JP2022543451A - CRISPR/Cas9遺伝子編集システムおよびその適用 - Google Patents
CRISPR/Cas9遺伝子編集システムおよびその適用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022543451A JP2022543451A JP2022507560A JP2022507560A JP2022543451A JP 2022543451 A JP2022543451 A JP 2022543451A JP 2022507560 A JP2022507560 A JP 2022507560A JP 2022507560 A JP2022507560 A JP 2022507560A JP 2022543451 A JP2022543451 A JP 2022543451A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- protein
- cas9
- sgrna
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title claims abstract description 268
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 84
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 47
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 47
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims abstract 39
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 claims abstract 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 264
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 213
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 121
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 103
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 52
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 45
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 39
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 37
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 37
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 21
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 15
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 13
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 12
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 12
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 claims description 8
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 claims description 7
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 7
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000006195 histone acetylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 108010076491 BsaI endonuclease Proteins 0.000 claims description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 4
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 claims description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 4
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 claims description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 4
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000005486 sulfidation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 3
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000002488 Nucleoplasmin Human genes 0.000 claims description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 claims description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 3
- 108060005597 nucleoplasmin Proteins 0.000 claims description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 3
- 230000025449 regulation of DNA methylation Effects 0.000 claims description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 2
- 238000005987 sulfurization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 14
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 101710172824 CRISPR-associated endonuclease Cas9 Proteins 0.000 description 7
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 7
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 6
- 241001134656 Staphylococcus lugdunensis Species 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 4
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 4
- 241001147687 Staphylococcus auricularis Species 0.000 description 4
- 241000191984 Staphylococcus haemolyticus Species 0.000 description 4
- 241000010986 Staphylococcus lutrae Species 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 229940037649 staphylococcus haemolyticus Drugs 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 2
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 2
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 description 2
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241001033898 Staphylococcus equorum Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【課題】 CRISPR/Cas9遺伝子編集システムおよびその適用。【解決手段】 遺伝子編集システムは特定のCas9タンパク質とsgRNAによって形成される複合体であり、標的DNA配列の二本鎖切断を引き起こすように標的DNA配列を正確に位置決め且つ切断することができる。遺伝子編集とは、細胞内またはin vitroの遺伝子編集を指す。使用される特定のCas9タンパク質は小さく、約1000アミノ酸しか有さないため、認識されるPAM配列が単純であり;Cas9タンパク質は、配列番号1~10および58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列を有し;sgRNAが配列番号11によって表されるヌクレオチド配列を有する。【選択図】 図1
Description
本開示は遺伝子編集の技術分野に属し、特に、細胞内で遺伝子編集を行うことができるCRISPR/Cas9システム、およびその関連用途に関する。
CRISPR/Cas9は、細菌および古細菌が外来ウイルスまたはプラスミドの侵入に抵抗するように進化してきた獲得免疫システムである。前記CRISPR/Cas9システムでは、crRNA(CRISPR由来RNA)、tracrRNA(trans-activating RNA)およびCas9タンパク質は標的部位のPAM(Protospacer Adjacent Motif)配列を認識する複合体を形成し、crRNAは標的DNA配列と相補的な構造を形成し、前記Cas9タンパク質はDNA切断の機能を行い、DNA切断損傷を引き起こす。この複合体において、tracrRNAおよびcrRNAは、リンカー配列を介してシングルガイドRNA(sgRNA)に融合することができる。DNAが壊れて損傷を受けた場合、非相同末端結合(NHEJ)と相同組換え(HR)の修復を担う、細胞内のDNA損傷に対する2つの主な修復機構が存在する。前記NHEJ修復は塩基の欠失または挿入を引き起こす可能性があり、したがって、遺伝子ノックアウトに用いることができる。相同な鋳型が提供される場合、前記HR修復は、遺伝子に対する部位特異的挿入および正確な塩基置換に使用することができる。
基礎科学研究に加えて、CRISPR/Cas9はまた、幅広く臨床適用できる。CRISPR/Cas9システムを遺伝子治療に用いる場合、Cas9とsgRNAを体内に導入する必要がある。現在、AAVウイルスは遺伝子治療に最も有効なデリバリーベクターであるが、AAVウイルスによってパッケージングされ得るDNAは、一般に4.5kbを超えない。SpCas9は単純なPAM配列(NGGを認識する)を認識し、高い活性を有するため、広く使用されているが、SpCas9タンパク質自体は1368アミノ酸を有するため、sgRNAおよびプロモーターとの複合体である場合、AAVウイルスに有効にパッケージングされず、その臨床適用が制限される。上記の問題を克服するために、研究者らは、SaCas9(PAM配列はNNGRRTである)、St1Cas9(PAM配列はNNAGAWである)、NmCas9(PAM配列はNNNNGATTである)、Nme2Cas9(PAM配列はNNNNCCである)、およびCjCas9(PAM配列はNNNNRYACである)を含む、いくつかの小さいCas9タンパク質を発明した。しかしながら、これらのCas9タンパク質は標的外である(すなわち、非標的部位で切断を行う)か、または複雑なPAM配列を認識するか、または編集活性が低いかのいずれかである傾向があり、広く使用することが困難である。
そこで、上記問題を解決するために、編集活性が高く、特異性が高く、単純なPAM配列を認識する小さいCRISPR/Cas9システムが期待されている。
上記課題に鑑み、本開示は、編集活性が高く、特異性が高く、Cas9タンパク質が小さく、単純なPAM配列を認識する新たなCRISPR/Cas9遺伝子編集システムおよびその適用を提供することを目的とする。
そこで、第一の態様において、本開示は、Cas9タンパク質とsgRNAとの複合体であり、標的DNA配列の二本鎖切断損傷を引き起こすように標的DNA配列を正確に位置決め且つ切断することができる、細胞内またはin vitroで遺伝子編集を行なうためのCRISPR/Cas9遺伝子編集システムであって、
前記Cas9タンパク質が、
配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するSauriCas9タンパク質、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するShaCas9タンパク質、
配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9タンパク質、
配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するSlutCas9タンパク質、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するSa-SauriCas9タンパク質、
配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するSa-SepCas9タンパク質、
配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するSa-SeqCas9タンパク質、
配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するSa-ShaCas9タンパク質、
配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlugCas9タンパク質、
配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlutCas9タンパク質、または
配列番号58で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9-HFタンパク質、または
配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するCas9タンパク質であって、
前記sgRNAが、配列番号11によって表されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列であるCRISPR/Cas9遺伝子編集システムを提供する。
前記Cas9タンパク質が、
配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するSauriCas9タンパク質、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するShaCas9タンパク質、
配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9タンパク質、
配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するSlutCas9タンパク質、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するSa-SauriCas9タンパク質、
配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するSa-SepCas9タンパク質、
配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するSa-SeqCas9タンパク質、
配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するSa-ShaCas9タンパク質、
配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlugCas9タンパク質、
配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlutCas9タンパク質、または
配列番号58で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9-HFタンパク質、または
配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するCas9タンパク質であって、
前記sgRNAが、配列番号11によって表されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列であるCRISPR/Cas9遺伝子編集システムを提供する。
第二の態様において、本開示は、Cas9タンパク質とsgRNAとの複合体を用いて標的DNA配列を認識し、位置決めすることによって標的DNA配列を編集する、本開示の第一の態様の遺伝子編集を行なうためのCRISPR/Cas9遺伝子編集システムを用いた細胞における遺伝子編集方法であって、
前記方法が、
(1)Cas9遺伝子配列を合成し、それをpAAV2_ITRなどの発現ベクターにクローニングして、前記Cas9遺伝子配列でクローニングされた発現ベクター(例えば、pAAV2_Cas9_ITR)を得る工程であって、
前記Cas9遺伝子配列が、
(a)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、
(b)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、または
(c)ヒト化Cas9遺伝子配列、例えば、配列番号23~32および配列番号112のいずれか1つによって表されるヌクレオチド配列を有するものである工程と;
(2)前記sgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNA、すなわち、オリゴフォワード鎖配列およびオリゴリバース鎖配列を合成し、前記オリゴフォワード鎖配列および前記オリゴリバース鎖配列をアニーリングして、アニーリング産物を前記Cas9遺伝子配列でクローニングされた発現ベクターの消化部位(例えば、プラスミドpAAV2_Cas9_U6_BsaIのBsaI消化部位)とライゲーションして、前記Cas9タンパク質および前記sgRNAを発現させるpAAV2_Cas9_hU6-sgRNAなどの発現ベクターを得る工程であって、
前記sgRNAが、
配列番号11で表されるヌクレオチド配列、または配列番号11で表されるヌクレオチド配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列、または該当ヌクレオチド配列に基づく、例えば、リン酸化、短縮、延長、硫化、メチル化、またはヒドロキシル化を含む改変を有する工程と;
(3)前記標的部位を編集するための標的部位を含む細胞に前記Cas9タンパク質および前記sgRNAを発現する発現ベクターを送達する工程とを含む遺伝子編集方法を提供する。
前記方法が、
(1)Cas9遺伝子配列を合成し、それをpAAV2_ITRなどの発現ベクターにクローニングして、前記Cas9遺伝子配列でクローニングされた発現ベクター(例えば、pAAV2_Cas9_ITR)を得る工程であって、
前記Cas9遺伝子配列が、
(a)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、
(b)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、または
(c)ヒト化Cas9遺伝子配列、例えば、配列番号23~32および配列番号112のいずれか1つによって表されるヌクレオチド配列を有するものである工程と;
(2)前記sgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNA、すなわち、オリゴフォワード鎖配列およびオリゴリバース鎖配列を合成し、前記オリゴフォワード鎖配列および前記オリゴリバース鎖配列をアニーリングして、アニーリング産物を前記Cas9遺伝子配列でクローニングされた発現ベクターの消化部位(例えば、プラスミドpAAV2_Cas9_U6_BsaIのBsaI消化部位)とライゲーションして、前記Cas9タンパク質および前記sgRNAを発現させるpAAV2_Cas9_hU6-sgRNAなどの発現ベクターを得る工程であって、
前記sgRNAが、
配列番号11で表されるヌクレオチド配列、または配列番号11で表されるヌクレオチド配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列、または該当ヌクレオチド配列に基づく、例えば、リン酸化、短縮、延長、硫化、メチル化、またはヒドロキシル化を含む改変を有する工程と;
(3)前記標的部位を編集するための標的部位を含む細胞に前記Cas9タンパク質および前記sgRNAを発現する発現ベクターを送達する工程とを含む遺伝子編集方法を提供する。
第三の態様において、本開示は、遺伝子編集を行なうためのCRISPR/Cas9遺伝子編集システムのキットであって、
(1)Cas9タンパク質およびsgRNAであって
前記Cas9タンパク質が、
配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するSauriCas9タンパク質、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するShaCas9タンパク質、
配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9タンパク質、
配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するSlutCas9タンパク質、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するSa-SauriCas9タンパク質、
配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するSa-SepCas9タンパク質、
配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するSa-SeqCas9タンパク質、
配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するSa-ShaCas9タンパク質、
配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlugCas9タンパク質、
配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlutCas9タンパク質、または
配列番号58で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9-HFタンパク質、または
配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するCas9タンパク質であり、
前記sgRNAが配列番号11によって表されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列である、Cas9タンパク質およびsgRNA;または
(2)Cas9遺伝子配列およびsgRNAを発現する配列でクローニングされた発現ベクターであって、
前記Cas9遺伝子配列が
(a)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つで表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、
(b)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、または
(c)ヒト化Cas9遺伝子配列、例えば、配列番号23~32および配列番号112のいずれか1つによって表されるヌクレオチド配列を有するものであり、
前記sgRNAが、配列番号11によって表されるヌクレオチド配列、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列を有する、Cas9遺伝子配列およびsgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNAでクローニングされた発現ベクターを含む、CRISPR/Cas9遺伝子編集システムのキットを提供する。
(1)Cas9タンパク質およびsgRNAであって
前記Cas9タンパク質が、
配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するSauriCas9タンパク質、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するShaCas9タンパク質、
配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9タンパク質、
配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するSlutCas9タンパク質、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するSa-SauriCas9タンパク質、
配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するSa-SepCas9タンパク質、
配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するSa-SeqCas9タンパク質、
配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するSa-ShaCas9タンパク質、
配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlugCas9タンパク質、
配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlutCas9タンパク質、または
配列番号58で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9-HFタンパク質、または
配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するCas9タンパク質であり、
前記sgRNAが配列番号11によって表されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列である、Cas9タンパク質およびsgRNA;または
(2)Cas9遺伝子配列およびsgRNAを発現する配列でクローニングされた発現ベクターであって、
前記Cas9遺伝子配列が
(a)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つで表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、
(b)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、または
(c)ヒト化Cas9遺伝子配列、例えば、配列番号23~32および配列番号112のいずれか1つによって表されるヌクレオチド配列を有するものであり、
前記sgRNAが、配列番号11によって表されるヌクレオチド配列、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列を有する、Cas9遺伝子配列およびsgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNAでクローニングされた発現ベクターを含む、CRISPR/Cas9遺伝子編集システムのキットを提供する。
第四の態様において、本開示は、遺伝子ノックアウト、部位特異的塩基変化、部位特異的挿入、遺伝子転写レベルの調節、DNAメチル化の調節、DNAアセチル化の改変、ヒストンアセチル化の改変、一塩基変換またはクロマチンイメージング追跡における、本開示の第一の態様のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムの使用を提供する。
従来技術における既存のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムと比較して、本開示のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムは、従来技術よりも少ないアミノ酸を有する小さいCas9タンパク質を含むことによって、効果的にパッケージングすることができる。さらに、本開示のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムは、比較的単純なPAM配列を認識することができるため、ゲノム中のより多くのDNA配列を標的とすることができ、編集効率がより高い。
以下の実施形態は本開示をさらに例示するために提供されるが、本開示の保護範囲を何ら限定しない。本開示の保護範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。
背景技術の項で述べたように、現在のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムには様々な問題がある。例えば、Cas9タンパク質は大きすぎて、システムをウイルスのようなベクターに効果的にパッケージングすることができない。別の例として、現在のPAM配列は比較的複雑であるため編集範囲が狭く、現在のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムを広く使用することは困難である。さらに別の例として、現在の小さいCas9タンパク質は一般に、編集活性が低い。
上記課題に対して、本開示は、編集活性が高く、特異性が高く、Cas9タンパク質が小さく、単純なPAM配列を認識する新たなCRISPR/Cas9遺伝子編集システムおよびその適用を提供することを目的とする。
そこで、第一の態様において、Cas9タンパク質とsgRNAとの複合体であり、標的DNA配列の二本鎖切断損傷を引き起こすように標的DNA配列を正確に位置決め且つ切断することができる、細胞内またはin vitroで遺伝子編集を行うためのCRISPR/Cas9遺伝子編集システムであって、
前記Cas9タンパク質が、
配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するSauriCas9タンパク質、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するShaCas9タンパク質、
配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9タンパク質、
配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するSlutCas9タンパク質、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するSa-SauriCas9タンパク質、
配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するSa-SepCas9タンパク質、
配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するSa-SeqCas9タンパク質、
配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するSa-ShaCas9タンパク質、
配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlugCas9タンパク質、
配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlutCas9タンパク質、
配列番号58で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9-HFタンパク質、または
配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するCas9タンパク質であって、
前記sgRNAが、
配列番号11によって表されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列であるCRISPR/Cas9遺伝子編集システムを提供する。
前記Cas9タンパク質が、
配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するSauriCas9タンパク質、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するShaCas9タンパク質、
配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9タンパク質、
配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するSlutCas9タンパク質、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するSa-SauriCas9タンパク質、
配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するSa-SepCas9タンパク質、
配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するSa-SeqCas9タンパク質、
配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するSa-ShaCas9タンパク質、
配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlugCas9タンパク質、
配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlutCas9タンパク質、
配列番号58で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9-HFタンパク質、または
配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するCas9タンパク質であって、
前記sgRNAが、
配列番号11によって表されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列であるCRISPR/Cas9遺伝子編集システムを提供する。
本開示において、配列番号1~11および配列番号58の配列は以下の通りである。
配列番号1 SauriCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MQENQQKQNYILGLDIGITSVGYGLIDSKTREVIDAGVRLFPEADSENNSNRRSKRGARRLKRRRIHRLNRVKDLLADYQMIDLNNVPKSTDPYTIRVKGLREPLTKEEFAIALLHIAKRRGLHNISVSMGDEEQDNELSTKQQLQKNAQQLQDKYVCELQLERLTNINKVRGEKNRFKTEDFVKEVKQLCETQRQYHNIDDQFIQQYIDLVSTRREYFEGPGNGSPYGWDGDLLKWYEKLMGRCTYFPEELRSVKYAYSADLFNALNDLNNLVVTRDDNPKLEYYEKYHIIENVFKQKKNPTLKQIAKEIGVQDYDIRGYRITKSGKPQFTSFKLYHDLKNIFEQAKYLEDVEMLDEIAKILTIYQDEISIKKALDQLPELLTESEKSQIAQLTGYTGTHRLSLKCIHIVIDELWESPENQMEIFTRLNLKPKKVEMSEIDSIPTTLVDEFILSPVVKRAFIQSIKVINAVINRFGLPEDIIIELAREKNSKDRRKFINKLQKQNEATRKKIEQLLAKYGNTNAKYMIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLSNPTHYEVDHIIPRSVSFDNSLNNKVLVKQSENSKKGNRTPYQYLSSNESKISYNQFKQHILNLSKAKDRISKKKRDMLLEERDINKFEVQKEFINRNLVDTRYATRELSNLLKTYFSTHDYAVKVKTINGGFTNHLRKVWDFKKHRNHGYKHHAEDALVIANADFLFKTHKALRRTDKILEQPGLEVNDTTVKVDTEEKYQELFETPKQVKNIKQFRDFKYSHRVDKKPNRQLINDTLYSTREIDGETYVVQTLKDLYAKDNEKVKKLFTERPQKILMYQHDPKTFEKLMTILNQYAEAKNPLAAYYEDKGEYVTKYAKKGNGPAIHKIKYIDKKLGSYLDVSNKYPETQNKLVKLSLKSFRFDIYKCEQGYKMVSIGYLDVLKKDNYYYIPKDKYEAEKQKKKIKESDLFVGSFYYNDLIMYEDELFRVIGVNSDINNLVELNMVDITYKDFCEVNNVTGEKRIKKTIGKRVVLIEKYTTDILGNLYKTPLPKKPQLIFKRGEL;
配列番号2 ShaCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKTDYILGLDIGITSVGYGIINYNDKSIIDAGVRLFPEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRIHRLERVKQLLLDYKLLDSIDVIPQSTNPYEIRVRGLREKLTKDELVIALLHLAKRRGIHNIDVIDQEEDASNELSTKEQLSKNNLLLRDKSICEVLLERYNEGKVRGEKNRFKTSDIVNEIRQILETQKEVHHLDDSFIDKYIELVETRREYYEGPGEGSPYGWGADLKKWYEHLMGRCTYFPEELRSVKYAYSADLFNALNDLNNLVIQRDGLNKLEYHEKYHIIENVFKQKKKPTLKQISNEIGVNPEDIKGYRITKSGKENFTEFKLYHDLKKILKDQSILENIQLLDQIAEIITIYQDKESIKKELEQLTEPINEIDKESISDLAGYNGTHRLSLKCINLVLEELWHTSRNQMEIFAYLNIKPRKIDLQKANKIPKDMIDEFILSPVVKRTFGQAINVINKVIEKYGVPKDIIIELARENNTKDKQKFINELQKKNEKTRQRINEIIGKTGNQNAKRLVEKIRLHDEQEGKCLYSLESIPLEDLLNNPNHYEVDHIIPRSVSFDNSYQNKVLVKQTENSKKGNRTPYQYLNSGEAKLSYNQFKQHVLNLSKSKDRISKKKKEYLLEERDINKFEVQKEFINRNLVDTRYATRELTNYLKAYFSANDMDVKVKTINGSFTNHLRKVWDFNKERNHGYKHHAEDALIIANADFLFKENKKLKAANKVLEQPERKEIETKIEVNSDENYQDLFVIPQQVKEIKEFRDFKYSHRVDKKPNRQLINDTLYSTRVKDDDLYIISPIKNIYSKDNTDLKKHFNKNPEKFLMYQKDPKTFEKLEVIMKQYANEKNPLAKYHEETGEYLTKYSKTNNGPIVKSIKMFGKKVGNHLDVTNQYNNSRNKLVKLSFKSYRFDVYLTDKGYKFVSITYLDVLKKENYYYISEAKYDKLKLNKGIDDKAKFIGSFYYNDLIELDGEVYTVIGVNNDKNNVIELNLPEIRYKEYCEINNIKGSGRLRITIGKKVNSIRKLSTDVLGNRYYQSFAKKPQLVFKKGI*;
配列番号3 SlugCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MNQKFILGLDIGITSVGYGLIDYETKNIIDAGVRLFPEANVENNEGRRSKRGSRRLKRRRIHRLERVKKLLEDYNLLDQSQIPQSTNPYAIRVKGLSEALSKDELVIALLHIAKRRGIHKIDVIDSNDDVGNELSTKEQLNKNSKLLKDKFVCQIQLERMNEGQVRGEKNRFKTADIIKEIIQLLNVQKNFHQLDENFINKYIELVEMRREYFEGPGKGSPYGWEGDPKAWYETLMGHCTYFPDELRSVKYAYSADLFNALNDLNNLVIQRDGLSKLEYHEKYHIIENVFKQKKKPTLKQIANEINVNPEDIKGYRITKSGKPQFTEFKLYHDLKSVLFDQSILENEDVLDQIAEILTIYQDKDSIKSKLTELDILLNEEDKENIAQLTGYTGTHRLSLKCIRLVLEEQWYSSRNQMEIFTHLNIKPKKINLTAANKIPKAMIDEFILSPVVKRTFGQAINLINKIIEKYGVPEDIIIELARENNSKDKQKFINEMQKKNENTRKRINEIIGKYGNQNAKRLVEKIRLHDEQEGKCLYSLESIPLEDLLNNPNHYEVDHIIPRSVSFDNSYHNKVLVKQSENSKKSNLTPYQYFNSGKSKLSYNQFKQHILNLSKSQDRISKKKKEYLLEERDINKFEVQKEFINRNLVDTRYATRELTNYLKAYFSANNMNVKVKTINGSFTDYLRKVWKFKKERNHGYKHHAEDALIIANADFLFKENKKLKAVNSVLEKPEIESKQLDIQVDSEDNYSEMFIIPKQVQDIKDFRNFKYSHRVDKKPNRQLINDTLYSTRKKDNSTYIVQTIKDIYAKDNTTLKKQFDKSPEKFLMYQHDPRTFEKLEVIMKQYANEKNPLAKYHEETGEYLTKYSKKNNGPIVKSLKYIGNKLGSHLDVTHQFKSSTKKLVKLSIKPYRFDVYLTDKGYKFITISYLDVLKKDNYYYIPEQKYDKLKLGKAIDKNAKFIASFYKNDLIKLDGEIYKIIGVNSDTRNMIELDLPDIRYKEYCELNNIKGEPRIKKTIGKKVNSIEKLTTDVLGNVFTNTQYTKPQLLFKRGN*;
配列番号4 SlutCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MRNSYILGLDIGITSVGYGIIDRVTREVIDAGVRLFPEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRIHRLNRIKQLLKNAGLLEGDVLPKSTNPYEIRVRGLRSPLTKDELVIALLHIAKRRGIHNINIVGDDEETDSTLSTTAQLKKNEKALKGQFVCELQLDRLANAHQVRGEKNRFKTEDIVKEVRALLQQQQNFHNIDNSFVEQYIALLESRRTYYEGPGEGSPYGWDGDIKKWYEMLMGYCTYFPEELRSVKYAYTADLFNALNDLNNLVITRDDNSKLTYAEKYHIIENVFKQKKVPTLKQIAKEIGVNESDIKGYRINKSEKPLFTSFKLYHDLKSVFSDPTKLEDIDLLDRIAVVLTMYQDAESMKAALNTFPEVFSEAEKEKLSALTGYAGTHRLSLKC MNLLIPDLWQTSLNQMELFVKLNLKPQKLDLSQCHQIPTQLVDEFILSPVVKRAFTQSIKVINAIIQKYGLPDDIIIELAREKNSADKRKFLNQLQKKNEKARHEINTLVAQYGQPNAKRLVEKITLHQQQEGKCLYSLKDIPLEQLLKQPYLYEVDHIIPRSVSFDNSMQNKVLVLAEENAKKGNQTPYQYLNSREASMTYPEFKQHILNLSKAKDRISKKKRNYLLEERDINKFDVQKDFINRNLVDTRYATRELASLLKAYFKTHELPVKVKTINGGFTHYLRKVWKFDKDRNKGYKHHAEDALIIANADFLFKNQTLNKIEAILNEPGREVESDTVKVQSEDNYQDLFENTKKAFAIKNFKDFKFSHRVDQKPNRQLVNDTLYSTREVNEDLYVVQTLKDIYSKDNKDVKRLFDKQPEKFLMFQHDPETFKKFELAMKQYAEEKNPLARYYEEQGYITKYAKKGDGPPVKSLKYIGKKVGKHLDVTGDYEDSNRKLVKLSLKSFRFDIYHTDKGYKMVPITYLDVQKKEKYYYIPTEKYEALKQEKGINQNAQFIGSFYYNDLIEFDGELYRVIGINNGDKNLVELDMVDIRYKEYCELNSITTTPRIVKTISPKTQSIEKYTTDILGNLYKAQPGKKPQFIFNKDED*;
配列番号5 Sa-SauriCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKSFRFDIYKCEQGYKMVSIGYLDVLKKDNYYYIPKDKYEAEKQKKKIKESDLFVGSFYYNDLIMYEDELFRVIGVNSDINNLVELNMVDITYKDFCEVNNVTGEKRIKKTIGKRVVLIEKYTTDILGNLYKTPLPKKPQLIFKRGEL*;
配列番号6 Sa-SepCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKNYRFDVYLTEKGYKFVTIAYLNVFKKDNYYYIPKDMYQELKAKKKIKDTDQFIASFYKNDLIKLNGDLYKIIGVNSDDRNIIELDYYDIKYKDYCEINNIKGEPRIKKTIGKKTESIEKLTTDVLGNLYLHSTEKAPQLIFKRGL*;
配列番号7 Sa-SeqCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLNVIKKENYYEVNSKCYEKAKKLKKISDQAEFIASFYNNDLIKIDGELYRVIGVNTDLINRIEVNMVDITYREYLENMNDKRSPRIFKTIASKTQSIKKYSTDILGTLYEVNSKKHPQMIMKG*;
配列番号8 Sa-ShaCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKSYRFDVYLTDKGYKFVSITYLDVLKKENYYYISEAKYDKLKLNKGIDDKAKFIGSFYYNDLIELDGEVYTVIGVNNDKNNVIELNLPEIRYKEYCEINNIKGSGRLRITIGKKVNSIRKLSTDVLGNRYYQSFAKKPQLVFKKGI*;
配列番号9 Sa-SlugCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLTDKGYKFITISYLDVLKKDNYYYIPEQKYDKLKLGKAIDKNAKFIASFYKNDLIKLDGEIYKIIGVNSDTRNMIELDLPDIRYKEYCELNNIKGEPRIKKTIGKKVNSIEKLTTDVLGNVFTNTQYTKPQLLFKRGN*;
配列番号10 Sa-SlutCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKSFRFDIYHTDKGYKMVPITYLDVQKKEKYYYIPTEKYEALKQEKGINQNAQFIGSFYYNDLIEFDGELYRVIGINNGDKNLVELDMVDIRYKEYCELNSITTTPRIVKTISPKTQSIEKYTTDILGNLYKAQPGKKPQFIFNKDED*;
配列番号11 sgRNAのヌクレオチド配列:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUU;
配列番号58 SlugCas9-HFタンパク質のアミノ酸配列:
MNQKFILGLDIGITSVGYGLIDYETKNIIDAGVRLFPEANVENNEGRRSKRGSRRLKRRRIHRLERVKKLLEDYNLLDQSQIPQSTNPYAIRVKGLSEALSKDELVIALLHIAKRRGIHKIDVIDSNDDVGNELSTKEQLNKNSKLLKDKFVCQIQLERMNEGQVRGEKNRFKTADIIKEIIQLLNVQKNFHQLDENFINKYIELVEMRREYFEGPGKGSPYGWEGDPKAWYETLMGHCTYFPDELASVKYAYSADLFNALNDLNNLVIQRDGLSKLEYHEKYHIIENVFKQKKKPTLKQIANEINVNPEDIKGYRITKSGKPQFTEFKLYHDLKSVLFDQSILENEDVLDQIAEILTIYQDKDSIKSKLTELDILLNEEDKENIAQLTGYTGTHRLSLKCIRLVLEEQWYSSRAQMEIFAHLNIKPKKINLTAANKIPKAMIDEFILSPVVKRTFGQAINLINKIIEKYGVPEDIIIELARENNSKDKQKFINEMQKKNENTRKRINEIIGKYGNQNAKRLVEKIRLHDEQEGKCLYSLESIPLEDLLNNPNHYEVDHIIPRSVSFDNSYHNKVLVKQSENSKKSNLTPYQYFNSGKSKLSYNQFKQHILNLSKSQDRISKKKKEYLLEERDINKFEVQKEFINRNLVDTRYATAELTNYLKAYFSANNMNVKVKTINGSFTDYLRKVWKFKKERNHGYKHHAEDALIIANADFLFKENKKLKAVNSVLEKPEIESKQLDIQVDSEDNYSEMFIIPKQVQDIKDFRNFKYSHRVDKKPNRQLINDTLYSTRKKDNSTYIVQTIKDIYAKDNTTLKKQFDKSPEKFLMYQHDPRTFEKLEVIMKQYANEKNPLAKYHEETGEYLTKYSKKNNGPIVKSLKYIGNKLGSHLDVTHQFKSSTKKLVKLSIKPYRFDVYLTDKGYKFITISYLDVLKKDNYYYIPEQKYDKLKLGKAIDKNAKFIASFYKNDLIKLDGEIYKIIGVNSDTRNMIELDLPDIRYKEYCELNNIKGEPRIKKTIGKKVNSIEKLTTDVLGNVFTNTQYTKPQLLFKRGN.
