CN108368502A - 使用单链dna的dna编辑 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于修饰细胞内DNA的组合物、方法和试剂盒以及用于修饰细胞中的基因表达的组合物和方法。具体地,本发明大体上涉及使用单链DNA编辑DNA的组合物、方法和试剂盒。还涵盖了使用人造微RNA(amiRNA)修饰基因表达的组合物和方法。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2015年6月3日提交的美国临时专利申请第62/170,306号的优先权益,其内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
本发明领域涉及用于修饰细胞内DNA的组合物、方法和试剂盒以及用于修饰细胞中的基因表达的组合物和方法。具体地,本发明领域涉及使用单链DNA(ssDNA)编辑DNA的组合物、方法和试剂盒。还涵盖使用人工微RNA(amiRNA)修饰基因表达的组合物和方法。
为了确保整个基因组的稳定性和活力,细胞已经发展出了复杂的机制来准确并有效地修复DNA损伤。在真核细胞中,双链断裂(DSB)的修复主要通过两个途径进行:非同源末端接合(NHEJ)和同源引导修复(HDR)。在NHEJ途径中,有数个因子用于将DSB产生的两个DNA末端再连接。在HDR途径中,使用同源DNA模板来修复DSB。
利用HDR途径已成为包括基因组编辑的DNA编辑的强有力手段。当前,有数种广泛使用的系统将诸如DSB的靶向切割引入到细胞基因组中,所述系统包括锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas系统(成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas))和Argonaute核酸酶系统。参见例如Gaj等人,Trends inBiotechnology 31(7):397-405(2013);Gao等人,Nature Biotechnology,2016年5月2日在线发布。ZFN和TALEN通常是由连接于非特异性DNA裂解域的可编程序列特异性DNA结合序列构成的嵌合核酸酶。另一方面,CRISPR-Cas和Argonaute核酸酶系统的序列特异性来源于将Cas或Argonaute蛋白的核酸酶活性引到特定序列的引导多核苷酸(例如RNA或DNA)。通过将这些靶向核酸酶系统中的一种与修复模板DNA编码序列或与核酸酶切割位点附近的上游序列或下游序列同源的“臂”一起引入细胞中,HDR途径可用于在基因组中几乎任何位置插入感兴趣的DNA(DOI)。
修复模板DNA可以是单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)。单链DNA修复模板通常长约100-200个碱基,其由数个具有改变的序列(例如点突变、重组酶识别序列、数个碱基的短缺失或插入)的碱基组成,所述碱基侧接有约40-80个碱基的同源臂。双链DNA修复模板通常需要长的同源臂,并且通常以比ssDNA修复模板低得多的效率插入。参见Singh等人,Genetics 199:1-15(2015);Yang等人,Nat Protoc 9:1956-1968(2014);和Ran等人,NatProtoc 8:2281-2308(2013)。当前,由于可合成的ssDNA的全长的限制和不确定是否能使用细胞的内源HDR机制将含有长DOI的ssDNA修复模板适当地并入靶序列中,所以ssDNA修复模板尚未被用于插入长DOI。插入大DOI(>100个碱基)通常依赖于使用具有长同源臂的dsDNA,所述具有长同源臂的dsDNA的制作很费力且具有不良的插入效率。因此,本领域需要将大DOI(>100个碱基)插入到细胞内的靶DNA序列中的更简单更有效的方法。
发明内容
本发明公开了使用单链DNA(ssDNA)编辑DNA的组合物、方法和试剂盒以及用于修饰基因表达的组合物和方法。所公开的组合物、方法和试剂盒可以用于修饰基因组DNA。
一方面,提供用于修饰细胞中的靶DNA序列的组合物。组合物可以包括单链DNA(ssDNA)。组合物还可以包括(a)单链DNA(ssDNA)和(b)能够切割靶DNA序列的核酸酶系统。所述ssDNA可以包括与靶DNA序列具有基本序列同一性的5'同源臂、外源序列和与靶DNA序列具有基本序列同一性的3'同源臂。还涵盖递送粒子,其包括用于药物组合物中的这些组合物。这些递送粒子可以包括聚合纳米粒子、脂质体纳米粒子或包括脂质和至少一种类型的聚合物的纳米粒子。
另一方面,提供用于修饰细胞中的靶DNA序列的方法。所述方法可以包括:(a)在细胞中引入单链DNA(ssDNA),和(b)在细胞中引入或表达核酸酶系统,其中所述核酸酶系统切割靶DNA序列。
在又另一方面,可以进行本发明方法来修饰细胞中的靶DNA序列,并且所述方法可以包括使细胞与本文所述的任何一种递送粒子以允许将组合物递送到细胞中并且修饰靶DNA序列的有效量接触。所述接触可以在体外、体内、原位或离体进行。
另一方面,还涵盖用于修饰细胞中的靶DNA序列的试剂盒或系统。所述试剂盒或系统包括组分,所述组分可以包括RNA聚合酶、逆转录酶、RNA降解酶和核酸酶系统中的一种或多种。任选地,所述试剂盒或系统可以包括从5'至3'含有启动子、克隆位点和限制酶位点的DNA载体。
在又另一方面,本发明的试剂盒或系统可以包括(a)单链DNA(ssDNA)和(b)能够切割靶DNA序列的核酸酶系统。所述试剂盒的ssDNA可能相对较长(例如,>100个碱基)。
另一方面,还提供了包括amiRNA的工程改造的真核细胞。所述工程改造的真核细胞可以包括编码amiRNA的外源DNA构建体。所述DNA构建体可被插入基因的内含子中。在一些实施方式中,所述DNA构建体缺乏启动子、报告序列和/或polyA尾。
附图说明
图1显示通过ivTRT(“体外转录和逆转录”)策略进行的ssDNA合成。质粒或PCR产物模板的示意图显示用于RNA体外转录的元件,诸如T7启动子(紫色)和侧接有针对靶序列的3'和5'同源序列(各55-bp,绿色)的amiRNA片段。通过用适合的限制酶进行消化将质粒模板线性化。使用T7启动子和T7RNA聚合酶进行体外转录。cDNA(ssDNA)通过逆转录合成,并且RNA模板被RNaseH降解。
图2显示通过CRISPR/Cas9系统靶向插入编码抗eGFP amiRNA的ssDNA(实验2)。图2(a)显示将amiR-eGFP123/419序列靶向整合到eEF-2基因的内含子6(上图)和amiR-eGFP123和amiR-eGFP419靶位点在eGFP cDNA上的的位置(下图)的示意图。从正确靶向的eEF-2基因座,amiRNA得到转录,接着结合于eGFP mRNA上的靶位点(amiR-eGFP123=粉红色线和amiR-eGFP419=紫色线),导致eGFP敲减。红色箭头指示用于检测具有靶向插入的胎鼠的引物组(PP119/PP120)的位置。图2(b)显示在荧光立体显微镜下观察到的E13.5天胎鼠中的eGFP荧光,显示在一些胎鼠中的成功敲减。图2(c)显示通过使用图2(a)所示的引物组进行的PCR来对胎鼠进行基因分型。图2(b)和图2(c)中的胚胎编号彼此对应。预期的片段尺寸:野生型=301-bp(下方黑色箭头),靶向插入=625-bp(上方蓝色箭头)。图2(d)显示靶向插入效率。即使插入不完全准确,含有功能性amiRNA序列的胎鼠也被认为是‘具有靶向插入的胚胎’。
图3显示通过CRISPR/Cas9系统靶向插入编码抗Otx2amiRNA的ssDNA(实验4)。图3(a)显示将amiR-Otx2_546靶向整合到eEF-2基因的内含子6(上图)和显示amiR-Otx2_546结合位点的Otx2基因组区(下图)的示意图。将Otx2的外显子以框形式显示,并且将具有同源域区的框用黑色遮蔽。红色箭头指示用于检测具有靶向插入的胎鼠的引物组(PP119/PP120)的位置。图3(b)显示在E14.5拍摄的所得胎鼠。图3(c)显示通过使用图3(a)所示的引物组进行的PCR来对胎鼠进行基因分型。图3(b)和图3(c)中的胚胎编号彼此对应。预期的片段尺寸:野生型=301-bp(上方黑色箭头),靶向插入=487-bp(下方蓝色箭头)。图3(d)显示靶向插入效率。即使插入不完全准确,含有功能性amiRNA序列的胎鼠也被认为是‘具有靶向插入的胚胎’。
图4显示通过CRISPR/Cas9系统靶向插入编码Cre-可活化的抗eGFP amiRNA的ssDNA(实验5)。图4(a)显示将相反取向的‘amiR-eGFP123/419'和突变loxP位点(JT15和JTZ17)靶向整合到eEF-2基因的内含子6中,随后Cre-loxP重组来将amiRNA盒转换到正确的取向的示意图。功能性amiRNA不会从靶向的“amiRNA-off”等位基因产生,因为amiRNA相对于eEF-2基因的取向相反。在Cre重组之后,等位基因被转化为产生功能性amiRNA的“amiRNA-on”。红色箭头指示用于基因分型的引物(PP119、PP120和M412)。图4(b)显示通过使用引物组(PP119/PP120)进行的PCR来对胎鼠进行基因分型。预期的片段尺寸:野生型=301-bp(黑色箭头),靶向插入=705-bp(蓝色箭头)。图4(c)显示靶向插入效率。图4(d)显示用(左)或不用(右)iCre质粒转染后9天,来自实验5样品#4(上)和#6(下)的胚胎饲养细胞的点图。显示弱eGFP荧光的细胞被分配在各图的框内。图4(e)显示通过用图4(a)所示的引物组进行的PCR来对实验图4(d)中所用的胚胎饲养细胞进行基因分型。
图5显示通过CRISPR/Cas9系统靶向插入编码抗eGFP amiRNA的ssDNA(实验1)。图5(a)显示将amiR-eGFP123/419靶向整合到eEF-2基因的内含子1(上图)中和amiR-eGFP123和amiR-eGFP419靶位点在eGFP cDNA上的位置(下图)的示意图。从正确靶向的eEF-2基因座,amiRNA得到转录,接着结合于eGFP mRNA上的靶位点(amiR-eGFP123=粉红色线和amiR-eGFP419=紫色线),导致eGFP敲减。红色箭头指示用于检测具有靶向插入的胎鼠的引物组(PP113/M412)的位置。图5(b)显示在荧光立体显微镜下观察到的E13.5胎鼠中的eGFP荧光,显示在一些胎鼠中的成功敲减。图5(c)显示通过使用图5(a)所示的引物组进行PCR来对胎鼠进行基因分型。图5(b)和图5(c)中的胚胎编号彼此对应。预期片段尺寸:靶向插入=562-bp(蓝色箭头)。图5(d)显示靶向插入效率。即使插入不完全准确,含有功能性amiRNA序列的胎鼠也被认为是‘具有靶向插入的胚胎’。
图6显示通过CRISPR/Cas9系统靶向插入编码抗Otx2 amiRNA的ssDNA(实验3)。图6(a)显示将amiR-Otx2_518靶向整合到eEF-2基因的内含子6(上图)中和显示amiR-Otx2_518结合位点的Otx2基因组区(下图)的示意图。Otx2的外显子以框形式显示,并且将具有同源域区的框用黑色遮蔽。红色箭头指示用于检测具有靶向插入的胎鼠的引物组(PP119/PP120)的位置。图6(b)显示在E14.5拍摄的所得胎鼠。图6(c)显示通过使用图6(a)所示的引物组进行PCR来对胎鼠进行基因分型。图6(b)和图6(c)中的胚胎编号彼此对应。预期的片段尺寸:野生型=301-bp(下方黑色箭头),靶向插入=487-bp(上方蓝色箭头)。图6(d)显示靶向插入效率。
图7显示了通过CRISPR/Cas9系统进行的ssDNA或dsDNA修复模板(编码抗eGFPamiRNA)的插入效率的比较(实验6和7)。图7(a)显示靶向整合amiRNA-eGFP123/419的eEF-2基因座的基因组结构。红色箭头指示用于通过嵌套式PCR检测具有靶向插入的胚泡的引物组(PP117/PP118和PP119/M412)的位置。制备含有amiR-eGFP123/419和在每一侧含有长度为55个碱基的同源臂的ssDNA(在实验6中)或dsDNA(在实验7中),并且将其用作修复DNA。将每种修复DNA(20ng/μl)与Cas9 mRNA(10ng/μl)和TS2的sgRNA(10ng/μl)一起进行显微注射。图7(b)显示通过使用图7(a)所示的引物组进行嵌套式PCR来对胚泡进行的基因分型。预期片段尺寸:459-bp。图7(c)显示靶向插入效率。
图8显示在eEF-2内含子6中插入序列不影响其mRNA剪接。图8(a)显示eEF-2基因的野生型和‘amiRNA-off’等位基因(含有相反取向的‘amiRNA-eGFP123/419'和突变loxP位点)的基因组结构和预期的剪接模式。红色箭头指示用于逆转录PCR(RT-PCR)的引物组(PP164/PP118)的位置。图8(b)显示使用从来源于实验5中胎鼠的胚胎饲养细胞制备的cDNA的RT-PCR结果(参见图4)。图8(b)中的样品编号与图4(b)中的编号对应。样品第6号:野生型等位基因;第4号和第9号:‘amiRNA-off’等位基因的杂合子;第8号:‘amiRNA-off’等位基因的纯合子。预期片段尺寸:500-bp(来自cDNA)。图8(c)显示外显子6和7之间的接合区。
图9显示通过ivTRT策略进行的ssDNA合成。质粒或PCR产物模板的示意图显示用于RNA体外转录的元件,诸如rtTA/Cre/Egfp插入序列(绿色),所述rtTA/Cre/Egfp插入序列侧接有针对靶序列的3'和5'同源序列(各约60-bp)。
图10显示如下示意图,其说明了与之前使用的ssDNA修复模板相比,本文所公开的ssDNA修复模板中包含的外源或插入序列的长度(插入序列)与5'同源臂和3'同源臂长度的总和(臂(总))的比率显著更大。
图11显示在Otoancorin和Fgf8基因座处插入超过1kb的ssDNA。图11(a,b)是显示Otoancorin(图11(a))和Fgf8(图11(b))基因座、ssDNA供体模板和靶向敲入等位基因的示意图。指示了ssDNA、同源臂和rtTA-polyA(图11(a))或P2A-FlpO(图11(b))盒的长度。图11(c,d)为用于检测盒插入的G0动物的基因分型。显示了用于5'和3'接合PCR的引物位置的示意图以及预期的扩增子尺寸。图11(c)显示如5'和3'接合PCR两者所见,样品Otoa G0幼崽3、7和8为rtTA盒插入阳性。请注意,3'PCR的扩增子很弱,并且用星号指示。图11(d)显示通过5'和3'PCR两者,基因座4为FlpO盒插入阳性。右边的凝胶显示该基因座具有盒的双等位基因插入。Wt:野生型,M;100bp标志物,kb:1kb标志物。图11(e,f)为Otoancorin基因座3和Fgf8基因座4的测序。上面显示了引导RNA序列(斜体)以及切割位点、PAM序列(红色)和侧接序列的几个碱基。序列色谱图显示正确的盒接合插入。
