CN111154801B - 一种提高基因编辑效率的方法 - Google Patents

一种提高基因编辑效率的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111154801B
CN111154801B CN201811318178.5A CN201811318178A CN111154801B CN 111154801 B CN111154801 B CN 111154801B CN 201811318178 A CN201811318178 A CN 201811318178A CN 111154801 B CN111154801 B CN 111154801B
Authority
CN
China
Prior art keywords
homologous recombination
sequence
plasmid
gene
talen plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811318178.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111154801A (zh
Inventor
靖超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan besai model Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
Wuhan Xianran Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Xianran Biotechnology Co ltd filed Critical Wuhan Xianran Biotechnology Co ltd
Priority to CN201811318178.5A priority Critical patent/CN111154801B/zh
Publication of CN111154801A publication Critical patent/CN111154801A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111154801B publication Critical patent/CN111154801B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种提高基因编辑效率的方法，包括以下步骤：(1)针对目的基因，构建上游TALEN质粒和下游TALEN质粒；(2)构建单链同源重组基因序列片段；(3)将上游TALEN质粒、下游TALEN质粒和单链同源重组基因序列片段以一定的比例转染目的细胞并筛选阳性单克隆。本发明选择低脱靶效应TALEN技术，将体外构建的同源重组基因序列制成单链DNA，使得限制性内切酶不能识别其序列而不能对其进行切割，从而延长其在体内的降解时间，提高该序列发生同源重组效率的几率，从而提高基因编辑效率；与此同时，同源重组基因序列经特定修饰后，获得的阳性单克隆增加。

Description

一种提高基因编辑效率的方法
技术领域
本发明属于基因编辑领域，具体是一种提高基因编辑效率的方法。
背景技术
基因编辑技术能够对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、敲入等。TALEN(Transcription Activator-like Effector Nuclease)技术是重要的基因编辑技术之一，它比简单经济的CRISPR-Cas技术更加精确，首先利用TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，再通过添加内切酶结构域，TALEN蛋白可以靶向切割基因组DNA。
中国专利文献CN103540587B公开了靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用，实现了使用同一对TALEN质粒同时对小鼠和大鼠细胞Rosa26位点实现切割，配合各自的同源重组模板，实现对小鼠和大鼠细胞Rosa26位点基因定点整合任意外源DNA序列。然而，目前TALEN技术主要的缺陷是效率相对较低，且不同靶基因的敲除或敲入的效率并不一样，因此，特定基因的编辑有时需要依靠增加工作量或多次重复实验以获取最终的目的细胞，甚至不能获得目的细胞。
中国专利文献CN103725712B公开了一种无物种限制的条件性基因敲除用中间载体及其制备方法和用途，能够突破物种限制获得基因编辑的目的细胞，然而，该方法较为繁琐，且依赖于CRISPR/Cas9系统，而CRISPR/Cas9技术虽然效率高、速度快且简单经济，但其系统的特异性较TALEN低，脱靶效应的几率更高，不如传统的基因编辑技术那样稳定成熟。
因此，亟需一种能够提高基因编辑效率的方法，在低脱靶效应的基础上，能更高效地进行基因编辑。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种提高基因编辑效率的方法，在低脱靶效应的基础上，能更高效地进行基因编辑。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种提高基因编辑效率的方法，包括以下步骤：
(1)针对目的基因，构建上游TALEN质粒和下游TALEN质粒；
(2)构建单链同源重组基因序列片段；
(3)将上游TALEN质粒、下游TALEN质粒和单链同源重组基因序列片段以一定的比例转染目的细胞并筛选阳性单克隆。
本发明选择低脱靶效应TALEN技术，采用单链同源重组基因序列片段进行转染，提高了阳性单克隆的获得率，能更高效地进行基因编辑。生物体内有一类酶，它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息，其中的一类限制性内切酶，可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割，这种能被特异性识别的切割部位都具有回文序列，也就是在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致；本发明将体外构建的同源重组基因序列制成单链DNA，使得限制性内切酶不能识别其序列而不能对其进行切割，从而延长其在体内的降解时间，提高该序列发生同源重组效率的几率，从而提高基因编辑效率。
进一步的，步骤(3)中上游TALEN质粒、下游TALEN质粒和单链同源重组基因序列片段的质量浓度比为1：1：1～2。
