびＫｐｎ　Ｉで切断した。
　Ｐｕｒｏカセット増幅用オリゴヌクレオチド対は、配列番号１３および１４でそれぞれ示すような下記配列を有するように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　上記配列のうち、下線部は、制限酵素認識配列である。
　本実施例は、ＫＣＮＱ２遺伝子に変異導入可能なアクセプターＥＳ細胞の構築に関する。かかるアクセプターＥＳ細胞の構築は下記の通りに行った（図７参照）。
　マウスＥＳ細胞をデイッシュ２枚に継代し、セミコンフルエント状態のマウスＥＳ細胞（フィーダーフリーＫＰＴＵ株）をトリプシン処理によりディッシュより剥離しＰＢＳに懸濁して全量１．６ｍｌとした。これに直線化した実施例１で作製した標的組換えベクター２０μｇを加え、１０分間氷上で冷却した後、２個のエレクトロポレーション用キュベットに等分して移し、ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いて０．８ｋＶ、３．０μＦの条件で１回ずつ放電してＤＮＡの導入を行った。
　上記のようにして標的組換えベクターをマウスＥＳ細胞にエレクトロポレーションでＤＮＡを導入し、標的組換えにより染色体上のＫＣＮＱ２遺伝子座に上記配列因子を導入した。かかる配列因子が導入されたマウスＥＳ細胞株は、ゲノムＤＮＡ中にネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）を含む標的組換えベクターが安定的に挿入された細胞のみが生存できるように、ネオマイシン（Ｇ４１８）を含有する培地によってマウスＥＳ細胞を培養して選別した。つまり、かかる配列因子が導入されたマウスＥＳ細胞株は、エレクトロポレーション後の細胞をＫＳＲ−ＧＭＥＭ培地６０ｍｌに懸濁し、６枚のディッシュに等分して培養し、２４時間後に２００μｇ／ｍｌのＧ４１８含有培地に交換し、その後２日に１回Ｇ４１８含有培地の交換を行って７日間培養することによって選別した。また、非相同組換え細胞によりＫＣＮＱ２遺伝子座以外の位置に標的組換えベクターが挿入された細胞は、長腕領域の外部に配置されたＤＴ−Ａ遺伝子より発現する致死性毒素により排除した。
　さらに、上記によりＧ４１８含有培地中で生存してコロニーを形成したＥＳ細胞から相同組換えＥＳ細胞の単離と選別を行った。上記のようにしてＥＳ細胞をＧ４１８含有培地によって選別した結果、合計約５００個のＥＳ細胞がＧ４１８含有培地中で生存しコロニーを形成した。それらの細胞のうち、１４４個を標的相同組換えを起こした細胞の候補として単離・培養し、それらからＤＮＡを抽出し、その抽出ＤＮＡを用いてＰＣＲによる選別を行った。このＰＣＲは、相同組換え検出をするための下記配列を持つＮｅｏ耐性遺伝子−短腕領域下流側間増幅用オリゴヌクレオチド対を用いてＮｅｏ耐性遺伝子の３’末端部分と標的組換えベクターの短腕領域の３’末端の下流側に隣接するＫＣＮＱ２遺伝子の部分配列との間の２．０ｋｂの断片を増幅する反応を行った。この増幅反応の結果、９個のクローンにおいて増幅産物が確認された。
　上記Ｎｅｏ耐性遺伝子−短腕領域下流側間増幅用オリゴヌクレオチド対は、配列番号１５および１６に示すように、下記塩基配列を持つように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　一方、これら増幅産物のＤＮＡについて下記配列を持つプライマー対を用いてＰＣＲを行ったところ、増幅産物は確認されなかったことからに、非相同組換えによる標的組換えベクターの挿入は起きていないと判断できた。つまり、これらのＤＮＡを制限酵素ＢｓｐＨ　ＩおよびＢｇｌ　ＩＩで切断し、短腕領域３’側領域をプローブとしてサザンブロット解析を行ったところ、９個のクローンすべてにおいて標的相同組換えの場合に予想された３．２ｋｂのＤＮＡ断片が検出された。このことから、これら９クローンＥＳ細胞において期待された標的組換えを確認し、ＫＣＮＱ２遺伝子に変異導入可能なアクセプターＥＳ細胞として凍結保存し、以降の操作に用いた。
　非相同組換え検出のためのＤＴ−Ａ遺伝子−長腕上流側間増幅用プライマー対は、配列番号１７および１８で示すように下記配列を有するように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　エキソン６周辺領域増幅・ｌｏｘＫＲ３配列導入用プライマー対は、配列番号１９および２０で示すように下記配列を有するように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　上記配列において、下線部は制限酵素認識配列、ボックスはｌｏｘＫＲ３配列、ゴシック文字は変異置換部位を示す。