图12显示将超过1kb的ssDNA插入Slc26a5和MafB中。图12(a,b)是显示Slc26a5(图12(a))和MafB(图12(b))、ssDNA供体模板和靶向敲入等位基因的示意图。指示了ssDNA、同源臂和P2A-FlpO盒的长度。图12(b,d)为用于检测盒插入的G0动物的基因分型。显示了用于5'和3'接合PCR的引物位置的示意图以及预期的扩增子尺寸。图12(c)显示使用5'和3'PCR两者,基因座1和3为P2A-FlpO盒插入阳性。请注意,基因座#1的3'接合PCR大于预期尺寸,并且其含有基因组DNA复制(数据未显示)。图12(d)显示,通过5'和3'PCR,基因座4为FlpO盒插入阳性。Wt:野生型,M:100bp标志物。图12(e,f)为Slc26a5基因座#1和Mafb基因座#7的测序。上面显示了引导RNA序列(斜体)以及切割位点、PAM序列(红色)和侧接序列的几个碱基。序列色谱图显示盒插入接合。
图13显示Otoa-rtTA ssDNA的示意图。将各种序列元件用颜色标记。在示意图上方显示了用于5'和3'接合PCR的引物和扩增子尺寸。
图14显示Fgf8-P2A-Flpo-ssDNA的示意图。将各种序列元件用颜色标记。在示意图上方显示了用于5'和3'接合PCR的引物和扩增子尺寸。
图15显示slc26a5-Flpo-ssDNA的示意图。将各种序列元件用颜色标记。在示意图上方显示了用于5'和3'接合PCR的引物和扩增子尺寸。
图16显示Mafb-Flpo-ssDNA的示意图和序列。将各种序列元件用颜色标记。在示意图上方显示了用于5'和3'接合PCR的引物和扩增子尺寸。
图17显示Easi-CRISPR敲入小鼠模型的生殖系传递。图17(a)为来源于Fgf8-P2A-FlpO基因座4交配的F1幼崽的基因分型。请注意,这个基因座是纯合子,并且与野生型小鼠交配产生FlpO插入杂合的所有幼崽。图17(b)为来自Slc25a5-P2A-FlpO基因座#3的F1幼崽的基因分型,其显示F1幼崽2、3和4含有敲入盒。
具体实施方式
本发明公开了使用单链DNA(ssDNA)编辑DNA如基因组DNA的组合物、方法和试剂盒以及用于修饰基因表达的组合物和方法。所公开的组合物、方法和试剂盒可以如下进一步描述。
除非上下文另外规定或指示,否则不带具体数量的术语意指“一个或多个”或“一种或多种”。此外,除非上下文另外规定或指示,否则如“ssDNA”和“amiRNA”的单数名词应该分别解释为意指“一个或多个ssDNA”和“一个或多个amiRNA”。
如本文所使用,“约”和“近似”将被本领域普通技术人员理解,并且将根据其使用的上下文而在某种程度上变化。如果在使用所述术语的上下文中,所述术语的使用对于本领域普通技术人员是不明确的,则“约”和“近似”将意指加或减特定术语的≤10%。
如本文所用,术语“包括”具有与术语“包含”相同的意义。术语“包含”应解释为是“开放性”的过渡术语,其允许包括除权利要求书中所述的那些组分之外的其它组分。术语“由...组成”应解释为是“封闭性”的过渡术语,其不允许包括除权利要求书中所述的组分之外的其它组分。术语“基本上由...组成”应解释为部分封闭性的,并且仅允许包括不会从根本上改变要求保护的标的物的性质的其它组分。
除非本文另外指示,否则在本文中值的范围的叙述仅旨在作为单独地提及属于该范围内的各单独值的速记方法,并且各单独值被并入本说明书中,就如同其在本文中被单独地叙述一样。例如,如果将浓度范围陈述为1%至50%,则意味着在本说明书中明确列举诸如2%至40%、10%至30%或1%至3%等的值。这些仅仅是具体意图的实例,并且在所列举的最低值与最高值之间并且包括所列举的最低值和最高值的数值的所有可能的组合被认为在本公开中明确地被陈述。使用词语“约”来描述特别叙述的量或量的范围意欲指示该量中包括非常接近所述量的值,诸如由于形成测量时的制造公差、仪器和人为误差等而可以或者自然地将产生的值。除非另有指明,否则提及量的所有百分数均以重量计。
DNA的核酸酶编辑系统
数种核酸酶系统,包括CRISPR/Cas系统,已经成为盛行的DNA和基因组编辑方法。这些方法不仅可以用于基因破环,而且可以用于使用DNA修复模板进行靶向修饰。使用长度最多为200个碱基的单链DNA(ssDNA)修复模板作为用于插入短延伸序列的供体。参见例如Harms等人,Curr Protoc Hum Genet 83:15(17)11-15(2014)。然而,由于较长的ssDNA(长度>200个碱基)通常不能购得,所以较长的插入需要使用低效率的dsDNA(质粒类构建体),其制作可以更费力并且通常具有不良的插入效率。
为了克服这些限制,本发明者已经部分开发了一种可以用于合成具有超过200个核苷酸的ssDNA供体的技术。一方面,本发明普遍地涉及本发明者的如下发现:具有超过200个核苷酸长度的ssDNA可以用作细胞中靶向修饰的有效供体。此外,本发明者发现当将长度超过200个核苷酸的ssDNA用作修复模板时,需要将相对短的同源臂插入较长的感兴趣的DNA序列。另一方面,本发明普遍地涉及本发明者的如下展示:靶向内含子的amiRNA可有效修饰基因表达。
在实施例中,本发明者合成了长度大于200个核苷酸的ssDNA供体,接着将其用于CRISPR/Cas9介导的靶向插入实验。本发明者观察到高达100%的总插入效率和在两种等位基因中高达50%的插入效率。值得注意的是,这些样品中同源臂长度在每侧约55个碱基-112个碱基范围内,证明即使供体的长度大于200个核苷酸的长度,基于ssDNA的插入仍然有效,并且所感兴趣的DNA序列显著长于所述同源臂的长度。
一方面,本发明包含使用单链DNA(ssDNA)编辑DNA的组合物、方法和试剂盒。所公开的组合物、方法和试剂盒可以用于体外、体内或离体DNA编辑,并且可以用于插入感兴趣的DNA序列,诸如编码以下非限制性元件的大表达盒和转基因:人工微RNA(amiRNA)构建体、报告序列(例如EGFP/LacZ等)、序列标签(例如免疫-亲和标签)和诸如rtTA/tTA、Cre、Flpo等的基因。所述组合物、方法和试剂盒还可以用于例如将多个点突变引入基因组序列中,产生有条件和无条件的敲入和敲除构建体,改变靶向基因的表达,产生转基因动物和植物和开发人类疗法。
用于修饰靶DNA序列的方法
本文提供用于修饰细胞中的靶DNA序列的方法。所述方法可以包括:(a)在细胞中引入单链DNA(ssDNA),和(b)在细胞中引入或表达核酸酶系统,其中所述核酸酶系统切割靶DNA序列。ssDNA可以包括与靶DNA序列具有基本序列同一性的5'同源臂、外源序列和与靶DNA序列具有基本序列同一性的3'同源臂。
如本文所用的术语“靶DNA序列”是指存在于细胞中的任何DNA核酸。靶DNA序列可以是细胞内源的(例如基因组或其它自复制形式的DNA,诸如在细胞中内源存在的质粒)或细胞外源的(例如引入细胞中的转基因或质粒)。靶DNA序列可以在基因内或在基因周围。
在一些实施方式中,靶DNA序列在基因的内含子中。该基因可以组成性表达或可以以组织特异性的方式表达。如本文所用,“组成性表达”是指在生物体的所有细胞中表达的基因。常见的组成性表达的基因包括维持基本细胞功能所需的看家基因。在非限制性实施例中,本发明者以eEF2看家基因内的内含子为靶标,但根据本发明可以使用其它看家基因。
如本文所用,“引入”描述了将外源多核苷酸(例如DNA或RNA)或蛋白质引入受体细胞中的过程。将核酸和蛋白质引入细胞中的方法是本领域已知的,并且可以非限制性地包括显微注射、转化和转染方法。转化或转染可以根据本领域众所周知的各种方法在自然或人工条件下发生,并且可以依赖于将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞中的任何已知方法。基于被转化的宿主细胞的类型来选择用于转化或转染的方法,并且可以包括但不限于噬菌体或病毒感染、电穿孔、热休克、脂质转染和粒子轰击。还可以使用核酸和/或蛋白质的显微注射来将核酸和/或蛋白质引入细胞中,例如在制作转基因动物时与胚胎一起使用的细胞。
常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可以用于将核酸引入细胞或靶组织中。非病毒载体递送系统可以包括与递送载体如脂质体复合的DNA质粒或核酸。可递送至细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
本发明的单链DNA(ssDNA)可以是单链DNA多核苷酸。术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸”和“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸(所述术语可以互换使用)或其任何片段。这些短语还指基因组、天然或合成起点的DNA或RNA(其可以是单链或双链的并且可以代表有义链或反义链)。
关于多核苷酸序列,术语“同一性百分比”和“同一性%”和“序列同一性”是指使用标准化的算法进行匹配的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配的百分比。这种算法可以以标准化和可再现的方式在所比较的序列中插入空位,以便优化两个序列之间的匹配,并因此实现两个序列的更有意义的比较。核酸序列的同一性百分比可以如本领域中所理解的来确定。(参见例如美国专利第7,396,664号)。美国国家生物技术信息中心(the NationalCenter for Biotechnology Information;NCBI)局部匹配检索基本工具(Basic LocalAlignment Search Tool;BLAST)提供了一套常用且可免费获得的序列比较算法,其可从多个来源包括NCBI、Bethesda、Md的网站获得。BLAST软件套件包括各种序列分析程序,包括用于将已知多核苷酸序列与来自各种数据库的其它多核苷酸序列进行匹配的“blastn”。还可以获得称为“BLAST 2序列”的工具,其用于两个核苷酸序列的直接成对比较。可以在NCBI网站上交互访问和使用“BLAST 2序列”。“BLAST 2序列”工具可以用于blastn和blastp(上文所讨论)两者。
关于多核苷酸序列,可以在完整的例如由特定的SEQ ID号所限定的指定多核苷酸序列的长度上测量同一性百分比,或可以在较短的长度上测量,例如在从较大的指定序列获得的片段的长度上测量,例如至少20、至少30、至少40、至少50、至少70、至少100或至少200个连续核苷酸的片段。这些长度仅仅是示例性的,并且应该理解,可以使用本文在表格、图式或序列表中显示的序列所支持的任何片段长度来描述可以测量同一性百分比的长度。
关于多核苷酸序列,“变体”、“突变体”或“衍生物”可以定义为如下核酸序列,使用在美国国家生物技术信息中心的网站获得的blastn以及“BLAST 2序列”工具,其与特定核酸序列在所述核酸序列之一的某个长度上具有至少50%序列同一性。(参见TatianaA.Tatusova,Thomas L.Madden(1999),“Blast 2序列-用于比较蛋白质和核酸序列的新工具(Blast 2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotidesequences)”,FEMS Microbiol Lett.174:247-250)。这种核酸对可以在某个指定长度上显示例如至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%或更大的序列同一性。
本发明的单链DNA(ssDNA)是相对长的。在一些实施方式中,ssDNA可以具有至少约200、250、300、350、400、450、500和1,500、2,000、5,000、10,000、15,000、20,000、30,000的长度,或ssDNA的长度可以在由这些核苷酸长度中的任一个所限定的范围内(例如200-1000个核苷酸的长度)。ssDNA可以含有本领域中众所周知的修饰的核苷酸。
ssDNA可以包括与靶DNA序列具有基本序列同一性的5'同源臂、外源序列和与靶DNA序列具有基本序列同一性的3'同源臂。优选地,安排所述ssDNA以5'至3'方向包括与靶DNA序列具有基本序列同一性的5'同源臂、外源序列和与靶DNA序列具有基本序列同一性的3'同源臂。
在一些实施方式中,所述ssDNA的5'同源臂和/或3'同源臂与靶DNA序列的至少约15、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或110个核苷酸具有基本同一性。在一些实施方式中,ssDNA的5'同源臂和3'同源臂与靶DNA序列的不超过约40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个核苷酸具有基本同一性。优选地,ssDNA的5'同源臂和3'同源臂与靶DNA序列的35至120个核苷酸具有基本同一性。在一些实施方式中,所述5'同源臂与在由核酸酶系统产生的切割的一侧的靶DNA序列具有基本同一性,并且3'同源臂与在由核酸酶系统产生的切割的另一侧的靶DNA序列具有基本同一性。
如本文所用,当提及本发明的ssDNA的5'同源臂和3'同源臂的多核苷酸序列时,“与......具有基本同一性(substantially identical to)”或“基本同一性(substantialidentity)”意指至少40%的多核苷酸序列同一性。适合的多核苷酸同一性可以为40%至100%的任何值。优选地,ssDNA的5'同源臂和3'同源臂的多核苷酸同一性是100%。
在本发明的ssDNA中,5'和3'同源臂的总长度可以显著小于外源序列的长度。在本发明者的研究之前,ssDNA修复模板通常长约100-200个碱基。这些修复模板通常包括如下外源序列,其含有数个具有改变的序列(例如点突变、重组酶识别序列、数个碱基的短缺失或插入)的碱基,所述外源序列侧接有约40-80个碱基的同源臂。参见例如图10。因此,同源臂构成了ssDNA修复模板的重要部分。另一方面,本发明者已经发现,即使所述ssDNA修复模板仅包括相对短的5'和3'同源臂,也可以高效率插入包括超过200个bp的外源序列的ssDNA修复模板。参见例如图10。
鉴于这个发现,本发明的ssDNA可以包括外源序列(ES)的长度与5'同源臂(L5')和3'同源臂(L3)的长度的和的特定比率。外源序列的长度与5'同源臂和3'同源臂的总长度的比率(R)通过将核苷酸中外源序列的长度除以核苷酸中5'和3'同源臂两者的组合长度来确定,如由式R=ES/(L5'+L3')所表示。例如,如果ssDNA包括长度为99个核苷酸的5'同源臂、长度为1,368个核苷酸的外源序列和长度为72个核苷酸的3'同源臂,则外源序列的长度与5'同源臂和3'同源臂的总长度的比率将是1368/(99+72)=8:1。在本文涵盖的ssDNA的一些实施方式中,外源序列的长度与5'同源臂和3'同源臂的总长度的比率(R)(外源序列长度:同源臂长度)可以是约1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或在由这些值中的任意两个所限定的比率范围内(即,比率在5:1-50:1范围内)。在一些实施方式中,外源序列的长度与5'同源臂和3'同源臂的总长度的比率(R)(外源序列长度:同源臂长度)可以在约1.5:1和20:1之间。
