CN104450869B - 一种双脱氧核苷修饰的引物方法、反应体系及其在突变检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双脱氧核苷修饰的引物方法、反应体系及其在突变检测中的应用。本发明人结合3’末端封闭的引物和高保真DNA聚合酶的3’‑5’外切酶校正功能，优化了一种操作简单快捷、灵敏性强、准确度高的检测方法，可广泛用于与点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变检测相关的领域。

Description

一种双脱氧核苷修饰的引物方法、反应体系及其在突变检测 中的应用

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，更具体地说，涉及一种双脱氧核苷修饰的引物方法及基于该引物和高保真DNA聚合酶、非高保真DNA聚合酶的核酸扩增方法及用于点突变、缺失、插入突变检测试剂盒及其应用。

背景技术

点突变也称作单碱基替换，指由单个碱基改变发生的突变，可以分为转换和颠换两类。转换是指嘌呤和嘌呤之间的替换或嘧啶和嘧啶之间的替换；颠换是指嘌呤和嘧啶之间的替换。DNA分子中单碱基突变广泛存在于生物体遗传信息的编码中，是导致遗传性疾病的重要原因之一。就人类基因组而言，在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，主要是指在染色体基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，而其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1%。这种多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致，但通常所说的SNP并不包括后两种情况。SNP的检测分析，可应用于医学上疾病易感性研究，解释个体间的表型差异对疾病的易感程度；可应用于药物基因组学及临床耐药研究，分析不同基因型个体对药物反应的差异，指导药物开发及临床合理用药；可应用于种族遗传学和连锁不平衡性分析；还在基因组制图以及遗传育种等方面有重大意义。

实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)是定量PCR的一种，指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Real-Time PCR的检测方法包括：荧光染料嵌合法和荧光探针法。SYBR GreenI是一种常用的荧光染料，能结合于所 有dsDNA双螺旋的小沟区域。SYBR Green I与dsDNA结合荧光信号可增强800-1000倍。在PCR反应体系中加入过量SYBR Green I荧光染料，SYBRGreen I荧光染料掺入DNA双链后，荧光信号增强，而不掺入链中的SYBR Green I染料分子荧光不变，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

点突变、缺失和插入突变所造成的基因理化特性改变甚微，无疑使与之相关的检测非常困难，目前对单核苷酸突变位点的检测技术主要包括：单链构象多态性(Single-Strand Conformational Polymorphism，SSCP)技术、异源双链分析(hereroduplexanalysis，HA)技术、变性高效液相色谱法(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)、变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)、化学错配裂解法(chemical mismatch cleavage，CMC)、焦磷酸序列(Pyrosequencing)分析技术、质谱法(mass spectrometry)、DNA芯片(DNA chip)技术、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、等位基因特异性PCR(allele specific PCR，ASPCR)、分子信标(molecular beacons)技术等。这些传统的检测方法大多操作复杂、费时繁琐且特异性、灵敏性及准确性较差。

因此，本领域仍然需要开发优化的、结果稳定、重复性好的基因突变检测方法，以应用于快速进行基因突变检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高保真DNA聚合酶，非高保真DNA聚合酶和引物末端封闭的核酸扩增方法及用于点突变(包括单核苷酸多态性)、缺失、插入(可为单碱基或任意长度片段的插入、缺失)突变检测试剂盒及其应用。

本发明的目的还在于提供在快速核酸诊断方面的试剂盒及其在病原微生物(细菌、病毒等)的核酸检测方面的应用，以及在人类遗传性疾病、长寿衰老相关的基因、健康风险相关的基因诊断以及药物代谢、疾病易感基因、药物基因组学研究中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种检测待测基因的待测突变位点上是否存在突变的方法，所述方法包括：

(1)以待测基因为模板，以正向引物和反向引物为引物，以高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶混合酶进行PCR扩增；