　Ｙ２８４Ｃ変異導入用プライマー対は、配列番号２１および２２で示すように下記配列を有するように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　Ａ３０６Ａ変異導入用プライマー対は、配列番号２３および２４で示すように下記配列を有するように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　さらに、実施例３で作製・単離した変異アクセプターＥＳ細胞株のクローンに、実施例２で得られた変異導入ベクターとＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクターとを、４００Ｖ、１２５μＦの条件でエレクトロポレーション法によって共導入し、染色体上のＫＣＮＱ２遺伝子の２つのｌｏｘ配列間に変異配列が導入されているかどうかと、置換された変異ＥＳ細胞をピューロマイシン耐性遺伝子によって選別・単離した。つまり、上記のようにしてエレクトロポレーションした後の細胞をＫＳＲ−ＧＭＥＭ培地６０ｍｌに懸濁し、６枚の１０ｃｍディッシュに等分して培養し、２４時間後に２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地に交換した。その後、２日に１回ピューロマイシン含有培地の交換を行い、７日間培養することにより２つのｌｏｘ配列間が変異遺伝子配列と置換された細胞のみにコロニーが形成されたことを確認した（図８参照）。
　上記で得られたＫＣＮＱ２変異ＥＳ細胞の単離と確認を行った。上記のようにしてコロニー形成をしたピューロマイシン耐性細胞株を複数単離し、ＫＣＮＱ２変異ＥＳ細胞の候補として凍結保存した。この細胞の一部よりＤＮＡを抽出し、変異を含む領域をＰＣＲにより増幅したのち、塩基配列の決定により変異導入を確認した。
　上記のようにして樹立したＫＣＮＱ２変異ＥＳ細胞をマウスに注入してノックインマウスを常法に従って作出した。つまり、ＫＣＮＱ２変異ＥＳ細胞クローンをＩＣＲマウス由来の桑果胚と凝集させ１晩培養した後、ＥＳ細胞と桑果胚とが凝集した混合胚を選択した。このキメラ胚を偽妊娠雌（仮親）の子宮の中へ移植した。約１７日後に出生した産仔のうち、被毛色がＫＣＮＱ２細胞由来組織を持つキメラマウスを選択した。このキメラマウスが性成熟する生後８週以降にＣ５７ＢＬ／６マウスと交配することにより、ＥＳクローン由来のＫＣＮＱ２変異細胞を体内にモザイク状に持つＦ１マウス（ヘテロ接合体）個体を得た。このＦ１マウスをＦｌｐ発現マウスと交配して、ＦＲＴ配列で挟まれたピューロマイシン耐性遺伝子などの不要な配列因子を除去し、ＫＣＮＱ２遺伝子に上記変異（Ｙ２８４Ｃ）ならびに（Ｔ３０６Ａ）がそれぞれ含み、その以外のＤＮＡ配列は野生型とほぼ等しい所望の変異ノックインマウスを作出した（図９参照）。
　この発明に係る可変式変異導入ベクターは、あらゆる遺伝子の変異に対して適用することができ、かつ、所望の遺伝子変異を導入した変異遺伝子を持つノックインマウスなどのノックイン非ヒト哺乳動物を迅速に作出することができる。その上、この発明のノックイン非ヒト哺乳動物は、あらゆる疾患の起因や発症などの原因解明などの研究に大いに寄与することができることから、特に医療分野などに多大の貢献が期待できる。
１０　　　　標的遺伝子
１０ａ　　　第１ＤＮＡ配列領域
１２　　　　変異導入対象エキソン
２０　　　　標的組換えベクター（ターゲテイングベクター）
２０ａ　　　第２ＤＮＡ配列領域
２２　　　　ネガティブ選択マーカーＤＮＡ配列領域
２４　　　　第１相同組換えＤＮＡ配列領域
２６　　　　標的ＤＮＡ配列領域
２８　　　　第２相同組換えＤＮＡ配列領域
３０　　　　第１変異ｌｏｘ配列
３２　　　　標的ＤＮＡ配列
３４　　　　第１ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列領域
３５　　　　変異標的ＤＮＡ配列領域
３６　　　　第２変異ｌｏｘ配列
３８　　　　ポリＡ付加配列
３９ａ　　　ＦＲＴ配列
３９ｂ　　　ＦＲＴ配列
３９ｃ　　　ＦＲＴ配列
４０　　　　組換え済み標的遺伝子
４０ａ　　　第３ＤＮＡ配列領域
５０　　　　変異導入ベクター
５１　　　　変異導入カセット
５２　　　　第３変異ｌｏｘ配列
５４　　　　変異導入ＤＮＡ配列領域
５６　　　　第４変異ｌｏｘ配列
５８　　　　第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列領域
６０　　　　変異導入遺伝子
６４　　　　第５変異ｌｏｘ配列
６６　　　　第６変異ｌｏｘ配列