配列番号1 SauriCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MQENQQKQNYILGLDIGITSVGYGLIDSKTREVIDAGVRLFPEADSENNSNRRSKRGARRLKRRRIHRLNRVKDLLADYQMIDLNNVPKSTDPYTIRVKGLREPLTKEEFAIALLHIAKRRGLHNISVSMGDEEQDNELSTKQQLQKNAQQLQDKYVCELQLERLTNINKVRGEKNRFKTEDFVKEVKQLCETQRQYHNIDDQFIQQYIDLVSTRREYFEGPGNGSPYGWDGDLLKWYEKLMGRCTYFPEELRSVKYAYSADLFNALNDLNNLVVTRDDNPKLEYYEKYHIIENVFKQKKNPTLKQIAKEIGVQDYDIRGYRITKSGKPQFTSFKLYHDLKNIFEQAKYLEDVEMLDEIAKILTIYQDEISIKKALDQLPELLTESEKSQIAQLTGYTGTHRLSLKCIHIVIDELWESPENQMEIFTRLNLKPKKVEMSEIDSIPTTLVDEFILSPVVKRAFIQSIKVINAVINRFGLPEDIIIELAREKNSKDRRKFINKLQKQNEATRKKIEQLLAKYGNTNAKYMIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLSNPTHYEVDHIIPRSVSFDNSLNNKVLVKQSENSKKGNRTPYQYLSSNESKISYNQFKQHILNLSKAKDRISKKKRDMLLEERDINKFEVQKEFINRNLVDTRYATRELSNLLKTYFSTHDYAVKVKTINGGFTNHLRKVWDFKKHRNHGYKHHAEDALVIANADFLFKTHKALRRTDKILEQPGLEVNDTTVKVDTEEKYQELFETPKQVKNIKQFRDFKYSHRVDKKPNRQLINDTLYSTREIDGETYVVQTLKDLYAKDNEKVKKLFTERPQKILMYQHDPKTFEKLMTILNQYAEAKNPLAAYYEDKGEYVTKYAKKGNGPAIHKIKYIDKKLGSYLDVSNKYPETQNKLVKLSLKSFRFDIYKCEQGYKMVSIGYLDVLKKDNYYYIPKDKYEAEKQKKKIKESDLFVGSFYYNDLIMYEDELFRVIGVNSDINNLVELNMVDITYKDFCEVNNVTGEKRIKKTIGKRVVLIEKYTTDILGNLYKTPLPKKPQLIFKRGEL;
配列番号2 ShaCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKTDYILGLDIGITSVGYGIINYNDKSIIDAGVRLFPEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRIHRLERVKQLLLDYKLLDSIDVIPQSTNPYEIRVRGLREKLTKDELVIALLHLAKRRGIHNIDVIDQEEDASNELSTKEQLSKNNLLLRDKSICEVLLERYNEGKVRGEKNRFKTSDIVNEIRQILETQKEVHHLDDSFIDKYIELVETRREYYEGPGEGSPYGWGADLKKWYEHLMGRCTYFPEELRSVKYAYSADLFNALNDLNNLVIQRDGLNKLEYHEKYHIIENVFKQKKKPTLKQISNEIGVNPEDIKGYRITKSGKENFTEFKLYHDLKKILKDQSILENIQLLDQIAEIITIYQDKESIKKELEQLTEPINEIDKESISDLAGYNGTHRLSLKCINLVLEELWHTSRNQMEIFAYLNIKPRKIDLQKANKIPKDMIDEFILSPVVKRTFGQAINVINKVIEKYGVPKDIIIELARENNTKDKQKFINELQKKNEKTRQRINEIIGKTGNQNAKRLVEKIRLHDEQEGKCLYSLESIPLEDLLNNPNHYEVDHIIPRSVSFDNSYQNKVLVKQTENSKKGNRTPYQYLNSGEAKLSYNQFKQHVLNLSKSKDRISKKKKEYLLEERDINKFEVQKEFINRNLVDTRYATRELTNYLKAYFSANDMDVKVKTINGSFTNHLRKVWDFNKERNHGYKHHAEDALIIANADFLFKENKKLKAANKVLEQPERKEIETKIEVNSDENYQDLFVIPQQVKEIKEFRDFKYSHRVDKKPNRQLINDTLYSTRVKDDDLYIISPIKNIYSKDNTDLKKHFNKNPEKFLMYQKDPKTFEKLEVIMKQYANEKNPLAKYHEETGEYLTKYSKTNNGPIVKSIKMFGKKVGNHLDVTNQYNNSRNKLVKLSFKSYRFDVYLTDKGYKFVSITYLDVLKKENYYYISEAKYDKLKLNKGIDDKAKFIGSFYYNDLIELDGEVYTVIGVNNDKNNVIELNLPEIRYKEYCEINNIKGSGRLRITIGKKVNSIRKLSTDVLGNRYYQSFAKKPQLVFKKGI*;
配列番号3 SlugCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MNQKFILGLDIGITSVGYGLIDYETKNIIDAGVRLFPEANVENNEGRRSKRGSRRLKRRRIHRLERVKKLLEDYNLLDQSQIPQSTNPYAIRVKGLSEALSKDELVIALLHIAKRRGIHKIDVIDSNDDVGNELSTKEQLNKNSKLLKDKFVCQIQLERMNEGQVRGEKNRFKTADIIKEIIQLLNVQKNFHQLDENFINKYIELVEMRREYFEGPGKGSPYGWEGDPKAWYETLMGHCTYFPDELRSVKYAYSADLFNALNDLNNLVIQRDGLSKLEYHEKYHIIENVFKQKKKPTLKQIANEINVNPEDIKGYRITKSGKPQFTEFKLYHDLKSVLFDQSILENEDVLDQIAEILTIYQDKDSIKSKLTELDILLNEEDKENIAQLTGYTGTHRLSLKCIRLVLEEQWYSSRNQMEIFTHLNIKPKKINLTAANKIPKAMIDEFILSPVVKRTFGQAINLINKIIEKYGVPEDIIIELARENNSKDKQKFINEMQKKNENTRKRINEIIGKYGNQNAKRLVEKIRLHDEQEGKCLYSLESIPLEDLLNNPNHYEVDHIIPRSVSFDNSYHNKVLVKQSENSKKSNLTPYQYFNSGKSKLSYNQFKQHILNLSKSQDRISKKKKEYLLEERDINKFEVQKEFINRNLVDTRYATRELTNYLKAYFSANNMNVKVKTINGSFTDYLRKVWKFKKERNHGYKHHAEDALIIANADFLFKENKKLKAVNSVLEKPEIESKQLDIQVDSEDNYSEMFIIPKQVQDIKDFRNFKYSHRVDKKPNRQLINDTLYSTRKKDNSTYIVQTIKDIYAKDNTTLKKQFDKSPEKFLMYQHDPRTFEKLEVIMKQYANEKNPLAKYHEETGEYLTKYSKKNNGPIVKSLKYIGNKLGSHLDVTHQFKSSTKKLVKLSIKPYRFDVYLTDKGYKFITISYLDVLKKDNYYYIPEQKYDKLKLGKAIDKNAKFIASFYKNDLIKLDGEIYKIIGVNSDTRNMIELDLPDIRYKEYCELNNIKGEPRIKKTIGKKVNSIEKLTTDVLGNVFTNTQYTKPQLLFKRGN*;
配列番号4 SlutCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MRNSYILGLDIGITSVGYGIIDRVTREVIDAGVRLFPEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRIHRLNRIKQLLKNAGLLEGDVLPKSTNPYEIRVRGLRSPLTKDELVIALLHIAKRRGIHNINIVGDDEETDSTLSTTAQLKKNEKALKGQFVCELQLDRLANAHQVRGEKNRFKTEDIVKEVRALLQQQQNFHNIDNSFVEQYIALLESRRTYYEGPGEGSPYGWDGDIKKWYEMLMGYCTYFPEELRSVKYAYTADLFNALNDLNNLVITRDDNSKLTYAEKYHIIENVFKQKKVPTLKQIAKEIGVNESDIKGYRINKSEKPLFTSFKLYHDLKSVFSDPTKLEDIDLLDRIAVVLTMYQDAESMKAALNTFPEVFSEAEKEKLSALTGYAGTHRLSLKC MNLLIPDLWQTSLNQMELFVKLNLKPQKLDLSQCHQIPTQLVDEFILSPVVKRAFTQSIKVINAIIQKYGLPDDIIIELAREKNSADKRKFLNQLQKKNEKARHEINTLVAQYGQPNAKRLVEKITLHQQQEGKCLYSLKDIPLEQLLKQPYLYEVDHIIPRSVSFDNSMQNKVLVLAEENAKKGNQTPYQYLNSREASMTYPEFKQHILNLSKAKDRISKKKRNYLLEERDINKFDVQKDFINRNLVDTRYATRELASLLKAYFKTHELPVKVKTINGGFTHYLRKVWKFDKDRNKGYKHHAEDALIIANADFLFKNQTLNKIEAILNEPGREVESDTVKVQSEDNYQDLFENTKKAFAIKNFKDFKFSHRVDQKPNRQLVNDTLYSTREVNEDLYVVQTLKDIYSKDNKDVKRLFDKQPEKFLMFQHDPETFKKFELAMKQYAEEKNPLARYYEEQGYITKYAKKGDGPPVKSLKYIGKKVGKHLDVTGDYEDSNRKLVKLSLKSFRFDIYHTDKGYKMVPITYLDVQKKEKYYYIPTEKYEALKQEKGINQNAQFIGSFYYNDLIEFDGELYRVIGINNGDKNLVELDMVDIRYKEYCELNSITTTPRIVKTISPKTQSIEKYTTDILGNLYKAQPGKKPQFIFNKDED*;
配列番号5 Sa-SauriCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKSFRFDIYKCEQGYKMVSIGYLDVLKKDNYYYIPKDKYEAEKQKKKIKESDLFVGSFYYNDLIMYEDELFRVIGVNSDINNLVELNMVDITYKDFCEVNNVTGEKRIKKTIGKRVVLIEKYTTDILGNLYKTPLPKKPQLIFKRGEL*;
配列番号6 Sa-SepCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKNYRFDVYLTEKGYKFVTIAYLNVFKKDNYYYIPKDMYQELKAKKKIKDTDQFIASFYKNDLIKLNGDLYKIIGVNSDDRNIIELDYYDIKYKDYCEINNIKGEPRIKKTIGKKTESIEKLTTDVLGNLYLHSTEKAPQLIFKRGL*;
配列番号7 Sa-SeqCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLNVIKKENYYEVNSKCYEKAKKLKKISDQAEFIASFYNNDLIKIDGELYRVIGVNTDLINRIEVNMVDITYREYLENMNDKRSPRIFKTIASKTQSIKKYSTDILGTLYEVNSKKHPQMIMKG*;
配列番号8 Sa-ShaCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKSYRFDVYLTDKGYKFVSITYLDVLKKENYYYISEAKYDKLKLNKGIDDKAKFIGSFYYNDLIELDGEVYTVIGVNNDKNNVIELNLPEIRYKEYCEINNIKGSGRLRITIGKKVNSIRKLSTDVLGNRYYQSFAKKPQLVFKKGI*;
配列番号9 Sa-SlugCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLTDKGYKFITISYLDVLKKDNYYYIPEQKYDKLKLGKAIDKNAKFIASFYKNDLIKLDGEIYKIIGVNSDTRNMIELDLPDIRYKEYCELNNIKGEPRIKKTIGKKVNSIEKLTTDVLGNVFTNTQYTKPQLLFKRGN*;
配列番号10 Sa-SlutCas9タンパク質のアミノ酸配列:
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNAATNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATAALMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKSFRFDIYHTDKGYKMVPITYLDVQKKEKYYYIPTEKYEALKQEKGINQNAQFIGSFYYNDLIEFDGELYRVIGINNGDKNLVELDMVDIRYKEYCELNSITTTPRIVKTISPKTQSIEKYTTDILGNLYKAQPGKKPQFIFNKDED*;
配列番号11 sgRNAのヌクレオチド配列:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUU;
配列番号58 SlugCas9-HFタンパク質のアミノ酸配列:
MNQKFILGLDIGITSVGYGLIDYETKNIIDAGVRLFPEANVENNEGRRSKRGSRRLKRRRIHRLERVKKLLEDYNLLDQSQIPQSTNPYAIRVKGLSEALSKDELVIALLHIAKRRGIHKIDVIDSNDDVGNELSTKEQLNKNSKLLKDKFVCQIQLERMNEGQVRGEKNRFKTADIIKEIIQLLNVQKNFHQLDENFINKYIELVEMRREYFEGPGKGSPYGWEGDPKAWYETLMGHCTYFPDELASVKYAYSADLFNALNDLNNLVIQRDGLSKLEYHEKYHIIENVFKQKKKPTLKQIANEINVNPEDIKGYRITKSGKPQFTEFKLYHDLKSVLFDQSILENEDVLDQIAEILTIYQDKDSIKSKLTELDILLNEEDKENIAQLTGYTGTHRLSLKCIRLVLEEQWYSSRAQMEIFAHLNIKPKKINLTAANKIPKAMIDEFILSPVVKRTFGQAINLINKIIEKYGVPEDIIIELARENNSKDKQKFINEMQKKNENTRKRINEIIGKYGNQNAKRLVEKIRLHDEQEGKCLYSLESIPLEDLLNNPNHYEVDHIIPRSVSFDNSYHNKVLVKQSENSKKSNLTPYQYFNSGKSKLSYNQFKQHILNLSKSQDRISKKKKEYLLEERDINKFEVQKEFINRNLVDTRYATAELTNYLKAYFSANNMNVKVKTINGSFTDYLRKVWKFKKERNHGYKHHAEDALIIANADFLFKENKKLKAVNSVLEKPEIESKQLDIQVDSEDNYSEMFIIPKQVQDIKDFRNFKYSHRVDKKPNRQLINDTLYSTRKKDNSTYIVQTIKDIYAKDNTTLKKQFDKSPEKFLMYQHDPRTFEKLEVIMKQYANEKNPLAKYHEETGEYLTKYSKKNNGPIVKSLKYIGNKLGSHLDVTHQFKSSTKKLVKLSIKPYRFDVYLTDKGYKFITISYLDVLKKDNYYYIPEQKYDKLKLGKAIDKNAKFIASFYKNDLIKLDGEIYKIIGVNSDTRNMIELDLPDIRYKEYCELNNIKGEPRIKKTIGKKVNSIEKLTTDVLGNVFTNTQYTKPQLLFKRGN.
