CN108070610B - 植物基因组定点敲入方法 - Google Patents

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    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Abstract

本发明提供了一种植物基因组定点敲入方法，该方法对供体DNA片段进行修饰，借助定点切割核酸酶对目标基因的特定位点进行切割，将供体DNA片段整合入切割位点。实验结果表明，本发明的方法可以高效的将供体DNA片段定点整合至受体植物的基因组中，与现有方法相比，敲入效率可提高5‑10倍。

Description

植物基因组定点敲入方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种植物基因组定点敲入方法。
背景技术
基因组编辑技术在近几年有了突破性的发展，包括锌指核酸技术(Zinc fingernuclease,ZFN)、为转录激活因子样效应物核酸酶技术(transcription activator-like(TAL)effector nucleases,Talen)和CRISPR/Cas9技术。这三种技术都可以在生物体基因组指定位点特异性的切割DNA产生双链断裂，从而利用生物的非同源末端连接或同源重组，进行定点编辑。ZFN和Talen技术用特异性的蛋白引导，蛋白元件的构建相对较复杂，编辑效率有待提高。CRISPR/Cas9技术以RNA引导，体外构建简单，编辑效率较高。目前，这三种技术已成功的应用于多种生物，包括大肠杆菌、酵母、水稻、拟南芥、大豆、玉米、小鼠和人类细胞等。
基因组编辑技术在生物体基因组的指定位点引入双链断裂后，其编辑的结果和目的主要包括碱基/片段的删除、插入和替换，其实现的策略主要包括下列4个方法：1)利用生物体的非同源末端连接(Non-homologous End Joining,NHEJ)机制引入随机突变；2)利用生物体的非同源末端连接机制删除一段序列；3)利用生物体的非同源末端连接机制插入一段序列；4)利用同源重组插入、删除或者替换一段序列。目前，在植物基因组中定点插入一段序列一直是一项难题，除非插入或者修改序列为筛选标签，否则其实现效率非常低，难以有效的应用于植物研究和育种。到目前为止，在植物领域一直缺乏高效的片段靶向敲入的方法。
综述所述，为了植物研究和育种的需要，本领域迫切需要开发一种高效的靶向敲入技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物基因组定点敲入方法及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种适用于植物基因靶向敲入的方法，所述方法包括步骤：
a)制备待敲入的供体DNA片段
提供待敲入的供体DNA片段，并对所述供体DNA片段的5’末端进行磷酸化修饰；
b)提供表达定点切割核酸酶的DNA构建物或载体，所述定点切割核酸酶在植物细胞表达后可定点切割目标位点；
c)将步骤a)制备的供体DNA片段和步骤b)提供的DNA构建物导入植物细胞中，
所述定点切割核酸酶在所述植物细胞中表达，并且所述定点切割核酸酶对目标位点进行切割形成待敲入缺口，所述供体DNA片段整合至所述缺口，从而实现定点敲入。
在另一优选例中，所述步骤a)中，所述供体DNA片段为单链DNA序列或双链DNA序列，优选为双链DNA序列。
在另一优选例中，所述步骤a)中，对所述供体DNA片段的两个5’末端均进行磷酸化修饰。
在另一优选例中，所述步骤a)中，还包括对所述供体DNA片段的5’和/或3’端的最末端的一个或多个(如2、3、4、或5个)碱基间的磷酸二脂键进行硫代修饰。
在另一优选例中，所述步骤b)中，所述定点切割核酸酶选自下组：ZFN、Talen和CRISPR/Cas9等。
在另一优选例中，所述步骤b)中，所述定点切割核酸酶为CRISPR/Cas9。
在另一优选例中，所述步骤b)中，提供表达定点切割核酸酶的DNA构建物的载体，所述载体表达CRISPR/Cas9系统，优选地所述载体为表达CRISPR/Cas9的质粒。
在另一优选例中，所述步骤c)中，所述供体DNA片段通过非同源末端连接机制(NHEJ)整合至目标位点。在另一优选例中，所述步骤c)中，使用基因枪将所述供体DNA片段和所述DNA构建物导入植物细胞。
在另一优选例中，所述步骤c)中，包括步骤：配制转导体系，所述转导体系包括供体DNA片段、CRISPR/Cas9质粒、金粉、氯化钙、和亚精胺。
在另一优选例中，所述转导体系中包括1体积份的供体DNA片段(浓度5-20μM，优选为10μM)；2体积份的CRISPR/Cas9质粒(浓度0.2-2ug/ul，优选为0.5ug/ul)；50体积份的金粉(浓度50-60mg/ml优选为60mg/ml)；50体积份的氯化钙(浓度1-5M，优选为2.5M)；20体积份的亚精胺(浓度0.05-0.5M，优选为0.1M)。
