EA006066B1

EA006066B1 - Способы амплификации нуклеиновых кислот

Info

Publication number: EA006066B1
Application number: EA200400329A
Authority: EA
Inventors: Тацудзи Еноки; Хироаки Сагава; Икуносин Като
Original assignee: Такара Био Инк.
Priority date: 2001-08-20
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2005-08-25
Also published as: KR20040028991A; EP1420069A4; EA200400329A1; TWI257426B; AU2002325538B2; US7056671B2; JPWO2003016569A1; WO2003016569A1; EP1420069A1; CN1633505A; US20050059003A1; CA2458127A1

Abstract

Описываются способы амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, посредством которых нуклеиновая кислота-мишень в образце амплифицируется с высокой чувствительностью и специфичностью, и композиции и наборы, используемые в указанных способах.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу детекции нуклеиновой кислоты-мишени, который применим в области клинической медицины, и способу синтеза ДНК, который применим в области генной инженерии. Настоящее изобретение относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты как матрицы и способу детекции нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной с использованием указанного способа.

Уровень техники

Синтез ДНК используют для разных целей при исследованиях в области генной инженерии. Большинство синтезов ДНК, за исключением синтеза короткоцепочечной ДНК (например, олигонуклеотида), осуществляют с использованием ферментативного способа, при котором используют ДНК-полимеразу. Примером такого способа является способ полимеразной цепной реакции (ПЦР, РСК.), подробно описанный в патентах США №№ 4683195, 4683202 и 48000159. Другим примером является способ ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, КТ-РСК), представляющий собой сочетание ПЦР и реакции обратной транскрипции, описанный в Тгепбк ίη Вю1есйпо1оду, 10:146-152 (1992). Разработка вышеуказанных способов сделала возможной амплификацию представляющего интерес участка ДНК или РНК.

Вышеуказанные способы синтеза осуществляют, например, с использованием взаимодействия, состоящего из трех стадий. Такими тремя стадиями являются стадия диссоциации (денатурации) двухцепочечной ДНК как матрицы до одноцепочечных ДНК, стадия отжига праймера к одноцепочечной ДНК и стадия синтеза (достраивания) комплементарной цепи с праймера с целью амплификации участка ДНК, представляющего интерес. С другой стороны, способы синтеза осуществляют с использованием реакции, называемой челночной ПЦР (РСК 1ои ка1/епкеп (Кесеп! абуапсек ίη РСК ше1йобо1оду), Тапракикййки Какикап Коико, Векка!ки (Рго1еш, Ыискю Αα6 апб Епхуше, 8ирр1ешеп1), 41(5):425-428 (1996), при которой две из трех стадий, т. е. стадию отжига и стадию достраивания, осуществляют при одной и той же температуре.

С другой стороны, можно использовать способ лигазной цепной реакции (ЛЦР, ЬСК), описанный в ЕР 320308, опубликованном 14 июня 1989г., или способ с системой амплификации на основе транскрипции (ТА8), описанный в РСК Рго1осо1к, Асабешю Ргекк 1пс., 1990, рр. 245-252. В указанных выше четырех способах требуется несколько раз повторить реакцию при высокой температуре и при низкой температуре для того, чтобы получить одноцепочечную молекулу-мишень для последующего цикла амплификации. Систему реакций следует проводить с использованием дискретных фаз или циклов, поскольку реакция ограничивается температурами, как описано выше.

Таким образом, в таких способах требуется использование дорогостоящих термоциклеров, в которых можно в широком интервале точно регулировать температуры по времени. Кроме того, при реакции требуется время для достижения двух или трех предварительно заданных температур. Потеря времени возрастает пропорционально числу циклов.

Для того чтобы решить такие проблемы, разработаны способы амплификации нуклеиновых кислот, которые можно осуществить изотермически. Их примерами являются способ амплификации с вытеснением цепи (8ΌΑ), описанный в 4Р-В 7-114718, способ самоподдерживающейся репликации последовательности (38К), способ амплификации на основе нуклеотидной последовательности (ΝΑ8ΒΑ), описанный в патенте Японии № 2650159, способ амплификации, опосредованной транскрипцией (ТМА), способ с Ρβ-репликазой, описанный в патенте Японии № 2710159, и различные способы модифицированной 8ΌΑ, описанные в патенте США № 5824517, АО 99/09211, АО 95/25180 и АО 99/49081. Способ изотермического ферментативного синтеза описывается в патенте США № 5916777. Достраивание с праймера и/или отжиг праймера к одноцепочечному продукту достраивания (или к исходной последовательности-мишени) с последующим достраиванием с праймера при реакции в таком способе изотермической амплификации нуклеиновых кислот или синтезе олигонуклеотидов происходят параллельно в реакционной смеси, инкубируемой при постоянной температуре.

Среди способов изотермической амплификации нуклеиновых кислот способ 8ΌΑ является примером системы, в которой в конечном счете амплифицируется ДНК. Способ 8ΌΑ представляет собой способ амплификации нуклеотидной последовательности-мишени (и комплементарной ей цепи) в образце путем вытеснения двух цепей с использованием ДНК-полимеразы и рестриктазы. Для способа требуется четыре праймера, используемых для амплификации, два из которых должны быть сконструированы таким образом, чтобы они содержали сайт узнавания для рестриктазы. Способ требует для синтеза ДНК в больших количествах применения в качестве субстрата модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата. Примером модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата является (а-8)-дезоксирибонуклеозидтрифосфат, в котором атом кислорода в фосфатной группе в α-положении заменен атомом серы (8). Проблема эксплуатационных расходов, связанная с применением модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата, становится серьезной, если реакцию используют регулярно, например, для генетических анализов. Кроме того, введение в таком способе модифицированного нуклеотида (например, (а-8)-дезоксирибонуклеотида) в амплифицированный фрагмент ДНК может лишить амплифициро

- 1 006066 ванный фрагмент ДНК способности к расщеплению рестриктазой, например, когда его подвергают анализу на полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, КТЬР).

Модифицированный способ 8ΌΑ, описанный в патенте США № 5824517, представляет собой способ амплификации ДНК, в котором используют химерный праймер, состоящий из РНК и ДНК и содержащий, в качестве обязательного элемента, структуру, в которой ДНК располагается, по меньшей мере, на З'конце. Модифицированный способ 8ΌΑ, описанный в АО 99/09211, требует применения рестрикционного фермента, который образует З'-выступающий конец. Модифицированный способ 8ΌΑ, описанный в АО 95/25180, требует применения, по меньшей мере, двух пар праймеров. Модифицированный способ 8ΌΑ, описанный в АО 99/49081, требует применения, по меньшей мере, двух пар праймеров и по меньшей мере одного модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата. С другой стороны, способ синтеза олигонуклеотидов, описанный в патенте США № 5916777, включает синтез ДНК с использованием праймера, содержащего рибонуклеотид на 3'-конце, завершение реакции с использованием праймера, введение ника между праймером и достраиваемой цепью в цепи, достраиваемой с праймера, с помощью эндонуклеазы для отделения их друг от друга, расщепление матрицы и извлечение праймера для его повторного использования. Необходимо выделить праймер из реакционной смеси и затем снова отжечь его с матрицей для того, чтобы праймер использовать в способе повторно. Кроме того, для способа изотермической амплификации, опосредованной петлей (ЬАМР), описанного в АО 00/28082, требуется четыре праймера для амплификации, и продукты, амплифицированные с использованием такого способа, представляют собой ДНК варьирующего размера, в которых области-мишени амплификации повторяются.

Кроме того, известен способ изотермической амплификации нуклеиновых кислот с использованием химерного олигонуклеотидного праймера - способ изотермической инициируемой химерным праймером амплификации нуклеиновых кислот (ΙΟΑΝ), описанный в АО 00/56877 или АО 02/7139. Однако традиционные способы изотермической амплификации нуклеиновых кислот все еще связаны с различными проблемами. Таким образом, требуется способ амплификации нуклеиновых кислот при низких эксплуатационных расходах, с помощью которого получают фрагмент ДНК, который затем можно использовать в генетической инженерии.

Раскрытие изобретения

Основной целью настоящего изобретения является способ амплификации нуклеиновой кислоты, при котором нуклеиновая кислота-мишень в образце специфически амплифицируется с высокой чувствительностью, а также композиция и набор для такого способа.

В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения нашли, что эффективность амплификации нуклеиновой кислоты-мишени повышается и чувствительность детекции улучшается за счет использования сочетания химерного олигонуклеотидного праймера и верхнего (ир81геат) блокирующего олигонуклеотида, который отжигается к участку, расположенному в 3'-направлении относительно участка в нуклеиновой кислоте-матрице, к которому отжигается праймер в способе ΙΟΑΝ, описанном в АО 00/56877 или АО 02/7139. Таким образом осуществлено настоящее изобретение.

Первый аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, причем способ включает (a) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты как матрицы, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи, по меньшей мере, одного химерного олигонуклеотидного праймера по меньшей мере одного верхнего блокирующего олигонуклеотида и РНКазы Н, где химерный олигонуклеотидный праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, по существу, комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или по 3'-концевой стороне праймера, и где верхний (ирйгеат) блокирующий олигонуклеотид, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности, расположенной в 3'-направлении к участку в нуклеиновой кислоте как матрице, который, по существу, комплементарен химерному олигонуклеотидному праймеру, и нуклеотид на 3'конце верхнего блокирующего олигонуклеотида модифицируют таким образом, что реакция достраивания комплементарной цепи под действием ДНК-полимеразы не происходит; и (b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

Согласно первому аспекту реакционная смесь также может содержать второй химерный олигонуклеотидный праймер, имеющий последовательность, по существу, гомологичную нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы. Реакционная смесь также может содержать верхний блокирующий олигонуклеотид, который имеет последовательность, по существу, гомологичную нуклеотидной последовательности, находящейся в 5'-направлении к участку в нуклеиновой кислоте как матрице, которая имеет последовательность, по существу, гомологичную нуклеотидной последовательности второго химерного олигонуклеотидного праймера, и нуклеотид на 3'-конце верхнего блокирующего олигонуклеотида модифицируют таким образом, что реакция достраивания комплементарной цепи под действием ДНК-полимеразы не происходит.

- 2 006066

Второй аспект настоящего изобретения относится к композиции для способа амплификации нуклеиновой кислоты по первому аспекту, которая содержит, по меньшей мере, один химерный олигонуклеотидный праймер и, по меньшей мере, один верхний блокирующий олигонуклеотид.

Третий аспект настоящего изобретения относится к набору для способа амплификации нуклеиновой кислоты по первому аспекту, который содержит, по меньшей мере, один химерный олигонуклеотидный праймер и, по меньшей мере, один верхний блокирующий олигонуклеотид.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу детекции нуклеиновой кислотымишени, причем способ включает (a) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому аспекту и (b) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на предыдущей стадии.

Краткое описание чертежа

Чертеж представляет результаты электрофореза в агарозном геле фрагментов ДНК, амплифицированных согласно способу настоящего изобретения.

Осуществление изобретения

Как используется в настоящей заявке, дезоксирибонуклеотид (также называемый 6Ν) представляет нуклеотид, в котором углеводная часть состоит из Б-2-дезоксирибозы. К дезоксирибонуклеотидам относятся, например, нуклеотиды, содержащие в качестве основания аденин, цитозин, гуанин или тимин. Кроме того, к дезоксирибонуклеотидам также относятся дезоксирибонуклеотид, содержащий модифицированное основание, такое как 7-деазагуанозин, и дезоксирибонуклеотидный аналог, такой как дезоксиинозиннуклеотид.

Как используется в настоящей заявке, рибонуклеотид (также называемый Ν) представляет нуклеотид, в котором углеводная часть состоит из Б-рибозы. К рибонуклеотидам относятся, например, нуклеотиды, содержащие в качестве оснований аденин, цитозин, гуанин или урацил. К рибонуклеотидам также относятся модифицированные рибонуклеотиды, такие как модифицированный рибонуклеотид, в котором атом кислорода фосфатной группы в α-положении заменен атомом серы (также называемый (α-8)рибонуклеотидом или (α-δ)-Ν), или другие производные.

Химерные олигонуклеотидные праймеры, используемые в настоящем изобретении, включают любой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, располагающийся на 3'-конце или на З'-концевой стороне праймера, который можно использовать для достраивания цепи нуклеиновой кислоты в способе настоящего изобретения, можно расщепить эндонуклеазой и можно использовать для осуществления реакции вытеснения цепи.

В данном случае З'-концевая сторона означает часть от центра к З'-концу нуклеиновой кислоты, такой как праймер. Подобным образом, 5'-концевая сторона означает часть от центра к 5'-концу нуклеиновой кислоты.

В данном изобретении верхняя (ирЦгсаш) часть представляет произвольную часть, которая находится в 5'-положении к 5'-концу химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе настоящего изобретения. Иными словами, она представляет собой произвольную часть, которая находится в З'-направлении по отношению к праймеру в цепи нуклеиновой кислоты как матрицы, к которой отжигается химерный олигонуклеотидный праймер.

В контексте данного изобретения эндонуклеаза может представлять собой любую эндонуклеазу, которая действует на двухцепочечную ДНК, полученную достраиванием ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, который отжигается к нуклеиновой кислоте как матрице, и специфически расщепляет ее в части праймера, содержащего рибонуклеотид.