上記のように、本発明の発明者らは、シングルガイドRNA(sgRNA)と複合体化し得る種々のCas9タンパク質を発見した。前記SauriCas9タンパク質とsgRNAによって形成する複合体を、本出願ではCRISPR/SauriCas9遺伝子編集システム(すなわち、SauriCas9タンパク質とシングルガイドRNA(sgRNA)が協調して遺伝子編集を行うシステム)という。CRISPR/ShaCas9遺伝子編集システム、CRISPR/SlugCas9遺伝子編集システムなど、他のCas9タンパク質とsgRNAによって形成される複合体も同様に命名できる。
本開示の全てのCas9タンパク質は非常に小さく、わずか1100未満のアミノ酸を有する。特に、SauriCas9タンパク質は1061アミノ酸、ShaCas9タンパク質、Sa-SepCas9タンパク質、Sa-ShaCas9タンパク質およびSa-SlugCas9タンパク質は1055アミノ酸、Sa-SeqCas9タンパク質は1053アミノ酸、SlugCas9タンパク質、SlugCas9-HFタンパク質およびSlutCas9タンパク質は1054アミノ酸、Sa-SauriCas9およびSa-SlutCas9タンパク質は1056アミノ酸を有する。
一実施形態において、本開示のCas9タンパク質は、配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、または80%から100%の範囲の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、細胞は真核細胞および原核細胞を含む。前記真核細胞は、例えば、哺乳動物細胞および植物細胞を含み、前記哺乳動物細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスセルトリ細胞、マウス乳房腫瘍細胞、Buffaloラット肝細胞、ラット肝細胞腫細胞、SV40形質転換サル腎臓CVI系統、サル腎臓細胞、イヌ腎臓細胞、ヒト子宮頸癌細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、HIH/3T3細胞、ヒトU2-OS骨肉腫細胞、ヒトA549細胞、ヒトK562細胞、ヒトHEK293細胞、ヒトHEK293T細胞、ヒトHCT116細胞、またはヒトMCF-7細胞またはTRI細胞を含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、配列番号1によって表されるアミノ酸配列を有し、シングルガイドRNA(sgRNA)と作用して遺伝子編集を行う、Staphylococcus auricularisCas9(SauriCas9)タンパク質を含む。
一実施形態において、SauriCas9タンパク質はStaphylococcus auricularisに由来し、UniProt受託番号はA0A2T4M4R5である。
一実施形態において、SauriCas9タンパク質は、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するSauriCas9タンパク質を含む。
一実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、配列番号2によって表されるアミノ酸配列を有し、シングルガイドRNA(sgRNA)と作用して遺伝子編集を行う、Staphylococcus haemolyticus Cas9(ShaCas9)タンパク質を含む。
一実施形態において、ShaCas9タンパク質は、Staphylococcus haemolyticusに由来し、UniProt受託番号はA0A2T4SLN6である。
一実施形態において、ShaCas9タンパク質は、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するShaCas9タンパク質を含む。
一実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、配列番号3によって表されるアミノ酸配列を有し、シングルガイドRNA(sgRNA)と作用して遺伝子編集を行う、Staphylococcus lugdunensis Cas9(SlugCas9)タンパク質を含む。
一実施形態において、SlugCas9タンパク質は、Staphylococcus lugdunensisに由来し、UniProt受託番号はA0A133QCR3である。
一実施形態において、SlugCas9タンパク質は、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するSlugCas9タンパク質を含む。
一実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、配列番号4によって表されるアミノ酸配列を有し、シングルガイドRNA(sgRNA)と作用して遺伝子編集を行うStaphylococcus lutrae Cas9(SlutCas9)タンパク質を含む。
一実施形態において、SlutCas9タンパク質は、Staphylococcus lutraeに由来し、UniProt受託番号はA0A1W6BMI2である。
一実施形態において、SlutCas9タンパク質は、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するSlutCas9タンパク質を含む。
一実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、SaCas9のPIドメインをSauriCas9(Staphylococcus auricularis Cas9)のPIドメインで置換することによって得られる融合タンパク質であるSa-SauriCas9タンパク質を含む。前記Sa-SauriCas9タンパク質は、配列番号5によって表されるアミノ酸配列を有する。Sa-SauriCas9融合タンパク質は、シングルガイドRNA(sgRNA)と作用して、遺伝子編集を行う。
一実施形態において、SauriCas9タンパク質は、Staphylococcus auricularisに由来し、UniProt受託番号はA0A2T4M4R5である。
一実施形態において、Sa-SauriCas9タンパク質は、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するSa-SauriCas9タンパク質を含む。
一実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、SaCas9のPIドメインをSepCas9(Staphylococcus epidermidis Cas9)のPIドメインで置換することによって得られる融合タンパク質であるSa-SepCas9タンパク質を含む。前記Sa-SepCas9タンパク質は、配列番号6によって表されるアミノ酸配列を有する。前記Sa-SepCas9融合タンパク質はシングルガイドRNA(sgRNA)と作用して、遺伝子編集を行う。
一実施形態において、SepCas9タンパク質は、Staphylococcus epidermidisに由来し、UniProt受託番号はA0A1Q9MLU4であり、NCBI受託番号はWP_075777761.1である。
一実施形態において、Sa-SepCas9タンパク質は、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するSa-SepCas9タンパク質を含む。
一実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、SaCas9のPIドメインをSeqCas9(Staphylococcus equorum Cas9)のPIドメインで置換することによって得られる融合タンパク質であるSa-SeqCas9タンパク質を含む。前記Sa-SeqCas9タンパク質は、配列番号7によって表されるアミノ酸配列を有する。前記Sa-SeqCas9融合タンパク質はシングルガイドRNA(sgRNA)と作用して、遺伝子編集を行う。
一実施形態において、SeqCas9タンパク質は、Staphylococcus equorumに由来し、UniProt受託番号はA0A1E5TL62である。
一実施形態において、Sa-SeqCas9タンパク質は、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するSa-SeqCas9タンパク質を含む。
一実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、SaCas9のPIドメインをShaCas9(Staphylococcus haemolyticus Cas9)のPIドメインで置換することによって得られる融合タンパク質であるSa-ShaCas9タンパク質を含む。前記Sa-ShaCas9タンパク質は、配列番号8によって表されるアミノ酸配列を有する。前記Sa-ShaCas9融合タンパク質はシングルガイドRNA(sgRNA)と作用して、遺伝子編集を行う。
一実施形態において、ShaCas9タンパク質は、Staphylococcus haemolyticusに由来し、UniProt受託番号はA0A2T4SLN6である。
一実施形態において、Sa-ShaCas9タンパク質は、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するSa-ShaCas9タンパク質を含む。
一実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、SaCas9のPIドメインをSlugCas9(Staphylococcus lugdunensis Cas9)のPIドメインで置換することによって得られる融合タンパク質であるSa-SlugCas9タンパク質を含む。前記Sa-SlugCas9タンパク質は、配列番号9によって表されるアミノ酸配列を有する。前記SlugCas9融合タンパク質はシングルガイドRNA(sgRNA)と作用して、遺伝子編集を行う。
一実施形態において、SlugCas9タンパク質は、Staphylococcus lugdunensisに由来し、UniProt受託番号はA0A133QCR3である。
一実施形態において、Sa-SlugCas9タンパク質は、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するSa-SlugCas9タンパク質を含む。
一実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、SaCas9のPIドメインをSlutCas9(Staphylococcus lutrae Cas9)のPIドメインで置換することによって得られる融合タンパク質であるSa-SlutCas9タンパク質を含む。前記Sa-SlutCas9タンパク質は、配列番号10によって表されるアミノ酸配列を有する。前記Sa-SlutCas9融合タンパク質はシングルガイドRNA(sgRNA)と作用して、遺伝子編集を行う。
一実施形態において、SlutCas9タンパク質は、Staphylococcus lutraeに由来し、UniProt受託番号はA0A1W6BMI2である。
一実施形態において、Sa-SlutCas9タンパク質は、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するSa-SlutCas9タンパク質を含む。
一実施形態において、CRISPR/Cas9システムは、SlugCas9にR247A、N415A、T421A、およびR656A突然変異を導入することによって得られるアミノ酸改変タンパク質であるSlugCas9-HFタンパク質を含む。前記SlugCas9-HFはStaphylococcus lugdunensis Cas9-HiFiである。SlugCas9-HFは、シングルガイドRNA(sgRNA)と作用して、遺伝子編集を行う。SlugCas9-HFタンパク質およびsgRNAの複合体は、オフターゲット率が低く且つ特異性が高く、非標的DNA配列に対して低い耐性を示す、すなわち、前記複合体は、非標的DNA配列を本質的に切断することができないか、または切断することができない。
一実施形態において、SlugCas9タンパク質は、Staphylococcus lugdunensisに由来し、UniProt受託番号はA0A133QCR3である。
一実施形態において、SlugCas9-HFタンパク質は、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するSlugCas9-HFタンパク質を含む。
一実施形態において、標的DNA配列を正確に位置決めすることは、sgRNAの5’末端の20bpまたは21bp配列が、該当標的DNA配列と相補的な塩基対形成構造を形成することができることを含む。
一実施形態において、標的DNA配列を正確に位置決めすることは、Cas9タンパク質とsgRNAとの複合体によって、標的DNA配列上のPAM配列を認識することを含む。
一実施形態において、SlugCas9-HFタンパク質とsgRNAとの複合体中のsgRNAの5’末端の20bpまたは21bp配列は、非標的DNA配列と不完全な相補的塩基対合構造を形成することができる。特に、本開示において、不完全な相補的塩基対合構造は、相補的塩基対合構造の一部および非相補的塩基対合構造の一部を含む。好ましい実施形態では、非標的DNA配列とsgRNAとの間に2つ以上の塩基ミスマッチが存在する。
さらに別の実施形態では、SlugCas9-HFタンパク質とsgRNAとの複合体は、非標的DNA配列上のPAM配列を認識することができる。
一実施形態において、PAM配列および標的DNA配列は、それぞれ以下の通りである:
SauriCas9タンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表され、
ShaCas9タンパク質の場合、PAMがNNGRMであり、標的DNA配列が配列番号13によって表され、
SlugCas9タンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表され、
SlutCas9タンパク質の場合、PAMがNNGRであり、標的DNA配列が配列番号14によって表され、
Sa-SauriCas9タンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表され、
Sa-SepCas9タンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表され、
Sa-SeqCas9タンパク質の場合、PAMがNNGRMであり、標的DNA配列が配列番号13によって表され、
Sa-ShaCas9タンパク質の場合、PAMがNNGRMであり、標的DNA配列が配列番号13によって表され、
Sa-SlugCas9タンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表され、
Sa-SlutCas9タンパク質の場合、PAMがNNGRRであり、標的DNA配列が配列番号15によって表され、
SlugCas9-HFタンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表される。
SauriCas9タンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表され、
ShaCas9タンパク質の場合、PAMがNNGRMであり、標的DNA配列が配列番号13によって表され、
SlugCas9タンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表され、
SlutCas9タンパク質の場合、PAMがNNGRであり、標的DNA配列が配列番号14によって表され、
Sa-SauriCas9タンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表され、
Sa-SepCas9タンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表され、
Sa-SeqCas9タンパク質の場合、PAMがNNGRMであり、標的DNA配列が配列番号13によって表され、
Sa-ShaCas9タンパク質の場合、PAMがNNGRMであり、標的DNA配列が配列番号13によって表され、
Sa-SlugCas9タンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表され、
Sa-SlutCas9タンパク質の場合、PAMがNNGRRであり、標的DNA配列が配列番号15によって表され、
SlugCas9-HFタンパク質の場合、PAMがNNGGであり、標的DNA配列が配列番号12によって表される。
配列番号12~15のヌクレオチド配列は以下の通りである:
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG(配列番号12);
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGRM(配列番号13);
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGR(配列番号14);および
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGRR(配列番号15)。
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG(配列番号12);
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGRM(配列番号13);
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGR(配列番号14);および
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGRR(配列番号15)。
当業者は上記の塩基Nが4つの塩基A(アデニン)、T(チミン)、C(シトシン)およびG(グアニン)のいずれか1つを表し、上記の塩基Mが2つの塩基AおよびCのいずれか1つを表し、上記の塩基Rが2つの塩基AおよびGのいずれか1つを表すことを理解することができる。
一実施形態において、前記Cas9タンパク質と前記sgRNAとの前記複合体が前記標的DNA配列を正確に位置決めすことができるが、これは、前記Cas9タンパク質および前記sgRNAとの前記複合体が前記標的DNA配列を認識して結合することができること、または、前記Cas9タンパク質および前記sgRNAとの前記複合体が前記Cas9タンパク質と融合した他のタンパク質または前記sgRNAを特異的に認識するタンパク質を前記標的DNA配列が位置する場所に運ぶことができることを意味する。
一実施形態において、前記Cas9タンパク質と前記sgRNAとの前記複合体、または前記Cas9タンパク質と融合した他のタンパク質、または前記sgRNAを特異的に認識するタンパク質は、標的DNA領域に対して改変および調節を行うことができ、前記改変および調節が、遺伝子転写レベルの調節、DNAメチル化調節、DNAアセチル化改変、ヒストンアセチル化改変、単一塩基編集またはクロマチンイメージング追跡を含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、前記SlugCas9-HFタンパク質と前記sgRNAとの前記複合体は、非標的DNA配列に対して低い耐性を有する。すなわち、前記SlugCas9-HFタンパク質と前記sgRNAとの前記複合体は、非標的DNA配列を認識して結合することが本質的にできないか、またはできない、または前記SlugCas9-HFタンパク質と前記sgRNAとの前記複合体が前記SlugCas9-HFタンパク質と融合した他のタンパク質または前記sgRNAを特異的に認識するタンパク質を非標的DNA配列が位置する場所に運ぶことが本質的にできないか、またはできない。
本開示において、「前記SlugCas9-HFタンパク質と前記sgRNAとの前記複合体は、非標的DNA配列を認識して結合することが本質的にできない」という表現における「本質的に」という語は、前記SlugCas9-HFタンパク質と前記sgRNAとの前記複合体の、非標的DNA配列に対する認識および結合の程度(もしあれば)において、生物学的および/または統計学的有意性がほとんどまたは全くないことを意味する。
さらに別の実施形態では、前記SlugCas9-HFタンパク質と前記sgRNAとの前記複合体、または前記SlugCas9-HFタンパク質と融合した他のタンパク質、または前記sgRNAを特異的に認識する前記タンパク質は、非標的DNA領域に対して改変および調節を行うことが本質的にできないか、またはできない、前記改変および調節が、遺伝子転写レベルの調節、DNAメチル化調節、DNAアセチル化改変、ヒストンアセチル化改変、単一塩基編集またはクロマチンイメージング追跡を含むが、これらに限定されない。
同様に、本開示において、表現「前記SlugCas9-HFタンパク質と前記sgRNAとの前記複合体、または前記SlugCas9-HFタンパク質と融合した他のタンパク質、または前記sgRNAを特異的に認識する前記タンパク質は、非標的DNA領域に対して改変および調節を行うことが本質的にできない」における「本質的に」は、前記SlugCas9-HFタンパク質と前記sgRNAとの前記複合体、または前記SlugCas9-HFタンパク質と融合した前記他のタンパク質、または前記sgRNAを非標的DNA領域に特異的に認識する前記タンパク質の、非標的DNA領域に対しての改変および調節の程度(もしあれば)において、生物学的および/または統計学的有意性がほとんどまたは全くないことを意味する。
一実施形態において、前記一塩基編集は、アデニンのグアニンへの変換、シトシンのチミンへの変換、またはシトシンのウラシルへの変換、または他の塩基間の変換を含むが、これらに限定されない。
本開示のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムは、編集活性が高く且つ特異性が高く、既存のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムと比較して有意な利点を示す。
本開示において、CRISPR/Cas9システムの編集効率およびオフターゲット率は、遺伝子合成、分子クローニング、細胞トランスフェクション、PCR産物ディープシークエンシング、フローサイトメトリー分析技術、バイオインフォマティクス分析などの技術によって検出される。
本開示のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムは、標的部位を含むGFP-レポーター細胞株で検証され、遺伝子編集システムは高い特異性で且つ低いオフターゲット率で標的遺伝子を編集できることが分かった。
従って、第二の態様において、本開示は、Cas9タンパク質とsgRNAとの複合体を用いて標的DNA配列を認識し、位置決めすることによって標的DNA配列を編集する、本開示の第一の態様の遺伝子編集を行うためのCRISPR/Cas9遺伝子編集システムを用いた細胞における遺伝子編集方法であって、
前記方法が、
(1)Cas9遺伝子配列を合成し、それをpAAV2_ITRなどの発現ベクターにクローニングして、前記Cas9遺伝子配列でクローニングされた発現ベクター(例えば、pAAV2_Cas9_ITR)を得る工程であって、
前記Cas9遺伝子配列が、
(a)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、
(b)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、または
(c)ヒト化Cas9遺伝子配列、例えば、配列番号23~32および配列番号112のいずれか1つによって表されるヌクレオチド配列を有するものである工程と;
(2)前記sgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNA、すなわち、オリゴフォワード鎖配列(オリゴ-F)およびオリゴリバース鎖配列(オリゴ-R)を合成し、前記オリゴフォワード鎖配列および前記オリゴリバース鎖配列をアニーリングして、アニーリング産物が、前記Cas9遺伝子配列でクローニングされた発現ベクターの消化部位(例えば、プラスミドpAAV2_Cas9_U6_BsaIのBsaI消化部位)とライゲーションして、前記Cas9タンパク質および前記sgRNAを発現させるpAAV2_Cas9_hU6-sgRNAなどの発現ベクターを得る工程であって、
前記sgRNAが、
配列番号11で表されるヌクレオチド配列、または配列番号11で表されるヌクレオチド配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列、または例えば、配列番号11で表されるヌクレオチド配列に基づく、例えば、リン酸化、短縮、延長、硫化、メチル化、またはヒドロキシル化を含む改変を有するものである、工程と;
(3)前記標的部位を編集するための標的部位を含む細胞に前記Cas9タンパク質および前記sgRNAを発現する発現ベクターを送達する工程とを含む、遺伝子編集方法を提供する。
前記方法が、
(1)Cas9遺伝子配列を合成し、それをpAAV2_ITRなどの発現ベクターにクローニングして、前記Cas9遺伝子配列でクローニングされた発現ベクター(例えば、pAAV2_Cas9_ITR)を得る工程であって、
前記Cas9遺伝子配列が、
(a)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、
(b)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、または
(c)ヒト化Cas9遺伝子配列、例えば、配列番号23~32および配列番号112のいずれか1つによって表されるヌクレオチド配列を有するものである工程と;
(2)前記sgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNA、すなわち、オリゴフォワード鎖配列(オリゴ-F)およびオリゴリバース鎖配列(オリゴ-R)を合成し、前記オリゴフォワード鎖配列および前記オリゴリバース鎖配列をアニーリングして、アニーリング産物が、前記Cas9遺伝子配列でクローニングされた発現ベクターの消化部位(例えば、プラスミドpAAV2_Cas9_U6_BsaIのBsaI消化部位)とライゲーションして、前記Cas9タンパク質および前記sgRNAを発現させるpAAV2_Cas9_hU6-sgRNAなどの発現ベクターを得る工程であって、
前記sgRNAが、
配列番号11で表されるヌクレオチド配列、または配列番号11で表されるヌクレオチド配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列、または例えば、配列番号11で表されるヌクレオチド配列に基づく、例えば、リン酸化、短縮、延長、硫化、メチル化、またはヒドロキシル化を含む改変を有するものである、工程と;
(3)前記標的部位を編集するための標的部位を含む細胞に前記Cas9タンパク質および前記sgRNAを発現する発現ベクターを送達する工程とを含む、遺伝子編集方法を提供する。
配列番号23~32および配列番号112は以下の通りである。
配列番号23 ヒト化SauriCas9遺伝子配列:
ATGCAGGAGAACCAGCAGAAGCAGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGAATCACCAGCGTCGGCTACGGACTGATCGATAGCAAGACAAGAGAAGTGATCGACGCCGGCGTTAGACTCTTTCCAGAAGCTGATAGCGAGAACAACTCCAACCGCAGAAGCAAGCGGGGCGCCAGACGGTTAAAACGGAGAAGAATCCACCGGCTGAACCGGGTCAAAGACCTGCTCGCTGATTACCAGATGATCGATCTTAACAATGTTCCTAAGAGCACCGACCCCTACACCATCAGAGTGAAGGGCCTCCGGGAGCCTCTGACAAAAGAAGAATTCGCCATCGCCCTCCTGCATATCGCTAAGAGAAGAGGCCTGCACAACATCAGTGTGTCCATGGGCGACGAAGAGCAGGACAATGAACTGAGCACCAAGCAGCAGCTGCAAAAGAATGCCCAGCAACTGCAGGACAAGTATGTGTGCGAACTGCAGTTAGAACGGCTGACCAACATCAACAAGGTCAGAGGCGAGAAGAACAGATTTAAGACAGAGGACTTTGTGAAAGAAGTGAAACAGCTGTGCGAAACCCAGAGACAGTACCACAACATCGACGACCAATTCATCCAGCAGTACATCGACCTGGTGTCTACAAGACGGGAGTACTTCGAGGGCCCCGGCAACGGCTCTCCATACGGCTGGGACGGCGACCTGCTGAAGTGGTACGAGAAGCTGATGGGCAGATGCACCTATTTCCCCGAAGAACTGAGGTCCGTGAAGTACGCCTACAGCGCCGACCTCTTCAACGCCCTGAACGACCTGAACAACCTCGTTGTGACCAGGGATGACAATCCAAAGCTTGAGTACTACGAGAAGTACCACATTATTGAGAACGTGTTCAAGCAAAAGAAGAATCCCACACTCAAACAAATCGCCAAAGAGATCGGCGTGCAAGATTACGACATCCGGGGCTATAGAATCACAAAGAGCGGCAAACCTCAGTTCACCTCTTTTAAGCTGTATCACGACCTGAAGAACATCTTCGAGCAGGCCAAATACCTGGAAGATGTGGAAATGCTGGACGAGATCGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGGATGAGATTAGCATCAAGAAAGCCCTGGACCAGCTGCCCGAACTGCTGACAGAGAGCGAGAAATCTCAGATCGCACAGCTCACCGGCTATACAGGCACCCACAGACTGAGCCTGAAGTGCATCCACATTGTGATCGACGAGCTGTGGGAGAGCCCCGAGAACCAGATGGAAATCTTTACCAGACTGAATCTGAAACCTAAGAAGGTGGAAATGAGCGAGATCGACAGCATACCCACCACCCTGGTCGACGAGTTCATCCTCTCACCTGTGGTGAAGCGGGCCTTCATCCAGAGCATCAAGGTAATCAACGCAGTGATCAATCGGTTCGGCCTGCCAGAGGACATCATCATCGAGCTGGCCAGAGAAAAGAATAGCAAGGATCGGAGAAAGTTCATTAACAAGCTGCAGAAACAAAATGAGGCCACAAGAAAGAAAATCGAACAGCTGCTGGCCAAGTACGGCAACACCAATGCCAAGTACATGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAGGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAGGCTATTCCTCTGGAAGACCTGCTGAGCAACCCGACACACTACGAAGTTGACCACATTATCCCCAGATCTGTGAGCTTTGACAACAGCCTGAACAACAAAGTGCTGGTGAAACAAAGCGAAAACAGCAAGAAGGGCAATCGCACCCCTTACCAGTACCTGAGCAGCAACGAGTCTAAGATTAGCTACAACCAGTTTAAGCAGCACATCCTGAACCTGAGCAAGGCCAAGGACAGAATCAGCAAGAAAAAAAGAGATATGCTGCTGGAAGAGAGAGATATCAACAAGTTCGAAGTGCAGAAGGAATTCATTAACCGGAACCTGGTGGATACACGGTACGCCACCAGAGAACTGTCTAACCTGCTGAAGACCTACTTCAGCACCCATGACTACGCCGTGAAGGTGAAGACCATCAACGGCGGCTTCACTAACCACCTGAGGAAGGTGTGGGATTTCAAGAAGCACAGAAACCACGGCTACAAGCACCACGCCGAAGATGCCCTGGTGATCGCCAACGCCGACTTCCTGTTTAAGACACATAAGGCCCTGCGGAGAACCGATAAGATCCTGGAACAACCTGGCCTGGAAGTGAATGATACAACCGTGAAAGTGGACACCGAGGAAAAATACCAGGAGCTGTTCGAGACACCTAAGCAAGTGAAGAACATCAAGCAGTTCCGGGACTTCAAGTACAGCCACCGAGTGGACAAGAAGCCTAACCGGCAGCTTATCAACGACACACTGTACTCCACCAGAGAGATTGATGGCGAAACCTACGTGGTGCAGACCCTTAAGGATCTGTACGCCAAGGACAACGAGAAAGTGAAGAAGCTGTTCACCGAAAGACCTCAGAAGATCCTGATGTACCAGCACGACCCTAAGACCTTCGAGAAACTGATGACAATCCTGAACCAGTACGCTGAGGCCAAGAACCCTCTGGCTGCTTATTACGAGGACAAAGGCGAGTACGTGACCAAGTACGCCAAGAAAGGCAATGGACCTGCCATCCACAAGATCAAGTATATCGATAAGAAGCTTGGATCTTACCTGGATGTTAGCAACAAGTATCCTGAGACACAGAACAAGCTTGTGAAGCTGTCCCTGAAGAGCTTTAGATTCGACATCTACAAGTGTGAACAGGGCTACAAGATGGTGTCCATCGGATACCTGGACGTGCTGAAGAAAGATAACTACTACTACATCCCTAAGGACAAGTACGAGGCCGAGAAGCAGAAAAAGAAGATCAAGGAATCTGATCTTTTTGTGGGCAGCTTCTACTACAACGACCTCATCATGTACGAGGATGAACTGTTCAGAGTGATAGGAGTGAACAGCGACATCAACAATCTGGTTGAGCTAAACATGGTCGACATTACCTACAAGGACTTCTGCGAGGTGAACAACGTGACAGGCGAGAAAAGAATCAAAAAGACTATCGGCAAGCGCGTGGTCCTGATCGAGAAGTACACCACAGATATTCTAGGCAACCTGTACAAGACTCCCCTGCCTAAGAAGCCCCAGCTTATCTTCAAGCGGGGAGAACTG;
配列番号24 ヒト化ShaCas9遺伝子配列:
