CN105821075B - 一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法 - Google Patents

一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法 Download PDF

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Abstract

一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，是以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列T1和T2；再分别构建靶序列T1和和T2的sgRNA表达盒；再将双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S‑H与上述T1sgRNA表达盒及T2sgRNA表达盒进行酶切‑连接反应，使T1sgRNA表达盒与T2sgRNA表达盒连接后插入该双元表达载体中，从而获得CRISPR/Cas9基因组编辑载体。本发明以茶树咖啡因合成酶为例，联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术，构建了包含茶树咖啡因合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础，同时对其它植物CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建提供了技术支撑。

Description

一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法。
背景技术
茶树是我国重要的木本经济作物，在我国国民经济中占有重要地位。我国不仅是世界上茶叶资源最丰富的国家，也是世界上茶叶资源最大的生产国、消费国和贸易国。然而，我国具有多抗及高品质的优良茶树品种不多。虽然我国一直非常重视茶树的品种改良工作，但由于茶树具有生长周期长、自交不亲和的特性，使得采用常规育种技术难以实现茶树育种工作取得突破性的进展。近年来分子育种及基因工程等现代分子生物学技术在水稻、西红柿、马铃薯等农作物品种改良中发挥了重要作用，也为茶树育种提供了新的途径。所以，茶树分子生物学研究成为了茶叶科学中最活跃和进展最快的一个领域。近年来，茶树转录组测序工作取得了重要进展，目前Genbank已收录了约35万条茶树mRNA序列，几乎涵盖了茶树中所有功能基因编码序列。此外，我国茶树的全基因组测序工作也于几年前在数家单位开始启动，并已相继完成，茶树全基因组序列将会在短期内释放。然而，像其它植物一样，面对大量的基因序列，我们对其功能了解却是非常缺少，从而制约了基因资源的利用。因此，确定茶树新基因的功能并高效利用新基因是未来茶树分子生物学研究中一个非常重要的主题，也就是说茶树后基因组时代即将降临。随着现代分子生物技术的突飞猛进，新型基因组编辑技术CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/CRISPR-associated protein 9)将会在茶树功能基因研究中发挥重要作用，预计将成为茶树后基因组时代不可或缺的研究工具。
基因组定点编辑技术是分子育种、基因的功能研究和遗传改造等重要工具，是通过某种途径对基因组DNA特定位点进行改造的一种手段。迄今为止，应用时间比较长的基因组编辑技术有锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸(Transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN)技术。但由于这两项技术DNA结合结构域的改造较为复杂，对每一个基因位点的编辑都需要重新设计、合成和组装2个核酸酶，载体构建困难，成为限制其发展的瓶颈。科学家一直在寻找精确而简单的基因组编辑方法，直到2013年发现了CRISPR/Cas9技术。CRISPR/Cas9技术是通过一段RNA来识别靶位点，因而在设计和构建上更加简单，只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性编辑。CRISPR/Cas9技术的出现，立即在整个生命科学领域掀起了席卷世界的一股“风暴”，短短几年内该技术迅速应用于世界各地的实验室，并成为基因组定点编辑的首选技术。
CRISPR/Cas广泛存在于古生菌和细菌的基因组中，属自身免疫系统，可降解入侵的病毒或质粒DNA。在该免疫系统中，Cas蛋白(CRISP-associated protein)含有两个核酸酶结构域，可以分别切割两条DNA链，切割后DNA双链断裂从而使入侵的外源DNA降解。CRISPR/Cas系统的组成结构比较固定，由CRISPR序列与Cas基因家族组成，其中CRISPR由一系列高度保守的重复序列(Repeat)与间隔序列(Spacer)相间排列组成，间隔序列可特异识别外源DNA。在CRISPR序列附近存在高度保守的CRISPR相关基因，这些基因编码的蛋白具有核酸酶功能，可以对DNA序列进行特异性切割。