在另一优选例中，所述植物包括但不限于：水稻、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱等。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤d)，将步骤c)获得的植物细胞培养成为植株。
本发明的第二方面，提供了一种植物细胞，其特征在于，所述植物细胞为采用本发明第一方面所述的植物基因靶向敲入的方法构建的植物细胞。
在另一优选例中，所述植物细胞为离体细胞。
本发明的第三方面，提供了一种用于植物基因靶向敲入试剂盒，其特征在于，所述试剂盒执行本发明第一方面所述的方法。
在另一优选例中，所述试剂盒包括独立保存的供体DNA片段、CRISPR/Cas9质粒、金粉、氯化钙、和亚精胺。
在另一优选例中，所述试剂盒包括1体积份的供体DNA片段(浓度5-20μM，优选为10μM)；2体积份的CRISPR/Cas9质粒(浓度0.2-2ug/ul，优选为0.5ug/ul)；50体积份的金粉(浓度50-60mg/ml优选为60mg/ml)；50体积份的氯化钙(浓度1-5M，优选为2.5M)；20体积份的亚精胺(浓度0.05-0.5M，优选为0.1M)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示靶向敲入示意图。(A)修饰后的供体DNA片段。该双链DNA的5’端进行了磷酸化修饰，最外侧的1-3个磷酸二脂键进行硫基化修饰(101)。(B)长片段供体DNA制备示意图。将含有磷酸化和硫基化修饰的供体DNA片段连接至长链DNA两侧，即可获得修饰的长链供体DNA片段。(C)利用修饰供体DNA进行植物靶向敲入示意图。
图2显示在水稻DRO1基因位点中靶向敲入ADH1片段示意图。(A)修饰后的ADH1供体DNA片段，*代表硫基化修饰的磷酸二脂键(201)。(B)水稻DRO1基因位点中靶向敲入ADH1片段。202为水稻DRO1基因位点，203为敲入位点，204为CRISPR/Cas9质粒，205为修饰后的供体DNA片段，206为检测用引物。(C)水稻靶向敲入结果检测结果。ADH1为普通的未修饰的供体DNA，ADH1*为修饰后的供体DNA片段，采用荧光定量PCR对水稻遗传转化阳性愈伤组织的DNA进行检测。
图3为水稻DRO1基因位点中靶向敲入ADH1检测结果。(A)PCR检测示意图。设计引物检测敲入结果，ADH1敲入后扩增片段为220bp，未成功敲入的为160bp。(B)PCR检测结果。自上而下的供体ADH1分别为未修饰的单链DNA、未修饰的双链DNA和修饰的双链DNA。电泳结果中靶向敲入阳性的包含220bp条带。(C)水稻植株中ADH1靶向敲入效率统计表。(D)水稻植株中ADH1靶向敲入效率统计图。(E)ADH1靶向敲入DNA测序结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种高效的植物基因组定点敲入方法，该方法对供体DNA片段进行修饰，借助定点切割核酸酶对目标基因的特定位点进行切割，将供体DNA片段整合入切割位点。实验结果表明，本发明的方法可以高效的将供体DNA片段定点整合至受体植物的基因组中，效率可提高5-10倍。在此基础上完成了本发明。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明提供了一种适用于植物的基因组定点敲入的方法。具体的，通过将需要敲入的供体DNA进行体外化学修饰后，用于植物基因组编辑，从而实现将该供体DNA高效率的定点敲入。本发明是一种植物育种的有效方法。
本发明提供了一种在植物基因组中简单高效的实现定点片段敲入的方法，其实施步骤包括：
a)体外制备5’和3’端的最末端的多个碱基间的磷酸二脂键进行硫代修饰的供体双链DNA，同时对其两个5’末端进行磷酸化修饰，用作定点敲入的供体DNA片段；和
b)体外制备表达定点切割核酸酶的DNA片段；和
c)将上述两个DNA片段转化植物受体，并在合适的条件下，使转化的植物细胞中的DNA表达核酸酶，定点切割目标位点造成双链断裂，从而使供体DNA片段通过非末端连接机制整合至目标位点，实现定点敲入。
优选的，上述步骤a中的供体DNA片段的3个末端碱基间的2个的磷酸二脂键进行硫代修饰。
优选的，上述步骤b中用于表达定点切割核酸酶的DNA序列为表达CRISPR/Cas9元件的DNA片段。
优选的，上述步骤c中用于将DNA导入植物细胞的方法为基因枪。
显而易见的，上述步骤c中的受体植物包括但不限于水稻、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱等。