Как используется в данном контексте, ДНК-полимераза относится к ферменту, синтезирующему цепь ДНК бе ηονο с использованием цепи ДНК как матрицы. К ДНК-полимеразам относятся ДНКполимеразы, встречающиеся в природе, и другие ферменты с вышеуказанной активностью. Например, к таким ферментам относится ДНК-полимераза с активностью вытеснения цепи, ДНК-полимераза, утратившая 5'^3'-экзонуклеазную активность, и ДНК-полимераза с обратнотранскриптазной активностью или эндонуклеазной активностью.

Используемый в данном описании термин активность вытеснения цепи относится к активности, которая может осуществлять вытеснение цепи, т. е. которая может производить дупликацию ДНК на основании последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы, в то же время вытесняя цепь ДНК, с высвобождением комплементарной цепи, отожженной к матричной цепи. Кроме того, цепь ДНК, высвобожденная из нуклеиновой кислоты как матрицы в результате вытеснения цепи, в данном описании упоминается как «вытесненная цепь».

Далее настоящее изобретение будет описываться подробно.

(1) Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении.

Праймер, используемый в способе настоящего изобретения, представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога. К таким праймерам также относится олигорибонуклеотидный праймер, содержащий немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, по существу, комплементарную части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы. Он может вносить вклад в достраивание цепи ДНК в используемых условиях. Кроме того, рибонуклеотид располагается на З'-конце или З'-концевой стороне химерного олигонуклеотидного праймера. Как правило, праймер конструируют таким образом, что он комплементарен верхней (ирзйеат) части амплифицируемого участка, т.е. находящейся в З'-направлении к нуклеотидной последовательности, соответствующей амплифицируемому участку в нуклеиновой кислоте как матрице. Используемый в данном описании термин по существу, комплементарная нуклеотидная последовательность означает нуклеотидную последовательность, которая может отжигаться к ДНК как матрице в используемых условиях реакции.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать один или несколько модифицированных рибонуклеотидов. В контексте данного изобретения рибонуклеотид может представлять собой немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, который может располагаться на З'-конце или З'-концевой стороне химерного олигонуклеотидного праймера и который узнается или расщепляется эндонуклеазой. Рибонуклеотиды включают как немодифицированные рибонуклеотиды, так и модифицированные рибонуклеотиды, как описано выше. Немодифицированный рибонуклеотид, модифицированный рибонуклеотид или их сочетание можно использовать для химерного олигонуклеотидного праймера настоящего изобретения до тех пор, пока они не уничтожат функцию праймера. Примерами модифицированных рибонуклеотидов являются (а-8)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с фосфатной группой, заменен на атом серы, и рибонуклеотид, в котором гидроксигруппа в положении 2 рибозы заменена на метоксигруппу, и другие рибонуклеотиды. Такой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий модифицированный рибонуклеотид, может быть получен путем использования, например, (а-8)-рибонуклеозидтрифосфата, который получают способом с использованием реагента для реакции сульфурации (О1еп Везеагсй), как описано в патенте США 500З097, или 2-ОМе-КЫА-СЕ фосфоамидитного реагента (О1еп ВезеагсН).

Химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать в способе амплификации настоящего изобретения, можно сконструировать как содержащий модифицированный рибонуклеотид, придающий устойчивость к расщеплению эндонуклеазой. Такой праймер применяют с тем, чтобы можно было контролировать сайт расщепления с помощью эндонуклеазы на стадиях реакции амплификации.

В способе настоящего изобретения можно использовать один или два химерных олигонуклеотидных праймера, в зависимости от нужной формы фрагмента ДНК после амплификации (одноцепочечной или двухцепочечной). Конкретно, один химерный олигонуклеотидный праймер используют, когда нужна одноцепочечная ДНК, в то время как в случае, когда нужна двухцепочечная ДНК, используют два праймера.

Не существует определенного ограничения в отношении длины химерного олигонуклеотидного праймера, используемого согласно настоящему изобретению, до тех пор, пока он содержит рибонуклеотид на З'-конце или З'-концевой стороне, и его можно использовать для способа 1САЫ.

Длина химерного олигонуклеотидного праймера, который можно использовать, составляет, например, от примерно 6 до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 10 до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительнее от примерно 12 до примерно 40 нуклеотидов. Предпочтительно, когда нуклеотидная последовательность химерного олигонуклеотида, по существу, комплементарна нуклеиновой кислоте как матрице, так что она отжигается к нуклеиновой кислоте как матрице в используемых условиях реакции. Праймер содержит на З'-конце или З'-концевой стороне последовательность, узнаваемую эндонуклеазой, которая используется на стадии, описываемой ниже.

Например, в способе синтеза ДНК настоящего изобретения в качестве праймера можно использовать олигонуклеотид структуры, представленной приведенной далее общей формулой, хотя он не предназначен для ограничения настоящего изобретения.

Общая формула: 5'-бЫа-НЬ-бМс-З' (6Ν - дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; N - немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, где некоторые из 6Ν в 6Ν;·ι могут быть заменены на Ν, и нуклеотид на З'-конце может быть модифицирован так, что достраивание с З'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит).

В приведенной выше общей формуле а равно целому числу, например 5 или большему целому числу, предпочтительно 6 или большему числу, предпочтительнее 8 или большему числу; Ь равно 1 или большему целому числу, например 1-15, предпочтительно 1-10, предпочтительнее 1-7, наиболее предпочтительно 1-5; и с может быть равно 0 или целому числу - 1 или большему целому числу, предпочтительно 0-5, предпочтительнее 0-З, хотя указанные интервалы не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

- 4 006066

Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, примерами химерных олигонуклеотидных праймеров, используемых согласно настоящему изобретению, являются праймеры, в которых а=8; и Ь=1 и с=0, Ь=2 и с=0, Ь=3-5 и с=0, или Ь=2-3 и с=0-3. Числа для а, Ь и с можно подобрать таким образом, что химерный олигонуклеотидный праймер можно использовать в способе настоящего изобретения.

Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый согласно настоящему изобретению, имеет структуру, в которой эндонуклеаза узнает или расщепляет цепь ДНК, достроенную с праймера под действием ДНК-полимеразы (достроенная с праймера цепь), в сайте, содержащем рибонуклеотид, располагающийся на З'-конце или З'-концевой стороне химерного олигонуклеотидного праймера. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, когда РНКаза Н действует на двухцепочечную ДНК, образовавшуюся путем достраивания ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, представленного приведенной выше общей формулой, отжигаемого к нуклеиновой кислоте как матрице, химерный олигонуклеотидный праймер расщепляется в рибонуклеотидной части. Затем образуется двухцепочечная ДНК, в которой введен ник между олигонуклеотидным праймером и цепью ДНК, синтезированной путем достраивания. Затем из ник-сайта с помощью ДНК-полимеразы происходит реакция вытеснения цепи. Таким образом, в способе настоящего изобретения можно использовать любой химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать для достраивания цепи нуклеиновой кислоты с 3'-конца праймера, который можно расщепить эндонуклеазой и с которым ДНК-полимераза может осуществлять реакцию вытеснения цепи. Кроме того, к химерным олигонуклеотидным праймерам настоящего изобретения относятся праймеры, чьи 3'-концы модифицированы, так что не может происходить достраивания под действием ДНК-полимеразы и достраивание ДНК происходит с 3'-конца, образовавшегося после расщепления эндонуклеазой.

Кроме того, на 5'-концевой стороне химерного олигонуклеотидного праймера может быть включена промоторная последовательность для РНК-полимеразы. Примерами таких РНК-полимераз являются РНК-полимераза Т7 и РНК-полимераза 8Р6.

Кроме того, химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать нуклеотидный аналог или другие вещества. Иными словами, в химерном олигонуклеотидном праймере настоящего изобретения могут содержаться один или несколько нуклеотидных аналогов до тех пор, пока не уничтожается функция праймера по осуществлению реакции достраивания с 3'-конца под действием ДНК-полимеразы. Многие типы нуклеотидных аналогов можно использовать в сочетании. Примерами нуклеотидных аналогов являются, но не ограничиваясь ими, дезоксиинозиннуклеотид, дезоксиурацилнуклеотид, нуклеотидный аналог с модифицированным основанием, таким как 7деазагуанин, нуклеотидный аналог с производным рибозы и т. п. Кроме того, химерные олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут содержать дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или нуклеотидные аналоги с различными модификациями, такими как присоединение меченых соединений, до тех пор, пока они сохраняют функцию, описанную выше.

Введение нуклеотидного аналога в праймер эффективно для подавления образования структуры высшего порядка самим праймером и стабилизации отжига к матрице. В праймер можно ввести рибонуклеотид для такой же цели. Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, предпочтительно можно использовать модифицированный рибонуклеотид, такой как (а-8)-рибонуклеотид, для того, чтобы предотвратить расщепление праймера неспецифической эндонуклеазой (РНКазой).

Химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий нужную нуклеотидную последовательность, можно синтезировать с использованием, например, синтезатора ДНК типа 394 от АррБеб ВюууЧспъ 1пс. (АВ1) согласно фосфоамидитному методу. С другой стороны, для синтеза химерного олигонуклеотидного праймера можно использовать любые способы, включая фосфотриэфирный способ, Н-фосфонатный способ и тиофосфонатный способ.

(2) Верхний (ирйтеат) блокирующий олигонуклеотид, используемый согласно настоящему изобретению.

По меньшей мере один элемент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, можно предпочтительно использовать в качестве верхнего блокирующего олигонуклеотида, используемого в способе настоящего изобретения.

В способе настоящего изобретения можно использовать, предпочтительно, верхний блокирующий олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, по существу, комплементарную части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы, и способный отжигаться к участку 3'-части в нуклеиновой кислоте как матрице, к которой отжигается химерный олигонуклеотидный праймер, описанный выше в (1). Как правило, олигонуклеотид конструируют таким образом, что он комплементарен части, расположенной против хода транскрипции (ирйтеат) амплифицируемого участка, т.е. части, расположенной в 3'-направлении к нуклеотидной последовательности, соответствующей амплифицируемому участку нуклеиновой кислоты как матрицы. Используемый в данном описании термин по существу, комплементарная нуклеотидная последовательность означает нуклеотидную последовательность, которая может отжигаться к ДНК как матрице в используемых условиях реакции.

Как описано выше, верхний блокирующий олигонуклеотид по настоящему изобретению модифицируют по 3'-концу таким образом, что его нельзя использовать для реакции достраивания ДНК под дей- 5 006066 ствием ДНК-полимеразы. Не существует конкретного ограничения в отношении способа модификации до тех пор, пока можно достичь вышеуказанных целей. Примерами модификации являются присоединение на З'-конце дидезоксинуклеотида, нуклеотида, модифицированного по гидроксильной группе в положении 3 рибозы, или нуклеотида с модификацией, препятствующей достраиванию с помощью ДНКполимеразы из-за пространственного затруднения. Для модификации гидроксильной группы в положении 3 рибозы верхнего блокирующего олигонуклеотида можно использовать алкилирование или другие известные способы модификации. Например, реакцию достраивания ДНК можно предотвратить путем аминоалкилирования.

В способе настоящего изобретения можно использовать один или два верхних блокирующих олигонуклеотида, в зависимости от нужной формы фрагмента ДНК после амплификации (одноцепочечной или двухцепочечной). Конкретно, один химерный олигонуклеотидный праймер и один верхний блокирующий олигонуклеотид используют, когда нужна одноцепочечная ДНК, в то время как в случае, когда нужна двухцепочечная ДНК, используют два праймера и два верхних блокирующих олигонуклеотида.

Не существует конкретного ограничения в отношении участка в нуклеиновой кислоте как матрице, к которому отжигается верхний блокирующий олигонуклеотид, используемый в способе настоящего изобретения, до тех пор, пока выбор такого участка приводит к максимальной эффективности амплификации, которая может изменяться в зависимости от нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, длины амплифицируемого участка и участка в нуклеиновой кислоте-мишени, к которому отжигается используемый в сочетании химерный олигонуклеотидный праймер. Например, указанный участок выбирают таким образом, что З'-конец располагается на расстоянии одного или нескольких олигонуклеотидов от 5'-конца химерного олигонуклеотидного праймера.

Предпочтительная длина цепи верхнего блокирующего олигонуклеотида, используемого в способе настоящего изобретения, может быть любой до тех пор, пока достигается эффект повышения чувствительности детекции амплифицированного фрагмента, представляющего интерес или подобного.

Хотя и без намерения ограничивать настоящее изобретение, длина верхнего блокирующего олигонуклеотида составляет, например, от примерно 6 до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 10 до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительнее от примерно 12 до примерно 40 нуклеотидов. Предпочтительно, когда нуклеотидная последовательность верхнего блокирующего олигонуклеотида, по существу, комплементарна нуклеиновой кислоте как матрице, так что она отжигается к нуклеиновой кислоте как матрице в используемых условиях реакции.