所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物，以其3’末端碱基起算第1-8 位的任意1个或多个(1～8个，如2、3、4、5、6、7个)碱基对应待测突变位点，但与野生型序列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所述的辨别性引物的3’末端核苷戊糖3号C的羟基进行双脱氧修饰；

所述的正向或反向引物中辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游(当辨别性引物为正向引物时，该引物为反向引物，位于基因突变位点下游；当辨别性引物为反向引物时，该引物则为正向引物，位于基因突变位点上游)且与相应区段上碱基序列完全匹配；

(2)分析PCR扩增产物，若获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点存在突变；若未获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点不存在突变。

在本发明的另一方面，提供一种检测基因突变的方法，所述方法包括：

(1)’以待测基因为模板，以正向引物和反向引物为引物，以高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶混合酶进行PCR扩增；

其中，所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物，以其3’末端碱基起算第1-8位的任意1个或多个(1～8个，如2、3、4、5、6、7个)碱基对应待测突变位点，但与突变型序列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所述的辨别性引物的3’末端核苷戊糖3号C的羟基进行双脱氧修饰；

所述的正向或反向引物中辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游(当辨别性引物为正向引物时，该引物则为反向引物，位于基因突变位点下游；当辨别性引物为反向引物时，该引物则为正向引物，位于基因突变位点上游)且与相应区段上碱基序列完全匹配；

(2)’分析PCR扩增产物，若获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点不存在突变；若未获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点存在突变。

在一个优选例中，所述的突变包括：点突变(包括单核苷酸多态性)、插入突变、缺失突变(可为单碱基，也可为任一长度片段的插入或缺失突变，见原理图1b、1c)。

在另一优选例中，正向引物长度15-30bp；和/或正向引物长度15-30bp。

在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；所述的非高保真DNA聚合酶是不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶。

在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶包括(但不限于)：Pfu DNA聚合酶、

HS DNA聚合酶、Q5^TM超保真DNA聚合酶等。

在另一优选例中，所述的非高保真DNA聚合酶包括(但不限于)：Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶。

在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶的比例是(0.05-0.3):1；较佳地为(0.1-0.2):1；更佳地为(0.14-0.19):1。

在另一优选例中，步骤(2)或(2’)中，通过电泳检测扩增产物；或通过荧光定量方法检测扩增产物(如应用SYBR Green I检测扩增曲线)。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测待测基因的待测突变位点上是否存在突变的检测试剂盒，所述试剂盒中包括：

正向引物和反向引物，其一作为辨别性引物，以其3’末端碱基起算第1-8位的任意1个或多个(1～8个，如2、3、4、5、6、7个)碱基对应待测突变位点，但与野生型或突变型序列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所述的辨别性引物的3’末端核苷戊糖3号C的羟基进行双脱氧修饰；

正向引物和反向引物中另一引物位于基因突变位点下游或上游(当辨别性引物为正向引物时，该引物则为反向引物，位于基因突变位点下游；当辨别性引物为反向引物时，该引物则为正向引物，位于基因突变位点上游)且与相应区段上碱基序列完全匹配；该引物为正常引物，不经任何修饰；

高保真DNA聚合酶；和

非高保真DNA聚合酶。

在本发明的另一方面，提供检测试剂盒的用途，用于检测待测基因(疾病相关基因、药物代谢、药物治疗相关基因等)的待测突变位点上是否存在突变。

在一个优选例中，所述的检测是非疾病诊断性的检测；例如，所述的检测是针对食品、病原微生物(细菌、病毒等)的检测。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1a、高保真酶介导的3’末端封闭切除的扩增方法对点突变检测的原理图(其中点突变位点位于正向引物3’末端最后一个碱基处)。

