CN110577970B

CN110577970B - CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统及其应用

Info

Publication number: CN110577970B
Application number: CN201910731398.9A
Authority: CN
Inventors: 王永明; 胡子英; 王大奇; 王帅
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2039-08-08
Also published as: CN110577970A

Abstract

本发明属于基因编辑技术领域，具体为一种CRISPR/Sa‑SlutCas9基因编辑系统以及其应用。本发明基因编辑系统为Sa‑SlutCas9蛋白与sgRNA形成的复合体，能精确靶向DNA序列，并产生切割，使DNA发生双链断裂损伤；所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑；Sa‑SlutCas9为融合蛋白，把SaCas9的PAM识别结构域（PAM interacting，PI）替换为SlutCas9的PAM识别结构域（SlutCas9‑PI）。Sa‑SlutCas9蛋白小，为1056个氨基酸，识别的PAM序列简单，所述Sa‑ SlutCas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明在基因编辑领域中具有广泛的应用前景。

Description

CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统及其应用

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种能在细胞中进行基因编辑的CRISPR/SlutCas9系统以及其相关应用。

背景技术

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免疫系统。在CRISPR/Cas9系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)、tracrRNA(trans-activating RNA) 以及Cas9蛋白形成复合体后，识别靶位点的PAM(Protospacer AdjacentMotif)序列，crRNA会与靶DNA序列形成互补结构，Cas9蛋白行使切割DNA的功能，使DNA发生断裂损伤。其中，tracrRNA和crRNA通过连接序列可以融合成为单链指导RNA(single guideRNA，sgRNA)。当DNA发生断裂损伤后，细胞内的两种主要DNA损伤修复机制负责修复：非同源末端连接(Non-homologous end-joining,NHEJ)和同源重组(homologous recombination,HR)。 NHEJ修复的结果会引起碱基的缺失或插入，可以进行基因敲除；在提供同源模板的情况下，利用HR修复可以进行基因的定点插入和碱基的精确替换。

除了基础科研外，CRISPR/Cas9还具有广泛的临床应用前景。利用CRISPR/Cas9系统做基因治疗时，需要把Cas9和sgRNA导入到体内。目前做基因治疗最有效的递送载体是AAV 病毒。但是AAV病毒包装的DNA一般不超过4.5kb。SpCas9因为PAM序列简单(识别NGG)和活性高而得到广泛应用。但是SpCas9蛋白有1367个氨基酸，加上sgRNA和启动子，无法有效的包装到AAV病毒中，限制了其在临床中的应用。为了克服这个问题，几个小的Cas9 被发明出来了，包括SaCas9(PAM序列为NNGRRT)；St1Cas9(PAM序列为NNAGAW)； NmCas9(PAM序列为NNNNGATT)；Nme2Cas9(PAM序列为NNNNCC)；CjCas9(PAM序列为NNNNRYAC)，但是这些Cas9或者PAM序列复杂(在基因组中可靶向的DNA序列少)，或者编辑效率低，难以广泛应用。寻找Cas9蛋白小，PAM序列简单CRISPR/Cas9系统是解决上述问题的希望所在。

发明内容

针对上述问题，本发明目的在于提供一种编辑活性高、Cas9蛋白小、PAM序列简单的 CRISPR/Cas9新的基因编辑系统及其应用。

本发明提供的CRISPR/Cas9基因编辑系统，为SlutCas9蛋白与sgRNA形成的复合体，记为CRISPR/SlutCas9基因编辑系统(即SlutCas9蛋白，它和single guide RNA(sgRNA)共同作用实现基因编辑)；能精确靶向DNA序列，并产生切割，使DNA发生双链断裂损伤；所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑；SlutCas9蛋白小，为1054个氨基酸，识别的 PAM序列简单(NNGR)，所述SlutCas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或者基于SEQ ID NO:2改造的sgRNA序列。

