CN1280422C - 一种不对称pcr扩增方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种不对称PCR扩增方法及其应用，目的是提供一种能简单、高效的制备单链扩增产物的PCR扩增方法。本发明所提供的不对称PCR引物，包括若干对PCR引物对，其特征在于：每对所述引物对中的一条引物的5′末端均加有一段与待扩增靶序列无关的寡核苷酸尾。所提供的不对称PCR扩增方法，包括如下步骤：1)预变性；2)包括若干变性、引物退火和引物延伸循环的第一部分PCR扩增；3)若干个变性，引物退火和引物延伸循环的第二部分PCR扩增；所述引物延伸中所用PCR引物对中的一条引物的5′末端均加有一段与待扩增靶序列无关的寡核苷酸尾。本发明的不对称PCR扩增方法单链产率高，可进行单重或多重PCR扩增，在核酸检测中可以得到广泛应用。

Description

一种不对称PCR扩增方法及其应用
技术领域
本发明涉及PCR扩增方法及其引物与应用，特别是涉及一种不对称PCR扩增方法，以及该不对称PCR引物及其在核酸检测上的应用。
背景技术
随着生命科学研究的不断进展，人们已经认识到核酸是决定遗传信息的关键物质，通过检测样品中是否存在某种(些)核酸及其序列变异，就可以判断出检测对象是否携带某种病原微生物及其抗药性、患有某种疾病或处于某种遗传状态等。因此，核酸分析技术已经广泛应用于生命科学研究的众多领域，包括病原微生物的鉴定、分型和耐药性检测；疾病诊断与预后；HLA分型；SNP检测等。
由于通常从样品中获得的核酸量不足以直接用于分析，因此，进行核酸分析前，需对被检测核酸进行基因扩增。扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，链置换扩增(SDA)以及滚环复制(RCA)等(Andraset al，Mol.Biotechnol.，19：29-44，2001)。其中，PCR技术是目前最常用的核酸扩增技术。有多种不同的方法可以用于PCR产物的分析。例如，琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳就通常被用于PCR产物的检测，电泳法尽管方便快速，但特异性差，对基因的突变分析难以完成；还有采用限制性内切酶分析PCR产物，但适用范围有限，操作性较差而灵敏度较低；为了确证PCR产物，可以将其直接或克隆后进行序列分析，序列分析尽管精确，但因其操作烦琐和成本高而实用性较差。相比之下，PCR产物与基因特异性核酸探针杂交，是准确鉴定PCR产物、防止报告假阳性扩增结果和进行基因突变或多态性分析有效而实用的方法。
PCR产物与探针可有以下几种方式杂交：1)Southern杂交：将PCR产物电泳后转移至膜上，然后与标记探针杂交。该技术特异性好，但操作复杂，耗时较长，不适用于多指标的并行分析。2)正向点杂交：将PCR产物固定在膜等固相载体的表面，再与探针杂交。由于需先将PCR产物纯化、定量和固定等处理，因此分析时间往往较长，不适用于小样本量的检测。3)反向点杂交：将PCR产物与预先固定在膜等固相载体表面上的探针杂交。该技术可以一次性制备含大量探针的杂交支持物，PCR结束后可立即进行杂交分析，方便快速，适合以试剂盒的形式推出，逐渐发展成为基因芯片技术。
作为一种革命性的分析技术，基因芯片以其集成化，微型化和自动化的优势在核酸分析技术领域发挥着重要的作用。目前，基因芯片技术已经发展得比较完备并且在核酸分析领域获得了广泛的应用，可以被用于核酸的高通量并行分析(Debouckand Goodfellow，Nature Genetics，1999，21(Suppl.)：48-50；Duggan et al.，NatureGenetics，1999，21(Suppl.)：10-14；Gerhold et al，Trends Biochem.Sci.，1999，24：168-173；and Alizadeh et al，Nature，2000，403：503-511)。核酸芯片用来快速地分析特定情况下的基因表达谱，也可以采用核酸芯片在一次实验中分析长达1kb的基因区域内的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)(Guo et al.，Genome Res.，2002，12：447-57)。
