JP2008510471A - 非対称ｐｃｒ増幅法、その特別なプライマーおよび用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、非対称ＰＣＲ増幅法、その特別なプライマーおよび用途を開示し、一本鎖産物の調製のための単純で効率的なＰＣＲ増幅を提供する。本発明のＰＣＲプライマーは、いくつかのプライマー対を含み、検出される標的配列とは無関係の核酸配列が、一方のプライマーの５’末端に付加されている。提供される非対称ＰＣＲ増幅は：１）予備的に変性する工程；２）ＰＣＲの第一段階として、変性、プライマーアニーリング、伸長サイクルを繰り返す工程；３）ＰＣＲ増幅の第二段階として、変性、プライマー伸長サイクルを繰り返す工程、を包含し、検出される標的配列とは無関係の核酸配列が、伸長における各対の一方のＰＣＲプライマーの５’末端に付加されている。本発明の非対称ＰＣＲ増幅によって、一本鎖産生のハイスループットを得ることができ、単一のＰＣＲ増幅または複数のＰＣＲ増幅が実施され得る。そして本方法は、核酸の検出において広範に使用され得る。

Description

（技術分野）
本願は、ＰＣＲ増幅法、ＰＣＲ増幅法のためのプライマー、およびそれらの使用に関する。具体的には、本願は、核酸の検出における、非対称ＰＣＲ増幅法、非対称ＰＣＲ増幅のためのプライマー、およびそれらの使用に関する。

（背景）
ライフサイエンスの研究が進歩するにつれて、核酸が、遺伝情報の決定のための重要な物質であることがよく認識されるようになった。被験体のサンプルにおいて核酸配列の変化または変異を決定することによって、その被験体が、病原性微生物および／もしくはそのような微生物に対する耐性を有するか否か、その被験体が特定の疾患を有するか否か、ならびにその被験体が特定の遺伝状態にあるか否かを決定することができる。したがって、核酸分析技術には、ライフサイエンス研究の種々の領域において用途が見出され、この領域としては、病原性微生物の耐性遺伝子の試験、分類および検出、疾患の診断および予後、ＨＬＡ分類、ならびにＳＮＰ検出が挙げられる。

サンプルにおける核酸の量は通常分析には不十分であるため、検出されるためには、分析の前にその核酸を増幅することが通常必須である。増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＲＤＡ）、およびローリングサイクル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｙｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）が挙げられる（非特許文献１）。とりわけ、ＰＣＲが近年最も頻繁に使用されている。ＰＣＲ産物を分析するための、多くの方法が存在する。例えば、アガロースゲル電気泳動またはＰＡＧＥ電気泳動が、ＰＣＲ産物の検出のために使用されている。これらの電気泳動法は、迅速かつ簡便な分析を提供する。しかしながら、これらの方法には、特異性が低いという問題があり、それゆえ遺伝子変異分析には適していない。ＰＣＲ産物を分析するための別の方法は、制限酵素の使用であり、この方法は、制限された用途、、低い感受性を有し、操作が困難である。ＰＣＲ産物の配列情報における正確性を保証する１つの方法は、ＰＣＲ産物をクローニングすること、およびそのクローニングされた配列を配列決定することを包含する。しかしながら、この方法は、複数の工程を包含し、それゆえ高価で、実用的ではない。

ＰＣＲ産物のプローブとのハイブリダーゼーションの方法としては、以下が挙げられる：１）サザンハイブリダイゼーション、すなわち、そのＰＣＲ産物を析出させるために電気泳動を使用し、そのＰＣＲ産物をメンブレンに移し、そしてそのＰＣＲ産物を標識されたプローブとハイブリダイズさせる。この技術は、良好な特異性を生じるが、操作が複雑であり、時間を要し、そしてそれゆえ、複数の特徴についての並行分析には適していない。２）ポジティブドットハイブリダイゼーション（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｏｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、すなわち、ＰＣＲ産物を巻くまたは他の固体基板上に固定化し、その固定化されたＰＣＲ産物とプローブとをハイブリダイズさせる。この方法は、ＰＣＲ産物が生成、定量および固定化されていることを必要とし、時間を要し、そして少量のサンプルにおける検出に適していない。３）リバースドットハイブリダイゼーション（ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｏｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、すなわち、ＰＣＲ産物と、既に膜または他の固体基板の表面に固定化したプローブとをハイブリダイズさせる。多数のプローブを含有する基板は、迅速に調製され得、そしてＰＣＲ反応完了後速やかにＰＣＲ産物を分析するために使用され得る。したがって、この方法は、迅速かつ簡便であり、キットおよび遺伝子チップにおける使用に適している。

遺伝子チップ技術は、革新的である。その対称的、微小的および自動的特性に起因して、遺伝子チップ技術は、核酸分析（特に、ハイスループット核酸分析）において、重要な用途が見出されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５）。核酸チップは、特異的な条件下で、遺伝子発現プロファイルを分析するために使用されており、そして１ｋｂまでの遺伝子領域において、一塩基多型（ＳＮＰ）を決定するためにもまた使用されている。