ATGAAGACAGATTACATCCTGGGCCTGGATATCGGCATCACCAGCGTGGGCTATGGCATCATCAACTACAATGACAAGAGCATCATCGACGCCGGAGTGCGGCTGTTCCCCGAGGCCAATGTTGAAAACAACGAGGGCAGAAGAAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGAGACGGCGGATTCACCGGCTGGAAAGAGTGAAGCAGCTTCTGCTGGACTACAAGCTGCTGGACAGCATCGACGTGATCCCTCAGTCTACCAACCCCTACGAGATCCGGGTGCGGGGCCTGAGAGAGAAGCTGACCAAAGACGAGCTGGTGATCGCGCTGCTCCATTTGGCTAAGCGCCGTGGAATTCACAACATCGACGTGATCGACCAGGAGGAGGATGCCAGCAACGAGCTGAGTACAAAGGAGCAGCTGAGCAAGAACAATCTGCTGCTGAGAGATAAGAGCATCTGTGAAGTCCTGCTGGAACGGTACAACGAGGGCAAGGTGCGCGGAGAGAAAAACAGATTCAAAACATCTGATATCGTGAACGAGATCAGACAGATTCTGGAGACACAGAAGGAAGTGCACCACCTGGACGATAGCTTCATCGACAAGTACATCGAACTGGTGGAAACCCGAAGAGAATATTACGAGGGCCCTGGCGAAGGAAGTCCTTACGGCTGGGGAGCCGATCTGAAGAAGTGGTACGAGCACCTGATGGGCCGGTGCACCTACTTCCCTGAGGAACTGAGATCCGTGAAGTACGCCTACTCAGCCGACCTGTTCAATGCCCTGAACGACCTGAACAACCTGGTTATCCAGAGAGACGGCCTGAACAAGCTGGAATATCACGAGAAGTACCACATCATTGAAAACGTGTTCAAGCAGAAAAAGAAACCTACACTGAAGCAGATCAGCAACGAGATCGGCGTGAACCCTGAAGACATCAAGGGCTACCGGATCACCAAATCTGGCAAGGAGAATTTCACCGAGTTCAAGTTGTACCACGATCTCAAGAAGATCCTGAAAGACCAGAGCATCCTAGAAAATATCCAGCTGCTGGACCAGATCGCCGAGATCATCACAATCTACCAGGACAAGGAGAGCATTAAAAAAGAACTGGAACAGCTCACCGAGCCTATAAATGAAATCGACAAGGAATCTATTTCTGACCTGGCTGGATACAACGGCACCCACAGACTTTCTCTGAAGTGCATCAACCTGGTGCTGGAAGAACTGTGGCACACCAGCAGAAATCAAATGGAAATCTTCGCCTACCTGAACATCAAACCCAGAAAGATCGACCTGCAGAAAGCTAATAAAATCCCCAAGGACATGATCGACGAATTCATCCTGAGCCCTGTGGTGAAGCGAACATTCGGCCAGGCCATCAACGTGATTAACAAGGTGATTGAGAAGTACGGCGTTCCTAAGGACATCATCATCGAGCTCGCCAGAGAGAACAACACCAAGGACAAGCAGAAATTCATTAACGAACTCCAGAAGAAAAACGAGAAAACCAGACAGCGGATCAATGAGATCATCGGAAAGACCGGCAACCAGAACGCCAAGAGACTGGTGGAAAAGATCAGACTGCACGACGAGCAGGAGGGAAAATGCCTGTACAGCCTGGAGAGCATCCCACTGGAGGACCTCCTCAACAACCCCAACCACTACGAGGTGGACCACATCATACCTAGAAGCGTGTCTTTTGATAACAGTTATCAAAACAAGGTGCTCGTCAAGCAAACAGAAAACAGCAAGAAGGGGAATAGAACACCTTACCAGTACCTGAACAGCGGCGAGGCTAAGCTGAGCTACAACCAGTTCAAGCAACACGTGCTGAACCTGAGCAAGAGCAAGGATAGAATTTCCAAGAAGAAGAAAGAGTACCTCCTGGAGGAACGGGACATTAACAAGTTCGAGGTGCAGAAGGAATTCATCAACAGAAACCTGGTCGACACCCGATATGCCACCCGCGAGCTGACCAATTACCTGAAGGCCTATTTCAGCGCTAACGATATGGACGTGAAGGTCAAGACCATCAATGGAAGCTTTACCAACCACCTGCGGAAGGTTTGGGACTTCAACAAGGAAAGAAACCACGGCTACAAACACCACGCCGAGGATGCCCTGATCATCGCCAATGCCGACTTCCTGTTTAAGGAGAACAAGAAGCTGAAGGCCGCCAACAAAGTGCTGGAACAGCCTGAGAGAAAGGAAATTGAAACGAAGATCGAGGTGAATTCCGATGAGAATTACCAAGATCTCTTTGTGATCCCCCAGCAGGTGAAAGAAATCAAGGAGTTTAGAGATTTTAAGTACAGCCACAGAGTGGACAAAAAACCTAATAGACAGCTGATCAACGATACACTGTACTCCACAAGAGTGAAGGACGACGACCTGTACATCATATCTCCTATCAAGAACATCTACAGCAAAGACAACACAGATCTGAAGAAGCACTTCAACAAAAACCCAGAGAAGTTCCTGATGTACCAGAAAGACCCCAAGACCTTCGAGAAACTGGAAGTTATTATGAAGCAGTACGCCAACGAGAAGAATCCTCTGGCCAAATACCACGAGGAAACAGGCGAGTACCTGACGAAGTACAGCAAGACCAACAACGGGCCAATCGTGAAAAGCATTAAGATGTTCGGCAAGAAAGTGGGCAATCACCTGGATGTGACCAACCAGTACAACAATAGCCGGAACAAGCTGGTGAAGCTGAGCTTCAAAAGCTACAGATTCGACGTGTACCTGACAGACAAGGGCTACAAGTTCGTGTCCATCACCTACCTGGACGTGCTGAAGAAAGAGAATTACTACTACATCAGCGAGGCCAAGTACGACAAACTGAAACTAAACAAGGGCATCGATGACAAGGCCAAGTTCATCGGCAGCTTCTACTACAACGACCTGATCGAGCTGGACGGCGAGGTGTACACCGTGATCGGCGTGAATAATGACAAGAACAACGTCATCGAGCTCAATCTCCCCGAAATTAGATACAAGGAATACTGCGAGATTAACAACATCAAGGGCTCCGGCAGACTCCGGATCACCATCGGCAAGAAGGTGAACTCCATTCGGAAGCTGTCCACCGACGTGCTCGGCAACCGGTACTACCAGTCTTTCGCCAAAAAGCCTCAGCTCGTGTTCAAGAAGGGAATA;
配列番号25 ヒト化SlugCas9遺伝子配列:
ATGAACCAAAAATTCATACTGGGACTGGACATCGGAATCACCAGCGTGGGCTACGGCCTGATCGACTACGAGACAAAGAATATCATCGATGCCGGCGTTAGACTGTTCCCCGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGAAGAAGGTCCAAACGTGGAAGCAGAAGACTGAAGCGACGCCGCATTCACAGACTTGAACGGGTGAAGAAGCTGCTCGAGGATTATAATCTGCTGGATCAGTCCCAGATTCCTCAGTCTACAAACCCCTACGCCATCCGCGTGAAGGGCCTGTCTGAAGCCCTGAGCAAGGACGAACTCGTGATTGCCCTGCTCCATATCGCCAAGAGAAGAGGCATCCACAAGATCGACGTGATCGACAGCAACGACGACGTGGGGAACGAGCTCAGCACCAAGGAACAGCTGAATAAGAACAGCAAGCTGCTGAAAGACAAATTTGTGTGCCAGATCCAGCTGGAAAGAATGAATGAGGGCCAGGTGCGGGGAGAGAAAAACCGGTTCAAGACCGCTGATATCATCAAGGAAATCATCCAGCTGCTGAATGTGCAGAAGAACTTCCACCAGCTGGACGAGAACTTCATCAACAAGTACATCGAACTGGTTGAGATGAGACGGGAATACTTCGAGGGCCCCGGCAAGGGCAGTCCATATGGCTGGGAAGGCGACCCTAAGGCTTGGTACGAGACACTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCAGATGAGCTGAGAAGCGTGAAATACGCCTACAGTGCCGACCTGTTCAACGCTCTGAACGACCTGAACAACCTGGTCATCCAAAGAGATGGACTGTCTAAGCTCGAGTATCATGAGAAGTATCACATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAACCTACACTGAAGCAGATCGCCAATGAGATCAATGTCAACCCTGAAGATATCAAGGGCTACAGAATCACAAAGTCTGGCAAGCCCCAGTTTACCGAGTTTAAGCTCTACCACGACCTGAAAAGCGTGCTGTTTGACCAGAGCATCCTGGAGAACGAAGACGTGCTGGACCAGATCGCTGAGATCCTGACCATCTACCAGGACAAGGATAGCATCAAATCTAAGCTGACGGAACTGGACATCCTGCTGAACGAGGAAGATAAGGAAAACATCGCCCAGCTGACTGGCTACACCGGGACCCACCGGCTCAGCCTGAAATGCATCCGGCTGGTCCTGGAAGAGCAGTGGTATTCTAGCCGGAATCAGATGGAAATCTTCACACACCTGAACATTAAGCCTAAGAAGATCAACCTGACAGCCGCCAACAAGATCCCGAAGGCTATGATCGACGAGTTCATCCTGAGCCCTGTGGTGAAGAGGACCTTCGGCCAGGCCATTAACCTTATTAACAAGATCATAGAAAAGTACGGCGTGCCTGAAGATATCATCATCGAGCTGGCCAGAGAAAATAATAGCAAGGACAAGCAGAAGTTCATCAATGAGATGCAGAAAAAGAACGAGAACACCAGAAAGAGAATTAACGAAATCATCGGCAAGTATGGCAACCAGAACGCCAAGAGACTGGTCGAGAAGATTAGACTGCACGACGAGCAGGAGGGCAAGTGCCTGTACTCACTGGAAAGCATCCCTCTGGAGGACCTGCTGAACAACCCCAACCACTACGAGGTGGACCACATCATTCCAAGATCTGTGTCCTTCGACAACTCTTACCACAACAAAGTGCTCGTGAAGCAGAGCGAGAACTCCAAAAAATCCAACCTGACCCCTTACCAGTACTTTAACAGCGGCAAGTCCAAGCTCTCTTACAACCAGTTTAAACAACACATCCTGAACCTGAGCAAGTCCCAGGATAGAATCAGCAAAAAAAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAAGTTCGAGGTGCAAAAAGAGTTCATCAATAGAAACCTGGTGGATACCCGGTACGCCACAAGAGAGCTGACAAACTACCTGAAGGCCTACTTCAGCGCCAACAATATGAACGTGAAGGTGAAAACGATCAACGGCAGCTTCACCGATTACCTGCGGAAAGTGTGGAAGTTTAAGAAGGAACGGAACCACGGCTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATTATCGCTAATGCCGATTTCCTGTTCAAAGAGAACAAGAAGCTGAAAGCCGTGAACTCTGTGCTGGAAAAACCTGAGATCGAGAGCAAGCAGCTGGATATCCAGGTGGATAGCGAGGATAACTACAGCGAAATGTTCATCATCCCTAAGCAGGTCCAGGACATCAAGGACTTCAGAAACTTCAAGTACAGCCACAGAGTGGACAAGAAGCCTAACAGACAGCTGATCAACGATACACTGTACAGCACCCGGAAGAAGGACAACTCCACCTACATCGTGCAGACCATCAAAGATATCTATGCCAAAGATAATACCACCCTGAAGAAGCAGTTTGACAAGTCACCCGAGAAGTTCCTCATGTACCAACACGATCCGCGGACCTTCGAGAAGTTGGAAGTGATCATGAAGCAGTACGCTAATGAGAAGAATCCTCTGGCCAAGTACCACGAGGAAACAGGCGAGTACCTGACCAAATACAGCAAAAAAAACAACGGCCCTATCGTGAAAAGCCTGAAGTACATTGGAAACAAGCTGGGCAGCCACCTAGATGTGACCCACCAGTTCAAGAGCAGCACCAAGAAGTTGGTGAAGCTGAGCATCAAGCCTTATAGATTCGACGTCTACCTGACCGACAAGGGATATAAGTTCATCACCATCAGCTACCTGGACGTGCTGAAGAAAGACAATTACTACTACATACCCGAACAGAAGTACGACAAGCTCAAACTGGGCAAGGCCATCGACAAAAACGCCAAGTTTATCGCTAGCTTCTACAAGAATGATCTGATCAAGCTGGACGGCGAGATCTACAAGATCATCGGCGTGAATAGCGACACCAGAAACATGATCGAACTGGATCTGCCTGACATCAGATACAAAGAATACTGCGAGCTGAACAATATCAAGGGCGAACCTAGAATCAAAAAGACCATCGGCAAAAAGGTGAATAGCATCGAAAAACTGACAACCGACGTGCTGGGCAACGTGTTCACCAACACCCAGTACACAAAACCTCAGCTGCTGTTCAAGCGAGGAAAT;
配列番号26 ヒト化SlutCas9遺伝子配列:
ATGAGAAACAGCTACATCCTGGGCCTGGACATCGGAATCACCAGCGTGGGATATGGCATCATCGACAGAGTCACCAGAGAGGTGATCGACGCCGGCGTGCGGCTTTTCCCCGAGGCCAACGTGGAGAACAACGAGGGCAGACGGAGCAAGAGAGGAGCCCGGCGGCTGAAAAGAAGGCGGATCCACCGGCTGAATAGAATCAAGCAGCTGCTGAAAAACGCCGGCCTGCTGGAGGGAGATGTGCTGCCTAAGTCTACCAACCCCTATGAGATCAGAGTGCGGGGCCTCCGAAGCCCTCTGACCAAAGATGAACTGGTGATCGCCCTGCTCCACATCGCCAAAAGAAGAGGCATCCACAACATCAACATCGTGGGAGATGACGAAGAAACGGACAGCACACTGAGTACCACAGCCCAGCTGAAGAAGAACGAGAAGGCTCTCAAGGGACAGTTTGTTTGTGAACTGCAACTGGACAGACTGGCTAATGCCCACCAAGTGCGGGGCGAGAAAAATCGATTTAAGACAGAGGACATTGTGAAGGAAGTCAGAGCCCTGCTTCAGCAACAGCAGAACTTCCACAACATCGATAATTCTTTCGTGGAACAGTACATTGCCCTGCTGGAGAGCCGGAGGACCTACTACGAGGGCCCTGGCGAAGGCTCTCCTTACGGCTGGGACGGCGACATTAAGAAGTGGTACGAGATGCTGATGGGCTATTGCACCTACTTCCCTGAAGAGCTGAGAAGCGTGAAGTACGCCTACACCGCCGATCTGTTCAACGCCCTGAATGACCTGAACAACCTGGTGATCACCCGGGACGACAACAGCAAATTGACATACGCCGAGAAGTACCATATCATCGAGAACGTGTTCAAACAGAAGAAAGTACCTACACTGAAGCAGATCGCCAAGGAAATCGGAGTGAACGAGAGCGATATTAAGGGCTACAGAATCAACAAATCTGAGAAACCTCTGTTCACCAGCTTCAAACTGTACCACGATCTGAAGAGCGTGTTCAGCGACCCTACAAAACTGGAAGATATCGACTTGCTGGACCGAATCGCCGTGGTGCTGACCATGTACCAAGATGCCGAATCCATGAAAGCCGCCCTGAACACCTTCCCTGAAGTGTTCAGCGAAGCAGAGAAAGAGAAGCTGAGCGCCCTCACAGGCTACGCTGGCACCCATAGACTGTCTCTGAAGTGCATGAACCTGCTGATCCCTGATCTGTGGCAGACAAGCCTGAACCAGATGGAACTGTTCGTGAAGCTGAATCTGAAACCACAGAAGCTGGACCTGAGCCAGTGCCACCAGATTCCTACCCAGCTGGTGGACGAGTTCATCCTGTCTCCTGTGGTGAAAAGAGCCTTCACCCAAAGCATCAAGGTGATCAACGCCATCATCCAGAAATACGGCCTGCCCGACGACATCATAATCGAGCTGGCCAGGGAAAAAAACAGCGCCGATAAGCGGAAGTTCCTGAATCAGCTGCAGAAGAAGAACGAGAAGGCCCGGCACGAGATCAATACCCTGGTGGCCCAGTACGGCCAGCCAAATGCTAAGCGGCTGGTGGAAAAGATCACACTGCACCAGCAGCAGGAGGGCAAGTGTCTGTACTCCCTGAAGGATATCCCCCTGGAGCAGCTGCTGAAGCAGCCCTACCTGTACGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTTTCTTTCGACAACAGCATGCAGAACAAGGTGCTGGTCCTGGCCGAAGAAAACGCCAAAAAGGGCAACCAGACCCCTTACCAGTACCTGAATAGCAGAGAGGCCAGCATGACCTACCCCGAATTCAAACAGCACATCCTGAATCTGAGCAAGGCCAAGGACCGGATCAGCAAGAAGAAGCGGAACTACCTGCTCGAGGAAAGAGATATCAACAAGTTCGACGTGCAAAAGGACTTCATCAACAGAAACCTGGTTGACACCAGATACGCCACCAGAGAGCTCGCCTCTCTGCTGAAGGCTTATTTCAAGACACATGAGCTCCCTGTGAAAGTGAAGACCATCAACGGCGGATTTACCCACTACCTGAGAAAGGTGTGGAAGTTTGACAAAGATAGAAACAAGGGCTACAAGCACCACGCCGAGGATGCACTGATCATCGCCAACGCCGACTTTCTGTTTAAGAACCAGACTCTGAACAAAATCGAGGCTATCCTGAACGAGCCCGGCAGAGAGGTGGAATCTGACACAGTGAAGGTGCAGAGCGAGGACAATTACCAGGACCTGTTTGAGAACACCAAGAAGGCTTTCGCCATCAAGAATTTCAAGGATTTCAAGTTTAGCCACAGAGTGGACCAGAAGCCTAACCGGCAGCTCGTGAACGACACCCTGTACAGCACCAGAGAGGTGAACGAAGATCTGTACGTGGTGCAGACCCTGAAGGACATCTACAGCAAGGACAACAAAGACGTGAAGCGGCTCTTCGACAAGCAACCCGAGAAGTTCCTGATGTTCCAGCACGACCCCGAGACATTCAAGAAATTCGAGCTGGCTATGAAGCAATATGCCGAAGAGAAGAACCCTCTGGCTAGATACTACGAGGAACAGGGCTACATCACCAAGTACGCCAAGAAAGGAGACGGCCCACCTGTGAAAAGCCTCAAATACATCGGCAAGAAGGTGGGAAAACACCTGGATGTGACCGGCGACTACGAGGATAGCAACCGGAAGCTGGTGAAGCTGAGCCTGAAGTCCTTTAGATTCGATATCTACCACACAGACAAGGGCTACAAGATGGTTCCAATCACTTACCTGGATGTGCAGAAAAAAGAGAAGTACTACTACATCCCCACCGAGAAATACGAAGCCCTGAAGCAGGAGAAGGGCATCAACCAGAATGCTCAGTTCATTGGCAGCTTCTACTACAACGACCTGATCGAGTTCGATGGCGAGCTGTATAGAGTGATCGGCATCAACAACGGCGACAAGAATCTCGTTGAACTCGACATGGTGGACATTAGATATAAGGAATACTGCGAGCTGAACTCCATCACCACCACACCTAGAATCGTTAAGACCATCAGCCCCAAGACCCAGAGCATCGAGAAGTACACAACAGATATCCTGGGCAACCTGTACAAAGCCCAGCCTGGCAAGAAGCCTCAGTTCATCTTCAACAAAGACGAGGAT;
配列番号27 ヒト化Sa-SauriCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGAGCTTCCGCTTCGACATCTACAAGTGCGAGCAGGGCTACAAGATGGTGAGCATCGGCTACCTGGACGTGCTGAAGAAGGACAACTACTACTACATCCCCAAGGACAAGTACGAGGCCGAGAAGCAGAAGAAGAAGATAAAGGAGAGCGACCTGTTCGTGGGCAGCTTCTACTACAACGACCTGATAATGTACGAGGACGAGCTGTTCCGCGTGATAGGCGTGAACAGCGACATCAACAACCTGGTGGAGCTGAACATGGTGGACATCACCTACAAGGACTTCTGCGAGGTGAACAACGTGACCGGCGAGAAGCGCATCAAGAAGACCATCGGCAAGCGCGTGGTGCTGATAGAGAAGTACACCACCGACATCCTGGGCAACCTGTACAAGACCCCCCTGCCCAAGAAGCCCCAGCTGATATTCAAGCGCGGCGAGCTG;
配列番号28 ヒト化Sa-SepCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGAACTACCGCTTCGACGTGTACCTGACCGAGAAGGGCTACAAGTTCGTGACCATCGCCTACCTGAACGTGTTCAAGAAGGACAACTACTACTACATCCCCAAGGACATGTACCAGGAGCTGAAGGCCAAGAAGAAGATAAAGGACACCGACCAGTTCATCGCCAGCTTCTACAAGAACGACCTGATAAAGCTGAACGGCGACCTGTACAAGATAATCGGCGTGAACAGCGACGACCGCAACATCATCGAGCTGGACTACTACGACATCAAGTACAAGGACTACTGCGAGATAAACAACATCAAGGGCGAGCCCCGCATCAAGAAGACCATCGGCAAGAAGACCGAGAGCATCGAGAAGCTGACCACCGACGTGCTGGGCAACCTGTACCTGCACAGCACCGAGAAGGCCCCCCAGCTGATATTCAAGCGCGGCCTG;
配列番号29 ヒト化Sa-SeqCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACCGCTTCGACGTGTACCTGGACAACGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAACCTGAACGTGATAAAGAAGGAGAACTACTACGAGGTGAACAGCAAGTGCTACGAGAAGGCCAAGAAGCTGAAGAAGATAAGCGACCAGGCCGAGTTCATCGCCAGCTTCTACAACAACGACCTGATAAAGATAGACGGCGAGCTGTACCGCGTGATAGGCGTGAACACCGACCTGATAAACCGCATCGAGGTGAACATGGTGGACATCACCTACCGCGAGTACCTGGAGAACATGAACGACAAGCGCAGCCCCCGCATCTTCAAGACCATCGCCAGCAAGACCCAGAGCATCAAGAAGTACAGCACCGACATCCTGGGCACCCTGTACGAGGTGAACAGCAAGAAGCACCCCCAGATGATAATGAAGGGC;
配列番号30 ヒト化Sa-ShaCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGAGCTACCGCTTCGACGTGTACCTGACCGACAAGGGCTACAAGTTCGTGAGCATCACCTACCTGGACGTGCTGAAGAAGGAGAACTACTACTACATCAGCGAGGCCAAGTACGACAAGCTGAAGCTGAACAAGGGCATCGACGACAAGGCCAAGTTCATCGGCAGCTTCTACTACAACGACCTGATAGAGCTGGACGGCGAGGTGTACACCGTGATAGGCGTGAACAACGACAAGAACAACGTGATAGAGCTGAACCTGCCCGAGATACGCTACAAGGAGTACTGCGAGATAAACAACATCAAGGGCAGCGGCAGGCTGCGCATCACCATCGGCAAGAAGGTGAACAGCATCCGCAAGCTGAGCACCGACGTGCTGGGCAACCGCTACTACCAGAGCTTCGCCAAGAAGCCCCAGCTGGTGTTCAAGAAGGGCATC;
配列番号31 ヒト化Sa-SlugCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACCGCTTCGACGTGTACCTGACCGACAAGGGCTACAAGTTCATCACCATCAGCTACCTGGACGTGCTGAAGAAGGACAACTACTACTACATCCCCGAGCAGAAGTACGACAAGCTGAAGCTGGGCAAGGCCATCGACAAGAACGCCAAGTTCATCGCCAGCTTCTACAAGAACGACCTGATAAAGCTGGACGGCGAGATATACAAGATAATCGGCGTGAACAGCGACACCCGCAACATGATAGAGCTGGACCTGCCCGACATCCGCTACAAGGAGTACTGCGAGCTGAACAACATCAAGGGCGAGCCCCGCATCAAGAAGACCATCGGCAAGAAGGTGAACAGCATCGAGAAGCTGACCACCGACGTGCTGGGCAACGTGTTCACCAACACCCAGTACACCAAGCCCCAGCTGCTGTTCAAGCGCGGCAAC;
配列番号32 ヒト化Sa-SlutCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGAGCTTCCGCTTCGACATCTACCACACCGACAAGGGCTACAAGATGGTGCCCATCACCTACCTGGACGTGCAGAAGAAGGAGAAGTACTACTACATCCCCACCGAGAAGTACGAGGCCCTGAAGCAGGAGAAGGGCATCAACCAGAACGCCCAGTTCATCGGCAGCTTCTACTACAACGACCTGATAGAGTTCGACGGCGAGCTGTACCGCGTGATAGGCATCAACAACGGCGACAAGAACCTGGTGGAGCTGGACATGGTGGACATCCGCTACAAGGAGTACTGCGAGCTGAACAGCATCACCACCACCCCCCGCATCGTGAAGACCATCAGCCCCAAGACCCAGAGCATCGAGAAGTACACCACCGACATCCTGGGCAACCTGTACAAGGCCCAGCCCGGCAAGAAGCCCCAGTTCATCTTCAACAAGGACGAGGAC;
配列番号112 ヒト化SlugCas9-HF遺伝子配列:
ATGAACCAAAAATTCATACTGGGACTGGACATCGGAATCACCAGCGTGGGCTACGGCCTGATCGACTACGAGACAAAGAATATCATCGATGCCGGCGTTAGACTGTTCCCCGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGAAGAAGGTCCAAACGTGGAAGCAGAAGACTGAAGCGACGCCGCATTCACAGACTTGAACGGGTGAAGAAGCTGCTCGAGGATTATAATCTGCTGGATCAGTCCCAGATTCCTCAGTCTACAAACCCCTACGCCATCCGCGTGAAGGGCCTGTCTGAAGCCCTGAGCAAGGACGAACTCGTGATTGCCCTGCTCCATATCGCCAAGAGAAGAGGCATCCACAAGATCGACGTGATCGACAGCAACGACGACGTGGGGAACGAGCTCAGCACCAAGGAACAGCTGAATAAGAACAGCAAGCTGCTGAAAGACAAATTTGTGTGCCAGATCCAGCTGGAAAGAATGAATGAGGGCCAGGTGCGGGGAGAGAAAAACCGGTTCAAGACCGCTGATATCATCAAGGAAATCATCCAGCTGCTGAATGTGCAGAAGAACTTCCACCAGCTGGACGAGAACTTCATCAACAAGTACATCGAACTGGTTGAGATGAGACGGGAATACTTCGAGGGCCCCGGCAAGGGCAGTCCATATGGCTGGGAAGGCGACCCTAAGGCTTGGTACGAGACACTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCAGATGAGCTGgctAGCGTGAAATACGCCTACAGTGCCGACCTGTTCAACGCTCTGAACGACCTGAACAACCTGGTCATCCAAAGAGATGGACTGTCTAAGCTCGAGTATCATGAGAAGTATCACATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAACCTACACTGAAGCAGATCGCCAATGAGATCAATGTCAACCCTGAAGATATCAAGGGCTACAGAATCACAAAGTCTGGCAAGCCCCAGTTTACCGAGTTTAAGCTCTACCACGACCTGAAAAGCGTGCTGTTTGACCAGAGCATCCTGGAGAACGAAGACGTGCTGGACCAGATCGCTGAGATCCTGACCATCTACCAGGACAAGGATAGCATCAAATCTAAGCTGACGGAACTGGACATCCTGCTGAACGAGGAAGATAAGGAAAACATCGCCCAGCTGACTGGCTACACCGGGACCCACCGGCTCAGCCTGAAATGCATCCGGCTGGTCCTGGAAGAGCAGTGGTATTCTAGCCGGgcTCAGATGGAAATCTTCgccCACCTGAACATTAAGCCTAAGAAGATCAACCTGACAGCCGCCAACAAGATCCCGAAGGCTATGATCGACGAGTTCATCCTGAGCCCTGTGGTGAAGAGGACCTTCGGCCAGGCCATTAACCTTATTAACAAGATCATAGAAAAGTACGGCGTGCCTGAAGATATCATCATCGAGCTGGCCAGAGAAAATAATAGCAAGGACAAGCAGAAGTTCATCAATGAGATGCAGAAAAAGAACGAGAACACCAGAAAGAGAATTAACGAAATCATCGGCAAGTATGGCAACCAGAACGCCAAGAGACTGGTCGAGAAGATTAGACTGCACGACGAGCAGGAGGGCAAGTGCCTGTACTCACTGGAAAGCATCCCTCTGGAGGACCTGCTGAACAACCCCAACCACTACGAGGTGGACCACATCATTCCAAGATCTGTGTCCTTCGACAACTCTTACCACAACAAAGTGCTCGTGAAGCAGAGCGAGAACTCCAAAAAATCCAACCTGACCCCTTACCAGTACTTTAACAGCGGCAAGTCCAAGCTCTCTTACAACCAGTTTAAACAACACATCCTGAACCTGAGCAAGTCCCAGGATAGAATCAGCAAAAAAAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAAGTTCGAGGTGCAAAAAGAGTTCATCAATAGAAACCTGGTGGATACCCGGTACGCCACAgccGAGCTGACAAACTACCTGAAGGCCTACTTCAGCGCCAACAATATGAACGTGAAGGTGAAAACGATCAACGGCAGCTTCACCGATTACCTGCGGAAAGTGTGGAAGTTTAAGAAGGAACGGAACCACGGCTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATTATCGCTAATGCCGATTTCCTGTTCAAAGAGAACAAGAAGCTGAAAGCCGTGAACTCTGTGCTGGAAAAACCTGAGATCGAGAGCAAGCAGCTGGATATCCAGGTGGATAGCGAGGATAACTACAGCGAAATGTTCATCATCCCTAAGCAGGTCCAGGACATCAAGGACTTCAGAAACTTCAAGTACAGCCACAGAGTGGACAAGAAGCCTAACAGACAGCTGATCAACGATACACTGTACAGCACCCGGAAGAAGGACAACTCCACCTACATCGTGCAGACCATCAAAGATATCTATGCCAAAGATAATACCACCCTGAAGAAGCAGTTTGACAAGTCACCCGAGAAGTTCCTCATGTACCAACACGATCCGCGGACCTTCGAGAAGTTGGAAGTGATCATGAAGCAGTACGCTAATGAGAAGAATCCTCTGGCCAAGTACCACGAGGAAACAGGCGAGTACCTGACCAAATACAGCAAAAAAAACAACGGCCCTATCGTGAAAAGCCTGAAGTACATTGGAAACAAGCTGGGCAGCCACCTAGATGTGACCCACCAGTTCAAGAGCAGCACCAAGAAGTTGGTGAAGCTGAGCATCAAGCCTTATAGATTCGACGTCTACCTGACCGACAAGGGATATAAGTTCATCACCATCAGCTACCTGGACGTGCTGAAGAAAGACAATTACTACTACATACCCGAACAGAAGTACGACAAGCTCAAACTGGGCAAGGCCATCGACAAAAACGCCAAGTTTATCGCTAGCTTCTACAAGAATGATCTGATCAAGCTGGACGGCGAGATCTACAAGATCATCGGCGTGAATAGCGACACCAGAAACATGATCGAACTGGATCTGCCTGACATCAGATACAAAGAATACTGCGAGCTGAACAATATCAAGGGCGAACCTAGAATCAAAAAGACCATCGGCAAAAAGGTGAATAGCATCGAAAAACTGACAACCGACGTGCTGGGCAACGTGTTCACCAACACCCAGTACACAAAACCTCAGCTGCTGTTCAAGCGAGGAAAT.
