KR20040028991A - 핵산 증폭 방법 - Google Patents

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KR20040028991A
KR20040028991A KR10-2004-7002070A KR20047002070A KR20040028991A KR 20040028991 A KR20040028991 A KR 20040028991A KR 20047002070 A KR20047002070 A KR 20047002070A KR 20040028991 A KR20040028991 A KR 20040028991A
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다츠지 에노키
히로아키 사가와
이쿠노신 가토
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다카라 바이오 가부시키가이샤
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Abstract

샘플내 표적 핵산을 고감도 및 특이적으로 증폭시키는 표적 핵산 증폭 방법; 및 상기 방법에서 사용되는 조성물 및 키트.

Description

핵산 증폭 방법{Nucleic acid amplification methods}
DNA 합성은 유전 공학분야의 검토에서 다양한 목적으로 사용된다. 단쇄 DNA(예: 올리고뉴클레오티드)의 합성을 제외한 대부분의 DNA 합성은 DNA 폴리머라제를 사용하는 효소적 방법에 의해 수행된다. 상기 방법의 예는 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202호, 및 4,800,159호에 상세히 기재된 중합효소 연쇄반응(PCR)이다. 또다른 예는 (Trends in Biotechnology, 10:146-152(1992))에 기재된 PCR 및 역전사 효소 반응의 조합인 역전사-PCR(RT-PCR) 방법이다. 상기 언급한 방법을 개발하므로써 DNA 또는 RNA로부터 관심의 대상이 되는 영역을 증폭시킬 수 있었다.
예를 들면, 3단계로 구성된 반응을 사용하여 상기 언급한 DNA 합성 방법을ㄹ 수행한다. 이 3단계는 주형으로서의 더블-스트랜드를 싱글-스트랜드 DNAs로 분리(변성)시키는 단계, 프라이머를 싱글-스트랜드에 어닐링시키는 단계 및 프라이머로부터 상보적인 스트랜드를 합성(신장)시켜 관심의 대상이 되는 DNA 영역을 증폭시키는 단계이다. 다르게는, 3단계중 두개, 즉 프라이머를 어닐링하는 단계 및 신장 단계를 동일한 온도에서 수행하는 "더 셔틀 PCR"("the shuttle PCR")("PCR hou saizensen" (Recent advances in PCR methodology), Tanpakushitsu Kakusan Kouso, Bessatsu, (Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Supplement), 41(5):425-428 (1996))로 고안된 반응을 사용하여 수행한다.
또한, 1989년 6월 14일에 공개된 유럽 특허 제 320,308 호에 기재된 리가아제 연쇄반응(ligase chain reation(LCR)) 방법 또는 문헌(PCR Protocols, Academic Press Inc., 1990, pp.245-252)에 기재된 전사-기초 증폭 시스템(transcription-based amplication system(TAS))을 사용할 수 있다. 상기 언급된 4개의 방법은 다음 증폭 사이클을 위한 싱글-스트랜드 표적 분자를 재생시키기 위해 고온 및 저온에서 반응을 여러 차례 반복시키는 것을 필요로 한다. 상기 기재된 바와 같이 반응은 온도에 의해 제한되기 때문에 반응 시스템은 불연속 상 또는 사이클을 사용하여 수행되어야 한다.
따라서, 상기 방법들은 시간에 따라 광범위한 범위의 온도를 엄격히 조정할 수 있는 고가의 열 싸이클러(thermal cycler)의 사용을 필요로 한다. 또한, 반응은 2개 또는 3개의 예정된 것으로 온도를 조정하기 위한 시간을 필요로 한다. 사이클 수에 비례하여 낭비되는 시간은 증가한다.
상기 문제점을 해결하기 위해 등온에서 수행될 수 있는 핵산 증폭 방법이 개발되었다. 그의 예는 JP-B 7-114718호에 기재된 스트랜드 치환 증폭(SDA) 방법, 자립복제(self-sustained sequence replicaiotn(3SR)) 방법, 일본 특허 제 2650159호에 기재된 핵산서열 기초 증폭(NASBA) 방법, 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification(TMA)) 방법, 일본 특허 제 2710159호에 기재된 Qβ레플리카아제(replicase) 방법 및 미국 특허 제 5,824,517 호, WO 99/09211, WO 95/25180 및 WO 99/49081에 기재된 다양한 개량 SDA 방법을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 등온 효소적 합성 방법은 미국 특허 제 5,916,777호에 기재되어 있다. 등온 핵산 증폭 또는 올리고뉴클레오티드의 합성 방법의 반응에서 프라이머로부터의 신장 및/또는 프라이머로부터의 신장전에 수행되는 프라이머의 싱글-스트랜드 신장 산물(원 표적 서열)에의 어닐링은 등온에서 인큐베이션된 반응 혼합물중에서 동시에 수행된다.
등온 핵산 증폭 방법중에서, SDA 방법이 DNA를 최종적으로 증폭시키는 시스템의 한 예이다. SDA 방법은 DNA 폴리머라제 및 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 더블 스트랜드를 치환하여 샘플중에서 핵산 서열(및 그의 상보적 스트랜드)를 증폭시키는 방법이다. 상기 방법은 증폭용 4개의 프라이머를 필요로 하고, 이중 2개는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함하도록 작제되어야 한다. 상기 방법은 DNA를 대량으로 합성하기 위해 기질로서 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 사용을 필요로 한다. 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 예는 α-위치의 인산 그룹의 산소 원자가 황 원자(S)로 치환된 (α-S) 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트이다. 예를 들면, 유전자 시험을 위해 상기 반응을 항상(routinely) 수행하는 경우, 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 사용과 관련된 러닝코스트(running cost) 문제는 심각하다. 또한, 예를 들면, 제한효소 단편 장다형(restriction enzyme fragment length polymorphism(RELP)) 분석시, 본 발명에서 (α-S) 데옥시리보클레오티드와 같은 변형된 뉴클레오티드를 증폭된 DNA 단편에 도입시킴으로써 제한 효소를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 절단하는 것을 생략할 수 있다.
미국 특허 제 5,824,517 호에 기재된 바와 같은 개량 SDA 방법은 RNA 및 DNA로 구성되고 필수 요소로서 DNA가 적어도 3'-말단에 위치한 구조를 갖는 키메라성 프라이머를 사용하는 DNA 증폭 방법이다. WO 99/09211에 기재된 바와 같은 개량 SDA 방법은 5'-팽창형의(Protruding) 단(end)을 제조하는 제한 효소의 사용을 필요로 한다. WO 95/25180에 기재된 개량된 SDA 방법은 적어도 두쌍의 프라이머의 사용을 필요로 한다. WO 99/49081에 기재된 개량된 SDA 방법은 적어도 2쌍의 프라이머 및 적어도 하나의 변형된 데옥시리보클레오티드 트리포스페이트의 사용을 필요로 한다. 한편, 미국 특허 제 5,916,777호에 기재된 올리고뉴클레오티드 합성 방법은 3'-말단에 리보뉴클레오티드를 갖는 프라이머를 사용하여 DNA를 합성하고, 프라이머를 사용하여 반응을 종결시키고, 프라이머-신장된 스트랜드중의 프라이머 및 신장된 스트랜드 사이에 엔도뉴클레아제로 닉(nick)를 도입하여 그들을 분리하고, 주형을 분해하고 그것을 재사용하기 위해 프라이머를 회수하는 것을 포함한다. 본 발명에서 반응 시스템으로부터 프라이머를 분리한 후 그것을 주형에 다시 어닐링하여 프라이머를 재사용하는 것이 필요하다. 또한, WO 00/28028에 기재되어 있는 루프-매개 등온 증폭법(Loop-mediated Isothermal Amplificatin(LAMP))는 증폭을 위해 4개의 프라이머를 필요로 하고 상기 방법을 사용하여 증폭된 산물은 증폭을 위한 표적 부위가 반복된 다양한 크기를 갖는 DNA 이다.
추가로, WO00/56877 또는 WO02/16639에 기술된 바와 같은 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 사용하는 등온 핵산 증폭 방법, 이소터말 앤드 키메라 프라이머-이니시에이트 앰플리케이션 오브 뉴클레익 엑시드(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids(ICAN)) 방법이 공지되어 있다. 그러나, 통상의 등온 핵산 증폭 방법은 여전히 다양한 문제점을 안고 있다. 따라서, 추가로 유전 공학적으로 처리될 수 있는 DNA 단편을 수득하여 저렴한 비용으로 핵산을 증폭시키는 방법이 요구되고 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 샘플중 표적 핵산을 고감도로 특이적으로 증폭시키는 표적 핵산 증폭 방법, 상기 방법에서 사용되는 키트 및 조성물을 제공한다.
발명의 요약
집중적으로 검토한 결과, 본 발명자는 WO 00/56877 또는 WO 02/16639에 기술된 바와 같은 ICAN 방법에서 주형으로서의 핵산중 프라이머가 어닐링하는 3'측 부위에 어닐링하는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드 및 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 배합물을 사용하여 표적 핵산 증폭 효율이 향상되고 검출 감도도 개선되었다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명은 완성되었다.
본 발명의 제 1면은
(a) 주형으로서의 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 적어도 하나의 상류 블럭(upstream block) 올리고뉴클레오티드 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고
(여기에서, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고,
상류 블럭 올리고뉴클레오티드는 주형으로서의 핵산중 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머와 실질적으로 상보적인 영역의 3'측 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고, 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제 작용에 의한 상보적 스트랜드 신장 반응은 발생하지 않도록 변형된다);
(b) 반응 혼합물을 반응 산물을 생성시키기에 충분한 시간동안 인큐베이션하는 것을 포함하는, 핵산 증폭 방법에 관한 것이다.
제 1면에 따라, 반응 혼합물은 추가로 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 제 2 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있다. 또한, 반응 혼합물은 주형으로서의 핵산중 제 2 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 영역의 5'측 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다(여기에서, 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의3' 말단의 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제 작용에 의한 상보적 스트랜드 신장 반응은 발생하지 않도록 변형된다).
본 발명의 제 2면은 적어도 하나의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 적어도 하나의 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 제 1면의 핵산을 증폭시키는 방법을 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제 3면은 적어도 하나의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 적어도 하나의 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 제 1면의 핵산을 증폭시키는 방법을 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제 4면은
(a) 제 1면의 핵산을 증폭시키는 방법에 의해 표적 핵산을 증폭시키고;
(b) 전 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 것을 포함하는, 표적 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 방법에 따라 증폭된 DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 임상 의학 분야에서 유용한 표적 핵산을 검출하는 방법 및 유전공학 분야에서 유용한 DNA 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 표적으로서의 핵산을 증폭시키는 방법 및 상기 방법을 사용하여 증폭된 표적 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바, 데옥시리보뉴클레오티드(또한 dN으로서 언급됨)는 당 부위가 D-2-데옥시리보오스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드는 염기 부위로서 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 티민을 갖는 것들을 포함한다. 추가로, 데옥시리보뉴클레오티드는 또한 7-데아자구아노신과 같이 변형된 염기를 갖는 데옥시리보뉴클레오티드 및 데옥시이노신 뉴클레오티드와 같은 데옥시리보뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 리보뉴클레오티드(또한 N으로서 언급됨)는 당 부위가 D-리보오스로 구성된 뉴클레오티드를 언급한다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드는 염기 부위로서 아데닌, 사이토신, 구아닌 또는 우라실 갖는 것들을 포함한다. 또한 리보뉴클레오티드는 α-위치의 인산 그룹의 산소 원자가 황원자로 치환된(또한 (α-S)로서 언급됨) 변형된 리보뉴클레오티드와 같은 변형된 리보뉴클레오티드 또는 다른 유도체를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드를 갖고, 본 발명의 방법에서 핵산 스트랜드를 신장시키기 위하여 사용할 수 있고, 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있고, 스트랜드 치환 반응을 위해 사용될 수 있는 어느 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 3'-말단측은 예를 들면, 프라이머와 같이 핵산의 중심으로부터 3'-말단까지의 부위를 언급한다. 또한, 5'-말단측은 핵산의 중심으로부터 5'-말단까지의 부위를 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 상류 부위는 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 내지 5' 말단인 임의의 부분을 언급한다. 다시 말하면, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어닐링되는 주형으로서의 핵산의 스트랜드에서 프라이머에 대하여 3'인 임의의 부분이다.