バイオチップ（例えば、感染性疾患の検出のために使用されるバイオチップ）を使用する伝統的な受動的核酸分析は、代表的に、３つの工程を包含する。第一の工程は、サンプル調製、すなわち、血漿、血液、唾液、尿、および糞便のようなサンプルからの核酸の調製である。そのようなサンプルから得られた核酸は、通常、直接分析されるには不十分であり、さらなる増幅（例えば、ＰＣＲ増幅）が必要である。第二の工程は、核酸ハイブリダイゼーション、すなわち、その増幅された産物と、そのチップ上に固定化されたプローブとの間のハイブリダイゼーションである。第三の工程は、ハイブリダイゼーションシグナルの検出である。この工程は、代表的に、特定の標識の検出によって実施される。この標識は、増幅およびハイブリダイゼーションの間に導入され得る。検出方法は、使用される標識に依存する。例えば、蛍光検出器が蛍光標識を検出するために使用され得、一方オートラジオグラムが放射能標識を検出するのに使用され得る。ビオチンおよびストレプトアビジン標識が使用される場合、さらなる酵素的増幅が実施され得る。異なる増幅法が、実験の所望の感度に依存して使用される。例えば、チラミドシグナル増幅（Ｔｙｒａｍｉｄｅ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＳＡ）および分枝ＤＮＡ法（それぞれ、非特許文献６および非特許文献７に記載される）である。

標的核酸と、バイオチップの表面上に固定化されたプローブとの間のハイブリダイゼーションは、核酸検出における中心的な工程を構成する。この標的核酸は、代表的に、ＰＣＲによって増幅され、一本鎖ＰＣＲ産物に変性され、これが次いで、ストリンジェントな条件下でプローブにハイブリダイズされる。このハイブリダイズされた産物を、次いで、洗浄および検出する。ハイブリダイゼーションの間、そのＰＣＲ産物の一方の鎖のみがプローブとハイブリダイズし得る。対応する相補鎖は、ＰＣＲ二本鎖産物の自己アニーリングに起因して、ハイブリダイゼーションを妨害し得る。結果として、ハイブリダイゼーションシグナルが失われ得る。オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする場合、一本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション感度は、変性した二本鎖ＤＮＡよりも約５倍高いことが見出されている（非特許文献８）。したがって、遺伝子チップ上でのオリゴヌクレオチドとの高効率ハイブリダイゼーションのために、一本鎖核酸を得ることが望ましい。

一本鎖核酸を調製するための、いくつかの方法が存在する。熱または塩基による二本鎖ＤＮＡの変性に加えて、一本鎖核酸を調製するための方法としては、以下が挙げられる。

１．逆転写法。この方法では、Ｔ７プロモーターがＰＣＲプライマーに加えられる。一本鎖核酸は、鋳型として精製ＰＣＲ産物を使用する、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ媒介性インビトロ転写によって生成される（非特許文献９）。一本鎖核酸の収率はこの方法では非常に高いが、そのような二工程の方法は不便であり、そしてＲＮａｓｅによる汚染の傾向がある。

２．エキソヌクレアーゼ切断法（非特許文献１０）。この方法において、上記ＰＣＲプライマーの一方はリン酸化されている。ＰＣＲ産物がエキソヌクレアーゼによる切断に供される場合、このリン酸化されたプライマーから伸長した鎖は切断されない。次いで、このエキソヌクレアーゼは熱不活性化されなければならない。この方法は、ＰＣＲ産物の精製を必要とし、エキソヌクレアーゼ活性に依存し、そしてそれゆえ不便である。

４．変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）。この方法において、上記ＰＣＲプライマーの一方はビオチンで標識されている。標識されたプライマーから伸長した鎖は、それゆえ、ＤＨＰＬＣにおいて他の鎖から分離され得る（非特許文献１１）。所望の一本鎖は、１５分以内に、二本鎖ＰＣＲ産物から得ることができる。しかしながら、そのような方法は、高価な機器を必要とし、それゆえ一般的には使用され得ない。

４．磁性ビーズ捕捉法。この方法では、ビオチンが上記ＰＣＲプライマーの一方に結合される。標識されたプライマーから伸長した鎖は、ストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズによって捕捉され、そしてＮａＯＨを使用してそのビーズから分離される（非特許文献１２）。この方法は、コーティングされた磁性ビーズの使用に起因して、非常に高価である。

５．非対称ＰＣＲ。上記の方法の全てがＰＣＲ反応後に余分な工程を含む一方で、非対称ＰＣＲは、ＰＣＲ反応プロセスの間のＤＮＡの調製を可能にする。本発明者らは、非対称ＰＣＲおよび磁性ビーズ捕捉法の両方が、比較的高い感度および特異性を有することを見出したが、熱変性および塩基変性法はしばしば、偽陰性の結果を生じる。これら全ての方法の中で、非対称ＰＣＲは、比較的単純かつ低価格であり、それゆえずっと実用的である（非特許文献１３）。