采用被动式生物芯片的常规核酸分析方法(例如用于感染性疾病临床分析的方法)通常包括三个分离的步骤：第一步是样品制备，也就是处理样品，包括处理血清、全血、唾液、尿液以及粪便而获得核酸(DNA或RNA)，通常从样品中获得的核酸量不足以直接用于分析，需要进行进一步的扩增，如PCR扩增；第二步是核酸杂交，也就是在扩增出的样品和固定在芯片上的探针之间进行杂交；第三步是检测杂交信号，对杂交信号的检测通常基于对特定标记的检测，检测标记可以在扩增或者杂交的过程中引入。信号检测方法随所使用的标记的不同而变化，例如采用荧光检测仪来检测荧光标记分子，采用放射自显影来检测放射标记物，而对于生物素标记以及地高辛标记等的检测则往往需要进一步的酶学放大反应。基于实际中对检测灵敏度的不同要求，可以采用不同的信号放大方法，例如Tyramide信号放大(TSA)(Karsten et.al.，Nucleic Acids Res.，2002，E4.)以及分支DNA(Kricka，Clin.Chem.，1999，45：453-458)等。
靶核酸与固定于芯片表面的寡核苷酸探针的杂交反应是利用基因芯片进行核酸检测的核心事件。在杂交前，靶核酸常需经PCR扩增，然后通过变性等方法制备单链PCR产物，再将单链PCR产物与探针在适宜的严谨度下杂交和洗涤，最后检测杂交信号。在杂交时，只有一条PCR产物链可以与芯片上的探针杂交，而其对应的互补链，由于PCR双链的自身退火，会干扰所需要的杂交反应，从而降低杂交信号，甚至可能引起杂交信号丢失。有研究表明，与寡核苷酸探针杂交时，单链DNA比煮沸变性的双链DNA的杂交灵敏度要高5倍(Kawai et al，Anal.Biochem.1993，209：63-69)。因此，要与基因芯片上的寡核苷酸探针进行高效杂交，制备单链的靶核酸是十分重要的。
有多种方法可以用于制备供杂交的核酸单链，除将双链PCR产物热变性或碱处理外，常用的方法还包括：
1、T7逆转录法。该法是在一条PCR引物5’端加上T7启动子，以纯化PCR扩增产物为模板，用T7RNA聚合酶体外逆转录合成单链RNA(Hughes，et al，Nat.Biotechnol.，2001，19：342-347)。该方法虽然单链得率较高，但需两步完成，操作不便，而且需严格控制RNA酶的污染。
2、核酸外切酶法(Higuchi and Ochman，Nucleic.Acids Res.，1989，17：5865)。由于一条PCR引物被磷酸化，PCR产物在用核酸外切酶消化时，被磷酸化的引物扩增链不被切割，消化后酶被加热灭活。该方法也需纯化PCR产物，操作不便，而且单链得率依赖于外切酶的活性。
3、变性高效液相色谱法(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)。由于一条PCR引物被生物素标记，其PCR扩增链在DHPLC时，会与另一条普通链分开(Dickman and Homby，Anal.Bioehem.，2000，284：164-167)。该方法可以15min内直接从双链PCR产物中获得所需的单链，但需要昂贵的仪器，难以普及。
4、磁珠捕获法。用链亲合素包被的磁珠捕获生物素标记引物的扩增链，然后用NaOH处理得到目标单链(Espelund，et.al，Nucleic.Acids Res.，1990，18：6157-6158)。该方法使用的包被磁珠较为昂贵。
5、不对称PCR。上述方法均需在PCR后进行额外的处理，而不对称PCR可在PCR扩增的同时制备DNA单链。比较一步法不对称PCR、磁珠捕获法、热变性和碱变性四种方法制备DNA单链进行基因芯片杂交的效果，发现不对称PCR和磁珠捕获法都具有较高的杂交灵敏度和特异性，而在同样杂交条件下，热变性或碱处理可能引起假阴性的杂交结果。考虑到操作简便性和成本，不对称PCR更为实用(Gao，et al.，Analytical Letters，2003，33：2849-2863)。目前，不对称PCR技术一般有以下几种技术方案：