본 명세서에서 사용되는 바, 엔도뉴클레아제는 주형으로서의 핵산에 어닐링하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA를 신장시켜 생성된 더블-스트랜드 DNA에 대하여 작용하고, 리보뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 부분에서 특이적으로 절단하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, DNA 폴리머라제는 주형으로서 DNA 스트랜드를 사용하여 다시(de novo) DNA 스트랜드를 합성하는 효소를 언급한다. DNA 폴리머라제는 자연 발생된 DNA 폴리머라제 및 상기 언급한 활성을 갖는 효소를 포함한다. 예를 들면, 그러한 효소는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제 및 역전사 효소 활성 또는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, "스트랜드 치환 활성"은 스트랜드를 치환할 수 있는 활성, 즉, DNA 스트랜드를 치환하여 주형 스트랜드에 어닐링된 상보적인 스트랜드를 분리시키면서 주형으로 뉴클레오티드 서열에 기초하여 DNA를 복제할 수 있는 활성을 언급한다. 또한, 본 명세서에서 스트랜드 치환으로부터 수득한 주형으로서 뉴클레오티드 서열로부터 분리된 DNA 스트랜드를 "치환된 스트랜드"로서 언급한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명할 것이다.
(1) 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이다. 그러한 프라이머는 또한 변형되지 않는 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 프라이머는 주형으로서의 핵산의 일부의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 키메라성 올리고뉴크레오티드 프라이머이다. 사용되는 조건하에서 DNA 스트랜드를 신장시킬 수 있다. 또한, 리보뉴클레오티드는 키메라성 올리고뉴크레오티드 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치한다. 프라이머는 일반적으로 증폭되는 영역의 상류, 즉, 주형으로서의 핵산중에 증폭되는 부위에 대응하는 뉴클레오티드 서열의 3' 부위에 상보적으로 작제된다. 본 명세서에서 사용되는 바, "실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열"은 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서 DNA에 어닐링할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 하나 이상의 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 리보뉴클레오티드는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치할 수 있고 엔도뉴클레아제에 의해 인식되거나 절단되는 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드중 어느 하나일 수 있다. 리보뉴클레오티드는 상기 언급된 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및 변형된 리보뉴클레오티드 둘 모두를 포함할 수 있다. 변형되지 않은 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 또는 그의 혼합물이 프라이머의 기능을 없애지 않는 한 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 위해 사용할 수 있다. 변형된 리보뉴클레오티드의 예로는 제한되는 것은 아니지만, 인산 그룹에 결합된 산소원자가 황 원자로 치환된 (α-S) 리보뉴클레오티드, 및 리보오스의 2번-위치에 하이드록시 그룹이 메톡시 그룹으로 치환된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 그러한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예를 들면, 미국특허 제 5,003,097 호에 기술된 황화 반응제(Glen Research), 또는 2-OMe-RNA-CE 포스포르아미다이트제(Glen Research)를 사용하는 방법에 의해 제조된 (α-S) 리보뉴클레오티드를 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 증폭 방법에서 사용될 수 있는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 엔도뉴클레아제를 사용하는 절단에 대하여 내성을 갖도록 하기 위해 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하도록 디자인될 수 있다. 그러한 프라이머는 증폭 반응 단계동안 그것이 엔도뉴클레아제로 절단 부위를 조정할 수 있게 하는데 유용한다.
한개 또는 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 증폭 후 DNA 단편의 바람직한 형태(싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드)에 따라 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 특히, 한개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 싱글-스트랜드 DNA가 바람직한 경우 사용되고, 두개의 프라이머는 더블-스트랜드가 바람직한 경우 사용된다.
본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 리보뉴클레오티드를 갖고 ICAN 방법에 사용될 수 있는 한 상기 프라이머의 길이과 관련하여 특별히 제한하지 않는다.
사용될 수 있는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 길이는 예를 들면, 약 6 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 바람직하게 약 12 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 약 15 뉴클레오티드 내지 약 40 뉴클레오티드이다. 키메라성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서의 핵산에 어닐링할 수 있도록 실질적으로 주형으로서의 핵산과 상보적인 것이 바람직할 수 있다. 프라이머는 하기에 기재된 단계에서 사용되는 엔도뉴클레아제에 의해 3'-말단 또는 3'-말단측에서 인식되는 서열을 포함한다.
예를 들면, 하기 일반식으로 표시되는 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 DNA 합성 방법에서 프라이머로서 사용할 있지만, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 것은 아니다:
일반식 : 5'-dNa-Nb-dNc3'
(dN: 데옥시리보뉴클레오티드이며; N: 변형되지 않은 리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드이다(여기에서, dNa중 dNs는 Ns에 의해 치환될 수 있고, 3'-말단의 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제의 작용에 의한 3'-말단으로부터의 신장을 발생하지 않도록 변형될 수 있다).
상기 언급한 일반식에서, 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, a는 예를 들면, 5이상, 바람직하게 6이상, 더욱 바람직하게 8이상의 정수이고; b는 1이상의 정수, 예를 들면, 1-15, 바람직하게 1-10, 더욱 바람직하게 1-7, 가장 바람직하게 1-5의 정수이고; c는 0일 수 있거나 c 는 1이상의 정수, 바람직하게 0-5, 더욱 바람직하게 0-3일 수 있다.
본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 본 발명에 따라 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 예는 a = 8; b = 1 및 c = 0, b = 2 및 c = 0, b = 3-5 및 c = 0, 또는 b = 2-3 및 c = 0-3인 것을 포함한다. a, b 및 c에 대한 수는 조절하여 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 본 발명의 방법에 사용될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 엔도뉴클레아제가 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드를 포함하는 위치에서 DNA 폴리머라제(프라이머-신장 스트랜드)를 사용하여 프라이머로부터 신장된 DNA 스트랜드를 인식하거나 절단하는 구조를 갖는다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만 예를 들면, 주형으로서의 핵산에 어닐링된 일반식에 의해 표시된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA 신장에 의해 제조된 더블-스트랜드 DNA에 RAas H를 작용시키는 경우, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 리보뉴클레오티드 부위에서 절단된다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 신장에 의해 합성된 DNA 스트랜드 사이에 닉(nick)이 도입된 더블-스트랜드가 제조된다. 이어서, 닉 부위로부터 DNA 폴리머라제로 스트랜드 치환 반응을 수행한다. 따라서, 프라이머의 3'-말단으로부터 핵산 스트랜드를 신장시키기 위해 사용될 수 있고, 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있고, 그것과 함께 DNA 폴리머라제로 스트랜드 치환시킬 수 있는 어느 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 추가로, 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 3'-말단이 DNA 폴리머라제에 작용에 의한 신장은 발생하지 않고 DNA 신장은 엔도뉴클레아제에 의한 절단시 생성된 3'-말단으로부터 발생하도록 변형되는 것을 포함한다.
추가로, RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열은 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5'-말단측상에 포함될 수 있다. 그러한 RNA 폴리머라제은 T7 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제에 의해 예시된다.
또한, 본 발명의 방법에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 즉, 하나 이상의 뉴클레오티드(들)는 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 3'-말단으로부터의 중합 신장 반응시키는 프라이머의 작용이 제거되지 않는 한 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 포함될 수 있다. 여러 형태의 뉴클레오티드 유사체가 배합되어 사용될 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 뉴클레오티드 유사체의 예로 데옥시이노신 뉴클레오티드, 데옥시우라실 뉴클레오티드, 7-데아자구아닌과 같이 변형된 염기를 갖는 뉴클레오티드 유사체, 리보스 유사체를 갖는 뉴클레오티드 유사체 등을 포함한다. 또한 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 데옥시뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 상기 기술된 작용을 갖는 한 표지된 화합물을 추가하는 것과 같은 다양한 변형을 갖는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 유사체를 프라이머내로 도입하는 것이 프라이머 자체의 고차 구조 생성을 억제하고 주형과의 어닐링 생성을 안정화시키는데 효과적이다. 리보클레오타이드를 동일한 방법으로 프라이머내로 도입할 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, (α-S) 리보클레오타이드와 같이 변형된 리보뉴클레오타이드를 바람직하게 사용하여 비-특이 엔도뉴클레아제(RNase)에 의한 프라이머의 분해를 방지할 수 있다.
예를 들면, 포스포르아미다이트 방법에 따라 어플라이드 바이오시스템사(Appliced Biosystems Inc. (ABI))의 394형 DNA 합성기를 사용하여 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어느 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성할 수 있다. 또한, 포스페이트 트리에스테르 방법, H-포스포네이트 방법 및 티오포스포네이트 방법을 사용하여 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성할 수 있다.
(2) 본 발명에 따라 사용되는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드
데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나는 본 발명의 방법에서 사용되는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드로 바람직하게 사용될 수 있다.
주형으로서의 핵산의 일부의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖고, 주형으로서의 핵산중 상기 (1)에 기술된 키메라성 올리고뉴크레오티드 프라이머가 어닐링하는 부위의 3'측 영역에 어닐링할 수 있는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용될 수 있다. 증폭시키고자 하는 영역의 상류 부위, 즉, 주형으로서의 핵산중 증폭시키고자 하는 부위에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 3' 부위에 상보적이도록 통상 올리고뉴크레오티드를 디자인한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "실질적으로 상보적인 뉴클레오티드서열"은 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서 DNA에 어닐링할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 상류 블럭 올리고뉴크레오티드는 DNA 폴리머라제 작용에 의한 DNA 신장 반응에 사용되지 못하도록 3' 말단에서 변형된다. 상기 언급한 목적을 달성시킬 수 있는 한, 변형 방법과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 그의 예는 디데옥시 뉴클레오티드, 리보오스의 3번 위치의 하이드록실 그룹이 변형된 뉴클레오티드, 또는 입체 장애에 기인하여 DNA 폴리머라제에 의한 신장을 방해하는 변형을 갖는 뉴클레오티드를 3'말단에 첨가하는 것을 포함한다. 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 리보오스의 3번 위치의 하이드록실 그룹을 변형시키기 위하여 알킬화 또는 다른 공지된 변형 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, DNA 신장 반응은 아미노알킬화에 의해 저지될 수 있다.
한개 또는 두개의 상류 블럭 올리고뉴클레오티드는 증폭 후 DNA 단편의 바람직한 형태(싱글-스트랜드 또는 더블-스트랜드)에 따라 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 특히, 한개의 상류 블럭 올리고뉴클레오티드는 싱글-스트랜드 DNA가 바람직한 경우 사용되고, 두개의 상류 블럭 올리고뉴클레오티드는 더블-스트랜드 DNA가 바람직한 경우 사용된다. 부위의 선택을 통해 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열, 증폭시키고자 하는 영역의 길이, 및 배합물로 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어닐링하는 표적 핵산 부위에 따라 달라질 수 있는 최대 증폭 효율을 가져올 수 있는 한, 주형으로서의 핵산중 본 발명의 방법에서 사용되는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드가 어닐링하는 부위와 관련하여 제한하지 않는다. 예를 들면,3' 말단이 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단으로부터 1 뉴클레오티드 이상의 거리에 위치하도록 부위를 선택한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 바람직한 쇄 길이는 관심의 대상이 되는 증폭 단편의 검출 감도의 향상 등의 효과를 얻을 수 있는 한 어느 것일 수 있다.