本发明中，所述细胞包括真核细胞和原核细胞；所述真核生物细胞包括哺乳动物细胞和植物细胞。

本发明中，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli细胞、小鼠乳腺瘤细胞、buffalo大鼠肝细胞、大鼠肝瘤细胞、由SV40转化的猴肾CVI系、猴肾细胞、犬肾细胞、人宫颈癌细胞、人肺细胞、人肝细胞、HIH/3T3细胞、人U2-OS骨肉瘤细胞、人A549细胞、人K562细胞、人HEK293细胞、人HEK293T细胞、人HCT116细胞或人 MCF-7细胞或TRI细胞。

本发明中，所述CRISPR/Cas9系统为Staphylococcus lutraeCas9(SlutCas9)蛋白，它和single guide RNA(sgRNA)共同作用实现基因编辑。

本发明中，所述SlutCas9蛋白属于水獭葡萄球菌属(Staphylococcus lutrae)，所述SlutCas9 蛋白的UniProt的检索号为A0A1W6BMI2。

本发明中，所述SlutCas9蛋白包括无切割活性或仅具有单链切割活性或具有双链切割活性的SlutCas9蛋白。

本发明中，所述精确定位DNA序列包括sgRNA中的5’端20bp或21bp序列与靶向DNA序列能形成碱基互补配对结构。

本发明中，所述精确定位靶向DNA序列包括SlutCas9蛋白和sgRNA复合体识别靶向DNA 序列上的PAM序列。

本发明中，所述PAM序列为NNGR，所述靶向DNA序列为：

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGR(SEQ ID NO:3)。

本发明中，所述SlutCas9蛋白和sgRNA复合体能精确靶向DNA序列指SlutCas9蛋白和sgRNA复合体可以识别并结合特定DNA序列，或指将与SlutCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白带至靶向DNA的位置。

本发明中，所述SlutCas9蛋白和sgRNA复合体或与SlutCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白可以对靶向DNA区域进行修饰和调控，所述修饰和调控包括但不限定于基因转录水平的调控、DNA甲基化调控、DNA乙酰化修饰、组蛋白乙酰化修饰、单碱基转换器或染色质成像追踪。

本发明中，所述单碱基转换器包括但不限定于碱基腺嘌呤到鸟嘌呤、或胞嘧啶到胸腺嘧啶、或胞嘧啶到尿嘧啶、或其它碱基之间的转换。

本发明提供的基因编辑系统编辑活性高，与之前的Cas9相比具有明显的优势。

本发明通过基因合成、分子克隆、细胞转染、PCR产物深度测序、生物信息学分析等技术检测CRISPR/SlutCas9系统的编辑效率。

本发明提供的CRISPR/SlutCas9基因编辑系统能够在细胞中进行基因编辑，包括通过 SlutCas9蛋白和sgRNA的复合物识别定位靶向DNA，对DNA进行编辑；最后检测编辑效率。

具体步骤为：

(1)合成人源化的SlutCas9基因序列；并克隆到表达载体上，得到pAAV2_SlutCas9_ITR；

(2)合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA，即Oligo-F和Oligo-R序列，退火后连接至质粒pAAV2_SlutCas9_U6_BsaI的BsaI酶切位点，得到pAAV2_SlutCas9-hU6-sgRNA；

(3)将表达SlutCas9蛋白、sgRNA的载体递送至含有靶位点的细胞中；

(4)将编辑后的靶位点进行PCR扩增，T7EI酶切或者二代测序检测编辑效率。

本发明中，可以根据具体需要，针对待编辑的DNA序列设计任意靶向的sgRNA，并一定程度上对sgRNA进行本领域所熟知的修饰，所述修饰包括但不限定于磷酸化、缩短、加长、硫化、甲基化、羟基化。

本发明中，可以根据具体需要，递送至细胞的CRISPR/SlutCas9系统包括但不限定于表达 SlutCas9蛋白或sgRNA的质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒载体或RNA或SlutCas9 蛋白。