配列番号23 ヒト化SauriCas9遺伝子配列:
ATGCAGGAGAACCAGCAGAAGCAGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGAATCACCAGCGTCGGCTACGGACTGATCGATAGCAAGACAAGAGAAGTGATCGACGCCGGCGTTAGACTCTTTCCAGAAGCTGATAGCGAGAACAACTCCAACCGCAGAAGCAAGCGGGGCGCCAGACGGTTAAAACGGAGAAGAATCCACCGGCTGAACCGGGTCAAAGACCTGCTCGCTGATTACCAGATGATCGATCTTAACAATGTTCCTAAGAGCACCGACCCCTACACCATCAGAGTGAAGGGCCTCCGGGAGCCTCTGACAAAAGAAGAATTCGCCATCGCCCTCCTGCATATCGCTAAGAGAAGAGGCCTGCACAACATCAGTGTGTCCATGGGCGACGAAGAGCAGGACAATGAACTGAGCACCAAGCAGCAGCTGCAAAAGAATGCCCAGCAACTGCAGGACAAGTATGTGTGCGAACTGCAGTTAGAACGGCTGACCAACATCAACAAGGTCAGAGGCGAGAAGAACAGATTTAAGACAGAGGACTTTGTGAAAGAAGTGAAACAGCTGTGCGAAACCCAGAGACAGTACCACAACATCGACGACCAATTCATCCAGCAGTACATCGACCTGGTGTCTACAAGACGGGAGTACTTCGAGGGCCCCGGCAACGGCTCTCCATACGGCTGGGACGGCGACCTGCTGAAGTGGTACGAGAAGCTGATGGGCAGATGCACCTATTTCCCCGAAGAACTGAGGTCCGTGAAGTACGCCTACAGCGCCGACCTCTTCAACGCCCTGAACGACCTGAACAACCTCGTTGTGACCAGGGATGACAATCCAAAGCTTGAGTACTACGAGAAGTACCACATTATTGAGAACGTGTTCAAGCAAAAGAAGAATCCCACACTCAAACAAATCGCCAAAGAGATCGGCGTGCAAGATTACGACATCCGGGGCTATAGAATCACAAAGAGCGGCAAACCTCAGTTCACCTCTTTTAAGCTGTATCACGACCTGAAGAACATCTTCGAGCAGGCCAAATACCTGGAAGATGTGGAAATGCTGGACGAGATCGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGGATGAGATTAGCATCAAGAAAGCCCTGGACCAGCTGCCCGAACTGCTGACAGAGAGCGAGAAATCTCAGATCGCACAGCTCACCGGCTATACAGGCACCCACAGACTGAGCCTGAAGTGCATCCACATTGTGATCGACGAGCTGTGGGAGAGCCCCGAGAACCAGATGGAAATCTTTACCAGACTGAATCTGAAACCTAAGAAGGTGGAAATGAGCGAGATCGACAGCATACCCACCACCCTGGTCGACGAGTTCATCCTCTCACCTGTGGTGAAGCGGGCCTTCATCCAGAGCATCAAGGTAATCAACGCAGTGATCAATCGGTTCGGCCTGCCAGAGGACATCATCATCGAGCTGGCCAGAGAAAAGAATAGCAAGGATCGGAGAAAGTTCATTAACAAGCTGCAGAAACAAAATGAGGCCACAAGAAAGAAAATCGAACAGCTGCTGGCCAAGTACGGCAACACCAATGCCAAGTACATGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAGGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAGGCTATTCCTCTGGAAGACCTGCTGAGCAACCCGACACACTACGAAGTTGACCACATTATCCCCAGATCTGTGAGCTTTGACAACAGCCTGAACAACAAAGTGCTGGTGAAACAAAGCGAAAACAGCAAGAAGGGCAATCGCACCCCTTACCAGTACCTGAGCAGCAACGAGTCTAAGATTAGCTACAACCAGTTTAAGCAGCACATCCTGAACCTGAGCAAGGCCAAGGACAGAATCAGCAAGAAAAAAAGAGATATGCTGCTGGAAGAGAGAGATATCAACAAGTTCGAAGTGCAGAAGGAATTCATTAACCGGAACCTGGTGGATACACGGTACGCCACCAGAGAACTGTCTAACCTGCTGAAGACCTACTTCAGCACCCATGACTACGCCGTGAAGGTGAAGACCATCAACGGCGGCTTCACTAACCACCTGAGGAAGGTGTGGGATTTCAAGAAGCACAGAAACCACGGCTACAAGCACCACGCCGAAGATGCCCTGGTGATCGCCAACGCCGACTTCCTGTTTAAGACACATAAGGCCCTGCGGAGAACCGATAAGATCCTGGAACAACCTGGCCTGGAAGTGAATGATACAACCGTGAAAGTGGACACCGAGGAAAAATACCAGGAGCTGTTCGAGACACCTAAGCAAGTGAAGAACATCAAGCAGTTCCGGGACTTCAAGTACAGCCACCGAGTGGACAAGAAGCCTAACCGGCAGCTTATCAACGACACACTGTACTCCACCAGAGAGATTGATGGCGAAACCTACGTGGTGCAGACCCTTAAGGATCTGTACGCCAAGGACAACGAGAAAGTGAAGAAGCTGTTCACCGAAAGACCTCAGAAGATCCTGATGTACCAGCACGACCCTAAGACCTTCGAGAAACTGATGACAATCCTGAACCAGTACGCTGAGGCCAAGAACCCTCTGGCTGCTTATTACGAGGACAAAGGCGAGTACGTGACCAAGTACGCCAAGAAAGGCAATGGACCTGCCATCCACAAGATCAAGTATATCGATAAGAAGCTTGGATCTTACCTGGATGTTAGCAACAAGTATCCTGAGACACAGAACAAGCTTGTGAAGCTGTCCCTGAAGAGCTTTAGATTCGACATCTACAAGTGTGAACAGGGCTACAAGATGGTGTCCATCGGATACCTGGACGTGCTGAAGAAAGATAACTACTACTACATCCCTAAGGACAAGTACGAGGCCGAGAAGCAGAAAAAGAAGATCAAGGAATCTGATCTTTTTGTGGGCAGCTTCTACTACAACGACCTCATCATGTACGAGGATGAACTGTTCAGAGTGATAGGAGTGAACAGCGACATCAACAATCTGGTTGAGCTAAACATGGTCGACATTACCTACAAGGACTTCTGCGAGGTGAACAACGTGACAGGCGAGAAAAGAATCAAAAAGACTATCGGCAAGCGCGTGGTCCTGATCGAGAAGTACACCACAGATATTCTAGGCAACCTGTACAAGACTCCCCTGCCTAAGAAGCCCCAGCTTATCTTCAAGCGGGGAGAACTG;
配列番号24 ヒト化ShaCas9遺伝子配列:
ATGAAGACAGATTACATCCTGGGCCTGGATATCGGCATCACCAGCGTGGGCTATGGCATCATCAACTACAATGACAAGAGCATCATCGACGCCGGAGTGCGGCTGTTCCCCGAGGCCAATGTTGAAAACAACGAGGGCAGAAGAAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGAGACGGCGGATTCACCGGCTGGAAAGAGTGAAGCAGCTTCTGCTGGACTACAAGCTGCTGGACAGCATCGACGTGATCCCTCAGTCTACCAACCCCTACGAGATCCGGGTGCGGGGCCTGAGAGAGAAGCTGACCAAAGACGAGCTGGTGATCGCGCTGCTCCATTTGGCTAAGCGCCGTGGAATTCACAACATCGACGTGATCGACCAGGAGGAGGATGCCAGCAACGAGCTGAGTACAAAGGAGCAGCTGAGCAAGAACAATCTGCTGCTGAGAGATAAGAGCATCTGTGAAGTCCTGCTGGAACGGTACAACGAGGGCAAGGTGCGCGGAGAGAAAAACAGATTCAAAACATCTGATATCGTGAACGAGATCAGACAGATTCTGGAGACACAGAAGGAAGTGCACCACCTGGACGATAGCTTCATCGACAAGTACATCGAACTGGTGGAAACCCGAAGAGAATATTACGAGGGCCCTGGCGAAGGAAGTCCTTACGGCTGGGGAGCCGATCTGAAGAAGTGGTACGAGCACCTGATGGGCCGGTGCACCTACTTCCCTGAGGAACTGAGATCCGTGAAGTACGCCTACTCAGCCGACCTGTTCAATGCCCTGAACGACCTGAACAACCTGGTTATCCAGAGAGACGGCCTGAACAAGCTGGAATATCACGAGAAGTACCACATCATTGAAAACGTGTTCAAGCAGAAAAAGAAACCTACACTGAAGCAGATCAGCAACGAGATCGGCGTGAACCCTGAAGACATCAAGGGCTACCGGATCACCAAATCTGGCAAGGAGAATTTCACCGAGTTCAAGTTGTACCACGATCTCAAGAAGATCCTGAAAGACCAGAGCATCCTAGAAAATATCCAGCTGCTGGACCAGATCGCCGAGATCATCACAATCTACCAGGACAAGGAGAGCATTAAAAAAGAACTGGAACAGCTCACCGAGCCTATAAATGAAATCGACAAGGAATCTATTTCTGACCTGGCTGGATACAACGGCACCCACAGACTTTCTCTGAAGTGCATCAACCTGGTGCTGGAAGAACTGTGGCACACCAGCAGAAATCAAATGGAAATCTTCGCCTACCTGAACATCAAACCCAGAAAGATCGACCTGCAGAAAGCTAATAAAATCCCCAAGGACATGATCGACGAATTCATCCTGAGCCCTGTGGTGAAGCGAACATTCGGCCAGGCCATCAACGTGATTAACAAGGTGATTGAGAAGTACGGCGTTCCTAAGGACATCATCATCGAGCTCGCCAGAGAGAACAACACCAAGGACAAGCAGAAATTCATTAACGAACTCCAGAAGAAAAACGAGAAAACCAGACAGCGGATCAATGAGATCATCGGAAAGACCGGCAACCAGAACGCCAAGAGACTGGTGGAAAAGATCAGACTGCACGACGAGCAGGAGGGAAAATGCCTGTACAGCCTGGAGAGCATCCCACTGGAGGACCTCCTCAACAACCCCAACCACTACGAGGTGGACCACATCATACCTAGAAGCGTGTCTTTTGATAACAGTTATCAAAACAAGGTGCTCGTCAAGCAAACAGAAAACAGCAAGAAGGGGAATAGAACACCTTACCAGTACCTGAACAGCGGCGAGGCTAAGCTGAGCTACAACCAGTTCAAGCAACACGTGCTGAACCTGAGCAAGAGCAAGGATAGAATTTCCAAGAAGAAGAAAGAGTACCTCCTGGAGGAACGGGACATTAACAAGTTCGAGGTGCAGAAGGAATTCATCAACAGAAACCTGGTCGACACCCGATATGCCACCCGCGAGCTGACCAATTACCTGAAGGCCTATTTCAGCGCTAACGATATGGACGTGAAGGTCAAGACCATCAATGGAAGCTTTACCAACCACCTGCGGAAGGTTTGGGACTTCAACAAGGAAAGAAACCACGGCTACAAACACCACGCCGAGGATGCCCTGATCATCGCCAATGCCGACTTCCTGTTTAAGGAGAACAAGAAGCTGAAGGCCGCCAACAAAGTGCTGGAACAGCCTGAGAGAAAGGAAATTGAAACGAAGATCGAGGTGAATTCCGATGAGAATTACCAAGATCTCTTTGTGATCCCCCAGCAGGTGAAAGAAATCAAGGAGTTTAGAGATTTTAAGTACAGCCACAGAGTGGACAAAAAACCTAATAGACAGCTGATCAACGATACACTGTACTCCACAAGAGTGAAGGACGACGACCTGTACATCATATCTCCTATCAAGAACATCTACAGCAAAGACAACACAGATCTGAAGAAGCACTTCAACAAAAACCCAGAGAAGTTCCTGATGTACCAGAAAGACCCCAAGACCTTCGAGAAACTGGAAGTTATTATGAAGCAGTACGCCAACGAGAAGAATCCTCTGGCCAAATACCACGAGGAAACAGGCGAGTACCTGACGAAGTACAGCAAGACCAACAACGGGCCAATCGTGAAAAGCATTAAGATGTTCGGCAAGAAAGTGGGCAATCACCTGGATGTGACCAACCAGTACAACAATAGCCGGAACAAGCTGGTGAAGCTGAGCTTCAAAAGCTACAGATTCGACGTGTACCTGACAGACAAGGGCTACAAGTTCGTGTCCATCACCTACCTGGACGTGCTGAAGAAAGAGAATTACTACTACATCAGCGAGGCCAAGTACGACAAACTGAAACTAAACAAGGGCATCGATGACAAGGCCAAGTTCATCGGCAGCTTCTACTACAACGACCTGATCGAGCTGGACGGCGAGGTGTACACCGTGATCGGCGTGAATAATGACAAGAACAACGTCATCGAGCTCAATCTCCCCGAAATTAGATACAAGGAATACTGCGAGATTAACAACATCAAGGGCTCCGGCAGACTCCGGATCACCATCGGCAAGAAGGTGAACTCCATTCGGAAGCTGTCCACCGACGTGCTCGGCAACCGGTACTACCAGTCTTTCGCCAAAAAGCCTCAGCTCGTGTTCAAGAAGGGAATA;
配列番号25 ヒト化SlugCas9遺伝子配列:
ATGAACCAAAAATTCATACTGGGACTGGACATCGGAATCACCAGCGTGGGCTACGGCCTGATCGACTACGAGACAAAGAATATCATCGATGCCGGCGTTAGACTGTTCCCCGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGAAGAAGGTCCAAACGTGGAAGCAGAAGACTGAAGCGACGCCGCATTCACAGACTTGAACGGGTGAAGAAGCTGCTCGAGGATTATAATCTGCTGGATCAGTCCCAGATTCCTCAGTCTACAAACCCCTACGCCATCCGCGTGAAGGGCCTGTCTGAAGCCCTGAGCAAGGACGAACTCGTGATTGCCCTGCTCCATATCGCCAAGAGAAGAGGCATCCACAAGATCGACGTGATCGACAGCAACGACGACGTGGGGAACGAGCTCAGCACCAAGGAACAGCTGAATAAGAACAGCAAGCTGCTGAAAGACAAATTTGTGTGCCAGATCCAGCTGGAAAGAATGAATGAGGGCCAGGTGCGGGGAGAGAAAAACCGGTTCAAGACCGCTGATATCATCAAGGAAATCATCCAGCTGCTGAATGTGCAGAAGAACTTCCACCAGCTGGACGAGAACTTCATCAACAAGTACATCGAACTGGTTGAGATGAGACGGGAATACTTCGAGGGCCCCGGCAAGGGCAGTCCATATGGCTGGGAAGGCGACCCTAAGGCTTGGTACGAGACACTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCAGATGAGCTGAGAAGCGTGAAATACGCCTACAGTGCCGACCTGTTCAACGCTCTGAACGACCTGAACAACCTGGTCATCCAAAGAGATGGACTGTCTAAGCTCGAGTATCATGAGAAGTATCACATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAACCTACACTGAAGCAGATCGCCAATGAGATCAATGTCAACCCTGAAGATATCAAGGGCTACAGAATCACAAAGTCTGGCAAGCCCCAGTTTACCGAGTTTAAGCTCTACCACGACCTGAAAAGCGTGCTGTTTGACCAGAGCATCCTGGAGAACGAAGACGTGCTGGACCAGATCGCTGAGATCCTGACCATCTACCAGGACAAGGATAGCATCAAATCTAAGCTGACGGAACTGGACATCCTGCTGAACGAGGAAGATAAGGAAAACATCGCCCAGCTGACTGGCTACACCGGGACCCACCGGCTCAGCCTGAAATGCATCCGGCTGGTCCTGGAAGAGCAGTGGTATTCTAGCCGGAATCAGATGGAAATCTTCACACACCTGAACATTAAGCCTAAGAAGATCAACCTGACAGCCGCCAACAAGATCCCGAAGGCTATGATCGACGAGTTCATCCTGAGCCCTGTGGTGAAGAGGACCTTCGGCCAGGCCATTAACCTTATTAACAAGATCATAGAAAAGTACGGCGTGCCTGAAGATATCATCATCGAGCTGGCCAGAGAAAATAATAGCAAGGACAAGCAGAAGTTCATCAATGAGATGCAGAAAAAGAACGAGAACACCAGAAAGAGAATTAACGAAATCATCGGCAAGTATGGCAACCAGAACGCCAAGAGACTGGTCGAGAAGATTAGACTGCACGACGAGCAGGAGGGCAAGTGCCTGTACTCACTGGAAAGCATCCCTCTGGAGGACCTGCTGAACAACCCCAACCACTACGAGGTGGACCACATCATTCCAAGATCTGTGTCCTTCGACAACTCTTACCACAACAAAGTGCTCGTGAAGCAGAGCGAGAACTCCAAAAAATCCAACCTGACCCCTTACCAGTACTTTAACAGCGGCAAGTCCAAGCTCTCTTACAACCAGTTTAAACAACACATCCTGAACCTGAGCAAGTCCCAGGATAGAATCAGCAAAAAAAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAAGTTCGAGGTGCAAAAAGAGTTCATCAATAGAAACCTGGTGGATACCCGGTACGCCACAAGAGAGCTGACAAACTACCTGAAGGCCTACTTCAGCGCCAACAATATGAACGTGAAGGTGAAAACGATCAACGGCAGCTTCACCGATTACCTGCGGAAAGTGTGGAAGTTTAAGAAGGAACGGAACCACGGCTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATTATCGCTAATGCCGATTTCCTGTTCAAAGAGAACAAGAAGCTGAAAGCCGTGAACTCTGTGCTGGAAAAACCTGAGATCGAGAGCAAGCAGCTGGATATCCAGGTGGATAGCGAGGATAACTACAGCGAAATGTTCATCATCCCTAAGCAGGTCCAGGACATCAAGGACTTCAGAAACTTCAAGTACAGCCACAGAGTGGACAAGAAGCCTAACAGACAGCTGATCAACGATACACTGTACAGCACCCGGAAGAAGGACAACTCCACCTACATCGTGCAGACCATCAAAGATATCTATGCCAAAGATAATACCACCCTGAAGAAGCAGTTTGACAAGTCACCCGAGAAGTTCCTCATGTACCAACACGATCCGCGGACCTTCGAGAAGTTGGAAGTGATCATGAAGCAGTACGCTAATGAGAAGAATCCTCTGGCCAAGTACCACGAGGAAACAGGCGAGTACCTGACCAAATACAGCAAAAAAAACAACGGCCCTATCGTGAAAAGCCTGAAGTACATTGGAAACAAGCTGGGCAGCCACCTAGATGTGACCCACCAGTTCAAGAGCAGCACCAAGAAGTTGGTGAAGCTGAGCATCAAGCCTTATAGATTCGACGTCTACCTGACCGACAAGGGATATAAGTTCATCACCATCAGCTACCTGGACGTGCTGAAGAAAGACAATTACTACTACATACCCGAACAGAAGTACGACAAGCTCAAACTGGGCAAGGCCATCGACAAAAACGCCAAGTTTATCGCTAGCTTCTACAAGAATGATCTGATCAAGCTGGACGGCGAGATCTACAAGATCATCGGCGTGAATAGCGACACCAGAAACATGATCGAACTGGATCTGCCTGACATCAGATACAAAGAATACTGCGAGCTGAACAATATCAAGGGCGAACCTAGAATCAAAAAGACCATCGGCAAAAAGGTGAATAGCATCGAAAAACTGACAACCGACGTGCTGGGCAACGTGTTCACCAACACCCAGTACACAAAACCTCAGCTGCTGTTCAAGCGAGGAAAT;
配列番号26 ヒト化SlutCas9遺伝子配列:
ATGAGAAACAGCTACATCCTGGGCCTGGACATCGGAATCACCAGCGTGGGATATGGCATCATCGACAGAGTCACCAGAGAGGTGATCGACGCCGGCGTGCGGCTTTTCCCCGAGGCCAACGTGGAGAACAACGAGGGCAGACGGAGCAAGAGAGGAGCCCGGCGGCTGAAAAGAAGGCGGATCCACCGGCTGAATAGAATCAAGCAGCTGCTGAAAAACGCCGGCCTGCTGGAGGGAGATGTGCTGCCTAAGTCTACCAACCCCTATGAGATCAGAGTGCGGGGCCTCCGAAGCCCTCTGACCAAAGATGAACTGGTGATCGCCCTGCTCCACATCGCCAAAAGAAGAGGCATCCACAACATCAACATCGTGGGAGATGACGAAGAAACGGACAGCACACTGAGTACCACAGCCCAGCTGAAGAAGAACGAGAAGGCTCTCAAGGGACAGTTTGTTTGTGAACTGCAACTGGACAGACTGGCTAATGCCCACCAAGTGCGGGGCGAGAAAAATCGATTTAAGACAGAGGACATTGTGAAGGAAGTCAGAGCCCTGCTTCAGCAACAGCAGAACTTCCACAACATCGATAATTCTTTCGTGGAACAGTACATTGCCCTGCTGGAGAGCCGGAGGACCTACTACGAGGGCCCTGGCGAAGGCTCTCCTTACGGCTGGGACGGCGACATTAAGAAGTGGTACGAGATGCTGATGGGCTATTGCACCTACTTCCCTGAAGAGCTGAGAAGCGTGAAGTACGCCTACACCGCCGATCTGTTCAACGCCCTGAATGACCTGAACAACCTGGTGATCACCCGGGACGACAACAGCAAATTGACATACGCCGAGAAGTACCATATCATCGAGAACGTGTTCAAACAGAAGAAAGTACCTACACTGAAGCAGATCGCCAAGGAAATCGGAGTGAACGAGAGCGATATTAAGGGCTACAGAATCAACAAATCTGAGAAACCTCTGTTCACCAGCTTCAAACTGTACCACGATCTGAAGAGCGTGTTCAGCGACCCTACAAAACTGGAAGATATCGACTTGCTGGACCGAATCGCCGTGGTGCTGACCATGTACCAAGATGCCGAATCCATGAAAGCCGCCCTGAACACCTTCCCTGAAGTGTTCAGCGAAGCAGAGAAAGAGAAGCTGAGCGCCCTCACAGGCTACGCTGGCACCCATAGACTGTCTCTGAAGTGCATGAACCTGCTGATCCCTGATCTGTGGCAGACAAGCCTGAACCAGATGGAACTGTTCGTGAAGCTGAATCTGAAACCACAGAAGCTGGACCTGAGCCAGTGCCACCAGATTCCTACCCAGCTGGTGGACGAGTTCATCCTGTCTCCTGTGGTGAAAAGAGCCTTCACCCAAAGCATCAAGGTGATCAACGCCATCATCCAGAAATACGGCCTGCCCGACGACATCATAATCGAGCTGGCCAGGGAAAAAAACAGCGCCGATAAGCGGAAGTTCCTGAATCAGCTGCAGAAGAAGAACGAGAAGGCCCGGCACGAGATCAATACCCTGGTGGCCCAGTACGGCCAGCCAAATGCTAAGCGGCTGGTGGAAAAGATCACACTGCACCAGCAGCAGGAGGGCAAGTGTCTGTACTCCCTGAAGGATATCCCCCTGGAGCAGCTGCTGAAGCAGCCCTACCTGTACGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTTTCTTTCGACAACAGCATGCAGAACAAGGTGCTGGTCCTGGCCGAAGAAAACGCCAAAAAGGGCAACCAGACCCCTTACCAGTACCTGAATAGCAGAGAGGCCAGCATGACCTACCCCGAATTCAAACAGCACATCCTGAATCTGAGCAAGGCCAAGGACCGGATCAGCAAGAAGAAGCGGAACTACCTGCTCGAGGAAAGAGATATCAACAAGTTCGACGTGCAAAAGGACTTCATCAACAGAAACCTGGTTGACACCAGATACGCCACCAGAGAGCTCGCCTCTCTGCTGAAGGCTTATTTCAAGACACATGAGCTCCCTGTGAAAGTGAAGACCATCAACGGCGGATTTACCCACTACCTGAGAAAGGTGTGGAAGTTTGACAAAGATAGAAACAAGGGCTACAAGCACCACGCCGAGGATGCACTGATCATCGCCAACGCCGACTTTCTGTTTAAGAACCAGACTCTGAACAAAATCGAGGCTATCCTGAACGAGCCCGGCAGAGAGGTGGAATCTGACACAGTGAAGGTGCAGAGCGAGGACAATTACCAGGACCTGTTTGAGAACACCAAGAAGGCTTTCGCCATCAAGAATTTCAAGGATTTCAAGTTTAGCCACAGAGTGGACCAGAAGCCTAACCGGCAGCTCGTGAACGACACCCTGTACAGCACCAGAGAGGTGAACGAAGATCTGTACGTGGTGCAGACCCTGAAGGACATCTACAGCAAGGACAACAAAGACGTGAAGCGGCTCTTCGACAAGCAACCCGAGAAGTTCCTGATGTTCCAGCACGACCCCGAGACATTCAAGAAATTCGAGCTGGCTATGAAGCAATATGCCGAAGAGAAGAACCCTCTGGCTAGATACTACGAGGAACAGGGCTACATCACCAAGTACGCCAAGAAAGGAGACGGCCCACCTGTGAAAAGCCTCAAATACATCGGCAAGAAGGTGGGAAAACACCTGGATGTGACCGGCGACTACGAGGATAGCAACCGGAAGCTGGTGAAGCTGAGCCTGAAGTCCTTTAGATTCGATATCTACCACACAGACAAGGGCTACAAGATGGTTCCAATCACTTACCTGGATGTGCAGAAAAAAGAGAAGTACTACTACATCCCCACCGAGAAATACGAAGCCCTGAAGCAGGAGAAGGGCATCAACCAGAATGCTCAGTTCATTGGCAGCTTCTACTACAACGACCTGATCGAGTTCGATGGCGAGCTGTATAGAGTGATCGGCATCAACAACGGCGACAAGAATCTCGTTGAACTCGACATGGTGGACATTAGATATAAGGAATACTGCGAGCTGAACTCCATCACCACCACACCTAGAATCGTTAAGACCATCAGCCCCAAGACCCAGAGCATCGAGAAGTACACAACAGATATCCTGGGCAACCTGTACAAAGCCCAGCCTGGCAAGAAGCCTCAGTTCATCTTCAACAAAGACGAGGAT;
配列番号27 ヒト化Sa-SauriCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGAGCTTCCGCTTCGACATCTACAAGTGCGAGCAGGGCTACAAGATGGTGAGCATCGGCTACCTGGACGTGCTGAAGAAGGACAACTACTACTACATCCCCAAGGACAAGTACGAGGCCGAGAAGCAGAAGAAGAAGATAAAGGAGAGCGACCTGTTCGTGGGCAGCTTCTACTACAACGACCTGATAATGTACGAGGACGAGCTGTTCCGCGTGATAGGCGTGAACAGCGACATCAACAACCTGGTGGAGCTGAACATGGTGGACATCACCTACAAGGACTTCTGCGAGGTGAACAACGTGACCGGCGAGAAGCGCATCAAGAAGACCATCGGCAAGCGCGTGGTGCTGATAGAGAAGTACACCACCGACATCCTGGGCAACCTGTACAAGACCCCCCTGCCCAAGAAGCCCCAGCTGATATTCAAGCGCGGCGAGCTG;
配列番号28 ヒト化Sa-SepCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGAACTACCGCTTCGACGTGTACCTGACCGAGAAGGGCTACAAGTTCGTGACCATCGCCTACCTGAACGTGTTCAAGAAGGACAACTACTACTACATCCCCAAGGACATGTACCAGGAGCTGAAGGCCAAGAAGAAGATAAAGGACACCGACCAGTTCATCGCCAGCTTCTACAAGAACGACCTGATAAAGCTGAACGGCGACCTGTACAAGATAATCGGCGTGAACAGCGACGACCGCAACATCATCGAGCTGGACTACTACGACATCAAGTACAAGGACTACTGCGAGATAAACAACATCAAGGGCGAGCCCCGCATCAAGAAGACCATCGGCAAGAAGACCGAGAGCATCGAGAAGCTGACCACCGACGTGCTGGGCAACCTGTACCTGCACAGCACCGAGAAGGCCCCCCAGCTGATATTCAAGCGCGGCCTG;
配列番号29 ヒト化Sa-SeqCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACCGCTTCGACGTGTACCTGGACAACGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAACCTGAACGTGATAAAGAAGGAGAACTACTACGAGGTGAACAGCAAGTGCTACGAGAAGGCCAAGAAGCTGAAGAAGATAAGCGACCAGGCCGAGTTCATCGCCAGCTTCTACAACAACGACCTGATAAAGATAGACGGCGAGCTGTACCGCGTGATAGGCGTGAACACCGACCTGATAAACCGCATCGAGGTGAACATGGTGGACATCACCTACCGCGAGTACCTGGAGAACATGAACGACAAGCGCAGCCCCCGCATCTTCAAGACCATCGCCAGCAAGACCCAGAGCATCAAGAAGTACAGCACCGACATCCTGGGCACCCTGTACGAGGTGAACAGCAAGAAGCACCCCCAGATGATAATGAAGGGC;