通过上述步骤，修饰后的供体DNA片段可以高效的定点整合至受体植物的基因组中，相比他人采用的未修饰的单链或者双链供体DNA，其效率可提高5-10倍。该发明提供的高效的片段定点敲入方法，可以广泛的用于植物研究和育种。
靶向敲入
在植物基因组的指定位点靶向敲入一段序列，即靶向敲入技术，一直是植物研究和育种迫切需要的技术，但现有的方法效率非常低。非同源末端连接是植物细胞对DNA断裂的主要修复机制。本发明采用修饰后的供体DNA片段，利用非同源末端连接机制，在植物中实现了高效的靶向敲入。
本发明人经过广泛而深入的研究和实验，发现修饰后的DNA供体确实能够极大的提高植物基因组编辑中靶向敲入的效率，并在此基础上完成了本发明。因此，本发明旨在提供一种适用于植物的高效的靶向敲入的方法。如图1所示，其实施步骤简要概括如下：
a)制备待敲入的供体DNA片段，对其5’和3’端的最末端的多个碱基间的磷酸二脂键进行硫代修饰，修饰结构如图1A-101，两个5’末端进行磷酸化修饰(图1A)。
b)体外制备表达定点切割核酸酶的DNA片段，该靶向切割的核酸酶可以是ZFN、Talen或者CRISPR/Cas9等(图1C，102)。
c)将上述两个DNA片段转化植物受体，并在合适的条件下，使转化的植物细胞中的DNA表达核酸酶，定点切割目标位点造成双链断裂，从而使供体DNA片段通过非末端连接机制整合至目标位点，实现定点敲入。
下面对实施方法作详细说明。
供体DNA片段制备
供体DNA碱基间的硫基化修饰需要位于DNA链的最末端。因此，本发明对最末端的1-3个磷酸二脂键进行修饰，优选2个(图1A，101)。同时对供体DNA的5’端进行磷酸化修饰。硫基化修饰和磷酸化修饰可以在寡核苷酸合成时引入，因此，对于较短的供体DNA的制备(通常120bp以内)，可以直接合成修饰的寡核苷酸单链后直接退火生成双链的供体DNA，而对于较长的供体DNA的制备，可以通过体外DNA连接获得(图1B)。
定点切割核酸酶DNA构建物的制备
ZFN、Talen和CRISPR/Cas9技术都可以在植物基因组上制造定点切割产生双链DNA断裂。因此，表达这3中定点切割核酸酶的DNA构建物都可以用于本发明。该DNA构建物可以是质粒，也可以是线性片段。由于CRISPR/Cas9技术相对简单高效，本发明优选CRISPR/Cas9在植物基因组上制造定点切割。
遗传转化
将修饰的供体DNA片段与表达定点切割核酸酶的DNA片段供体导入到植物受体中。导入方法包括但不局限于：基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法等。受体植物包括但不限于水稻、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱等。上述两种DNA片段导入植物细胞后，该供体DNA可以较长时间存在于受体植物细胞中。待定点切割核酸酶表达，并在基因组指定位点制造双链断裂后，由于供体DNA的5’端进行了磷酸化修饰，因此其可以有效的用于非同源末端连接。采用本发明的方法，极大的提高了供体DNA片段定点插入到该基因组位点的效率。因此，导入后通过常规的组织培养即可获得定点敲入的植株。
应用
本发明可以用于植物基因工程领域，用于植物研究和育种，尤其是具有经济价值的农作物和林业作物的遗传改良。
本发明的主要优点在于：
相比以前采用的未修饰的单链或者双链供体DNA，该发明提供了一种适用于植物的高效的片段定点敲入方法，其效率可提高5-10倍，使之可以广泛的用于植物研究和育种。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)或植物分子生物学-实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual,MelodyS.Clark编,Springer-verlag Berlin Heidelberg,1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1：在水稻DRO1基因5’UTR中敲入ADH1翻译增强子片段
利用体外合成的修饰后的DNA片段作为供体DNA，结合CRISPR/Cas9技术，将其导入到水稻DRO1基因的5’UTR区域。PCR、电泳和DNA测序检测表面，该片段能够高效的整合至目标位置。具体操作流程如下。
供体片段和CRISPR/Cas9载体制备
在体外合成修饰或未修饰的单链寡核苷酸片段：
表1
Figure BDA0001148199440000081
其中，5’P代表5’端磷酸化修饰，*号代表碱基间硫代修饰。合成后的单链寡核苷酸片段用水溶解至100μM后，用退火缓冲液(10mMTris-Cl,0.1mM EDTA,50mM NaCl,pH8.0)稀释至10μM，PCR仪退火结合成双链供体DNA(图2A)。其中，ssADH1和dsADH1分别为单链和双链的未修饰的供体DNA，为对照组。dsADH1*为修饰后的供体DNA片段，具体序列如下：