Верхний блокирующий олигонуклеотид, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать нуклеотидный аналог или другие вещества. Верхний блокирующий олигонуклеотид согласно настоящему изобретению может содержать один или более нуклеотидных аналогов. Многие типы нуклеотидных аналогов можно использовать в сочетании. Хотя и без намерения ограничивать настощее изобретение, примерами нуклеотидного аналога, который можно использовать согласно настоящему изобретению, являются дезоксиинозиннуклеотид, дезоксиурацилнуклеотид или нуклеотидный аналог с модифицированным основанием, таким как 7-деазагуанин, или нуклеотидный аналог с производным рибозы. Верхний блокирующий олигонуклеотид, используемый в настоящем изобретении, может содержать дезоксинуклеотид, рибонуклеотид или нуклеотидный аналог с различными модификациями (например, с присоединением меченого соединения).

Введение нуклеотидного аналога в блокирующий олигонуклеотид эффективно для подавления образования структуры высшего порядка самим олигонуклеотидом и стабилизации отжига к матрице.

Верхний блокирующий олигонуклеотид можно синтезировать так, чтобы он имел желаемую нуклеотидную последовательность, с использованием, например, синтезатора ДНК типа 394 от Лррйеб Вюкуйетз 1пс. (ΑΒΙ), согласно фосфоамидитному методу. С другой стороны, для синтеза верхнего блокирующего олигонуклеотида можно использовать любые способы, включая фосфотриэфирный способ, Н-фосфонатный способ и тиофосфонатный способ.

(3) Эндонуклеаза, используемая в настоящем изобретении.

В настоящем изобретении можно использовать любую эндонуклеазу, которая может действовать на двухцепочечную ДНК, полученную достраиванием ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, описанного выше в (1), который отжигается к нуклеиновой кислоте как матрице, и расщепляет достроенную цепь для осуществления реакции вытеснения цепи. Иными словами, эндонуклеаза представляет собой фермент, который может образовывать ник в химерной олигонуклеотидной праймерной части двухцепочечной ДНК. Примерами эндонуклеаз, которые можно использовать в настоящем изобретении, но не ограничиваясь ими, являются рибонуклеазы. Из них можно использовать, предпочтительно, эндорибонуклеазу Н (РНКазу Н), которая действует на РНК-часть двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из ДНК и РНК. Любую рибонуклеазу, обладающую вышеуказанными активностями, можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении, включая мезофильные и теплоустойчивые рибонуклеазы. Например, РНКазу Н из Е. сой можно использовать в способе настоящего изобретения для реакции при примерно 50-70°С. В способе настоящего изобретения можно использовать, предпочтительно, теплоустойчивую рибонуклеазу. Примерами теплоустойчивых рибонуклеаз, которые можно предпочтительно использовать, но не ограничиваясь ими, являются коммерчески доступная рибонуклеаза - 6 006066 термостабильная РНКаза Н НуЬйбаке™ (ЕркеЫет Тесйпо1одкк), а также РНКаза Н из термофильной бактерии рода ВасШик, бактерии рода Тйегтик, бактерии рода Ругососсик, бактерии рода ТйегтоЮда. бактерии рода Лгсйаеод1оЬик или подобной бактерии. Кроме того, можно предпочтительно использовать как рибонуклеазы, встречающиеся в природе, так и варианты. Указанная в данном описании ферментативная единица РНКазы Н представляет собой величину, выраженную согласно способу измерения ферментативной единицы, описанному в ссылочных примерах.

Конкретных ограничений для РНКазы Н не существует до тех пор, пока ее можно использовать в способе настоящего изобретения. Например, РНКаза Н может происходить из разных вирусов, фагов, прокариот или эукариот. Она может представлять собой или клеточную РНКазу Н, или вирусную РНКазу Н. Примером клеточной РНКазы Н является РНКаза Н1 из ЕксйепсЫа сой, и примером вирусной РНКазы Н является РНКаза Н ВИЧ-1. В способе настоящего изобретения можно использовать РНКазу Н типа I, типа II или типа III. Например, предпочтительной, без ограничений, является РНКаза Н1 из ЕксйепсЫа сой или РНКаза НИ из бактерии рода Ругососсик или бактерии рода Лгсйаеод1оЬик.

Эффективность реакции расщепления эндонуклеазой, такой как РНКаза Н, используемой в способе настоящего изобретения, может изменяться в зависимости от нуклеотидной последовательности вблизи З'-конца праймера и влиять на эффективность амплификации нужной ДНК. Поэтому обычно конструируют праймер, оптимальный для используемой РНКазы Н.

Используемый в данном описании термин введение ника или никирование означает внутреннее расщепление одной из двух цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, РНКаза Н действует на гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из ДНК и рибонуклеотидсодержащей ДНК, селективно расщепляя из двух цепей рибонуклеотидсодержащую цепь по рибонуклеотидной части, посредством чего в гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту вводится ник.

(4) ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении.

В настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразу с активностью вытеснения цепи. В частности, можно предпочтительно использовать ДНК-полимеразу, по существу, лишенную 5'^3'-экзонуклеазной активности.

В настоящем изобретении можно использовать любую ДНК-полимеразу, обладающую активностью вытеснения цепи. Ее примерами являются варианты ДНК-полимераз, лишенные своих 5'^3'-экзонуклеазных активностей, полученные из термофильных бактерий рода ВасШик, таких как ВасШик са1бокпах (далее обозначаемая как В. са), и ВасШик ккатоШегторййик (далее обозначаемая как В. к1), а также большой фрагмент (фрагмент Кленова) ДНК-полимеразы I из ЕксйепсЫа сой (Е. сой). Как мезофильные, так и теплоустойчивые ДНК-полимеразы можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении.

В. са представляет собой термофильную бактерию с оптимальной температурой роста около 70°С. Известно, что ДНК-полимераза Вса из такой бактерии обладает ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью (обратнотранскриптазной активностью), 5'^3'-экзонуклеазной активностью и 3'^5'-экзонуклеазной активностью. Фермент может представлять собой или фермент, выделенный в чистом виде из источника своего происхождения, или рекомбинантный белок, полученный с использованием методов генетической инженерии. Фермент можно подвергнуть модификации, такой как замещение, делеция, присоединение или вставка, используя методы генетической инженерии или другие способы. Примером таких ферментов является ДНК-полимераза ВсаВЕ8Т (Такага Шш/о), представляющая собой ДНК-полимеразу Вса, лишенную ее 5'^3'-экзонуклеазной активности.

Известно, что некоторые ДНК-полимеразы в определенных условиях обладают эндонуклеазной активностью, такой как активность РНКазы Н. Такую ДНК-полимеразу можно использовать в способе настоящего изобретения. В одном аспекте ДНК-полимеразу можно использовать в условиях, допускающих проявление активности РНКазы Н, например в присутствии Мп²⁺. В таком случае способ настоящего изобретения можно осуществлять без добавления РНКазы Н. Так, ДНК-полимераза Вса может обнаруживать РНКазную активность в буфере, содержащем Мп²⁺. Вышеуказанный аспект не ограничивается применением ДНК-полимеразы Вса. В настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразу, о которой известно, что она обладает активностью РНКазы Н , такую как ДНК-полимераза ТШ из Тйегтик ШегторЫЫк.

(5) Способ амплификации нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения.

Способ настоящего изобретения можно осуществлять, используя в сочетании по меньшей мере один химерный олигонуклеотидный праймер, описанный выше в (1), по меньшей мере один верхний блокирующий олигонуклеотид, описанный выше в (2), эндонуклеазу, описанную выше в (3), и ДНКполимеразу, описанную выше в (4). С другой стороны, можно использовать ДНК-полимеразу с активностью РНКазы Н в условиях, допускающих проявление активности РНКазы Н, как описано выше.

В качестве нуклеозидтрифосфатов, служащих в способе в качестве субстратов при реакции достраивания, можно предпочтительно использовать άΝΊΡ, используемые для ПЦР (смесь 6ЛТР, 6СТР, 6ОТР и

6ТТР), или им подобные. Кроме того, в качестве субстрата можно использовать 6ИТР. άΝΊΓ могут содержать аналог άΝΊΤ (дезоксирибонуклеозидтрифосфата), такой как 7-деаза-бОТР, трифосфат ШТР или подобное вещество, до тех пор, пока оно служит в качестве субстрата для используемой ДНК-полимеразы. Можно использовать производное άΝΊΓ или аналог 6№ТР. Может содержаться производное с функ- 7 006066 циональной группой, такое как бИТР, содержащий аминогруппу. В способе используют химерный олигонуклеотидный праймер. Праймер можно получить, например, с использованием синтезатора ДНК согласно обычному способу синтеза.

Количества химерного олигонуклеотидного праймера и верхнего блокирующего олигонуклеотида, используемых в способе настоящего изобретения, можно подбирать в зависимости от нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, длины амплифицируемого фрагмента и состава используемой реакционной системы. Например, количества можно подбирать с использованием в качестве индекса количество продукта амплификации. Иными словами, конкретного ограничения в отношении количеств химерного олигонуклеотидного праймера и блокирующего олигонуклеотида, используемых в способе настоящего изобретения, не существует до тех пор, пока образуется продукт амплификации, представляющий интерес.

Согласно настоящему изобретению не существует конкретного ограничения в отношении молярного отношения используемых химерного олигонуклеотидного праймера к верхнему блокирующему олигонуклеотиду до тех пор, пока образуется продукт амплификации, представляющий интерес.

В одном из воплощений способа настоящего изобретения молярное отношение химерного олигонуклеотидного праймера к верхнему блокирующему олигонуклеотиду составляет, например, от 1:0,1 до 1:10, предпочтительно от 1:0,2 до 1:5, предпочтительнее от 1:0,25 до 1:4.

Если активность используемого фермента может снижаться в ходе реакции, в способе настоящего изобретения фермент можно дополнительно добавлять в ходе реакции. Добавляемый фермент может быть таким же, какой содержится в реакционной смеси в начале реакции, или он может представлять собой другой фермент, проявляющий такую же активность. Таким образом, тип или свойство добавляемого фермента не ограничивается одним конкретным ферментом до тех пор, пока добавление во время реакции обеспечивает действие, такое как повышение чувствительности детекции или увеличение количества продукта амплификации.

Нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), используемую в качестве матрицы в способе настоящего изобретения, можно получить или выделить из любого образца, который может содержать нуклеиновую кислоту. С другой стороны, согласно настоящему изобретению при реакции амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать непосредственно образец. Примерами образцов, которые могут содержать нуклеиновую кислоту, являются, но не ограничиваясь перечисленными, образцы, полученные из организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитная пленка, моча, фекалии, спинно-мозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или ткань лимфоузлов) и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, содержащие нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, гриб, дрожжи, растение или животное, образцы, предпочтительно загрязненные или инфицированные микроорганизмом, таким как вирус или бактерия (например, пища или биологическая композиция), и образцы, которые могут содержать организмы, такие как почва и сточные воды. Образец может представлять собой препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, полученный обработкой вышеуказанных образцов согласно известным способам. Примерами препаратов, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются продукт разрушения клеток или образец, полученный путем фракционирования такого продукта, нуклеиновая кислота в образце или образец, который обогащен определенными молекулами нуклеиновой кислоты, такими как мРНК. Кроме того, можно предпочтительно использовать нуклеиновую кислоту, такую как ДНК или РНК, полученную амплификацией нуклеиновой кислоты, содержащейся в образце.

Препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, можно получить из вышеуказанных материалов, используя, например, лизис при помощи детергента, ультразвуковую обработку, встряхивание/перемешивание с использованием стеклянных шариков или пресса Френча, но не ограничиваясь этими способами. В некоторых случаях выгодно дополнительно обработать препарат для очистки нуклеиновой кислоты (например, в случае, когда присутствует эндогенная нуклеаза). В таких случаях нуклеиновую кислоту очищают известным способом, таким как экстракция фенолом, хроматография, ионный обмен, гель-электрофорез или центрифугирование в градиенте плотности.

Когда нужно амплифицировать нуклеиновую кислоту с последовательностью, происходящей от РНК, способ настоящего изобретения можно осуществлять с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной с использованием обратнотранскриптазной реакции, в которой в качестве матрицы используют РНК. В способе настоящего изобретения можно использовать любую РНК, для которой можно создать праймер, используемый в обратнотранскриптазной реакции, включая тотальную РНК в образце, молекулы РНК, такие как мРНК, тРНК и рРНК, а также определенные типы молекул РНК.

Любой праймер, который в используемых условиях реакции отжигается к РНК как матрице, можно использовать в обратнотраскриптазной реакции. Праймер может представлять собой праймер с олигонуклеотидной последовательностью, комплементарной специфической РНК как матрице (специфический праймер), олиго-бТ (дезокситиминовый) праймер и праймер со случайной последовательностью (случайный праймер). С точки зрения специфического отжига длина праймера для обратной транскрипции составляет предпочтительно 6 нуклеотидов или более, предпочтительнее 9 нуклеотидов или более. С точки зрения синтеза олигонуклеотида длина составляет предпочтительно 100 нуклеотидов или менее,

- 8 006066 предпочтительнее 30 нуклеотидов или менее. В качестве праймера для обратной транскрипции можно использовать химерный олигонуклеотидный праймер. Химерный олигонуклеотидный праймер также можно предпочтительно использовать в качестве праймера для реакции вытеснения цепи в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной после обратной транскрипции. Такой праймер может представлять собой любой праймер, который имеет свойства, описанные выше в (1), и который можно использовать при обратнотранскриптазной реакции с РНК.