본 발명을 제한하는 것은 아니지만 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 길이는약 6 뉴클레오티드 내지 약 100 뉴클레오티드, 바람직하게 약 10 뉴클레오티드 내지 약 50 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 약 12 뉴클레오티드 내지 약 40 뉴클레오티드이다. 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 사용되는 반응 조건하에서 주형으로서의 핵산에 어닐링할 수 있도록 실질적으로 주형으로서의 핵산과 상보적인 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 상류 블럭 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 여러 종류의 뉴클레오티드 유사체를 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명에서 사용될 수 있는 뉴클레오티드 유사체는 데옥시이노신 뉴클레오티드, 데옥시우라실 뉴클레오티드, 7-데아자구아닌과 같이 변형된 염기를 갖는 뉴클레오티드 유사체, 리보스 유사체를 갖는 뉴클레오티드 유사체 등을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드는 데옥시뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 다양한 변형을 갖는(예: 표지 화합물의 추가) 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 유사체를 블럭 올리고뉴클레오티드로 도입하는 것이 올리고뉴클레오티드 자체의 고차 구조 생성을 억제하고 주형과의 어닐링 생성을 안정화시키는데 효과적이다.
예를 들면, 포스포르아미다이트 방법에 따라 어플라이드 바이오시스템사(Appliced Biosystems Inc. (ABI))의 394형 DNA 합성기를 사용하여 상류 블럭 올리고뉴클레오티드가 바람직한 뉴클레오티드 서열을 갖도록 합성할 수 있다. 또한, 포스페이트 트리에스테르 방법, H-포스포네이트 방법 및 티오포스포네이트 방법을 포함하는 방법을 사용하여 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
(3) 본 발명에서 사용되는 엔도뉴클레아제
상기 (1)에 기재된 바와 같이 주형으로서의 핵산에 어닐링되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 DNA 신장에 의해 제조된 더블-스트랜드 DNA에 작용하고 스트랜드를 치환시키기 위해 신장된 스트랜드를 절단하는 엔도뉴클레아제를 본 발명에서 사용할 수 있다. 즉, 엔도뉴클레아제는 더블-스트랜드 DNA의 키메라성 올리보뉴클레오티드 부위에 닉을 생성하는 효소이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 엔도뉴클레아제의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 리보뉴클레아제들이다. 이들중에서, DNA 및 RNA로 구성된 더블-스트랜드 핵산의 RNA 부분에 작용하는 엔도리보뉴클레아제 H(RNase H)를 바람직하게 사용할 수 있다. 중온성 및 열-내성의 것을 포함하고, 상기 언급된 활성을 갖는 어느 리보뉴클레아제를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법에서 E.Coli로부터의 RNase H를 약 50℃ 내지 약 70℃에 반응을 위해 사용할 수 있다. 열-내성 리보뉴클레아제를 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용할 수 있다. 바람직하게 사용될 수 있는 열-내성 리보뉴클레아제는 제한하는 것은 아니지만, 상업상 사용가능한 열-내성의 리보뉴클레아제, HybridaseTMThermostable RNase H(Epicenter Technologies) 및 바실러스(Bacillus) 속의 고온성 세균, 써무스(thermus) 속 세균, 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균, 써모토가(Thermotoga) 속 세균, 아키오글로부스(archaeoglobus) 속 세균 등으로부터의 RNase H를 포함한다. 추가로 자연발생된 리보뉴클레아제 및 변이체가 바람직하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 지시되는 RNase H의 효소 유니트는 참조예에 기술되는 바와 같이 효소 유니트 측정 방법에 따라 표시된다.
RNase H는 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 한 특정의 것으로 제한되지 않는다. 예를 들면, RNase H는 다양한 바이러스, 파지, 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 세포성 RNase H 또는 바이러스성 RNase H일 수 있다. 세포성 RNase H는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) RNase HI에 의해 바이러스성 RNase H는 HIV-1에 의해 예시된다. I형, II형 또는 III형 Rnase H는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 RNase HI, 또는 피로코쿠스(Pyrococcus)속 세균 또는 아키오글로부스(archaeoglobus) 속 세균으로부터의 RNase H가 제한되지 않고 바람직하다.
본 발명의 방법에서 사용되는 RNase H와 같은 엔도뉴클레아제를 사용하는 절단 반응의 효율은 프라이머의 3'-말단 주위의 뉴클레오티드 서열에 따라 달라질 수 있고 원하는 DNA의 증폭 효율에 영향을 줄 수 있다. 그러므노, 사용되는 Rase H 를 위해 최적의 프라이머를 작제하는 것이 적절하다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "닉의 도입" 또는 "닉킹(nicking)"은 더블-스트랜드 핵산의 두개의 스트랜드중 하나를 내부적으로 절단하는 것을 의미한다. 예를 들면, RNase H는 DNA 및 리보뉴클레오티드-포함 DNA로 구성된 하이브리드 더블-스트랜드 핵산에 작용하여 두개의 스트랜드중에서 리보뉴클레오티드 부분에서 리보뉴클레오티드-포함 스트랜드를 선택적으로 절단한다.
(4) 본 발명에서 사용되는 DNA 폴리머라제
본 발명에서 DNA상에 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 특히, 실질적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제가 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 스트랜드 치환 활성을 갖는 어느 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있다. 그의 예는 바실러스 칼도테넥스(Bacillus caldotenax)(이하, B. ca로서 언급함) 및 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus)(이하, B. st로서 언급함)와 같은 바실러스 속의 고온성 세균으로부터 유래된, 그들의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 DNA 폴리머라제, 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 DNA 폴리머라제 I의 거대 단편(클레나우 단편)의 변이체를 포함한다. 중온성 및 열-내성 DNA 폴리머라제 둘 모두를 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다.
B. ca는 약 70℃의 최적 성장 온도를 갖는 고온성 세균이다. 이 세균으로부터의 Bca DNA 폴리머라제가 DNA-의존 DNA 폴리머라제 활성, RNA-의존 DNA 폴리머라제 활성(역전사 활성), 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성 및 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다고 공지되어 있다. 효소는 그의 기원으로부터의 정제된 효소 또는 유전 공학 기술에 의해 생산된 재배합 단백질일 수 있다. 효소를 유전 공학 기술 또는 다른 방법을 사용하여 치환, 결실, 첨가 또는 삽입에 의해 변형시킬 수 있다. 변형된 효소의 예는 그의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 Bca DNA 폴리머라제인 Bca BEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 포함한다.
DNA 폴리머라제는 특정 조건하에서 RNase H 활성과 같은 엔도뉴클레아제 활서을 갖는 것으로 공지되어 있다. 그러한 DNA 폴리머라제를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 일면으로, Mn+2의 존재하에서와 같이 RNase H의 활성을 발현시킬 수 있는 조건하에서 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 방법은 RNase H를 가하지 않고 수행될 수 있다. 따라서, Mn+2을 포함하는 완충액에서 Bca DNA 폴리머라제가 RNase 활성을 나타낼 수 있다. 상기 언급한 일면을 Bca DNA 폴리머라제의 사용으로 제한하지 않는다. 써무스 써모필러스(Thermus stearothermophilus)로부터의 Tth DNA 폴리머라제와 같이 RNase H 활성을 갖는 것으로 공지된 DNA 폴리머라제를 본 발명에서 사용할 수 있다.
(5) 본 발명의 표적 핵산을 증폭시키는 방법
상기 (1)에 기술된 적어도 하나의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 상기(2)에 기술된 적어도 하나의 상류 블럭 올리고뉴클레오티드, 상기 (3)에 기술된 엔도뉴클레아제 및 상기 (4)에 기술된 DNA 폴리머라제를 배합하여 사용하므로써 본 발명의 방법을 수행할 수 있다. 다르게는, RNase H 활성을 갖는 DNA 폴리머라제는 상기 기술된 바와 같은 RNase 활성이 나타날 수 있는 조건하에서 사용될 수 있다.
PCR 방법에 사용되는 dNTPs 등(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)등을 방법중에서 신장 반응에서 기질로서 뉴클레오티드 트리포스페이트로서 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, dUTP는 그것이 사용되는 DNA 폴리머라제에 대한 기질로서 작용하는 한 7-데자(deaza)-dGTP와 같은 dNTP(데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트) 유사체를 포함할 수 있다. dNTP 또는 dNTP 유사체의 유도체를 사용할 수 있다. 아미노 그룹을 갖는 dUTP와 같은 작용 그룹을 갖는 유사체를 포함할 수 있다. 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 통상의 합성 방법에 따라 DNA 합성기를 사용하여 프라이머를 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 양은 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열, 증폭시키고자 하는 단편의 길이 및 사용하는 반응 시스템의 조성에 따라 조절될 수 있다. 예를 들면, 양은 증폭 산물의 양을 인덱스로 사용하여 조절할 수 있다. 즉, 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 수득할 수 있는 한 본 발명의 방법에서 사용하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 블럭 올리고뉴클레오티드의 양과 관련하여 특별히 제한하지 않는다.
본 발명에 따라, 관심의 대상이 되는 증폭 산물을 수득할 수 있는 한 본 발명의 방법에서 사용하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 대 블럭 올리고뉴클레오티드의 몰비와 관련하여 특별히 제한하지 않는다.
본 발명의 방법의 한 일면에서, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 대 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 몰비는 예를 들면, 1 : 0.1 내지 1 : 10, 바람직하게 1 : 0.2 내지 1 : 5, 더욱 바람직하게 1 : 0.25 내지 1 : 4이다.
사용되는 효소의 활성이 반응과정에서 감소하는 경우 본 발명의 방법에서 반응하는 동안 추가로 효소를 가할 수 있다. 첨가된 효소는 반응 시작시 반응 혼합물에 포함된 것과 동일할 수 있거나 동일한 활성을 보이는 상이한 효소일 수 있다. 따라서, 첨가되는 효소의 타입 또는 성질은 반응시 첨가가 검출 감수성의 증가 또는 증폭 산물 양의 증가와 같은 효과를 제공하는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다.
본 발명의 방법에서 주형으로서 사용되는 핵산(DNA 또는 RNA)은 핵산을 포함할 수 있는 어느 샘플로부터 분리하거나 제조할 수 있다. 또한, 샘플은 본 발명에 따른 핵산 증폭 반응에서 직접 사용할 수 있다. 핵산을 포함할 수 있는 샘플의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 전체 혈액, 혈청, 백혈구층(buffy coat), 소변, 대변, 뇌척수액, 정액, 침, 조직(예: 종양 조직 또는 림프절) 및 세포 배양액(예: 포유류 세포 배양액 또는 박테리아성 세포 배양액)과 같이 유기체로부터의 샘플, 비로이드(viroid), 바이러스, 박테리아, 진균, 효모, 식물 및 동물과 같이 핵산을 포함하는 샘플, 바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물로 오염되거나 감염감염된 것으로 예측되는 샘플(예; 식품 또는 생물학적 제제), 및 토양 및 폐수와 같이 유기체를 포함할 수 있는 샘플을 포함한다. 상기 샘플은 공지된 방법에 따라 상기 기재된 바와 같은 샘플을 공정화하여 수득된 핵산을 함유하는 샘플(preparation)일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 샘플의 예는 세포 파괴 산물 또는 상기 산물을 분별하여 수득한 샘플, 샘플중에 핵산, 또는 mRNAs가 풍부한 샘플과 같은 특이적인 핵산 분자들을 포함한다. 또한, 샘플중에 포함된 핵산을 공지된 방법에 따라 증폭시켜 수득한 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 바람직하게 사용할 수 있다.