更进一步的，所述上游TALEN质粒、下游TALEN质粒和单链同源重组基因序列片段的质量浓度比为1：1：1.5。
进一步的，步骤(2)中所述单链同源重组基因序列为甲基化的单链同源重组基因序列片段。同源重组基因序列经特定修饰后得到的阳性单克隆增加，可能是基因序列修饰后进一步降低了基因序列在细胞内的降解速度，也可能是修饰后的基因序列能更有效地进行同源重组。
进一步的，步骤(2)中所述单链同源重组基因序列包含嘌呤霉素基因。
进一步的，步骤(2)中所述单链同源重组基因序列包含EGFP基因。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明选择低脱靶效应TALEN技术，将体外构建的同源重组基因序列制成单链DNA，使得限制性内切酶不能识别其序列而不能对其进行切割，从而延长其在体内的降解时间，提高该序列发生同源重组效率的几率，从而提高基因编辑效率；此外，同源重组基因序列经特定修饰后，获得的阳性单克隆增加。
附图说明
图1为本发明实施例1单链片段Fndc5AB的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种提高基因编辑效率的方法，包括以下步骤：
(1)针对目的基因，构建上游TALEN质粒和下游TALEN质粒；
(2)构建单链同源重组基因序列片段；
(3)将上游TALEN质粒、下游TALEN质粒和单链同源重组基因序列片段以一定的比例转染目的细胞并筛选阳性单克隆。
实施例1
一种提高基因编辑效率的方法，包括以下步骤：
一、构建上游TALEN质粒和下游TALEN质粒
以Fndc5为目的基因进行基因编辑，从NCBI上下载小鼠Fndc5的基因序列，上游TALEN质粒peTALEN-L和下游TALEN质粒peTALEN-R由北京唯尚立德生物科技有限公司合成，提供对应的靶位点位置L序列为：TTTCTAGAAGAAGGATGT gcggatgctccggttCATTCAGGAGGTGAACA(如SEQ ID NO.1所示)，靶位点位置R序列为：TCCGGCACCTCAAGGCC aactctgccgtggtcagCTGGGATGTCCTGGAGGA(如SEQ ID NO.2所示)。
二、构建单链同源重组基因序列片段
1、引物设计
以小鼠基因组DNA为模板，设计以下引物序列：
Fndc5-AF：GCAGTGATATCGCTCCTCTACTGCTCTCCCAC(如SEQ ID NO.3所示)
Fndc5-AR：GATGATATGTTAACGTCACCATCTTGATATGCCC(如SEQ ID NO.4所示)
Fndc5-BF:CATCGCGGCGGCCGCGATGCGTGGCCCTGGGCAAC(如SEQ ID NO.5所示)
Fndc5-BR:TACGGCACTAGTGTCAGTAAAGGAAGACCTGG(如SEQ ID NO.6所示)
其中，Fndc5-AF和Fndc5-AR为一对引物，扩增上游同源臂；Fndc5-BF和Fndc5-BR为一对引物，扩增下游同源臂。
2、上下游同源臂的PCR扩增
PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温(其中退火温度根据引物的Tm值进行调整，延伸时间根据扩增目的片段的大小进行调整)。
按下列反应体系依次加入到PCR管中，混匀并离心后置于PCR仪上进行PCR反应。
Figure BDA0001856848530000041
将上游同源臂和下游同源臂的PCR片段分别进行切胶回收，得到上游同源臂纯化片段Fndc5A和下游同源臂纯化片段Fndc5B，操作参照DNA纯化试剂盒的操作说明。
3、构建模板质粒
大肠杆菌感受态细胞的制备：挑取大肠杆菌DH5α单菌落于37℃，180r/min振荡培养过夜；1％接种量接种于50ml LB，37℃，180r/min振荡培养2-4h，待细菌长至对数生长期(OD600为0.5-0.6)；将菌液在冰上预冷10min后，倒入50ml预冷的离心管中，4℃5000r/min离心5min，收集菌体；用10ml预冷的CaCl2(0.1mol/L)重悬菌体，冰上放置30min后，4℃5000r/min离心5min，用1ml预冷的CaCl2溶液重悬菌体，并于4℃保存于12-24h内可用于转化；感受态细胞也可由170μl菌悬液与30μl无菌甘油混匀，分装于无菌1.5ml离心管中，置于-70℃保存备用。
酶切酶连：将HY-HR质粒(和元生物技术(上海)有限公司)和Fndc5A片段分别使用EcoR V和Hpa I双酶切后，用DNA纯化试剂盒纯化，按照摩尔比(质粒:片段＝1:7)进行混合，加入T4连接酶酶连过夜。
大肠杆菌感受态细胞的转化：取100-200μl感受态细胞与20ul酶连产物混合，冰上静置15-30min；随后置于42℃水浴锅中热击90s；快速置于冰中，使细胞冷却2-5min；每管加入800μl LB液体培养基，37℃，120r/min恢复培养45min；取200μl菌液涂布于含相应抗生素的LB固体培养基上；固体培养基置于37℃培养箱，静置培养12-16h后，可长出单菌落。
转化子验证：用灭菌的牙签挑少量的转化子菌落于装有预混好的eazyTaq PCR体系中，搅拌使菌体充分混匀，进行PCR扩增反应(PCR预变性时间延长为10min，以裂解大肠杆菌细胞)。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR鉴定结果为阳性的转化子进行测序分析，经过测序鉴定，得到正确的转化子，进行质粒抽提，得到质粒HY-HR-Fndc5A。
将质粒HY-HR-Fndc5A和Fndc5B片段分别使用Not I和SpeI双酶切后，按上述方法酶连、转化及转化子验证，将正确的转化子进行质粒抽提，得到质粒HY-HR-Fndc5AB，即模板质粒。
4、构建单链同源重组基因序列片段
以质粒HY-HR-Fndc5-AB为模板，用引物Fndc5-AF和Fndc5-BR进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃3min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
按下列反应体系依次加入到PCR管中，混匀并离心后置于PCR仪上进行PCR反应。
Figure BDA0001856848530000051
将PCR片段回收后，以该PCR产物为模板，用引物Fndc5-AF进行单引物PCR扩增，PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃3min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