1)使用不同浓度的上下游引物进行不对称扩增。随着循环的增加，量少的引物被逐渐耗尽，而超量的引物可继续直线扩增生成DNA单链(Gyllensten and Erlich，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988，85：7652-7656，)。国内也有相关的报道，如何子红等用1∶10和1∶20的比例不对称扩增了IGF-II基因进行SNP检测(何子红等，中国运动医学杂志，2002，21：116-121)；李双顶等用1∶15的比例不对称扩增了HLA-DRB1基因(李双顶等，中国实验血液学杂志，2003，11：393-397)等。但这种方法需要优化上下游引物的比例，而且非特异扩增的机会增加，电泳时常可见弥散条带(Erdogan，et.al.，Nucleic.Acids Res.，2001，29：E36)。
2)使用不同长度的上下游引物进行不对称扩增。如彭晓谋等用34个碱基的上游引物和20个碱基的下游引物不对称扩增了HBV的S基因，在后一轮的温度循环中，提高退火温度，短的引物不能退火，长引物可继续延伸反应从而达到制备单链的目的(彭晓谋等，中国实验诊断学，2002，6：206-208)。该方法使用的引物序列均为基因特异性，但由于较长，增加了非特异扩增的可能；在设计SNP位点较广泛的基因(如细菌16S rRNA基因)扩增引物时较为困难。
3)先进行对称PCR反应，然后纯化PCR产物，以纯化的对称PCR产物为模板，加入单条引物或不等量进行不对称扩增和标记(Gorelov，et.al，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1994，200：365-369；Scott，et.al.，Lett.Appl.Microbiol.，1998，27：39-44；Guo，et al，Genome Res.，2002，12：447-457；周钧等，基因芯片检测日本血吸虫及其现场应用，医学动物控制，2003，19：524-527)。这种方法是以纯化的对称PCR产物为模板，使用单条引物进行PCR循环制备单链，但须多步完成，其耗时和不便是显而易见的。
目前常规的多重PCR需要多轮优化，存在以下问题：1)由于引物较多，不同引物间可能引起假阳性扩增；2)引物对间的竞争作用使得靶分子出现不均衡扩增，某些引物对优势扩增而一些引物对的扩增效率很低；3)结果的重复性差。这种情况下，再进行不对称多重PCR扩增，难以获得满意的实验结果。在进行多个靶分子的并行分析时，上述不对称PCR策略难以凑效。单管一步法不对称多重PCR未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能简单、高效的制备单链扩增产物的不对称PCR扩增方法及其专用引物。
本发明所提供的不对称PCR引物，包括若干对PCR引物对，每对所述引物对中的一条引物的5′末端均加有一段与待扩增靶序列无关的寡核苷酸尾。
为了使所用引物具有合适的Tm值，所述寡核苷酸尾长度一般在8-40bp之间为好；优选为15-25bp。
为了平衡不同靶序列的扩增效率，所述不对称PCR引物中还加有一条通用引物，所述通用引物的序列与所述寡核苷酸尾中至少8个连续碱基序列相同，其中优选的通用引物序列是与所述寡核苷酸尾的碱基序列相同的序列。
为了利于不对称扩增和单链生成，所述通用引物的浓度高于所述引物对的浓度。
应用本发明的不对称PCR引物进行不对称PCR扩增方法，包括如下步骤：1)预变性；2)若干个变性、引物退火和引物延伸循环的第一部分PCR扩增；3)若干个变性，引物退火和延伸循环的第二部分PCR扩增，所述引物延伸中所用PCR引物对中的一条引物的5′末端均加有一段与待扩增靶序列无关的寡核苷酸尾。
为了提高产物的扩增率，在第二部分PCR扩增循环结束后，一般还要进行引物继续延伸反应。
其中，步骤2)所述第一部分PCR扩增温度循环的循环数为15-25；步骤3)所述引物延伸的温度为60-75℃。
本发明不对称PCR扩增反应示意图如图1所示，图中sf-1、sr-1以及sf-2、sr-2分别是靶基因-1和靶基因-2的特异性引物对，其中sr-1与sr-2的5’末端加上了一段通用序列；up为通用引物，其序列与sr-1、sr-2的通用序列相同。进行本发明不对称PCR扩增反应时，反应液中DNA聚合酶、dNTP、Mg2+和反应缓冲液等组分与普通PCR相同，并可根据不同的反应予以优化。