핵산을 포함하는 샘플을 제한하지 않고, 예를 들면, 세제를 사용하는 세포 용해, 초음파 처리, 글래스 비드 또는 프렌치 프레스(French press)를 사용하는 진탕/교반을 사용하여 상기 언급된 물질로부터 제조할 수 있다. 일부 경우에는, 추가로 샘플을 공정하여 핵산을 정제하는 것이 유리하다(예: 엔도뉴클레아제가 존재하는 경우). 그러한 경우에, 핵산은 공지된 방법, 예를 들면, 페놀 추출, 크로마토그래피, 이온 교환, 겔 전기 영동 또는 밀도-구배 농축에 의해 정제된다.
RNA로부터 유래된 서열을 갖는 핵산을 증폭시켜야 하는 경우, 주형으로서 RNA를 사용하는 역전사반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로서 사용하여 본 발명의 발명을 수행할 수 있다. 샘플중에 mRNA, tRNA 및 rRNA와 같은 RNA 분자 및 특이 RNA 종을 포함하여, 역전사 반응용 프라이머를 제조할 수 있는 어느 RNA도 본 발명의 방법에 적용될 수 있다.
사용되는 조건하에서 주형으로서의 RNA에 어닐링하는 어느 프라이머를 역전사 반응에서 사용할 수 있다. 프라이머는 주형으로서의 특정 RNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머(특정 프라이머), oligo-dT (데옥시티민) 프라이머 및 랜던 서열을 갖는 프라이머(랜덤 프라이머)일 수 있다. 특정한 어닐링과 관련하여, 역전사를 위한 프라이머의 길이는 바람직하게 6 뉴클레오티드 이상, 더욱 바람직하게 9 뉴클레오티드 이상이다. 올리고뉴클레오티드 합성과 관련하여, 상기 길이는 바람직하게 100 뉴클레오티드 이하, 더욱 바람직하게 30 뉴클레오티드 이하이다. 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 역전사를 위한 프라이머로서 사용할 수 있다. 역전사후 수득한 cDNA를 주형으로서 사용하는 본 발명의 핵산 증폭 방법에서 스트랜드 치환 반응을 위한 프라이머로서 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 바람직하게 사용할 수 있다. 이 프라이머는 상기 (1)에 기술한 성질을 갖고 RNA로부터 역전사 반응에서 사용될 수 있는 것일 수 있다. 그의 예는 다양한 원으로부터 기원한 역전사효소, 예를 들면, 조류 골수아세포증바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase(AMV RTase)), 마우스 백혈병 바이러스-유래된 역전사 효소( murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase(MMLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전자 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase(RAV-2 RTase)를 포함한다. 또한, 역전사효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용할 수 있다. 써모스속 박테리아로부터의 DNA 폴리머라아제(예: Tth DNA 폴리머라아제) 및 바실러스(Bacillus)속의 고온성 박테리아로부터의 DNA 폴리머라아제와 같이 고온에서 역전사 활성을 갖는 어느 효소가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, B. st로부터의 DNA 폴리머라아제(Bst DNA 폴리머라아제) 및 B. ca로부터의 DNA 폴리머라아제(Bca DNA 폴리머라아제)와 같은 바실러스(Bacillus)속의 고온성 박테리아로부터의 DNA 폴리머라아제가 바람직할 수 있지만, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 예를 들면, Bca DNA 폴리머라아제는 역전사 반응을 위해 마그네슘 이온을 필요로하지 않는다. 또한, 그것은 고온 조건하에서 주형으로서 RNA의 2차 구조 생성을 억제시키면서 cDNA를 합성할 수 있다. 역전사 효소활성을 갖는 천연의 것 및 상기 효소의 변이체는 그들이 상기 활성을 갖는 한 사용될 수 있다.
또다른 일면으로, 앞서 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA를 복제시킨 후, 복제 산물을 본 발명의 방법에서 주형 핵산으로서 사용할 수 있다. 복제 방법의 예는 제한하는 것을 아니지만, 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편이 삽입된 벡터로 적절한 숙주를 형질전환시키고, 생성된 형질전환체를 배양하고, 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편이 삽입된 벡터를 그로부터 추출하고 사용하는 방법이다. 백터는 숙주에서 안정하게 복제되는 한 어느 것일 수 있다. 예를 들면, pUC 시리즈, pBluescript 시리즈, pGEM 시리즈, 코스미드 타입 벡터 및 파지 타입 벡터가 바람직하게 사용된다. 숙주는 사용하는 벡터를 유지시킬 수 있는 한 어느 것일 수 있다. 예를 들면, 숙주는 용이하게 배양되는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 의해 예시된다.
복제 반응의 또다른 일면에서, 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA를 RNA 폴리머라제 및 주형으로서 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편을 사용하여 전사시킨 후, 본 발명의 방법을 위한 주형으로서 RNA를 직접 사용할 수 있거나, 역전사 반응에 의해 cDNA로 전환시킨 후 사용할 수 있다. 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편은 그것이 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 벡터내로 삽입하고, 그의 말단에 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 아댑터 또는 카세트와 결찰시키거나 적절할 주형 및 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 효소적으로 합성할 수 있다. 따라서, 증폭시키고자 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 단편은 상기 기술된 바와 같이 위치하는 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 사용하여 RNA 형태로 복제되거나 증폭될 수 있다. 벡터는 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 갖는 한 어는 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, pUC 시리즈, pBluescript 시리즈, pGEM 시리즈, 코스미드 타입 벡터 및 파지 타입 벡터가 바람직하게 사용된다. 벡터는 바람직하게 환상 형태로 또는 선형화된 후 사용될 수 있다. RNA 폴리머라제는 복제 또는 증폭 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, SP6 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제 등을 바람직하게 사용할 수 있다.
상기와 같이 분리된 게놈 DNA 또는 PCR 단편과 같은 더블-스트랜드 DNA, 및 총 RNA 또는 mRNA로부터의 역전사 반응에 의해 제조된 cDNA와 같은 싱글-스트랜드 DNA 둘 모두, 및 DNA 및 RNA로 구성된 하이브리드 더블 스트랜드를 본 발명에서 주형 DNA로서 바람직하게 사용할 수 있다. 더블-스트랜드 DNA는 그것을 싱글-스트랜드 DNA로 변성시킨 후 사용하거나 변성시키기 않고 사용하는 것이 바람직하다.
즉, 본 발명의 방법은 변성 단계를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 일면에서, RNA로부터의 서열을 갖는 핵산을 증폭시키고자 하는 경우, 증폭 반응은 주형으로서 RNA를 사용하는 역전사 반응에 의해 수득한 RNA-cDNA 더블-스트랜드 핵산을 RNase H를 포함하는 본 발명의 증폭 반응 혼합물에 가하여 RNA 스트랜드를 분해하고 핵산을 싱글-스트랜드 cDNA로 전환시키는 것으로 개시한다. 또한, 주형으로서 RNA를 사용하는 역전사 반응 및 역전사 반응에 의해 생성된 cDNA를 사용하는 DNA 증폭 반응은 본 발명의 DNA 합성 방법에서 하나의 DNA 폴리머라제를 사용하여 수행할 수 있다. 그러한 DNA 폴리머라제는 역전사 효소 활성 및 스트랜드 치환 활성을 갖는다.
더블-스트랜드 DNA를 싱글-스트랜드 DNAs로 변성시키거나, RNA를 주형으로서 사용하는 경우, 역전사 반응에 의해 cDNA(싱글-스트랜드 DNA)를 제조한 후, 순차적으로 등온 조건하에서 뉴클레오타이드 서열을 증폭시킨다.
"순차적으로"는 반응 온도 또는 반응 혼합물의 조성을 변화시키지 않고 반응을 수행하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "등온"은 실직적으로 그 온도하에서 각 단계에서 효소 및 핵산 스트랜드가 작용하는 상온(constant temperature) 조건을 의미한다.
본 발명의 핵산 증폭 반응은 클레나우 단편과 같은 중온성 DNA 폴리어라아제를 사용하여 표준 온도(예: 37℃)에서 수행할 수 있다. 또한, 그것은 열-내성효소(엔도뉴클레아제 또는 DNA 폴리어라아제)를 사용하여 고온 온도(예: 50℃ 이상)에서 수행할 수 있다. 이러한 경우, 프라이머의 비특이적 어닐링은 억제되어 DNA 증폭의 특이성은 증가한다. 또한, 주형으로서 DNA의 2차 구조 생성의 문제점을 해결함으로써, DNA 폴리머라아제의 신장 능력을 증가시킨다. 일례에서, 본 발명에서 역전사 반응 및 뉴클레오타이드 서열 증폭을 순차적으로 수행할 수 있다. 이러한 경우, 역전사 효소를 상기 언급된 반응과 사용하거나 역전사 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 RNA로부터 유래된 서열을 갖는 DNA를 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 각 일면에서, 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 바람직하게, 주형으로서의 DNA에 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 상류 블럭 올리고뉴클레오티드는 DNA에 어닐링하다. 이어서 주형으로서의 DNA에 상보적인 DNA(프라이머-신장 스트랜드)는 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3' 말단으로부터 주형으로서의 DNA의 남은 서열을 따라 신장된다. 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머로부터 신장된 스트랜드는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머에 실질적으로 상보적인 주형으로서의 핵산의 3' 영역의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 주형으로서의 핵산에 어닐링하여 차단한다. 결과, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어닐링하는 비선형 증폭을 위한 주형은 본 발명의 방법중 초기 반응 단계에서 증폭된다. 초기 증폭 반응은 본 발명의 방법의 증폭 효율을 증가시킨다. 결과적으로 표적 핵산의 검출 감수성은 증대된다.
본 발명의 일면에서, 엔도뉴클레아제는 본 발명으로 이론으로서 제한하는 것은 아니지만, 닉을 더블-스트랜드 DNA내로 도입하거나 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 주혀으로서의 DNA로 구성된 더블-스트랜드 DNA의 구조를 변형시키는 닉 효소로서 작용한다. 엔도뉴클레아제는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 주형으로서 DNA로 구성된 더블-스트랜드 DNA의 구조를 변경시킬 수 있다.
스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제는 닉의 3'-말단의 하류에서 DNA를 분리시키면서 더블-스트랜드 DNA중에 도입된 닉의 3'-말단으로부터 DNA 스트랜드를 재-신장시킨다. 따라서, 신규의 프라이머-신장된 스트랜드가 앞서 합성된 프라이머-신장된 스트랜드를 대신한다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 한 쌍의 프라이머 및 한 쌍의 블럭 올리고뉴클레오티드, 즉, 주형으로서의 핵산에 상보적인 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 상류 블럭 올리고뉴클레오티드 및 치환된 스트랜드에 상보적인 또다른 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 또다른 상류 블럭 올리고뉴클레오티드을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 경우, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 더블-스트랜드 DNA에 결합하여 각각의 상보적인 스트랜드를 합성하고, 및 상류 블럭 올리고뉴클레오티드는 각각의 상보적인 스트랜드에 어닐링하여 상류 블럭 올리고뉴클레오티드가 어닐링하는 부위에서 각각의 상보적인 스트랜드가 서로 어닐링하는 것을 차단하는 것으로 판단된다. 또한, 주형 스위치 반응은 신장 반응과 동시에 진행되는 것으로 고려된다. 이점을 사용하는 경우 하나의 프라이머를 포함하는 반응 산물이 또다른 프라이머에 대한 주형으로서 작용할 수 있다는 것은 확실하다. 따라서, 증폭 산물의 양은 주형의 양이 증가함에 따라 비선형 방식으로 증가한다.
