CN105950639A - 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用 - Google Patents

金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105950639A
CN105950639A CN201610287827.4A CN201610287827A CN105950639A CN 105950639 A CN105950639 A CN 105950639A CN 201610287827 A CN201610287827 A CN 201610287827A CN 105950639 A CN105950639 A CN 105950639A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cas9
grna
staphylococcus aureus
preparation
crispr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610287827.4A
Other languages
English (en)
Inventor
黄军就
梁普平
松阳洲
张曦亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Magigen Biotechnology Corp
Original Assignee
Guangzhou Magigen Biotechnology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Magigen Biotechnology Corp filed Critical Guangzhou Magigen Biotechnology Corp
Priority to CN201610287827.4A priority Critical patent/CN105950639A/zh
Publication of CN105950639A publication Critical patent/CN105950639A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备方法及其在构建基因修饰小鼠模型中的应用。所述金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统由Cas9 mRNA和gRNA两部分组分组成；所述Cas9 mRNA的制备方法是在原始Cas9编码DNA的上游加上T7启动子；所述gRNA的制备方法是在原始gRNA编码序列上游加上T7启动子。将金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA和gRNA通过显微注射的方法注射到小鼠受精卵中，可以对小鼠受精卵进行多种类型的基因编辑修饰，如单基因敲除、多基因敲除和/或基因敲入等，在小鼠等动物受精卵基因编辑修饰工作以及动物模型的构建方面，具有很好的应用前景。

Description

金黄色葡萄球菌 CRISPR/Cas9 系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及是金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统组分的制备及其在构建基因修饰小鼠模型中的应用。
背景技术
2003年完成的人类基因组计划掀起了基因功能研究的热潮，使得功能基因组学成为生命科学研究的焦点。小鼠由于在解剖结构、生理以及基因组上与人类具有高度的相似性，而成为解析人类基因功能的重要工具。20世纪80年代末，小鼠基因敲除技术的出现，使得我们第一次可以精确修饰小鼠基因组，利用小鼠构建人类疾病模型，为阐明疾病的发病机理、疾病的预防和治疗提供了最有力的证据。尤其是对于癌基因的修饰，极大地促进了人们对肿瘤的发生、发展及治疗的认识。而2013年首次出现的CRISPR/Cas9系统更是极大地促进了基因敲除小鼠模型的构建。
CRISPR/Cas9系统是一项新的人工核酸酶技术，其是由gRNA（guide RNA）和Cas9蛋白组成的复合物。在靶位点3’末端PAM（Protospacer adjacent motif）序列的帮助下，该gRNA-Cas9蛋白复合物通过 gRNA 5’末端的20个碱基与靶DNA结合，从而将内切核酸酶Cas9招募到靶位点处，切割靶DNA，从而编辑靶基因。与锌指核酸酶和TALEN核酸酶通过蛋白-DNA相互作用来寻靶不同，CRISPR/Cas9技术是利用RNA-DNA杂交来寻靶。目前最常用的CRISPR/Cas9系统是来源于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的II型CRISPR/Cas系统。化脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的II型CRISPR/Cas系统比较简单，其主要由Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA(trans-activating crRNA)组成。crRNA和tracrRNA结合形成二聚体，并与Cas9蛋白结合，最终形成有活性的CRISPR/Cas9复合物，从而切割靶DNA。此外，crRNA和tracrRNA的二聚体，可以用具有发卡结构的gRNA来替代。化脓链球菌的CRISPR/Cas9系统只能够识别包含由NGG构成的PAM（Protospacer adjacent motif）序列的靶DNA。这就限制了化脓链球菌的CRISPR/Cas9系统可以靶向的序列范围。虽然，后续研究通过对化脓链球菌的Cas9蛋白进行定点突变，使得化脓链球菌的CRISPR/Cas9可以识别由NGAN构成的PAM序列，但化脓链球菌的CRISPR/Cas9系统的靶向范围依然有限。
最近，科学家从一种能导致皮肤和软组织感染的革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中发现了新的CRISPR/Cas9系统。该CRISPR/Cas9系统能够识别由NNGRRT构成的PAM序列，这就扩展了CRISPR/Cas9系统可以靶向的序列范围。但是，金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统是否能够在小鼠受精卵中进行基因编辑仍然不清楚，金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统组分的Cas9 mRNA和gRNA的制备方法仍未建立，严重制约了金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统在基因修饰小鼠模型构建中的应用。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷和不足，提供一种制备金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统组分的方法。具体涉及用金黄色葡萄球菌的CRISPR/Cas9系统Cas9编码DNA和gRNA的序列信息，通过PCR扩增和体外转录的方法制备金黄色葡萄球菌的Cas9 mRNA和gRNA，并将金黄色葡萄球菌的CRISPR/Cas9系统应用到小鼠受精卵基因编辑中，进行基因修饰小鼠模型的构建。
本发明目的是提供一种金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统组分的制备方法。
本发明的另一目的是提供上述方法制备得到的金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统及其组分。