配列番号30 ヒト化Sa-ShaCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGAGCTACCGCTTCGACGTGTACCTGACCGACAAGGGCTACAAGTTCGTGAGCATCACCTACCTGGACGTGCTGAAGAAGGAGAACTACTACTACATCAGCGAGGCCAAGTACGACAAGCTGAAGCTGAACAAGGGCATCGACGACAAGGCCAAGTTCATCGGCAGCTTCTACTACAACGACCTGATAGAGCTGGACGGCGAGGTGTACACCGTGATAGGCGTGAACAACGACAAGAACAACGTGATAGAGCTGAACCTGCCCGAGATACGCTACAAGGAGTACTGCGAGATAAACAACATCAAGGGCAGCGGCAGGCTGCGCATCACCATCGGCAAGAAGGTGAACAGCATCCGCAAGCTGAGCACCGACGTGCTGGGCAACCGCTACTACCAGAGCTTCGCCAAGAAGCCCCAGCTGGTGTTCAAGAAGGGCATC;
配列番号31 ヒト化Sa-SlugCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACCGCTTCGACGTGTACCTGACCGACAAGGGCTACAAGTTCATCACCATCAGCTACCTGGACGTGCTGAAGAAGGACAACTACTACTACATCCCCGAGCAGAAGTACGACAAGCTGAAGCTGGGCAAGGCCATCGACAAGAACGCCAAGTTCATCGCCAGCTTCTACAAGAACGACCTGATAAAGCTGGACGGCGAGATATACAAGATAATCGGCGTGAACAGCGACACCCGCAACATGATAGAGCTGGACCTGCCCGACATCCGCTACAAGGAGTACTGCGAGCTGAACAACATCAAGGGCGAGCCCCGCATCAAGAAGACCATCGGCAAGAAGGTGAACAGCATCGAGAAGCTGACCACCGACGTGCTGGGCAACGTGTTCACCAACACCCAGTACACCAAGCCCCAGCTGCTGTTCAAGCGCGGCAAC;
配列番号32 ヒト化Sa-SlutCas9遺伝子配列:
ATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACGCCGCCACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCGCCGCCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGAGCTTCCGCTTCGACATCTACCACACCGACAAGGGCTACAAGATGGTGCCCATCACCTACCTGGACGTGCAGAAGAAGGAGAAGTACTACTACATCCCCACCGAGAAGTACGAGGCCCTGAAGCAGGAGAAGGGCATCAACCAGAACGCCCAGTTCATCGGCAGCTTCTACTACAACGACCTGATAGAGTTCGACGGCGAGCTGTACCGCGTGATAGGCATCAACAACGGCGACAAGAACCTGGTGGAGCTGGACATGGTGGACATCCGCTACAAGGAGTACTGCGAGCTGAACAGCATCACCACCACCCCCCGCATCGTGAAGACCATCAGCCCCAAGACCCAGAGCATCGAGAAGTACACCACCGACATCCTGGGCAACCTGTACAAGGCCCAGCCCGGCAAGAAGCCCCAGTTCATCTTCAACAAGGACGAGGAC;
配列番号112 ヒト化SlugCas9-HF遺伝子配列:
ATGAACCAAAAATTCATACTGGGACTGGACATCGGAATCACCAGCGTGGGCTACGGCCTGATCGACTACGAGACAAAGAATATCATCGATGCCGGCGTTAGACTGTTCCCCGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGAAGAAGGTCCAAACGTGGAAGCAGAAGACTGAAGCGACGCCGCATTCACAGACTTGAACGGGTGAAGAAGCTGCTCGAGGATTATAATCTGCTGGATCAGTCCCAGATTCCTCAGTCTACAAACCCCTACGCCATCCGCGTGAAGGGCCTGTCTGAAGCCCTGAGCAAGGACGAACTCGTGATTGCCCTGCTCCATATCGCCAAGAGAAGAGGCATCCACAAGATCGACGTGATCGACAGCAACGACGACGTGGGGAACGAGCTCAGCACCAAGGAACAGCTGAATAAGAACAGCAAGCTGCTGAAAGACAAATTTGTGTGCCAGATCCAGCTGGAAAGAATGAATGAGGGCCAGGTGCGGGGAGAGAAAAACCGGTTCAAGACCGCTGATATCATCAAGGAAATCATCCAGCTGCTGAATGTGCAGAAGAACTTCCACCAGCTGGACGAGAACTTCATCAACAAGTACATCGAACTGGTTGAGATGAGACGGGAATACTTCGAGGGCCCCGGCAAGGGCAGTCCATATGGCTGGGAAGGCGACCCTAAGGCTTGGTACGAGACACTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCAGATGAGCTGgctAGCGTGAAATACGCCTACAGTGCCGACCTGTTCAACGCTCTGAACGACCTGAACAACCTGGTCATCCAAAGAGATGGACTGTCTAAGCTCGAGTATCATGAGAAGTATCACATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAACCTACACTGAAGCAGATCGCCAATGAGATCAATGTCAACCCTGAAGATATCAAGGGCTACAGAATCACAAAGTCTGGCAAGCCCCAGTTTACCGAGTTTAAGCTCTACCACGACCTGAAAAGCGTGCTGTTTGACCAGAGCATCCTGGAGAACGAAGACGTGCTGGACCAGATCGCTGAGATCCTGACCATCTACCAGGACAAGGATAGCATCAAATCTAAGCTGACGGAACTGGACATCCTGCTGAACGAGGAAGATAAGGAAAACATCGCCCAGCTGACTGGCTACACCGGGACCCACCGGCTCAGCCTGAAATGCATCCGGCTGGTCCTGGAAGAGCAGTGGTATTCTAGCCGGgcTCAGATGGAAATCTTCgccCACCTGAACATTAAGCCTAAGAAGATCAACCTGACAGCCGCCAACAAGATCCCGAAGGCTATGATCGACGAGTTCATCCTGAGCCCTGTGGTGAAGAGGACCTTCGGCCAGGCCATTAACCTTATTAACAAGATCATAGAAAAGTACGGCGTGCCTGAAGATATCATCATCGAGCTGGCCAGAGAAAATAATAGCAAGGACAAGCAGAAGTTCATCAATGAGATGCAGAAAAAGAACGAGAACACCAGAAAGAGAATTAACGAAATCATCGGCAAGTATGGCAACCAGAACGCCAAGAGACTGGTCGAGAAGATTAGACTGCACGACGAGCAGGAGGGCAAGTGCCTGTACTCACTGGAAAGCATCCCTCTGGAGGACCTGCTGAACAACCCCAACCACTACGAGGTGGACCACATCATTCCAAGATCTGTGTCCTTCGACAACTCTTACCACAACAAAGTGCTCGTGAAGCAGAGCGAGAACTCCAAAAAATCCAACCTGACCCCTTACCAGTACTTTAACAGCGGCAAGTCCAAGCTCTCTTACAACCAGTTTAAACAACACATCCTGAACCTGAGCAAGTCCCAGGATAGAATCAGCAAAAAAAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAAGTTCGAGGTGCAAAAAGAGTTCATCAATAGAAACCTGGTGGATACCCGGTACGCCACAgccGAGCTGACAAACTACCTGAAGGCCTACTTCAGCGCCAACAATATGAACGTGAAGGTGAAAACGATCAACGGCAGCTTCACCGATTACCTGCGGAAAGTGTGGAAGTTTAAGAAGGAACGGAACCACGGCTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATTATCGCTAATGCCGATTTCCTGTTCAAAGAGAACAAGAAGCTGAAAGCCGTGAACTCTGTGCTGGAAAAACCTGAGATCGAGAGCAAGCAGCTGGATATCCAGGTGGATAGCGAGGATAACTACAGCGAAATGTTCATCATCCCTAAGCAGGTCCAGGACATCAAGGACTTCAGAAACTTCAAGTACAGCCACAGAGTGGACAAGAAGCCTAACAGACAGCTGATCAACGATACACTGTACAGCACCCGGAAGAAGGACAACTCCACCTACATCGTGCAGACCATCAAAGATATCTATGCCAAAGATAATACCACCCTGAAGAAGCAGTTTGACAAGTCACCCGAGAAGTTCCTCATGTACCAACACGATCCGCGGACCTTCGAGAAGTTGGAAGTGATCATGAAGCAGTACGCTAATGAGAAGAATCCTCTGGCCAAGTACCACGAGGAAACAGGCGAGTACCTGACCAAATACAGCAAAAAAAACAACGGCCCTATCGTGAAAAGCCTGAAGTACATTGGAAACAAGCTGGGCAGCCACCTAGATGTGACCCACCAGTTCAAGAGCAGCACCAAGAAGTTGGTGAAGCTGAGCATCAAGCCTTATAGATTCGACGTCTACCTGACCGACAAGGGATATAAGTTCATCACCATCAGCTACCTGGACGTGCTGAAGAAAGACAATTACTACTACATACCCGAACAGAAGTACGACAAGCTCAAACTGGGCAAGGCCATCGACAAAAACGCCAAGTTTATCGCTAGCTTCTACAAGAATGATCTGATCAAGCTGGACGGCGAGATCTACAAGATCATCGGCGTGAATAGCGACACCAGAAACATGATCGAACTGGATCTGCCTGACATCAGATACAAAGAATACTGCGAGCTGAACAATATCAAGGGCGAACCTAGAATCAAAAAGACCATCGGCAAAAAGGTGAATAGCATCGAAAAACTGACAACCGACGTGCTGGGCAACGTGTTCACCAACACCCAGTACACAAAACCTCAGCTGCTGTTCAAGCGAGGAAAT.
一実施形態において、発現ベクターがプラスミドベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、pAAV2_ITRなどのアデノ随伴ウイルスベクターなどであり得る。しかし、任意の他の適切な発現ベクターもまた実現可能であることが理解され得る。
本開示において、標的化用の任意のsgRNAは、実際の必要性に従って編集されるDNA配列に対して設計することができ、当該分野で公知の改変をsgRNAに対してある程度行うことができる。したがって、一実施形態において、前記sgRNAに対する改変は、リン酸化、短縮、延長、硫化、メチル化、およびヒドロキシル化を含むが、これらに限定されない。
本開示において、任意のミスマッチsgRNAは、実際の必要性に従って編集されるDNA配列に対して設計することができ、当該分野で公知の改変はsgRNAに対してある程度行うことができる。前記改変はリン酸化、短縮、延長、硫化、メチル化、およびヒドロキシル化を含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、工程(3)において、標的部位を含む細胞に送達されるCRISPR/Cas9システムは、実際の必要性に応じて、本開示のCas9タンパク質およびsgRNAを発現するプラスミドベクター、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクター、またはsgRNAおよびタンパク質自体を含むことができるが、これらに限定されない。
さらなる一実施形態において、工程(3)において、送達手段はリポソーム、カチオン性ポリマー、ナノ粒子、多機能エンベロープ型ナノ粒子、およびウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
さらなる一実施形態において、工程(3)において、細胞は真核細胞および細菌細胞などの原核細胞を含むが、これらに限定されない。前記真核細胞は、例えば、哺乳動物細胞および植物細胞を含み、前記哺乳動物細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスセルトリ細胞、マウス乳房腫瘍細胞、buffaloラット肝細胞、ラット肝細胞腫細胞、SV40形質転換サル腎臓CVI系統、サル腎臓細胞、イヌ腎臓細胞などの動物細胞;およびヒト子宮頸癌細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、HIH/3T3細胞、ヒトU2-OS骨肉腫細胞、ヒトA549細胞、ヒトK562細胞、ヒトHEK293細胞、ヒトHEK293T細胞、ヒトHCT116細胞、またはヒトMCF-7細胞またはTRI細胞などのヒト細胞を含む。
さらなる一実施形態において、工程(2)における改変はリン酸化、短縮、延長、硫化、またはメチル化を含むが、これらに限定されない。
特定の一実施形態において、SlugCas9-HF遺伝子以外の他のCas9遺伝子の場合、オリゴ-Fは配列番号16であり、オリゴ-Rは配列番号17であり、SlugCas9-HF遺伝子の場合、オリゴ-Fおよびオリゴ-Rはそれぞれ配列番号59および配列番号60によって表される第1のオリゴフォワード鎖配列(オリゴ-F1)および第1のオリゴリバース鎖配列(オリゴ-R1)、ならびにそれぞれ配列番号61および配列番号62によって表される第2のオリゴフォワード鎖配列(オリゴ-F2)および第2のオリゴリバース鎖配列(オリゴ-R2)を含む。
当業者によって理解され得るように、オリゴ-F配列およびオリゴ-R配列は、アニーリングして二本鎖DNAになる必要がある。したがって、一実施形態において、アニーリング反応は、100μMのオリゴ-F配列を1μL、100μMのオリゴ-R配列を1μL、および水を28μL含む。振盪混合後、アニーリング反応をPCR増幅器で行い、0.3℃/秒の冷却速度で、95℃で5分間、85℃で1分間、75℃で1分間、65℃で1分間、55℃で1分間、45℃で1分間、35℃で1分間、25℃で1分間、および4℃でかなりの長時間アニーリングプログラムを実行した。
一実施形態において、プラスミドpAAV2_Cas9_ITRなどのCas9でクローニングされた発現ベクターは、BsaIなどの制限エンドヌクレアーゼで線状化される必要がある。
特定の一実施形態において、オリゴ-F配列およびオリゴ-R配列のアニーリング産物は、pAAV2_Cas9_ITR骨格ベクターなどのCas9でクローニングされた線状化発現ベクターとDNAリガーゼを介してライゲーションされる。このようにして、pAAV2_Cas9-hU6-sgRNAなどのCas9およびsgRNAの両方を用いてクローニングされた発現ベクターが得られる。特定の一実施形態において、pAAV2_Cas9-hU6-sgRNAは、AAV2 ITR、CMVエンハンサー、CMVプロモーター、SV40 NLS、Cas9、ヌクレオプラスミンNLS、3x HA、bGHポリ(A)、ヒトU6プロモーター、BsaIエンドヌクレアーゼ部位、およびsgRNA足場配列を含むアデノ随伴ウイルス骨格プラスミドである。
特定の一実施形態において、ライゲーション産物は、コンピテント細胞に形質転換され、次いで、正確なクローン検証のためにサンガー配列決定に供される。次いで、プラスミドを抽出して使用する。
特定の一実施形態において、前記SlugCas9-HF遺伝子以外の他のCas9遺伝子の場合、工程(3)における細胞は配列番号18によって表されるヌクレオチド配列を有する標的部位を含むHEK293T細胞であり、前記SlugCas9-HF遺伝子の場合、工程(3)における細胞における標的部位がそれぞれ、配列番号63および配列番号64によって表されるヌクレオチド配列を有する。
特定の一実施形態において、工程(3)における送達手段は、例えば、Lipofectamine(登録商標)2000またはPEIを含むリポソームである。
任意の一実施形態において、本方法は、例えば、編集された標的部位上でPCR増幅し、T7EI消化または次世代配列決定することによって、前記編集された標的部位の編集効率を検出する工程(4)をさらに含む。
特定の一実施形態において、工程(4)におけるPCR増幅用テンプレートは、HEK293T細胞において編集されたゲノムDNAである。
特定の一実施形態において、工程(4)において、前記SlugCas9-HF遺伝子以外の他のCas9遺伝子の場合、PCR増幅用プライマー配列は配列番号19、配列番号20、配列番号21、および配列番号22によって表され、前記SlugCas9-HF遺伝子の場合、PCR増幅用プライマー配列は配列番号65、配列番号66、配列番号21、配列番号22、および配列番号67によって表される。
第三の態様では、本開示はさらに、遺伝子編集のためのCRISPR/Cas9遺伝子編集システムのキットであって、
(1)Cas9タンパク質およびsgRNAであって、
前記Cas9タンパク質が、
配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するSauriCas9タンパク質、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するShaCas9タンパク質、
配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9タンパク質、
配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するSlutCas9タンパク質、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するSa-SauriCas9タンパク質、
配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するSa-SepCas9タンパク質、
配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するSa-SeqCas9タンパク質、
配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するSa-ShaCas9タンパク質、
配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlugCas9タンパク質、
配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlutCas9タンパク質、または
配列番号58で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9-HFタンパク質、または
配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するCas9タンパク質であり、
前記sgRNAが
配列番号11によって表されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列である、Cas9タンパク質およびsgRNA;または
(2)Cas9遺伝子配列およびsgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNAでクローニングされた発現ベクターであって、
前記Cas9遺伝子配列が
(a)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つで表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、
(b)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、または
(c)ヒト化Cas9遺伝子配列、例えば、配列番号23~32および配列番号112のいずれか1つによって表されるヌクレオチド配列を有するものであり、
前記sgRNAが、
配列番号11によって表されるヌクレオチド配列、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列を有する、Cas9遺伝子配列およびsgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNAでクローニングされた発現ベクターを含む、遺伝子編集のためのCRISPR/Cas9遺伝子編集システムのキットを提供する。
(1)Cas9タンパク質およびsgRNAであって、
前記Cas9タンパク質が、
配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するSauriCas9タンパク質、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するShaCas9タンパク質、
配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9タンパク質、
配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するSlutCas9タンパク質、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するSa-SauriCas9タンパク質、
配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するSa-SepCas9タンパク質、
配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するSa-SeqCas9タンパク質、
配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するSa-ShaCas9タンパク質、
配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlugCas9タンパク質、
配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlutCas9タンパク質、または
配列番号58で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9-HFタンパク質、または
配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するCas9タンパク質であり、
前記sgRNAが
配列番号11によって表されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列である、Cas9タンパク質およびsgRNA;または
(2)Cas9遺伝子配列およびsgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNAでクローニングされた発現ベクターであって、
前記Cas9遺伝子配列が
(a)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つで表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、
(b)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、または
(c)ヒト化Cas9遺伝子配列、例えば、配列番号23~32および配列番号112のいずれか1つによって表されるヌクレオチド配列を有するものであり、
前記sgRNAが、
配列番号11によって表されるヌクレオチド配列、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列を有する、Cas9遺伝子配列およびsgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNAでクローニングされた発現ベクターを含む、遺伝子編集のためのCRISPR/Cas9遺伝子編集システムのキットを提供する。
第四の態様において、本開示はさらに、
遺伝子ノックアウト、部位特異的塩基変化、部位特異的挿入、遺伝子転写レベルの調節、DNAメチル化の調節、DNAアセチル化の改変、ヒストンアセチル化の改変、一塩基編集またはクロマチンイメージング追跡における、本開示の第一の態様のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムの使用を提供する。
遺伝子ノックアウト、部位特異的塩基変化、部位特異的挿入、遺伝子転写レベルの調節、DNAメチル化の調節、DNAアセチル化の改変、ヒストンアセチル化の改変、一塩基編集またはクロマチンイメージング追跡における、本開示の第一の態様のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムの使用を提供する。
従来技術における既存のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムと比較して、本開示のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムは従来技術よりも少ないアミノ酸を有する小さいCas9タンパク質を含むことで、効果的にパッケージングすることができる。さらに、本開示のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムは、比較的単純なPAM配列を認識することができるため、ゲノム中のより多くのDNA配列を標的とすることができ、編集効率がより高い。
以下、添付図面を参照して、以下の実施例により、本開示をより詳細に説明する。特に明記しない限り、本開示で使用される試薬、方法、およびデバイスはすべて、技術分野における従来の試薬、方法、およびデバイスであることを理解されたい。特に明記しない限り、以下の実施例で使用される試薬および材料はすべて市販されている。本明細書に特定の条件が示されていない実験方法は、通常、製造業者によって慣用のまたは推奨される条件下で実施される。
実施例1 プラスミドpAAV2_Cas9-ITRの構築
工程(1):Cas9遺伝子UniProtの受託番号に従ってアミノ酸配列をダウンロードした。
本開示では、SauriCas9遺伝子、ShaCas9遺伝子、SlugCas9遺伝子、SlutCas9遺伝子、Sa-SauriCas9遺伝子、Sa-SepCas9遺伝子、Sa-SeqCas9遺伝子、Sa-ShaCas9遺伝子、Sa-SlugCas9遺伝子およびSa-SlutCas9遺伝子のアミノ酸配列を、これらの遺伝子UniProtの受託番号に従ってダウンロードした。UniProt上のCas9遺伝子の受託番号およびそのアミノ酸配列は以下の通りである。
工程(2):上記のCas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列をコドン最適化に供して、ヒト細胞においてCas9タンパク質を高度に発現するコード配列を得た。ヒト細胞においてSauriCas9タンパク質、ShaCas9タンパク質、SlugCas9タンパク質、SlutCas9タンパク質、Sa-SauriCas9タンパク質、Sa-SepCas9タンパク質、Sa-SeqCas9タンパク質、Sa-ShaCas9タンパク質、Sa-SlugCas9タンパク質およびSa-SlutCas9タンパク質を高度に発現するコード配列は、それぞれ配列番号23~32および配列番号112によって表される。
工程(3):工程(2)で得られたCas9コード配列を遺伝子合成し、pAAV2_ITR骨格プラスミドに構築して、図2に示すようなプラスミドpAAV2_Cas9_ITRを得た。
実施例2 線状化プラスミドpAAV2_Cas9-ITRの調製
工程(1):実施例1で得られたプラスミドpAAV2_Cas9_ITRを、BsaI制限エンドヌクレアーゼによる消化によって線状化した。消化混合物はそれぞれ、プラスミドpAAV2_Cas9_ITRを1μg、10×CutSmart緩衝液を5μL、BsaIエンドヌクレアーゼを1μL、ddH2Oを含み、50μLにした。前記消化混合物を37℃で1時間反応させた。
工程(2):消化産物を1%アガロースゲル上で120Vで30分間電気泳動に供した。
工程(3):DNA断片を切断し、製造業者によって提供される説明書に従ってゲル回収用キットを用いて回収し、最後にddH2Oで溶出した。回収されたDNA断片は、それぞれ、7447bp、7430bp、7427bp、7437bp、7433bp、7430bp、7423bp、7430bp、7430bp、7433bpおよび7427bpのサイズのSauriCas9、ShaCas9、SlugCas9、SlutCas9、Sa-Sauri、Sa-SepCas9、Sa-SeqCas9、Sa-ShaCas9、Sa-SlugCas9、Sa-SlutCas9およびSlugCas9-HFを有する線状化プラスミドpAAV2_Cas9_ITRであった。
工程(4):回収した線状化プラスミドpAAV2_Cas9_ITRのDNA濃度を、NanoDropを使用して測定し、さらなる使用のために保存したか、または-20℃で長期保存した。
実施例3 プラスミドpAAV2_Cas9_hU6_sgRNAの構築
工程(1):sgRNA配列を設計した。
工程(2):線状化プラスミドpAAV2_Cas9_ITRの両端に対応する粘着末端配列を、設計されたsgRNA配列に対応するセンス鎖およびアンチセンス鎖に付加し、オリゴ一本鎖DNAを合成した。
SlugCas9-HF以外の他の遺伝子の場合、オリゴ一本鎖DNAの特定の配列は以下の通りであった:
オリゴ-F:CACCGCTCGGAGATCATCATTGCG(配列番号16)
オリゴ-R:AAACCGCAATGATGATCTCCGAGC(配列番号17)。
オリゴ-F:CACCGCTCGGAGATCATCATTGCG(配列番号16)
オリゴ-R:AAACCGCAATGATGATCTCCGAGC(配列番号17)。
さらに、SlugCas9-HFの場合、オリゴ一本鎖DNAの特定の配列は以下の通りであった:
オリゴ-F1:CACCAGAGTAGGCTGGTAGATGGAG(配列番号59)
オリゴ-R1:AAACCTCCATCTACCAGCCTACTCT(配列番号60)
オリゴ-F2:CACCGTCAGACATGAGATCACAGAT(配列番号61)
オリゴ-R2:AAACATCTGTGATCTCATGTCTGAC(配列番号62)。
オリゴ-F1:CACCAGAGTAGGCTGGTAGATGGAG(配列番号59)
オリゴ-R1:AAACCTCCATCTACCAGCCTACTCT(配列番号60)
オリゴ-F2:CACCGTCAGACATGAGATCACAGAT(配列番号61)
オリゴ-R2:AAACATCTGTGATCTCATGTCTGAC(配列番号62)。
工程(3):オリゴ一本鎖DNAをアニーリングして二本鎖DNAとした。アニーリング反応は、100μMのオリゴ-Fを1μL、100μMのオリゴ-Rを1μL、ddH2Oを28μL含んだ。振盪混合後、アニーリング反応をPCR増幅器で行い、0.3℃/秒の冷却速度で、95℃で5分間、85℃で1分間、75℃で1分間、65℃で1分間、55℃で1分間、45℃で1分間、35℃で1分間、25℃で1分間、4℃でかなりの長時間アニーリングプログラムを実行した。
工程(4):製造業者によって提供される説明書に従ってDNAリガーゼを使用することによって、アニーリング産物を、実施例2において得られた線状化プラスミドpAAV2_Cas9_ITRとライゲーションした。
工程(5):ライゲーション産物1μLを、化学的にコンピテントな形質転換のために採取し、増殖した細菌クローンを、サンガー配列決定によって検証した。