本发明的不对称PCR扩增反应分为两个部分，第一部分PCR扩增循环与普通PCR相同，包括变性、引物退火和引物延伸三个步骤，退火温度根据特异基因引物的Tm值可相应调整，同样地，延伸时间也可根据扩增片段长度调整，两条引物均可进行普通的PCR扩增；第二部分PCR扩增循环引物退火温度与引物延伸温度相同，因此只有变性和引物延伸两个步骤，这时只有加尾的引物(较长，其全长的Tm值较高)可以退火延伸，从而达到制备单链的目的。在本发明的不对称PCR反应中所加的通用引物主要有以下作用：在第一部分PCR温度循环中，它可以参与第二个温度循环以后的扩增反应，平衡多重扩增时不同靶的扩增效率；在扩增的全过程里，由于通用引物浓度较高，可与加有寡核苷酸尾的引物一起，增加了与对应引物的浓度差异，从而进一步有利于不对称扩增和单链生成。
本发明的另一个目的是提供本发明不对称PCR引物在核酸检测中的应用。
应用本发明的不对称PCR引物，可以实现多重不对称PCR扩增，采用基因芯片检测或其它杂交方式，如膜杂交等可以很方便地实现对多个靶序列的检测。
通过本发明的不对称PCR扩增方法得到的扩增产物，可以采用以下基因芯片检测方法：a反向杂交模式：将所得不对称PCR扩增产物与任何有效的杂交缓冲液混合，热变性后与固定于基因芯片上寡核苷酸探针杂交；或b正向杂交模式：将所得不对称PCR扩增产物纯化，固定于合适的固相载体表面制成基因芯片，然后用核酸探针与基因芯片杂交。杂交完成后，使用不同的标记方法和信号检测方式检测杂交信号，即可完成对靶序列的检测。
与目前通常采用的不对称PCR方案相比，本发明的不对称PCR扩增引物具有以下特点和优点：
1)在PCR引物对的一条基因特异性引物的5′端加上了一段与扩增靶基因无关的通用序列，这样既能达到引物长度不等(使引物对Tm值差异较大)，又可保证基因特异性序列的“相称”，增加初始PCR循环的扩增效率，同时降低了引物设计的难度；
2)在PCR引物中添加了一条通用引物，该通用引物与引物上所加的通用尾序列相同，由于只有1条通用引物，可以在引物的数量上进一步增加上下游引物的不均衡性；
3)更重要的是，本发明的不对称PCR引物可以十分容易的进行多重扩增，而无须进行复杂的优化，这主要有两方面原因：首先，由于所有引物对1条引物中都带有相同的通用序列，这一方面增加了引物的一致性，使得其扩增效率趋于一致，另一方面也减少了长引物间相互作用的可能性；其次，由于通用引物在扩增过程中的平衡作用。如果某对基因特异引物扩增效率低，则更多的通用引物将参与其后续的扩增反应，基因特异性引物扩增效率越低，通用引物参与的后续反应越多；反之亦然。这样，不同的靶分子均能得到较为一致的扩增。因此通用引物在多重PCR扩增过程中起到了平衡作用，使反应体系中所有的基因特异性引物拥有相近的扩增效率。
本发明的不对称PCR扩增方法单链产率高，有利于随后的杂交反应，可极大地提高杂交效率和杂交信号；并且可用相同的不对称条件进行单重或多重PCR扩增，无须复杂的优化过程。本发明引物设计简单，扩增操作方便，结合可高通量多指标并行分析的基因芯片技术，可广泛应用于微生物鉴定、分型、耐药基因检测；疾病诊断与预后；HLA分型；SNP检测等基因分析领域。
附图说明
图1为本发明不对称PCR扩增反应示意图；
图2为实施例1的探针排布示意图；
图3为实施例1PCR产物电泳图；
图4A为实施例1金黄色葡萄球菌26001杂交反应的应出现阳性信号示意图；
图4B为实施例1空白对照杂交反应的应出现阳性信号示意图；
图5为实施例1杂交反应的荧光检测结果；
图6为实施例2的探针排布示意图；
图7为实施例2杂交反应的荧光检测结果。
具体实施方式
实施例1、单重不对称PCR扩增及其在革兰氏阳性细菌的基因芯片鉴定上的应用
1、PCR扩增的基因特异性引物和各种寡核苷酸探针
引物和探针均由上海博亚生物技术公司合成，部分引物5′端的TAMR荧光标记和探针5′端氨基修饰也由上海博亚生物技术公司完成。
基因特异性引物的靶序列为细菌16S rRNA基因，扩增片段约1.5kb。引物的种类及其核苷酸序列如表1所示。
表1.细菌鉴定PCR引物
  引物编号   引物种类   引物序列(5′-3′)