CRISPR系统分为3种类型，现在常用的CRISPR/Cas系统由类型Ⅱ系统改造而来。类型Ⅱ系统的特征性蛋白为Cas9蛋白，具有加工产生CRISPR RNA(crRNA)和切割双链DNA功能。crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合体，此复合体一旦形成就能引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而tracrRNA/crRNA复合体可通过人工设计，融合crRNA与tracrRNA形成sgRNA(single-guided RNA)，sgRNA足以引导Cas9对DNA的定点切割。sgRNA可以通过载体表达或者化学合成后与Cas9蛋白共同进入细胞，对特异DNA序列剪切，从而促使DNA发生NHEJ(nonhomologous end-joining)导致的基因缺失或同源重组，实现基因敲除，结合参见图1。CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为选择性基因组编辑提供了一个简便而强大的工具。来自Streptococcus pyogenes的Cas9由于识别序列仅为2个碱基(GG)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。Cas9蛋白在目前测试过的几乎所有生物和细胞中均有活性，包括细菌、酵母、植物、鱼、以及哺乳动物细胞。该体系其中一个最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的sgRNA的引导下同时修饰多个基因组靶点。
目前植物CRISPR/Cas9系统已日趋完善，已在十多种植物中成功实现了定点基因组编辑，除了在本氏烟草拟南芥等模式植物上获得了成功，很快在小麦、玉米、水稻、高粱、西红柿以及甜橙等作物上也成功实现了CRISPR/Cas9的应用。最近，先后利用CRISPR/Cas9技术实现了木本植物杨树和观赏植物牵牛花基因组的定点编辑，将CRISPR/Cas9系统在植物中应用推上了新的领域。
然而，到目前为止尚未见有关CRISPR/Cas9技术在茶树上的应用报道，其中一个重要的原因是针对茶树的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建技术尚不完善。本发明以茶树中咖啡因合成酶基因为例，建立了茶树CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，该方法步骤如下：
1)以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列，其中：
靶序列T1为：5’-CTCACAAGCAGAGAAGGCT-3’(SEQ ID No.1),靶序列T2为5’-ATATCACTGCTGTGGCAGC-3’(SEQ ID No.2)；
2)构建靶序列T1和和T2的sgRNA表达盒：
以pYLgRNA-AtU3d-LacZ质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T1靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR(Overlapping PCR)反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T1sgRNA表达盒；
以pYLgRNA-AtU3b质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T2靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T2sgRNA表达盒；
3)利用限制性内切酶BsaI-HF和连接酶T4DNA ligase，将双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H与上述T1sgRNA表达盒及T2sgRNA表达盒进行酶切-连接反应，使T1sgRNA表达盒与T2sgRNA表达盒连接后插入该双元表达载体中，从而获得CRISPR/Cas9基因组编辑载体。
上述步骤2)中构建T1sgRNA表达盒的第一轮PCR反应包括二个PCR反应，第一个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.6所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.4所示；重叠PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10；
构建T2sgRNA表达盒的第一轮PCR反应包括二个PCR反应，第一个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.8所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.4所示；重叠PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。