按下列反应体系依次加入到PCR管中，混匀并离心后置于PCR仪上进行PCR反应。
Figure BDA0001856848530000052
将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化，即得到Fndc5基因的单链同源重组基因序列片段，该片段包含Fndc5A-CMV-EGFP-IRES-Puromycin-Fndc5B的碱基序列(如SEQ ID NO.7和图1所示)，记为单链片段Fndc5AB。
三、转染目的细胞并筛选阳性单克隆
1、铺板
转染前一天消化3T3细胞，计数、铺板，一般一个6孔板每个孔铺30万个细胞，均匀铺板。
2、转染
将DMEM在37℃水浴锅中预热15min，同时将转染试剂Lipofectamine2000放置室温平衡30min。观察前一天铺的细胞密度，达到80％左右可以开始转染。
转染：将上游TALEN质粒peTALEN-L、下游TALEN质粒peTALEN-R和单链片段Fndc5AB以质量浓度比为1:1:1.5的比例按照lipofectamine2000说明书转染小鼠3T3细胞。
3、筛选阳性单克隆
转染6小时后弃去转染液，换完全培养液；转染48小时后，观察荧光，将细胞传入6孔板中，并使用puromycin(2μl/ml)药物处理3天后，将细胞以适当密度(约每盘200-400个细胞)铺盘于10cm Dish中，使细胞之间保持适当距离，便于形成单个克隆。在不含puromycin的培养基中正常培养3-4周后，挑选有荧光的阳性单克隆转入24孔板继续培养，最终获得单克隆稳定细胞株。
4、验证
抽提细胞基因组：具体流程参照生工基因组DNA快速抽提试剂盒说明书。
将抽提的细胞基因组进行PCR验证，验证PCR引物序列为：
Fndc5-YANF：CCACTTGTCTGAGGGGTATG(如SEQ ID NO.8所示)
Fndc5-YANR：GAGAAGGGATTTAGCCCCCAG(如SEQ ID NO.9所示)
将所得PCR产物送测序公司测序，测序结果显示序列正确，即得到预期的基因编辑细胞。
实施例2
一种提高基因编辑效率的方法，与实施例1的区别在于，转染时将上游TALEN质粒peTALEN-L、下游TALEN质粒peTALEN-R和单链片段Fndc5AB以质量浓度比为1:1:1的比例按照lipofectamine2000说明书转染小鼠3T3细胞。
实施例3
一种提高基因编辑效率的方法，与实施例1的区别在于，转染时将上游TALEN质粒peTALEN-L、下游TALEN质粒peTALEN-R和单链片段Fndc5AB以质量浓度比为1:1:2的比例按照lipofectamine2000说明书转染小鼠3T3细胞。
实施例4
一种提高基因编辑效率的方法，与实施例1的区别在于，转染时将上游TALEN质粒peTALEN-L、下游TALEN质粒peTALEN-R和单链片段Fndc5AB以质量浓度比为1:2:2.5的比例按照lipofectamine2000说明书转染小鼠3T3细胞。
实施例5
一种提高基因编辑效率的方法，与实施例1的区别在于，转染时将上游TALEN质粒peTALEN-L、下游TALEN质粒peTALEN-R和单链片段Fndc5AB以质量浓度比为2:1:0.5的比例按照lipofectamine2000说明书转染小鼠3T3细胞。
实施例6
一种提高基因编辑效率的方法，与实施例1的区别在于，构建单链同源重组基因序列片段时，单引物PCR扩增得到的PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化，再经DNA甲基化试剂盒修饰后，得到单链片段Fndc5AB。
对比例1
一种基因编辑的方法，包括以下步骤：
一、构建上游TALEN质粒和下游TALEN质粒
以Fndc5为目的基因进行基因编辑，从NCBI上下载小鼠Fndc5的基因序列，上游TALEN质粒peTALEN-L和下游TALEN质粒peTALEN-R由北京唯尚立德生物科技有限公司合成，提供对应的靶位点位置L序列为：TTTCTAGAAGAAGGATGT gcggatgctccggttCATTCAGGAGGTGAACA(如SEQ ID NO.1所示)，靶位点位置R序列为：TCCGGCACCTCAAGGCC aactctgccgtggtcagCTGGGATGTCCTGGAGGA(如SEQ ID NO.2所示)。
二、构建同源重组质粒
1、引物设计
以小鼠基因组DNA为模板，设计以下引物序列：
Fndc5-AF：GCAGTGATATCGCTCCTCTACTGCTCTCCCAC(如SEQ ID NO.3所示)
Fndc5-AR：GATGATATGTTAACGTCACCATCTTGATATGCCC(如SEQ ID NO.4所示)
Fndc5-BF:CATCGCGGCGGCCGCGATGCGTGGCCCTGGGCAAC(如SEQ ID NO.5所示)
Fndc5-BR:TACGGCACTAGTGTCAGTAAAGGAAGACCTGG(如SEQ ID NO.6所示)
其中，Fndc5-AF和Fndc5-AR为一对引物，扩增上游同源臂；Fndc5-BF和Fndc5-BR为一对引物，扩增下游同源臂。
2、上下游同源臂的PCR扩增
PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温(其中退火温度根据引物的Tm值进行调整，延伸时间根据扩增目的片段的大小进行调整)。
按下列反应体系依次加入到PCR管中，混匀并离心后置于PCR仪上进行PCR反应。
Figure BDA0001856848530000081
将上游同源臂和下游同源臂的PCR片段分别进行切胶回收，得到上游同源臂纯化片段Fndc5A和下游同源臂纯化片段Fndc5B，操作参照DNA纯化试剂盒的操作说明。
3、构建同源重组质粒
大肠杆菌感受态细胞的制备：挑取大肠杆菌DH5α单菌落于37℃，180r/min振荡培养过夜；1％接种量接种于50ml LB，37℃，180r/min振荡培养2-4h，待细菌长至对数生长期(OD600为0.5-0.6)；将菌液在冰上预冷10min后，倒入50ml预冷的离心管中，4℃5000r/min离心5min，收集菌体；用10ml预冷的CaCl2(0.1mol/L)重悬菌体，冰上放置30min后，4℃5000r/min离心5min，用1ml预冷的CaCl2溶液重悬菌体，并于4℃保存于12-24h内可用于转化；感受态细胞也可由170μl菌悬液与30μl无菌甘油混匀，分装于无菌1.5ml离心管中，置于-70℃保存备用。