  PMB-0408047PMB-0201034PMB-0201002PMB-0201042PMB-0201041   通用引物不加尾的基因特异性上游引物不加尾的基因特异性下游引物加尾的基因特异性上游引物加尾的基因特异性下游引物   TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTAMRA-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAAGGAGGTGATCCAGCCTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGTCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGGAGGTGATCCAGCC
各种寡核苷酸探针可与检测目标细菌的单链扩增产物的不同位置进行特异性杂交，其序列与检测目标细菌16S rRNA基因的某一段序列相同。部分探针的核苷酸序列和检测目标如表2所示。
表2.细菌鉴定探针
  探针编号   检测目标   探针序列(5′-3′)
  PBB-0201001PBB-0201002PBB-0201024PBB-0201053PBB-0201075PBB-0201090   细菌通用金黄色葡萄球菌革兰氏阳性细菌葡萄球菌属细菌通用质控探针   NH2-T12-GCTGCCTCCCGTAGGAGTNH2-T12-AGAAGCAAGCTTCTCGTCCGNH2-T12-GGGCATGATGATTTGACGTCNH2-T12-TCCTCCATATCTCTGCGCATNH2-T12-GACGGGCGGTGTGTACAHEX-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-NH2
2、带有醛基基团的基质制备
将玻璃基质浸泡于洗液中，室温过夜。用自来水冲洗以洗净玻璃基质上的酸液，蒸馏水冲洗三次，去离子水漂洗一次，再用去离子水冲洗一次。离心甩干玻璃基质，在110℃干燥15分钟，彻底干燥玻璃基质。将玻璃基质浸入1％APTES(异丙胺基-三乙氧基硅烷)的95％乙醇中，在室温下用摇床轻摇1小时。用95％乙醇清洗处理过的玻璃基质，先冲洗一次，再漂洗一次。将洗净的玻璃基质放入真空干燥箱，抽真空至最大刻度(-0.08Mpa到-0.1Mpa)，关闭通气阀，110℃处理20分钟。然后将凉至室温的玻璃基质浸泡于12.5％的戊二醛溶液(400ml 12.5％戊二醛溶液：100ml 50％的戊二醛，300ml磷酸盐缓冲液(1mol/L NaH2PO4 30ml，2.628g NaCl)，调PH值到7.0)，室温下轻摇4小时，将玻璃基质从戊二醛溶液中取出，3×SSC漂洗一次，去离子水冲洗两次，离心甩干，室温干燥。
3、制备表面固定有探针的玻璃基质(基因芯片)
将表3中的探针溶于50％的DMSO中，终浓度为10μmol/L。采用Cartesian的点样仪(Cartesian Technologies，Inc.，CA，USA)按照图2的样式(9×9，图中090QC表示为探针PBB-0201090，其余与此类似)点样。将点好的玻璃基质在室温中放置过夜以干燥玻璃基质，然后室温下将玻璃基质在0.2％的SDS中浸泡两次，每次2分钟，振动。将玻璃基质用去离子水冲洗两次，去离子水漂洗一次，离心甩干。把玻璃基质转移到NaBH4溶液(1.0g NaBH4溶于300ml 1×PBS中，再加入100ml无水乙醇)，室温摇床轻摇5分钟。将玻璃基质用去离子水冲洗一次，去离子水漂洗两次，每次1分钟，离心甩干。
4、细菌培养与核酸提取
所用的菌株金黄色葡萄球菌26001购自中国药品生物制品检定所中国医学细菌保藏管理中心。
在超净工作台内将细菌划线接种于MH(Mueller Hinton Agar Medium)培养基平板以分离单菌落，将平板在孵箱中倒置，35℃孵育24h。
称取10mg G1145型玻璃珠和40mg G1152型玻璃珠(Sigma)于一无菌1.5ml离心管，向管内加入100μL 1×TE。将镊子在火焰上灭菌并冷却后，夹取牙签或tip头，从培养细菌的MH平板上沾取一单菌落，在管底的玻璃珠中反复摩擦使菌尽可能完全留在管中，把用完的牙签或tip头丢弃到盛有杀菌液的废液缸中，盖好离心管盖。手持离心管，在涡旋混合器上(TDX-1型，北京通达)最大力度持续振荡5min。然后将离心管95℃水浴5min，置4℃备用。
5、核酸PCR扩增
PCR反应体系的组成如表3所示，在A、B、C三种反应体系中加入1μL的玻璃珠振荡后的26001菌液或1μL无菌水(作为空白对照)，反应的总体积为25μl。
PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)热循环仪上进行，体系A、B采用表4的不对称PCR扩增热循环程序；体系C采用表5的对称PCR扩增热循环程序。
表3.PCR反应体系
体系A：(仅基因特异性上游引物加尾)            体系B：(基因特异性上、下游引物均加尾)
 反应物   终浓度
 MasterMix(北京天为时代)PMB-0201042PMB-0201002PMB-0408047   1×0.2μmol/L0.2μmol/L1μmol/L
 反应物   终浓度
 MasterMix(北京天为时代)PMB-0201042PMB-0201041PMB-0408047   1×0.2μmol/L0.2μmol/L1μmol/L
体系C：(基因特异性上、下游引物均不加尾)
 反应物   终浓度
 MasterMix(北京天为时代)   1×
  PMB-0201034PMB-0201002   0.2μmol/L0.2μmol/L
表4.不对称PCR扩增程序
  温度(℃)   94   94   59   72   94   70   72   4
  时间(s)   180   15   60   90   15   90   300   -
  循环数   1   20   20   1   1
  说明   预变性   第一步PCR扩增   第二步PCR扩增   /   /
表5.对称PCR扩增热循环程序
  温度(℃)   94   94   59   72   72   4
  时间(s)   180   15   60   90   300   -
  循环数   1   30   1   1
6、电泳
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度为1.5％，每份样品上样量为2μL，50V/cm电压电泳30min。
7、杂交
杂交反应体系的配制如表6所示。
表6.杂交反应体系
  成分   终浓度   加入量(μL)
  H2O20×SSC50×Denhardt′s50％硫酸葡聚糖4％SDSPCR产物   /2×5×10％0.4％/   1.01.81.83.61.88.0
  Total   /   18.0
在杂交盒(HybriCassettesTM，北京博奥生物芯片有限责任公司)内加入200μL蒸馏水，以防止杂交体系蒸发，将表面固定有反应物的玻璃基质及盖片(SmartCoverTM，北京博奥生物芯片有限责任公司)放置于杂交盒中。杂交体系加热至95℃保持5分钟使PCR产物充分变性后，立即置于冰水混合物中冷却。取13μL杂交体系通过盖片上的小孔加入盖片和玻璃基质之间的空隙中，盖好杂交盒，52℃杂交90分钟。取出芯片，浸入2×SSC，0.2％SDS的溶液中，室温摇床轻摇5分钟。再将芯片用去离子水漂洗两次，每次1分钟，离心甩干。加有金黄色葡萄球菌26001的PCR体系进行两组平行实验。
8、芯片信号检测
芯片荧光信号采用GenePix4000B扫描仪(Axon Instruments，Inc.，CA，USA)检测，检测条件为：波长(wavelength)，532nm；PMT，600；功率(power)，33％。
9、结果分析
琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示，图中泳道1，11为DL2000 Marker(Takara)泳道2，3，4为体系A PCR产物；泳道5，6，7为体系B PCR产物；泳道8，9，10为体系CPCR产物；其中泳道2，3，5，6，8，9的PCR体系中加入26001菌液；泳道4，7，10的PCR体系中加入无菌水作为空白对照。从图3可以看出，3种PCR体系均能很好的扩增出靶核酸的约1.5kb的双链扩增产物，但只有体系A可以看到明显的单链扩增产物。
图4为本实施例杂交反应的应出现阳性信号示意图，图4A为金黄色葡萄球菌信号图；图4B为空白对照信号图；图5为本实施例杂交反应的荧光检测结果。对比图4和图5可以看出，仅有体系A的杂交结果和图4完全符合，而另外两种体系的杂交结果中预期阳性信号则只有部分出现。可能的原因是体系B、C制备的主要是双链PCR产物，杂交可能时自身退火，从而使某些探针不出现阳性信号或者阳性信号很弱。