所述步骤2)中构建T1sgRNA和T2sgRNA表达盒的第一轮PCR反应时的反应体系为：H2O 13.65μL、10×Buffer2μL、2mM的dNTP1.5μL、25mM的MgSO40.6μL、5mM的正向引物0.6μL、5mM的反向引物0.6μL、模板0.75μL、1U/μL的KOD-Plus酶0.3μL，总体积20μL；反应程序：94℃预变性3min，30个循环，94℃20s，58℃20s，68℃25s。
所述步骤2)中构建T1sgRNA和T2sgRNA表达盒的重叠PCR反应时的反应体系：H2O19.4μL、10×Buffer 3μL、2mM的dNTP3μL、25mM的MgSO41.2μL、10mM的正向引物0.9μL、10mM的反向引物0.9μL、稀释10倍的第一轮PCR产物1μL、1U/μL的KOD-Plus酶0.6μL，总体积30μL；反应程序：94℃预变性5min，22个循环，94℃25s，58℃25s，68℃30s。
本发明首次建立了茶树CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。
附图说明
图1是CRISPR/Cas9工作原理图。
图2是sgRNA设计；“---”连接处含有内含子序列，GG表示PAM识别位点，下划线标记的序列为候选靶序列。
图3是.pYLgRNA-AtU3d-LacZ，pYLgRNA-AtU3b和pYLCRISPR/Cas9P35S-H质粒电泳图。
其中：a表示.pYLgRNA-AtU3d-LacZ质粒；b表示pYLgRNA-AtU3b质粒；c表示pYLCRISPR/Cas9P35S-H质粒。
图4是sgRNA表达盒的构建流程图。
图5是第一、二轮PCR反应产物电泳图。
其中：M为marker，T1为针对靶序列T1的PCR，T2为针对靶序列T2的PCR，T1P和T2P表示第一轮PCR产物混合后进行了纯化。
图6是Golden gate cloning组装茶树CRISPR/Cas9基因组编辑载体。
图7是连接产物及质粒酶切电泳图。
其中：L为连接产物，TCA为TCA基因编辑载体，C表示pYLCRISPR/Cas9P35S-H空载体，M为marker。
图8是TCA基因编辑载体部分测序图。
图9是TCA基因编辑载体测序结果。
其中：深灰色背景为AtU3d启动子序列，浅灰色背景为AtU3b启动子序列，前后加黑斜体序列分别为靶序列T1和靶序列T2，下划线标记的序列为sgRNA的3’区域保守结构序列。
具体实施方式
1.材料与方法
双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H，GeneBank登录号为AY310901，是在双元载体质粒pCAMBIA1300(ACCESSION:AF234296)的基础上进行改造而来的，由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动Cas9p序列的表达。该质粒在E.coli TOP10F’(LacIq)菌株繁殖，该菌株LacIq基因型产生的阻碍蛋白可抑制ccdB大肠杆菌致死基因的表达。植物CRISPR/sgRNA载体pYLgRNA-AtU3d-LacZ(KR029100.1)和pYLgRNA-AtU3b(KR029097.1)，为植物CRISPR/Cas9基因编辑载体的中间载体，分别提供small nuclear(sn)RNA U3d和U3b启动子序列，驱动sgRNA的表达并保证转录出的sgRNA停留在细胞核中与Cas9结合，且二者均提供长度为57nt的sgRNA3’区域保守结构序列，可与靶基因的20nt靶序列组装成sgRNA。此外，pYLgRNA-AtU3d-LacZ还提供了LacZ标记基因(198bp)的表达元件，可在含有X-gal的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆。
本文所需引物序列如表1所示，引物合成与序列测序均由上海生工生物工程技术服务公司完成，测序引物使用TCA-SP-L2和TCA-SP-R-C。
表1所需引物序列
引物 序列(5’--3’)
TCA-U-F CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG，SEQ ID No.3；
TCA-gR-R CGGAGGAAAATTCCATCCAC，SEQ ID No.4；
TCAgRT1 CTCACAAGCAGAGAAGGCTGTTTTAGAGCTAGAAAT，SEQ ID No.5；
TCAU3dT1 AGCCTTCTCTGCTTGTGAGTGACCAATGGTGCTTTG，SEQ ID No.6；
TCAgRT2 CATATCACTGCTGTGGCAGCGTTTTAGAGCTAGAAAT，SEQ ID No.7；
TCAU3bT2 GCTGCCACAGCAGTGATATGTGACCAATGTTGCTCC，SEQ ID No.8；
TCA-Pps-R-C TTCAGAGGTCTCTACCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG，SEQ ID No.9；
TCA-Pgs-GG2 AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC，SEQ ID No.10；