图1b、高保真酶介导的3’末端封闭切除的扩增方法对插入突变检测的原理图。

图1c、高保真酶介导的3’末端封闭切除的扩增方法对缺失突变检测的原 理图。

图2、本发明实施例1中引物3’末端不同修饰方式对PCR反应的封闭效果对比图。

图3、本发明实施例2、3、4、5中高保真酶介导的3’末端封闭切除的扩增方法对点突变、插入、缺失突变检测的电泳图。

图4、本发明实施例6中高保真酶介导的3’末端封闭切除的实时定量PCR方法对点突变检测的扩增曲线图。

图5、本发明实施例7中高保真酶介导的3’末端封闭切除的扩增方法对点突变检测的灵敏度分析图。

图6、本发明实施例8中高保真酶介导的3’末端封闭切除的扩增方法对点突变检测的特异性分析。

图7、本发明实施例9中单用高保真DNA聚合酶与高保真和非高保真DNA聚合酶混合酶对点突变检测效果的比较。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，结合3’末端封闭的引物和高保真DNA聚合酶的3’-5’外切酶校正功能，优化了一种操作简单快捷、灵敏性强、准确度高的检测方法，可广泛用于与点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变检测相关的领域。

如本文所用，碱基的“匹配”或“配对”是指两条核苷酸序列中相应的碱基按照A与T，G与C配对的原则形成反向互补的双链结构。本文所用“完全匹配”是指引物与模板之间序列完全互补，不存在任何碱基错配。

本发明中，“3号C”是指戊糖上的一个C，其编号是以戊糖上连接碱基的C为1号，顺时针依次编号(如式(I))，位于第3位的C即称为“3号C”。

本发明的方法基于3’末端双脱氧封闭的引物与高保真DNA聚合酶3’-5’外切酶校读活性。DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3号C上缺少一个羟基。如果引物与模板(野生型或突变型)完全互补配对，则高保真DNA聚合酶将不对引物进行3’-5’校对，封闭的引物由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此不能启动DNA合成；当引物与模板(突变型或野生型)不完全匹配，高保真DNA聚合酶将发挥其3’-5’校对功能，利用其3’-5’外切酶活性，切除3’羟基被封闭的核苷，暴露出正常3’羟基，可以在非高保真DNA聚合酶催化下形成3-5磷酸二酯键，从而进行DNA合成(即PCR扩增)；

本发明提供了一种基于高保真DNA聚合酶和引物末端封闭的核酸扩增方法，以及用于点突变(包括单核苷酸多态性)、缺失、插入突变检测试剂盒。其步骤如下：

步骤1，根据野生型基因序列设计正向和反向引物，对其中一条引物3’末端最后一个核苷戊糖上3号C上的羟基进行化学修饰，从而封闭3’末端核苷戊糖的3号羟基，且保证其3’末端1-8位内存在有一个或多个与突变型基因错配的碱基，即突变位点位于封闭引物3’末端1-8位碱基内；

步骤2，用所述正向和反向引物对待测样品进行(RT-或实时荧光定量)PCR扩增反应；如果引物与模板(野生型或突变型)完全互补配对，则高保真DNA聚合酶将不对引物进行3’-5’校对，封闭的引物3’羟基不能被催化形成3-5磷酸二酯键，因此不能启动DNA合成；当引物与模板(突变型或野生型)不完全匹配，高保真DNA聚合酶将发挥其3’-5’校对功能，利用其3’-5’外切酶活性，切除3’羟基被封闭的核苷，暴露出正常3’羟基，可以在聚合酶催化下形成3-5磷酸二酯键，从而进行DNA合成(即PCR扩增)，其原理示意图如图1；

步骤3，电泳检测扩增产物或通过SYBR Green I检测扩增曲线，可以判断引物与模板是否完全匹配，从而确定是否存在突变(包括点突变、缺失和插入)。

所述步骤1中，尽管引物3’羟基被修饰和封闭的类型可以是双脱氧修饰、氨基化修饰、硫代修饰、磷酸化修饰等；被修饰的核苷酸可以包括：A、T、C、G或U。但是本发明人发现，迄今只有3’末端ddC修饰才具有最好的封闭效果，(因目前生物公司只能实现引物3’末端ddC修饰，根据反应原理引物3’末端进行ddA、ddT或ddG修饰也能达到最佳封闭效果)即引物3’末端为C且进行 双脱氧修饰，突变位点可位于3’末端1-8位碱基内。