酶切酶连：将HY-HR质粒(和元生物技术(上海)有限公司)和Fndc5A片段分别使用EcoR V和Hpa I双酶切后，用DNA纯化试剂盒纯化，按照摩尔比(质粒:片段＝1:7)进行混合，加入T4连接酶酶连过夜。
大肠杆菌感受态细胞的转化：取100-200μl感受态细胞与20ul酶连产物混合，冰上静置15-30min；随后置于42℃水浴锅中热击90s；快速置于冰中，使细胞冷却2-5min；每管加入800μl LB液体培养基，37℃，120r/min恢复培养45min；取200μl菌液涂布于含相应抗生素的LB固体培养基上；固体培养基置于37℃培养箱，静置培养12-16h后，可长出单菌落。
转化子验证：用灭菌的牙签挑少量的转化子菌落于装有预混好的eazyTaq PCR体系中，搅拌使菌体充分混匀，进行PCR扩增反应(PCR预变性时间延长为10min，以裂解大肠杆菌细胞)。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR鉴定结果为阳性的转化子进行测序分析，经过测序鉴定，得到正确的转化子，进行质粒抽提，得到质粒HY-HR-Fndc5A。
将质粒HY-HR-Fndc5A和Fndc5B片段分别使用Not I和SpeI双酶切后，按上述方法酶连、转化及转化子验证，将正确的转化子进行质粒抽提，得到质粒HY-HR-Fndc5AB，即同源重组质粒。
三、转染目的细胞
1、铺板
转染前一天消化3T3细胞，计数、铺板，一般一个6孔板每个孔铺30万个细胞，均匀铺板。
2、转染
将DMEM在37℃水浴锅中预热15min，同时将转染试剂Lipofectamine2000放置室温平衡30min。观察前一天铺的细胞密度，达到80％左右可以开始转染。
转染：将上游TALEN质粒peTALEN-L、下游TALEN质粒peTALEN-R和质粒HY-HR-Fndc5AB以质量浓度比为1:1:1.5的比例按照lipofectamine2000说明书转染小鼠3T3细胞。
对比例2
一种基因编辑的方法，包括以下步骤：
一、构建上游TALEN质粒和下游TALEN质粒
以Fndc5为目的基因进行基因编辑，从NCBI上下载小鼠Fndc5的基因序列，上游TALEN质粒peTALEN-L和下游TALEN质粒peTALEN-R由北京唯尚立德生物科技有限公司合成，提供对应的靶位点位置L序列为：TTTCTAGAAGAAGGATGT gcggatgctccggttCATTCAGGAGGTGAACA(如SEQ ID NO.1所示)，靶位点位置R序列为：TCCGGCACCTCAAGGCC aactctgccgtggtcagCTGGGATGTCCTGGAGGA(如SEQ ID NO.2所示)。
二、构建单链同源重组基因序列片段
1、引物设计
以小鼠基因组DNA为模板，设计以下引物序列：
Fndc5-AF：GCAGTGATATCGCTCCTCTACTGCTCTCCCAC(如SEQ ID NO.3所示)
Fndc5-AR：GATGATATGTTAACGTCACCATCTTGATATGCCC(如SEQ ID NO.4所示)
Fndc5-BF:CATCGCGGCGGCCGCGATGCGTGGCCCTGGGCAAC(如SEQ ID NO.5所示)
Fndc5-BR:TACGGCACTAGTGTCAGTAAAGGAAGACCTGG(如SEQ ID NO.6所示)
其中，Fndc5-AF和Fndc5-AR为一对引物，扩增上游同源臂；Fndc5-BF和Fndc5-BR为一对引物，扩增下游同源臂。
2、上下游同源臂的PCR扩增
PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温(其中退火温度根据引物的Tm值进行调整，延伸时间根据扩增目的片段的大小进行调整)。
按下列反应体系依次加入到PCR管中，混匀并离心后置于PCR仪上进行PCR反应。
Figure BDA0001856848530000101
将上游同源臂和下游同源臂的PCR片段分别进行切胶回收，得到上游同源臂纯化片段Fndc5A和下游同源臂纯化片段Fndc5B，操作参照DNA纯化试剂盒的操作说明。
3、构建模板质粒
大肠杆菌感受态细胞的制备：挑取大肠杆菌DH5α单菌落于37℃，180r/min振荡培养过夜；1％接种量接种于50ml LB，37℃，180r/min振荡培养2-4h，待细菌长至对数生长期(OD600为0.5-0.6)；将菌液在冰上预冷10min后，倒入50ml预冷的离心管中，4℃5000r/min离心5min，收集菌体；用10ml预冷的CaCl2(0.1mol/L)重悬菌体，冰上放置30min后，4℃5000r/min离心5min，用1ml预冷的CaCl2溶液重悬菌体，并于4℃保存于12-24h内可用于转化；感受态细胞也可由170μl菌悬液与30μl无菌甘油混匀，分装于无菌1.5ml离心管中，置于-70℃保存备用。
酶切酶连：将HY-HR质粒(和元生物技术(上海)有限公司)和Fndc5A片段分别使用EcoR V和Hpa I双酶切后，用DNA纯化试剂盒纯化，按照摩尔比(质粒:片段＝1:7)进行混合，加入T4连接酶酶连过夜。
大肠杆菌感受态细胞的转化：取100-200μl感受态细胞与20ul酶连产物混合，冰上静置15-30min；随后置于42℃水浴锅中热击90s；快速置于冰中，使细胞冷却2-5min；每管加入800μl LB液体培养基，37℃，120r/min恢复培养45min；取200μl菌液涂布于含相应抗生素的LB固体培养基上；固体培养基置于37℃培养箱，静置培养12-16h后，可长出单菌落。
转化子验证：用灭菌的牙签挑少量的转化子菌落于装有预混好的eazyTaq PCR体系中，搅拌使菌体充分混匀，进行PCR扩增反应(PCR预变性时间延长为10min，以裂解大肠杆菌细胞)。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR鉴定结果为阳性的转化子进行测序分析，经过测序鉴定，得到正确的转化子，进行质粒抽提，得到质粒HY-HR-Fndc5A。
将质粒HY-HR-Fndc5A和Fndc5B片段分别使用Not I和SpeI双酶切后，按上述方法酶连、转化及转化子验证，将正确的转化子进行质粒抽提，得到质粒HY-HR-Fndc5AB，即模板质粒。
4、构建双链同源重组基因序列片段
以质粒HY-HR-Fndc5-AB为模板，用引物Fndc5-AF和Fndc5-BR进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃3min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