近年、非対称ＰＣＲのための以下のスキームが存在する。

１）非対称ＰＣＲのための異なる濃度の上流プライマーおよび下流プライマーの使用。サイクルが増加するにつれて、低い濃度のプライマーが使い果たされ、一方高濃度のプライマーは、線形に増加する速度で一本鎖ＤＮＡを産生する（非特許文献１４）。同様に、Ｚｉｈｏｎｇ へらは、ＳＮＰ検出のためにＩＧＦ−ＩＩ遺伝子を非対照的に増幅するために、プライマーを１：１０および１：２０の比率において使用した（非特許文献１５）。Ｓｈｕａｎｇｄｉｎｇ Ｌｉらは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子を非対照的に増幅するために、プライマーを１：１５の比率で使用した（非特許文献１６）。そのような方法は、上流プライマーと下流プライマーとの間の比率の最適化を必要とし、非特異的増幅の可能性を増加させる。結果として、その産物は、通常、電気泳動上で拡散したバンドとして示される（非特許文献１７）。

２）非対称ＰＣＲのための異なる長さの上流プライマーおよび下流プライマーの使用。Ｘｉａｏｍｏｕ Ｐｅｎｇらは、ＨＢＶのＳ遺伝子を非対照的に増幅するために、３４ヌクレオチドの上流プライマーおよび２０ヌクレオチドの下流プライマーを使用した。ＰＣＲサイクルの第二相の間に、アニーリング温度が上昇される。短いプライマーはそのような条件下ではアニーリングできず、一方長いプライマーは伸長し続け、一本鎖核酸を得る（非特許文献１８）。このプライマーは遺伝子特異的であるが、長いプライマーの使用により、増幅に非特異性が導入される。したがってそのような方法は、多くのＳＮＰ部位を有する遺伝子（例えば、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ）の増幅には適していない。

３）ＰＣＲ鋳型を生成するための対称ＰＣＲの使用、ならびにＰＣＲ産物をさらに非対称増幅および標識するための１つのプライマーまたは異なる量のプライマーの使用（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）。これらの方法は、鋳型として精製された対称ＰＣＲ産物を使用し、その後ＰＣＲサイクルを介して一本鎖を産生するために１つのプライマーを使用する。この方法は、複数工程の反応を必要とし、そしてそれゆえ、時間を要し、不便である。

複数ＰＣＲの慣習的な方法は、複数のレベルの最適化を必要とする。これらの方法は、以下の問題点を有する。１）複数のプライマーの使用が、これらの異なるプライマーによる偽陽性の増幅を生成する。２）異なるプライマー間での競合により、標的核酸のバランスのとれていない増幅が生じる。すなわち、特定のプライマー対が効率的に増幅し、一方特定のプライマー対は非常に非効率的に増幅する。３）異なる実験を繰り返す。したがって、そのような状況下で非対称ＰＣＲをさらに実施するのは不満である。上述の方法は、それゆえ、複数の標的の同時分析には適していない。一工程の非対称ＰＣＲに対する必要性が存在する。
Ａｎｄｒａｓら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：２９−４４，２００１ ＤｅｂｏｕｃｋおよびＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，２１（補遺）：４８−５０ Ｄｕｇｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９９，２１（補遺）：１０−１４ Ｇｅｒｈｏｌｄら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９９，２４：１６８−１７３ Ａｌｉｚａｄｅｈら、Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３：５０３−５１１ Ｋａｒｓｔｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２００２，Ｅ４ Ｋｒｉｃｋａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，４５：４５３−４５８ Ｋａｗａｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３，２０９：６３−６９ Ｈｕｇｈｅｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，１９：３４２−３４７ ＨｉｇｕｃｈｉおよびＯｃｈｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８９，１７：５８６５ ＤｉｃｋｍａｎおよびＨｏｒｎｂｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，２８４：１６４−１６７ Ｅｓｐｅｌｕｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６１５７−６１５８ Ｇａｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００３，３３：２８４９−２８６３ ＧｙｌｌｅｎｓｔｅｎおよびＥｒｌｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５：７６５２−７６５６ Ｈｅら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００２，２１：１１６−１２１ Ｌｉら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００３，１１：３９３−３９７ Ｅｒｄｏｇａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１，２９：Ｅ３６ Ｐｅｎｇら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，２００２，６：２０６−２０８ Ｇｏｒｅｌｏｖら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９４，２００：３６５−３６９ Ｓｃｏｔｔら、Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．未Ｃ路日おＬ。、１９９８，２７：３９−４４ Ｇｕｏら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００２，１２：４４７−４５７ Ｚｈｏｕら、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ，２００３，１９：５２４−５２７