ssDNA可以使用体外方法合成。所涵盖的用于合成ssDNA的体外方法包括如下方法,其包括转录编码可操作地连接于核苷酸序列的启动子的DNA模板以产生RNA转录本,所述核苷酸序列优选沿5'至3'方向包括与靶DNA序列具有基本序列同一性的5'同源臂、外源序列和与靶DNA序列具有基本序列同一性的3'同源臂;通过RNA转录本的逆转录来合成ssDNA/RNA双链体;和使用RNA降解酶从ssDNA/RNA双链体降解RNA以产生ssDNA。任选地,所述方法还可以包含纯化ssDNA。ssDNA的纯化可以通过凝胶纯化或本领域中众所周知的其它DNA纯化方案。适用于体外转录DNA模板的启动子是本领域中已知的。适合启动子的实例包括但不限于T7、T3和SP6启动子。优选地,所述启动子包含T7启动子并且使用T7RNA聚合酶进行转录。
ssDNA/RNA双链体的合成可以使用RNA依赖性DNA聚合酶如逆转录酶进行。用于本发明的适合的逆转录酶蛋白可以从各种逆转录病毒获得,所述逆转录病毒包括但不限于莫洛尼鼠科白血病病毒(Moloney Murine Leukemia virus)、人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和从各种酵母和细菌种分离的逆转录子。优选地,所述逆转录酶为莫洛尼鼠科白血病病毒。
本领域技术人员将理解,逆转录酶通常含有赋予RNase H活性的域。根据本发明,所述逆转录酶可能具有或不具有这种RNase H活性。因此,本发明方法和试剂盒中使用的RNA降解酶可以具有与逆转录酶相关的RNase H活性,或可以是本领域已知的降解DNA/RNA双链体中的RNA来产生ssDNA的单独RNA降解酶,包括但不限于RNase H。
还可以使用其它体外方法来产生本发明的ssDNA。适合的方法包括:不对称PCR(参见例如美国专利8,735,067)、使用两种寡核苷酸引物且一种引物以限制浓度存在的PCR(参见例如美国专利5,066,584)以及使用“切口酶”和/或限制性核酸内切酶从dsDNA分子产生ssDNA(参见例如,LsODN制备试剂盒-Biodynamics Laboratory Inc.,Tokyo,Japan)。
基于ssDNA的插入效率也可能受ssDNA二级结构的影响。可以通过使用减少ssDNA修复模板中存在的二级结构的策略来防止或最小化这种二级结构。因此,本发明的组合物、方法和试剂盒还可以包括但不限于使二级结构最小化的缓冲剂(或使用缓冲剂)、减少二级结构的蛋白质(或使用蛋白质)如ssDNA结合蛋白,或修饰的核苷酸(或使用修饰的核苷酸)如N4-乙基脱氧胞苷(d4EtC)。
本发明的ssDNA可以包括外源序列。如本文所用,“外源序列”或“外源多核苷酸”是指被引入细胞中的多核苷酸。
所述外源序列可以具有至少约200、250、300、350、400、450、500和1,500、2,000、5,000、10,000、15,000、20,000或30,000的长度,或所述外源序列的长度可以在由这些核苷酸长度中的任一个所限定的范围内(例如200-1000个核苷酸的长度)。
所述外源序列可以包括任何给定的序列,包括可以被人工设计或修饰的序列。所述外源序列可以编码蛋白质产物、RNA产物、DNA调节元件、变体DNA序列或其任何组合。
所述蛋白质产物可以是全长蛋白质、蛋白质片段如外显子、融合蛋白、多肽或肽。当外源序列被引入细胞中和/或被引入到靶DNA序列中时,可以表达所述蛋白质产物(例如,外源序列被转录并翻译来产生蛋白质产物)。所述蛋白质产物在外源序列被引入靶DNA序列中时可能成为在细胞中表达的融合蛋白的一部分,或可以表达为单独的蛋白质。示例性蛋白质产物包括但不限于荧光蛋白如eGFP、Cre蛋白、Flp蛋白、四环素反向控制的反式活化蛋白(rtTA)、四环素控制的反式活化蛋白(tTA)或表位标记蛋白如CBP、FLAG、GST、HA、HBH、MBP、Myc、poly His、S-tag、SUMO、TAP、TRX或V5标签。
如本文所用,术语“蛋白质”或“多肽”或“肽”可以互换使用来指氨基酸的聚合物。本文涵盖的“多肽”通常包含天然存在的氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的聚合物。本文涵盖的蛋白质可以在体外或体内进一步修饰来包括非氨基酸部分。这些修饰可以包括但不限于酰化(例如O-酰化(酯)、N-酰化(酰胺)、S-酰化(硫酯))、乙酰化(例如在蛋白质的N末端或在赖氨酸残基处添加乙酰基)、甲酰化、硫辛酰化(例如连接硫辛酸酯,一种C8官能团)、肉豆蔻酰化(例如连接肉豆蔻酸酯,一种C14饱和酸)、棕榈酰化(例如连接棕榈酸酯,一种C16饱和酸)、烷化(例如在赖氨酸或精氨酸残基处添加烷基,如甲基)、异戊二烯化或异戊烯化(例如添加类异戊二烯类基团,诸如法呢醇或香叶基香叶醇)、在C末端酰胺化、糖基化(例如向天冬酰胺、羟基赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸添加糖基,产生糖蛋白)。聚唾液酸化(例如添加聚唾液酸)、糖基磷脂酰肌醇化(例如糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚形成)、羟基化、碘化(例如甲状腺激素)和磷酸化(例如通常向丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸添加磷酸酯基)与糖化不同,糖化被认为是糖的非酶促连接。
所述外源序列可以编码RNA产物。当所述外源序列被引入细胞中和/或被引入靶DNA序列中时,可以表达RNA产物(即,在将外源序列转录产生RNA产物时)。所述RNA产物可以包括参与蛋白质合成的RNA、参与转录后修饰或DNA复制的RNA或调节RNA。参与蛋白质合成的RNA可以包括但不限于mRNA、rRNA、tRNA或SRP RNA。参与转录后修饰的RNA可以包括但不限于snRNA、snoRNA或Y RNA。调节RNA可以包括但不限于反义RNA、CRISPR RNA、引导RNA、长非编码RNA、微RNA、siRNA、piRNA、tasiRNA、5'UTR序列、3'UTR序列、RNA剪接调节序列、IRES序列或polyA信号序列。
所述外源序列可以编码DNA调节元件。DNA调节元件可以是非编码DNA序列,其调节基因的转录或作为蛋白质产物或RNA产物的识别序列。示例性DNA调节元件可以包括但不限于启动子,增强子,沉默子,绝缘子,组织特异性调节元件或者蛋白质产物或RNA产物的识别序列。蛋白质产物或RNA产物的识别序列可以包括但不限于位点特异性重组酶或整合酶的识别序列,诸如FRT、loxP、rox和attB/attP序列。适用于实践本发明的启动子包括但不限于组成型、诱导型、暂时调节型、发展调节型、化学调节型、物理调节型(例如光调节型或温度调节型)、组织优选型和组织特异性启动子。启动子可以包括pol I、pol II或pol III启动子。用于在植物中表达的适合启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒的35S启动子、泛素、tCUP隐蔽组成型启动子、Rsyn7启动子、病原体诱导型启动子、玉米In2-2启动子、烟草PR-1a启动子、糖皮质激素诱导型启动子、雌激素诱导型启动子以及四环素诱导型启动子和四环素抑制型启动子。其它启动子包括T3、T7和SP6启动子序列。在哺乳动物细胞中,典型的启动子包括但不限于劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV),人免疫缺陷病毒(HIV-1),巨细胞病毒(CMV),SV40病毒等的启动子以及翻译延伸因子EF-1α启动子或泛素启动子。本领域技术人员熟悉用于各种细胞类型的多种其它启动子。
所述外源序列可以编码“变体DNA序列”。如本文所用,“变体DNA序列”是指具有与参考DNA序列不同的序列的DNA分子。变体DNA序列可以包括DNA序列的一个或多个拷贝,该DNA序列在变体DNA序列被插入靶DNA序列中时产生重复(重复)序列或拷贝数变化。变体DNA序列可以相对于参考分子如靶DNA序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多核苷酸碱基的插入、缺失或取代。例如,相对于试图通过将外源序列引入细胞的靶DNA序列而进行修饰的DNA序列,变体DNA序列可以具有至少一个核苷酸碱基的一个或多个插入、缺失或取代。
所述外源序列可以编码本文所述的蛋白质产物、RNA产物或DNA调节元件的任何组合。例如,在产生条件敲除生物体时,本领域普通技术人员应了解,可以优选产生编码蛋白质产物的外源序列,如外显子和DNA调节元件,所述DNA条件元件例如位点特异性重组酶的识别序列。
在一些实施方式中,本发明的ssDNA的外源序列可以编码微RNA。如本领域中已知的,微RNA是小的非编码RNA分子,其在基因表达的RNA沉默和转录后调节中起作用,其可以来源于pri-miRNA和pre-miRNA前体。微RNA可以是天然存在或人造的。人造微RNA(amiRNA)是已被基因工程改造成特异性修饰单个或多个感兴趣的基因的表达的微RNA。如本文所用,“修饰”基因表达可以包括增加或减少基因表达。在一些实施方式中,amiRNA降低(例如,“敲减”)单个或多个感兴趣的基因的表达。本领域中已知用于设计amiRNA的方法。参见例如BLOCK-iT RNAi设计器(Invitrogen,Carlsbad,CA)。
在一些实施方式中,本发明的ssDNA的外源序列可以编码amiRNA。任选地,所编码的amiRNA可以侧接有两个位点特异性重组酶靶序列。适合的位点特异性重组酶靶序列包括但不限于FRT和loxP序列。在一些实施方式中,所述两个位点特异性重组酶靶序列的取向是相反的。在本发明方法的一些实施方式中,所述方法还可以包括将识别位点特异性重组酶靶序列的位点特异性重组酶表达或引入细胞中。适合的位点特异性重组酶包括但不限于FLP和Cre。优选地,所述两个位点特异性重组酶靶序列是loxP位点,并且所述位点特异性重组酶是Cre蛋白。
本发明的核酸酶系统包括能够切割细胞内基因组或其它DNA中的靶DNA序列的任何稀有切割的(rare-cutting)核酸内切酶系统。所述核酸酶系统包括通常能够与其它核酸内切酶(例如限制酶)相区分的稀有切割的核酸内切酶,所述其他核酸内切酶可以在基因组中的数个位置进行切割。所述核酸酶系统还可以包括引导多核苷酸,其将核酸内切酶引向特异性多核苷酸序列。所述核酸酶系统可以在靶DNA序列中产生双链断裂或可以切割靶DNA序列。本领域中已知核酸酶系统,诸如工程改造的巨核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、Argonaute核酸酶系统和CRISPR/Cas系统。本发明的核酸酶系统优选选自:锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、Argonaute核酸酶系统和CRISPR/Cas系统。ZFN和TALEN是能够在特定序列处结合和切割DNA的人造核酸内切酶蛋白。本领域中已知ZFN和TALEN的结构和功能。参见例如Carlson等人,Molecular Therapy Nucleic Acids 1(1):e3(2012)。
CRISPR表示“成簇的规则间隔的短回文重复序列”。Cas蛋白,诸如Cas9,是一种在细菌中发现的核酸酶,其可以借助于单引导RNA(sgRNA)结合和切割特定序列上的DNA。本领域中已知数种CRISPR/Cas系统(参见例如美国专利公开第20140170753号、第20140234972号;Mali等人,Science 339(6121):823-826(2013);Cong等人,Science 339(6121):819-823;Shmakov等人,Molecular Cell 60:1-13(2015))。优选地,本发明的核酸酶系统包括CRISPR/Cas系统。在一些优选实施方式中,CRISPR/Cas系统包含CRISPR/Cas9系统。
Argonaute核酸酶系统包括来自Argonaute蛋白家族的核酸内切酶和使核酸内切酶靶向特异性DNA序列来产生序列特异性DNA裂解的单链引导DNA。参见例如Gao等人,利用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute进行DNA引导的基因组编辑(DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute)Nature Biotechnology,2016年5月2日在线发布。
核酸酶系统的核酸内切酶可以是蛋白质或由多核苷酸(例如DNA或RNA)编码。核酸酶系统的引导多核苷酸可以是多核苷酸(例如DNA或RNA)。
在包括CRISPR-Cas核酸酶系统的实施方式中,Cas核酸内切酶可以是蛋白质或是编码在多核苷酸(例如DNA或RNA)中。引导RNA可以由单链RNA构成或是编码在DNA多核苷酸中。引导RNA可以包括单引导RNA或退火的2部分合成的crRNA和tracrRNA分子(参见例如Alt-RTM CRISPR引导RNA,Integrated DNA Technologies)。
在包括Argonaute核酸酶系统的实施方式中,Argonaute核酸内切酶可以是蛋白质或被编码在多核苷酸(例如DNA或RNA)中。引导DNA可以是单链DNA并且可以在其5'端被磷酸化。
如本文所用,在细胞中“表达”核酸酶系统是指在细胞中转录或翻译编码核酸酶系统的多核苷酸。所述多核苷酸可以存在于表达构建体,用于增殖多核苷酸的表达载体中,或可以整合到细胞的基因组中。
本文所公开的组合物、方法和试剂盒可以用于修饰细胞中的靶DNA序列。适合的细胞包括原核细胞和真核细胞。真核细胞可以包括原生细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞。适合的真核细胞包括来自常用模式生物的细胞,所述模式生物包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、果蝇(Drosophila melanogaster)、斑马鱼(Danio rerio)、小家鼠(Mus musculus)和褐家鼠(Rattus norvegicus)。
所述细胞可以存在于生物体或对象中,或可以存在于生物体或对象的外部,诸如在细胞培养物中。适合的生物体包括真菌、植物或其它真核生物如动物。在一些实施方式中,所述生物体可以是哺乳动物,其包括但不限于小鼠、大鼠或人类。在一些实施方式中,所述生物体可以是常用的模式生物,包括但不限于酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、果蝇、斑马鱼、小家鼠和褐家鼠。
所述细胞可以是哺乳动物细胞,诸如但不限于小鼠细胞、大鼠细胞或人类细胞。所述细胞可以是干细胞(例如,胚胎干细胞、诱导的多能干细胞或含有一种或多种细胞的非人类胚胎)。在一些实施方式中,所述细胞是在修饰后移植到假孕雌性小鼠的输卵管中的小鼠胚胎。在一些实施方式中,从受试者取出细胞,接着进行修饰。
如本文所用,术语“对象”和“患者”在本文中可互换使用并且指人类和非人类动物两者。本公开的术语“非人类动物”包括所有脊椎动物,例如哺乳动物和非哺乳动物,诸如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、马、牛、猪、小鼠、大鼠、鸡、两栖动物、爬行动物等。在一些实施方式中,所述对象是人类患者。所述对象可以是需要遗传修饰的细胞的人类患者。
用于修饰靶DNA序列的组合物