电泳和芯片杂交实验结果表明，本发明的不对称PCR扩增体系和不对称PCR扩增温度循环，能够非常有效的制备单链扩增产物，而且所制备的单链扩增产物有利于随后的杂交反应，可极大地提高杂交效率和杂交信号。
实施例2、细菌耐药基因的多重不对称PCR扩增和基因芯片检测
1、多重不对称PCR引物和寡核苷酸探针
所用引物和探针均由上海博亚生物技术公司合成，部分引物5′端的TAMRA荧光标记和探针5′端氨基修饰也由上海博亚生物技术公司完成。
基因特异性引物的种类、序列信息、靶基因和扩增片段长度如表7所示，针对每种靶基因设计了两条探针，其序列信息如表8所示。其中，靶基因tetK、tetM为革兰氏阳性细菌的四环素耐药基因，靶基因ermA、ermC为革兰氏阳性细菌大环内酯-林可霉素-链阳霉素B耐药基因，23S rRNA基因的一段细菌通用序列作为内对照，对PCR扩增和杂交反应过程进行监控。
表7.耐药基因检测引物
  引物编号   引物种类   引物序列(5′-->3′)   靶基因   扩增片段长度(bp)
  PMB_0408101PMB_0408121PMB_0408103   不加尾的上游引物加尾的下游引物不加尾的上游引物 ATTCCGTTTATGCTTGGTTTGTTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGCTATACCTGTTCCCTCTGATTACAGAATTAGGAAGCGTGGA tetKtetM 440429
PMB_0408122PMB_0408105PMB_0408123PMB_0408107PMB_0408124PMB-0408115PMB-0408116PMB-0408047 加尾的下游引物不加尾的上游引物加尾的下游引物不加尾的上游引物加尾的下游引物加尾的上游引物不加尾的下游引物通用引物   TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTCAGATTCGGTAAAGTTCGTCCCTGTCGGAATTGGTTTTTAGTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCGGTAAACCCCTCTGAGAATAAGTAATGCCAATGAGCGTTTTTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGTGTAATTTCGTAACTGCCATAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTAACGGTCCTAAGGTAGCGAAGGCTCCTACCTATCCTGTACATAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGT ermAermC23S rRNA/ 432283231/
表8.耐药基因检测探针
  探针编号   靶基因   探针序列(5′-3′)
  PBB-0204654PBB-0204655PBB-0204656PBB-0204657PBB-0204658PBB-0204659PBB-0204660PBB-0204661PBB-0204662PBB-0204663PBB-0201090   23S rRNA23S rRNAtetKtetKtetMtetMermAermAermCermC质控探针   NH2-T12-CGGGTAACCTGCATCTTCACANH2-T12-AYGGGGTCTTTCCGTCCTGTNH2-T12-GTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCTNH2-T12-TGTTATGGGCGGATTATCTTTTACTNH2-T12-TTTCAGTGGGAAAATACGAAGGTGNH2-T12-CATCATAGACACGCCAGGACATATNH2-T12-CAATCTTTTTCGCAAATCCCTTCTCNH2-T12-ATAGTAAACCCAAAGCTCGTTGCNH2-T12-TAGCAAACCCGTATTCCACGATTNH2-T12-TTGGAAATTATCGTGATCAACAAGTTHEX-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-NH2