本领域技术人员可以理解的是，碱基N表示A、T、C或G四种碱基中的任何一种。

进一步地，步骤(3)中，所述递送的手段包括但不限定于脂质体、阳离子多聚物、纳米颗粒、多功能信封式纳米以及病毒载体。

进一步地，步骤(3)中，所述细胞包括但不限定于人细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。

进一步地，步骤(2)中，所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或与SEQID NO:2所示的核苷酸序列至少80％相同的核苷酸序列，或基于核苷酸序列进行的修饰，修饰包括但不限定于磷酸化、缩短、加长、硫化或甲基化。

更具体地，在一个具体实施例中，合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA序列，即Oligo-F 和Oligo-R，该寡核苷酸单链DNA序列如下：

Oligo-F CACCGCTCGGAGATCATCATTGCG，(SEQ ID NO:4)

Oligo-R AAACCGCAATGATGATCTCCGAGC。(SEQ ID NO:5)

更具体地，在一个具体实施例中，本领域技术人员可以理解的是，Oligo-F和Oligo-R需要进行退火变为双链DNA，退火反应体系为1μL 100μM oligo-F，1μL 100μMoligo-R，28μL 水，震荡混匀后，放置于PCR仪中运行退火程序；退火程序如下：95℃_5min，85℃_1min， 75℃_1min，65℃_1min，55℃_1min，45℃_1min，35℃_1min，25℃_1min，4℃保存，降温速率0.3℃/s。

更具体地，在一个具体实施例中，所述质粒pAAV2_SlutCas9_ITR需要经过BsaI限制性内切酶(NEB)进行线性化处理。

更具体地，在一个具体实施例中，所述Oligo-F和Oligo-R退火后的产物与线性化处理后的pAAV2_SlutCas9_ITR骨架载体通过DNA连接酶进行连接反应。

更具体地，在一个具体实施例中，将连接产物转化至感受态细胞后，经Sanger测序验证正确的克隆，然后提取质粒备用。

更具体地，在一个具体实施例中，步骤(3)中的细胞为HEK293T，其包含的靶位点具有 SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

更具体地，在一个具体实施例中，步骤(3)中的递送手段为脂质体，包括

2000或PEI。

更具体地，在本发明第一方面的一个具体实施例中，所述实验步骤(4)中PCR的模板为编辑后的HEK293T基因组DNA。

更具体地，在一个具体实施例中，步骤(4)中PCR扩增的引物序列为：

F1-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGCGAGAAAAGCCTTGTTT； (SEQ IDNO:7)

R1-ACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGAACTTGTGGCCGTTTAC； (SEQ ID NO:8)

F2-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC；(SEQ ID NO:9)

R2-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG； (SEQ ID NO:10)

本发明还提供一种用于基因编辑的CRISPR/SlutCas9系统试剂盒，该试剂盒包括SlutCas9 蛋白或靶向DNA序列的sgRNA或靶向的DNA。

本发明还提供CRISPR/SlutCas9基因编辑系统的应用，包括基因敲除、定点碱基的改变、定点插入、基因转录水平的调控、DNA甲基化调控、DNA乙酰化修饰、组蛋白乙酰化修饰、单碱基转换器或染色质成像追踪。

附图说明

图1为CRISPR/SlutCas9基因编辑系统切割靶向DNA示意图。其中，灰色椭圆形表示SlutCas9蛋白，黑色弯曲状表示sgRNA序列，基因组上链中加深区域表示PAM序列NNGG。

图2为质粒pAAV2_SlutCas9_U6_BsaI图谱示意图。其中，包括AAV2 ITR、CMV增强子、 CMV启动子、SV40 NLS、SlutCas9、nucleoplasmin NLS、3x HA、bGH poly(A)、人U6启动子(hU6)、BsaI内切酶位点、sgRNA scaffold序列等元件。