本文提供用于修饰细胞中的靶DNA序列的组合物。所述组合物可以包括单链DNA(ssDNA)。所述组合物还可以包括(a)单链DNA(ssDNA)和(b)能够切割靶DNA序列的核酸酶系统。ssDNA可以包括与靶DNA序列具有基本序列同一性的5'同源臂、外源序列和与靶DNA序列具有基本序列同一性的3'同源臂。
本文还涵盖包含ssDNA组合物的递送粒子。所述递送粒子可以包括本文所公开的任一组合物。适用于递送多核苷酸和/或蛋白质的递送粒子是本领域中已知的,并且可以包括但不限于聚合物粒子、脂质体粒子和包括脂质和至少一种类型的聚合物的粒子。在一些实施方式中,所述递送粒子可以使用常用的脂质体转染(Lipofectamine)试剂形成,诸如但不限于脂质体转染RNAiMAXTM转染试剂(Thermo Fisher Scientific)。
所述递送粒子可以包括纳米级粒子和/或微米级粒子,例如,作为将组分递送到细胞以进行基因组编辑的载体。所述粒子的有效平均直径可以小于约500μm、100μm、50μm、20μm、10μm、5μm、2μm、1μm、0.5μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm、0.02μm、0.01μm,或有效平均直径在由500μm、100μm、50μm、20μm、10μm、5μm、2μm、1μm、0.5μm、0.2μm、0.1μm、0.05μm、0.02μm、0.01μm中的任一个界定的范围内(例如0.01-5μm)。所述纳米级粒子和微米级粒子可以分别称为“纳米粒子”和“微米粒子”。
本领域中已经描述了聚合物粒子。(参见例如Reis等人,Nanomedicine 2(I)(2006)8-21;Kumari等人,Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 75(2010)1-18;和美国专利公开20140066388)。聚合物粒子可以包括可生物降解的聚合物分子或可由其形成,在一些实施方式中其可以包括树枝状聚合物。适合的树枝状聚合物可以包括但不限于聚酰胺胺(PAMAM)树枝状聚合物。本领域已经使用聚酰胺胺树枝状聚合物作为细胞内递送治疗剂的载体。(参见Esfand等人,Drug Discov.Today(2001)6(8):427-436;和Bharali,International Journal of Nanomedicine(2009)4:1-7)。适用于制备本发明公开的纳米粒子的聚酰胺胺树枝状聚合物可以包括第3、第4、第5或优选至少第6代树枝状聚合物。
聚合物粒子还可以包括其它可生物降解的聚合物分子或可由其形成,所述聚合物分子可以包括但不限于聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、PLA与PGA的共聚物(例如聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA))、聚-ε-己内酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)、聚(3-羟基丁酸酯)、聚(对二氧杂环己酮)、聚丙二醇富马酸酯、聚(原酸酯)、多元醇/二烯酮缩醛加成聚合物、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(癸二酸酐)(PSA)、聚(羧基双羧基苯氧基苯氧基己酮(PCPP)、聚[双(对羧基苯氧基)甲烷](PCPM),PSA、PCPP和PCPM的共聚物、聚(氨基酸)、聚(假氨基酸)、聚磷腈、聚[(二氯)磷腈]和聚[(有机)磷腈]的衍生物、聚羟基丁酸或S-己酸、弹性蛋白、明胶和壳聚糖。(参见例如Kumari等人,Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 75(2010)1-18;和美国专利第6,913,767号;第6,884,435号;第6,565,777号;第6,534,092号;第6,528,087号;第6,379,704号;第6,309,569号;第6,264,987号;第6,210,707号;第6,090,925号;第6,022,564号;第5,981,719号;第5,871,747号;第5,723,269号;第5,603,960号;和第5,578,709号;和美国公开申请第2007/0081972号;和国际申请公开第WO 2012/115806号;和第WO2012/054425号)。在一些实施方式中,所述粒子可以包括PLGA与PAMAM的混合物。
聚合物粒子可以通过本领域中已知的方法制备。(参见例如Nagavarma等人,AsianJ.of Pharma.And Clin.Res.,第5卷,增刊3,2012,第16-23页;Cismaru等人,Rev.Roum.Chim.,2010,55(8),433-442;和国际申请公开第WO 2012/115806号;和第WO2012/054425号)。用于制备纳米粒子的适合方法可以包括利用预形成聚合物的分散液的方法,其可以包括但不限于溶剂蒸发、纳米沉淀、乳化/溶剂扩散、盐析、透析和超临界流体技术。在一些实施方式中,所述纳米粒子可以通过形成双重乳液(例如,水包油包水),接着进行溶剂蒸发来制备。根据需要,通过所公开的方法获得的纳米粒子可以进行进一步的处理步骤,诸如洗涤和冻干。任选地,所述纳米粒子可以与防腐剂(例如海藻糖)组合。
基于胶束和脂质体的粒子也可以用作适合的递送粒子。参见例如美国专利8,252,324。胶束是由两亲性分子形成的自组装球形胶态纳米粒子。胶束也被描述为分散在液体胶体中的聚集的表面活性剂分子。分离在水性环境中的胶束的核心能够包封多核苷酸和/或蛋白质,保护其免受破坏和生物环境的影响,同时改善其药代动力学和生物分布。胶束的直径通常为约5-50nm,因此由于增强的渗透性和保留作用而能够在具有渗漏脉管系统的病理区域如梗塞区和肿瘤中积聚。胶束还能够避免粒子系统的药物靶向中的主要障碍:网状内皮系统的非特异性摄取和肾分泌。
胶束可以通过任何通常已知的表面活性剂如十二烷基硫酸钠或磷脂来形成,但是与由特别设计的嵌段共聚物构成的胶束相比,作为药物递送系统的这些表面活性剂的性能较低,如Kataoka等人,同上和Torchilin等人,同上(2003)所述。用作聚合物胶束的成壳部分的柔性亲水聚合物组装成致密的栅栏壳,其通过许多水分子交联来实现囊泡的有效稳定。因此,聚合物胶束比未修饰的表面活性剂胶束解离得慢得多,保留负载的药物更长时间,并且更有效地将药物积聚在靶位点。此外,聚合物胶束容易被工程改造成尺寸在数十纳米范围内,其具有窄的尺寸分布,这在调节生物分布方面是很大的优势。
与胶束相比,脂质体是直径约50至1,000nm的双层磷脂囊泡。脂质体是生物学惰性的并且完全生物相容的;其实际上不引起有毒或抗原反应。包含在脂质体中的多核苷酸和/或蛋白质被脂质体保护而免受外部介质的破坏性作用。因此,脂质体能够将其内含物递送到细胞内,甚至不同的细胞区室内。通常,脂质体被认为是具有显著治疗潜力的有前景载体,如在许多实验室测试和临床试验中所展示,例如Torchilin,Nat.Rev.Drug discov.4,145-160(2005)。
已知脂质体和胶束可以通过向最外面的疏水性壳增加水溶性聚合物如聚乙二醇(PEG)来稳定。在这些载体粒子的疏水性表面上存在的亲水性聚合物吸引水壳,使得载体粒子的调理素吸附减少。这又反过来使得单核吞噬细胞摄取载体粒子的速率和程度都降低。长循环脂质体改善了其中所包封的药物的治疗指数。当前,基于长循环脂质体的数种制剂可购得,例如一种含聚乙二醇化(PEG化)脂质体的阿霉素(doxorubicin),Sharp等人,Drugs 62 2089-2126(2002)。Doxil由bridgewater,N.J.,USA的ortho biotechproducts,LP制造。O'Shaughnessy,Clin.Breast cancer 4,318-328,(2003)展示通过将阿霉素封装到PEG化脂质体中实现了该药物向患有乳癌转移的患者的实体肿瘤中的选择性递送,从而引起随后的存活改善。将脂质体阿霉素与紫杉醇(paclitaxel)(可以Bristol-Meyers Squibb Company,New York,N.Y.,USA获得)、楷莱(caelyx)(Schering-Plough corporation,Kenilworth,N.J.,USA)和卡铂(carboplatin)(可以从Bristol-Meyers Squibb company以获得)组合也展示出功效。已经批准了数种脂质体制剂用于临床应用或进行临床评估,Torchilin,同上(2005)。
用于递送CRISPR/Cas系统的组分的示例性递送粒子也已经公开于例如美国专利公开第20150232883号以及WO专利公开第2014/093635号和第2015/089351号。在一些实施方式中,递送粒子包含1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、聚乙二醇(PEG)、胆固醇或其任何组合。
所述递送粒子还可以包括含有脂质和聚合物组分的粒子。例如,含有磷脂双层和聚(β-氨基酯)(PBAE)的粒子已经被开发用于体内递送多核苷酸。参见例如Su等人,Molecular Pharmaceutics,8(3):774-787(2011)。
所述递送粒子可以包括表面活性剂,所述表面活性剂可以包括阳离子表面活性剂。适合的阳离子表面活性剂可以包括但不限于季铵化合物,例如具有式(X)3N+(CH2)n(CH3)的季铵化合物或其盐,其中X是C1-6烷基或芳基,并且n=(9、11、13、15或17)。季铵化合物的适合的盐可以包括卤化盐(例如Cl-或Br-盐),诸如溴化鲸蜡基三甲基铵(CTAB)。
所述递送粒子优选具有有利于被靶细胞摄取的物理特性。例如,粒子优选具有有利于被靶细胞摄取的尺寸和电荷。通常,粒子的平均有效直径小于1微米,并且粒子的平均有效直径优选为约25nm至约500nm,并且更优选为约50nm至约250nm,并且最优选为约100nm至约150nm。可以通过本领域中已知的方法评估粒子的尺寸(例如平均有效直径),所述方法可以包括但不限于透射电子显微术(TEM)、扫描电子显微术(SEM)、原子力显微术(AFM)、光子相关光谱法(PCS)、纳米粒子表面积监测仪(NSAM)、冷凝粒子计数器(CPC)、微分迁移率分析仪(DMA)、扫描迁移粒子分级仪(SMPS)、纳米粒子追踪分析(NTA)、X射线衍射(XRD)、气溶胶飞行时间质谱法(ATFMS)和气溶胶粒子质量分析仪(APM)。
所公开的递送粒子优选具有有利于被靶细胞摄取的ξ电位。通常,粒子的ξ电位大于0。在一些实施方式中,纳米粒子的ξ电位为约5mV至约45mV、约15mV至约35mV,或约20mV至约30mV。ξ电位可以通过包括电泳迁移率或动态电泳迁移率的特征来实验测定。可以使用电动现象和电声现象来计算ξ电位。
即使递送粒子在其表面上不包括特异性配体,所述递送粒子也将被细胞非特异性地摄取。然而,所公开的递送粒子可以被配置成还包括特异性靶向特定细胞类型的配体。为了实现递送粒子的更特异性靶向,可以使用预先结合程序用各种配体修饰这些粒子。例如,将抗体和小肽连接于聚乙二醇链的暴露于水的尖端,Blume等人,Biomembranes 1149,180-184(1993)。抗体和小肽还通过反应性对硝基苯基羰基、N-苯并三唑羰基或顺丁烯二酰亚胺封端的PEG-磷脂酰乙醇胺进行结合,Moreira,Pharm.Res.19,265-269(2002);Torchilin等人,同上(2001);xiong,等人,J.Pharm.Sci.94,1782-1793(2005)。
递送粒子方法
本发明的一方面提供一种修饰细胞中的靶DNA序列的方法,其包括使细胞与本文所公开的任何一种递送粒子以允许将所公开的组合物递送到细胞中并且修饰靶DNA序列的有效量接触。在这些方法中,细胞可以直接或间接地在体内、体外、原位或离体与所述递送粒子接触。在体内的情况下,根据最常使用的程序,在个体体内进行与对象的细胞的接触。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或所要的生物学和/或临床结果的量。所述治疗有效量根据化合物、制剂或组合物、疾病和其严重性以及待治疗对象的年龄、体重、身体状况和反应性而变化。本发明组合物优选被包含在用于向人类或非人类哺乳动物患者施用的递送粒子内。本领域技术人员可以容易地选择适合的递送粒子,并且可以取决于所选择的施用途径。
ssDNA和核酸酶系统可以在同一个递送粒子或分开的递送粒子中递送。同样地,核酸酶系统的组分可以在同一个递送粒子或分开的递送粒子中递送。例如,关于CRISPR/Cas系统,Cas酶(例如Cas9)(蛋白质、RNA或DNA)和引导RNA可以在同一个递送粒子中递送或可以在分开的递送粒子中递送。
可以一起施用核酸酶系统和ssDNA。或者,可以在ssDNA之前递送核酸酶系统以给予核酸酶系统表达的时间。在一些实施方式中,可以在施用ssDNA之前1-12小时(优选约2-6小时)施用核酸酶系统。此外,额外的施用ssDNA和/或核酸酶系统可能适用于实现足够水平的DNA修饰或基因组修饰。
递送粒子还可以存在于药物组合物中,所述药物组合物可以含有药学上可接受的组分,诸如赋形剂、载体和/或稳定剂。这些组分包括本身不诱导对接受组合物的个体有害的免疫应答并且可以在不引起不当毒性的情况下施用的任何药剂。药学上可接受的组分包括但不限于液体,诸如水、盐水、甘油和乙醇。其中可以包括药学上可接受的盐,例如无机酸盐,诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等;和有机酸盐,诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外,这些媒剂中可以存在辅助物质,诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。其它示例性组分包括乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、右旋糖酐、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。本发明中载体的选择不受限制。任选地,除ssDNA和核酸酶系统之外,本公开的组合物还可以包含其它常规药物成分,诸如防腐剂、化学稳定剂等。适合的示例性成分包括微晶纤维素、羧基甲基纤维素钠、聚山梨酸酯80、苯乙醇、氯丁醇,山梨酸钾,山梨酸,二氧化硫,没食子酸丙酯,对羟基苯甲酸酯,乙基香兰素,甘油,苯酚,对氯酚,明胶和白蛋白。在REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中对药学上可接受的赋形剂进行了全面讨论。
适当的剂量取决于所选递送粒子组合物的特异性、施用途径、所治疗的哺乳动物(例如人类或非人类灵长类动物或其它哺乳动物)、待治疗对象的年龄、体重、性别和一般状况以及施用模式等其他因素。因此,所述适当的剂量可能因患者而异。本领域技术人员可以容易地确定适当的有效量。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。此外,适当时可以向对象施用多次剂量。本领域技术人员可以容易地确定适当的剂量数。然而,可能需要调节剂量来考虑替代的施用途径,或平衡治疗益处与任何副作用。这些剂量可以根据使用本发明组合物的治疗应用而变化。