本发明的再一目的是提供上述金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统及其组分在构建基因修饰小鼠模型中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备方法，所述金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统由Cas9 mRNA和gRNA两部分组分组成；所述Cas9 mRNA的制备方法是在原始Cas9编码DNA的上游加上T7启动子；所述gRNA的制备方法是在原始gRNA编码序列上游加上T7启动子。
优选地，所述Cas9 mRNA的制备方法是先通过PCR的方式在原始Cas9编码DNA的上游加上T7启动子的DNA序列，然后以PCR产物为模板制备Cas9 mRNA；所述gRNA的制备方法是先通过PCR的方式在原始gRNA编码序列上游加上T7启动子的DNA序列，再以PCR产物为模板制备gRNA。
其中，优选地，制备Cas9 mRNA或gRNA所用的PCR的引物分别为：Cas9上游引物和Cas9下游引物、gRNA上游引物和gRNA下游引物；所述Cas9上游引物和gRNA上游引物的5’端均加上T7启动子的序列，所述Cas9下游引物和gRNA下游引物分别与Cas9编码DNA和gRNA编码DNA的3’端互补配对。
优选地，所述Cas9上游引物和Cas9下游引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述gRNA上游引物和gRNA下游引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
更优选地，所述Cas9 mRNA的制备方法是：（1）制备包含T7启动子的金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA；（2）制备金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA；
更具体优选地，步骤（1）制备包含T7启动子的金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA的方法是：利用合成的Cas9上游引物和Cas9下游引物，以包含金黄色葡萄球菌Cas9编码DNA序列的质粒PX601（购自Addgene）为模板，通过PCR的方法扩增出包含T7启动子的金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA；PCR产物纯化后用不含核酸酶的水洗脱，即可获得包含T7启动子的金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA；
步骤（2）制备金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA的方法是：以包含T7启动子的金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA为模板，转录生产金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA，然后纯化并用不含核酸酶的水洗脱，即可获得金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA。
更优选地，所述gRNA的制备方法是（1）制备包含T7启动子的金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA；（2）制备金黄色葡萄球菌gRNA；
更具体优选地，步骤（1）制备包含T7启动子的金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA的方法是：利用合成的gRNA上游引物和gRNA下游引物，以包含金黄色葡萄球菌gRNA编码DNA序列的质粒PX601(购自Addgene)为模板，通过PCR方法扩增出包含T7启动子的金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA，PCR产物纯化后用不含核酸酶的水洗脱，即可获得包含T7启动子的金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA；
步骤（2）制备金黄色葡萄球菌gRNA的方法是：以包含T7启动子的金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA为模板，转录生产金黄色葡萄球菌gRNA，再纯化并用不含核酸酶的水洗脱，即可获得金黄色葡萄球菌gRNA。
另外，由上述方法制备得到的金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统也在本发明的保护范围之内。所述金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统包括组分Cas9 mRNA和gRNA，所述Cas9 mRNA的长度为3264 nt，所述gRNA长度为106 nt。
进一步地，所述Cas9 mRNA的序列如SEQ ID NO.5所示，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明以PX601质粒载体为模板，通过PCR的方式制备了金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA和gRNA的转录模板DNA，并以该模板DNA制备了Cas9 mRNA和gRNA；所述Cas9 mRNA和gRNA组成的金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统可应用于小鼠等动物模型的基因修饰，比如如下的应用：1）在小鼠受精卵中进行单基因的敲除；2）在小鼠受精卵中进行多基因同时敲除；3）在小鼠受精卵中进行基因的敲入。
另外，上述金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统在构建基因修饰小鼠模型中的应用，也在本发明的额保护范围之内。
进一步优选地，所述基因修饰是指在小鼠受精卵中进行单基因敲除、多基因敲除和/或基因敲入。
因此，金黄色葡萄球菌CRISPR-Cas9系统在对小鼠受精卵进行单基因敲除、多基因敲除和/或基因敲入方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
作为一种具体的可实施方案，所述应用的方法是将Cas9 mRNA和gRNA共注射到小鼠受精卵中。
优选地，所述共注射是将Cas9 mRNA和gRNA混合在一起，并注射到小鼠受精卵中；所述注射的方法可以是受精卵胞质注射或受精卵的原核注射等。
将金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA和gRNA共注射到小鼠受精卵中，可以实现单基因、多基因的敲除；将金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA、gRNA和基因修复模板共注射到小鼠受精卵中，还可以实现精确的基因敲入。
因此，本发明将促进以金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9为工具，进行小鼠受精卵基因编辑的工作，促进疾病动物模型的构建。本发明制备的金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统在小鼠受精卵基因编辑的工作以及动物模型的构建方面的应用，都应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种制备金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统组分的方法，获得的Cas9 mRNA和gRNA组成的金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统能够应用于基因修饰及小鼠等动物模型的构建。