图3为靶位点DNA序列被编辑后的部分二代测序结果。其中编辑结果有缺失、插入或错配，最后4bp表示PAM序列NNGR。

图4为内源位点的T7 Endonuclease I酶切结果。其中，箭头表示切开的片段大小。

具体实施方式

以下将通过实施例进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。

在一具体实施方式中，本发明提供的CRISPR/SlutCas9系统为一种新的基因编辑系统、方法、试剂盒及其应用。

在本发明一具体实施例中，CRISPR/SlutCas9系统能够在细胞中进行基因编辑，所述方法包括如下步骤：

1、构建质粒pAAV2_SlutCas9_ITR

步骤(1)，根据SlutCas9基因在UniProt上的检索号A0A1W6BMI2，下载的SlutCas9蛋白序列加以改进，得到Sa-SlutCas9基因，其氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示。

步骤(2)，将SlutCas9的氨基酸序列进行密码子优化，获得了SlutCas9在人细胞中高表达的编码序列，如SEQ ID NO:11所示。

步骤(3)，将获得基因SlutCas9的编码序列在公司进行基因合成，并构建至pAAV2_ITR 骨架质粒上，得到质粒pAAV2_SlutCas9_ITR，如图2所示。

2、制备线性化质粒pAAV2_SlutCas9_ITR

步骤(1)，用BasI限制性内切酶将质粒pAAV2_SlutCas9_ITR进行酶切线性化，酶切体系： 1μg质粒pAAV2_SlutCas9_ITR，5μL 10xCutSmart缓冲液，1μLBasI内切酶，水补足至50μl， 37℃反应1小时。

步骤(2)，将酶切后的产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，120V电泳30分钟。

步骤(3)，切除7437bp大小的DNA片段，用胶回收试剂盒依据厂家提供的步骤进行回收，最终用超纯水进行洗脱。

步骤(4)，将回收的线性化质粒pAAV2_SlutCas9_ITR用NanoDrop测定DNA浓度，备用或置于-20℃进行长期保存。

3、构建质粒pAAV2_SlutCas9-hU6-sgRNA

步骤(1)，设计gRNA序列。

步骤(2)，在设计的gRNA序列对用的正义链和反义链上分别加上线性化质粒pAAV2_ SlutCas9_ITR两侧对应的粘性末端序列，并在公司合成两条寡核苷酸单链DNA，具体序列为：

Oligo-F CACCGCTCGGAGATCATCATTGCG，(SEQ ID NO:4)

Oligo-R AAACCGCAATGATGATCTCCGAGC。(SEQ ID NO:5)

步骤(3)，寡核苷酸单链DNA进行退火变为双链DNA，退火反应体系：1μL 100μMoligo-F， 1μL 100μMoligo-R，28μL水，震荡混匀后，放置于PCR仪中运行退火程序：95℃_5min， 85℃_1min，75℃_1min，65℃_1min，55℃_1min，45℃_1min，35℃_1min，25℃_1min，4℃保存，降温速率0.3℃/s。

步骤(4)，将退火后的产物与线性化质粒pAAV2_SlutCas9_ITR在DNA连接酶的作用下依据产品提供的步骤进行连接。

步骤(5)，取1μL连接产物进行化学感受态转化，将生长的细菌克隆进行Sanger测序验证。

步骤(6)，将测序验证连接正确的克隆摇菌，提取质粒pAAV2_SlutCas9-hU6-sgRNA备用。

4、转染表达SlutCas9蛋白和sgRNA的质粒pAAV2_SlutCas9-hU6-sgRNA

步骤(1)，第0天，根据转染所需，将含有sgRNA靶向位点的HEK293T细胞系在6孔板进行铺板，细胞密度约30％左右，靶位点序列如SEQ ID NO:6所示。

步骤(2)，第1天，进行转染，转染体系如下，

i.取2μg待转染质粒pAAV2_SlutCas9-hU6-sgRNA加入至100μlOpti-MEM培养基中，轻轻吹打混匀；

ii.将

2000轻弹混匀，吸取5μl加入至100μlOpti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温静置5min；

iii.将稀释的

2000和稀释的质粒进行混合，轻轻吹打混匀，室温静置20min，然后加入至待转染细胞的培养基中。

步骤(3)，将细胞置于37℃，5％的CO2培养箱中继续培养。

5、制备二代测序文库

步骤(1)，收集编辑3天后的HEK293T细胞，用DNA试剂盒依据产品提供的步骤提取基因组DNA。

步骤(2)，进行PCR建库第一轮PCR，用2xQ5 Mastermix进行PCR反应，PCR引物如SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8所示，反应体系如下：