本発明は、一本鎖増幅産物の調製のための単純かつ効率的な非対称ＰＣＲ増幅法、およびそのような方法のためのプライマーを提供する。

本発明は、非対称ＰＣＲ増幅のためのプライマーセットを提供し、このプライマーセットは複数のプライマー対を含み、各プライマー対における２つのプライマーのうちの一方は、その５’末端において、増幅される標的配列と無関係な配列を有するオリゴヌクレオチドテイルを有する。

プライマーが適したＴｍ値を有するために、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、通常、８ｂｐ〜４０ｂｐであり、好ましくは１５ｂｐ〜２５ｂｐである。

異なる標的配列の間の増幅効率のバランスをとるために、非対称ＰＣＲプライマーにおいて、一般プライマーが提供される。ここで、その一般プライマーの少なくとも８個の連続するヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドテイルにおけるヌクレオチドの同じである。好ましくは、この一般プライマーは、オリゴヌクレオチドテイルの配列と同じ配列を有する。

一本鎖の非対称増幅および生成を促進するために、本明細書中に記載される一般プライマーの濃度は、本明細書中に記載される遺伝子特異的プライマー対の濃度よりも高い。

したがって、本発明は、非対称ＰＣＲプライマーを使用する非対称ＰＣＲ増幅法を提供する。この方法は、１）プレ変性（ｐｒｅｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）；２）変性、アニーリングおよびプライマー伸長のサイクルの１つ以上を含む、第一相ＰＣＲ増幅；ならびに３）変性、アニーリングおよびプライマー伸長のサイクルの１つ以上を含む第二相ＰＣＲ増幅、の工程を包含し、ここで、プライマー伸長のためのプライマー対の２つのプライマーのうちの一方は、その５’末端において、標的配列とは無関係の配列を有するオリゴヌクレオチドテイルを有する。

増幅効率を増加させるために、さらなるプライマー伸長反応が、第二相ＰＣＲ増幅の後に実施される。

上記工程２）における第一相ＰＣＲ反応は、１５〜２５サイクルを有し、工程３）における第二相ＰＣＲのための伸長温度は、６０℃〜７５℃であり得る。

本発明の非対称ＰＣＲ法は、図１にさらに図示される。図１において、ｓｆ−１／ｓｒ−１およびｓｆ−２／ｓｒ−２が、それぞれ標的遺伝子１および標的遺伝子２に対する特異的プライマー対である。これらの中で、ｓｒ−１およびｓｒ−２は、その５’末端において、一般配列を有する。一般プライマーに対して「Ｕｐ」という場合、その配列は、ｓｒ−１およびｓｒ−２における一般配列と同じである。非対称ＰＣＲ増幅反応の間、反応混合物におけるＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｍｇ^２＋、および反応プライマーは、慣習的なＰＣＲのために使用されているものと同じであり、そして異なる反応の要求に基づいて条件は最適化され得る。

本発明の非対称ＰＣＲ増幅反応は、２つの相を有する。ＰＣＲの第一相は、慣習的なＰＣＲと同じであり、変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長の工程を包含する。このアニーリング温度は、上記遺伝子特異的プライマーのＴｍに基づいて調整され得る。同様に、伸長時間は、増幅されるフラグメントの長さに依存する。両方のプライマーが、慣習的な増幅の間に使用される。ＰＣＲ増幅の第二相において、プライマーアニーリングのための温度は、プライマー伸長のための温度と同じである。それゆえ、この第二相は、変性およびプライマー伸長の工程のみを有する。長く、それゆえより高いＴ_ｍを有する、テイルを有するプライマーのみが、アニーリングおよび伸長することができ、それによって一本鎖を産生する。

本発明の非対称ＰＣＲにおいて使用される一般プライマーは、以下の機能を有する。ＰＣＲの第一相の間、この一般プライマーは、第二の温度サイクルの後の増幅反応に関与し得、それによって複数の増幅反応における異なる標的の増幅効率のバランスをとる。この一般プライマーの高い濃度に起因して、増幅プロセス全体を通じて異なるプライマーの濃度における差異を釣り合わせ、それによって非対称的増幅および一本鎖の作製を促進する。

本発明の別の目的は、核酸の検出における非対称ＰＣＲプライマーの使用を提供することである。

本発明において記載される非対称ＰＣＲプライマーは、複数のＰＣＲ増幅のために有用であり、その後、遺伝子チップまたは他のハイブリダイゼーション（例えば、メンブレンハイブリダイゼーション）が行われ、複数の標的配列を簡便に検出することを可能にする。

本発明の方法によって生成される非対称ＰＣＲ産物は、以下の遺伝子チップ検出法において使用され得る：ａ）リバースハイブリダイゼーション、すなわち、非対称ＰＣＲ増幅の産物とハイブリダイゼーション緩衝液とを混合し、熱変性し、そして遺伝子チップ上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる；あるいは、ｂ）ポジティブハイブリダイゼーション、すなわち、非対称ＰＣＲ増幅の産物を精製し、その精製産物を、固体キャリアの表面上に固定化し、遺伝子チップを作製し、そしてその遺伝子チップを核酸プローブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの最後に、異なる標識法およびシグナル検出法が、ハイブリダイゼーションシグナルを検出し、標的配列の検出を完了するために使用され得る。