주형으로서 더블-스트랜드 DNA를 사용하여 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 증폭 방법을 수행하는 경우, 각각 두개의 스트랜드에 어닐링하는 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭 반응에서 주형으로서 두개의 스트랜드를 사용할 수 있다. 주형으로서 더블-스트랜드 DNA를 사용하여 반응을 개시하는 경우, 키메라성 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 상류 블럭 올리고뉴클레오티드, 4개의 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTPs), DNA 폴리머라아제 및 엔도뉴클레아제를 반응 혼합물에 첨가한다. 더블-스트랜드 DNA를 변성시키기 위해 열처리를 사용하고 열-내성 효소를 사용하지 않는 경우, 변성 후 효소를 첨가하는 것이 바람직하다.
주형으로서의 더블-스트랜드 DNA, 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 두개의 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 본 발명의 핵산 증폭 방법의 일면에서, 반응 조건 등에 프라이머로부터의 신장반응 과정에서 주형-신장 스트랜드 중간체중 주형이 스위치되어 서로 어닐링하는 합성된 프라이머-신장 스트랜드로 구성된 더블-스트랜드 핵산을 생성할 수 있다. 더블-스트랜드 핵산은 양 끝에 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 갖는다. 이어서, 스트랜드 치환을 포함하는 상보적인 스트랜드 신장 반응은 다시 양 끝에서부터 시작될 수 있다. 반응 결과, 한쪽 끝에 프라이머 서열을 갖는 증폭 산물이 생성된다. 또한, 반응시 주형 이 스위치되는 경우 상기 기술된 것과 유사한 더블-스트랜드 핵산이 다시 생성된다.
본 발명은 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형 스위치 반응을 발생시키는 것을 포함하는 핵산 증폭 방법을 제공한다. 주형으로서의 더블-스트랜드 핵산,각 스트랜드의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 두개의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 두개의 상류 블럭 올리고뉴클레오티드 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제의 존재하의 주형 스위치 반응에서 주형에 상보적인 두개의 프라이머-신장 스트랜드를 합성한다. 주형으로부터 다른 프라이머-신장 스트랜드로의 프라이머-신장 스트랜드 각각의 주형 스위치는 프라이머-신장 스트랜드 합성시 발생한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 주형 스위치 반응은 상보적인 스트랜드가 더블-스트랜드 핵산의 양 측으로부터 스트랜드 치환 반응에 의해 합성될 때, DNA 폴리머라제가 주형을 스위치하고 이후 또다른 DNA 폴리머제에 의해 새로 합성된 다른 상보적 스트랜들 주형으로서 사용하여 상보적 스트랜드를 합성하는 반응을 언급한다. 즉, 주형 스위치 반응은 주형으로서의 더블-스트랜드 핵산을 프라이머 및 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형에 상보적인 신장 스트랜드를 생성하고, 여기에서 프라이머-신장 스트랜드를 합성하는 DNA 폴리머라제는 신장 스트랜드 합성시 원(orginal) 주형으로부터 다른 프라이머-신장 스트랜드로 주형을 활발하게 스위치하는 방법을 언급한다.
스트랜드 치환 반응시 주형 스위치 반응을 일으킬 수 있는 DNA 폴리머라제를바람직하게 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들면, 특히 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 BcDNA 폴리머라제의 변이 효소를 사용한다. 상기 효소는 Bca BEST DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)로서 상업적으로 이용할 수 있다. 또한, 일본 특허 제2978001 호에 기술된 바와 같은 방법에 따라 상기 효소에 대한 유전자를 포함하는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) HB101/pUI205(FERM BP-3720)으로부터 제조할 수 있다.
본 발명의 증폭 방법에서, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머-신장 스트랜드는 리보뉴클레오티드를 포함하는 위치에서 절단되어 절단에 의해 생성된 5'단편(프라이머 부분)이 리보뉴클레오티드를 포함하지 않도록 할 수 있다. 생성된 프라이머 부분으로부터 신장된 프라이머-신장 스트랜드는 더이상 엔도뉴클레아제에 의해 절단되지 않는다. 결과적으로 그의 말단에 프라이머 서열을 갖는 증폭 산물이 생성된다.
상기 기술된 바와 같이, 프라이머 서열을 갖지 않는 증폭 산물 및 한쪽 끝 또는 양 끝에 프라이머 서열(들)을 갖는 증폭 산물이 본 발명의 증폭 방법에서 생성될 수 있다. 이 산물이 본 증폭 산물에 포함된다.
키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 본 발명의 핵산 증폭 방법에서, 증폭시키고자 하는 영역이 서로 연결된 폴리머가 생성될 수 있다. 폴리머는 증폭시키고자 하는 다수의 영역이 동일한 방향으로 반복된 구조를 갖는다. 폴리머는 증폭 산물의 전기영동 분석시 래더 밴드(laddered band)로서 관찰된다. 폴리머 생성은 증폭시키고자 하는 영역, 영역의 크기, 측면 영역, 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열, 반응 조건 등에 의해 영향을 받는 것으로 판단된다.
상기 기재된 바와 같이 폴리머는 증폭시키고자 하는 다수의 영역을 포함한다. 예로서, 폴리머는 적절한 프로브를 사용하여 하이브리드화시키는 경우 다수의 프로브와 하이브리드하고 강한 시그날을 발생시키기 때문에 증폭시키고자 하는 영역을 포함하는 핵산을 검출하고자 하는 경우 유용하다. 증폭시키고자 하는 영역 또는 그의 일부는 제한 효소 등에 의한 분해에 의해 모노머로서 또는 그의 배합물로서 폴리머로부터 수득될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 DNA 폴리머라아제는 앞서 신장된 DNA 스트랜드를 치환하면서 프라이머 부위의 3' 말단으로부터 하류 방향으로 신장 스트랜드를 합성하여야 한다. DNA 폴리머라아제는 치환된 스트랜드을 분해할 수 있는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내지 않는 것이 중요하다. 예를 들면,E. coli로부터의 DNA 폴리머라아제 I의 에고뉴클레아제-결핍 변이체인 클레나우 단편, Bst DNA 폴리머라아제로부터 유래된 유사한 단편(New England Biolabs), 및 B. ca로부터의 Bca BEST DNA 폴리머라아제(Takara Shuzo)를 그러한 DNA 폴리머라아제로서 사용한다. 시쿼나아제(Sequenase) 1.0 및 시쿼나아제 2.0(United States Biochemical), 및 (Gene, 97:13-19(1991))에 기재된 T5 DNA 폴리머라아제 및 φ29 DNA 폴리머라아제를 또한 사용할 수 있다. 적절한 억제제를 첨가하여 활성을 억제시키는 경우, 일반적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라아제를 DNA 합성 방법에서 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 다양한 온도 또는 등온에서 수행될 수 있다. 다양한 온도는 각 단계에서의 변화가 반응을 방해하지 않도록 각 단계를 위해 반응 온도를 변화시키는 것을 의미한다. 특히, 다양한 온도는 예를 들면, 프라이머의 어닐링, 상보적 스트랜드의 합성 반응, 상보적 스트랜드의 닉킹(nicking) 및 치환 반응의 각각에 적절한 온도의 변화를 언급한다.
한편, 등온은 각 단계에 대한 반응 온도는 불변하고 각 단계를 실질적으로 상온(constant temperature)에서 수행하는 것을 의미한다. 둘 모두의 경우에서 반응 조건을 최적화하기 위해 온도를 선택하는 것이 적절하다.
본 발명의 핵산 증폭 방법의 하나의 특성은 상기 방법은 핵산 합성동안 온도를 상하로 조정할 필요가 없다는 것이다. 따라서, 본 발명은 등온으로 핵산을 합성하는 방법을 제공하는 것이다. 다수의 통상적인 핵산 증폭 방법은 합성된 스트랜드로부터 표적을 해리시키기 위하여 온도를 상하로 조절하는 것을 필요로 한다. 이들 방법은 이 목적을 위해 열 싸이클러(thermal cycler)와 같은 특별한 반응 장치를 필요로 한다. 그러나, 본 발명의 방법은 단지 온도를 일정하게 유지시킬 수 있는 장치만을 사용하여 수행된다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 단일 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 프라이머의 비-특이적인 어닐링을 감소시키고 프라이머가 특이적으로 주형으로서 뉴클레오타이드 서열에 어닐링할 수 있도록 반응 온도 및 엄격한(stringency) 수준을 선택하여 수행한다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법은 상기 기재된 열-내성 효소를 사용하여 고온 조건하에서 수행될 수 있다. 또한, 사용되는 효소의 활성을 충분히 유지하기 위한 적절한 온도에서 본 발명의 방법을 수행하여 반응 효율을 고수준으로 유지시키는 겻이 바람직할 수 있다. 따라서, 반응 온도는 사용되는 효소에 따라 달라질 수 있지만, 바람직하게, 20℃ 내지 약 80℃, 더욱 바람직하게 약 30 ℃ 내지 약 75℃, 가장 바람직하게 약 50℃ 내지 약 70℃이다. 특히, 고온 조건하에서 반응을 수행하는 경우, 표준 온도하의 반응을 위한 것보다 좀 더 긴 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 55℃ 내지 60℃ 또는 65℃의 반응 온도를 사용하는 경우, 본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머의 길이는 예를 들면, 제한하지 않고, 약 6 내지 약 100 뉴틀레오타이드, 바람직하게 약 10 내지 약 50 뉴틀레오타이드, 더욱 바람직하게 약 12 내지 약 40 뉴클레오타이드이다. 반응 온도를 승온시킴으로써 얻은 효과의 예는 주형으로서 DNA의 2차 구조 형성의 문제를 해결한 것이다. 높은 GC 함량을 갖는 핵산을 주형으로서 사용하여도, 반응 온도를 승온시킴으로써 원하는 핵산을 증폭시킬 수 있다. 또한, 그것은 유사하게 장쇄의 영역을 증폭시키는데 효과적이다. 그러한 효과는 약 60bp 내지 약 20 kbp 사이, 특히 약 60bp 내지 약 4.3 kbp 사이, 더욱 바람직하게 약 60bp 내지 약 1500 bp 사이 범위에서 관찰된다.
본 발명의 방법에서 역전사 효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제(예: Bca BEST DNA 폴리머라아제)를 사용하여 단지 하나의 효소만을 사용하여 통상적으로 수행될 수 있는, RNA로부터 cDNA를 제조하는 단계(역전사 반응)를 포함하는 RNA로부터 핵산 증폭시킬 수 있다. 또한, RNA로부터 뉴클레오타이드 서열을 증폭시키는 단계를 독립적으로 수행하여 수득한 산물, 즉, cDNA를 본 발명의 방법에서 주형으로서 DNA로서 사용할 수 있다.