PCR运行程序如下：

步骤(3)，进行PCR建库第二轮PCR，用2xQ5 Mastermix进行PCR反应，PCR引物如SEQID NO:9--SEQ ID NO:10所示，反应体系如下：

PCR运行程序如下：

步骤(4)，将第二轮的PCR产物用胶回收试剂盒依据厂家提供的步骤，纯化366bp大小的DNA片段，二代测序文库制备完毕。

6、二代测序结果分析

步骤(1)，将制备好的二代测序文库交由公司在HiseqXTen上进行双端测序。

步骤(2)生物信息学分析二代测序结果，部分编辑结果如图2和图3所示。

7、内源位点验证

步骤(1)，将表达SlutCas9和sgRNA的质粒pAAV2_SlutCas9-hU6-sgRNA通过

2000依据厂家提供的步骤转染至HEK293T细胞中，其中，

sgRNA序列为：GGCGCAGTTTACTGCACAGGT，(SEQ ID NO:12)

靶位点的具体序列为：GGCGCAGTTTACTGCACAGGTGCGG；(SEQ ID NO:13)

步骤(2)，提取编辑5天后的细胞基因组DNA，通过2x Q5 Master mix，用引物Test-F和 Test-R将靶向DNA序列进行扩增；其中：

Test-F的具体序列为：AGGGAAGAGGAAATGCTGGG，(SEQ ID NO:14)

Test-R的具体序列为：TGAGCCGCCAGTGTACAGA；(SEQ ID NO:15)

步骤(3)，将PCR产物通过琼脂糖凝胶回收，纯化276bp大小的DNA片段；

步骤(4)，依照T7 Endonuclease I的说明书对纯化的DNA片段进行酶切，然后跑胶检测，结果如图4所示，左侧为阴性对照组，转染时无sgRNA，T7 Endonuclease I切靶向序列后无切开的片段，说明未发生编辑；右侧为实验组，转染时有sgRNA，T7 Endonuclease I切靶向序列后出现切开的片段，说明发生了编辑。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统及其应用

<130> 1116

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1056

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val

1 5 10 15

Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly

20 25 30

Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg

35 40 45

Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile

50 55 60

Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His

65 70 75 80

Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu

85 90 95

Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu

100 105 110

Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr

115 120 125

Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala

130 135 140

Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys

145 150 155 160

Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr

165 170 175

Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln

180 185 190

Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg

195 200 205

Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys

210 215 220

Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe

225 230 235 240

Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr

245 250 255

Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn

260 265 270

Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe

275 280 285

Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu

290 295 300

Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys

305 310 315 320

Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr

325 330 335

Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala

340 345 350

Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu

355 360 365

Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser

370 375 380

Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile

385 390 395 400

Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala

405 410 415

Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln

420 425 430

Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro

435 440 445

Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile

450 455 460

Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg

465 470 475 480

Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys

485 490 495

Arg Asn Ala Ala Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr

500 505 510

Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp

515 520 525

Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu

530 535 540

Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro

545 550 555 560

Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys

565 570 575

Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu

580 585 590

Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile

595 600 605

Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu

610 615 620

Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp

625 630 635 640

Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Ala Ala Leu

645 650 655

Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys

660 665 670

Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp

675 680 685

Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp

690 695 700

Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys

705 710 715 720

Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys

725 730 735

Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu

740 745 750

Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp

755 760 765

Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile

770 775 780

Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu

785 790 795 800

Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu

805 810 815

Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His

820 825 830

Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly

835 840 845

Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr

850 855 860

Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile

865 870 875 880

Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp

885 890 895

Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Ser Phe

900 905 910

Arg Phe Asp Ile Tyr His Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Met Val Pro Ile