按下列反应体系依次加入到PCR管中，混匀并离心后置于PCR仪上进行PCR反应。
Figure BDA0001856848530000111
将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化，即得到Fndc5基因的双链同源重组基因序列片段，该片段包含Fndc5A-CMV-EGFP-IRES-Puromycin-Fndc5B的碱基序列(如SEQ ID NO.7和图1所示)，记为双链片段Fndc5AB。
三、转染目的细胞并筛选阳性单克隆
1、铺板
转染前一天消化3T3细胞，计数、铺板，一般一个6孔板每个孔铺30万个细胞，均匀铺板。
2、转染
将DMEM在37℃水浴锅中预热15min，同时将转染试剂Lipofectamine2000放置室温平衡30min。观察前一天铺的细胞密度，达到80％左右可以开始转染。
转染：将上游TALEN质粒peTALEN-L、下游TALEN质粒peTALEN-R和双链片段Fndc5AB以质量浓度比为1:1:1.5的比例按照lipofectamine2000说明书转染小鼠3T3细胞。
在多次重复实验中，实施例1～6和对比例1～2得到的阳性单克隆数见表1。
表1不同组的阳性单克隆数
Figure BDA0001856848530000121
从表1可以看出，本发明方法能够稳定的得到阳性单克隆，而对比例1和对比例2不能稳定的得到阳性单克隆，说明将同源重组基因序列制成单链DNA能够提高基因编辑效率；实施例1～5之间的对比可以看出，上游TALEN质粒peTALEN-L、下游TALEN质粒peTALEN-R和单链片段Fndc5AB的质量浓度比为1:1:1.5进行转染时，效率最高；实施例1和实施例6的对比可以看出，单链同源重组基因序列经甲基化修饰后，获得的阳性单克隆增加。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 武汉纤然生物科技有限公司
<120> 一种提高基因编辑效率的方法
<130> 1
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttctagaag aaggatgtgc ggatgctccg gttcattcag gaggtgaaca 50
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccggcacct caaggccaac tctgccgtgg tcagctggga tgtcctggag ga 52
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcagtgatat cgctcctcta ctgctctccc ac 32
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatgatatgt taacgtcacc atcttgatat gccc 34
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catcgcggcg gccgcgatgc gtggccctgg gcaac 35
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tacggcacta gtgtcagtaa aggaagacct gg 32
<210> 7
<211> 4542
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctcctctac tgctctccca cttatctctg acgttttccc cattcaccat cttccttcac 60
ccagaaggcc ttgcgctatc ttggtgtctc tccaccaagg gaccctgttc tgaatgtccc 120
ctcttctcta acttcctcta ttcctcgcac gtgaggaccc acagagtatg gagaggctca 180
catagaccct tccccttagg cgccctctgc ccagcttacc atgtgaggtt gcccctcagc 240
tccatgccag ggctcagccc ctcctggctc ttcatctcag ggtctgtctc cttccctcaa 300
ggtcactcac ttgacaacat gaggctatag aaagtgcaat ggactaggag tccttgtggc 360
tgctttttct caagctaatc agctcctgaa ctccattcag ctattcctcg ctcggtgccc 420
aaccacctat ccactagctc tcgccttggt tcaagcccag gtccaccaat tttattttag 480
gacccttggt ttggccagtc tatagccagc aggagtttct atgctagtca caaggaacct 540
ggggcctctc agccactgag gaaccgagag ccatgtggcc cagctgagac cttggatcct 600
tgtttctgtt cacatagcct cccccagctt tctctttctc atatatgatg gggctgggcc 660
ttacagcagg gcacgctcag actcaggtgc ttccctgccc tgcagacagc ccctcagccc 720
ctgtgaacgt gaccgtccgg cacctcaagg ccaactctgc cgtggtcagc tgggatgtcc 780
tggaggatga agtggtcatt ggctttgcca tctctcagca ggtaaccctt gagggtgctt 840
aaggggagag ggcatatcaa gatggtgact aacataactt cgtatagcat acattatacg 900
aagttatacg cgtgatatac tgagtcatta gggactttcc aatgggtttt gcccagtaca 960
taaggtcaat aggggtgaat caacaggaaa gtcccattgg agccaagtac actgagtcaa 1020
tagggacttt ccattgggtt ttgcccagta caaaaggtca atagggggtg agtcaatggg 1080
tttttcccat tattggcacg tacataaggt caataggggt gagtcattgg gtttttccag 1140