Claims (24)

  1. 染色体上の組換え済み標的遺伝子（４０）に含まれる互いに異なる第１変異ｌｏｘ配列（３０）および第２変異ｌｏｘ配列（３６）の対で挟まれた標的ＤＮＡ配列（３２）と、変異導入ベクター（５０）の変異導入カセット（５１）によって、該変異導入カセット（５１）に含まれる互いに異なる第３変異ｌｏｘ配列（５２）および第４変異ｌｏｘ配列（５６）の対で挟まれた変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）とを、Ｃｒｅレコンビナーゼの介在作用によって組換えて導入することを特徴とする遺伝子変異導入方法。
  2. 請求項１に記載の遺伝子変異導入方法であって、該組換え済み標的遺伝子（４０）が、標的遺伝子（１０）と標的組換えベクター（２０）との相同組換えで得られた組換え遺伝子であって、互いに異なる第１変異ｌｏｘ配列（３０）および第２変異ｌｏｘ配列（３６）の対で挟まれた標的ＤＮＡ配列（３２）を含んでいることを特徴とする遺伝子変異導入方法。
  3. 請求項１または２に記載の遺伝子変異導入方法であって、該変異導入ベクター（５０）の変異導入カセット（５１）が、第３変異ｌｏｘ配列（５２）および第４変異ｌｏｘ配列（５６）の対で挟まれた変異ＤＮＡ配列（５７）と第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）とを含むことを特徴とする遺伝子変異導入方法。
  4. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該変異導入ベクター（５０）の変異導入カセット（５１）に含まれる第３変異変異ｌｏｘ配列（５２）と第４変異変異ｌｏｘ配列（５６）との対で挟まれた変異ＤＮＡ配列（５７）が、Ｃｒｅレコンビナーゼの介在作用によって、該組換え済み標的遺伝子（４０）に含まれる第１変異ｌｏｘ配列（３０）および第２変異ｌｏｘ配列（３６）の対で挟まれた標的ＤＮＡ配列（３２）と組換わることを特徴とする遺伝子変異導入方法。
  5. 請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該第１変異ｌｏｘ配列（３０）がｌｏｘＰ配列の５’側反復繰り返し配列に変異が存在する変異ｌｏｘ配列、第２変異ｌｏｘ配列（３６）がｌｏｘＰ配列のスペーサー配列に変異が存在する変異ｌｏｘ配列、第３変異ｌｏｘ配列（５２）がｌｏｘＰ配列の３’側反復繰り返し配列に変異が存在する変異ｌｏｘ配列、および第４変異ｌｏｘ配列（５６）がｌｏｘＰ配列のスペーサー配列に変異が存在する変異ｌｏｘ配列であること、を特徴とする遺伝子変異導入方法。
  6. 請求項１ないし５のいずれか１項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該第１変異ｌｏｘ配列（３０）がｌｏｘ７１であり、第２変異ｌｏｘ配列（３６）がｌｏｘ２２７２であり、第３変異ｌｏｘ配列（５２）がｌｏｘＫＲ３であり、および第４変異ｌｏｘ配列（５６）がｌｏｘ２２７２であることを特徴とする遺伝子変異導入方法。
  7. 請求項１ないし６のいずれか１項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該組換え済み標的遺伝子（４０）と変異導入ベクター（５０）の変異導入カセット（５１）との組換えにより得られた変異導入遺伝子（６０）が、第１変異ｌｏｘ配列（３０）ならびに第２変異ｌｏｘ配列（３６）の対と、該第３変異ｌｏｘ配列（５２）ならびに第４変異ｌｏｘ配列（５６）の対とのそれぞれの組換えによって得られる第５変異ｌｏｘ配列（６４）ならびに第６変異ｌｏｘ配列（６６）で挟まれた変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）を含み、ならびに該変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）が変異ＤＮＡ配列（５７）と第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）を含むことを特徴とする遺伝子変異導入方法。
  8. 請求項７に記載の遺伝子変異導入方法であって、該第５変異ｌｏｘ配列（６２）が、ｌｏｘＰ配列の５’側および３’側反復繰り返し配列に第１変異ｌｏｘ配列（３０）のｌｏｘ７１と第３変異ｌｏｘ配列（３６）のｌｏｘＫＲ３の変異を併せ持つｌｏｘ７１／ＫＲ３であり、および第６変異ｌｏｘ配列（６６）がｌｏｘ２２７２であることを特徴とする遺伝子変異導入方法。