本発明の非対称ＰＣＲ法は慣習的な非対称ＰＣＲ法に対して以下の利点を有する。

１）プライマー対の一方のプライマーの５’末端において標的配列に無関係である一般配列を加えることにより、そのプライマー対における一方のプライマーが他方のプライマーよりも長くなり、それによってそのプライマー対における２つのプライマーのＴｍを差別化する。５’末端オリゴヌクレオチドテイルの一般配列はまた、遺伝子特異的配列の間の差異を強調しないようにし（ｄｅｅｍｐｈａｓｉｚｅ）、初期ＰＣＲサイクルの増幅頻度を増加させ、そしてプライマー設計における困難性を克服する。

２）オリゴヌクレオチドテイルの配列と同じ配列を有する一般プライマーの付加により、上流プライマーと下流プライマーとの間のプライマー数におけるさらなる不均衡を作り出す。

３）より重要なことに、本発明の非対称ＰＣＲプライマーは、複雑な最適化プロセスの必要なしで、複数のＰＣＲ増幅のために使用され得る。この利点には、２つの理由が存在する。第一に、全てのプライマー対に対する２つのプライマーのうちの１つは同じ一般配列を有するため、これらのプライマー対に対する増幅効率は似通う傾向があり、異なるプライマー間の干渉の可能性は低い。第二に、この一般プライマーは、増幅プロセスにおけるプライマーのバランスをとる。ある特定の遺伝子特異的プライマー対が低い増幅効率を有する場合、より多くの一般プライマーが、その後の増幅反応に関与する。遺伝子特異的プライマーの増幅効率が低くなるほど、その後の反応に関与する一般プライマーの数は増加し、逆もまた同様である。したがって、異なる標的分子が、ほぼ同じ効率において増幅される。この一般配列は、それゆえ、異なるＰＣＲ反応の間のバランスを生み出し、そして全ての遺伝子特異的プライマーの類似の増幅効率を保証する。

（本発明の実施例の最良の形態）
（実施例１．単一非対称ＰＣＲ増幅および遺伝子チップ上でのグラム陽性細菌の決定におけるその適用）
１．ＰＣＲ増幅のための遺伝子特異的プライマーおよび種々のオリゴヌクレオチドプローブ。

プライマーおよびプローブはいずれも、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｏｙａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙによって合成した。５’末端にＴＡＭＲＡ蛍光標識を有する特定のプライマーおよび５’末端に修飾アミノ基を有するプローブもまた、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｏｙａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙから提供された。

遺伝子特異的プライマーに対する標的配列は、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子であった。増幅フラグメントは、約１．５ｋｂであった。このプライマーの分類およびそのオリゴヌクレオチド配列を、表１に提供する。

種々のオリゴヌクレオチドプローブが、標的細菌の一本鎖増幅産物における種々の部位にハイブリダイズし得る。このプローブの配列は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のフラグメントと同一であった。いくつかの核酸プローブの核酸配列およびその対応する標的を、表２に提供する。

２．アルデヒド基を有する基板の調製
室温で一晩、酸性溶液中にガラス基板を浸す。この酸性溶液を水道水で３回洗浄し、蒸留水で３回洗浄し、脱イオン水で１回浸し洗いし、そして脱イオン水で１回洗浄する。このガラス基板を、次いで、遠心分離によって乾燥させ、１１０℃で１５分間焼き、このガラス基板を完全に乾燥させる。このガラス基板を、次いで、９５％エタノール中１％ ＡＰＴＥＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）に浸し、振盪床上で４時間、室温にて振盪する。このガラス基板を、次いで、１回洗浄し、９５％ＥｔＯＨで１回浸し洗いする。この洗浄されたガラス基板を、次いで、１１０℃において２時間ガスバルブを閉じて、最大減圧（−０．０８Ｍｐａ〜−０．１Ｍｐａ）下で、減圧乾燥器内に置いた。このガラス基板を、次いで、室温まで冷却し、１２．５％グルタルジアルデヒド（４００ｍｌの１２．５％グルタルジアルデヒド溶液、１００ｍｌの５０％グルタルジアルデヒド、３００ｍｌのリン酸緩衝液（１モル／Ｌ ＮａＨ_２ＰＯ_４ ３０ｍｌ、２．６８２ｇ ＮａＣｌ）ｐＨ７．０）に浸し、室温下で４時間振盪した。このガラス基板を、次いで、グルタルジアルデヒド溶液から取り出し、３×ＳＳＣで３回、脱イオン水で２回洗浄し、遠心分離して水を除去し、そして室温において乾燥させた。