В обратнотранскриптазной реакции с использованием РНК в качестве матрицы можно использовать любой фермент, обладающий активностью синтеза кДНК. Его примерами являются обратные транскриптазы, происходящие из различных источников, такие как обратная транскриптаза, происходящая из вируса миелоидного лейкоза птиц (АМУ ЯТаке), обратная транскриптаза, происходящая из вируса мышиного лейкоза Молони (ММЬУ ЯТаке), и обратная транскриптаза вируса 2, ассоциированного с саркомой Рауса (ЯАУ-2 ЯТаке). Кроме того, можно использовать ДНК-полимеразу, которая также обладает обратнотранскриптазной активностью. Для настоящего изобретения предпочтителен фермент, обладающий обратнотранскриптазной активностью при высокой температуре, такой как ДНК-полимераза из бактерии рода Ткетшик (например, ДНК-полимераза Т111) и ДНК-полимераза из термофильной бактерии рода ВасШик. Например, предпочтительны ДНК-полимеразы из термофильных бактерий рода ВасШик, такие как ДНК-полимераза из В. к! (ДНК-полимераза Вк1) и ДНК-полимераза Вса, хотя они и не предназначены для ограничения настоящего изобретения. Например, ДНК-полимераза Вса не требует иона марганца для обратнотранскриптазной реакции. Кроме того, она может синтезировать кДНК, подавляя в то же время образование вторичной структуры РНК как матрицы в условиях высокой температуры. Как встречающиеся в природе ферменты, так и варианты ферментов с обратнотранскриптазной активностью можно использовать до тех пор, пока они обладают такой активностью.

В другом аспекте в способе настоящего изобретения в качестве нуклеиновой кислоты как матрицы можно использовать продукт дупликации после предварительной дупликации ДНК или РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, подлежащую амплификации. Примером, но не ограничением, способов дупликации является способ, при котором соответствующего хозяина трансформируют вектором, в который встроен фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий подлежащую амплификации нуклеотидную последовательность, полученный трансформант культивируют, вектор, в который встроен фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, подлежащую амплификации, экстрагируют и используют. Можно использовать любые векторы до тех пор, пока они стабильно реплицируются в хозяине. Например, предпочтительно использовать векторы серии рИС, серии рВ1иекспр1. серии рСЕМ, векторы космидного типа и векторы фагового типа. Можно использовать любых хозяев до тех пор, пока они могут поддерживать используемые векторы. Например, примером такого хозяина является ЕксйейсЫа сой, которая легко культивируется.

В другом аспекте способа дупликации после транскрипции РНК с подлежащей амплификации нуклеотидной последовательностью с использованием РНК-полимеразы и фрагмента нуклеиновой кислоты, содержащего такую нуклеотидную последовательность, в качестве матрицы в способе настоящего изобретения в качестве матрицы можно использовать РНК непосредственно или после превращения ее в кДНК путем обратнотранскриптазной реакции. Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий подлежащую амплификации нуклеотидную последовательность, специально не ограничивается до тех пор, пока он содержит промоторную последовательность для РНК-полимеразы. Его можно встроить в вектор, содержащий промоторную последовательность для РНК-полимеразы, лигировать с адаптером или кассетой, содержащими промоторную последовательность для РНК-полимеразы на своих концах, или синтезировать ферментативно с использованием праймера, содержащего промоторную последовательность для РНК-полимеразы, и соответствующей матрицы. Таким образом, фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий подлежащую амплификации нуклеотидную последовательность, можно дуплицировать или амплифицировать в форме РНК с использованием промоторной последовательности для РНК-полимеразы, располагающейся так, как описано выше. Любые векторы можно использовать до тех пор, пока они содержат промоторные последовательности для РНК-полимераз. Например, предпочтительно использовать векторы серии рИС, серии рВ1иекспр! серии рСЕМ, векторы космидного типа и векторы фагового типа. Вектор можно предпочтительно использовать в его кольцевой форме или после преобразования в линейную форму. Для способа дупликации или амплификации можно использовать любые РНК-полимеразы. Например, можно предпочтительно использовать РНК-полимеразу 8Р6, РНК-полимеразу Т7, РНКполимеразу Т3 или подобную РНК-полимеразу.

В настоящем изобретении в качестве матрицы можно предпочтительно использовать как двухцепочечную ДНК, такую как геномная ДНК, выделенная так, как описано выше, или ПЦР-фрагмент и одноцепочечную ДНК, такую как кДНК, полученная обратнотранскриптазной реакцией из тотальной РНК или мРНК. Двухцепочечную ДНК используют, предпочтительно, после ее денатурации в одноцепочечные ДНК или без такой денатурации.

Иными словами, способ настоящего изобретения может включать, а может и не включать стадию денатурации.

- 9 006066

В одном из воплощений настоящего изобретения, если необходимо амплифицировать нуклеиновую кислоту с последовательностью из РНК, реакцию амплификации можно инициировать путем добавления двухцепочечной нуклеиновой кислоты РНК-кДНК, полученной обратнотранскриптазной реакцией с использованием РНК в качестве матрицы, в реакционную смесь для амплификации по настоящему изобретению, содержащую РНКазу Н для расщепления цепи РНК и превращения нуклеиновой кислоты в одноцепочечную кДНК. Кроме того, в способе синтеза ДНК по настоящему изобретению обратнотранскриптазную реакцию с использованием РНК в качестве матрицы и реакцию амплификации ДНК с использованием в качестве матрицы полученной с помощью обратнотранскриптазной реакции кДНК можно проводить с одной ДНК-полимеразой. Такая ДНК-полимераза обладает обратнотранскриптазной активностью и активностью вытеснения цепи.

Нуклеиновую кислоту последовательно амплифицируют в изотермических условиях после денатурации двухцепочечной ДНК до одноцепочечных ДНК или, если в качестве матрицы используют РНК, после получения кДНК (одноцепочечной ДНК) обратнотранскриптазной реакцией.

Последовательно означает, что реакция протекает без изменения температуры реакции или состава реакционной смеси. Используемый в данном описании термин изотермические относится к условиям с, по существу, постоянной температурой, при которых фермент и цепь нуклеиновой кислоты функционируют на каждой стадии.

Реакцию амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно проводить при обычной температуре (например, 37°С) с использованием мезофильной ДНК-полимеразы, такой как фрагмент Кленова. Ее также можно проводить при высокой температуре (например, при 50°С или выше) с использованием теплостойких ферментов (эндонуклеазы и ДНК-полимеразы). В таком случае подавляется неспецифический отжиг праймера, что приводит к повышению специфичности амплификации ДНК. Кроме того, решается проблема образования вторичной структуры ДНК как матрицы, что приводит к повышению способности ДНК-полимеразы к достраиванию. В данном способе можно последовательно провести обратнотранскриптазную реакцию и амплификацию нуклеиновой кислоты. В таком случае ДНК с последовательностью, происходящую из РНК, можно амплифицировать, комбинируя использование обратной транскриптазы с вышеуказанной реакцией или используя ДНК-полимеразу с обратнотранскриптазной активностью.

В каждом аспекте настоящего изобретения, предпочтительно, химерный олигонуклеотидный праймер и верхний блокирующий олигонуклеотид, комплементарные ДНК как матрице, отжигают к ДНК, хотя этим не предполагается ограничить настоящее изобретение. ДНК, комплементарную ДНК как матрице (цепь, достроенная с праймера), затем достраивают вдоль оставшейся последовательности ДНК как матрицы с З'-конца химерного олигонуклеотидного праймера под воздействием ДНК-полимеразы, обладающей активностью вытеснения цепи. Затем цепь, достроенную с химерного олигонуклеотидного праймера, блокируют отжигом к нуклеиновой кислоте как матрице верхнего блокирующего олигонуклеотида, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности, расположенной в 3'направлении к участку в нуклеиновой кислоте как матрице, по существу, комплементарному химерному олигонуклеотидному праймеру. В результате, в способе настоящего изобретения на ранней стадии реакции амплифицируют матрицу для нелинейной амплификации, к которой отжигается химерный олигонуклеотидный праймер. Реакция ранней амплификации устойчиво повышает эффективность амплификации способа по настоящему изобретению. Следовательно, повышается чувствительность детекции нуклеиновой кислоты-мишени.

В одном аспекте настоящего изобретения эндонуклеаза действует как ник-фермент, вводящий ник в двухцепочечную ДНК, или она изменяет структуру двухцепочечной ДНК, состоящей из химерного олигонуклеотидного праймера и ДНК как матрицы, хотя настоящее изобретение не ограничивается какойлибо теорией. ДНК-полимераза с активностью замещения цепи снова достраивает цепь ДНК с З'-конца ника, введенного в двухцепочечную ДНК, с образованием новой достроенной с праймера цепи, причем в то же время высвобождается ДНК, находящаяся ниже (бо\\'П51гсат) З'-конца ника. Таким образом, новая достроенная с праймера цепь заменяет синтезированную ранее достроенную с праймера цепь.

Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно осуществлять с использованием пары праймеров и пары блокирующих олигонуклеотидов, т.е. химерного олигонуклеотидного праймера и верхнего блокирующего олигонуклеотида, комплементарных нуклеиновой кислоте как матрице, и другого химерного олигонуклеотидного праймера и другого верхнего блокирующего олигонуклеотида, комплементарных вытесненной цепи. В таком случае считается, что химерные олигонуклеотидные праймеры связываются с двухцепочечной ДНК для синтеза соответствующих комплементарных цепей, а верхние блокирующие олигонуклеотиды отжигаются к соответствующим комплементарным цепям, посредством этого блокируя отжиг соответствующих комплементарных цепей одна с другой на участках, к которым отжигаются верхние блокирующие олигонуклеотиды. Кроме того, считается, что параллельно реакции достраивания также протекает реакция переключения матрицы. Ясно, что продукт реакции с одним праймером может функционировать как матрица для другого праймера, если используется такой аспект. Таким образом, количество продукта амплификации нелинейно возрастает с возрастанием количества матрицы.

- 10 006066

Когда способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения осуществляют с использованием в качестве матрицы двухцепочечной ДНК, обе цепи могут служить матрицами в реакции амплификации путем использования химерных олигонуклеотидных праймеров и верхних блокирующих олигонуклеотидов, которые отжигаются к соответствующим двум цепям. Если реакцию инициируют с использованием в качестве матрицы двухцепочечной ДНК, к реакционной смеси добавляют химерный олигонуклеотидный праймер, верхний блокирующий олигонуклеотид, четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (6ΝΤΡ), ДНК-полимеразу и эндонуклеазу. Если для денатурации двухцепочечной ДНК используют тепловую обработку и не используют теплостойкий фермент, предпочтительно добавлять фермент после денатурации.

В аспекте способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, когда в качестве матрицы используют двухцепочечную ДНК и используют два химерных олигонуклеотидных праймера и два верхних блокирующих олигонуклеотида, может происходить переключение матриц между промежуточными достроенными с матрицы цепями во время реакции достраивания с праймеров с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжигающихся одна с другой, хотя это зависит от условий реакции и т. п. Двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит химерные олигонуклеотидные праймеры по обоим концам. Затем по обоим концам можно снова инициировать реакцию достраивания комплементарных цепей, включая вытеснение цепи. В результате реакции образуется продукт амплификации, содержащий на одном конце праймерную последовательность. Кроме того, если во время реакции происходит переключение матриц, снова образуется двухцепочечная нуклеиновая кислота, подобная той, что описана выше.

Настоящее изобретение обеспечивает способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий использование ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи для осуществления реакции переключения матрицы. При реакции переключения матрицы в присутствии двухцепочечной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, двух химерных олигонуклеотидных праймеров и двух верхних блокирующих олигонуклеотидов, по существу, комплементарных нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, а также ДНК-полимеразы, обладающей активностью вытеснения цепи, синтезируют две достроенные с праймеров цепи, комплементарные матрице. Переключение матрицы для каждой из достроенных с праймера цепей с матрицы на другую достроенную с праймера цепь происходит во время синтеза достроенных с праймеров цепей.

Используемый в данном описании термин реакция переключения матрицы относится к реакции, при которой, когда комплементарные цепи синтезируют путем реакции вытеснения цепи с обеих сторон двухцепочечной нуклеиновой кислоты, ДНК-полимераза переключает матрицу и затем синтезирует комплементарную цепь с использованием в качестве матрицы другой комплементарной цепи, синтезированной вновь с помощью другой ДНК-полимеразы. Иными словами, реакция переключения матрицы относится к реакции, при которой двухцепочечную нуклеиновую кислоту как матрицу обрабатывают праймерами и ДНК-полимеразой с активностью вытеснения цепи для образования достроенных цепей, комплементарных матрице, где ДНК-полимераза, которая синтезирует достроенные с примеров цепи, во время синтеза достроенных цепей активно переключает матрицу с исходных матриц на другие достроенные с праймеров цепи.