将金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA和gRNA通过显微注射的方法注射到小鼠受精卵中，可以对小鼠受精卵进行多种类型的基因编辑，如单基因敲除、多基因敲除和/或基因敲入等，在小鼠等动物受精卵基因编辑的工作以及动物模型的构建方面，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为金黄色葡萄球菌Cas9和gRNA转录模板DNA的琼脂糖凝胶电泳图；图1A为Cas9转录模板DNA电泳图，左侧的泳道为DNA分子Marker，右侧为PCR扩增出的Cas9转录模板DNA；图1B为gRNA转录模板DNA电泳图，左侧的泳道为DNA分子Marker，右侧为PCR扩增出的gRNA转录模板DNA。
图2为金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA和gRNA的制备结果（琼脂糖凝胶电泳结果）；图2A为Cas9 mRNA电泳图，左侧的泳道为DNA分子Marker，右侧为Cas9 mRNA；图2B为gRNA电泳图，左侧的泳道为DNA分子Marker，右侧4条泳道均为gRNA。
图3为金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统介导的Tyr单基因敲除；图3A通过T7内切核酸酶Ⅰ切割Tyr位点，从而鉴定Tyr敲除小鼠；图中三角形标注了不能被T7内切核酸酶Ⅰ切割的产物；WT是野生型小鼠对照；图3B是Tyr敲除小鼠的照片，Tyr基因敲除小鼠毛色为白色，野生型为黑色；图3C是金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9介导Tyr单基因敲除效率的统计。
图4为金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统介导的Slx2，ZP1，Tyr三基因敲除；图4A通过T7内切核酸酶Ⅰ切割Slx2，ZP1，Tyr位点，从而鉴定基因敲除小鼠；图中三角形标注了不能被T7内切核酸酶Ⅰ切割的产物；图4B是金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9介导多基因敲除效率的统计。
图5为金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统介导的精确基因敲入；图5A是基因敲入的策略图，Oligo donor是敲入2×Flag编码序列和StuI酶切位点的单链DNA修复模板；H1c-Sa-gRNA为gRNA的靶向位点；图5B为限制性片段长度多态性实验鉴定结果，*号标注了成功敲入的胚胎；图5C为TA克隆测序的结果，结果显示2×Flag编码序列和StuI酶切位点被精确地敲入到H1c基因的C端。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。
实施例 1 金黄色葡萄球菌 CRISPR/Cas9 系统组分 Cas9 mRNA 和 gRNA 的制备
1、Cas9 mRNA和gRNA的制备
（1）所述Cas9 mRNA的制备方法是：（1）制备包含T7启动子的金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA；（2）制备金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA；
更具体优选地，步骤（1）制备包含T7启动子的金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA的方法是：利用合成的Cas9上游引物和Cas9下游引物，以包含金黄色葡萄球菌Cas9编码DNA序列的质粒PX601(购自Addgene)为模板，通过PCR的方法扩增出包含T7启动子的金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA；PCR产物再用PCR产物纯化试剂盒（Axygen）进行过柱纯化，然后用不含核酸酶的水洗脱，即可获得包含T7启动子的金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA；
步骤（2）制备金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA的方法是：以包含T7启动子的金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA为模板，用mMESSAGEmMACHINE T7 ULTRA kit (Life Technologies)转录生产金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA；然后，再用RNA纯化试剂盒纯化Cas9 mRNA(Qiagen)，并用不含核酸酶的水洗脱Cas9 mRNA，即可获得金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA。
（2）所述gRNA的制备方法是（1）制备包含T7启动子的金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA；（2）制备金黄色葡萄球菌gRNA；
更具体地，步骤（1）制备包含T7启动子的金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA的方法是：利用合成的gRNA上游引物和gRNA下游引物，以包含金黄色葡萄球菌gRNA编码DNA序列的质粒PX601为模板，通过PCR方法扩增出包含T7启动子的金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA。PCR产物再用PCR产物纯化试剂盒（Axygen）进行过柱纯化，然后用不含核酸酶的水洗脱，即可获得包含T7启动子的金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA；
步骤（2）制备金黄色葡萄球菌gRNA的方法是：以包含T7启动子的金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA为模板，用MEGAshortscript T7 kit (Life Technologies)转录生产金黄色葡萄球菌gRNA。再用RNA纯化试剂盒纯化gRNA(Qiagen)，并用不含核酸酶的水洗脱gRNA，即可获得金黄色葡萄球菌gRNA。
2、具体地，上述Cas9 mRNA和gRNA的制备方法的操作程序如下：
（1）金黄色葡萄球菌Cas9和gRNA转录模板DNA的制备：
1）金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA的制备
以Cas9上游引物和Cas9下游引物作为引物对，以包含金黄色葡萄球菌Cas9编码DNA序列的质粒PX601(购自Addgene)为PCR模板，按照如下反应体系和反应程序进行PCR扩增，扩增出包含T7启动子的金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA。
表1 反应体系
表2 反应程序
2）金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA的制备。