TCA-Pps-GG2 TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG，SEQ ID No.11；
TCA-Pgs-L-C AGCGTGGGTCTCGCTCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCT，SEQ ID No.12；
TCA-SP-L2 GTCGTGCTCCACATGTTGACCG，SEQ ID No.13；
TCA-SP-R-C CCGACATAGATGCAATAACTT，SEQ ID No.14；
2.sgRNA序列设计及分析
为提高打靶效率针对TCS基因设计2个靶点，设计靶点遵循如下原则：目的基因的正链和负链靶点的打靶效率大致相同，都可以设计靶点；靶点的GC％尽量不要低于40％，靶点序列GC％偏高(50-70％)有较高的打靶效率；靶点内(按5-N20NGG-3方向)不要有连续4个以上的T，以防RNA Pol III将其作为转录终止信号；虽然非特异打靶(脱靶)对植物基因打靶不是很重要的问题，但应进行靶点特异性分析，用靶点+NGG(前后各加几十碱基)与茶树转录组做blast分析，避免使用与同源序列差异少于5个碱基的靶点(在切点附近和PAM可有2个碱基差异就具有特异性)。把靶点序列连接到sgRNA序列的5’端(靶序列+GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT)，做二级结构分析。
3.采用常规PCR和Overlapping PCR构建sgRNA表达盒
3.1Target 1sgRNA(T1sgRNA)构建
3.1.1第一轮PCR
以2-5ng pYLgRNA-AtU3d-LacZ质粒为模板分别进行两个PCR反应，在第一个PCR反应中使用引物TCA-U-F(上游引物)和TCAU3dT1(下游引物)，第二个PCR反应使用引物TCAgRT1(上游引物)和TCA-gR-R(下游引物)。第一个PCR和第二个PCR反应分别在两个PCR管中进行，采用相同的PCR反应体系和相同的PCR反应程序。将第一个和第二个PCR反应的产物混合后，取3μL PCR产物，电泳检查产物长度是否符合预期。
上述PCR反应体系，总体积20μL：H2O 13.65μL、10×Buffer 2μL、2mM的dNTP1.5μL、25mM的MgSO40.6μL、5mM的正向引物0.6μL、5mM的反向引物0.6μL、模板0.75μL、1U/μL的KOD-Plus酶0.3μL。
上述PCR反应程序：94℃预变性3min，30个循环，94℃20s，58℃20s，68℃25s。
3.1.2第二轮PCR
取第一轮PCR中的二次PCR反应产物混合后所得的第一轮PCR产物U3dT1-gRNA1μL，用H2O稀释10倍；再取1μL稀释的第一轮PCR产物U3dT1-gRNA作为模板，以TCA-Pps-R-C和TCA-Pgs-GG2分别作为上、下游引物，PCR扩增U3dT1-gRNA。取3μL PCR产物，电泳检查产物长度是否符合预期，并估计样品的大致浓度。
采用的PCR反应体系，总体积30μL：H2O 19.4μL、10×Buffer 3μL、2mM的dNTP3μL、25mM的MgSO4 1.2μL、10mM的正向引物0.9μL、10mM的反向引物0.9μL、稀释10倍的第一轮PCR产物1μL、1U/μL的KOD-Plus酶0.6μL。
采用的PCR反应程序：94℃预变性5min，22个循环，94℃25s，58℃25s，68℃30s。
3.2Target 2sgRNA(T2sgRNA)构建
3.2.1第一轮PCR
分别取2-5ng pYLgRNA-AtU3b质粒作为模板进行二个PCR反应，在第一个PCR反应中使用引物TCA-U-F(上游引物)和TCAU3bT2(下游引物)，第二个PCR反应使用引物TCAgRT2(上游引物)和TCA-gR-R(下游引物)。TCA-U-F/TCAU3bT2扩出U3bT2序列，TCAgRT2/TCA-gR-R扩出T2sgRNA序列。反应完毕，将两个反应的产物混合，取3μLPCR产物，电泳检查产物长度是否符合预期。
采用的PCR反应体系，总体积20μL：H2O13.65μL、10×Buffer2μL、2mM的dNTP1.5μL、25mM的MgSO40.6μL、5mM的正向引物0.6μL、5mM的反向引物0.6μL、模板0.75μL、1U/μL的KOD-Plus酶0.3μL。
采用的PCR反应程序：94℃预变性3min，30个循环，94℃20s，58℃20s，68℃25s。
3.2.2第二轮PCR
取第一轮PCR中的二次PCR反应产物混合后所得的第一轮PCR产物U3bT2-gRNA1μL，用H2O稀释10倍；再取1μL稀释的第一轮PCR产物U3bT2-gRNA作为模板，以TCA-Pps-GG2和TCA-Pgs-L-C为引物，PCR扩增U3bT2-gRNA。取3μL电泳检查产物长度是否符合预期。
采用的PCR反应体系，总体积30μL：H2O19.4μL、10×Buffer 3μL、2mM的dNTP3μL、25mM的MgSO41.2μL、10mM的正向引物0.9μL、10mM的反向引物0.9μL、稀释10倍的第一轮PCR产物1μL、1U/μL的KOD-Plus酶0.6μL。
采用的PCR反应程序：94℃预变性5min，22个循环，94℃25s，58℃25s，68℃30s。