ДНК-полимеразу, способную осуществлять реакцию переключения матрицы во время реакции вытеснения цепи, можно предпочтительно использовать для настоящего изобретения. Например, предпочтительно использовать, в частности, вариант фермента ДНК-полимеразы Вса, лишенный 5'^3'-экзонуклеазной активности. Такой фермент коммерчески доступен как ДНК-полимераза ВсаВЕЗТ (Такага 81111ΖΟ). Его также можно получить из ЕксйепсЫа сой НВ101/рШ205 (ЕЕКМ ВР-3720), которая содержит ген для фермента согласно способу, описанному в патенте Японии № 2978001.

В способе амплификации настоящего изобретения цепь, достроенную с химерного олигонуклеотидного праймера, можно расщепить в сайте, содержащем рибонуклеотид, так что 5'-фрагмент (праймерная часть), образующийся при расщеплении, не содержит рибонуклеотида. Достроенная с праймера цепь, достроенная с полученной таким образом праймерной части, более не расщепляется эндонуклеазой. В результате, получают продукт амплификации, имеющий на своем конце праймерную последовательность.

Как описано выше, по способу амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения можно получить продукт амплификации без праймерной последовательности и продукт, содержащий праймерную(ые) последовательность(и) на одном или обоих концах. В данном описании такие продукты включаются в продукты амплификации.

В способе амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения с использованием химерного олигонуклеотидного праймера может образоваться полимер, в котором подлежащие амплификации участки соединены друг с другом. Полимер имеет структуру, в которой множество подлежащих амплификации участков повторяется в одном и том же направлении. Полимеры обнаруживают при анализе продуктов амплификации методом электрофореза в виде мультимерных полос. Считается, что на образование таких полимеров влияет амплифицируемый участок, размер участка, фланкирующие области, нук- 11 006066 леотидная последовательность используемого химерного олигонуклеотидного праймера, условия реакции и т.п.

Полимер, описанный выше, содержит множество подлежащих амплификации участков. Например, полимер полезен, когда предполагается детекция нуклеиновой кислоты, содержащей предназначенный для амплификации участок, поскольку он гибридизуется с рядом зондов, при гибридизации с использованием соответствующего зонда, и образует интенсивный сигнал. Подлежащий амплификации участок или его часть можно получить из полимера в виде мономера, используя расщепление рестриктазой или подобным ферментом в сочетании.

ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении, должна синтезировать достраиваемую цепь с 3'-конца праймерной части в направлении транскрипции (бо^ийтсат), в то же время вытесняя цепь ДНК, достроенную ранее. Важно, что ДНК-полимераза не должна проявлять 5'^3'-экзонуклеазную активность, которая может расщепить вытесняемую цепь. Например, в качестве таких ДНК-полимераз применяют фрагмент Кленова, представляющий собой лишенный экзонуклеазы вариант ДНК-полимеразы I из ЕксйсйсЫа сой, сходный фрагмент, полученный из ДНК-полимеразы Вь1 (№\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и ДНК-полимеразу ВсаВЕ8Т из В. са (Такага 81ιιιζο). Также можно использовать 8сс.|испа5с 1.0 и 8сс.|испа5с 2.0 (ииНеб 81а!с5 Вюс11С1шса1) и ДНК-полимеразу Т5 и ДНК-полимеразу φ29, описанную в Ссис, 97:1319 (1991). Полимеразу, обычно обладающую 5'^3'-экзонуклеазной активностью, можно использовать в способе синтеза ДНК по настоящему изобретению, если ингибировать такую активность можно добавлением соответствующего ингибитора.

Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно осуществлять при переменных температурах или его можно осуществлять изотермически. Переменные температуры означают, что температура реакции изменяется на соответствующих стадиях таким образом, что изменение не влияет на реакции на таких стадиях. Конкретно, переменные температуры относятся к изменению, подходящему, например, для каждой из стадий отжига праймера, реакции синтеза комплементарной цепи, введения ника в комплементарную цепь и реакции вытеснения.

С другой стороны, термин изотермическая означает, что температура реакции для каждой стадии неизменна, и каждую стадию проводят при, по существу, постоянной температуре. Естественно, что в обоих случаях выбирают температуру, оптимизирующую условия реакции.

Одной из особенностей способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является то, что способ не требует повышения и понижения температуры во время синтеза нуклеиновой кислоты. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ изотермического синтеза нуклеиновой кислоты. Во многих традиционных способах амплификации нуклеиновых кислот требуется повышение и понижение температуры для отделения мишени от синтезированной цепи. Такие способы требуют специального оборудования для реакций, такого как термоциклер. Однако способ настоящего изобретения можно проводить с использованием лишь оборудования, позволяющего поддерживать постоянную температуру. Как описано выше, способ настоящего изобретения можно осуществлять при одной температуре. Предпочтительно, его осуществляют, выбирая температуру реакции и уровень строгости такими, чтобы уменьшить неспецифический отжиг праймера, и такими, чтобы праймер специфически отжигался к нуклеиновой кислоте как матрице. Без намерения ограничивать настоящее изобретение, способ настоящего изобретения можно осуществлять в условиях высокой температуры, используя теплостойкий фермент, как описано выше. Кроме того, предпочтительно осуществлять способ настоящего изобретения при температуре, соответствующей достаточному сохранению активности используемого фермента для того, чтобы поддерживать эффективность реакции на высоком уровне. Таким образом, температура реакции составляет, предпочтительно, от примерно 20 до примерно 80°С, предпочтительнее от примерно 30 до примерно 75°С, наиболее предпочтительно от примерно 50 до примерно 70°С, хотя она варьирует в зависимости от используемого фермента. Когда реакцию проводят, в частности, в высокотемпературных условиях, предпочтительно использовать более длинный праймер, чем в случае реакции при нормальной температуре. Например, когда используют температуру реакции от 55 до 60 или 65°С, праймер или блокирующий олигонуклеотид, используемый в способе настоящего изобретения, может иметь, например, без ограничений, длину от примерно 6 до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 10 до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительнее от примерно 12 до примерно 40 нуклеотидов. Примером влияния, привносимого повышенной температурой реакции, является решение проблемы образования вторичной структуры ДНК как матрицы. Повышенная температура реакции создает возможность амплификации нужной нуклеиновой кислоты даже в том случае, если в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту с высоким содержанием ОС. Кроме того, она сходным образом эффективна при амплификации участка с большой длиной цепи. Такое действие наблюдают в интервале от примерно 60 п.о. до примерно 20 т.п.о., конкретно от примерно 60 п.о. до примерно 4,3 т.п.о., конкретнее от примерно 60 п.о. до примерно 1500 п.о.

Использование ДНК-полимеразы с обратнотранскриптазной активностью (например, ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т) в способе настоящего изобретения может позволить удобно провести амплификацию нуклеиновой кислоты от РНК, включающую стадию получения кДНК из РНК (обратнотранскриптазная реакция), с использованием только одного фермента. С другой стороны, продукт, полученный путем не- 12 006066 зависимого проведения стадии получения кДНК из РНК, т.е. кДНК, можно использовать в способе настоящего изобретения в качестве ДНК как матрицы.

В каждом случае реакцию в способе настоящего изобретения повторяют до прекращения ее подходящим способом, например путем инактивации фермента или путем снижения температуры реакции, или до тех пор, пока реакционная смесь не истощится по одному из субстратов.

Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для различных экспериментальных процедур, в которых используют амплификацию нуклеиновой кислоты, включая детекцию, мечение и секвенирование нуклеиновой кислоты.

Кроме того, способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для способа амплификации нуклеиновой кислоты ίη δίΐιι. способа амплификации нуклеиновой кислоты на твердом субстрате, таком как ДНК-чип, или метода множественной амплификации нуклеиновых кислот, при котором одновременно амплифицируют множество участков.

Верхний блокирующий олигонуклеотид по настоящему изобретению можно использовать в так называемом способе асимметричной амплификации нуклеиновых кислот, при котором реакцию амплификации осуществляют с использованием избыточного количества одного праймера относительно другого.

По способу амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно получить одноцепочечную ДНК, по существу, свободную от комплементарной ей цепи. Например, можно легко получить за короткий промежуток времени одноцепочечную ДНК для получения материала, содержащего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, такого как ДНК-чип, одноцепочечную ДНК-зонд для детекции нуклеиновой кислоты-мишени или мегапраймер для длинноцепочечной ПЦР. С использованием способа настоящего изобретения можно селективно амплифицировать только смысловую или антисмысловую последовательность. Таким образом, настоящее изобретение также полезно как способ получения нуклеиновой кислоты со смысловой последовательностью или с антисмысловой последовательностью.

Участок нуклеиновой кислоты, представляющий интерес, можно амплифицировать даже из следового количества нуклеиновой кислоты как матрицы путем осуществления способа настоящего изобретения в буфере с Бицином, Трицином, ΗΕΡΕ8, фосфатом или Трис.

Кроме того, способы амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения не требуют специального оборудования для реакции, в котором можно регулировать температуру по времени. Поэтому реакцию амплификации можно проводить в большом объеме реакционной смеси. Таким образом, можно получать нуклеиновую кислоту (например, для применения в медицине) в промышленном масштабе в больших количествах.

Способом амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно получать продукт амплификации с высокой точностью относительно нуклеотидной последовательности матричной нуклеиновой кислоты. Когда частоту ошибок при синтезе ДНК способом настоящего изобретения подтверждали путем анализа нуклеотидных последовательностей полученных продуктов амплификации, частота ошибок, найденная в продуктах амплификации, полученных способом настоящего изобретения, была эквивалентна частоте ошибок при ЬЛ-РСК, которая, как известно, позволяет амплифицировать нуклеиновую кислоту с высокой точностью. Иными словами, способ настоящего изобретения имеет точность, эквивалентную точности при ЬЛ-РСК.

(6) Набор настоящего изобретения.

Настоящее изобретение обеспечивает набор, используемый в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, описанном выше. В одном из воплощений набор находится в упакованной форме и содержит инструкции, касающиеся применения ДНК-полимеразы, эндонуклеазы, химерного олигонуклеотидного праймера и верхнего блокирующего олигонуклеотида в реакции вытеснения цепи. Также для способа настоящего изобретения предпочтительно использовать набор, содержащий ДНК-полимеразу с активностью вытеснения цепи, эндонуклеазу и буфер для реакции вытеснения цепи. С другой стороны, можно выбрать коммерчески доступную ДНК-полимеразу с активностью вытеснения цепи и/или эндонуклеазу и использовать согласно инструкциям. Кроме того, набор может содержать реагент для обратнотранскриптазной реакции, который используют, когда в качестве матрицы используют РНК. ДНК-полимеразу можно выбрать из числа ДНК-полимераз, используемых в настоящем изобретении, описанных выше в (4). Эндонуклеазу можно выбрать из числа эндонуклеаз, описанных выше в (3).

Инструкции представляют собой отпечатанный материал, где описывается способ применения набора, например способ приготовления раствора реагентов для реакции вытеснения цепи, рекомендуемые условия реакций и т.п. Инструкции включают руководство в форме проспекта или листовки, этикетку, наклеенную на набор, и описание на поверхности упаковки, содержащей набор. Инструкции также включают сведения, раскрытые или передаваемые через электронные средства передачи данных, такие как Интернет.

Набор настоящего изобретения также может содержать буфер для реакции, содержащий в качестве буферного компонента Бицин, Трицин, ΗΕΡΕ8, фосфат или Трис, и раствор для отжига. Кроме того, он может содержать ДНК-полимеразу с активностью вытеснения цепи и РНКазу Н. Кроме того, набор может содержать модифицированный дезоксирибонуклеотид или аналог дезоксинуклеозидтрифосфата.

- 13 006066

Набор, используемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени, также может содержать, кроме инструкций и реагентов для реакции амплификации, описанных выше, соответствующий химерный олигонуклеотидный праймер и соответствующий верхний блокирующий олигонуклеотид для амплификации нуклеиновой кислоты-мишени и реагент для детекции амплифицированной нуклеиновой кислоты-мишени, такой как зонд.

Кроме того, наборы настоящего изобретения включают набор, содержащий химерный олигонуклеотидный праймер и верхний блокирующий олигонуклеотид, используемые в настоящем изобретении, и/или зонд настоящего изобретения, описанные выше.

(7) Композиция настоящего изобретения.

Настоящее изобретение обеспечивает композицию, используемую в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения или способе детекции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, описанных выше. Например, композиция может содержать химерный олигонуклеотидный праймер, описанный выше в (1), верхний блокирующий олигонуклеотид, описанный выше в (2), эндонуклеазу, описанную выше в (3), и ДНК-полимеразу, описанную выше в (4). Композиция также может содержать буферный компонент, соль магния, 6ΝΤΡ и т.п. в качестве компонентов для проведения реакции амплификации. Кроме того, она может содержать модифицированный дезоксирибонуклеотид или аналог дезоксинуклеозидтрифосфата. Кроме того, можно использовать буферный компонент и другие добавки.

В особенно предпочтительном аспекте композиция может содержать подходящие количества различных компонентов, перечисленных выше, для способа амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Реакцию амплификации можно проводить только путем добавления к композиции соответствующих матрицы, химерного(ых) олигонуклеотидного(ых) праймера(ов) и верхнего(их) блокирующего(их) олигонуклеотида(ов). Если подлежащий амплификации объект заранее известен, композиция содержит, предпочтительно, химерный(ые) олигонуклеотидный(ые) праймер(ы), подходящий(ие) для амплификации такого объекта.