以gRNA上游引物和gRNA下游引物作为引物对，以PX601为PCR模板，按照如下体系和反应程序进行PCR扩增，扩增出金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA。
表3 反应体系
表4 反应程序
3）结果如附图1，显示了金黄色葡萄球菌Cas9和gRNA转录模板DNA的琼脂糖凝胶电泳结果。
（2）金黄色葡萄球菌Cas9和gRNA转录模板DNA的纯化
按AxyPrep PCR cleanup kit的操作手册进行实验。
1）在PCR反应液中，加3个体积的Buffer PCR-A并混匀，然后转移到DNA制备管，将DNA制备管置于2 ml离心管中，12,000 g离心1 min，将滤液弃掉。
2）将制备管放回2 ml离心管中，加700 μl Buffer W2，12000 g离心1 min，将滤液弃掉。
3）将制备管放回2 ml离心管中，加400 μl Buffer W2，12000 g离心1 min，弃滤液。
4）12,000 g离心3 min，使Buffer W2中的乙醇充分弃掉。
5）将制备管置于新的1.5 ml离心管中，在制备管中央加25-30 μl的无核酸酶的水，静置1 min。12000 g离心1 min（无核酸酶的水用前先65 ℃预热）。
（3）金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA和gRNA的制备和纯化。
1）金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA的转录。
以金黄色葡萄球菌Cas9转录模板DNA为模板，利用mMESSAGEmMACHINE T7 ULTRA kit (Life Technologies)，按照如下表5所示体系配制反应体系。
表5 反应体系
37℃反应2 h，案后往反应体系中加1μl TURBO DNase, 37℃反应15min。终止反应后，再往表6所示反应体系中加入如下成分加poly A尾。
表6 反应体系
37℃反应45min，然后置于冰上。
2）金黄色葡萄球菌gRNA的转录。
以金黄色葡萄球菌gRNA转录模板DNA为模板，利用MEGAshortscript T7 kit (Life Technologies)，按照如下表7所示体系配制反应体系。
表7 反应体系
37℃反应2 h，案后往反应体系中加1μl TURBO DNase, 37℃反应15min。
3）金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA和gRNA的纯化，用Qiagen的RNaeasy Kit纯化，按照如下步骤进行：
a. 加ddH2O使得起始RNA的体积为100μl，混匀。
b. 加350μl Binding Solution Concentrate到RNA样品中，并混匀。
c. 加250μl 100%乙醇，并混匀。
d. 将样品转移到柱子中，12000g离心15s。
e. 用500μl Wash Solution洗两次，12000g离心15s。
f. 加50μlddH2O将RNA从柱子上洗脱下来。
4）结果如图2所示，图2显示了金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA和gRNA的琼脂糖凝胶电泳结果。
实施例 2 金黄色葡萄球菌 CRISPR/Cas9 系统介导的 Tyr 单基因敲除
1、为了利用金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统在小鼠受精卵中实现单基因敲除，我们针对Tyr基因设计了一条gRNA。Tyr基因的敲除会使得崽鼠的毛色由黑色变成白色，从而有利于快速鉴定基因敲除小鼠。首先，我们转录了Tyr的gRNA，然后将Tyr gRNA (50ng/μl) 与金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA(100 ng/μl)混匀后一起注射到0.5天的小鼠受精卵中。注射后，再将小鼠受精卵移植到0.5天假孕鼠的输卵管中，待20天之后，假孕鼠便会产下崽鼠。通过将靶位点用PCR的方式扩增出来，然后利用T7内切核酸酶Ⅰ切割PCR产物(T7E1实验)，我们发现81.8% (9/11)的小鼠为Tyr基因敲除小鼠。同时，我们还观察了崽鼠的毛色，结果显示金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA和gRNA能够高效介导Tyr基因的敲除，从毛色上我们发现敲除效率约为72.7%（8/11），由于在1只崽鼠中Tyr敲除的并不完全，导致该敲除小鼠的毛色仍然为黑色。
2、结果如附图3所示。
图3A通过T7内切核酸酶Ⅰ切割Tyr位点，从而鉴定Tyr敲除小鼠；图中三角形标注了不能被T7内切核酸酶Ⅰ切割的产物；WT是野生型小鼠对照；图3B是Tyr敲除小鼠的照片，Tyr基因敲除小鼠毛色为白色，野生型为黑色；图3C是金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9介导Tyr单基因敲除效率的统计。
图3的结果显示了，本发明制备的金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统能在小鼠受精卵中高效进行单基因敲除。
实施例 3 金黄色葡萄球菌 CRISPR/Cas9 系统介导的 Slx2 ， ZP1 ， Tyr 三基因敲除
1、为了利用金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统在小鼠受精卵中实现多基因同时敲除，我们分别设计了针对Slx2，ZP1，Tyr基因的gRNA。然后将这三条gRNA（每条浓度为50 ng/μl）与金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA（100 ng/μl）混匀后一起注射到0.5天的小鼠受精卵中。然后，将这些小鼠受精卵培养到3.5天，再通过全基因组扩增的方法分别扩增单个胚胎的基因组DNA。然后，以该扩增产物为模板，通过PCR的方式扩增Slx2，ZP1，Tyr靶位点，并利用T7内切核酸酶Ⅰ切割该PCR产物，我们发现金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统能够在小鼠受精卵中高效实现三基因的敲除（46.7%，14/30）。
2、结果如附图4所示。
图4A通过T7内切核酸酶Ⅰ切割Slx2，ZP1，Tyr位点，从而鉴定基因敲除小鼠；图中三角形标注了不能被T7内切核酸酶Ⅰ切割的产物；图4B是金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9介导多基因敲除效率的统计。
图4的结果显示了，金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统能在小鼠受精卵中高效进行多基因的敲除。
实施例 4 金黄色葡萄球菌 CRISPR/Cas9 系统介导的精确基因敲入
1、为了利用金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统在小鼠受精卵中进行基因敲入，我们设计了一条针对组蛋白H1c基因末端的gRNA，以及一条包含2×Flag编码序列、StuI酶切位点和两端各30nt同源臂的单链DNA寡聚核苷酸作为基因修复模板。然后，将gRNA（50 ng/μl)、金黄色葡萄球菌Cas9 mRNA(100 ng/μl)和修复模板混匀后一起注射到0.5天的小鼠受精卵中。然后，将这些小鼠受精卵培养到3.5天。3.5天时，再通过PCR的方式扩增H1c位点，并用StuⅠ切割PCR产物，我们发现12个胚胎中有两个插入了StuⅠ的酶切位点。我们进一步将这两个阳性胚胎的PCR产物克隆到T载体中，并进行测序，我们发现，2×Flag编码序列和StuI酶切位点确实被精确敲入到H1c的末端，基因敲入的效率为16.7% (2/12)。