３．プローブが表面上に固定化されたガラス基板（遺伝子チップ）の調製
表２に示されるプローブを、最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌで５０％ ＤＭＳＯに溶解する。このプローブを、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｓｐｏｔｔｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）（９×９、０９０ＱＣはプローブＰＢＢ−０２０１０９０を示す）を使用して、図２に示すように基板上にスポットする。このスポットされたガラス基板を、室温下で一晩乾燥させ、室温において０．２％ＳＤＳ中に２回、それぞれ振動条件下で浸した。このガラス基板を、次いで、脱イオン水で２回洗浄し、脱イオン水で１回浸し洗いし、そして遠心分離して水を除去した。このガラス基板を次いで、ＮａＢＨ４溶液（1ｇ ＮａＢＨ４を３００ｍｌの１×ＰＢＳに溶解し、次いで１００ｍｌエタノールを加えた）に移し、５分間わずかに振盪した。このガラス基板を、次いで、脱イオン水で１回洗浄し、脱イオン水で１回浸し洗いし（それぞれ１分）、そして遠心分離して水を除去した。

４．細菌培養および核酸抽出
本明細書中で使用されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ２６００１を、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手した。

無菌のワークステーションにおいて、ＭＨ（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地）培養スラブに細菌を播種し、シングルコロニーを分離する。このスラブを、３５℃インキュベーターにおいて、２４時間、上下にインキュベートした。

１０ｍｇのＧ１１４５ガラスビーズおよび４０ｍｇのＧ１１５２ガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）を、無菌の１．５ｍｌ遠心チューブ内に入れ、１００μｌの１×ＴＥを加える。炎によって滅菌されたピンセットを使用して、爪楊枝またはチップを掴み、その培養スラブからシングルコロニーを取り、その爪楊枝またはチップをそのチューブの底部においてガラスビーズにこすりつけ、それによって十分量の細菌をそのチューブ内に残す。その爪楊枝またはチップを、細菌殺傷溶液を含むくず入れに投げ入れ、その遠心チューブを閉じる。そのチューブを、ボルテックスミキサー（ＴＤＸ−１，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｏｎｇｄａ）において最大速度で５分間ボルテックスする。この遠心分離チューブを、次いで、９５℃の水浴に５分間入れ、４℃で保管する。

５．核酸ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ系を、表３に示すように組み立てた。２６００１細菌懸濁液においてガラスビーズを振盪することによって調製した１μＬの細菌サンプルを、系Ａ、ＢおよびＣの各々に加えた。総反応容量は、２５μｌであった。

ＰＣＲ反応を、ＰＴＣ−２００サイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）において実施した。系Ａおよび系Ｂは、表４に示すような非対称ＰＣＲ増幅サイクルを使用した。系Ｃは、表５に示されるような非対称ＰＣＲサイクルを使用した。

６．電気泳動
アガロースゲル電気泳動を、ＰＣＲ増幅産物を検出するために使用した。アガロースゲルの濃度は１．５％であった。各サンプルは２μｌであり、電気泳動は、５０Ｖ／ｃｍで３０分間実施した。

７．ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション系を、表６に示す。

２００μｌの蒸留水を、ＨｙｂｒｉＣａｓｓｅｔｔｅｓ^ＴＭ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｏ’ａｏ Ｂｉｏｃｈｉｐ，Ｌｔｄ）に加え、ハイブリダイゼーション系の蒸発を防ぐ。反応物が表面上に固定化されたガラス基板およびカバースリップ（ＳｍａｒｔＣｏｖｅｒＴＭ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｏ’ａｏ Ｂｉｏｃｈｉｐ，Ｌｔｄ．）を、ハイブリダイゼーションカセット中に入れる。このハイブリダイゼーション系を９５℃に加熱し、５分間９５℃で維持し、ＰＣＲ産物の変性を可能にする。この混合物を、次いで、氷水浴において速やかに冷却する。１３μＬのハイブリダイゼーション系を採取し、そのカバースリップ上の孔を通して、その基板とそのカバースリップとの間の空隙にそのハイブリダイゼーション系を加える。そのハイブリダイゼーションカセットを閉じ、９０分間ハイブリダイゼーションさせる。次いでチップを取り出し、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中に浸し、そして５分間振盪する。このチップを、次いで、脱イオン水で２回、それぞれ１分間浸し洗いし、そして遠心分離して水を除去した。２回の実験を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ２６００１サンプルを含むＰＣＲ系で実施した。

８．チップ上でのシグナルの検出
チップ上の蛍光シグナルを、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂスキャナ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用することによって検出した。波長５３２ｎｍ、ＰＭＴ６００、および出力３３％。