(8) Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения.

Нуклеиновую кислоту-мишень в образце можно обнаружить, используя способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Способ детекции включает (a) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени способом амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, как описано выше; и (b) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на предыдущей стадии.

На указанной выше стадии (а), если в качестве матрицы используют РНК, обратнотранскриптазную реакцию и реакцию амплификации нуклеиновой кислоты можно проводить в одну стадию. Без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, в качестве сочетания обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи можно использовать, предпочтительно, сочетание ЛМУ РТазс. ММЬУ РТазс или РЛУ-2 РТазс и ДНК-полимеразы Вса.

Способ можно использовать для детекции или количественного определения специфического гена в образце. Иными словами, специфический ген можно обнаружить или определить количественно во всех образцах, где предполагается содержание нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК. Примерами образцов, в которых можно обнаружить специфический ген или определить его количественно, являются, но не ограничиваются перечисленным, образцы, полученные из организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитная пленка, моча, фекалии, спинно-мозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или ткань лимфоузлов) и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, содержащие нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, гриб, дрожжи, растение и животное, образцы, предположительно загрязненные или инфицированные микроорганизмами, такими как вирусы или бактерии (например, пища или биологический состав), и образцы, которые могут содержать организмы, такие как почва и сточные воды. Например, вироиды, вирусы, грибы, бактерии или другие микроорганизмы в образце можно обнаружить или определить количественно на основании присутствия или содержания в качестве мишени специфического гена, происходящего из таких микроорганизмов. В частности, способ детекции патогенных микроорганизмов применим в областях санитарии и охраны окружающей среды. Кроме того, способ настоящего изобретения можно использовать для того, чтобы отличить генотип организма или определить уровень экспрессии гена. В частности, детекция или подтверждение экспрессионного статуса гена, связанного с заболеванием, например гена, связанного с озлокачествлением клеток, полезна в области медицины. При детекции в качестве нуклеиновой кислоты как матрицы можно предпочтительно использовать как РНК, так и ДНК.

Кроме того, способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения можно использовать как способ типирования генетического полиморфизма нуклеиновой кислоты-мишени.

Без намерения ограничивать настоящее изобретение, например, используемый химерный олигонуклеотидный праймер конструируют таким, чтобы 3'-концевая часть праймера располагалась вблизи специфического основания нуклеотидной последовательности-мишени, подлежащего распознаванию. Например, его конструируют так, чтобы между основанием и З'-концевым основанием праймера образовы- 14 006066 валась водородная связь. Если имеет место ошибочное спаривание (мисматч) между нуклеотидной последовательностью 3'-концевой части праймера и нуклеотидной последовательностью матрицы, амплификации нуклеиновой кислоты-мишени не происходит, и с использованием для реакции амплификации вышеуказанного химерного олигонуклеотидного праймера продукт амплификации не образуется. С использованием способа можно получить информацию о специфическом основании в гене, таком как точковая мутация или однонуклеотидный полиморфизм (8ΝΡ).

Сходным образом способ настоящего изобретения можно использовать как способ типирования генетического полиморфизма, такого как делеционная мутация или инсерционная мутация.

Верхний блокирующий олигонуклеотид по настоящему изобретению можно использовать в способе типирования генетических полиморфизмов так, как описывается в РСТ/1Р02/01222.

В одном из воплощений верхний блокирующий олигонуклеотид по настоящему изобретению можно использовать в сочетании с нуклеотидом в способе типирования генетических полиморфизмов в нуклеиновой кислоте-мишени, причем способ включает (1) смешивание образца, содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, с нуклеотидом, где нуклеотид (Α) модифицируют по 3'-концу таким образом, что достраивания с указанного конца ДНК-полиме- разой не происходит;

(B) содержит последовательность оснований, способную отжигаться к участку, содержащему специфическое основание в нуклеиновой кислоте-мишени; и (C) содержит последовательность, в которой, если в комплексе, состоящем из нуклеотида и нуклеиновой кислоты-мишени, имеется ошибочное спаривание (мисматч) между специфическим основанием и основанием в нуклеотиде, соответствующим специфическому основанию, нуклеотид не расщепляется нуклеазой, а если ошибочного спаривания между специфическим основанием и основанием в нуклеотиде, соответствующим специфическому основанию, не имеется, нуклеотид расщепляется нуклеазой с образованием нового 3'-конца;

(2) обработку смеси нуклеазой и ДНК-полимеразой и (3) детекцию наличия расщепления нуклеотида нуклеазой.

В другом воплощении верхний блокирующий олигонуклеотид по настоящему изобретению можно использовать в сочетании с нуклеотидом в способе типирования генетических полиморфизмов в нуклеиновой кислоте-мишени, причем способ включает (1) смешивание образца, содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, с нуклеотидом, где нуклеотид (Α) модифицируют по 3'-концу таким образом, что достраивания с указанного конца ДНК-полиме- разой не происходит;

(B) содержит последовательность оснований, способную отжигаться к участку, содержащему специфическое основание в нуклеиновой кислоте-мишени; и (C) содержит последовательность, в которой, если в комплексе, состоящем из нуклеотида и нуклеиновой кислоты-мишени, не имеется ошибочного спаривания (мисматча) между специфическим основанием и основанием в нуклеотиде, соответствующим специфическому основанию, нуклеотид не расщепляется нуклеазой, а если ошибочное спаривание (мисматч) между специфическим основанием и основанием в нуклеотиде, соответствующим специфическому основанию, имеется, нуклеотид расщепляется нуклеазой с образованием нового 3'-конца;

Используемый в данном описании термин генетический полиморфизм означает различие в нуклеотидной последовательности гена у индивидуумов в одной и той же популяции организмов. Различия в нуклеотидных последовательностях, составляющие генетические полиморфизмы, не ограничиваются определенными формами, но включают разные типы, такие как замены оснований, делеционные мутации и инсерционные мутации. Различие в генетической информации также называют вариацией.

Замена основания означает замену нуклеотида в специфическом сайте в нуклеиновой кислоте другим нуклеотидом. Замены оснований включают однонуклеотидные полиморфизмы одного нуклеотида (8ΝΡ).

Делеционные мутации означают частичную или полную делецию нуклеотидной последовательности в специфическом сайте в нуклеиновой кислоте.

Инсерционная мутация означает встраивание нуклеотидной последовательности произвольной длины в специфический сайт в нуклеиновой кислоте.

В вышеуказанном воплощении блокирующий олигонуклеотид по настоящему изобретению отжигается к участку нуклеиновой кислоты-мишени, расположенному выше (ирйгеат) относительно нуклеотида. В результате, чувствительность детекции при типировании генетических полиморфизмов в нуклеиновой кислоте-мишени может повыситься, как и в способе амплификации нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения.

Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения можно осуществлять путем нуклеиновой кислоты-мишени, подлежащей амплификации, непосредственно из образца, содержащего нуклеиновую кислоту. В таком случае длина цепи нуклеиновой кислоты-мишени, подлежащей ам- 15 006066 плификации, не ограничивается определенной длиной. Например, для чувствительной детекции нуклеиновой кислоты-мишени эффективен участок в 200 п.о. или короче, предпочтительно в 150 п.о. или короче. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить в образце с высокой чувствительностью, сконструировав химерные олигонуклеотидные праймеры настоящего изобретения так, чтобы получить в результате длину амплифицируемой цепи, указанную выше.

Кроме того, нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить с большей чувствительностью даже из следового количества образца нуклеиновой кислоты способом детекции настоящего изобретения, используя буфер для реакции, содержащий Бицин, Трицин, НЕРЕ8. фосфат или Трис в качестве буферного компонента, и раствор для отжига, содержащий спермидин или пропилендиамин. В таком случае используемые эндонуклеаза и ДНК-полимераза не ограничиваются какими-то конкретными. Например, предпочтительно сочетание РНКазы Н АГи и ДНК-полимеразы ВсаВЕ8Т. Считается, что предпочтительные количества единиц активности эндонуклеазы и ДНК-полимеразы могут варьировать в зависимости от типов ферментов. В таком случае состав буфера и количества добавляемых ферментов можно подобрать с использованием в качестве показателя повышение чувствительности детекции или количества продукта амплификации.

В способе детекции настоящего изобретения во время амплификации нуклеиновой кислотымишени в качестве субстрата можно включать 6ИТР. Таким образом, если в качестве субстрата используют биТР, возможно предотвратить ложноположительные результаты в результате коптаминации за счет переноса продуктов амплификации путем разрушения продуктов амплификации с использованием урацил-Ы-гликозилазы (υΝΟ).

Для стадии (Ь) можно использовать известные способы детекции нуклеиновой кислоты. Примерами таких способов являются детекция продукта реакции специфического размера методом электрофореза и детекция путем гибиридизации с зондом. Кроме того, можно предпочтительно использовать способ детекции, при котором используют в сочетании магнитные гранулы. При детекции методом электрофореза, как правило, используют флуоресцирующее вещество, такое как этидия бромид. Гибридизацию с зондом можно сочетать с детекцией методом электрофореза. Зонд можно пометить радиоизотопом или нерадиоактивным веществом, таким как биотин или флуоресцирующее вещество. Кроме того, использование меченого нуклеотида на стадии (а) может облегчить детекцию продукта амплификации, в который включен меченый нуклеотид, или, используя метку, можно усилить сигнал для детекции. Также можно использовать для детекции метод поляризации флуоресценции, метод переноса энергии флуоресценции или подобный метод. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить автоматизированным способом или определить количественно, сконструировав подходящую систему детекции. Кроме того, можно предпочтительно использовать детекцию невооруженным глазом с помощью метода гибридной хроматографии.

В способе детекции настоящего изобретения можно использовать рибонуклеотидный (РНК) зонд или химерный олигонуклеотидный зонд, состоящий из рибонуклеотида и дезоксирибонуклеотида, меченный двумя или большим числом флуоресцирующих веществ, расположенных на расстоянии, что приводит к состоянию тушения. Зонд не дает флуоресценции. Когда его отжигают к ДНК, амплифицированной с нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарной зонду, РНКаза Н расщепляет зонд. Затем увеличивается расстояние между флуоресцирующими веществами на зонде, что приводит к испусканию флуоресценции. Таким образом, испускание обнаруживает присутствие нуклеиновой кислоты-мишени. Если в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения используют РНКазу Н, нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить только путем добавления зонда в реакционную смесь. Например, для мечения зонда можно предпочтительно использовать сочетание флуоресцирующих веществ 6-карбоксифлуоресцеина (6-ЕЛМ) и Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметил-б-карбоксиродамина (ТАМКА).

Настоящее изобретение также обеспечивает зонд, используемый в вышеописанном способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени. Зонд настоящего изобретения не ограничивается конкретным зондом до тех пор, пока он в нормальных условиях гибридизации может гибридизоваться с нуклеиновой кислотоймишенью, амплифицированной способом амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. С точки зрения специфической детекции продукта амплификации предпочтителен зонд, гибридизующийся в условиях, например, известных специалистам в данной области техники как строгие. Строгие условия гибридизации описываются, например, в Т. МашаЩ е( а1., (еб§.). Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2пб еб., 1989, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу. Конкретно, примером строгих условий являются следующие условия: инкубация при температуре примерно на 25°С ниже Тт используемого зонда в течение от 4 ч до ночи в 6 х 88С (1 х 88С: 0,15М №С1, 0,015М цитрата натрия, рН 7,0), содержащем 0,5% 8Ό8, 5 х растворе Денхардта (0,1% бычьего сывороточного альбумина (В8А), 0,1% поливинилпирролидона, 0,1% фиколла 400) и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. Зонд с меткой, описанной выше, можно использовать в качестве зонда для облегчения детекции нуклеиновой кислоты.

Способ настоящего изобретения не требует применения оборудования, такого как термоциклер.

Чувствительность детекции нуклеиновой кислоты-мишени можно повысить согласно способу настоящего изобретения за счет использования в сочетании химерного олигонуклеотидного праймера и верхнего блокирующего олигонуклеотида. В способе настоящего изобретения можно применять такие реагенты, как б№ТР, используемые для ПЦР и подобных способов. Следовательно, способ настоящего изобретения

- 16 006066 можно использовать предпочтительно, например, в области генетических исследований, при которых регулярно проводят детекцию. Способ настоящего изобретения дает большее количество продукта амплификации за более короткий промежуток времени, чем ПЦР. Поэтому способ настоящего изобретения можно использовать как удобный, быстрый и чувствительный способ детекции гена.

При генном анализе на геномном уровне предпринимаются попытки сделать реакционную систему небольшой и повысить степень интеграции для того, чтобы анализировать большое количество нуклеотидных последовательностей. Разработана система для указанной цели с использованием новейших сверхтонких технологий производства, в которой базовые процессы для геномного анализа (например, экстракция ДНК из клеток, реакция амплификации ДНК, электрофорез, гибридизация, детекция представляющей интерес ДНК и т.п.) интегрируются на микрочипе размером от нескольких квадратных сантиметров до кончика пальца. Такая система называется микрочипом или наночипом.