915 920 925

Thr Tyr Leu Asp Val Gln Lys Lys Glu Lys Tyr Tyr Tyr Ile Pro Thr

930 935 940

Glu Lys Tyr Glu Ala Leu Lys Gln Glu Lys Gly Ile Asn Gln Asn Ala

945 950 955 960

Gln Phe Ile Gly Ser Phe Tyr Tyr Asn Asp Leu Ile Glu Phe Asp Gly

965 970 975

Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Ile Asn Asn Gly Asp Lys Asn Leu Val

980 985 990

Glu Leu Asp Met Val Asp Ile Arg Tyr Lys Glu Tyr Cys Glu Leu Asn

995 1000 1005

Ser Ile Thr Thr Thr Pro Arg Ile Val Lys Thr Ile Ser Pro Lys

1010 1015 1020

Thr Gln Ser Ile Glu Lys Tyr Thr Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu

1025 1030 1035

Tyr Lys Ala Gln Pro Gly Lys Lys Pro Gln Phe Ile Phe Asn Lys

1040 1045 1050

Asp Glu Asp

1055

<210> 2

<211> 101

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> n is a, c, g, or u

<400> 2

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca 60

aaaugccgug uuuaucucgu caacuuguug gcgagauuuu u 101

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngrr 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caccgctcgg agatcatcat tgcg 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaaccgcaat gatgatctcc gagc 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(25)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

gctcggagat catcattgcg nnnnn 25

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(37)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnngcg agaaaagcct tgttt 55

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actggagttc agacgtgtgc tcttccgatc tctgaacttg tggccgttta c 51

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgac 45

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caagcagaag acggcatacg agatcactgt gtgactggag ttcagacgtg tg 52

<210> 11

<211> 3168

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgaagcgga actacatcct gggcctggac atcggcatca ccagcgtggg ctacggcatc 60

atcgactacg agacacggga cgtgatcgat gccggcgtgc ggctgttcaa agaggccaac 120

gtggaaaaca acgagggcag gcggagcaag agaggcgcca gaaggctgaa gcggcggagg 180

cggcatagaa tccagagagt gaagaagctg ctgttcgact acaacctgct gaccgaccac 240

agcgagctga gcggcatcaa cccctacgag gccagagtga agggcctgag ccagaagctg 300

agcgaggaag agttctctgc cgccctgctg cacctggcca agagaagagg cgtgcacaac 360

gtgaacgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcca ccaaagagca gatcagccgg 420

aacagcaagg ccctggaaga gaaatacgtg gccgaactgc agctggaacg gctgaagaaa 480

gacggcgaag tgcggggcag catcaacaga ttcaagacca gcgactacgt gaaagaagcc 540

aaacagctgc tgaaggtgca gaaggcctac caccagctgg accagagctt catcgacacc 600

tacatcgacc tgctggaaac ccggcggacc tactatgagg gacctggcga gggcagcccc 660

ttcggctgga aggacatcaa agaatggtac gagatgctga tgggccactg cacctacttc 720

cccgaggaac tgcggagcgt gaagtacgcc tacaacgccg acctgtacaa cgccctgaac 780

gacctgaaca atctcgtgat caccagggac gagaacgaga agctggaata ttacgagaag 840

ttccagatca tcgagaacgt gttcaagcag aagaagaagc ccaccctgaa gcagatcgcc 900

aaagaaatcc tcgtgaacga agaggatatt aagggctaca gagtgaccag caccggcaag 960

cccgagttca ccaacctgaa ggtgtaccac gacatcaagg acattaccgc ccggaaagag 1020

attattgaga acgccgagct gctggatcag attgccaaga tcctgaccat ctaccagagc 1080

agcgaggaca tccaggaaga actgaccaat ctgaactccg agctgaccca ggaagagatc 1140

gagcagatct ctaatctgaa gggctatacc ggcacccaca acctgagcct gaaggccatc 1200

aacctgatcc tggacgagct gtggcacacc aacgacaacc agatcgctat cttcaaccgg 1260

ctgaagctgg tgcccaagaa ggtggacctg tcccagcaga aagagatccc caccaccctg 1320

gtggacgact tcatcctgag ccccgtcgtg aagagaagct tcatccagag catcaaagtg 1380

atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaacgaca tcattatcga gctggcccgc 1440