각 경우에서, 적절한 방법, 예를 들면, 효소를 불활성시키거나 반응 온도를 낮추어 그것이 종결될 때까지, 또는 반응에서 반응물중 하나가 부족할 때까지 본 발명의 방법에서 반응을 반복한다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 핵산 검출, 표지화 및 서열화를 포함하는 핵산 증폭을 이용하는 다양한 실험 방법에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 증폭 방법은 인시츄(in situ) 핵산 증폭 방법, DNA 칩과 같은 고체 기질상의 핵산을 증폭시키는 방법, 또는 다수의 영역을 동시에 증폭시키는 멀티플렉스 핵산 증폭 방법을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상류 블럭 올리고뉴클레오티드는 또다른 프라이머에 대하여 과량의 하나의 프라이머를 사용하여 증폭 반응을 수행하는 소위 비대칭 핵산 증폭 방법에서 사용할 수 있다.
본 발명의 핵산 증폭 방법에 따라, 그의 상보적인 스트랜드가 실질적으로 결핍된 싱글-스트랜드 DNA를 제조할 수 있다. 예를 들면, DNA 칩과 같이 고정하고자 하는 핵산을 갖는 물질을 제조하기 위한 싱글-스트랜드 DNA, 표적 핵산 을 검출하기 위한 싱글-스트랜드 DNA 프로브, 또는 장쇄 PCR 방법용 메가-프라이머(mega-primer)를 단시간에 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 단지 센스 서열(sense sequence) 또는 안티센스 서열(anti sense sequence)을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 센스 서열 또는 안티센트 서열을 갖는 핵산을 제조하는 방법으로서 유용하다.
Bicine, Tricine, HEPES, 포스페이트 또는 트리스 완충액에서 본 발명의 방법을 수행하여 주형으로서의 핵산이 미량이 경우에도 관심의 대상이 되는 영역을 증폭시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 증폭 방법은 시간 경과에 따라 온도를 조정할 수 있는반응 장치의 사용을 필요로 하지 않는다. 그러므로, 증폭 반응은 대량의 반응 혼합물중에서 수행될 수 있다. 따라서, 핵산(예: 의료용)을 대량으로 산업적으로 생산할 수 있다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 주형 핵산의 뉴클레오티드 서열에 고도로 동일한 증폭 산물을 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에서 DNA 합성의 오차 빈도수를 생성된 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 확인했을 때, 본 발명의 방법에 의해 수득횐 증폭 산물에서 발견된 오차 빈도수는 고도로 동일하게 증폭시킬 수 있는 것으로 공지된 LA-PCR에 의한 것과 동일하였다. 다시 말해, 본 발명의 방법은 LA-PCR의 것과 동일한 고도의 동일성을 갖는다.
(6) 본 발명의 키트
본 발명은 상기 기술된 본 발명의 핵산 증폭 방법을 위한 키트를 제공한다. 일례에서, 키트는 패키지 형태(packaged form)이고 스트랜드 치환 반응에서 DNA 폴리머라아제, 엔도뉴클레아제, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 사용과 관련된 안내서를 포함한다. 또한, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제, 엔도뉴클레아제, 및 스트랜드 치환 반응용 완충액을 포함하는 키트가 본 발명의 방법에서 바람직하게 사용된다. 또한, 상업적으로 사용가능한 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제 및/또는 엔도뉴클레아제을 안내서에 따라 선택하고 사용할 수 있있다. 또한, RNA를 주형으로서 사용하는 경우, 키트는 사용되는 역전사 반응용 시약을 포함할 수 있다. DNA 폴리머라아제는 상기 (4)에 기재된 바와 같이 본 발명에서 사용되는 DNA 폴리머라아제들로부터 선택될수 있다. 엔도뉴클레아제는 상기 (3)에 기재된 바와 같은 엔도뉴클레아제들로부터 선택할 수 있다.
"안내서"는 키트 사용법, 예를 들면, 스트랜드 치환 반응용 시약 용액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 키트는 어닐링 용액 및 완충 성분으로서 Bicine, Tricine, HEPES, 포스페이트 또는 tris를 포함하는 반응 완충액을 포함할 수 있다. 또한 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제 및 RNase H를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체를 포함할 수 있다.
표적 핵산 검출 방법에 사용되는 키트는 상기 기술한 바와 같은 증폭 반응용 시약 및 안내서외에 표적 핵산 증폭을 위한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 상류 블럭 올리고뉴클레오티드 및 프로브로서 증폭된 표적 핵산을 검출하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명의 키트들은 상기 기술한 바와 같은 본 발명에서 사용되는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 상류 블럭 올리고뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 프로브를 포함하는 키트를 포함한다.
(7) 본 발명의 조성물
본 발명은 상기 기술된 바와 같은 본 발명의 핵산 증폭 방법 또는 본 발명의 핵산 검출 방법에 사용되는 조성물을 제공한다. 예를 들면, 조성물은 상기 (1)에 기술된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 상기 (2)에 기술된 상류 블럭 올리고뉴클레오티드, 상기 (3)에 기술된 엔도뉴클레아제 및 상기 (4)에 기술된 DNA 폴리머라제를 포함할 수 있다. 추가로, 본 조성물은 증폭 반응을 위한 성분으로서 완충 성분, 마그네슘염 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 또한, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 유사체를 포함할 수 있다. 추가로, 완충 성분 및 다른 첨가제를 사용할 수 있다.
특히 바람직한 일면으로, 조성물은 본 발명의 핵산 증폭 반응에 대하여 상기 열거된 다양한 성분들을 적절하게 포함할 수 있다. 증폭 반응은 적절한 주형, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머(들) 및 상류 블럭 올리고뉴클레오티드(들)을 조성물에 가하여 수행될 수 있다. 증폭시키고자 하는 목적물이 이미 공지되어 있는 경우 조성물은 바람직하게 목적물을 증폭시키기에 적절한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머(들)을 포함한다.
(7) 본 발명의 핵산 검출 방법
본 발명의 핵산 증폭 방법을 사용하여 샘플중 표적 핵산을 검출할 수 있다. 검출은 하기 방법을 포함한다:
(a) 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 핵산 증폭 방법에 의해 표적 핵산을 증폭시키고;
(b) 상기 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출한다.
상기 (a) 단계에서, RNA를 주형으로서 사용하는 경우, 역전사 반응 및 핵산 증폭 반응을 하나의 단계로 수행할 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 예를 들면 예로서, AMV RTase, MMLV RTase 또는 RAV-2 RTase 및 BcDNA 폴리머라제의 배합물을 리버스 트랜스크립타제 및 스트랜드 치환형 DNA 폴리머라제의 배합물로서 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명을 사용하여 샘플중에 특이적 유전자를 검출하거나 측량화할 수 있다. 즉, 특이적 유전자는 검출하거나 측량화된 형태이다. 즉, DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 포함할 것으로 예측되는 모든 샘플로부터 특이적 유전자를 검출하거나 측량할 수 있다. 특이적 유전자가 검출하거나 측량화될 수 있는 샘플의 예는, 제한하는 것은 아니지만, 전체 혈액, 혈청, 백혈구층, 소변, 대변, 뇌척수액, 정액, 침, 조직(예: 종양 조직 또는 림프절) 및 세포 배양액(예: 포유류 세포 배양액 또는 박테리아성 세포 배양액)과 같은 유기체로부터의 샘플, 비로이드, 바이러스, 박테리아, 균류, 효모, 식물 및 동물과 같은 핵산을 포함하는 샘플, 바이러스 또는 박테리아와 같은 미생물로 오염되거나 감염된 샘플(예; 식품 또는 생물학적 제제), 및 토양 및 폐수와 같은 유기체를 포함할 수 있는 샘플을 포함한다. 예를 들면, 샘플중의 비로이드, 바이러스, 박테리아, 균류 또는 다른 미생물은 표적으로서 비로이드, 바이러스, 박테리아, 진균 또는 다른 미생물로부터 유래된 특이적 유전자의 존재 또는 함량에 기초하여 검출 또는 측량화될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 유기체의 유전자형을 식별하거나 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다. RNA 및 DNA 둘 모두를 검출 방법에서 주형으로서의 핵산으로 바람직하게 사용할 수 있다.
추가로, 본 발명의 표적 핵산 검출 방법은 표적 핵산의 유전자 다형성을 분류하는 방법으로 사용될 수 있다.
본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 프라이머의 3' 말단 부위를 식별하고자 하는 표적 뉴클레오티드 서열의 특정 염기에 근접하게 위치하도록 사용하고자 하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인한다. 예를 들면, 수소 결합이 염기와 프라이머의 3' 말단 염기 상이에 형성되도록 디자인한다. 프라이머의 3'-말단 부위의 뉴클레오티드 서열 및 주형의 뉴클레오티드 서열 주형사이가 일치하지 않는 경우, 표적 핵산으로부터 증폭은 발생하지 않고 상기 언급한 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭 산물은 생성되지 않는다. 점돌연변이(point mutation) 또는 단일염기변이 (SNP)와 같은 유전자의 특정 염기와 관련된 정보를 상기 방법을 사용하여 수득할 수 있다.
유사하게, 본 발명의 방법을 결실 돌연변이 또는 삽입 돌연변이와 같은 유전자 다형성을 분류하는 방법으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 상류 블럭 올리고뉴클레오티드 PCT/JP02/01222에 기술된 바와 갖이 유전자 다형성을 분류(typiing)하는 방법에서 사용할 수 있다.
일례로,
(1) (A) DNA 폴리머라제에 의해 말단으로부터 신장되지 못하도록 3' 말단에서 변형되고;
(B) 표적 핵산중 특정 염기를 포함하는 영역에 어닐링할 수 있는 염기서열을 갖고;
(C) 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 컴플렉스에서 특정 염기와 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기가 서로 일치하지 않는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않고, 특정 염기와 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기가 서로 일치하는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되어 새로운 3' 말단을 생성하는 서열을 포함하는 뉴클레오티드와 표적 핵산을 포함하는 샘플을 혼합하고;
(2) 상기 혼합물을 뉴클레아제 및 및 DNA 폴리머라제로 처리하고;
(3) 뉴클레아제로 뉴클레오티드의 절단 여부를 검출하는 것을 포함하는, 표적 핵산중 유전자 다형성을 분류하는 방법에서 본 발명에 따른 상류 블럭 올리고뉼뉴클레오티드는 이 뉴클레오티드와 배합되어 사용될 수 있다.
또다른 일면으로,
(1) (A) DNA 폴리머라제에 의해 말단으로부터 신장되지 못하도록 3' 말단에서 변형되고;
(B) 표적 핵산중 특정 염기를 포함하는 영역에 어닐링할 수 있는 염기 서열을 갖고;
(C) 뉴클레오티드 및 표적 핵산으로 구성된 컴플렉스에서 특정 염기와 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기가 서로 일치하지 않는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않고, 특정 염기와 뉴클레오티드중 특정 염기에 상응하는 염기가 서로 일치하는 경우, 뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 절단되어 새로운 3' 말단을 생성하는 서열을 포함하는 뉴클레오티드와 표적 핵산을 포함하는 샘플을 혼합하고;
(2) 상기 혼합물을 뉴클레아제 및 및 DNA 폴리머라제로 처리하고;
(3) 뉴클레아제로 뉴클레오티드의 절단 여부를 검출하는 것을 포함하는, 표적 핵산중 유전자 다형성을 분류하는 방법에서 본 발명에 따른 상류 블럭 올리고뉼뉴클레오티드는 배합되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, "유전자 다형성"은 동일한 유기체 군집내 개체간의 유전자 뉴클레오티드 서열상의 차이를 언급한다. "유전자 다형성"을 구성하는 뉴클레오티드 서열상의 차이는 특정의 형태로 제한하지 않지만, "염기 치환", "결실 돌연변이" 및 "삽입 돌연변이"와 같은 다양한 형태를 포함한다. 유전자 정보상의 상이를 변이라 명명한다.