工程(6):配列決定によって検証された正しくライゲーションされたクローンを振盪下で培養した後、それを用いてさらなる使用のためにプラスミドpAAV2_Cas9-hU6-sgRNAを抽出した。
実施例4 Cas9タンパク質とsgRNAを発現するプラスミドpAAV2_Cas9_hU6_sgRNAによるHEK293T細胞株のトランスフェクション
1.プラスミドpAAV2_Cas9-hU6-sgRNAによるGFP-レポーターHEK293T細胞株のトランスフェクション
工程(1):0日目に、トランスフェクションの要件に従って、GFPレポーターHEK293T細胞株を、約30%の細胞密度で6ウェルプレート上にプレーティングした。標的部位の配列は配列番号18(GCTCGGAGATCATCATTGCGNNNNN)によって表される。
工程(2):1日目に、トランスフェクションを以下の工程で行った。
i.トランスフェクションするプラスミドpAAV2_Cas9-hU6-sgRNAを2μg採取し、Opti-MEM(登録商標)培地100μLに添加し、穏やかにピペッティングすることによって均質に混合した。
ii.5μLのフリック混合Lipofectamine(登録商標)2000を100μLのOpti-MEM(登録商標)培地にピペッティングし、穏やかに混合し、室温で5分間放置した。
iii.希釈したLipofectamine(登録商標)2000および希釈したプラスミドを穏やかにピペッティングすることによって均質に混合し、室温で20分間放置し、次いでトランスフェクションする細胞を含む培地に添加した。前記トランスフェクションする細胞は、配列番号18によって表される配列を含む、配列番号113によって表されるCMV-ATG-標的部位-NNNNNNN-GFPヌクレオチド配列を含んでいた。ここで、前記ヌクレオチド配列は、標的部位とGFP配列との間のPAM配列(太字および下線でマークされている)として7個のランダム塩基Nを有する。
工程(3):前記細胞を、5%CO2のインキュベーター内で37℃で培養し続けた。
工程(4):3日間編集した後、GFP陽性細胞を流動選別によって選別し、5%のCO2のインキュベーター内で37℃で培養し続けた。
配列番号113で表される配列は以下の通りである:
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGTCTAGAGATCCGACGCCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATGCATGCGAGAAAAGCCTTGTTTGCCACCATGGAACGGCTCGGAGATCATCATTGCGNNNNNNNGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAAGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGTCTAGAGATCCGACGCCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATGCATGCGAGAAAAGCCTTGTTTGCCACCATGGAACGGCTCGGAGATCATCATTGCGNNNNNNNGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAAGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
2.pAAV2_SlugCas9-HF-hU6-sgRNAによるHEK293T細胞株のトランスフェクション
工程(1):0日目に、トランスフェクションの要件に従って、sgRNA標的部位を含むHEK293T細胞株を、約30%の細胞密度で6ウェルプレート上にプレーティングした。SlugCas9-HFに対するG4およびG7標的部位の配列は、それぞれ、配列番号63(AGAGTAGGCTGGTAGATGGAGNNNN)および配列番号64(ATCTGTGATCTCATGTCTGACNNNN)によって表される。
工程(2):1日目に、以下の工程によりトランスフェクションを行った:
i.トランスフェクションするプラスミドpAAV2_SlugCas9-HF-hU6-sgRNAを2μg採取し、100μLのOpti-MEM(登録商標)培地に添加し、穏やかにピペッティングすることによって均質に混合した。
ii.5μLのフリック混合Lipofectamine(登録商標)2000を100μLのOpti-MEM(登録商標)培地にピペッティングし、穏やかに混合し、室温で5分間放置した。
iii.希釈したLipofectamine(登録商標)2000および希釈したプラスミドを、穏やかにピペッティングすることによって均質に混合し、室温で20分間放置し、次いで、トランスフェクションする細胞を含む培地に添加した。
工程(3):前記細胞を、5%のCO2のインキュベーター内で37℃で培養し続けた。
実施例5 次世代配列決定ライブラリーの調製
工程(1):3日間編集した後のHEK293T細胞または流動選別後のGFP-レポーターHEK293T細胞株を採取し、製造業者によって提供される説明書に従って、DNAキットを用いてゲノムDNAを抽出するために使用した。
工程(2):PCRライブラリー構築のためのPCRの第1ラウンドを、2xQ5マスターミックスを用いて行った。SlugCas9-HF以外の他の遺伝子の場合、PCRプライマーは配列番号19および配列番号20で表され、SlugCas9-HF遺伝子の場合、PCRプライマーは配列番号65および配列番号66で表される:
F1-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGCGAGAAAAGCCTTGTTT(配列番号19);
R1-ACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGAACTTGTGGCCGTTTAC(配列番号20);
F1-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNTGTCAGGCAGCAGAGCTC(配列番号65);
R1-ACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNGGCGATGGCTTCCTGGTC(配列番号66)。
F1-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGCGAGAAAAGCCTTGTTT(配列番号19);
R1-ACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGAACTTGTGGCCGTTTAC(配列番号20);
F1-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNTGTCAGGCAGCAGAGCTC(配列番号65);
R1-ACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNGGCGATGGCTTCCTGGTC(配列番号66)。
反応は以下の通りであった:
PCR手順は以下の通りであった:
工程(3):PCRライブラリー構築のためのPCRの第2ラウンドを、2xQ5マスターミックスを用いて行った。SlugCas9-HF以外の他の遺伝子の場合、PCRプライマーを配列番号21および配列番号22で表し、SlugCas9-HFの場合、G4部位に対する第1ラウンドのPCR産物を配列番号21および配列番号22で表されるプライマーで増幅し、G7部位に対する第1ラウンドのPCR産物を配列番号21および配列番号67で表されるプライマーで増幅した。
F2-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC(配列番号21)
R2-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG(配列番号22)
F2-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC(配列番号21)
R2-1-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG(配列番号22)
F2-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC(配列番号21)
R2-2-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG(配列番号67)
F2-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC(配列番号21)
R2-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG(配列番号22)
F2-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC(配列番号21)
R2-1-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG(配列番号22)
F2-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC(配列番号21)
R2-2-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG(配列番号67)
反応は以下の通りであった:
PCR手順は以下の通りであった:
工程(4):第2ラウンドのPCR産物を、製造業者によって提供される指示に従ってゲル回収のためのキットを用いて精製して、366bpまたは406bp(後者はSlugCas9-HFについてのみ)の大きさを有するDNAフラグメントを得ることにより、次世代配列決定のためのライブラリーの調製を完了した。
実施例6 次世代配列決定結果の解析
工程(1):次世代配列決定のために調製したライブラリーを、HiseqXTen上でペアエンドシーケンシングに供した。
工程(2):次世代配列決定結果を、Bioinformaticsによって分析した。編集結果のいくつかを図3A~図3Jに示す。図から、編集結果は欠失、挿入またはミスマッチを含み、最後の4bpまたは5bpは、それぞれ、図3A~図3JのNNGG、NNGRM、NNGG、NNGR、NNGG、NNGG、NNGRM、NNGRM、NNGGおよびNNGRRであるPAM配列を表すことがわかる。図3KはSlugCas9-HF遺伝子編集システムによる2つの標的部位の編集を示し、X軸は2つの標的部位であるG4およびG7を表し、Y軸はインデル効率を表す。
実施例7 内因性部位の検証
工程(1):Cas9およびsgRNAを発現するプラスミドpAAV2_Cas9-hU6-sgRNAを、製造業者によって提供される説明書に従って、Lipofectamine(登録商標)2000によってHEK293T細胞にトランスフェクトした。複数のCas9s、crRNAおよび標的部位についての特定の配列を表6および7に示す。
工程(2):5日間編集した細胞中のゲノムDNAを抽出し、標的DNA配列を2xQ5マスターミックスおよびTest-FおよびTest-Rプライマーで増幅した。Test-FおよびTest-Rプライマーの詳細な配列を以下の表6および7に示す。
工程(3):PCR産物をアガロースゲル電気泳動により回収し、これにより得た異なるサイズのDNA断片を精製し、DNA断片の大きさを表6および7に示す。
工程(4):精製したDNA断片をT7エンドヌクレアーゼIの説明書に従って消化し、次いでゲル電気泳動によって検出した。
結果を図4A~4Jに示す。各図において、左のレーンはトランスフェクション中にsgRNAが関与しなかったネガティブコントロール群に対応し、標的配列がT7エンドヌクレアーゼIによって切断された後に切断断片は存在せず、編集が起こらなかったことを示し;右のレーンはトランスフェクション中にsgRNAが関与した処理群に対応し、標的配列がT7エンドヌクレアーゼIによって切断された後に切断断片が現れ、編集が起こったことを示す。
実施例8 CRISPR/Cas9システム特異性の検出
本実施例では、SlugCas9-HFを例に挙げ、CRISPR/Cas9システムの特異性を検証した。特定のプロトコルは以下の通りであった。
1.プラスミドpAAV2_SlugCas9-HF_ITRを、実施例1のプロトコルに従って構築した。
2.線状化プラスミドpAAV2_SlugCas9-HF_ITRを、実施例2のプロトコルに従って調製した。
3.プラスミドpAAV2_SlugCas9-HF-hU6-オンターゲットsgRNAおよびプラスミドpAAV2_SlugCas9-HF-hU6-ミスマッチsgRNAを構築した。
工程(1):オンターゲットsgRNA配列およびミスマッチsgRNA配列を設計した。
工程(2):線状化プラスミドpAAV2_SlugCas9-HF_ITRの両端に対応する粘着末端配列を、設計されたオンターゲットsgRNA配列およびミスマッチsgRNA配列に対応するセンス鎖およびアンチセンス鎖に付加し、オリゴ一本鎖DNAを合成した。特定の配列は以下の通りである(ここで、下線および太字の塩基はミスマッチ塩基である):
オリゴ-F3:CACCGGCTCGGAGATCATCATTGCG(配列番号68)(オンターゲット)
オリゴ-R3:AAACCGCAATGATGATCTCCGAGCC(配列番号89)(オンターゲット)
オリゴ-F4:CACCAACTCGGAGATCATCATTGCG(配列番号69)(ミスマッチ)
オリゴ-F5:CACCGATTCGGAGATCATCATTGCG(配列番号70)(ミスマッチ)
オリゴ-F6:CACCGGTCCGGAGATCATCATTGCG(配列番号71)(ミスマッチ)
オリゴ-F7:CACCGGCCTGGAGATCATCATTGCG(配列番号72)(ミスマッチ)
オリゴ-F8:CACCGGCTTAGAGATCATCATTGCG(配列番号73)(ミスマッチ)
オリゴ-F9:CACCGGCTCAAAGATCATCATTGCG(配列番号74)(ミスマッチ)
オリゴ-F10:CACCGGCTCGAGGATCATCATTGCG(配列番号75)(ミスマッチ)
オリゴ-F11:CACCGGCTCGGGAATCATCATTGCG(配列番号76)(ミスマッチ)
オリゴ-F12:CACCGGCTCGGAAGTCATCATTGCG(配列番号77)(ミスマッチ)
オリゴ-F13:CACCGGCTCGGAGGCCATCATTGCG(配列番号78)(ミスマッチ)
オリゴ-F14:CACCGGCTCGGAGACTATCATTGCG(配列番号79)(ミスマッチ)
オリゴ-F15:CACCGGCTCGGAGATTGTCATTGCG(配列番号80)(ミスマッチ)
オリゴ-F16:CACCGGCTCGGAGATCGCCATTGCG(配列番号81)(ミスマッチ)
オリゴ-F17:CACCGGCTCGGAGATCACTATTGCG(配列番号82)(ミスマッチ)
オリゴ-F18:CACCGGCTCGGAGATCATTGTTGCG(配列番号83)(ミスマッチ)
オリゴ-F19:CACCGGCTCGGAGATCATCGCTGCG(配列番号84)(ミスマッチ)
オリゴ-F20:CACCGGCTCGGAGATCATCACCGCG(配列番号85)(ミスマッチ)
オリゴ-F21:CACCGGCTCGGAGATCATCATCACG(配列番号86)(ミスマッチ)
オリゴ-F22:CACCGGCTCGGAGATCATCATTATG(配列番号87)(ミスマッチ)
オリゴ-F23:CACCGGCTCGGAGATCATCATTGTA(配列番号88)(ミスマッチ)
オリゴ-R4:AAACCGCAATGATGATCTCCGAGTT(配列番号90)(ミスマッチ)
オリゴ-R5:AAACCGCAATGATGATCTCCGAATC(配列番号91)(ミスマッチ)
オリゴ-R6:AAACCGCAATGATGATCTCCGGACC(配列番号92)(ミスマッチ)
オリゴ-R7:AAACCGCAATGATGATCTCCAGGCC(配列番号93)(ミスマッチ)
オリゴ-R8:AAACCGCAATGATGATCTCTAAGCC(配列番号94)(ミスマッチ)
オリゴ-R9:AAACCGCAATGATGATCTTTGAGCC(配列番号95)(ミスマッチ)
オリゴ-R10:AAACCGCAATGATGATCCTCGAGCC(配列番号96)(ミスマッチ)
オリゴ-R11:AAACCGCAATGATGATTCCCGAGCC(配列番号97)(ミスマッチ)
オリゴ-R12:AAACCGCAATGATGACTTCCGAGCC(配列番号98)(ミスマッチ)
オリゴ-R13:AAACCGCAATGATGGCCTCCGAGCC(配列番号99)(ミスマッチ)
オリゴ-R14:AAACCGCAATGATAGTCTCCGAGCC(配列番号100)(ミスマッチ)
オリゴ-R15:AAACCGCAATGACAATCTCCGAGCC(配列番号101)(ミスマッチ)
オリゴ-R16:AAACCGCAATGGCGATCTCCGAGCC(配列番号102)(ミスマッチ)
オリゴ-R17:AAACCGCAATAGTGATCTCCGAGCC(配列番号103)(ミスマッチ)
オリゴ-R18:AAACCGCAACAATGATCTCCGAGCC(配列番号104)(ミスマッチ)
オリゴ-R19:AAACCGCAGCGATGATCTCCGAGCC(配列番号105)(ミスマッチ)
オリゴ-R20:AAACCGCGGTGATGATCTCCGAGCC(配列番号106)(ミスマッチ)
オリゴ-R21:AAACCGTGATGATGATCTCCGAGCC(配列番号107)(ミスマッチ)
オリゴ-R22:AAACCATAATGATGATCTCCGAGCC(配列番号108)(ミスマッチ)
オリゴ-R23:AAACTACAATGATGATCTCCGAGCC(配列番号109)(ミスマッチ)。
オリゴ-F3:CACCGGCTCGGAGATCATCATTGCG(配列番号68)(オンターゲット)
オリゴ-R3:AAACCGCAATGATGATCTCCGAGCC(配列番号89)(オンターゲット)
オリゴ-F4:CACCAACTCGGAGATCATCATTGCG(配列番号69)(ミスマッチ)
オリゴ-F5:CACCGATTCGGAGATCATCATTGCG(配列番号70)(ミスマッチ)
オリゴ-F6:CACCGGTCCGGAGATCATCATTGCG(配列番号71)(ミスマッチ)
オリゴ-F7:CACCGGCCTGGAGATCATCATTGCG(配列番号72)(ミスマッチ)
オリゴ-F8:CACCGGCTTAGAGATCATCATTGCG(配列番号73)(ミスマッチ)
オリゴ-F9:CACCGGCTCAAAGATCATCATTGCG(配列番号74)(ミスマッチ)
オリゴ-F10:CACCGGCTCGAGGATCATCATTGCG(配列番号75)(ミスマッチ)
オリゴ-F11:CACCGGCTCGGGAATCATCATTGCG(配列番号76)(ミスマッチ)
オリゴ-F12:CACCGGCTCGGAAGTCATCATTGCG(配列番号77)(ミスマッチ)
オリゴ-F13:CACCGGCTCGGAGGCCATCATTGCG(配列番号78)(ミスマッチ)
オリゴ-F14:CACCGGCTCGGAGACTATCATTGCG(配列番号79)(ミスマッチ)
オリゴ-F15:CACCGGCTCGGAGATTGTCATTGCG(配列番号80)(ミスマッチ)
オリゴ-F16:CACCGGCTCGGAGATCGCCATTGCG(配列番号81)(ミスマッチ)
オリゴ-F17:CACCGGCTCGGAGATCACTATTGCG(配列番号82)(ミスマッチ)
オリゴ-F18:CACCGGCTCGGAGATCATTGTTGCG(配列番号83)(ミスマッチ)
オリゴ-F19:CACCGGCTCGGAGATCATCGCTGCG(配列番号84)(ミスマッチ)
オリゴ-F20:CACCGGCTCGGAGATCATCACCGCG(配列番号85)(ミスマッチ)
オリゴ-F21:CACCGGCTCGGAGATCATCATCACG(配列番号86)(ミスマッチ)
オリゴ-F22:CACCGGCTCGGAGATCATCATTATG(配列番号87)(ミスマッチ)
オリゴ-F23:CACCGGCTCGGAGATCATCATTGTA(配列番号88)(ミスマッチ)
オリゴ-R4:AAACCGCAATGATGATCTCCGAGTT(配列番号90)(ミスマッチ)
オリゴ-R5:AAACCGCAATGATGATCTCCGAATC(配列番号91)(ミスマッチ)
オリゴ-R6:AAACCGCAATGATGATCTCCGGACC(配列番号92)(ミスマッチ)
オリゴ-R7:AAACCGCAATGATGATCTCCAGGCC(配列番号93)(ミスマッチ)
オリゴ-R8:AAACCGCAATGATGATCTCTAAGCC(配列番号94)(ミスマッチ)
オリゴ-R9:AAACCGCAATGATGATCTTTGAGCC(配列番号95)(ミスマッチ)
オリゴ-R10:AAACCGCAATGATGATCCTCGAGCC(配列番号96)(ミスマッチ)
オリゴ-R11:AAACCGCAATGATGATTCCCGAGCC(配列番号97)(ミスマッチ)
オリゴ-R12:AAACCGCAATGATGACTTCCGAGCC(配列番号98)(ミスマッチ)
オリゴ-R13:AAACCGCAATGATGGCCTCCGAGCC(配列番号99)(ミスマッチ)
オリゴ-R14:AAACCGCAATGATAGTCTCCGAGCC(配列番号100)(ミスマッチ)
オリゴ-R15:AAACCGCAATGACAATCTCCGAGCC(配列番号101)(ミスマッチ)
オリゴ-R16:AAACCGCAATGGCGATCTCCGAGCC(配列番号102)(ミスマッチ)
オリゴ-R17:AAACCGCAATAGTGATCTCCGAGCC(配列番号103)(ミスマッチ)
オリゴ-R18:AAACCGCAACAATGATCTCCGAGCC(配列番号104)(ミスマッチ)
オリゴ-R19:AAACCGCAGCGATGATCTCCGAGCC(配列番号105)(ミスマッチ)
オリゴ-R20:AAACCGCGGTGATGATCTCCGAGCC(配列番号106)(ミスマッチ)
オリゴ-R21:AAACCGTGATGATGATCTCCGAGCC(配列番号107)(ミスマッチ)
オリゴ-R22:AAACCATAATGATGATCTCCGAGCC(配列番号108)(ミスマッチ)
オリゴ-R23:AAACTACAATGATGATCTCCGAGCC(配列番号109)(ミスマッチ)。
工程(3):オリゴ一本鎖DNAをアニーリングして二本鎖DNAとした。各アニーリング反応は、100μMのオリゴ-Fを1μL、100μMのオリゴ-Rを1μL、ddH2Oを28μL含んだ。振盪混合後、アニーリング反応をPCR増幅器で行い、0.3℃/秒の冷却速度で、95℃で5分間、85℃で1分間、75℃で1分間、65℃で1分間、55℃で1分間、45℃で1分間、35℃で1分間、25℃で1分間、4℃でかなりの長時間アニーリングプログラムを実行した。
工程(4):製造業者によって提供される説明書に従ってDNAリガーゼを使用することによって、アニーリング産物を、線状化プラスミドpAAV2_SlugCas9-HF_ITRとライゲーションした。
工程(5):ライゲーション産物(1μL)を、化学的にコンピテントな形質転換のために採取し、増殖した細菌クローンを、サンガー配列決定によって検証した。
工程(6):配列決定によって検証された正しくライゲーションされたクローンを振盪下で培養した後、それを用いてさらなる使用のためのプラスミドpAAV2_SlugCas9-HF-hU6-オンターゲットsgRNAおよびプラスミドpAAV2_SlugCas9-HF-hU6-ミスマッチsgRNAを抽出した。
4.GFPレポーターHEK293T細胞株を、それぞれpAAV2_SlugCas9-HF-hU6-オンターゲットsgRNAおよびpAAV2_SlugCas9-HFhU6-ミスマッチsgRNAでトランスフェクトした。特定の工程は以下の通りである。
工程(1):0日目に、トランスフェクションの要件に従って、GFPレポーターHEK293T細胞株を、約30%の細胞密度で6ウェルプレート上にプレーティングした。標的部位の配列は、配列番号110(GGCTCGGAGATCATCATTGCGNNNN)によって表される。
工程(2):1日目に、以下の工程によりトランスフェクションを行った:
i.トランスフェクトするプラスミドpAAV2_SlugCas9-HF-hU6-オンターゲットsgRNA/ミスマッチsgRNAを2μgを採取し、Opti-MEM(登録商標)培地100μLに添加し、穏やかにピペッティングすることによって均質に混合した。
ii.5μLのフリック混合Lipofectamine(登録商標)2000を100μLのOpti-MEM(登録商標)培地にピペッティングし、穏やかに混合し、室温で5分間放置した
iii.希釈したLipofectamine(登録商標)2000および希釈したプラスミドを、穏やかにピペッティングすることによって均質に混合し、室温で20分間放置し、次いで、トランスフェクトする細胞を含む培地に添加した。トランスフェクトする細胞は、配列番号110によって表される配列を含む配列番号111によって表されるCMV-ATG-標的部位-CTGG-GFPヌクレオチド配列を含んだ。
工程(3):5%のCO2のインキュベーター中で細胞を37℃で培養し続けた。
5.フローサイトメトリーによるSlugCas9-HFの編集効率およびオフターゲット率の分析。
工程(1):3日間編集した細胞を回収し、フローサイトメトリーに供した。
工程(2):FlowJo解析ソフトウェアを用いてGFP陽性比を分析し、プロットした。
配列番号111によって表される配列は、以下の通りである:
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGTCTAGAGATCCGACGCCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATGCATGCGAGAAAAGCCTTGTTTGCCACCATGGGCTCGGAGATCATCATTGCGCTGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAAGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGTCTAGAGATCCGACGCCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATGCATGCGAGAAAAGCCTTGTTTGCCACCATGGGCTCGGAGATCATCATTGCGCTGGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAAGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG
図4Kは、GFPレポーターHEK293T細胞株におけるSlugCas9-F遺伝子編集システムの特異性の検出結果を示している。図4から、SlugCas9-HFとsgRNAとの複合体が標的配列(図1に示される配列)を特異的に切断したが、非標的配列(図2-21に示される配列)を本質的に切断することができなかったか、または切断することができなかったことが分かる。したがって、本開示のシステムは、高い特異性および低いオフターゲット率を示す。
Claims (23)
- 細胞内またはin vitroで遺伝子編集を行なうためのCRISPR/Cas9遺伝子編集システムであって、
前記CRISPR/Cas9システムは、Cas9タンパク質とsgRNAとの複合体であり、標的DNA配列の二本鎖切断損傷を引き起こすように標的DNA配列を正確に位置決め且つ切断することができ、
前記Cas9タンパク質が、
配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するSauriCas9タンパク質、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するShaCas9タンパク質、
配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9タンパク質、
配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するSlutCas9タンパク質、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するSa-SauriCas9タンパク質、
配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するSa-SepCas9タンパク質、
配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するSa-SeqCas9タンパク質、
配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するSa-ShaCas9タンパク質、
配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlugCas9タンパク質、
配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlutCas9タンパク質、または
配列番号58で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9-HFタンパク質、または
配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するCas9タンパク質であって、
前記sgRNAが、
配列番号11によって表されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列であるCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。 - 前記細胞が、真核細胞および原核細胞を含み、前記真核細胞が、例えば、哺乳動物細胞および植物細胞を含み、前記哺乳動物細胞が、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスセルトリ細胞、マウス乳房腫瘍細胞、buffaloラット肝細胞、ラット肝細胞腫細胞、SV40形質転換サル腎臓CVI系統、サル腎臓細胞、イヌ腎臓細胞、ヒト子宮頸癌細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、HIH/3T3細胞、ヒトU2-OS骨肉腫細胞、ヒトA549細胞、ヒトK562細胞、ヒトHEK293細胞、ヒトHEK293T細胞、ヒトHCT116細胞、またはヒトMCF-7細胞またはTRI細胞を含む、請求項1に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 前記Cas9タンパク質が、切断活性を有さないか、一本鎖切断活性のみを有するか、または二本鎖切断活性を有するCas9タンパク質を含む、請求項1に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 前記標的DNA配列を正確に位置決めすることが、前記sgRNAの5'末端の20bpまたは21bpの配列と前記標的DNA配列とから相補的な塩基対形成構造を形成することを含む、請求項1記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 前記標的DNA配列を正確に位置決めすることが、前記Cas9タンパク質と前記sgRNAとの複合体によって、前記標的DNA配列上のPAM配列を認識することを含む、請求項1に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 前記SlugCas-HFタンパク質および前記sgRNAの前記複合体中のsgRNAの5'末端の20bpまたは21bp配列が非標的DNA配列と不完全な相補的塩基対合構造を形成することができ、好ましくは、前記非標的配列が前記sgRNAに対して2つ以上の塩基ミスマッチを有する、請求項1に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 前記SlugCas9-HFタンパク質と前記sgRNAとの前記複合体が、前記非標的DNA配列上のPAM配列を認識することができる、請求項6に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 前記SauriCas9タンパク質の場合、前記PAMが、NNGGであり、前記標的DNA配列が、配列番号12によって表され、
前記ShaCas9タンパク質の場合、前記PAMが、NNGRMであり、前記標的DNA配列が、配列番号13によって表され、