施用足量的本发明的递送粒子以使其进入所要细胞并确保转移的核酸组合物具有足够水平的功能来提供治疗益处,而无过度副作用,或具有医学上可接受的生理学作用,这可由医学领域技术人员确定。
所公开的递送粒子可以以任何适合的方式施用。然而,在一些实施方式中,递送粒子存在于通过注射(例如静脉内注射、腹膜注射或皮下注射)施用的药物组合物中。例如,递送粒子可以与适用于注射的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂诸如盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液等组合。具体的给药方案,即剂量、时间和重复,将取决于具体个体和该个体的病史。
本文所公开的药物组合物可以通过包括但不限于混合、粒化、溶解或冻干方法的手段来制造。
在所公开方法中用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。无菌组合物可以例如经由通过无菌过滤膜过滤来制备。
试剂盒和系统
本文还提供用于修饰细胞中的靶DNA序列的试剂盒或系统。所述试剂盒或系统可以用于进行本文所述的任何方法。所述试剂盒或系统可以包括RNA聚合酶、逆转录酶、RNA降解酶和核酸酶系统。所述试剂盒或系统还可以包括用于进行本文所述的任何方法的说明书。任选地,所述试剂盒或系统可以包括DNA载体,其从5'至3'包含启动子、克隆位点和限制酶位点。在一些实施方式中,所述启动子是T7、T3或SP6启动子。应了解,逆转录酶和RNA降解酶可以是同一种酶的一部分,因为已知逆转录酶可以具有RNase活性。
另一方面,本发明的试剂盒或系统包括(a)单链DNA(ssDNA)和(b)能够切割靶DNA序列的核酸酶系统。
工程改造的真核细胞
本文还公开了工程改造或重组的真核细胞,其包括通过本文所公开的方法进行修饰的DNA。在一些实施方式中,所述工程改造的真核细胞包括amiRNA。所述工程改造的真核细胞可以包括编码amiRNA的外源DNA构建体。DNA构建体可被插入基因的内含子中。优选将DNA构建体插入内含子的进化上非保守区中。这些非保守区不太可能含有调节序列,并且可以通过比较相关物种之间的内含子序列来确定。在实施例中,本发明者比较了小鼠和人类eEF-2基因的内含子区。同样地,可以将小鼠内含子序列与其它哺乳动物进行比较,所述其他哺乳动物包括但不限于大鼠。在一些实施方式中,靶向小鼠内含子DNA序列与可比较的人类内含子DNA序列具有不超过80%、70%、60%、50%、40%或30%的序列同一性。
该基因可以是细胞内源的(例如基因组或其它自复制形式的DNA,诸如在细胞中内源存在的质粒)或细胞外源的(例如引入细胞中的转基因或质粒)。该基因还可以组成性表达或可以以组织特异性的方式表达。在一些实施方式中,将DNA构建体插入内源eEF-2基因的内含子中。适合地,所述内含子是内源eEF-2基因的内含子1或内含子6。
在一些实施方式中,所述DNA构建体缺乏启动子、报告序列和/或polyA尾。用常规技术制备的转基因构建体中通常需要这些组分。然而,在实施例中,本发明者令人惊喜地证实,当amiRNA特异性靶向内含子时,不需要这些组分来敲减特定基因的表达。
任选地,工程改造的真核细胞中编码的amiRNA可以侧接有两个位点特异性重组酶靶序列。适合的位点特异性重组酶靶序列包括但不限于FRT和loxP序列。在一些实施方式中,两个位点特异性重组酶靶序列的取向是相反的。在一些实施方式中,工程改造的真核细胞还可以包括识别细胞中的位点特异性重组酶靶序列的位点特异性重组酶。适合的位点特异性重组酶包括但不限于FLP和Cre。优选地,所述两个位点特异性重组酶靶序列是loxP位点,并且所述位点特异性重组酶是Cre蛋白。
适合的工程改造的真核细胞包括来自常用模式生物的细胞,所述模式生物包括但不限于酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、果蝇、斑马鱼、小家鼠和褐家鼠。在一些实施方式中,所述工程改造的真核细胞是哺乳动物细胞,诸如但不限于小鼠细胞、大鼠细胞或人类细胞。在一些实施方式中,所述工程改造的真核细胞是干细胞(例如,胚胎干细胞、诱导的多能干细胞或含有一种或多种细胞的非人类胚胎)。在一些实施方式中,所述工程改造的真核细胞是在修饰后移植入假孕雌性小鼠的输卵管中的小鼠胚胎。在一些实施方式中,在修饰之前从对象中取出所述工程改造的真核细胞。
本文还提供了包括任何一种公开的工程改造的真核细胞的真核生物。适合的真核生物包括真菌、植物或其它真核生物。在一些实施方式中,所述真核生物是哺乳动物,其包括但不限于小鼠、大鼠或人类。在一些实施方式中,真核生物体是常用的模式生物,包括但不限于酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、果蝇、斑马鱼、小家鼠和褐家鼠。
在以上描述中,对于本领域技术人员显而易见的是,在不背离本发明的范畴和精神的情况下,可以对本文公开的发明进行各种替代和修改。在本文中说明性地适当描述的本发明可以在不存在任何元件、没有本文中未特别公开的限制下实施。使用的术语和表达被用作描述的术语而不具有限制性,并且在使用这些术语和表达时无意排除显示和描述的特征或其部分的任何等效物,而是承认在本发明的范畴内可以进行各种修改。因此,应了解,尽管本发明已经通过特定实施方式和任选特征来说明,但是本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改和/或变化,并且认为这些修改和变化属于本发明的范畴。
本文引用了许多专利和非专利参考文献。所引用的参考文献以全文引用的方式并入本文中。如果本说明书中的术语的定义与引用的参考文献中的术语的定义之间存在不一致,则该术语应该基于本说明书中的定义来解释。
不承认包括本说明书中引用的任何非专利或专利文献的任何参考文献构成现有技术。具体地,应了解,除非另外说明,否则在本文中提及任何文件并不构成承认任何这些文件形成美国或任何其它国家的本领域公知常识的一部分。本申请者保留质疑本文引用的任何文件的准确性和适当性的权利。
实施例
以下实施例是说明性的并且不旨在限制要求保护的标的物的范畴。
实施例1
参考Miura等人,“CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice byintronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA”Scientific Reports 5,文章编号:12799,doi:10.1038/srep12799(2015)第1-11页,2015年8月5日,包括增补信息,其内容以引用的方式并入本文中。
摘要
可以调节基因剂量的敲减小鼠模型为基因功能提供了有价值的见解。通常,这些模型通过敲减表达盒的基于胚胎干(ES)细胞的靶向插入或原核注射来产生。然而,这些方法与费力且费时的步骤相关,诸如产生具有表达功能性RNAi盒所需的元件的大构建体、ES细胞处理或筛选具有所要敲减作用的小鼠。本文展示了可以通过使用成簇的规则间隔的短回文重复序列/Crispr相关9(CRISPR/Cas9)系统将人造微RNA(amiRNA)序列靶向插入基因组中的特定基因座[诸如内源真核翻译延伸因子2(eEF-2)基因的内含子区]中来产生可靠的敲减模型。我们使用体外合成的单链DNA(约0.5-kb长),其编码作为CRISPR/Cas9诱变中的修复模板的amiRNA序列。我们使用这种方法展示了针对外源基因(eGFP)或内源基因[正小齿同源框2(Otx2)]的amiRNA盒可以有效地靶向基因组中的预定基因座并使基因表达敲减。我们还提供了一种策略来用这种方法建立条件敲减模型。
引言
通常通过破坏基因产生敲除模型来实现对小鼠中基因功能的研究,并对动物进行表型分析来了解给定蛋白质完全损失的影响。研究中等水平的蛋白质丧失的影响还可以为发育和疾病期间的基因功能提供有价值的见解,尤其是对于完全蛋白质损失造成胚胎致死的那些基因。在过去的十年中,已经通过表达短发夹RNA(shRNA)或人造微RNA(amiRNA)产生了数种转基因敲减模型来进行基因剂量作用研究1,2,3。在这些敲减模型中,针对RNA干扰(RNAi)的靶序列被设计为互补链,以使得其结合于mRNA来进行其降解或抑制翻译。
表达shRNA或amiRNA的敲减小鼠通过如下步骤产生:将转基因盒注入合子的原核中4,5,6,接着将其随机插入基因组中;或通过靶向基因组中特定基因座的转基因的胚胎干(ES)细胞类方法7,8。前一种方法由于诸如整合位点的局部作用、转基因沉默、由多个整合位点引起的副作用和/或多个串联转基因插入的原因经常引起多样的转基因表达。尽管ES细胞靶向方法可以克服这些缺陷,但这种方法费力、费时并且成本过高。此外,在这两种策略中,典型的转基因构建体构成各种元件的数千碱基对(kbp)序列,所述元件诸如适合的启动子、经常与报道基因偶合的amiRNA序列和polyA信号。
内源miRNA通常包含在编码蛋白质的基因的内含子内。内含子miRNA与宿主基因一起共表达。内含子中miRNA的存在似乎不影响宿主基因的表达,这不同于位于基因的3'非翻译区(3'UTR)中的那些基因9。因此,预期可以通过将amiRNA序列插入内源基因的内含子区中获得敲减小鼠,而不影响宿主基因的表达。如果这种策略(将amiRNA插入内含子区中)确实产生可靠的敲减,则可以在基因组中提供多个内含子位点来作为用于靶向插入amiRNA序列的选择。
CRISPR/Cas9系统已经成为使用非同源末端接合(NHEJ)途径或同源引导修复(HDR)途径快速编辑细胞和生物体的基因组的精选方法10,11。HDR途径用于通过共引入为单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)形式的修复模板DNA在切割位点插入感兴趣的DNA(DOI)。ssDNA修复模板需要较短的同源臂并且插入效率非常高,而dsDNA修复模板需要长同源臂,并且插入效率要低得多12,13,14。由于可以合成的ssDNA全长的限制,ssDNA修复方法不能用于插入较长的序列。商业上可合成的ssDNA寡核苷酸的当前长度限制最多为200个碱基。此外,根据文献,还没有报道使用超过200个碱基的ssDNA来进行基因组的靶向修饰。
在本文中,我们利用两步法来合成更长的ssDNA分子并且展示其有效地用作CRISPR/Cas9介导的序列敲入的修复模板。在第一步中,从DNA模板合成RNA。在第二步中,进行所述RNA的逆转录来产生ssDNA。我们合成了编码针对外源基因(eGFP)和内源基因[正小齿同源框2(Otx2)]的amiRNA序列的ssDNA,并将其用作CRISPR/Cas9介导的敲入实验中的修复模板。我们展示了编码amiRNA序列的ssDNA模板被高效插入真核翻译延伸因子2(eEF-2)的内含子6中,从而成功进行基因敲减。通过将Cre-loxP系统与这种方法组合,我们还展示了插入的amiRNA序列可以进行条件性表达。此外,与基于随机或ES细胞的靶向转基因方法中必需的复杂设计不同,这种系统能够使用较短的不太复杂的amiRNA敲减转基因盒。ssDNA序列的长度在296至514个碱基的范围内。因此,可以通过我们在本文描述的方法容易地合成多达514个碱基的序列,并且它们可以用作HDR模板来利用CRISPR/Cas9系统产生敲入突变。
结果
ssDNA的制备:假设类似于基于单链寡核苷酸的短序列插入,如果可以合成较长的ssDNA并且在CRISPR/Cas9实验中提供来作为修复模板,则这种较长的ssDNA可以较高效地插入。因为市售ssDNA合成方法可以产生最多只有200个碱基的寡核苷酸,所以我们采用另一种策略合成较长的ssDNA分子来将其用作修复模板。出于这个目的,首先产生转录成RNA的DNA模板;接着将RNA逆转录回来以产生ssDNA分子。我们称这种方法为“体外转录和逆转录(ivTRT)”。DNA模板是含有T7启动子、amiRNA区和用于靶向插入的短同源臂的PCR产物或质粒(图1)。在体外转录反应中使用约100-500ng(对于PCR产物)或1,250ng(对于质粒)凝胶纯化的线性DNA模板进行RNA合成。典型产量在8至18μg RNA范围内。接着,通过逆转录反应对5μg RNA进行cDNA合成。通过RNaseH处理完全降解RNA后,将所得cDNA凝胶纯化并且在显微注射缓冲液中洗脱。cDNA的产量在310至807ng范围内,其足以用于CRISPR/Cas9注射,因为用于显微注射的最终浓度是14-20ng/μl。
将针对eGFP的amiRNA序列靶向插入eEF-2基因的内含子区。我们的目的在于将amiRNA序列插入基因组位点,该位点将容易地允许转基因表达而不具有在某些染色体位置中存在的抑制性位置作用。选择真核翻译延伸因子2(eEF-2)基因的内含子作为候选者,因为在发育和成人阶段,eEF-2都以高水平普遍且一致地表达15。匹配并比较了小鼠和人类eEF-2基因的相应内含子区域,揭露了小鼠内含子1和6的部分位于进化非保守区之间。我们推断这些非保守区不太可能含有调节序列,因此不具有生物学功能。eEF-2基因中两个较不保守的内含子区被称为靶位点1和2(TS1和TS2)(图2a、图5a)。如方法部分所述,将sgRNA设计为针对TS1和TS2,以将amiRNA盒插入这些位点中。作为测试这个的第一模型,我们使用之前产生的显示高度稳定的eGFP表达的eGFP Tg小鼠模型插入amiRNA来敲减eGFP基因16,17。制备用于TS1和TS2的含有amiR-eGFP123/419的434个碱基的ssDNA拷贝,并在含有Cas9 mRNA(10ng/μl)和相应的CRISPR sgRNA(10ng/ml)的显微注射中用作修复DNA(20ng/μl)。关于TS1和TS2的这些注射实验被分别指定为实验1和实验2。用于注射的合子通过使用从纯合eGFP Tg小鼠收集的精子对从野生型C57BL/6小鼠收集的卵子进行体外受精来获得。将被注射的合子转移到假孕小鼠的输卵管中,并使其发育至胚胎第13.5天(E13.5),此时将其收集并检查eGFP荧光。
从实验1和实验2都获得了展现低eGFP荧光的胚胎,表明amiRNA序列有效地敲减了eGFP表达(图2b、图5b)。通过PCR来检测amiRNA序列在靶位点处的插入的基因分型分析与eGFP表达降低充分相关(图2c、图5c)。对于实验1(插入TS1中)和实验2(插入TS2中),插入效率分别为50.0%(3/6)和83.3%(5/6)(图2d、图5d)。令人惊讶的是,在实验2(样品#2、#5和#6)中,amiR-eGFP被插入两个等位基因中,尽管在实验2样品#6中PCR片段的尺寸大于预期(图2c)。测序揭露实验2样品#1、#2、#3和#5显示正确的插入,而实验2样品#6显示异常插入18。这种样品具有两个不同的等位基因;一个等位基因(图2c中下方的条带)含有amiRNA盒(amiR-eGFP123和amiR-eGFP419各一个拷贝)以及载体序列的一部分。另一个等位基因(图2c中上方的条带)含有amiR-eGFP123的一个拷贝,amiR-eGFP419的两个拷贝和载体序列的一部分。值得注意的是,这种样品显示eGFP荧光几乎完全丧失,这表明amiR-eGFP123-eGFP419盒和amiR-eGFP419的额外拷贝(在一个等位基因中)的插入的纯合性可能有助于更有效的敲减。然而,难以排除载体序列对amiRNA盒表达的影响。值得注意的是,TS1区(实验1)的所有插入等位基因的PCR扩增片段显示出非预期的尺寸(图5c),并且测序显示所有等位基因都在TS1基因组区附近含有ssDNA盒的部分插入和/或缺失[例如,在实验1样品#3中检测到amiR-eGFP123区域中的154个碱基对(bp)缺失]。这表明在ssDNA介导的修复期间TS1位点不稳定,或ssDNA修复模板的同源臂区中可能的二级结构可能已经干扰了模板的正确插入。