>ssADH1
5-GTGAATTCCA AGCAACGAAC TGCGAGTGAT TCAAGAAAAA AGAAAACCTG AGCTTTCGATCTAT-3(SEQ ID NO.1)
>dsADH1
5-GTGAATTCCA AGCAACGAAC TGCGAGTGAT TCAAGAAAAA AGAAAACCTG AGCTTTCGATCTAT-3(SEQ ID NO.1)
3-CACTTAAGGT TCGTTGCTTG ACGCTCACTA AGTTCTTTTT TCTTTTGGAC TCGAAAGCTAGATA-5(SEQ ID NO.2)
>dsADH1*
5-G*T*GAATTCCA AGCAACGAAC TGCGAGTGAT TCAAGAAAAA AGAAAACCTG AGCTTTCGATCT*A*T-3(SEQ ID NO.1)
3-C*A*CTTAAGGT TCGTTGCTTG ACGCTCACTA AGTTCTTTTT TCTTTTGGAC TCGAAAGCTAGA*T*A-5(SEQ ID NO.2)
针对水稻DRO1基因的5’UTR区域设计gRNA(序列1)，将该gRNA引导序列构建至水稻CRISPR/Cas9载体，体外制备该质粒。CRISPR/Cas9载体参考毛妍斐等人的方法构建(Mao etal.,2013)。
水稻DRO1基因5’UTR序列如下：
>CAGCCACGCTGCACCGAACCCTCCAATCCTTGGAACTTGAACCCCTTCAAATCACACCCAGTAGGCTACTAGTAGTACTTCTCTGCACCAATTCCATCGCCAATAGCAGCCACTACAAGTCTTACATCTCTCCTTTCCTCCTCTCTCTGCCATTGCTAGGAGCTTGCATTTCTTGGTAGCTTCATCAGCTAGCTGCTTTCTCCCTCCCCAATCTCTCATTCTTCAGGCCAGGATATGAAGGTAAAGGCTCAAACCATCGGTGTGATTAATCATTTCAGAGAGGTTAATAGATTTGAAGTGTTGGTAGTGTTGATCCATTTCTTGATGGCATCATGAGGCTTGGGTTTTCTCTGCAGATTTTCAGCTGGGTAGCCAACAAGATCAGTGGGAAGCAAGAAG(SEQ ID NO.3)
其中，下划线所示为gRNA靶序列(反向)，加粗碱基AT之间为Cas9切割位点。
基因枪转化水稻愈伤组织
将CRISPR/Cas9质粒、供体DNA与金粉按经优化的表2转导体系混合，按照伯乐PDS-1000台式基因枪的操作手册，转化用高渗培养基预处理4小时的水稻愈伤组织。利用潮霉素作为筛选标签，经常规组织培养筛选后获得阳性的抗性愈伤，进一步分化获得稳定转化植株。
表2
Figure BDA0001148199440000091
靶向敲入效率检测
将经组织培养筛选后的抗性愈伤分组混合，即ssADH1、dsADH1和dsADH*，提取基因组DNA。采用引物ADH1-F：5’-GAATTCCAAGCAACGAACTG(SEQ ID NO.4)和DRO-R2：5’-GGATCAACACTACCAACACTTCAA(SEQ ID NO.5)进行PCR扩增。如图2B所示，当ADH1以正向敲入靶点位置时通过PCR可以扩增获得145bp目标片段。荧光定量PCR和电泳检测表明，相对采用未修饰的ssADH1和dsADH1供体片段，修饰后的供体dsADH1*的靶向敲入效率明显较高(图2C)。
将筛选得到的阳性愈伤进一步分化获得稳定转化植株，共进行2批次的遗传转化，将转化获得的植株分别提取基因组DNA。在靶点上下游设计引物进行PCR扩增检测，扩增引物为DRO-F2：5’-CCATTGCTAGGAGCTTGCATTTC(SEQ ID NO.6)和DRO-R2：5’-GGATCAACACTACCAACACTTCAA(SEQ ID NO.7)。ADH1供体DNA靶向单拷贝敲入的PCR片段和未敲入的片段长度分别为220bp和160bp(图3A)。PCR扩增后电泳检测结果如图3B所示，部分样品扩增为220bp和160bp双条带，即为靶向敲入的样品。进一步的测序结果显示，ADH1供体DNA正确敲入靶点(图3E)。将两次独立转化实验的结果统计后，如图3C和图3D所示，单链供体ssADH1的敲入效率最低，在两次实验中都未能获得靶向敲入植株。以未修饰的双链DNA(dsADH1)作为供体片段时，能够较低效率的检测到靶向敲入植株(共3株)，说明双链DNA相对单链DNA的靶向整合效率要高。当对双链DNA进行磷酸化修饰和碱基间硫代修饰后，其靶向敲入的效率明显提高，相对未修饰的供体片段，提高了5-10倍左右，使用优化后的转导体系敲入效率可以达到54.5％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