2、结果如附图5所示。
图5A是基因敲入的策略图，Oligo donor是敲入2×Flag编码序列和StuI酶切位点的单链DNA修复模板；H1c-Sa-gRNA为gRNA的靶向位点；图5B为限制性片段长度多态性实验鉴定结果，*号标注了成功敲入的胚胎；图5C为TA克隆测序的结果，结果显示2×Flag编码序列和StuI酶切位点被精确地敲入到H1c基因的C端。
图5的结果显示了，金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统能在小鼠受精卵中高效地进行基因敲入。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州美格生物科技有限公司
<120> 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Cas9上游引物
<400> 1
taatacgact cactataggg agaatggccc caaagaagaa gc 42
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Cas9下游引物
<400> 2
ttaggatccc tttttctttt ttgc 24
<210> 3
<211> 69
<212> DNA
<213> gRNA上游引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(44)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
tgtaatacga ctcactatag gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngtttta gtactctgga 60
aacagaatc 69
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> gRNA下游引物
<400> 4
aaaaatctcg ccaacaagtt 20
<210> 5
<211> 3264
<212> RNA
<213> Cas9 mRNA的序列
<400> 5
auggccccaa agaagaagcg gaaggucggu auccacggag ucccagcagc caagcggaac 60
uacauccugg gccuggacau cggcaucacc agcgugggcu acggcaucau cgacuacgag 120
acacgggacg ugaucgaugc cggcgugcgg cuguucaaag aggccaacgu ggaaaacaac 180
gagggcaggc ggagcaagag aggcgccaga aggcugaagc ggcggaggcg gcauagaauc 240
cagagaguga agaagcugcu guucgacuac aaccugcuga ccgaccacag cgagcugagc 300
ggcaucaacc ccuacgaggc cagagugaag ggccugagcc agaagcugag cgaggaagag 360
uucucugccg cccugcugca ccuggccaag agaagaggcg ugcacaacgu gaacgaggug 420
gaagaggaca ccggcaacga gcuguccacc aaagagcaga ucagccggaa cagcaaggcc 480
cuggaagaga aauacguggc cgaacugcag cuggaacggc ugaagaaaga cggcgaagug 540
cggggcagca ucaacagauu caagaccagc gacuacguga aagaagccaa acagcugcug 600
aaggugcaga aggccuacca ccagcuggac cagagcuuca ucgacaccua caucgaccug 660
cuggaaaccc ggcggaccua cuaugaggga ccuggcgagg gcagccccuu cggcuggaag 720
gacaucaaag aaugguacga gaugcugaug ggccacugca ccuacuuccc cgaggaacug 780
cggagcguga aguacgccua caacgccgac cuguacaacg cccugaacga ccugaacaau 840
cucgugauca ccagggacga gaacgagaag cuggaauauu acgagaaguu ccagaucauc 900
gagaacgugu ucaagcagaa gaagaagccc acccugaagc agaucgccaa agaaauccuc 960
gugaacgaag aggauauuaa gggcuacaga gugaccagca ccggcaagcc cgaguucacc 1020
aaccugaagg uguaccacga caucaaggac auuaccgccc ggaaagagau uauugagaac 1080
gccgagcugc uggaucagau ugccaagauc cugaccaucu accagagcag cgaggacauc 1140
caggaagaac ugaccaaucu gaacuccgag cugacccagg aagagaucga gcagaucucu 1200
aaucugaagg gcuauaccgg cacccacaac cugagccuga aggccaucaa ccugauccug 1260
gacgagcugu ggcacaccaa cgacaaccag aucgcuaucu ucaaccggcu gaagcuggug 1320
cccaagaagg uggaccuguc ccagcagaaa gagaucccca ccacccuggu ggacgacuuc 1380
auccugagcc ccgucgugaa gagaagcuuc auccagagca ucaaagugau caacgccauc 1440
aucaagaagu acggccugcc caacgacauc auuaucgagc uggcccgcga gaagaacucc 1500
aaggacgccc agaaaaugau caacgagaug cagaagcgga accggcagac caacgagcgg 1560
aucgaggaaa ucauccggac caccggcaaa gagaacgcca aguaccugau cgagaagauc 1620
aagcugcacg acaugcagga aggcaagugc cuguacagcc uggaagccau cccucuggaa 1680
gaucugcuga acaaccccuu caacuaugag guggaccaca ucauccccag aagcgugucc 1740
uucgacaaca gcuucaacaa caaggugcuc gugaagcagg aagaaaacag caagaagggc 1800
aaccggaccc cauuccagua ccugagcagc agcgacagca agaucagcua cgaaaccuuc 1860
aagaagcaca uccugaaucu ggccaagggc aagggcagaa ucagcaagac caagaaagag 1920
uaucugcugg aagaacggga caucaacagg uucuccgugc agaaagacuu caucaaccgg 1980