"염기 치환"은 핵산중 특정 위치의 뉴클레오티드가 또다른 뉴클레오티드로 치환된 것을 언급한다. "염기 치환"은 "단일염기변이(SNP)"을 포함한다.
"결실 돌연변이"는 핵산중 특정 위치의 뉴클레오티드가 부분적으로 또는 전체적으로 결실된 것을 언급한다.
"삽입 돌연변이"는 핵산중 특정 위치에 임의 길이의 뉴클레오티드 서열 쇄가 삽입된 것을 언급한다.
상기 언급한 일면에서 본 발명에 따른 블럭 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산중 뉴클레오티드의 상류 부위에 어닐링한다. 결과 표적 핵산중 유전자 다형성의 분류시 검출 감수성은 본 발명의 표적 핵산 증폭 방법에서 증대될 수 있다.
본 발명의 표적 핵산 검출 방법은 핵산을 포함하는 샘플로부터 표적 핵산을 직접 증폭시켜 수행될 수 있다. 이러한 경우, 증폭시키고자 하는 표적 핵산의 쇄 길이는 특정의 것으로 제한하지 않는다. 예를 들면, 200bp 이하, 바람직하게 150bp 이하의 영역이 표적 핵산의 고감도 검출에 효과적이다. 상기 기술된 바와 같이 증폭시키고자 하는 쇄 길이로 생성될 수 있도록 본 발명의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하여 샘플중 표적 핵산을 고감도로 검출할 수 있다.
추가로, 완충 성분으로서 Bicine, Tricine, HEPES, 포스페이트 또는 트리스를 포함하는 반응 완충액 및 스퍼미딘 또는 프로필렌디아민을 포함하는 어닐링 용액을 사용하여 본 발명의 검출 방법에서 핵산 샘플이 미량이 경우에도 표적 핵산을 더욱 고감도로 검출할 수 있다. 이러한 경우, 사용하는 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제를 특정의 것으로 제한하지 않는다. 예를 들면, Afu RNase H 및 BcaBEST DNA 폴리머라제의 배합물이 바람직할 수 있다. 엔도뉴클레아제 및 DNA 폴리머라제의 바람직하 유니트는 효소 타입에 따라 달라질 수 있음을 고려한다. 그러한 경우, 완충액의 조성 및 첨가되는 효소의 양은 인덱스로서 증폭 산물의 양 또는 검출 감수성의 증가를 사용하여 조정될 수 있다.
본 발명의 검출 방법에서 표적 핵산의 증폭시 dUTP가 기질로서 도입될 수 있다. 따라서, dUTP가 기질로서 사용되는 경우, 우라실 N-글리소키다아제 (UNG)를 사용하여 증폭 산물을 분해시켜 증폭 산물의 캐리-오버(glycosidase) 오염에 기인한 위 양성을 방지할 수 있다.
핵산 검출을 위한 공지된 방법을 단계 (b)에 사용할 수 있다. 그러한 방법의예는 전기영동에 의해 특정 크기를 갖는 반응 산물의 검출, 및 프로브와 하이브리다이제이션시키는 검출을 포함한다. 또한, 자기 비드를 배합하여 사용하는 검출 방법을 바람직하게 사용할 수 있다. 에티디윰 브로마이드와 같은 형광 물질을 사용하여 전기 영동에 의한 검출에서 사용한다. 프로브와의 하이브리다이제이션은 전기 영동에 의해 검출과 조합할 수 있다. 프로브는 방사성 동위 원소로 표지할 수 있거나 바이오틴과 같은 비-방사성 동위 원소 물질 또는 형광 물질로 표지할 수 있다. 또한, 단계 (a)에서 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 증폭 산물의 검출을 촉진시킬 수 있다. 또한, 형광 편광법, 형광 에너지 전이(FERT) 등을 검출을 위해 사용할 수 있다. 적절한 검출 시스템을 구측하여 핵산을 자동적으로 검출하거나 측량화할 수 있다. 또한 하이브리드 크로마토그래피에 의해 나안(naked eye)으로 검출하는 것이 바람직하게 사용될 수 있다.
소광 상태가 되는 거리에 위치한 두개 이상의 형광 물질로 표지된 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 리보뉴클레오티드(RNA) 프로브를 본 발명의 검출 방법에 사용할 수 있다. 프로브는 형광을 발산하지 않는다. 그것이 프로브에 상보적인 핵산으로부터 증폭된 DNA에 어닐링되는 경우, RNase H가 프로브를 분해한다. 이어서, 프로브상에 형광 물질사이에 거리를 증가시켜, 형광을 발산시킨다, 발산은 핵산의 존재를 나타낸다. RNase H를 본 발명의 핵산 증폭 방법에서 사용하는 경우, 단지 프로브를 반응 혼합물에 첨가하여 표적 핵산을 검출할 수 있다. 예를 들면, 형광 물질, 6-카복시플루오레슨(6-FAM) 및 N,N,N',N'-테트메틸-6-카복시로다민(TAMRA)(FRET에 대한 라벨쌍)의 혼합물을 프로브 표지용으로 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명은 추가로 상기 언급한 표적 핵산을 검출하는 방법에서 사용되는 프로브를 제공한다. 본 발명의 프로브는 정상 하이브리드화 조건하에서 본 발명의 핵산 증폭 방법에 의해 증폭된 표적 핵산에 하이브리드될 수 있는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다. 증폭 산물의 특정 검출과 관련하여 조건 예를 들면, 본 분야의 기술자에거 엄격한(stringent) 조건으로 공지되어 있는 조건하에 혼성화하는 프로브가 바람직할 수 있다. 엄격한 하이브리드 조건은 예를 들면 [T. Maniatis et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술되어 있다. 특히 엄격한 조건은 하기와 같이 예시된다: 사용되는 프로브의 Tm보다 낮은 약 25℃의 온도에서 4시간 내지 밤새도록 0.5% SDS, 5 x Denhardt's(0.1% 소혈청 알부민(BSA), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% Ficoll 400) 및 100μg/㎖ 살몬 정자 DNA를 포함하는 6 x SSC(1 x SSC : 0.15M NaCl, 0.015M 소듐 시트레이트, pH 7.0)중에서 인큐베이션. 상기 기재된 바와 같은 라벨을 갖는 프로브를 표적 핵산의 검출을 촉진하는 프로브로서 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 열 싸이클러와 같은 장치의 사용을 필요로 하지 않는다. 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 배합하여 사용하는 본 발명의 방법에 따라 표적 핵산의 검출 감도를 향상시킬 수 있다. PCR용 dNTPs 등과 같은 시약을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법이 검출이 통상적으로 수행되는 유전자 테스트 분야에서 바람직하게 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 PCR 방법보다 더욱 단시간에 증폭 산물을 대량으로 제공한다. 그러므로, 본 발명의 방법은 편리하고 신속하고 민감한 유전자 검출 방법으로서 사용될 수 있다.
게놈 수준의 유전자 분석에서, 대량의 뉴클레오티드 서열을 분석하기 위하여 반응 시스템을 미량화하고 집적도를 증가시키려는 시도가 이루어졌다. 게놈 분석을 위한 기본 방법(예: 세포로부터의 DNA 추출, DNA 증폭 반응, 전기영동, 하이브리드화, 관심의 대상이 되는 DNA 검출 등)을 핑거팁 크기로 몇몇 제곱 센티미터의 마이크로 칩상에 통합시키는 최신 고정밀 프로세싱 기술을 이용하여 본 목적을 위해 상기 시스템이 개발되었다. 상기 시스템은 마이크로칩 또는 나노칩으로 명명한다.
현재 유전자 증폭 반응으로서 PCR을 상기 시스템에 적용하는 것이 고려중에 있다. 그러나, PCR은 시간 경과에 따라 온도를 반복적으로 상하로 제어하는 수단을 필요로 하기 때문에 시스템은 복잡할 것이다. 반대로, 상기 시스템은 등온 조건하에서 핵산을 증폭시킬 수 있는 본 발명의 방법을 사용하여 간소화되기 때문에 상기 기술된 통합 시스템에 대하여 상기 방법이 매우 적절하게 사용된다. 본 발명의 기술을 사용하여 고통합 시스템을 작제할 수 있다.
본 발명을 실시예에 따라 더욱 구체적으로 설명하며, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
참고예: 아키오글로부스 풀기두스( Archaeoglobus fulgidus )로부터 RNase HII 유전자 클로닝
(1) 아키오글로부스 풀기두스( Archaeoglobus fulgidus )로부터의 게놈 DNA 제조
8㎖의 배양액으로부터 회수된 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus) 세포(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH로부터 구입; DSM4139)을 100㎕의 25% 수크로오스, 50mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 현탁시켰다. 물중 20㎕의 0.5M EDTA 및 10㎕의 10mg/ml 염화리소자임(Nacalai Tesque)을 가하였다. 혼합물을 1시간동안 20℃에서 반응시켰다. 반응 후, 150mM의 NaCl, 1mM EDTA 및 20mM의 tris-HCl(pH 8.0)을 포함하는 800㎕의 혼합물, 10㎕의 20mg/ml 프로테아제 K(Takara Shuzo) 및 50㎕의 10% 소듐 라우릴 설페이트 수용액을 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후, 혼합물을 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전 및 대기 건조시킨 후 50㎕의 TE에 용해시켜 게놈 DNA 용액을 수득하였다.
(2) RNase HII 유전자 클로닝
아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)의 전장 게놈 서열은 공개되어 있다[Nature, 390:364-370(1997)]. RNase HII(AF0621)의 호모로그를 코딩하는 하나의 유전자가 존재한다고 공지되어 있다(서열번호:1 http://www,tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.htlm).
주형으로서의 (1)에서 제조된 30ng의 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)의 게놈 DNA, 및 프라이머로서 20 pmol의 각각의 AfuNde 및 AfuBam을 사용하여 100㎕ 용량으로 PCR을 수행하였다. 첨부된 프로토콜에 따라 Pyrobest DNA 폴리머라제(Takara shuzo)를 PCR용 DNA 폴리머라제로서 사용하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분동안 40 싸이클. 약 0.6kb의 증폭된 DNA 단편을 NdeI 및 BamHI(모두 Takara shuzo)로 분해하였다. 이어서, 플라스미드 벡터 pTV119Nd (pTV119N중 NcoI 사이트가 NdeI 사이트로 전환된 플라스미드)중 NdeI 및 BamHI 사이트 사이에 생성된 DNA 단편을 도입하여 플라스미드 pAFU204를 작제하였다.
(3) RNase HII 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 확인
(2)에서 수득한 pAFU204내로 삽입된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시 방법에 따라 확인하였다. 확인된 뉴클레오티드 서열을 분석하여 RNase HII를 코딩하는 것으로 가정된 오픈 리딩 프레임의 존재를 밝혀냈다. 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 4에 나타낸다. 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 RNase HII의 아미노산 서열을 서열번호 5에 나타낸다.
플라스미드 pAFU204로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)JM109을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)JM109/pAFU204로 명명하고 2001년 2월 22일(원기탁일)에 기탁번호 FERM P-18221하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1 Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하고 기탁 번호 FERM BP-7691하에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology에 기탁하였다(국제 기탁기관으로의 이관일: 2001년 8월 2일).