2、带有醛基基团的玻璃基质的制备
制备方法同实施例1。
3、制备表面固定有探针的玻璃基质
制备方法同实施例1，所用探针为表8中的探针，按照图6的样式(6×6，图中090QC为质控探针PBB-0201090，其余探针编号为PBB-0204XXX的后三位)点样。
4、细菌培养与核酸提取
本实施例使用的菌株购自于表9所示单位，细菌培养与核酸提取的方法同实施例1。
表9.实施例2使用的菌株
  来源   菌株编号   菌种
北京医院   B435B437   金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌
北京天坛医院   MRSA6437MRSA6460MRSA6581   金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌
北京同仁医院   TR1429TR1887TR2041   粪肠球菌屎肠球菌表皮葡萄球菌
5、核酸PCR扩增
本实施例为5重不对称PCR扩增，PCR反应体系的组成如下：1×MasterMix(北京天为时代)；0.2μmol/L的五对表7中基因特异性引物；1μmol/L的通用引物PMB 0408047；1μL玻璃珠振荡后的菌液。反应的总体积为25μL。
PCR在PTC-200(MJ Research Inc.)热循环仪上进行，采用表1的不对称PCR扩增热循环程序。
6、杂交与检测
杂交反应体系的配制及杂交方法，以及杂交后芯片的荧光检测同实施例1。
7、结果分析
图7为本实施例8株菌耐药基因检测结果，结果表明，对于不同的菌株，其所含耐药基因的种类和数量并不相同：金黄色葡萄球菌MRSA6581、粪肠球菌TR1429含有1个耐药基因；金黄色葡萄球菌B437、表皮葡萄球菌TR2041含有2个耐药基因；金黄色葡萄球菌B435、金黄色葡萄球菌MRSA6460含有3个耐药基因；金黄色葡萄球菌MRSA6437含有4个耐药基因；而屎肠球菌TR1887不含耐药基因。
而且，从图7的杂交结果可以看到，所有菌株的PCR和杂交内对照23S rRNA基因都得到良好的扩增和强的杂交信号，对于含有1个、2个、3个和4个耐药基因的菌株，都能获得正确的阳性信号而且杂交信号较为均一。这表明本发明的不对称PCR扩增体系和扩增温度循环，能够非常有效的用于多个基因的并行检测。

Claims (9)

1、一种不对称PCR扩增方法，包括如下步骤：1)预变性；2)若干个变性、引物退火和引物延伸循环的第一部分PCR扩增；3)若干个变性，引物退火和引物延伸循环的第二部分PCR扩增；所述引物延伸中所用PCR引物对中的一条引物的5′末端均加有一段与待扩增靶序列无关的寡核苷酸尾。
2、根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于：所述第二部分PCR扩增后，还包括引物继续延伸的步骤。
3、根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于：步骤2)所述第一部分PCR扩增的循环数为8-25。
4、根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于：步骤3)所述寡核苷酸尾长度为8-40个碱基。
5、根据权利要求4所述的扩增方法，其特征在于：步骤3)所述寡核苷酸尾长度为15-25个碱基。
6、根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于：步骤3)所述PCR引物中还包括一条通用引物，所述通用引物的序列与所述寡核苷酸尾中至少8个连续碱基序列相同。
7、根据权利要求6所述的扩增方法，其特征在于：所述通用引物序列与所述寡核苷酸尾的碱基序列相同。
8、根据权利要求6所述的扩增方法，其特征在于：所述通用引物的浓度高于所述引物对的浓度。
9、根据权利要求1或2所述的扩增方法，其特征在于：步骤3)所述引物延伸的温度为60-75℃。
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