aaccuggugg auaccagaua cgccaccaga ggccugauga accugcugcg gagcuacuuc 2040
agagugaaca accuggacgu gaaagugaag uccaucaaug gcggcuucac cagcuuucug 2100
cggcggaagu ggaaguuuaa gaaagagcgg aacaaggggu acaagcacca cgccgaggac 2160
gcccugauca uugccaacgc cgauuucauc uucaaagagu ggaagaaacu ggacaaggcc 2220
aaaaaaguga uggaaaacca gauguucgag gaaaagcagg ccgagagcau gcccgagauc 2280
gaaaccgagc aggaguacaa agagaucuuc aucacccccc accagaucaa gcacauuaag 2340
gacuucaagg acuacaagua cagccaccgg guggacaaga agccuaauag agagcugauu 2400
aacgacaccc uguacuccac ccggaaggac gacaagggca acacccugau cgugaacaau 2460
cugaacggcc uguacgacaa ggacaaugac aagcugaaaa agcugaucaa caagagcccc 2520
gaaaagcugc ugauguacca ccacgacccc cagaccuacc agaaacugaa gcugauuaug 2580
gaacaguacg gcgacgagaa gaauccccug uacaaguacu acgaggaaac cgggaacuac 2640
cugaccaagu acuccaaaaa ggacaacggc cccgugauca agaagauuaa guauuacggc 2700
aacaaacuga acgcccaucu ggacaucacc gacgacuacc ccaacagcag aaacaagguc 2760
gugaagcugu cccugaagcc cuacagauuc gacguguacc uggacaaugg cguguacaag 2820
uucgugaccg ugaagaaucu ggaugugauc aaaaaagaaa acuacuacga agugaauagc 2880
aagugcuaug aggaagcuaa gaagcugaag aagaucagca accaggccga guuuaucgcc 2940
uccuucuaca acaacgaucu gaucaagauc aacggcgagc uguauagagu gaucggcgug 3000
aacaacgacc ugcugaaccg gaucgaagug aacaugaucg acaucaccua ccgcgaguac 3060
cuggaaaaca ugaacgacaa gaggcccccc aggaucauua agacaaucgc cuccaagacc 3120
cagagcauua agaaguacag cacagacauu cugggcaacc uguaugaagu gaaaucuaag 3180
aagcacccuc agaucaucaa aaagggcaaa aggccggcgg ccacgaaaaa ggccggccag 3240
gcaaaaaaga aaaagggauc cuaa 3264
<210> 6
<211> 104
<212> RNA
<213> gRNA的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 6
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnguuuuag uacucuggaa acagaaucua cuaaaacaag 60
gcaaaaugcc guguuuaucu cgucaacuug uuggcgagau uuuu 104

Claims (10)

1.一种金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统由Cas9 mRNA和gRNA两部分组分组成；所述Cas9 mRNA的制备方法是在原始Cas9编码DNA的上游加上T7启动子；所述gRNA的制备方法是在原始gRNA编码序列上游加上T7启动子。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Cas9 mRNA的制备方法是先通过PCR的方式在原始Cas9编码DNA的上游加上T7启动子的DNA序列，然后以PCR产物为模板制备Cas9 mRNA；所述gRNA的制备方法是先通过PCR的方式在原始gRNA编码序列上游加上T7启动子的DNA序列，再以PCR产物为模板制备gRNA。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备Cas9 mRNA或gRNA所用的PCR的引物分别为：Cas9上游引物和Cas9下游引物、gRNA上游引物和gRNA下游引物；所述Cas9上游引物和gRNA上游引物的5’端均加上T7启动子的序列，所述Cas9下游引物和gRNA下游引物分别与Cas9编码DNA和gRNA编码DNA的3’端互补配对。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述Cas9上游引物和Cas9下游引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述gRNA上游引物和gRNA下游引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
5. 根据权利要求1所述制备方法制备得到的金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统，包括组分Cas9 mRNA和gRNA，其特征在于，所述Cas9 mRNA的长度为3264 nt，所述gRNA长度为104 nt。
6. 根据权利要求5所述的金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述Cas9 mRNA的序列如SEQ ID NO.5所示，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.6所示。
7. 权利要求5所述金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统在构建基因修饰小鼠模型中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基因修饰是指在小鼠受精卵中进行单基因敲除、多基因敲除和/或基因敲入。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，应用的方法是将Cas9 mRNA和gRNA共注射到小鼠受精卵中。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述共注射是将Cas9 mRNA和gRNA混合在一起，并注射到小鼠受精卵中；所述注射的方法包括受精卵胞质注射或受精卵的原核注射。