９．結果の分析
アガロースゲル電気泳動の結果を、図３に示す。レーン１およびレーン１１は、ＤＬ２０００マーカー（Ｔａｋａｒａｒ）であり；レーン２、レーン３およびレーン４は、系ＡのＰＣＲ産物であり；レーン５、レーン６およびレーン７は、系ＢのＰＣＲ産物であり；レーン８、レーン９およびレーン１０は、系ＣのＰＣＲ産物であった。これらのレーンの中で、レーン２、レーン３、レーン５、レーン６、レーン８およびレーン９は、２６００１細菌サンプルを含有し、一方レーン４、レーン７およびレーン１０におけるＰＣＲ系は、ブランクコントロールを含有した。図３に示されるように、３つ全てのＰＣＲ系（Ａ、ＢおよびＣ）が、約１．５ｋｂの二本鎖標的核酸の良好な増幅をもたらしたが、一方系Ａのみが明確な一本鎖ＰＣＲ増幅産物を産生した。

図４は、本明細書中に記載される実験のポジティブなハイブリダイゼーション結果を示す。図４Ａは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの所望のハイブリダイゼーションシグナルを示し；図５は、本明細書中に記載されるハイブリダイゼーション実験の蛍光検出結果を示す。図４および図５に示されるように、系Ａを使用したハイブリダイゼーション結果のみが、図４と一致するシグナルを生じ、一方他の２つの系は、部分的な結果を生じるのみであった。１つの可能な説明は、系Ｂおよび系Ｃにおいて産生された主要な産物は二本鎖ＰＣＲ産物であり、これはハイブリダイゼーションの間に自己アニーリングすることができ、それによってポジティブなシグナルを弱めているか、またはポジティブなシグナルを生じることができなくなっているというものである。

電気泳動およびチップハイブリダイゼーション結果は、本発明の非対称ＰＣＲ増幅系および非対称ＰＣＲ増幅温度サイクルが一本鎖増幅産物の調製において効率的であることを実証した。これは、ハイブリダイゼーション反応に特に適しており、それによってハイブリダイゼーション効率およびハイブリダイゼーションシグナルを増加させる。

（実施例２．複数の非対称ＰＣＲ増幅および遺伝子チップを使用する、細菌の薬物耐性遺伝子の検出）
プライマーおよびプローブはいずれも、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｏｙａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙによって合成した。５’末端にＴＡＭＲＡ蛍光標識を有する特定のプライマーおよび５’末端に修飾アミノ基を有する特定のプローブもまた、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｏｙａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙによって提供された。

遺伝子特異的プライマーの分類、配列情報、標的遺伝子、および増幅されたフラグメントの長さは、表７に示す。各標的遺伝子は２つのプローブを有し、それらの配列情報は表８に示す。これらの中で、標的遺伝子ｔｅｔＫおよびｔｅｔＭは、グラム陽性細菌由来のテトラサイクリン耐性遺伝子であった。標的遺伝子ｅｒｍＡおよびｅｒｍＣは、グラム陽性細菌由来のマクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミンＢ耐性遺伝子であった。普遍的な細菌の２３ｒＲＮＡ遺伝子の部分を、ＰＣＲ増幅およびハイブリダイゼーションプロセスをモニタリングするために、内部コントロールとして使用した。

２．アルデヒド基を有するガラス基板の調製
アルデヒド基を有するガラス基板は、実施例１のように調製した。

３．プローブが表面上に固定化されたガラス基板の調製
調製法は、実施例１と同じであった。このプローブは、表８に示す。これらのプローブを、図６に示すように（６×６、０９０ＱＣは、コントロールプローブＰＢＢ−０２０１０９０を示し、残りのプローブは、プローブ番号の最後３つの数字で番号を付けた）スポットした。例えば、ＰＢＢ−０２４６５４は、「６５４」と示される。

４．細菌培養および核酸抽出
本実施例において使用した最近の供給元は、表９に示す。細菌の培養および核酸抽出法は、実施例２に示される。

５．核酸のＰＣＲ増幅
本実施例は、１回の実験における５つの異なるＰＣＲ増幅を示す。このＰＣＲ反応系を、以下に示す：１×ＭａｔｅｒＭｉｘ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｉａｎｗｅｉ Ｔｉｍｅｓ）；０．２μｍｏｌ／Ｌの、表７に示される５対の遺伝子特異的プライマー；１μｍｏｌ／Ｌの一般プライマーＡＭＢ＿０４０８０４７；ガラスビーズとの振動後の１μＬの細菌サンプル。総反応容量は、２５μＬであった。

ＰＣＲを、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）サーモサイクラーで実施した。この非対称ＰＣＲサーモサイクルは、表４に示した。

６．ハイブリダイゼーションおよび検出
ハイブリダイゼーション検出系およびハイブリダイゼーション検出法、ならびにハイブリダイゼーション後の蛍光検出法は、実施例１に示した。

７．結果の分析
図７は、８種の細菌株についての薬物耐性遺伝子検出結果を示す。図７に示されるように、異なる細菌株は、異なる種類および数の薬物耐性遺伝子を有する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＭＲＳＡ６５８１およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓは、１つの薬物耐性遺伝子のみを有する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｂ４３７およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ＴＲ２０４１は、２つの薬物耐性遺伝子を有する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｂ４３５およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＭＲＳＡ６４６０は、３つの薬物耐性遺伝子を有する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＭＲＳＡ６４３７は、４つの薬物耐性遺伝子を有する。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍは、薬物耐性遺伝子を有さない。