В настоящее время рассматривается применение в системе ПЦР в качестве реакции для амплификации гена. Однако, так как для ПЦР требуются средства для повторяющегося регулирования температуры с ее повышением и понижением во времени, система становится сложной. Напротив, так как систему можно упростить, используя способ настоящего изобретения, которьм можно амплифицировать нуклеиновую кислоту в изотермических условиях, такой способ является вполне подходящим для использования в интегрированной системе, описанной выше. Высокоинтегрированную систему можно сконструировать, используя методы настоящего изобретения.

Примеры

Приведенные далее примеры иллюстрируют настоящее изобретение подробнее, но не предназначаются для ограничения объема изобретения.

Ссылочный пример 1. Клонирование гена РНКазы Н11 из Атсйаеод1оЬи5 £и1д1би5.

(1) Получение геномной ДНК из Лгсйаеод1оЬи5 £и1д1би5.

Клетки Лгсйаеод1оЬи5 ГЫщбнз (приобретенные у ИеиГзсйе 8атт1ипд уоп М1кгоогдаш5теи ипб 2е11ки1!шеп ОтЬН; Ό8Μ4139), собранные из 8 мл культуры, суспендируют в 100 мкл 25% сахарозы, 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0). Добавляют к смеси 20 мкл 0,5М ЭДТА и 10 мкл 10 мг/мл хлорида лизоцима (ЫасаЫ Тезсще) в воде. Смесь реагирует при 20°С в течение 1 ч. После реакции к реакционной смеси добавляют 800 мкл смеси, содержащей 150 мМ №1С1. 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 10 мкл 20 мг/мл протеиназы К (Такага 811ихо) и 50 мкл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч. После реакции смесь подвергают экстракции фенолом и хлороформом, осаждают этанолом и сушат на воздухе и затем растворяют в 50 мкл ТЕ-буфера, получая раствор геномной ДНК.

(2) Клонирование гена РНКазы Н11.

Полная геномная последовательность Лгсйаеод1оЬи5 ГЫщбнз опубликована Ща!ите, 390:364-370 (1997)]. Известно существование одного гена, кодирующего гомолог РНКазы Н11 (ΆΡΌ621) (8ЕО ГО N0:1, ййр://тетете.бдг.огд/!бЬ/СМЯ/Ь!т/й!ш15/8р1а5ЙРаде.Ы!т).

На основании последовательности гена ΆΕΌ621 (8ЕО ГО N0:1) синтезируют праймеры АГнНбе (8ЕО ΙΌ N0:2) и АГиВат (8ЕО ГО N0:3).

Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием 30 нг геномной ДНК Атсйаеод1оЬи5 Ги1д1би5, полученной в (1), в качестве матрицы и 20 пмоль каждого из АГиЫбе и АГиВат в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют ДНК-полимеразу РутоЬез! (Такага 8йнхо) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 40 циклов - 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1 мин. Амплифицированный фрагмент ДНК размером около 0,6 т.п.о. расщепляют Ше1 и ВатН1 (обе от Такага 8йнхо). Затем конструируют плазмиду рАРИ204, встраивая полученный фрагмент ДНК между сайтами Нбе1 и ВатН1 в плазмидном векторе рТУ119Нб (плазмида, в которой сайт №о1 в рТУ119Нб превращен в сайт ШеЦ (3) Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего ген РНКазы Н11.

Нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК, встроенного в плазмиду рАРИ204, полученную в (2), определяют согласно дидезоксиметоду.

Анализ определенной нуклеотидной последовательности выявил открытую рамку считывания, предположительно кодирующую РНКазу Н11. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания показана в 8ЕО ГО N0:4. Аминокислотная последовательность РНКазы Н11, расшифрованная из нуклеотидной последовательности, показана в 8Е0 ГО N0:5.

ЕзсйепсЫа сой ΙΜ109, трансформированную плазмидой рАРИ204, обозначили и указывают как ЕзсйепсЫа сой 1М109/рАЕи204 и депонировали 22 февраля 2001г. в 1п!етпа!юпа1 Ра!еп! 0тдашзт Иерозйату, №1Ропа1 1пз!йи!е о Г Абуапсеб 1пби5йта1 8с1епсе апб Тесйпо1оду, АКТ ТзикиЬа Сеп!та1 6, 1-1, Н1дазЫ 1сйоте, ТзикиЬа-зЫ, 1Ьагак1 305-8566, .Гараи, под инвентарным номером ЕЕВМ Р-18221 и депонировали в 1п!етпа!юпа1 Ра!еп! 0гдашзт Иерозйату, №Шопа1 1пзй!и!е о£ Абуапсеб 1пби5йта1 8аепсе апб ТесйпоКду, под инвентарным номером ЕЕКМ ВР-7691 (дата заявления для передачи в международный депозитарий 2 августа 2001г.).

(4) Получение препарата очищенной РНКазы Н11.

ЕзсйепсЫа сой ΙΜ109 трансформируют рАЕи204, полученной в (2). Полученную ЕзсйепсЫа сой

ΙΜ109, содержащую рАЕИ204, инокулируют в 2 л среды ЬВ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и

- 17 006066 культивируют при встряхивании при З7°С в течение 16 ч. После культивирования клетки, собранные центрифугированием, суспендируют в З7,1 мл буфера для обработки ультразвуком [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 2 мМ фенилметансульфонилфторида] и обрабатывают ультразвуком. Супернатант, полученный центрифугированием при 12000 об./мин в течение 10 мин обработанной ультразвуком суспензии, нагревают при 70°С в течение 15 мин. Затем его снова центрифугируют при 12000 об./мин в течение 10 мин и собирают супернатант. Таким образом получают 40,З мл прогретого супернатанта.

Прогретый супернатант наносят на колонку с КЕ8ОиВСЕ О (Атегзкат РЬагтас1а Вю1есН), уравновешенную буфером А [50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА], и хроматографируют с использованием системы РРЬС (Атегзкат РНагтааа Вю1есН). В результате, РНКаза Н11 проходит через колонку с КЕ8ОиВСЕ О, не удерживаясь.

Прошедшую через колонку фракцию РНКазы Н11 наносят на колонку с КЕ8ОиВСЕ 8 (АтегзНат РНагтааа Вю1есН), уравновешенную буфером А, и хроматографируют с использованием системы РРЬС (Атегзкат Рйагтаота Вю1есН). В результате, РНКаза Н11 проходит через колонку с КЕ8ОиВСЕ 8, не удерживаясь.

Прошедшую через колонку фракцию РНКазы Н11 (40,0 мл) диализуют против 2 л буфера В (50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), 1 мМ ЭДТА), содержащего 50 мМ №С1, в течение 2 ч. Диализ повторяют еще 2 раза. Диализованный раствор фермента (40,2 мл) наносят на колонку с НГТгар-гепарином (АтегзНат РНагтаота Вю1есН), уравновешенную буфером В, содержащим 50 мМ №С1, и элюируют линейным градиентом №1С1 от 50 до 550 мМ с использованием системы РРЬС. В результате, получают фракцию, содержащую РНКазу Н11, элюированную при примерно 240 мМ №С1.

Фракцию РНКазы Н11 (7,8 мл) концентрируют путем ультрафильтрации с использованием Сейпсоп10 (Аписон). Четыре порции, выделенные, каждая, из примерно 600 мкл концентрата, подвергают гельфильтрации на колонке с 8ирегозе 6 (Атегзкат Рйагтааа Вю1ес11), уравновешенной 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,0), содержащим 100 мМ №1С1 и 0,1 мМ ЭДТА, и элюируют тем же буфером. В результате, элюируют РНКазу Н11 в положении, соответствующем молекулярной массе в З0,0 кДа. Такая молекулярная масса соответствует молекулярной массе РНКазы Н11 в мономерной форме.

РНКазу Н11, элюированную так, как описано выше, используют в качестве препарата РНКазы Н11 АГи.

Ферментативную активность полученного таким образом препарата РНКазы Н11 АГи измеряют так, как описано далее.

Реакционную смесь (100 мкл) [20 мМ НЕРЕ8-гидроксид калия (рН 7,8), 0,01% бычьего сывороточного альбумина (Такага 81ιιιζο), 1% диметилсульфоксида, 4 мМ ацетат марганца, 20 мкг/мл поли(бТ) (Атегзкат Рйагтаота Вю1ес11), З0 мкг/мл поли(гА) (Атегзкат Рйагтааа Вю1ес11)|, икубированную при 40°С, добавляют к 1 мкл препарата РНКазы Н11 АГи. Смесь реагирует при 40°С в течение 10 мин. Затем реакцию останавливают, добавляя 10 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). Затем измеряют поглощение при 260 нм. В результате, для препарата РНКазы Н11 АГи наблюдают активность РНКазы Н.

Число единиц теплостойкой РНКазы Н вычисляют следующим образом.

Растворяют 1 мг поли(гА) или поли(бТ) (оба от Атегзкат Рйагтааа Вю1ес11) в 1 мл 40 мМ ТрисНС1 (рН 7,7), содержащего 1 мМ ЭДТА, и получают раствор поли(гА) и раствор поли(бТ).

Затем раствор поли(гА) (до конечной концентрации 20 мкг/мл) и раствор поли(бТ) (до конечной концентрации З0 мкг/мл) добавляют к 40 мМ Трис-НС1 (рН 7,7), содержащему 4 мМ МдС1₂, 1 мМ ЭТТ, 0,00З% В8А и 4% глицерина. Смесь реагирует при З7°С в течение 10 мин, и затем ее охлаждают до 4°С для получения раствора поли(гА)-поли(бТ). К 100 мкл раствора поли(гА)-поли(бТ) добавляют 1 мкл раствора фермента соответствующего разведения. Смесь реагирует при 40°С в течение 10 мин. К ней добавляют 10 мкл 0,5М раствора ЭДТА для прекращения реакции. Затем измеряют поглощение при 260 нм. В качестве контроля к реакционной смеси добавляют 10 мкл 0,5 М раствора ЭДТА, полученную реакционную смесь оставляют реагировать при 40°С в течение 10 мин и затем измеряют поглощение. Величину (разницу в поглощении) получают, вычитая поглощение для контроля из поглощения для реакционной смеси в отсутствие ЭДТА. Таким образом, на основании разницы в поглощении определяют концентрацию нуклеотида, высвобожденного из гибрида поли(гА)-поли(бТ) за счет ферментативной реакции. Одну единицу РНКазы Н определяют как количество фермента, дающее увеличение А₂₆₀, соответствующее высвобождению 1 нмоль рибонуклеотида за 10 мин, вычисленную согласно уравнению Единица=[(разница в поглощении)х(объем реакционной смеси (мл))]/0,0152х(110/100)х(степень разведения)

Пример 1.

(1) Конструирование праймеров и блокирующих олигонуклеотидов.

Проверяют сочетание химерного олигонуклеотидного праймера и верхнего блокирующего олигонуклеотида, способного отжигаться к произвольному участку, расположенному в З'-направлении к участку в нуклеиновой кислоте как матрице, к которому отжигается праймер. Сначала синтезируют химерные праймеры для детекции плазмидной ДНК СЫатуФа йасйотайз СТ-ВР19-З (8ЕО ГО NО:6) и СТВК2З-2 (8ЕО ГО NО:7) на основе нуклеотидной последовательности плазмиды СЫатуФа йасйотайз (СепВапк, инвентарный номер Х06707) с использованием синтезатора ДНК. Кроме того, синтезируют верхние блокирующие олигонуклеотиды СВ-РВК (8ЕО ГО NО:8) и СВ-КВК (8ЕО ГО NО:9), имеющие нуклеотидные последовательности плазмидной ДНК СЫатубта 1гас1ютаЕз и способные отжигаться к

- 18 006066 произвольным участкам, расположенным в 3'-направлении к участкам нуклеиновой кислоты как матрицы, к которым отжигаются химерные олигонуклеотидные праймеры. Верхние блокирующие олигонуклеотиды блокируют по 3'-концам путем аминирования, так что реакция достраивания под действием ДНК-полимеразы не происходит. Верхние блокирующие олигонуклеотиды СЯ-ЕВК и СЯ-ЯВК являются смысловым и антисмысловым олигонуклеотидом, соответственно.

(2) Получение положительного контроля на СЫатуФа.

Плазмиду-положительный контроль на СЫатуФа получают ПЦР-амплификацией и очисткой фрагмента в 560 п.о., соответствующего части гена СЫатуШа, представленного 8ЕО ГО N0:10, встраиванием амплифицированного фрагмента в вектор рТ7 В1ие с использованием набора ΌΝΑ Ыдайоп К11 Ует.2 (Такага δΐιιιζο) и трансформацией Е. со11 ΣΜ109.