4.组装sgRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9载体
4.1双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H与sgRNA表达盒的酶切-连接反应
于上述通过常规PCR和Overlapping PCR构建好的T1sgRNA和T2sgRNA表达盒中分别加入9倍体积的无水乙醇混匀，室温下12000rpm/min离心10min，去上清，加入1mL70％质量浓度的乙醇洗沉淀1次，室温下12000rpm/min离心3min，去上清，37℃干燥30min，各加入30μL无菌水。使用双元表达载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应体系进行酶切、连接。反应程序：37℃孵育1min，16℃孵育1min，30个循环，最后75℃灭活内切酶5min。酶切-连接产物加入9倍体积的无水乙醇混匀，室温下12000rpm/min离心10min，去上清，加入1mL70％质量浓度的乙醇洗沉淀1次，室温下12000rpm/min离心3min，去上清，37℃干燥30min，各加入10μL无菌水。
上述提及的双元表达载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应体系：10×CutSmartBuffer 3μL、10mM ATP 3μL、pYLCRISPR/Cas9质粒160ng、T1sgRNA表达盒30ng、T2sgRNA表达盒30ng、BsaI-HF 1μL、T4DNA ligase 0.2μL、H2O加至30μL。
4.2酶切-连接产物的转化与质粒提取
从-80℃冰箱中取出50μL DH 5α感受态细胞，放置在冰上直至融化，取8μL连接产物加入DH 5α感受态细胞离心管，轻轻小弹离心管使之混匀，冰浴20min，于42℃水浴中热击90s后，迅速将管子移到冰中放置2min，加入平衡至室温的750μLLB培养基，37℃振荡培养45min，取100μL菌液涂到含50μg/mLKan、0.5mM IPTG和40μg/mL X-gal的LB平板，将平板于37℃倒置过夜培养，挑取蓝斑菌落，于3mL含50μg/mLKan的LB液体培养基中震荡培养过夜，使用质粒提取试剂盒提取质粒，使用Mlu I酶切验证，挑取正确质粒进行测序验证。
5.结果与分析
5.1sgRNA设计
sgRNA序列全长97nt，分为两部分，5’决定靶序列的20nt种子序列(seedsequence)和3’区域为保守的结构序列。因此构建针对特定靶位点的sgRNA，只需要克隆决定靶序列的5’端20nt。从genbank中下载茶树TCA基因组序列和cDNA序列，分析其内含子所在区域。结果表明(如图2所示)，TCS1基因含3个内含子。在此基础上搜寻TCA的CRISPR/Cas9靶序列，结果共搜寻到18个不含内含子的候选靶序列。对18个候选靶序列进行结构分析，靶序列与sgRNA序列产生连续配对7bp以上会抑制其与染色体DNA靶序列结合靶点，因此要避免使用连续配对7bp以上的靶序列。分析结果表明，在TCA1基因ORF内的靶序列“CTCACAAGCAGAGAAGGCT”(设为靶序列T1，如SEQ ID No.1所示)和非编码区内靶序列“ATATCACTGCTGTGGCAGC”(设为靶序列T2，如SEQ ID No.2所示)较为理想，能作为sgRNA序列的seed sequence。
5.2pYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b和pYLCRISPR/Cas9P35S-H质粒提取
将分别含有pYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b和pYLCRISPR/Cas9P35S-H质粒的菌划线活化，挑取单菌摇菌，采用质粒提取试剂盒提取质粒。电泳结果表明，提取的质粒符合下一步实验的要求。
5.3sgRNA表达盒的构建
sgRNA需要在植物细胞内合成从而指导Cas9蛋白编辑靶基因，而sgRNA的合成是通过sgRNA表达盒来完成，sgRNA表达盒由启动子序列和gRNA序列组成。pYLgRNA载体(pYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b)提供了不同的snRNA启动子可在植物细胞核内转录gRNA，并使gRNA停留在细胞核内发挥其功能。此外，pYLgRNA载体还提供gRNA中保守序列。因此，以pYLgRNA质粒为模板，通过常规PCR可以获得snRNA启动子序列和gRNA中保守序列，而gRNA中5’段的种子序列在引物合成时导入,联合应用常规PCR和overlapping PCR将启动子序列和gRNA序列组装在一起(如图4)。如图5所示，针对靶序列T1的第一轮PCR获得了一个360bp和一个130bp左右的片段，分别为U3d启动子和连接T1靶序列的gRNA；而针对靶序列T2的第一轮PCR获得了一个380bp和一个130bp左右的片段，分别为U3b启动子和连接T2靶序列的gRNA；针对靶序列T1的第二轮PCR将U3d启动子片段和gRNA片段2个分离的片段连接在一起组装成T1sgRNA表达盒；针对靶序列T2的第二轮PCR将U3b启动子片段和gRNA片段2个分离的片段连接在一起组装成T2sgRNA表达盒。