ccaatttaat taaaacgcca tgtactttcc caccattgac gtcaatgggc tattgaaact 1200
aatgcaacgt gacctttaaa cggtactttc ccatagctga ttaatgggaa agtaccgttc 1260
tcgagccaat acacgtcaat gggaagtgaa agggcagcca aaacgtaaca ccgccccggt 1320
tttcccctgg aaattccata ttggcacgca ttctattggc tgagctgcgt tctacgtggg 1380
tataagaggc gcgaccagcg tcggtaccgt cgcagtcttc ggtctgacca ccgtagaacg 1440
cagatcagat ctcgagctca agcttcgaat tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc 1500
tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt 1560
tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca 1620
tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg 1680
gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg 1740
ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca 1800
agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg 1860
gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca 1920
gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga 1980
tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc 2040
ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc 2100
tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg 2160
ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagcttaa ggactacaag gatgacgatg 2220
acaaggatta caaagacgac gatgataagg actataagga tgatgacgac aaataatcta 2280
gaaaattccg cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat 2340
aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg 2400
tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc 2460
tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt 2520
cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg 2580
acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac 2640
cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg 2700
tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg 2760
ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc 2820
cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgata ataccatggc caccgagtac 2880
aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtccccc gggccgtacg caccctcgcc 2940
gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg acccggaccg ccacatcgag 3000
cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg 3060
tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg 3120
ggggcggtgt tcgccgagat cggctcgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc 3180
gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc 3240
ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg 3300
ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgct ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg 3360
ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg 3420
cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac cgcgtctgga 3480
acaagagctt atcgataatc aacctctgga ttactcgact tcgagcaact tgtttattgc 3540
agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 3600
ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat 3660