CN201610287827.4A 2016-05-04 2016-05-04 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用 Pending CN105950639A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610287827.4A CN105950639A (zh) 2016-05-04 2016-05-04 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610287827.4A CN105950639A (zh) 2016-05-04 2016-05-04 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105950639A true CN105950639A (zh) 2016-09-21

Family

ID=56913342

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610287827.4A Pending CN105950639A (zh) 2016-05-04 2016-05-04 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105950639A (zh)

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834330A (zh) * 2016-12-30 2017-06-13 上海科技大学 一种pCasSA质粒及其应用
CN107384920A (zh) * 2017-05-10 2017-11-24 中山大学 一套基于化脓性链球菌的碱基编辑系统及其在基因编辑中的应用
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
CN107475300A (zh) * 2017-09-18 2017-12-15 上海市同济医院 Ifit3‑eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
CN108174823A (zh) * 2018-02-01 2018-06-19 中国检验检疫科学研究院 一种孕烷x受体转基因小鼠模型、其构建方法及其应用
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
CN109715804A (zh) * 2016-09-23 2019-05-03 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于宿主细胞的指导rna表达系统
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
CN110590909A (zh) * 2019-09-16 2019-12-20 江苏省农业科学院 一种穿透肽及其在敲除金黄色葡萄球菌黏附因子中的应用
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
JP2022543451A (ja) * 2019-08-08 2022-10-12 ▲復▼旦大学 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムおよびその適用
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US12084663B2 (en) 2022-11-14 2024-09-10 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104342457A (zh) * 2014-10-17 2015-02-11 杭州师范大学 一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法
CN104531705A (zh) * 2014-12-09 2015-04-22 中国农业大学 利用CRISPR-Cas9系统敲除动物myostatin基因的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104342457A (zh) * 2014-10-17 2015-02-11 杭州师范大学 一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法
CN104531705A (zh) * 2014-12-09 2015-04-22 中国农业大学 利用CRISPR-Cas9系统敲除动物myostatin基因的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F.ANN.RAN等: "In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9", 《NATURE》 *
刘宣等: "应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA-301a敲除小鼠", 《第二军医大学学报》 *

Cited By (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12006520B2 (en) 2011-07-22 2024-06-11 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US11920181B2 (en) 2013-08-09 2024-03-05 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US10954548B2 (en) 2013-08-09 2021-03-23 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US11299755B2 (en) 2013-09-06 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Switchable CAS9 nucleases and uses thereof
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10912833B2 (en) 2013-09-06 2021-02-09 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US10682410B2 (en) 2013-09-06 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
US11124782B2 (en) 2013-12-12 2021-09-21 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US11578343B2 (en) 2014-07-30 2023-02-14 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US12043852B2 (en) 2015-10-23 2024-07-23 President And Fellows Of Harvard College Evolved Cas9 proteins for gene editing
US11214780B2 (en) 2015-10-23 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10947530B2 (en) 2016-08-03 2021-03-16 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11702651B2 (en) 2016-08-03 2023-07-18 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11999947B2 (en) 2016-08-03 2024-06-04 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN109715804A (zh) * 2016-09-23 2019-05-03 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于宿主细胞的指导rna表达系统