  9. 請求項１ないし８項のいずれか１項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該遺伝子変異導入方法が、該標的遺伝子（１０）と標的組換えベクター（２０）との相同組換えによって、該標的遺伝子（１０）の第１ＤＮＡ配列領域（１０ａ）を、該標的組換えベクター（２０）の第２ＤＮＡ配列領域（２０ａ）と相同組換えして、該第１ＤＮＡ配列領域（１０ａ）に含まれる変異導入対象エキソン（１２）を、該第２ＤＮＡ配列領域（２０ａ）に含まれる標的ＤＮＡ配列（３２）で組換えて組換え済み標的遺伝子（４０）を得ることからなる相同組換え工程と、該組換え済み標的遺伝子（４０）の第３ＤＮＡ配列領域（４０ａ）に含まれる第１変異ｌｏｘ配列（３０）と第２変異ｌｏｘ配列（３６）の対と、その対で挟まれた変異標的ＤＮＡ配列領域（３５）とを、Ｃｒｅレコンビナーゼと１対の変異型ｌｏｘ配列からなるＣｒｅ−変異ｌｏｘシステムの介在作用によって、該変異導入ベクター（５０）の変異導入カセット（５１）で組換えて変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）を導入した変異導入遺伝子（６０）を得る変異導入工程と、からなる遺伝子変異導入方法とからなり、
    該標的組換えベクター（２０）が、ネガティブ選択マーカーＤＮＡ配列（２２）と、第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）と、標的ＤＮＡ配列領域（２６）と、第２相同組換えＤＮＡ配列領域（３４）とを含むこと、および該標的ＤＮＡ配列領域（２６）が、第１変異ｌｏｘ配列（３０）と、標的ＤＮＡ配列（３２）と、第１ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（３４）と、第２変異ｌｏｘ配列（３６）と、ポリＡ付加配列（３８）とを含み、ならびに該第１および第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２２、２８）が相同組換えに必要なＤＮＡ配列の長さを有すること；
    該組換え済み標的遺伝子（４０）の第３ＤＮＡ配列領域（４０ａ）が、第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）と、第１変異ｌｏｘ配列（３０）、変異標的ＤＮＡ配列領域（３５）と、第２変異ｌｏｘ配列（３６）と、第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２８）とを含み、および変異標的ＤＮＡ配列領域（３５）が、標的ＤＮＡ配列（３２）と、第１ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（３４）とを含むこと；
    該変異導入ベクター（５０）の変異導入カセット（５１）が、第３変異ｌｏｘ配列（５２）と、変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）と、第２変異ｌｏｘ配列（５６）と、を含み、ならびに該変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）が変異ＤＮＡ配列（５７）と、第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）とを含むこと；および
    該変異導入遺伝子（６０）が、第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）と、第５変異ｌｏｘ配列（６２）と、変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）と、第６変異ｌｏｘ配列（６６）と、第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２８）と、を含み、ならびに変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）が、変異ＤＮＡ配列（５７）と、第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）とを含むこと、からなること；
    を特徴とする遺伝子変異導入方法。
  10. 　請求項１ないし９のいずれか１項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該変異導入ベクターの変異導入カセット（５１）に含まれる変異ＤＮＡ配列（５７）が変異エキソンであることを特徴とする遺伝子変異導入方法。