gagaagaact ccaaggacgc ccagaaaatg atcaacgaga tgcagaagcg gaacgccgcc 1500

accaacgagc ggatcgagga aatcatccgg accaccggca aagagaacgc caagtacctg 1560

atcgagaaga tcaagctgca cgacatgcag gaaggcaagt gcctgtacag cctggaagcc 1620

atccctctgg aagatctgct gaacaacccc ttcaactatg aggtggacca catcatcccc 1680

agaagcgtgt ccttcgacaa cagcttcaac aacaaggtgc tcgtgaagca ggaagaaaac 1740

agcaagaagg gcaaccggac cccattccag tacctgagca gcagcgacag caagatcagc 1800

tacgaaacct tcaagaagca catcctgaat ctggccaagg gcaagggcag aatcagcaag 1860

accaagaaag agtatctgct ggaagaacgg gacatcaaca ggttctccgt gcagaaagac 1920

ttcatcaacc ggaacctggt ggataccaga tacgccaccg ccgccctgat gaacctgctg 1980

cggagctact tcagagtgaa caacctggac gtgaaagtga agtccatcaa tggcggcttc 2040

accagctttc tgcggcggaa gtggaagttt aagaaagagc ggaacaaggg gtacaagcac 2100

cacgccgagg acgccctgat cattgccaac gccgatttca tcttcaaaga gtggaagaaa 2160

ctggacaagg ccaaaaaagt gatggaaaac cagatgttcg aggaaaagca ggccgagagc 2220

atgcccgaga tcgaaaccga gcaggagtac aaagagatct tcatcacccc ccaccagatc 2280

aagcacatta aggacttcaa ggactacaag tacagccacc gggtggacaa gaagcctaat 2340

agagagctga ttaacgacac cctgtactcc acccggaagg acgacaaggg caacaccctg 2400

atcgtgaaca atctgaacgg cctgtacgac aaggacaatg acaagctgaa aaagctgatc 2460

aacaagagcc ccgaaaagct gctgatgtac caccacgacc cccagaccta ccagaaactg 2520

aagctgatta tggaacagta cggcgacgag aagaatcccc tgtacaagta ctacgaggaa 2580

accgggaact acctgaccaa gtactccaaa aaggacaacg gccccgtgat caagaagatt 2640

aagtattacg gcaacaaact gaacgcccat ctggacatca ccgacgacta ccccaacagc 2700

agaaacaagg tcgtgaagct gtccctgaag agcttccgct tcgacatcta ccacaccgac 2760

aagggctaca agatggtgcc catcacctac ctggacgtgc agaagaagga gaagtactac 2820

tacatcccca ccgagaagta cgaggccctg aagcaggaga agggcatcaa ccagaacgcc 2880

cagttcatcg gcagcttcta ctacaacgac ctgatagagt tcgacggcga gctgtaccgc 2940

gtgataggca tcaacaacgg cgacaagaac ctggtggagc tggacatggt ggacatccgc 3000

tacaaggagt actgcgagct gaacagcatc accaccaccc cccgcatcgt gaagaccatc 3060

agccccaaga cccagagcat cgagaagtac accaccgaca tcctgggcaa cctgtacaag 3120

gcccagcccg gcaagaagcc ccagttcatc ttcaacaagg acgaggac 3168

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcgagcctga ggcgaacaat g 21

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcgagcctga ggcgaacaat ggcgga 26

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agggaagagg aaatgctggg 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgagccgcca gtgtacaga 19