针对内源基因的amiRNA序列的靶向插入:我们接着测试了上述策略以敲减内源基因Otx2,所述内源基因Otx2编码参与颅面发育(例如头部、脑和眼睛的一部分)的含同源框的转录因子19,20。因为降低的Otx2水平与头部或眼睛的畸形密切相关,所以敲减作用的鉴定能够容易地通过形态表型检测21,22,23。
基于eGFP敲减的结果,使用显示较好的完整序列插入率的TS2位点作为插入针对Otx2的amiRNA序列的靶位点(图3a和图6a)。测试了针对Otx2的两个不同的amiRNA靶序列:amiR-Otx2_518(实验3)和amiR-Otx2_546(实验4)。这些amiRNA序列的ssDNA长度为296个碱基,将其以14-20ng/μl浓度与10ng/μl Cas9mRNA和10ng/μl sgRNA一起注射到C57BL/6合子中。将被注射的合子转移到假孕小鼠的输卵管。在E14.5回收胎鼠并检查敲减表型。我们在来自实验4的两个胚胎中观察到推定的Otx2敲减表型(图3b),试验4在注射混合物中包含amiR-Otx2_546。一个胚胎(实验4样品#3)呈现头部、眼睛和身体尺寸的明显减小。这种表型部分类似于Fossat等人(2006)报道的Otx2条件敲除小鼠23。在实验4的胚胎#6中观察到无眼(缺乏双眼)表型。这与Bernard等人(2014)22报道的Otx2亚效等位基因(Otx2AA/AA)表型类似。然而,从注射amiR-Otx2_518的鼠胎中没有获得显示推定的Otx2敲减表型的胚胎(图6b)。
基因分型揭露对于实验3和实验4,插入效率分别为10.0%(1/10)和66.7%(4/6)(图3c和图6c)。与观察到的表型一致,amiRNA序列被插入实验4样品#3胎鼠中的eEF-2内含子6的两个等位基因中(图3b、c)。此外,展现无眼的实验4样品#6胚胎也在基因组中含有预期的amiR-Otx2_546插入(图3b、c)。但是,实验4样品#4和#5和实验3样品#10胎鼠未展现明显的敲减表型。序列分析揭露实验4样品#4胎鼠缺乏来自盒的23-bp核苷酸,其包括amiRNA序列的3'端中被认为对于amiRNA加工不关键的部分。另一方面,实验4样品#5和实验3样品#10具有完整的amiR-Otx2。在这些胎鼠中未发生敲减的观察结果表明amiRNA序列对于敲减是效率低的,和/或在这些胚胎中被插入的细胞(嵌合体)的比例较低。实验4样品#1和#2中出现的多个条带的序列分析显示这些条带含有插入缺失(indel)突变并且不含ssDNA衍生的序列。总之,这些结果指示将amiRNA序列插入eEF-2内含子6中能够引起内源基因的敲减并产生可观察到的表型。
条件性敲减amiRNA序列的靶向插入。导致胚胎致死的某些amiRNA序列的组成性表达能够最终导致模型不能用于进一步研究24,25。在这些情况下,条件性表达策略提供了最佳的解决方案来产生可行的模型。因此,我们接着测试Cre-loxP系统,一种广泛使用的条件性活化系统在我们的敲减策略中的适用性。出于这个目的,如图4a所示,包括突变的loxP序列JT15和JTZ17来侧接amiRNA序列,并且将盒沿与eEF-2基因取向相反的方向放置。因为取向相反,所以不会产生功能性amiRNA,并且等位基因将处于“关闭”状态(例如,‘miRNA-off’等位基因)。在施用Cre后,在取向相反的JT15与JTZ1726之间发生Cre-loxP介导的重组,从而使amiRNA区逆转而将所述等位基因转化为“开启”状态(‘amiRNA-on’等位基因),这将允许表达由eEF-2启动子驱动的功能性amiRNA。由于JT15和JTZ17在其反向重复区域内含有突变,所以逆转步骤将是单向的,并且Cre重组后‘amiRNA-on’状态将被锁定27。
为了测试这个概念,合成了514个碱基长的ssDNA,其含有针对eGFP的amiRNA以及侧接的突变loxP和用于靶向整合的同源区(图4a)。将此ssDNA(20ng/μl)与Cas9 mRNA(10ng/μl)和sgRNA(10ng/μl)一起注射到合子中(实验5)。如实验1和实验2所述获得合子。回收衍生自被注射的合子的E14.5胎鼠,并通过PCR分析以检测amiRNA序列在靶位点处的插入。回收的九个胚胎中的四个(44.4%)具有预期插入,其中一个显示在两个等位基因中的插入(图4b、c)。序列分析揭露所有四个胎鼠都含有正确的插入等位基因(例如实验5样品#8)。
为了测试工程改造的敲减盒是否可在Cre重组后经历从‘amiRNA-off’到‘amiRNA-on’状态的转化,将iCre表达载体(pAYC)转染到从胚胎分离的成纤维细胞(实验5样品#4作为测试样品并且样品#6作为阴性对照)中并评估eGFP表达。培养转染的细胞9天后,通过荧光活化细胞分选(FACS)检查eGFP荧光强度,显示eGFP荧光的中度减少仅在来自实验5样品#4胚胎的转染有iCre的细胞中发生。相反,在未转染的对照和amiRNA阴性胚胎衍生的细胞中没有观察到荧光降低(实验5样品#6;图4d)。与此结果一致,使用引物组PP119/M412的PCR基因分型检测到仅在转染有iCre的样品(实验5样品#4;图4e)中存在通过Cre-loxP介导的逆转产生的‘amiRNA-on’等位基因。
讨论
CRISPR/Cas9系统因其技术简单已经成为受欢迎的基因组编辑方法。其不仅可以用于基因破环,而且可以用于使用HDR进行靶向修饰。使用长度最多为200个碱基的ssDNA供体作为供体来插入短延伸序列10。由于商业上不能合成更长的ssDNA(长度>200个碱基),所以更长的插入需要使用dsDNA(基于质粒的构建体)。在这个研究中,我们使用称为ivTRT的技术合成了长度为约0.5kb的ssDNA供体。接着将所述ssDNA供体用于CRISPR/Cas9介导的靶向插入实验。我们观察到高达83.3%的总插入效率和在两种等位基因中高达50%的插入效率。值得注意的是,这些样品中的同源臂长度仅为每侧55个碱基。这些结果表明,即使供体的长度为约0.5kb,基于ssDNA的插入也是有效的。对于长度为千碱基的较长ssDNA分子,评估此策略将是有意义的。考虑到体外转录反应通常可以产生长度超过4至5-kb的RNA,并且使用某种逆转录酶可以合成长度高达10-kb的cDNA,可以使用ivTRT来合成长度为千碱基的ssDNA。
如果实际上我们的方法可以用于合成和插入较长的ssDNA模板,那么该方法将非常适用于插入较大的表达盒,诸如启动子:cDNA:终止信号或融合蛋白标签(例如自裂解肽酶如T2A之后的GFP或Cre至基因最后密码子的3'端)。参见图9。系统评估具有不同长度的ssDNA供体的效率将是有意义的。较长的ssDNA可能需要较长的同源臂来用于有效地靶向。然而,考虑到成功的HDR可能发生在ssDNA末端少至50至60个碱基的情况下,所以并不预计会出现这种情况。参见图9。我们目前正在测试用ivTRT产生的较长ssDNA的插入效率以及上述的一些应用。在某些较长序列中的二级结构也可能导致插入效率较低和/或不准确的插入。将来的研究将能够系统地评估这些参数。
在TS2位点处含有插入(其包括eGFP和Otx2 amiRNA盒插入两者)的总共14个样品中,12个样品(86%)具有正确插入的盒并且仅有2个样品(实验2样品#6和实验4样品#4)含有不准确的插入。实验2样品#6除完整或额外的amiRNA序列外还含有源自载体的序列。源自载体的序列的存在可能是由于在ssDNA制备方法期间的体外转录反应后通过DNase处理没有完全去除模板DNA,并且可能在切割位点插入了残余的dsDNA(其含有载体序列)。我们还观察到,在一个样品(实验4样品#4)中,在amiRNA区域的3'端附近有23-bp的缺失。这可能是由于在插入期间插入了部分降解的cDNA(缺乏amiRNA区域下游的3'序列)或ssDNA模板的末端23个核苷酸的丢失。很可能这种缺失并非由于不完全的cDNA合成而发生,因为这个末端来源于引物端。约86%(14个中有12个)的后代已经正确插入了供体序列的事实表明通过ivTRT方法合成的ssDNA可以使用CRISPR/Cas9产生相当高准确性的敲入盒插入。
实验2样品#6胎鼠中存在源自载体的序列指示残余的dsDNA(在ssDNA制备步骤中未完全去除)有可能本来可以用作双链断裂(DSB)修复的供体模板。为了独立测试这种可能性,注射dsDNA(作为PCR产物提供)并分析样品的dsDNA模板的插入效率。从dsDNA注射获得的总计20%(2/10)的合子显示靶向插入,而来自ssDNA注射的合子的50%(12/24)含有插入等位基因(图7)。值得注意的是,与ssDNA注射相比,至少在这些实验条件下,dsDNA注射(20ng/μl浓度)对合子造成过度损伤。因此,我们得出结论:具有短同源臂的基于dsDNA的靶向插入也是可能的,尽管ssDNA敲入策略似乎比dsDNA敲入策略更有效。应该注意到,线性dsDNA可以容易地(作为转基因)插入随机位点。因此,与使用环形dsDNA或线性ssDNA模板相比,dsDNA不是理想的修复模板。
我们怀疑新型遗传基因座(eEF-2)和内含子靶向方法对amiRNA介导的敲减的有效性的适合性,因为插入的amiRNA盒的成功表达将取决于宿主基因的正常表达,并且插入事件也不应该影响宿主基因的表达。内源基因(Otx2)和外源基因(eGFP)两者的敲减效率表明,我们选择的eEF-2基因座是一个好的选择,并且内含子位点插入提供了一种新策略。然而,在eGFP和Otx2敲减中,胎鼠中的敲减作用似乎都是多样的,这可能归因于插入是单等位基因或双等位基因和/或嵌合体。实际上,在显示针对eGFP以及Otx2的amiRNA的双等位基因插入的样品中观察到较高的敲减。尽管敲减作用的多样性可以在建立突变后通过种系传递变稳定,但是考虑到存在由于嵌合体细胞突变而发生的人类疾病,在F0动物中观察到的表型变异通常可以提供有价值的信息28。
将盒插入内含子位点可能影响宿主基因的正确转录和剪接。为了排除这种可能性,我们检查了TS2位点插入是否影响培养的细胞中eEF-2基因的剪接。如图8所示,eEF-2基因的剪接是完整的。此外,最近我们产生了含有针对Otx2基因的条件amiRNA的活幼崽,并且这些动物没有显示任何异常(数据未显示)。使用MIT的GENSCAN网络服务器(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)29进行分析,以排除盒的内含子插入是否会影响剪接事件的预测。结果表明修饰的eEF-2基因组(在实验2、4和5中获得)预测正常的剪接模式。这些结果指示amiRNA序列插入eEF-2内含子中对其转录和剪接没有任何影响。其它内含子(或其它基因的内含子)在插入外源序列的适合性方面有可能与本文所测试的这一个不类似,特别是如果其含有任何调节序列的情况下。
为了克服与组成型敲减相关的限制,诸如缺乏组织特异性或由RNAi导致的致死性,使用利用Cre-loxP的条件方法或利用四环素的诱导型RNAi24,25。在基于Cre-loxP的条件RNAi方法中,为防止组成型活性shRNA的产生,将侧接loxP的填充序列插入shRNA环中或启动子与shRNA之间24,25。在这种情况下,在Cre介导的从盒中切除填充序列之后诱导RNAi。作为另一种方法,Stern等人(2008)使用了利用两对突变loxP位点(lox2272和lox5171)的不可逆逆转策略,从而在amiRNA从反义逆转为正义取向后诱导RNAi30。我们能够很容易地在我们的条件敲减方法中采用使用突变loxP(JT15和JTZ17)的逆转策略,这与此处不能使用的侧接有loxP位点的(floxed)填充序列策略不同,因为填充序列在转录单元中的存在可以破坏宿主基因的正确转录。当将表达iCre的载体引入由敲入胎鼠制备的胚胎成纤维细胞中时,观察到基于amiRNA的敲减,指示插入eEF-2基因座的敲减盒的条件活化按预期进行。应该注意到,逆转策略可能不能用于编码来自反义链的重叠转录本的内含子区域。
总之,本研究成功建立了一种使用CRISPR/Cas9系统产生敲减小鼠的简单并且有效的方法。为了产生编码amiRNA序列的供体修复DNA,我们使用由称为ivTRT的简单策略合成的ssDNA,并获得高的整合效率。我们还展示,靶向内含子位点(例如,eEF-2基因的内含子6)的amiRNA赋予胎鼠中的敲减作用,指示该策略对于发育重要基因的快速和可行的分析是强有力的。我们目前正在研究这种方法产生的动物模型中敲减表型的遗传性。据我们所知,这是展示成功敲减模型能够通过将amiRNA序列靶向插入到内含子序列中来产生的第一个报道。检查其它基因的内含子作为潜在候选者来实现插入的amiRNA盒的期望水平的较高/较低表达或甚至组织特异性表达是有意义的。本文描述的方法不需要构建复杂的载体,并且可以通过直接显微注射方法来完成,而不使用费力的基于ES细胞的步骤。我们的方法提供了一种简单、快速并且有效的方法来产生适用于基因功能的亚效等位基因分析的敲减模型。此外,这种方法可以用于使用商业上合成的单链寡核苷酸不能完成的敲入序列的较长延伸序列的插入。
方法
amiRNA的设计。使用BLOCK-iT RNAi设计工具(Invitrogen,Carlsbad,CA)设计用于靶向eGFP基因(eGFP123和eGFP419)或Otx2基因(Otx2_518和Otx2_546)的amiRNA序列。对于针对eGFP的amiRNA序列,将两个pre-miRNA序列(eGFP123和eGFP419)串联组装,而针对Otx2的amiRNA则分别进行测试(Otx2_518或Otx2_546)。
通过ivTRT合成ssDNA。将合成的DNA寡核苷酸(顶部和底部;图5)热变性并且退火,接着克隆到“具有EmGFP的BLOCK-iT Pol II miR RNAi表达载体试剂盒”(Invitrogen,Carlsbad,CA)中提供的载体中。通过使用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶(TOYOBO,Osaka,Japan)用含有55个碱基的同源臂的引物组(PP109/PP110用于实验1,PP111/PP112用于实验2、实验3和实验4)进行PCR来扩增跨过pre-miRNA的区域,并克隆到pUC119载体的SmaI位点中。通过使用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶进行PCR(用如下引物组:PP123/M272用于实验1,PP125/M322用于实验2和实验4,PP125/M272用于实验3;图5)从序列确认的克隆再扩增含有amiRNA和同源臂序列的区域,将DNA片段凝胶纯化并且用作ivTRT的模板。通过基因合成(GENEWIZ,Inc.,South Plainfield,NJ)基于连接的克隆产生用于实验5中体外转录的模板(含有“T7启动子-5'同源臂-JT15-amiR-eGFP419-amiR-eGFP123-JTZ17-3'同源臂-NcoI位点”的pP170),并在用NcoI消化后用于体外转录。用mMESSAGE mMACHINE T7Ultra转录试剂盒(Ambion,Austin,TX)在体外合成与所述DNA片段互补的RNA,并在如前述DNase处理之后使用MEGAclear试剂盒(Ambion)进行纯化10。使用SuperScriptIII逆转录酶(Invitrogen)使用引物(PP124用于TS1并且PP126用于TS2)从合成的RNA逆转录cDNA。将cDNAs凝胶纯化,并使用NanoDropTM 2000测量浓度。为避免显微注射期间阻塞,通过穿过Ultrafree-MC过滤器(HV;0.45μm孔径;#UFC30HV00;Millipore,Billerica,MA)来过滤ssDNA。