(4) 정제된 RNase HII 샘플의 제조
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)JM109를 (2)에서 수득한 pAFU204로 형질전환시켰다. pAFU204을 포함하는(Harboring) 생성된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)JM109을 100μg/㎖의 앰피실린을 포함하는 2L의 LB 배지내로 접종하고 37℃에서 16시간동안 진탕시키면서 배양하였다. 배양후, 원심분리에 의해 회수한 세포를 37.1의 초음파 처리 완충액[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 2mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드]에 현탁시키고 초음파처리하였다. 10분동안 12000rpm에서 초음파 처리된 현탁액을 원심분리하여 수득한 상등액을 15분동안 70℃에서 가열하였다. 10분동안 다시 12000rpm에서 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 따라서, 40.3㎖의 가열된 상등액을 수득하였다.
가열된 상등액을 완충액 A[50mM tris-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA]으로 평형화된 RESOURSE Q 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용하고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase HII는 RESOURSE Q 칼럼을 통해 이동하였다.
이동(flow-through) RNase HII 분획을 완충액 A으로 평형화된 RESOURSE S 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 사용하여 크로마토그래피하였다. 결과, RNase HII는 RESOURSE S 칼럼을 통해 이동하였다.
40.0ml의 이동 RNase HII 분획을 50mM NaCl를 포함하는 2L의 완충액 B(50mM tris-HCl(pH 7.0), 1mM EDTA]에 대하여 2시간동안 다시 투석시켰다. 2회 이상을 투석을 반복실시 하였다. 40.2ml의 투석된 효소 용액을 50mM NaCl을 포함하는 완충액 B로 평형화된 HiTrap-heparin 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 FPLC 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 50 내지 550mM NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 약 240mM NaCl로 용출된 RNase II를 포함하는 분획을 수득하였다.
7.8㎖의 RNase HIII 분획을 한외여과에 의해 Centricon-10(Amicon)을 사용하여 농축시켰다. 약 600㎕의 농축액으로부터 각각 분리된 4분량을 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 7.0)로 평형화된 Superose 6 겔 여과 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용시키고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 결과 RNase HII가 분자량 30.0 킬로달톤에 상응하는 위치에서 용출되었다. 이 분자량은 모노머 형태의 RNase HII 것과 일치한다.
상기 기술된 바와 같이 용출된 RNase HII를 Afu RNase HII 샘플으로서 사용하였다.
수득한 Afu RNase HII 샘플의 효소 활성르 하기와 같이 측정하였다.
40℃에서 인큐베이션된 반응 혼합물[20mM HEPES-수산화칼륨(pH 7.8), 0.01% 송아지 혈청 알부민(Takara Shuzo), 1% 디메틸 설폭시드, 4mM 아세트산 마그네슘,20μg/ml의 poly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech), 300μg/ml의 poly(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)] 100㎕을 1㎕의 Afu RNase HII 샘플에 가하였다. 혼합물을 10분동안 40℃에서 반응시켰다. 이어서 10㎕의 0.5M EDTA(pH 8.0)을 가하여 반응을 종결시켰다. 이어서, 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과, Afu RNase HII 샘플에 대하여 RNase H 활성이 관찰되었다.
열-내성 RNase H의 유니트 수는 하기와 같이 계산하였다.
1 mg의 poly(rA) 또는 poly(dT) (Amersham Pharmacia Biotech로부터 모두 입수)를 1 mM EDTA를 포함하는 1 ml의 40 mM tris-HCl (pH 7.7)에 용해시켜 poly(rA) 용액 및 poly(dT) 용액을 제조하였다.
poly(rA) 용액(20μg/㎖의 최종 농도) 및 poly(dT)(30μg/㎖의 최종 농도)을 이어서 4mM MgCl2, 1mM DTT, 0.003% BSA 및 4% 글리세롤를 포함하는 40mM tris-HCl 완충액(pH 7.7)에 가하였다. 혼합물을 10분동안 37℃에서 반응시킨 후 4℃으로 냉각시켜 poly(rA) 용액-poly(dT) 용액을 제조하였다. 적절히 희석된 1㎕의 효소 용액의 희석액을 100㎕의 poly(rA) 용액-poly(dT) 용액에 가하였다. 혼합물을 40℃에서 10분동안 반응시켰다. 10㎕의 0.5M EDTA를 가하여 반응을 종결시켰다. 이어서, 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로서 10㎕의 0.5M EDTA를 반응 혼합물에 가하고 생성된 혼합물을 10분동안 40℃에서 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. EDTA가 존재하지 않은 반응에서의 흡광도로부터 대조군의 흡광도를 감하여 값(흡광도 차)을 얻었다. 따라서, 효소 반응에 의한 poly(rA) -poly 하이브리드으로부터 유리된 뉴클레오티드의 농도를 흡광도 차에 기초하여 측정하였다. 하기 식에서 계산되는 바 1 유니트의 RNase H는 10분후 1nmol의 리보뉴클레오티드의 유리에 상응하여 A260를 증가시키는 효소의 양으로 정의된다.
유니트 = [흡광도 차 x 반응 용량(㎖)] / 0.0152 x (110/100) x 희석율
실시예 1
(1) 프라이머 및 블럭 올리고뉴클레오티드 디자인
키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 핵산으로서의 핵산중 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어닐링하는 임의의 3'측 부위에 어닐링 할 수 있는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 배합물을 조사하였다. 우선, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 플라스미드 DNA를 검출하기 위한 키메라성 프라이머, CT-BF19-3 (서열번호:6) 및 CT-BR23-2 (서열번호:7)를 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 플라스미드(GenBank 수탁번호 X06707)의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. 또한, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 플라스미드의 뉴클레오티드 서열을 갖고 주형으로서의 핵산중 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어닐링하는 3'측의 임의 부위에 어닐링 할 수 있는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드, CR-FBK (서열번호:8) 및 CR-RBK (서열번호:9)을 합성하였다.
아민화하여 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 3' 말단에서 차단하여 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 신장 반응이 진행되지 못하도록 하였다. 상류 블럭 올리고뉴클레오티드 CR-FBK 및 CR-RBK는 각각 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
(2) 클라미디아( Chlamydia ) 양성 대조군의 제조
서열번호:10로 나타낸 클라미디아(Chlamydia) 유전자의 일부에 상응하는 560-bp 단편을 PCR-증폭시키고 정제하고, DNA Ligation Kit Ver. 2(Takara Shuzo)를 사용하여 증폭된 단편을 pT7 Blue T 벡터내로 삽입하고 E. Coli JM 109를 형질전환시켜 클라미디아(Chlamydia) 양성 대조군의 제조하였다.
(3) ICAN 반응
대조군으로서 1㎕의 물 또는 상기 (2)에서 제조한 102내지 105개 카피의 양성 대조군 DNA을 포함하는 용액, 상기 (1)에서 합성한 50pmol의 각각의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 100pmol의 상류 블럭 올리코뉴클레오티드 및 하기를 포함하는 최종 용량 25㎕의 반응 혼합물을 제조하였다: 각 0.5 dNTP, 32mM Hepes-KOH 완충액(pH 7.8), 100mM 아세트산칼륨, 4.0mM 아세트산마그네슘, 0.01% 소혈청 알부민, 1.0% 디메틸설폭사이드, 4.375U의 Afu RNase H 및 2.64U의 Bca DNA 폴리머라아제(Takara Shuzo). 반응 혼합물을 열 싸이클러를 사용하여 1시간동안 60℃에서 인큐베이션시켰다. 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 가하지 않는 그룹을 대조군으로 사용하였다. 반응 후, 5㎕의 각 반응 혼합물을 3.0% 아가로스 겔상에서 전기영동시켜 분석하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1A는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 가하지 않은 반응 시스템에 대한 결과를 나타낸다. 레인 1: 100-bp DNA 래더 마커; 레인 2: 음성 대조군 (물); 레인 3: 102개 카피의 주형; 레인 4: 103개 카피의 주형; 레인 5: 104개 카피의 주형; 레인 6: 105개 카피의 주형; 및 레인 7: 106개 카피의 주형. 도 1B는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 가한 반응 시스템에 대한 결과를 나타낸다. 레인 1: 100-bp DNA 래더 마커; 레인 2: 음성 대조군 (물); 레인 3: 102개 카피의 주형; 레인 4: 103개 카피의 주형; 레인 5: 104개 카피의 주형; 레인 6: 105개 카피의 주형.
도 1에 나타낸 바와 같이, 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 가하지 않은 그룹에 대한 증폭은 105개 카피의 주형을 사용하여 관찰되었다. 한편, 상류 블럭 프라이머를 가한 그룹에 대한 증폭은 103개 카피의 주형을 사용하여 관찰되었다. 따라서, 비첨가 그룹과 비교하여 감도는 2항 정도(two orders of magnitude)까지 향상되었다. 이 결과에 기초하여, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 핵산으로서의 핵산중 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머가 어닐링하는 임의의 3'측 부위에 어닐링 할 수 있는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 배합물을 사용하여 검출 감도를 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
산업상 이용가능성
본 발명은 특이적인 증폭에 대하여 적절한 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열중의 영역을 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 사용하는 DNA 합성 반응에 의해 증폭시키는 표적 핵산 증폭 방법을 제공한다. 추가로 본 발명은 표적 핵산 증폭 방법에 의해 수득한 표적 핵산으로부터 증폭된 단편을 검출하는 단계를 포함하는 표적 핵산 검출 방법을 제공한다.
서열 목록 프리 텍스트
서열번호:2: 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 AfuNde.
서열번호:3: 아키오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터 RNaseHII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위한 PCR 프라이머 AfuBam
서열번호:6: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia tracomatis)의 일부를 증폭시키기 위한 CT-BF19-3로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 20 내지 22는 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:7: 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia tracomatis)의 일부를 증폭시키기 위한 CT-BR23-2로 명시되는 작제된 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머. "뉴클레오티드 21 내지 23은 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다"
서열번호:8: CR-FBK로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호:9: CR-RBK로 명시되는 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머.

Claims (6)

  1. (a) 주형으로서의 핵산, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 스트랜드 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제, 적어도 하나의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머, 적어도 하나의 상류 블럭(upstream block) 올리고뉴클레오티드 및 RNase H를 혼합하여 반응 혼합물을 제조하고
    (여기에서, 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고 프라이머의 3'-말단 또는 3'-말단측에 위치하는 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머이고,
    상류 블럭 올리고뉴클레오티드는 주형으로서의 핵산중 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머와 실질적으로 상보적인 영역의 3'측 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적이고, 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제 작용에 의한 상보적 스트랜드 신장 반응은 발생하지 않도록 변형된다);
    (b) 반응 혼합물을 반응 산물을 생성시키기에 충분한 시간동안 인큐베이션하는 것을 포함하는, 핵산 증폭 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 반응 혼합물이 추가로 주형으로서의 핵산의 뉴클레오티드서열에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 제 2 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 반응 혼합물이 추가로 주형으로서의 핵산중 제 2 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 영역의 5'측 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 포함하는(여기에서, 상류 블럭 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제 작용에 의한 상보적 스트랜드 신장 반응은 발생하지 않도록 변형된다) 방법.
  4. 적어도 하나의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 적어도 하나의 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 제 1항의 핵산 증폭 방법을 위한 조성물.
  5. 적어도 하나의 키메라성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 적어도 하나의 상류 블럭 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 제 1항의 핵산 증폭 방법을 위한 키트.
  6. (a) 제 1항의 핵산 증폭 방법에 의해 표적 핵산을 증폭시키고;
    (b) 전 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 것을 포함하는 표적 핵산 검출 방법.
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