Claims

1.一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统为Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体，能精确定位靶向DNA序列，并产生切割，使DNA发生双链断裂损伤；所述Sa-SlutCas9蛋白为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述sgRNA为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述细胞包括真核细胞和原核细胞；所述真核生物细胞包括哺乳动物细胞和植物细胞；所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli细胞、小鼠乳腺瘤细胞、buffalo大鼠肝细胞、大鼠肝瘤细胞、由SV40转化的猴肾CVI系、猴肾细胞、犬肾细胞、人宫颈癌细胞、人肺细胞、人肝细胞、HIH/3T3细胞、人U2-OS骨肉瘤细胞、人A549细胞、人K562细胞、人HEK293细胞、人HEK293T细胞、人HCT116细胞或人MCF-7细胞或TRI细胞。

3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述精确定位靶向DNA序列包括sgRNA中的5’端20bp或21bp序列与靶向DNA序列能形成碱基互补配对结构。

4.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述精确定位靶向DNA序列包括Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体识别靶向DNA序列上的PAM序列。

5.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述PAM序列为NNGR，所述靶向DNA序列为SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA可以进行磷酸化、硫化、甲基化或羟基化修饰。

7.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体能精确定位靶向DNA序列指Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体可以识别并结合特定DNA序列，或指将与Sa-SlutCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白带至靶向DNA的位置。

8.根据权利要求7所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA复合体或与Sa-SlutCas9蛋白融合的其他蛋白或特异性识别sgRNA的蛋白可以对靶向DNA区域进行修饰和调控，所述修饰和调控包括基因转录水平的调控、单碱基转换器或染色质成像追踪。

9.根据权利要求8所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述单碱基转换器包括碱基腺嘌呤到鸟嘌呤、胞嘧啶到胸腺嘧啶、胞嘧啶到尿嘧啶或其它碱基之间的转换。

10.如权利要求1-9之一所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统在细胞中进行非治疗目的的基因编辑的方法，包括通过Sa-SlutCas9蛋白和sgRNA的复合物识别定位靶向DNA，对DNA进行编辑；最后检测编辑效率；具体步骤为：

（1）合成人源化的Sa-SlutCas9基因序列；并克隆到表达载体上，得到pAAV2_SlutCas9_ITR；

（2）合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA，即Oligo-F和Oligo-R序列，退火后连接至质粒pAAV2_SlutCas9_U6_BsaI的BsaI酶切位点，得到pAAV2_ Sa-SlutCas9-hU6-sgRNA；

（3）将表达Sa-SlutCas9蛋白、sgRNA的载体递送至含有靶位点的细胞中；

（4）将编辑后的靶位点进行PCR扩增，T7EI酶切或者二代测序检测编辑效率。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述pAAV2_ Sa-SlutCas9-hU6-sgRNA为腺相关病毒骨架质粒，其包括AAV2 ITR、CMV增强子、CMV启动子、SV40 NLS、SlutCas9、nucleoplasmin NLS、3x HA、bGH poly(A)、人U6启动子、BsaI内切酶位点、sgRNA scaffold序列。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，递送至细胞的CRISPR/SlutCas9系统包括表达Sa-SlutCas9蛋白或sgRNA的质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒载体或RNA或Sa-SlutCas9蛋白。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，合成sgRNA对应的寡核苷酸单链DNA序列，即Oligo-F和Oligo-R序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；

步骤(3)中的细胞的靶位点具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

步骤(4)中PCR的模板为编辑后的DNA；PCR扩增的引物序列为：SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10。

14.基于权利要求1-9之一所述CRISPR/Cas9基因编辑系统的试剂盒，该试剂盒包括Sa-SlutCas9蛋白和靶向DNA序列的sgRNA。

15.如权利要求1-9之一所述CRISPR/Cas9基因编辑系统的应用，包括基因敲除、定点碱基的改变、定点插入、基因转录水平的调控、单碱基转换器或染色质成像追踪，所述的应用为非治疗目的的应用。