cgtctagcat cgaagatcca ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttataagtag 3720
cttggcggcg gccgcgatgc gtggccctgg gcaacactct gacccctctg aacatgtttc 3780
cttagctcta ctgtggaaat aaggctgttc tgggtggcgg gaatgtaaca gccatgaaga 3840
gggggcttgt cactgtcgag gtgggcagat gtggggttgg tgccctgcat gctaacatag 3900
caagctctct cccctttcta gaagaaggat gtgcggatgc tccggttcat tcaggaggtg 3960
aacaccacca cccggtcctg cgctctctgg gacctggagg aggacacaga atatatcgtc 4020
catgtgcagg ccatctccat ccagggacag agcccagcca gtgagcctgt gctcttcaag 4080
accccacgcg aggctgaaaa gatggcctca aagaacaaag gcaagcacgg ggcaaggagg 4140
gtgagttagg tgagggaggt tgggcagggc aggaggaaag acaagcggct cgagagatga 4200
agaagggttg atttcggccc ctggaaggag actgccatgc atgctttctc cttaagattg 4260
agtccaaatg ctgtcgcccc aaaacagcct tcaccctgtt cctgggtcta tgttgggtgt 4320
gttggcactg acagaggcac ttcttgttgt gggctgctgg gccctggagg agtggctcgg 4380
gaggaacgga gcccagggct agcttatctc tccccacaga tgaggtgacc atgaaggaga 4440
tggggaggaa ccagcagctg cgaacggggg aggtgctgat cattgttgtg gtcctcttca 4500
tgtgggcagg tgagtcaggc ctccaggtct tcctttactg ac 4542

Claims (5)

1.一种提高基因编辑效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对目的基因，构建上游TALEN质粒和下游TALEN质粒；
(2)构建单链同源重组基因序列片段，所述单链同源重组基因序列为甲基化的单链同源重组基因序列片段；
(3)将上游TALEN质粒、下游TALEN质粒和单链同源重组基因序列片段以一定的比例转染目的细胞并筛选阳性单克隆。
2.根据权利要求1所述的一种提高基因编辑效率的方法，其特征在于，步骤(3)中上游TALEN质粒、下游TALEN质粒和单链同源重组基因序列片段的质量浓度比为1：1：1～2。
3.根据权利要求2所述的一种提高基因编辑效率的方法，其特征在于，所述上游TALEN质粒、下游TALEN质粒和单链同源重组基因序列片段的质量浓度比为1：1：1.5。
4.根据权利要求1所述的一种提高基因编辑效率的方法，其特征在于，步骤(2)中所述单链同源重组基因序列包含嘌呤霉素基因。
5.根据权利要求1所述的一种提高基因编辑效率的方法，其特征在于，步骤(2)中所述单链同源重组基因序列包含EGFP基因。
CN201811318178.5A 2018-11-07 2018-11-07 一种提高基因编辑效率的方法 Active CN111154801B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811318178.5A CN111154801B (zh) 2018-11-07 2018-11-07 一种提高基因编辑效率的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811318178.5A CN111154801B (zh) 2018-11-07 2018-11-07 一种提高基因编辑效率的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111154801A CN111154801A (zh) 2020-05-15
CN111154801B true CN111154801B (zh) 2021-09-10

Family

ID=70555270

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811318178.5A Active CN111154801B (zh) 2018-11-07 2018-11-07 一种提高基因编辑效率的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111154801B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113249456B (zh) * 2021-05-21 2023-05-23 云南农业大学 一种快速筛选基因编辑猪阳性细胞系的方法
CN117384277A (zh) * 2023-12-05 2024-01-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种人源IgA抗体重链表达质粒及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105101787A (zh) * 2012-06-21 2015-11-25 重组股份有限公司 遗传修饰的动物及其制备方法
CN107880132A (zh) * 2016-09-30 2018-04-06 北京大学 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法
CN108070610A (zh) * 2016-11-08 2018-05-25 中国科学院上海生命科学研究院 植物基因组定点敲入方法
CN108368502A (zh) * 2015-06-03 2018-08-03 内布拉斯加大学董事委员会 使用单链dna的dna编辑