制备sgRNA和Cas9mRNA。使用CRISPR设计5,14和CHOPCHOP31设计针对eEF-2基因中的TS1和TS2的sgRNA。挑选了在两个程序中被列为高度潜在靶标但不位于内含子中推定分支位点中的sgRNA。使用pUC57-sgRNA载体(addgene编号:#51132)32作为模板用引物组(PP105/M939用于TS1,并且PP106/M939用于TS2)来PCR扩增用于sgRNA合成的模板。对400ng凝胶纯化的PCR产物用MEGAshortscript TM T7试剂盒(Ambion)进行RNA合成,DNase处理,接着使用MEGAclear试剂盒纯化mRNA。使用XbaI消化的pBGK10作为合成Cas9 mRNA的模板。按照对于ssDNA合成的RNA合成步骤的所述进行Cas9 mRNA的合成和纯化。
小鼠。用作eGFP和Otx2敲减实验的胚胎供体的C57BL/6小鼠获自CLEA Japan,Inc.(Tokyo,Japan)。以前在我们的设施中产生用作eGFP敲减实验的胚胎供体的eGFP Tg小鼠品系(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor<tm2.1(CAG-EGFP)Maoh>),其具有整合在Rosa26基因座上的单拷贝eGFP转基因17。所有小鼠都保存在日本Tokai University School of Medicine的人类疾病遗传工程中心(Center of Genetic Engineering for Human Diseases;CGEHD)动物设施中。所有动物实验均根据机构指南进行,并经Tokai University的机构动物照管与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准(许可证编号:#143037)。
显微注射到单细胞小鼠胚胎中。将ssDNA、sgRNA和Cas9 mRNA混合(ssDNA的浓度为14-20ng/μl,sgRNA的浓度为10ng/μl,Cas9 mRNA的浓度为10ng/μl),并共同注射到使用体外受精获得的受精卵的原核和细胞质两者中。对于eGFP敲减,使用来自eGFP Tg雄鼠和C57BL/6雌鼠的受精卵,并且对于Otx2敲减,使用来自C57BL/6雄鼠和雌鼠的受精卵。在37℃下,在5%CO2存在下,在KSOM培养基中培养注射的卵子过夜,并将所得的两细胞胚胎转移到假孕ICR雌鼠的输卵管中。
检测amiRNA序列的靶向插入。在E13.5或E14.5从植入注射的合子的假孕小鼠中分离胎鼠。通过在荧光显微镜下观察(仅用于eGFP敲减)、基于PCR的基因分型和测序来评估靶向ssDNA插入。使用Leica M165 FC(Leica,Wetzlar,Germany)用GFP的过滤器组检查胎鼠中eGFP荧光的表达。用于基于PCR的基因分型的引物组如下:实验1中为PP113/M412;实验2、实验3、实验4和实验5中为PP119/PP120。
使用凝胶纯化或Exo-SAP处理的PCR产物作为模板来进行一些样品的直接测序。对于一些PCR扩增的条带,将片段克隆到pUC119或TA克隆载体(TA克隆试剂盒,LifeTechnologies)中,并测定插入序列。
初级胚胎成纤维细胞的制备。在无菌条件下分离E14.5胎鼠,并用含有抗生素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗。解剖出肝脏和头部,将其余部分切成小块并且在37℃下0.1%胰蛋白酶/EDTA消化20min。接着将培养基添加到样品中,并用尼龙网过滤来获得充分分散的细胞群。将细胞离心,再悬浮在培养基中,计数并涂于6cm培养板上,培养至其汇合,胰蛋白酶消化,离心,再悬浮在具有DMSO的细胞培养冷冻培养基中,并在-80℃下冷冻以备将来之用。
初级成纤维细胞中的Cre-loxP重组和FACS分析。将胚胎初级成纤维细胞涂在6cm平板上。根据制造商的建议,在涂布后两天,用NeonTM转染系统(Invitrogen)对细胞进行电穿孔。在每次电穿孔中,使用以下电穿孔条件用500ng表达iCre的质粒(pAYC)电穿孔5×104个细胞:1350V脉冲电压,30ms脉冲宽度和一个脉冲。电穿孔后,将每个样品涂在含有培养基的24孔板上,培养9天,并且进行FACS分析以评估eGFP荧光。
将细胞用PBS洗涤2次,并在37℃下在5%CO2培养箱中与0.05%胰蛋白酶-EDTA一起培育5min,向培养板中添加培养基以停止细胞解离,接着穿过35-μm滤网(BDBiosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)来进行FACS分析。使用LSRFortessa(BDBiosciences)对细胞进行流式细胞术来评估eGFP荧光。使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.,Ashland,OR,USA)分析数据,并且定量显示eGFP损失的细胞%,所述eGFP损失指示Cre诱导的敲减活化。
通过使用从细胞分离的基因组DNA,用引物组PP119/M412、M412/PP120和PP119/PP120进行PCR来进一步证实细胞中的Cre-loxP重组。
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实施例2
Easi-CRISPR;一种有效敲入长DNA插入序列的方法
摘要
CRISPR/Cas9技术有效产生短的插入或缺失(indel),并且当其作为修复模板被包括时,其也可以实现短的单链寡核苷酸的靶向插入。然而,使用双链DNA模板的长插入序列的靶向是低效率的。为了克服这个挑战,我们开发了Easi-CRISPR(有效添加ssDNA插入序列-CRISPR)。这种方法使用体外合成的长单链DNA作为修复模板用于在Cas9切割位点处的高效插入。
引言
CRISPR/Cas9系统被广泛用于多个研究领域来产生基因组修饰的细胞和生物体。其通常用于通过非同源末端接合(NHEJ)产生短indel(插入/缺失),并通过同源引导修复(HDR)将来自短单链寡聚脱氧核苷酸(ssODN)的序列内容插入感兴趣的基因中。ssODN修复模板通常长约100-200个碱基,其由被改变过的序列(例如点突变、重组酶识别序列、数个碱基的短缺失或插入)的数个碱基组成,所述碱基侧接有约40-80个碱基的同源臂(1,2)。较长的新序列(>100个碱基)的靶向插入通常使用克隆的双链DNA(dsDNA)作为修复模板,因为不能商购获得长度超过200个碱基的ssODN。但是,dsDNA模板插入的效率不良(3)。此外,dsDNA模板需要至少0.5kb的同源臂。为每种方案设计和构造这些常规靶向构建体的技术限制增加了这种方法的局限性。
一些提高供体DNA靶向效率的策略包括通过化学处理抑制NHEJ或提高HDR(4-8)。然而,这些方法基于对细胞中基本DNA修复过程的干扰,并且可能是有毒的。无毒的方法包括使用具有嵌入式人造引导序列的环形dsDNA供体,其在细胞/胚胎内被线性化(9-11)。接着通过细胞连接酶将线性化的供体DNA插入基因组切割位点。这些设计包括在基因组DNA与供体DNA的切割端之间的微同源末端,或与两个切割端结合的ssODN,从而在供体与基因组DNA之间发生精确的融合。尽管这些策略能更好地替代那些干扰DNA修复的策略,但是其也具有局限性,包括需要设计特定的供体质粒来适应每个靶位点,并且所得的载体骨架在靶位点处的整合可能取决于实验设计而发生,从而留下可能会混淆等位基因的随后使用的足迹。
结果
为了开发适用于产生许多常见类型的敲入动物模型的更简单方法,我们在小鼠中测试了长ssDNA修复模板策略。原理如下:短的ssODN模板(至多200个碱基)在引导Cas9切割位点处的插入方面非常有效,并且如果ssDNA的长度可以延伸,则相同的修复机制可用于递送较大的序列。我们最近展示了约500个碱基的ssDNA能引导小鼠基因组的有效靶向,所述ssDNA中含有侧接有约55个碱基的同源臂的约400个碱基的新序列。如在胚胎期所分析,6个后代中有5个含有所要插入(83%效率)(12)。在本研究中,我们测试了长ssDNA供体模板引导多达约1.6kb插入到不同基因座中的适合性。这里报道的称为Easi-CRISPR(有效添加ssDNA插入序列-CRISPR;发音为Easy-CRISPR)的方法可以容易地调节以产生在Cas9切割位点的更长的插入。
我们使用Easi-CRISPR开发了四种小鼠模型;紧接在Otoa的硝化密码子之后,框内插入~1kb逆向四环素反式活化蛋白(rtTA)-polyA盒,并且紧接在Fgf8、Mafb和Slc26a5的终止密码子之前插入编码P2A-Flpo重组酶的~1.4kb盒。所述盒侧接有与靶基因座同源的72至105个碱基。长ssDNA供体分子使用前述IvTRT(体外转录和逆转录)方法(12)合成或从商业来源(单链基因片段,Integrated DNA Technologies)获得。图11(a)、11(b)、图12(a)、12(b)和图13至16显示ssDNA盒的示意图。
遵循标准CRISPR/Cas9小鼠基因组工程改造方案(13)使用在线方法中描述的一些修改产生G0幼崽。表1显示显微注射的细节和结果。使用5'和3'引物对G0幼崽进行基因分型指示,所有四个基因座的总插入效率为32%(25只幼崽中有8只含有相应的插入盒:表1)。对于不同的基因,单独的插入效率范围为25%至66%:Fgf8和Mafb基因座;25%,Otoa基因座;33%和Slc26a5基因座;66%(表1)。值得注意的是,Fgf8基因座含有敲入盒的双等位基因插入(图11(d))。包括接合处的插入的精确度通过测序进行确认(图11(e)、11(f)和图12(e)、12(f))。除了一个Slc26a5P2A-Flpo基因座外,所述基因座中基因组DNA序列重复存在于3'端(图12(c)),所有靶向动物都含有精确的插入。一些基因座以孟德尔法则的比率(Mendelian ratio)产生F1杂合后代,表明其种系不是嵌合体(图17)。总之,这些结果指示Easi-CRISPR能以高效率插入~1kb或更长的序列,并且该技术在多个基因组基因座处可重现。
表1:显微注射数据
多种类型的敲入动物模型被常规用于生物医学研究。例如,设计数千只敲入小鼠来表达常用的蛋白编码序列,诸如EGFP、Cre、Flp、rtTA、tTA等。值得注意的是,大多数这些盒长约1至1.5kb。研究机构仍然依赖于冗长的基于胚胎干细胞的方法来产生这些类型的小鼠模型,因为目前使用的基于CRISPR/Cas9的策略对于插入长dsDNA而言是低效率的。现在使用本文描述的Easi-CRISPR方法可以在小鼠胚胎中快速敲入这些盒,并且类似的技术可适合于在其它物种中产生敲入。Easi-CRISPR还可以通过在基因组中进行两次切割来适用于替换基因组DNA的长区段。这将有助于在基因组序列的延伸序列内产生多点突变,并有助于产生携带两个侧接靶外显子(floxing)的LoxP位点的条件敲除(CKO)动物。鉴于供体DNA的简单设计要求(向dsDNA盒添加50至100个碱基的同源臂)以及Easi-CRISPR的高效率(在四个不同的基因组基因座处展示25至66%的效率),这种方法将成为一种用于产生多种常用细胞和动物模型的简单并且有效的方法。
最后,虽然ssDNA分子被用作DNA修复过程中的模板的机制尚不清楚,但ssDNA介导的修复机制(14)和这些修复过程所需的细胞蛋白(15,16)正在显露出来。在这种情况下,Easi-CRISPR可以作为一种工具来探询ssDNA供体在胚胎中进行DNA修复的分子机制。
方法
CRISPR试剂
使用CRISPR.mit.edu设计CRISPR引导RNA,并用作单一引导RNA(sgRNA,用于Otoa)或用作退火的2部分合成crRNA和tracrRNA分子(用于Fgf8、Slc26a5和Mafb)(Alt-RTMCRISPR引导RNA,Integrated DNA Technologies)。遵循制造商的说明,使用HiScribeTM T7快速高产率RNA合成试剂盒(New England Biolabs)从通过使两个引物退火产生的模板转录sgRNA。如Harms等人,2014所述,使用pBGK质粒制备Cas9 mRNA。将质粒用XbaI线性化,凝胶纯化并用作使用mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA试剂盒(Ambion:AM 1345)进行的体外转录的模板。Cas9蛋白获自IDT(Alt-RTM S.p.Cas9核酸酶3NLS)。单链DNA供体使用之前描述的IvTRT方法(12)制备或从Integrated DNA Technologies获得。
单细胞胚胎的显微注射
通过腹膜内注射5IU孕马血清促性腺激素,48小时后注射5IU人绒毛膜促性腺激素(两种激素都来自National Hormone&Peptide Program,NIDDK)使3-4周龄的C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories)超排卵。通过使C57Bl/6育种雄鼠与超排卵的C57BL/6雌鼠交配获得小鼠合子。向单细胞阶段的受精小鼠胚胎注射20ng/μl Cas9蛋白(或10ng/μlCas9 mRNA;用于Otoa基因座)、20ng/μl退火的crRNA和tracrRNA(或每个10ng/μl sgRNA;用于Otoa基因座)和5-10ng/μl ssDNA HDR模板。进行细胞质和原核注射两者。将存活的胚胎手术植入假孕的CD-1雌鼠中。
小鼠基因组DNA提取、基因分型和测序
使用Qiagen Gentra PuregeneTissue试剂盒从脚趾样品提取小鼠基因组DNA。设计引物以扩增靶区域。对基因组DNA进行侧接引物PCR以及内部(供体寡聚体特异性)和外部引物PCR。使用PromegaHot启动绿色混合物进行PCR反应。在1%琼脂糖凝胶上分析测定产物。使用一个PCR引物对凝胶纯化的PCR条带进行测序。
实施例2的参考文献
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实施例3
使用ssDNA产生条件敲除小鼠模型