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11820969B2 (en) 2016-12-23 2023-11-21 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
CN106834330B (zh) * 2016-12-30 2020-07-31 上海科技大学 一种pCasSA质粒及其应用
CN106834330A (zh) * 2016-12-30 2017-06-13 上海科技大学 一种pCasSA质粒及其应用
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
CN107384920A (zh) * 2017-05-10 2017-11-24 中山大学 一套基于化脓性链球菌的碱基编辑系统及其在基因编辑中的应用
CN107384920B (zh) * 2017-05-10 2020-07-14 中山大学 一套基于化脓性链球菌的碱基编辑系统及其在基因编辑中的应用
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11932884B2 (en) 2017-08-30 2024-03-19 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CN107475300A (zh) * 2017-09-18 2017-12-15 上海市同济医院 Ifit3‑eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
CN107475300B (zh) * 2017-09-18 2020-04-21 上海市同济医院 Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN108174823A (zh) * 2018-02-01 2018-06-19 中国检验检疫科学研究院 一种孕烷x受体转基因小鼠模型、其构建方法及其应用
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11795452B2 (en) 2019-03-19 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11643652B2 (en) 2019-03-19 2023-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
JP2022543451A (ja) * 2019-08-08 2022-10-12 ▲復▼旦大学 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムおよびその適用
CN110590909A (zh) * 2019-09-16 2019-12-20 江苏省农业科学院 一种穿透肽及其在敲除金黄色葡萄球菌黏附因子中的应用
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US12031126B2 (en) 2020-05-08 2024-07-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US12084663B2 (en) 2022-11-14 2024-09-10 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105950639A (zh) 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用
CN108441520B (zh) 利用CRISPR/Cas9系统构建的基因条件性敲除方法
Ceasar et al. Insert, remove or replace: A highly advanced genome editing system using CRISPR/Cas9
JP6700306B2 (ja) 受精前の卵細胞、受精卵、及び標的遺伝子の改変方法
US8907157B2 (en) Methods for producing transgenic rodents having recombinant immunoglobulin loci
CN109475109A (zh) 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
EP3546575B1 (en) Genome editing method
CN107208078A (zh) 使用成对向导rna进行靶向遗传修饰的方法和组合物
CN107208113A (zh) 用于通过单步多重靶向进行靶向遗传修饰的方法和组合物
JP6958917B2 (ja) 遺伝子ノックイン細胞の作製方法
CN106282231B (zh) 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用
WO2020077930A1 (zh) 一种应用Cas9技术制备CKO/KI动物模型的方法
CN104611368A (zh) 重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用
CN111094573A (zh) 有效靶向敲入或基因置换的材料和方法
CN109652459B (zh) 一种基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因编辑方法
CN105925579A (zh) 一对特异性识别猪IGF2基因内含子的sgRNA及其编码DNA与应用
CN108559731A (zh) 一种可调控基因表达的人类胚胎干细胞系及其应用
Nakamura et al. Transplacental delivery of genome editing components causes mutations in embryonic cardiomyocytes of mid‐gestational murine fetuses
JP2023544987A (ja) 編集効率が向上したプライム編集ベースの遺伝子編集用組成物およびその用途
CN114410630B (zh) 一种tbc1d8b基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用
CN114480497B (zh) 一种ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建及其应用的方法
Wang et al. Molecular and cellular evidence for biased mitotic gene conversion in hybrid scallop
CN113564145B (zh) 用于胞嘧啶碱基编辑的融合蛋白及其应用
KR102679001B1 (ko) 신규의 개량된 염기 편집 또는 교정용 융합단백질 및 이의 용도
CN110551763B (zh) CRISPR/SlutCas9基因编辑系统及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160921