さらに、図７に示されるように、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションコントロールの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、全ての細菌株に対して良好に機能し、良好な増幅および強力なハイブリダイゼーションシグナルを生じた。ポジティブおよび相同なシグナルを、１つ、２つ、３つまたは４つの薬物耐性遺伝子を有する全ての細菌から得た。このことは、本発明の非対称ＰＣＲ増幅法および温度サイクルが、複数の遺伝子の並行検出に適していることを示す。

本発明の非対称ＰＣＲ増幅法は、高収率の一本鎖産物を産生し、このことはその後のハイブリダイゼーション反応を促進し、ハイブリダイゼーション効率を向上させ、そしてハイブリダイゼーションシグナルを増加させる。この方法はまた、最適化の必要性なく、類似の条件下での単一または複数のＰＣＲ増幅のために有用である。本発明のプライマーは、設計が単純である。本方法は、操作が容易であり、多因子のハイスループット遺伝子チップ法に適用可能である。本明細書中に記載される方法は、微生物判定、分類、薬物耐性遺伝子検出、疾患診断および予後、ＨＬＡ分類、ＳＮＰ検出ならびに遺伝子分析において用途を見出し得る。

図１は、本発明の非対称ＰＣＲの概略図を提供する。 図２は、実施例１において使用されるプローブアレイの概略図を提供する。 図３は、実施例１のＰＣＲ産物の電気泳動写真を提供する。 図４Ａは、実施例１に記載されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ２６００１サンプルにおける所望のハイブリダイゼーション結果を提供する。図４Ｂは、実施例１に記載されるブランクコントロールにおける所望のハイブリダイゼーション結果を提供する。 図５は、ハイブリダイゼーション後の蛍光検出の結果を提供する。 図６は、実施例２に記載されるプローブのアレイの概略図を提供する。 図７は、実施例２に記載されるハイブリダイゼーション後の蛍光検出の結果を提供する。

Claims (16)

1. 複数のＰＣＲプライマー対を含む非対称ＰＣＲ増幅のためのプライマーセットであって、各プライマー対における一方のプライマーは、５’末端において、増幅される標的配列に無関係な配列を有するオリゴヌクレオチドテイルを有する、プライマーセット。
2. 前記オリゴヌクレオチドテイルは８オリゴヌクレオチド長〜４０オリゴヌクレオチド長である、請求項１に記載のプライマーセット。
3. 前記オリゴヌクレオチドテイルは１５ヌクレオチド長〜２５ヌクレオチド長である、請求項２に記載のプライマーセット。
4. 一般プライマーをさらに含む、請求項１、２または３のいずれか１項に記載のプライマーセットであって、該一般プライマーは、前記オリゴヌクレオチドテイルのヌクレオチドと同じ、少なくとも８個の連続するヌクレオチドを有する、プライマーセット。
5. 前記一般プライマーの配列は、前記オリゴヌクレオチドテイルの配列と同じである、請求項４に記載のプライマーセット。
6. 前記一般プライマーの濃度は、前記プライマー対の濃度よりも高い、請求項４に記載のプライマーセット。
7. 非対称ＰＣＲ増幅法であって、該方法は、
   １）プレ変性；
   ２）変性、アニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを１つ以上含む、第一相のＰＣＲ増幅；ならびに
   ３）変性およびプライマー伸長のサイクルの１つ以上を１つ以上含む、第二相のＰＣＲ増幅、
   を包含し、
   伸長のための各プライマー対における一方のプライマーは、その５’末端において、増幅される標的配列に無関係な配列を有するオリゴヌクレオチドを有する、方法。
8. 前記第二相のＰＣＲの後にさらなる伸長工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
9. 前記第一相のＰＣＲ増幅のための前記ＰＣＲ増幅サイクルは、８回〜２５回である、請求項７または８に記載の方法。
10. 前記オリゴヌクレオチドテイルは８ヌクレオチド長〜４０ヌクレオチド長である、請求項７または８に記載の方法。
11. 前記ＰＣＲのためのプライマーはさらに一般プライマーを含み、該一般プライマーは、前記オリゴヌクレオチドテイルのヌクレオチドと同じ、少なくとも８個の連続したヌクレオチドを有する、請求項７または８に記載の方法。
12. 前記一般プライマーの配列は、前記オリゴヌクレオチドテイルのプライマーと同一である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記一般プライマーの濃度は、前記プライマー対の濃度よりも高い、請求項１１に記載の方法。
14. 前記第二相のＰＣＲのための伸長温度は、６０〜７５℃である、請求項７または８に記載の方法。
15. 核酸の検出のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の非対称ＰＣＲ増幅プライマーセットの使用。
16. 前記核酸検出は、遺伝子チップまたはメンブレンハイブリダイゼーションを使用する、請求項１５に記載の使用。

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