表2显示使用在532至931个碱基范围内的不同ssDNA盒产生三种条件敲除动物的显微注射数据。在基因1和3中观察到全长盒的正确插入(7%至100%效率),而一些基因2样品仅含有部分盒插入,并且其评分为阴性(对于全长盒插入)。
表2:条件敲除数据
实施例4:基于核酸酶的DNA编辑系统的转染
该预言性实施例描述了本发明者计划的使用CRISPR/Cas9系统和长ssDNA修复模板修饰培养的哺乳动物细胞中的DNA的实验。类似的方案可以从诸如Integrated DNATechnologies(Coralville,Iowa)的公司获得。
本发明者计划使用常规脂质转染试剂,用CRISPR机和长ssDNA修复模板转染培养的细胞,诸如常见类型的哺乳动物细胞。除了包含Cas9蛋白和下列两种合成RNA寡核苷酸的基因编辑核糖核蛋白(RNP)复合物之外:与反式活化crRNA(tracrRNA)形成双链体的CRISPR靶向RNA(crRNA),本发明者还将向细胞递送长ssDNA修复模板。或者,细胞可能已经稳定或瞬时表达Cas9蛋白,或可以使用单一引导RNA来代替crRNA和tracrRNA。
本发明者将使用以下步骤组装RNP复合物(使RNA寡核苷酸形成双链体并与Cas9蛋白混合)。首先,将每种RNA寡核苷酸(crRNA和tracrRNA)以例如100μM的最终浓度再悬浮于无核酸酶的缓冲液中。将两种RNA寡核苷酸以等摩尔浓度在无菌微量离心管中混合。例如,本发明者将通过组合3μL 100μM crRNA;3μL 100μM tracrRNA;94μL无核酸酶缓冲液至100μL的最终体积来产生3μM的最终双链体浓度。在95℃下加热双链体混合物5min,然后去除加热并冷却至室温(15-25℃)。需要时,可将双链RNA在无核酸酶缓冲液中稀释至工作浓度(例如,3μM)。
为了将Cas9蛋白加入到双链体混合物中,本发明者用Cas9缓冲液(20mM HEPES,150mM KCl,5%甘油,1mM DTT,pH 7.5)将Cas9蛋白稀释至工作浓度(例如5μM)。对于每次转染,本发明者将1.5pmol双链RNA寡核苷酸与1.5pmol Cas9蛋白在Opti-MEMTM培养基(ThermoFisher Scientific)中组合,最终体积为12.5μL。接着在室温下培育RNP混合物5min来组装RNP复合物。
为了添加ssDNA修复模板,本发明者将各种浓度的ssDNA修复模板添加到RNP复合物混合物中。将测试1倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍或超过10000倍的ssDNA修复模板。
为了形成转染复合物,本发明者将混合12.5μL RNP+ssDNA修复模板;1.2μL脂质体转染RNAiMAXTM转染试剂(Thermo Fisher Scientific);11.3μL OptiMEMTM培养基,最终体积为25μL。
接着将转染复合物(25μL)添加到已经使用不含抗生素的完全培养基稀释至400,000个细胞/毫升的培养细胞中。然后将细胞在组织培养培养箱(37℃,5%CO2)中培育48hr。
本发明者预期使用长ssDNA修复模板,培养物中的至少一些细胞将在靶位点处被修饰。将使用用于突变检测的常规分子生物学技术对修饰进行检测。
Claims (89)
1.一种用于修饰细胞中的靶DNA序列的方法,所述方法包含:
(a)在所述细胞中引入单链DNA(ssDNA),所述ssDNA包含与所述靶DNA序列具有基本序列同一性的5'同源臂、外源序列和与所述靶DNA序列具有基本序列同一性的3'同源臂,其中所述ssDNA的长度为200至10,000个核苷酸,和
(b)在所述细胞中引入或表达核酸酶系统,其中所述核酸酶系统切割所述靶DNA序列。
2.权利要求1的方法,其中所述外源序列的长度与所述5'同源臂和所述3'同源臂的总长度的比率(外源序列长度:同源臂长度)为1.5:1至20:1。
3.权利要求2的方法,其中所述外源序列编码蛋白质产物、RNA产物、DNA调节元件或变体DNA序列。
4.前述权利要求任一项的方法,其中所述ssDNA通过包含如下步骤的方法产生:
(a)转录编码可操作地连接于核苷酸序列的启动子的DNA模板以产生RNA转录本,所述核苷酸序列包含与所述靶DNA序列具有基本序列同一性的5'同源臂、外源序列和与所述靶DNA序列具有基本序列同一性的3'同源臂,
(b)通过所述RNA转录本的逆转录来合成ssDNA/RNA双链体,和
(c)使用RNA降解酶从所述ssDNA/RNA双链体降解所述RNA,以产生ssDNA。
5.权利要求4的方法,其还包含纯化所述ssDNA。
6.权利要求4至5任一项的方法,其中所述启动子包含T7启动子并且所述转录使用T7RNA聚合酶来进行。
7.权利要求4至6任一项的方法,其中所述ssDNA/RNA双链体使用逆转录酶和引物来合成。
8.权利要求4至7任一项的方法,其中所述RNA降解酶包含RNase H。
9.前述权利要求任一项的方法,其中所述5'同源臂和所述3'同源臂与所述靶DNA序列的不超过110个核苷酸具有基本同一性。
10.前述权利要求任一项的方法,其中在所述细胞中引入核酸酶系统包含在所述细胞中引入编码所述核酸酶系统的多核苷酸。
11.前述权利要求任一项的方法,其中所述核酸酶系统在所述靶DNA序列处产生双链断裂。
12.权利要求11的方法,其中所述5'同源臂与在所述双链断裂的一侧的靶DNA序列具有基本同一性,并且所述3'同源臂与在所述双链断裂的另一侧的靶DNA序列具有基本同一性。
13.前述权利要求任一项的方法,其中所述核酸酶系统选自:巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、Argonaute核酸酶系统和CRISPR/Cas系统。
14.前述权利要求任一项的方法,其中所述核酸酶系统包含CRISPR/Cas系统。
15.前述权利要求任一项的方法,其中所述CRISPR/Cas系统包含CRISPR/Cas9系统。
16.前述权利要求任一项的方法,其中所述细胞是原核细胞。
17.权利要求1至15任一项的方法,其中所述细胞是真核细胞。
18.权利要求17的方法,其中所述细胞是哺乳动物细胞。
19.权利要求18的方法,其中所述细胞是小鼠细胞。
20.权利要求18的方法,其中所述细胞是人类细胞。
21.权利要求17至19任一项的方法,其中所述细胞是非人类单细胞胚胎。
22.权利要求20的方法,其中在修饰之前从对象中取出所述人类细胞。
23.权利要求21的方法,其中所述单细胞胚胎是小鼠胚胎,所述小鼠胚胎在修饰后被移植入假孕雌性小鼠的输卵管中。
24.权利要求17至22任一项的方法,其中所述细胞是干细胞。
25.权利要求24的方法,其中所述细胞是胚胎干细胞。
26.权利要求24的方法,其中所述细胞是诱导的多能干细胞。
27.前述权利要求任一项的方法,其中所述外源序列编码人造微RNA(amiRNA)。
28.权利要求27的方法,其中所述amiRNA侧接有两个位点特异性重组酶靶序列。
29.权利要求28的方法,其中所述两个位点特异性重组酶靶序列的取向是相反的。
30.权利要求28至29任一项的方法,其还包含表达或转染识别所述细胞中的所述位点特异性重组酶靶序列的位点特异性重组酶。
31.权利要求28至30任一项的方法,其中所述两个位点特异性重组酶靶序列包含loxP位点。
32.权利要求28至31任一项的方法,其中所述位点特异性重组酶包含Cre蛋白。
33.前述权利要求任一项的方法,其中所述靶DNA序列在基因的内含子中。
34.权利要求33的方法,其中所述基因被组成性表达。
35.前述权利要求任一项的方法,其中所述靶DNA序列是所述细胞内源的并且在所述细胞的基因组中。
36.一种用于修饰细胞中的靶DNA序列的组合物,所述组合物包含:
(a)单链DNA(ssDNA),所述ssDNA包含与所述靶DNA序列具有基本序列同一性的5'同源臂、外源序列和与所述靶DNA序列具有基本序列同一性的3'同源臂,其中所述ssDNA的长度为200至10,000个核苷酸,和
(b)能够切割所述靶DNA序列的核酸酶系统。
37.权利要求36的组合物,其中所述外源序列的长度与所述5'同源臂和所述3'同源臂的总长度的比率(外源序列长度:同源臂长度)为1.5:1至20:1。
38.权利要求36至37任一项的组合物,其中所述外源序列编码蛋白质产物、RNA产物、DNA调节元件或变体DNA序列。
39.权利要求36至38任一项的组合物,其中所述5'同源臂和所述3'同源臂与所述靶DNA序列的不超过110个核苷酸具有基本同一性。
40.权利要求36至39任一项的组合物,其中所述核酸酶系统包含编码所述核酸酶系统的多核苷酸。
41.权利要求36至40任一项的组合物,其中所述核酸酶系统在所述靶DNA序列处产生双链断裂。
42.权利要求41的组合物,其中所述5'同源臂与在所述双链断裂的一侧的靶DNA序列具有基本同一性,并且所述3'同源臂与在所述双链断裂的另一侧的靶DNA序列具有基本同一性。
43.权利要求36至42任一项的组合物,其中所述核酸酶系统选自:巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、Argonaute核酸酶系统和CRISPR/Cas系统。
44.权利要求36至43任一项的组合物,其中所述核酸酶系统包含CRISPR/Cas系统。
45.权利要求36至44任一项的组合物,其中所述CRISPR/Cas系统包含CRISPR/Cas9系统。
46.权利要求36至45任一项的组合物,其中所述外源序列包含人造微RNA(amiRNA)。
47.权利要求46的组合物,其中所述amiRNA侧接有两个位点特异性重组酶靶序列。
48.权利要求47的组合物,其中所述两个位点特异性重组酶靶序列的取向是相反的。
49.权利要求47至48任一项的方法,其中所述两个位点特异性重组酶靶序列包含loxP位点。
50.一种递送粒子,其包含权利要求36至49或88至89任一项的组合物。
51.权利要求50的递送粒子,其中所述递送粒子选自:聚合物粒子、脂质体粒子和包括脂质和至少一种类型的聚合物的粒子。
52.一种修饰细胞中的靶DNA序列的方法,其包含使所述细胞与权利要求50至51任一项的递送粒子以允许将组合物递送到所述细胞中并且修饰所述靶DNA序列的有效量接触。
53.权利要求52的方法,其中所述接触在体外进行。
54.权利要求52的方法,其中所述接触在体内进行。
55.一种试剂盒,其用于进行权利要求1至35的方法中的任一种。
56.一种用于修饰细胞中的靶DNA序列的试剂盒,所述试剂盒包含RNA聚合酶、逆转录酶、RNA降解酶和核酸酶系统。
57.权利要求56的试剂盒,其还包含从5'至3'含有T7启动子、克隆位点和限制酶位点的DNA载体。
58.权利要求56至57任一项的试剂盒,其中所述核酸酶系统包含至少一种编码所述核酸酶系统的多核苷酸。
59.权利要求58的试剂盒,其中所述核酸酶系统包含DNA。
60.权利要求56至59任一项的试剂盒,其中所述核酸酶系统包含CRISPR/Cas系统。
61.权利要求60的试剂盒,其中所述CRISPR/Cas系统包含CRISPR/Cas9系统。
62.权利要求56至61任一项的试剂盒,其中所述RNA聚合酶包含T7RNA聚合酶。
63.权利要求56至62任一项的试剂盒,其中所述RNA降解酶包含RNase H。
64.一种用于修饰细胞中的靶DNA序列的试剂盒,所述试剂盒包含:
(a)单链DNA(ssDNA),所述ssDNA包含与所述靶DNA序列具有基本序列同一性的5'同源臂、外源序列和与所述靶DNA序列具有基本序列同一性的3'同源臂,其中所述ssDNA的长度为200至10,000个核苷酸,和
(b)能够切割所述靶DNA序列的核酸酶系统。
65.权利要求64的试剂盒,其中所述外源序列的长度与所述5'同源臂和所述3'同源臂的总长度的比率(外源序列长度:同源臂长度)为1.5:1至20:1。
66.权利要求64至65任一项的试剂盒,其中所述外源序列编码蛋白质产物、RNA产物、DNA调节元件或变体DNA序列。
67.权利要求64至66任一项的试剂盒,其中所述5'同源臂和所述3'同源臂与所述靶DNA序列的不超过110个核苷酸具有基本同一性。
68.权利要求64至67任一项的试剂盒,其中所述核酸酶系统在所述靶DNA序列处产生双链断裂。
69.权利要求64至68任一项的试剂盒,其中所述核酸酶系统选自:巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、Argonaute核酸酶系统和CRISPR/Cas系统。
70.权利要求64至69任一项的试剂盒,其中所述核酸酶系统包含CRISPR/Cas系统。
71.权利要求70的试剂盒,其中所述CRISPR/Cas系统包含CRISPR/Cas9系统。
72.一种工程改造的真核细胞,其包含有包含人造微RNA(amiRNA)的外源DNA构建体,所述外源DNA构建体被插入基因的内含子中。
73.权利要求72的真核细胞,其中所述基因被组成性表达。
74.权利要求72至73任一项的真核细胞,其中所述外源DNA构建体缺乏启动子。
75.权利要求72至74任一项的真核细胞,其中所述外源DNA构建体缺乏报告序列。
76.权利要求72至75任一项的真核细胞,其中所述外源DNA构建体缺乏polyA尾。
77.权利要求72至76任一项的真核细胞,其中所述基因是所述细胞内源的并且在所述细胞的基因组中。
78.权利要求72至77任一项的真核细胞,其中所述amiRNA侧接有两个位点特异性重组酶靶序列。
79.权利要求78的真核细胞,其中所述两个位点特异性重组酶靶序列的取向是相反的。
80.权利要求78至79任一项的真核细胞,其还包含识别所述细胞中的所述位点特异性重组酶靶序列的位点特异性重组酶。
81.权利要求78至80任一项的真核细胞,其中所述两个位点特异性重组酶靶序列包含loxP位点。
82.权利要求78至81任一项的真核细胞,其中所述位点特异性重组酶包含Cre蛋白。
83.权利要求72至82任一项的真核细胞,其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
84.权利要求83的真核细胞,其中所述哺乳动物细胞是小鼠细胞。
85.权利要求72至84任一项的真核细胞,其中所述DNA构建体被插入内源eEF-2基因的内含子中。
86.权利要求85的真核细胞,其中所述内含子是所述内源eEF-2基因的内含子6。
87.一种哺乳动物,其包含权利要求72至86的真核细胞中的任一种。
88.一种ssDNA,其包含与细胞中的靶DNA序列具有基本序列同一性的5'同源臂、外源序列和与所述靶DNA序列具有基本序列同一性的3'同源臂,其中所述ssDNA的长度为200至10,000个核苷酸,并且其中所述外源序列的长度与所述5'同源臂和所述3'同源臂的总长度的比率(外源序列长度:同源臂长度)为1.5:1至20:1。
89.权利要求88的ssDNA,其中所述外源序列编码蛋白质产物、RNA产物、DNA调节元件或变体DNA序列。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN111154801A (zh) * | 2018-11-07 | 2020-05-15 | 武汉纤然生物科技有限公司 | 一种提高基因编辑效率的方法 |
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