(3) Реакция 1САК

Готовят реакционные смеси с конечными объемами 25 мкл, содержащие 1 мкл воды в качестве отрицательного контроля или раствора, содержащего 10²-10⁶ копий положительной контрольной ДНК, полученной выше в (2), 50 пмоль каждого химерного олигонуклеотидного праймера и 100 пмоль каждого верхнего блокирующего олигонуклеотида, синтезированных выше в (1), а также следующие компоненты: 0,5 мМ каждого 6ΝΤΡ, 32 мМ буфер Нере8-К0Н (рН 7,8), 100 мМ ацетат калия, 4,0 мМ ацетат магния, 0,01% бычьего сывороточного альбумина, 1,0% диметилсульфоксида, 4,375 Ед РНКазы Н АГи и 2,64 Ед ДНК-полимеразы ВсаВЕЗТ (Такага δΐιιιζο). Реакционные смеси инкубируют при 60°С в течение 1 ч с использованием термоциклера. Группу образцов, к которым верхние блокирующие олигонуклеотиды не добавляют, используют в качестве контроля. По завершении реакции по 5 мкл каждой реакционной смеси анализируют методом электрофореза в 3,0% агарозном геле. Результаты показаны на фиг. 1. Фиг. 1А представляет результаты для реакционной системы без добавления верхних блокирующих олигонуклеотидов. Полоса 1: мультимерный маркер ДНК в 100 п.о.; полоса 2: отрицательный контроль (вода); полоса 3: 10² копий матрицы; полоса 4: 10³ копий матрицы; полоса 5: 10⁴ копий матрицы; полоса 6: 10⁵ копий матрицы; и полоса 7: 10⁶ копий матрицы. Фиг. 1В представляет результаты для реакционной системы с добавлением верхних блокирующих олигонуклеотидов. Полоса 1: мультимерный маркер ДНК в 100 п.о.; полоса 2: отрицательный контроль (вода); полоса 3: 10² копий матрицы; полоса 4: 10 копий матрицы; полоса 5: 10 копий матрицы; полоса 6: 10⁵ копий матрицы; и полоса 7:10 копий матрицы.

Как видно на фиг. 1, для группы образцов без добавления верхних блокирующих олигонуклеотидов амплификацию наблюдают с использованием 10⁵ копий матрицы. С другой стороны, для группы образцов с добавлением верхних блокирующих праймеров амплификацию наблюдают с использованием 10³копий матрицы. Таким образом, чувствительность повышается на два порядка по сравнению с группой без добавления. На основании таких результатов подтверждено, что чувствительность детекции повышается за счет использования верхнего блокирующего олигонуклеотида, способного отжигаться к произвольному участку, расположенному в 3'-направлении к участку нуклеиновой кислоты как матрицы, к которой отжигается химерный олигонуклеотидный праймер.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение обеспечивает способ амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, при котором участок в нуклеиновой кислоте-мишени, подходящий для специфической амплификации, амплифицируют посредством реакции синтеза ДНК с использованием химерного олигонуклеотидного праймера и верхнего блокирующего олигонуклеотида. Настоящее изобретение также обеспечивает способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающий стадию детекции фрагмента, амплифицированного из нуклеиновой кислоты-мишени, полученного указанным способом амплификации нуклеиновой кислоты-мишени.

Свободный текст к перечню последовательностей

8ЕО ГО N0:2: ПЦР-праймер АиМе для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы Н11, из Агсйаеод1оЬи8 Ги1д16и8.

8ЕО ГО N0:3: ПЦР-праймер АГиВаш для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы Н11, из АгсйаеоДоЬш Ги1д16и8.

8ЕО ГО N0:6: Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как СТВЕ19-3, для амплификации части плазмидной ДНК СЫат1Фа (гасйотаШ. Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами, другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ГО N0:7: Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как СТВЯ23-2, для амплификации части плазмидной ДНК СЫат1Фа ЯасйотаШ. Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами, другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами.

8Е0 ГО N0:8: Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как СВЕВЕ.

8Е0 ГО N0:9: Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как СЯЯВК.

- 19 006066

Перечень последовательностей <110> ТАКАКА ΒΙΟ ШС.

<120> Способ амплификации нуклеиновых кислот <130> 663373 <150> ЗР 2001-249497 <151> 2001-08-20 <160> 10 <210> 1 <211> 626 <212>ДНК <213> АгсЬаеод1оЬиз ίυΐβίάυδ <400> 1 а1§аа§дса§ дса1с§а1§а §дс1д§ааад §§с1дсд1са 1сдцсссас1 ддПдЦдса 60 ддад!ддсй дсадсда!да §да!аддс1д адааадсйд д!д!дааада сЛссааааад 120 с!аад!садд ддаддадада ддаас!адсс даддааа!аа ддаааа!с!д садаасддад 180 дЦйдааад Шс1сссда ааа1с!сдас дааадда!дд с!дс1аааас са1ааасдад 240 аШкдаадд ад!дс1асдс 1дааа1аай с!саддс1да адссддааа! 1дсйа1дй 300 дасад!сс!д а!д1да«сс сдададасй 1сдадддадс «даддада! 1асддддйд 360 ададПд!дд ссдадсасаа ддсддасдад аад!а!сссс 1дд1адс1дс ддсйсаа!с 420 а!сдсааадд 1ддаааддда дсдддадай дададдс!да аадааааай сддддаМс 480 ддсадсддс! а!дсдадсда 1ссдаддаса ададаад!дс 1дааддад1д да!адсйса 540 ддсадаайс сдадс1дсд! дадаа!дсдс 1ддаадасдд 1д1сааа1с1 даддсадаад 600

- 20 006066 ас§сй§ас§ аШс1ааас дааасс 626 <210> 2 <211> 30 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер ΑίτιΝάε для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ, из АгсЬаео§1оЬиз ίύΐβίάπδ <400>2 аа§с!§ддй !са!а1§аа§ §са§§са1с§ 30 <210> 3 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> ПЦР-праймер АГиВат для клонирования гена, кодирующего полипептид, обладающий активностью РНКазы НИ из АгсЬаео§1оЬиз Ги1щбиз <400> 3

1§§1аа1аас дда!сс§Ш а§ааа!с§1с 30 <210> 4 <211> 638 <212>ДНК

- 21 006066 <213> АгсНаеод1оЬиз 1и1д1Пиз <400> 4 са!а!даадд саддса!сда !даддс!дда аадддс!дсд !са!сддссс ас!дд!!ди 60 дсаддад!дд сйдсадсда !дадда!адд с!дадааадс Пдд1д!даа адас!ссааа 120 аадс!аад!с аддддаддад ададдаас!а дссдаддааа 1ааддаааа1 с1дсадаасд 180 даддППда аа§Шс!сс сдаааа!с!с дасдааадда !ддс!дс1аа аассаТааас 240 дадаШбда аддад!дс!а сдс!дааа!а а!!с!саддс !даадссдда аайдсПа! 300 д«дасад!с с!да1д1да!!сссдадада сШсдаддд адсПдадда дайасдддд 360

ПдададНд 1ддссдадса сааддсддас дадаад!а!с ссс1дд!адс 1дсддсП:са 420 а!са1сдсаа адд!ддааад ддадсдддад аКдададдс !дааадаааа айсдддда! 480

Нсддсадсд дсШдсдад сда!ссдадд асаададаад 1дс1даадда д!дда!адс! 540

1саддсадаа !!ссдадс1д сд!дадаа!д сдс!ддаада сдд!д!сааа 1с1даддсад 600 аадасдсИд асдай!с!а аасдда!ссс сддд!асс 638 <210> 5 <211> 205 <212> Белок <213> АгсЬаеод1оЬиз МдИиз <400> 5

Ме! Ьуз А1а С1у Пе Азр О1и А1а О1у Ьуз О1у Суз Уа1 Пе О1у

10 15

Рго Ьеи Уа1 Уа1 А1а О1у Уа1 А1а Суз Зег Азр 61и Азр Агд Ьеи

Агд Ьуз Ьеи С1у Уа1 Ьуз Азр Зег Ьуз Ьуз Ьеи Зег О1п (Ну Агд

Агд О1и О1и Ьеи А1а 61и (Ии Пе Агд Ьуз Пе Суз Агд ТЬг (Ни

- 22 006066

Уа1 Ьеи Ьуз Уа1 8ег Рго СИи Азп Ьеи Азр С1и Агд Ме! А1а А1а

7075

Ьуз ТЬг Не Азп СЛи Не Ьеи Ьуз 61и Суз Туг А1а СИи Не Не

8590

Ьеи Агд Ьеи Ьуз Рго О1и Не А1а Туг Уа1 Азр 8ег Рго Азр Уа1

100105

Не Рго СИи Агд Ьеи 8ег Агд (Ии Ьеи (Ии СИи Не ТЬг СИу Ьеи

ПО 115120

Агд Уа1 Уа1 А1а (Ии ЬНзЬуз А1а Азр СИи Ьуз Туг Рго Ьеи Уа1

125 130135

А1а А1а А1а 8ег Не Не А1а Ьуз Уа1 СИи Агд СИи Агд СИи Не

140 145150

СИи Агд Ьеи Ьуз СИи Ьуз РЬе СИу Азр РЬе СИу 8ег СИу Туг А1а

155 160165

8ег Азр Рго Агд ТЬг Агд (Ии Уа1 Ьеи Ьуз СИи Тгр Не А1а 8ег

170 175180

СИу Агд Не Рго 8ег Суз Уа1 Агд Ме! Агд Тгр Ьуз ТЬг Уа1 8ег

185 190195

Азп Ьеи Агд СИп Ьуз ТЬг Ьеи Азр Азр РЬе

200205 <210> 6 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как СТ-ВР19-3, для амплификации части плазмидной ДНК СЫатусйа ПасЬотаПз.

- 23 006066 «Нуклеотиды 20-22 являются рибонуклеотидами, другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами».

<400> 6 са!ас§§Ш 1сс1с§а1§а ии 22 <210> 7 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как СТ-ВК23-2, для амплификации части плазмидной ДНК СЫашусйа йасйотабз. «Нуклеотиды 21-23 являются рибонуклеотидами, другие нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами».

<400> 7 §а!с!ас§са а1§§аШ1с аии 23 <210> 8 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как СК-РВК <400> 8

- 24 006066 §асаа§с11а §а1ссдШс 20 <210>9 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Сконструированный химерный олигонуклеотидный праймер, обозначенный как СК-КВК <400> 9 с§с1саа§са а!а§ааас§§ 20 <210> 10 <211>560 <212>ДНК <213> СЫатуЛа 1гасйота118 <400> 10 а§§1ааа§с! с!§а1аШ:§ аа§ас!с1ас 1§а§1а1а11 с1§а§§са§с 60

11дс1аайа 1§а§Шаа§ 1§11с1са1с а!аааааса1 айса1а§1а Шааа1ас1 120

1аааа§асаа 1ддайасс1 а1аас!§1а§ ас1с££сй§ §§аа§а§сй й§сддс§1с 180 §1а1сааада 1а1§§асааа 1с§1а1с1с§ £§Паа1§11 §са1да1дс1 На1сааа1§ 240 асаадсйад а1сс§Шс1 са!асддШ 1сс1сда1да 1§1адсдс1д 300 аадааааШ §а§1аа1йс аШТссдс! с§Шаа1§а §1асаа1даа аа1ссай§с 360 §1ада1с1сс §Шс1ай§ сй§а§с§1а 1ааадддаа§ §сй§аса§1 §с1а!а§саа 420 адасШйс 1а11с§са§с §с1ада§§сс §§1с1аШа 1да1а1айс 1сасад1сад 480 ааайддад! §с1§дс1с§1 а1аааааааа дасдадсаас д11с!с1дад ааЮаааай 540 сШсШда 1дссйссса 560

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий (а) получение реакционной смеси путем смешивания нуклеиновой кислоты как матрицы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ДНК-полимеразы с активностью вытеснения цепи по меньшей мере одного химерного олигонуклеотидного праймера по меньшей мере одного верхнего (ир81геат) блокирующего олигонуклеотида и РНКазы Н, где химерный олигонуклеотидный праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, по существу, комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один элемент, выбранный из группы,

- 25 006066 состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на З'-конце или З'-концевой стороне праймера, и где верхний блокирующий олигонуклеотид, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности, расположенной в З'-направлении к участку в нуклеиновой кислоте как матрице, который, по существу, комплементарен химерному олигонуклеотидному праймеру, и нуклеотид на 3'-конце верхнего блокирующего олигонуклеотида модифицируют таким образом, что реакция достраивания комплементарной цепи под действием ДНК-полимеразы не происходит; и (Ь) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.
2. Способ по п.1, где реакционная смесь дополнительно содержит второй химерный олигонуклеотидный праймер, имеющий последовательность, по существу, гомологичную нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы.
3. Способ по п.2, где реакционная смесь дополнительно содержит верхний блокирующий олигонуклеотид, имеющий последовательность, по существу, гомологичную нуклеотидной последовательности, расположенной в 5'-направлении к участку в нуклеиновой кислоте как матрице, который, по существу, гомологичен нуклеотидной последовательности второго химерного олигонуклеотидного праймера, и нуклеотид на З'-конце верхнего блокирующего олигонуклеотида модифицируют таким образом, что реакция достраивания комплементарной цепи под действием ДНК-полимеразы не происходит.
4. Композиция для способа амплификации нуклеиновой кислоты по п.1, содержащая по меньшей мере один химерный олигонуклеотидный праймер и по меньшей мере один верхний (ирк1геаш) блокирующий олигонуклеотид.
5. Набор для способа амплификации нуклеиновой кислоты по п.1, содержащий по меньшей мере один химерный олигонуклеотидный праймер и по меньшей мере один верхний (ирк1геаш) блокирующий олигонуклеотид.
6. Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени, включающий (a) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени способом амплификации нуклеиновой кислоты по п.1 и (b) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на предыдущей стадии.