  11. 　請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該変異導入遺伝子（６０）に含まれる変異ＤＮＡ配列（５７）が変異エキソンであることを特徴とする遺伝子変異導入方法。
  12. 　請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該標的遺伝子がヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）関連電位依存性カリウムチャンネルＫＣＮＱ２サブユニットの遺伝子由来であることを特徴とする遺伝子変異導入方法。
  13. 請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の遺伝子変異導入方法にあって、該標的遺伝子（１０）の標的変異が遺伝子ＫＣＮＱ２のＹ２８４Ｃ（配列番号１および２）またはＴ３０６Ａ（配列番号３および４）であることを特徴とする遺伝子変異導入方法。
  14. 請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の遺伝子変異導入方法によって標的遺伝子（１０）に遺伝子変異を導入して変異導入遺伝子（６０）を作製することを特徴とする変異導入遺伝子の作製方法。
  15. 第１相同組換えＤＮＡ配列領域（２４）と、第５変異ｌｏｘ配列（６２）と、変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）と、第６変異ｌｏｘ配列（６６）と、第２相同組換えＤＮＡ配列領域（２８）と、を含み、ならびに変異導入ＤＮＡ配列領域（５４）が、変異ＤＮＡ配列（５７）と、第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）とを含み、かつ、第５変異ｌｏｘ配列（６２）と第６変異ｌｏｘ配列（６６）との対で挟まれている変異導入遺伝子（６０）であることを特徴とする変異導入遺伝子。
  16. 請求項１５に記載の変異導入遺伝子であって、該第５変異ｌｏｘ配列（６２）と第６変異ｌｏｘ配列（６６）との対が、第１変異ｌｏｘ配列（３０）と第２変異ｌｏｘ配列（３６）との対と、第３変異ｌｏｘ配列（５２）と第４変異ｌｏｘ配列（５６）との対との組換えによって得られたものであることを特徴とする変異導入遺伝子。
  17. 第３変異ｌｏｘ配列（５２）と第４変異ｌｏｘ配列（５６）との対およびその対で挟まれた変異ＤＮＡ配列（５７）ならびに第２ポジティブ選択マーカーＤＮＡ配列（５８）とを含む変異導入カセットであることを特徴とする変異導入カセット。
  18. 請求項１７に記載の変異導入カセットであって、該第３変異ｌｏｘ配列（５２）がｌｏｘＫＲ３であり、第４変異ｌｏｘ配列（５６）がｌｏｘ２２７２であるとともに、変異ＤＮＡ配列（５７）が変異エキソンを含むことを特徴とする変異導入カセット。
  19. 請求項１７または１８に記載の変異導入カセットを含むことを特徴とする変異導入ベクター。
  20. 　請求項１４に記載の変異導入遺伝子の作製方法で作製した変異導入遺伝子または請求項１５もしくは１６に記載の変異導入遺伝子が導入されていることを特徴とする変異導入ＥＳ細胞。
  21. 　請求項１４に記載の変異導入遺伝子の作製方法で作製した変異導入遺伝子または請求項１５もしくは１６に記載の変異導入遺伝子が導入されていることを特徴とするノックイン非ヒト哺乳動物。
  22. 請求項２１に記載のノックイン非ヒト哺乳動物であって、該ノックイン非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とするノックイン非ヒト哺乳動物。
  23. 　請求項２１または２２に記載のノックイン非ヒト動物において、該変異遺伝子がヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん（ＢＦＮＣ）関連電位依存性カリウムチャンネルの遺伝子ＫＣＮＱ２サブユニット由来であることを特徴とするノックイン非ヒト哺乳動物。
  24. 　請求項１８ないし２３のいずれか１項に記載のノックイン非ヒト哺乳動物において、該変異遺伝子が変異遺伝子ＫＣＮＱ２のＹ２８４ＣまたはＴ３０６Ａであることを特徴とするノックイン非ヒト動物。
PCT/JP2009/068729 2008-10-23 2009-10-23 変異遺伝子導入方法、変異導入遺伝子、変異導入カセットならびに変異導入ベクターおよびノックイン非ヒト哺乳動物 WO2010047423A1 (ja)

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