5.4T1sgRNA和T2sgRNA表达盒的拼接及与Cas9双元表达载体的组合
T1sgRNA和T2sgRNA两个单独的表达盒构建好后，需要将两个表达盒拼接在一起，并且插入Cas9双元表达载体中，以便通过农杆菌的介导整合到茶树基因组中，从而在茶树细胞内进行表达，获得Cas9和gRNA，进而对目标基因进行编辑。我们应用Golden gatecloning技术，一步完成sgRNA表达盒的拼接及与Cas9双元表达载体的组合，从而获得CRISPR/Cas编辑载体(图6)。如图7所示，酶切、连接产物可见一条980bp左右的电泳条带，表明T1sgRNA和T2sgRNA表达盒连接成功，同时还可见一条>4000bp的电泳条带，说明T1sgRNA和T2sgRNA表达盒可能已组装进入pYLCRISPR/Cas9P35S-H双元表达载体。连接产物转化DH5α后摇菌提取质粒，以Mlu I酶切，结果如图7所示，可见两条电泳条带，其中一条950bp左右的条带为T1sgRNA和T2sgRNA连接片段，而pYLCRISPR/Cas9P35S-H双元表达载体未见950bp左右的电泳条带，说明酶切、连接成功，获得了TCA CRISPR/Cas9基因编辑载体。
5.5测序验证TCA CRISPR/Cas9基因编辑载体
为了进一步验证TCA CRISPR/Cas9基因编辑载体是否构建成功，将获得的10个质粒送上海生物工程技术有限公司测序，测序结果(如图8)表明，T1sgRNA和T2sgRNA表达盒构建成功，在119bp处检测到T1,T2靶序列，紧接靶序列后检测到gRNA保守序列的存在，同时在T1和T2靶序列上游分别检测到U3d和U3b启动子序列，在T1sgRNA表达盒上游T2sgRNA表达盒下游均检测到了pYLCRISPR/Cas9P35S-H双元表达载体序列，结合参见图9。测序结果表明：T1sgRNA表达盒和T2sgRNA表达盒构建成功，并成功组装入pYLCRISPR/Cas9P35S-H双元表达载体，证实TCA CRISPR/Cas9基因编辑载体构建成功。

Claims (1)

1.一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法，其特征在于，该方法步骤如下：
1)以茶树咖啡因合成酶基因为基础设计两条靶序列，其中靶序列T1为：5’-CTCACAAGCAGAGAAGGCT-3’,靶序列T2为5’-ATATCACTGCTGTGGCAGC-3’；
2)构建靶序列T1和T2的sgRNA表达盒：
以pYLgRNA-AtU3d-LacZ质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T1靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T1sgRNA表达盒；其中，该第一轮PCR反应包括两个PCR反应，该两个PCR反应分别在两个PCR管中进行后再将两个反应产物混合；第一个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.6所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.4所示；重叠PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；
以pYLgRNA-AtU3b质粒为模板进行第一轮PCR反应，获得sgRNA表达的启动子片段和连接T2靶序列的gRNA片段，再通过重叠PCR反应将该启动子片段与gRNA片段连接，以组装成T2sgRNA表达盒；其中，该第一轮PCR反应包括两个PCR反应，该两个PCR反应分别进行后再将两个反应产物混合；第一个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.8所示，第二个PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.4所示；重叠PCR反应使用的引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；
上述提及的构建T1sgRNA和T2sgRNA表达盒的第一轮PCR反应时的反应体系为：H2O13.65μL、10×Buffer2μL、2mM的dNTP1.5μL、25mM的MgSO40.6μL、5mM的正向引物0.6μL、5mM的反向引物0.6μL、模板0.75μL、1U/μL的KOD-Plus酶0.3μL，总体积20μL；反应程序：94℃预变性3min，30个循环，94℃20s，58℃20s，68℃25s；
上述提及的构建T1sgRNA和T2sgRNA表达盒的重叠PCR反应时的反应体系：H2O 19.4μL、10×Buffer 3μL、2mM的dNTP3μL、25mM的MgSO41.2μL、10mM的正向引物0.9μL、10mM的反向引物0.9μL、稀释10倍的第一轮PCR产物1μL、1U/μL的KOD-Plus酶0.6μL，总体积30μL；反应程序：94℃预变性5min，22个循环，94℃25s，58℃25s，68℃30s；