参考文献
Mao,Y.,Zhang,H.,Xu,N.,Zhang,B.,Gou,F.,and Zhu,J.K.(2013).Applicationof the CRISPR-Cas System for Efficient Genome Engineering in Plants.Molecularplant.
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggatcaacac taccaacact tcaa 24

Claims (14)

1.一种适用于植物基因靶向敲入的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
a)制备待敲入的供体DNA片段
提供待敲入的供体DNA片段，并对所述供体DNA片段的5’末端进行磷酸化修饰，所述供体DNA片段为双链DNA序列，并且对所述供体DNA片段的两个5’末端均进行磷酸化修饰；
b)提供表达定点切割核酸酶的DNA构建物或载体，所述定点切割核酸酶在植物细胞表达后可定点切割目标位点；
c)将步骤a)制备的供体DNA片段和步骤b)提供的DNA构建物导入植物细胞中，
所述定点切割核酸酶在所述植物细胞中表达，并且所述定点切割核酸酶对目标位点进行切割形成待敲入缺口，所述供体DNA片段整合至所述缺口，从而实现定点敲入；
并且所述步骤a)中，还包括对所述供体DNA片段的5’和/或3’端的最末端的2、3、4、或5个碱基间的1-3个磷酸二脂键进行硫代修饰。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述定点切割核酸酶选自下组：ZFN、Talen和CRISPR/Cas9。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述定点切割核酸酶为CRISPR/Cas9。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，提供表达定点切割核酸酶的DNA构建物的载体，所述载体表达CRISPR/Cas9系统。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述载体为表达CRISPR/Cas9的质粒。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c)中，所述供体DNA片段通过非同源末端连接机制(NHEJ)整合至目标位点。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c)中，所述导入方法选自下组：基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法、聚乙二醇(PEG)介导法、或其组合。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c)中，使用基因枪将所述供体DNA片段和所述DNA构建物导入植物细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c)中，包括步骤：配制转导体系，所述转导体系包括供体DNA片段、CRISPR/Cas9质粒、金粉、氯化钙、和亚精胺。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转导体系中包括1体积份的供体DNA片段；2体积份的CRISPR/Cas9质粒；50体积份的金粉；50体积份的氯化钙；20体积份的亚精胺。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物包括但不限于：水稻、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤d)，将步骤c)获得的植物细胞培养成为植株。
13.一种用于植物基因靶向敲入试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括独立保存的供体DNA片段、CRISPR/Cas9质粒、金粉、氯化钙、和亚精胺，其中所述供体DNA片段为双链DNA序列，并且对所述供体DNA片段的两个5’末端均进行磷酸化修饰，并且所述试剂盒执行权利要求1所述的方法。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1体积份的供体DNA片段；2体积份的CRISPR/Cas9质粒；50体积份的金粉；50体积份的氯化钙；20体积份的亚精胺。
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