前記SlugCas9タンパク質の場合、前記PAMが、NNGGであり、前記標的DNA配列が、配列番号12によって表され、
前記SlutCas9タンパク質の場合、前記PAMが、NNGRであり、前記標的DNA配列が、配列番号14によって表され、
前記Sa-SauriCas9タンパク質の場合、前記PAMが、NNGGであり、前記標的DNA配列が、配列番号12によって表され、
前記Sa-SepCas9タンパク質の場合、前記PAMが、NNGGであり、前記標的DNA配列が、配列番号12によって表され、
前記Sa-SeqCas9タンパク質の場合、前記PAMが、NNGRMであり、前記標的DNA配列が配列番号13によって表され、
前記Sa-ShaCas9タンパク質の場合、前記PAMが、NNGRMであり、前記標的DNA配列が、配列番号13によって表され、
前記Sa-SlugCas9タンパク質の場合、前記PAMが、NNGGであり、前記標的DNA配列が、配列番号12によって表され、
前記Sa-SlutCas9タンパク質の場合、前記PAMが、NNGRRであり、前記標的DNA配列が、配列番号15によって表され、
前記SlugCas9-HFタンパク質の場合、前記PAMが、NNGGであり、前記標的DNA配列が、配列番号12によって表される、請求項5から7のいずれか一項に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。 - 前記sgRNAが、リン酸化、短縮、延長、硫化、メチル化、またはヒドロキシル化によって改変される、請求項1に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 前記Cas9タンパク質と前記sgRNAとの前記複合体が、前記標的DNA配列を正確に位置決めすことができるが、これは、前記Cas9タンパク質および前記sgRNAとの前記複合体が、前記標的DNA配列を認識して結合することができること、または、前記Cas9タンパク質および前記sgRNAとの前記複合体が、前記Cas9タンパク質と融合した他のタンパク質または前記sgRNAを特異的に認識するタンパク質を前記標的DNA配列が位置する場所に運ぶことができることを意味する、請求項1に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 前記Cas9タンパク質と前記sgRNAとの前記複合体、または前記Cas9タンパク質と融合した他のタンパク質、または前記sgRNAを特異的に認識するタンパク質が、前記標的DNA領域に対して改変および調節を行うことができ、前記改変および調節が、遺伝子転写レベルの調節、DNAメチル化調節、DNAアセチル化改変、ヒストンアセチル化改変、単一塩基変換またはクロマチンイメージング追跡を含む、請求項10に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 前記SlugCas9-HFタンパク質と前記sgRNAとの複合体が、前記非標的DNA配列を認識して結合することが本質的にできないか、またはできない、または前記Cas9タンパク質と前記sgRNAとの前記複合体が、前記SlugCas9-HFタンパク質と融合した他のタンパク質または前記sgRNAを特異的に認識するタンパク質を前記非標的DNA配列が位置する場所に運ぶことが本質的にできないか、またはできない、請求項6から8のいずれか一項に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 前記SlugCas9-HFタンパク質と前記sgRNAとの前記複合体、または前記SlugCas9-HFタンパク質と融合した前記他のタンパク質、または前記sgRNAを特異的に認識する前記タンパク質が、非標的DNA領域に対して改変および調節を行うことが本質的にできないか、またはできず、前記改変および調節が、遺伝子転写レベルの調節、DNAメチル化調節、DNAアセチル化改変、ヒストンアセチル化改変、単一塩基変換またはクロマチンイメージング追跡を含む、請求項12に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 前記一塩基変換が、アデニンのグアニンへの変換、シトシンのチミンへの変換、またはシトシンのウラシルへの変換、または他の塩基間の変換を含む、請求項11または13に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システム。
- 請求項1から14のいずれか一項に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムを用いた細胞における遺伝子編集方法であって、
前記方法が、Cas9タンパク質とsgRNAとの複合体を用いて標的DNA配列を認識し、位置決めすることによって標的DNA配列を編集し、
前記方法が、
(1)Cas9遺伝子配列を合成し、それをpAAV2_ITRなどの発現ベクターにクローニングして、前記Cas9遺伝子配列でクローニングされた発現ベクター(例えば、pAAV2_Cas9_ITR)を得る工程であって、
前記Cas9遺伝子配列が、
(a)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、
(b)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、または
(c)ヒト化Cas9遺伝子配列、例えば、配列番号23~32および配列番号112のいずれか1つによって表されるヌクレオチド配列を有するものである工程と;
(2)前記sgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNA、すなわち、オリゴフォワード鎖配列およびオリゴリバース鎖配列を合成し、前記オリゴフォワード鎖配列および前記オリゴリバース鎖配列をアニーリングして、アニーリング産物を前記Cas9遺伝子配列でクローニングされた発現ベクターの消化部位(例えば、プラスミドpAAV2_Cas9_U6_BsaIのBsaI消化部位)とライゲーションして、前記Cas9タンパク質および前記sgRNAを発現させるpAAV2_Cas9_hU6-sgRNAなどの発現ベクターを得る工程であって、
前記sgRNAが、
配列番号11で表されるヌクレオチド配列、または配列番号11で表されるヌクレオチド配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列、または例えば、配列番号11で表されるヌクレオチド配列に基づく、例えば、リン酸化、短縮、延長、硫化、メチル化、またはヒドロキシル化を含む改変を有する工程と;
(3)前記標的部位を編集するための標的部位を含む細胞に前記Cas9タンパク質および前記sgRNAを発現する発現ベクターを送達する工程と;
(4)例えば、編集された標的部位上でPCR増幅し、T7EI消化または次世代配列決定することによって、前記標的部位の編集効率を任意に検出する工程とを含む、遺伝子編集方法。 - 前記pAAV2_Cas9_hU6-sgRNAが、アデノ随伴ウイルス骨格プラスミドであり、AAV2 ITR、CMVエンハンサー、CMVプロモーター、SV40 NLS、Cas9、ヌクレオプラスミンNLS、3x HA、bGHポリ(A)、ヒトU6プロモーター、BsaIエンドヌクレアーゼ部位、およびsgRNA足場配列を含む、請求項15記載の方法。
- 前記細胞に送達される前記CRISPR/Cas9システムが、前記Cas9タンパク質および前記sgRNAを発現するプラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクター、または前記sgRNAおよび前記Cas9タンパク質を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記SlugCas9-HF遺伝子以外の他のCas9遺伝子の場合、前記オリゴフォワード鎖配列および前記オリゴリバース鎖配列が、それぞれ、配列番号16および配列番号17によって表されるヌクレオチド配列を有し、前記SlugCas9-HF遺伝子の場合、前記オリゴフォワード鎖配列および前記オリゴリバース鎖配列が、それぞれ、配列番号59および配列番号60によって表される第1のオリゴフォワード鎖配列および第1のオリゴリバース鎖配列、ならびにそれぞれ、配列番号61および配列番号62によって表される第2のオリゴフォワード鎖配列および第2のオリゴリバース鎖配列を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記SlugCas9-HF遺伝子以外の他のCas9遺伝子の場合、工程(3)における細胞中の標的部位が、配列番号18によって表されるヌクレオチド配列を有し、前記SlugCas9-HF遺伝子の場合、工程(3)における前記細胞中の前記標的部位が、それぞれ配列番号63および配列番号64によって表されるヌクレオチド配列を有する、請求項15に記載の方法。
- 工程(4)におけるPCRテンプレートが、編集されたDNAであり、前記SlugCas9-HF遺伝子以外の他のCas9遺伝子の場合、PCR増幅用プライマー配列が配列番号19、配列番号20、配列番号21、および配列番号22によって表され、前記SlugCas9-HF遺伝子の場合、PCR増幅用プライマー配列が配列番号65、配列番号66、配列番号21、配列番号22、および配列番号67によって表される、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞が、真核細胞および原核細胞を含み、前記真核細胞が、例えば、哺乳動物細胞および植物細胞を含み、前記哺乳動物細胞が、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスセルトリ細胞、マウス乳房腫瘍細胞、buffaloラット肝細胞、ラット肝細胞腫細胞、SV40形質転換サル腎臓CVI系統、サル腎臓細胞、イヌ腎臓細胞、ヒト子宮頸癌細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、HIH/3T3細胞、ヒトU2-OS骨肉腫細胞、ヒトA549細胞、ヒトK562細胞、ヒトHEK293細胞、ヒトHEK293T細胞、ヒトHCT116細胞、またはヒトMCF-7細胞またはTRI細胞を含む、請求項11に記載の方法。
- 遺伝子編集のためのCRISPR/Cas9遺伝子編集システムのキットであって、
(1)Cas9タンパク質およびsgRNAであって、
前記Cas9タンパク質が、
配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するSauriCas9タンパク質、
配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するShaCas9タンパク質、
配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9タンパク質、
配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するSlutCas9タンパク質、
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するSa-SauriCas9タンパク質、
配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するSa-SepCas9タンパク質、
配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するSa-SeqCas9タンパク質、
配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するSa-ShaCas9タンパク質、
配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlugCas9タンパク質、
配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するSa-SlutCas9タンパク質、または
配列番号58で表されるアミノ酸配列を有するSlugCas9-HFタンパク質、または
配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するCas9タンパク質であり、
前記sgRNAが
配列番号11によって表されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列である、Cas9タンパク質およびsgRNA;または
(2)Cas9遺伝子配列およびsgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNAでクローニングされた発現ベクターであって、
前記Cas9遺伝子配列が
(a)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つで表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、
(b)配列番号1~10および配列番号58のいずれか1つによって表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、または
(c)ヒト化Cas9遺伝子配列、例えば、配列番号23~32および配列番号112のいずれか1つによって表されるヌクレオチド配列を有するものであり、
前記sgRNAが、
配列番号11によって表されるヌクレオチド配列、または配列番号11に基づく改変sgRNA配列を有する、Cas9遺伝子配列およびsgRNAに対応するオリゴ一本鎖DNAでクローニングされた発現ベクターを含む、遺伝子編集のためのCRISPR/Cas9遺伝子編集システムのキット。 - 遺伝子ノックアウト、部位特異的塩基変化、部位特異的挿入、遺伝子転写レベルの調節、DNAメチル化の調節、DNAアセチル化の改変、ヒストンアセチル化の改変、一塩基変換またはクロマチンイメージング追跡における、請求項1から14のいずれか一項に記載のCRISPR/Cas9遺伝子編集システムの使用。
Applications Claiming Priority (21)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910731398.9 | 2019-08-08 | ||
CN201910731803.7 | 2019-08-08 | ||
CN201910731398.9A CN110577970B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统及其应用 |
CN201910731803.7A CN110499335B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | CRISPR/SauriCas9基因编辑系统及其应用 |
CN201910731802.2A CN110551763B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用 |
CN201910731390.2 | 2019-08-08 | ||
CN201910731794.1A CN110551762B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | CRISPR/ShaCas9基因编辑系统及其应用 |
CN201910731396.X | 2019-08-08 | ||
CN201910731794.1 | 2019-08-08 | ||
CN201910731802.2 | 2019-08-08 | ||
CN201910731795.6A CN110499334A (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | CRISPR/SlugCas9基因编辑系统及其应用 |
CN201910731412.5 | 2019-08-08 | ||
CN201910731402.1 | 2019-08-08 | ||
CN201910731390.2A CN110551760B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | CRISPR/Sa-SeqCas9基因编辑系统及其应用 |
CN201910731401.7A CN110577971B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | CRISPR/Sa-SauriCas9基因编辑系统及其应用 |
CN201910731396.XA CN110577969B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | CRISPR/Sa-SlugCas9基因编辑系统及其应用 |
CN201910731795.6 | 2019-08-08 | ||
CN201910731402.1A CN110551761B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | CRISPR/Sa-SepCas9基因编辑系统及其应用 |
CN201910731401.7 | 2019-08-08 | ||
CN201910731412.5A CN110577972B (zh) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑系统及其应用 |
PCT/CN2020/107880 WO2021023307A1 (zh) | 2019-08-08 | 2020-08-07 | CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022543451A true JP2022543451A (ja) | 2022-10-12 |
Family
ID=74503329
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022507560A Pending JP2022543451A (ja) | 2019-08-08 | 2020-08-07 | CRISPR/Cas9遺伝子編集システムおよびその適用 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4012037A1 (ja) |
JP (1) | JP2022543451A (ja) |
WO (1) | WO2021023307A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110499334A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-11-26 | 复旦大学 | CRISPR/SlugCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110551763B (zh) * | 2019-08-08 | 2023-03-10 | 复旦大学 | CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110499335B (zh) * | 2019-08-08 | 2023-03-28 | 复旦大学 | CRISPR/SauriCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110577970B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-11-18 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110577971B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-11-18 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-SauriCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110551762B (zh) * | 2019-08-08 | 2023-03-10 | 复旦大学 | CRISPR/ShaCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110577969B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-07-22 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-SlugCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110577972B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-10-11 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110551760B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-11-18 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-SeqCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110551761B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-11-18 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-SepCas9基因编辑系统及其应用 |
EP4144841A1 (en) * | 2021-09-07 | 2023-03-08 | Bayer AG | Novel small rna programmable endonuclease systems with impoved pam specificity and uses thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105950639A (zh) * | 2016-05-04 | 2016-09-21 | 广州美格生物科技有限公司 | 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用 |
US20180155789A1 (en) * | 2014-03-10 | 2018-06-07 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating cep290-associated disease |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK2898075T3 (en) * | 2012-12-12 | 2016-06-27 | Broad Inst Inc | CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF IMPROVED SYSTEMS, PROCEDURES AND ENZYME COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION |
US11427824B2 (en) * | 2016-10-28 | 2022-08-30 | Genethon | Compositions and methods for the treatment of myotonic dystrophy |
JP7211940B2 (ja) * | 2016-10-28 | 2023-01-24 | ジェネトン | 筋緊張性ジストロフィーの治療のための組成物および方法 |
CN110499335B (zh) * | 2019-08-08 | 2023-03-28 | 复旦大学 | CRISPR/SauriCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110577970B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-11-18 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110577971B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-11-18 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-SauriCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110551763B (zh) * | 2019-08-08 | 2023-03-10 | 复旦大学 | CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110551762B (zh) * | 2019-08-08 | 2023-03-10 | 复旦大学 | CRISPR/ShaCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110577969B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-07-22 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-SlugCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110577972B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-10-11 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110551760B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-11-18 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-SeqCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110551761B (zh) * | 2019-08-08 | 2022-11-18 | 复旦大学 | CRISPR/Sa-SepCas9基因编辑系统及其应用 |
CN110499334A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-11-26 | 复旦大学 | CRISPR/SlugCas9基因编辑系统及其应用 |
-
2020
- 2020-08-07 EP EP20849939.2A patent/EP4012037A1/en active Pending
- 2020-08-07 JP JP2022507560A patent/JP2022543451A/ja active Pending
- 2020-08-07 WO PCT/CN2020/107880 patent/WO2021023307A1/zh unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20180155789A1 (en) * | 2014-03-10 | 2018-06-07 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating cep290-associated disease |
CN105950639A (zh) * | 2016-05-04 | 2016-09-21 | 广州美格生物科技有限公司 | 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
CELL, vol. 162, JPN6023013389, 2015, pages 1113 - 1126, ISSN: 0005030324 * |
DATABASE UNIPROT [ONLINE], ACCESSION NO. A0A2T4M4R5, JPN6023013391, 10 April 2019 (2019-04-10), ISSN: 0005030323 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2021023307A1 (zh) | 2021-02-11 |
EP4012037A1 (en) | 2022-06-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2022543451A (ja) | CRISPR/Cas9遺伝子編集システムおよびその適用 | |
CN115651927B (zh) | 编辑rna的方法和组合物 | |
US20180195089A1 (en) | CRISPR Oligonucleotides and Gene Editing | |
US20190038780A1 (en) | Vectors and system for modulating gene expression | |
WO2017215648A1 (zh) | 基因敲除方法 | |
CN114634930A (zh) | 使用rna指导型内切核酸酶改善基因组工程特异性的组合物和方法 | |
CN110551761B (zh) | CRISPR/Sa-SepCas9基因编辑系统及其应用 | |
CN113373130A (zh) | Cas12蛋白、含有Cas12蛋白的基因编辑系统及应用 | |
CN112159801B (zh) | SlugCas9-HF蛋白、含有SlugCas9-HF蛋白的基因编辑系统及应用 | |
CN110577971B (zh) | CRISPR/Sa-SauriCas9基因编辑系统及其应用 | |
CN110551762B (zh) | CRISPR/ShaCas9基因编辑系统及其应用 | |
CN110499335B (zh) | CRISPR/SauriCas9基因编辑系统及其应用 | |
CN110577969B (zh) | CRISPR/Sa-SlugCas9基因编辑系统及其应用 | |
CN114990093B (zh) | 氨基酸序列小的蛋白序列mini rfx-cas13d | |
US20230332184A1 (en) | Template guide rna molecules | |
CN110551763B (zh) | CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用 | |
CN110499334A (zh) | CRISPR/SlugCas9基因编辑系统及其应用 | |
EP4230737A1 (en) | Novel enhanced base editing or revising fusion protein and use thereof | |
CN110577972B (zh) | CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑系统及其应用 | |
CN110551760B (zh) | CRISPR/Sa-SeqCas9基因编辑系统及其应用 | |
JP7109009B2 (ja) | 遺伝子ノックアウト方法 | |
CN110577970B (zh) | CRISPR/Sa-SlutCas9基因编辑系统及其应用 | |
Kheirandish et al. | Efficient site-specific integration in CHO-K1 cells using CRISPR/Cas9-modified donors | |
US20230365992A1 (en) | Novel enhanced base editing or revising fusion protein and use thereof | |
Sheriff et al. | Gene Editing Therapies for Genodermatoses |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220405 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230404 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20231024 |