3)利用限制性内切酶BsaI-HF和连接酶T4DNA ligase，将双元表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H与上述T1sgRNA表达盒及T2sgRNA表达盒进行酶切-连接反应，使T1sgRNA表达盒与T2sgRNA表达盒连接后插入该双元表达载体中，从而获得CRISPR/Cas9基因组编辑载体；其中，该酶切-连接反应程序为：37℃孵育1min，16℃孵育1min，30个循环，最后75℃灭活内切酶5min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2734621B1 (en) 2011-07-22 2019-09-04 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
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US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
IL310721A (en) 2015-10-23 2024-04-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
EP3494215A1 (en) 2016-08-03 2019-06-12 President and Fellows of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
EP3497214B1 (en) 2016-08-09 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
JP2019530464A (ja) 2016-10-14 2019-10-24 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸塩基エディターのａａｖ送達
CN106636184A (zh) * 2016-11-17 2017-05-10 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一种水稻抽穗期基因载体的应用
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
CN110914310A (zh) 2017-03-10 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 胞嘧啶至鸟嘌呤碱基编辑器
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
EP3658573A1 (en) 2017-07-28 2020-06-03 President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace)
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
CN107653256A (zh) * 2017-11-21 2018-02-02 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用
GB201807192D0 (en) * 2018-05-01 2018-06-13 Tropic Biosciences Uk Ltd Compositions and methods for reducing caffeine content in coffee beans
DE112020001306T5 (de) 2019-03-19 2022-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Verfahren und zusammensetzungen zur editierung von nukleotidsequenzen
CN111424050B (zh) * 2020-03-04 2022-02-22 深圳大学 悬铃木突变体、获取悬铃木突变体的方法和应用
JP2023525304A (ja) 2020-05-08 2023-06-15 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物
CN111621515A (zh) * 2020-05-14 2020-09-04 中国计量大学 一种增强CRISPR/Cas9系统基因编辑效率的方法
CN112175969B (zh) * 2020-10-13 2023-06-20 广东省农业科学院果树研究所 一种玉米ZmFKF1基因及其基因编辑突变体的制备与应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105505957B (zh) * 2015-11-17 2017-05-31 中国农业科学院茶叶研究所 筛选具有低咖啡碱性状的茶组植物的特异引物对、等位基因、分子标记及筛选方法

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