CN108603160A (zh) * 2016-02-04 2018-09-28 花王株式会社 突变丝状菌的制造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105101787A (zh) * 2012-06-21 2015-11-25 重组股份有限公司 遗传修饰的动物及其制备方法
CN108368502A (zh) * 2015-06-03 2018-08-03 内布拉斯加大学董事委员会 使用单链dna的dna编辑
CN108603160A (zh) * 2016-02-04 2018-09-28 花王株式会社 突变丝状菌的制造方法
CN107880132A (zh) * 2016-09-30 2018-04-06 北京大学 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法
CN108070610A (zh) * 2016-11-08 2018-05-25 中国科学院上海生命科学研究院 植物基因组定点敲入方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The Position of DNA Cleavage by TALENs and Cell Synchronization Influences the Frequency of Gene Editing Directed by Single-Stranded Oligonucleotides;Natalia Rivera-Torres等;《PLOS ONE》;20140501;第9卷(第5期);e96483 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111154801A (zh) 2020-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105907758B (zh) CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法
CN107502608B (zh) 用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用
WO2021023307A1 (zh) CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用
WO2019062522A1 (zh) 一种sgRNA、改造的Cas9蛋白及试剂盒
CN109750035B (zh) 靶向并引导Cas9蛋白高效切割TCR及B2M基因座的sgRNA
CN107151677B (zh) 基于CRISPR/Cas9多基因敲除低转染效率细胞系的方法
CN108165581B (zh) 采用单链核苷酸片段体外修复hba2基因突变的方法
CN111154801B (zh) 一种提高基因编辑效率的方法
CN111778252B (zh) 一种靶向敲除SST基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9系统和应用
CN109486814A (zh) 一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑试剂盒
CN116904464A (zh) 用于人AGXT基因编辑的sgRNA及包含其的组合物和应用
CN111378660A (zh) 一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用
CN106520829B (zh) 一种终止双等位基因转录的方法
CN113025613B (zh) 一种adora2a基因敲除细胞及其构建方法和应用
CN117683727A (zh) 一种GHR基因敲除的胰岛β细胞系及其构建方法和应用
CN110551762B (zh) CRISPR/ShaCas9基因编辑系统及其应用
CN109929865B (zh) 基于gal4-uas系统的crispr辅助反式增强子激活基因表达的方法及其应用
CN115976103B (zh) 一种双壳贝类生长调控基因的功能验证方法
WO2023206871A1 (zh) 一种优化的CRISPR/SpCas12f1系统、工程化向导RNA及其应用
CN108103025B (zh) 一种造血干细胞及其制备方法和用途
CN111004813A (zh) 一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用
CN114807138B (zh) 一种植物环状rna过表达载体及其构建方法和应用
CN113881678B (zh) 一种c/ebpz基因启动子及其应用
CN109536494A (zh) 一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑试剂盒
CN111662932B (zh) 一种提高CRISPR-Cas9基因编辑中同源重组修复效率的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address

Address after: 430000 room D201, 4th floor, building B4, biological innovation park, Guanggu biological city, No. 666, Gaoxin Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei Province (one site with multiple photos)

Patentee after: Wuhan besai model Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 430000 c207-208, floor 3, building B4, Wuhan National Biological Industry (Jiufeng innovation) base, No. 666, Gaoxin Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan, Hubei Province

Patentee before: WUHAN XIANRAN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

CP03 Change of name, title or address