所述步骤2中，高保真DNA聚合酶包括任何具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶，如Pfu DNA聚合酶、

HS DNA聚合酶、Q5^TM超保真DNA聚合酶等；非高保真DNA聚合酶包括任何不具有3’-5’外切酶活性的普通耐热DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等。

本发明人在研究中发现，高保真酶的3’→5’外切酶(Proof reading)活性不是完全特异性的，不仅可以切除并校正与模板不匹配的引物，对与模板完全匹配的引物也有一定的外切酶活性。因此如果在反应体系中只单独使用高保真酶的话不能达到选择性扩增的效果，即对于突变型和野生型模板都能扩增，容易造成假阳性结果。因此，本发明人在反复研究后发现，在PCR反应中，将高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶以适当比例混合使用，将大大提高检测的灵敏度及准确性。加入少量高保真DNA聚合酶，主要发挥校对功能：切除3’羟基被封闭的核苷，暴露出正常3’羟基；而非高保真DNA聚合酶的量较多，主要发挥聚合酶作用进行PCR扩增反应。

通过本发明所述检测方法进行(RT-或实时荧光定量)PCR方法在检测核酸点突变(包括单核苷酸多态性)、缺失、插入的过程中，引物设计简单，实验操作简便快捷，检测结果准确可靠。与现有所有应用于点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变检测的方法相比，本发明在实际操作的简易程度以及实验结果的准确度上均具有明显的优越性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、引物3’末端不同修饰方式对PCR反应的封闭效果

本发明人选取人基因组的两条序列片段，分别为野生型WT(SEQ ID NO:1)和突变型Mu1(SEQ ID NO:2)序列。在这两条序列中存在一个单核苷酸突变位点，由野生型的C突变为T。设计正向和反向引物，其中反向引物位于突变位点下游且与相应位置野生型和突变型模板完全匹配；正向引物与野生型模板完全匹配，且其3’末端位于单核苷酸突变位点处(如表1所示)。对正向引物3’末 端的最后一个核苷戊糖3号C上的羟基分别进行磷酸化修饰、氨基化修饰(Amino C6)和双脱氧修饰(ddC)，修饰的正向引物分别命名为：正向引物-P、正向引物-N、正向引物-ddC。3’末端没有任何修饰的正常上游引物命名为正向引物，反向引物Reverse Primer，这两条引物的Tm值均为60℃左右。

表1

引物序列如下：

正向引物：5’-CGCGGTGGCTTTGAAGAGCC-3’(SEQ ID NO:3)；

反向引物：5’-GGTTGTTTTTCACCCAGTGCGT-3’(SEQ ID NO:4)；

正向引物-ddC：5’-CGCGGTGGCTTTGAAGAGC-ddC-3’；

反应体系如下：

反应条件如下：

按上述反应体系和反应条件在普通PCR仪上进行反应，其中反应体系中的Taq DNA聚合酶为宝生物工程(大连)有限公司(R001A)产品，然后将扩增产物进 行琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为1.5%琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的DL2,000DNA Marker(D501A)电泳结果如图2所示。从图中可看出双脱氧修饰引物的封闭效果最佳，可完全抑制PCR反应；氨基化修饰封闭效果次之；磷酸化修饰封闭效果最差。

实施例2、高保真酶介导的3’末端封闭切除的扩增方法对点突变的检测

使用与实施例1中完全相同的野生型模板序列WT(SEQ ID NO:1)和突变型序列Mu1(SEQ ID NO:2)，使用实施例1中的正向引物-ddC和反向引物(SEQ ID NO:4)为上、下游引物，按下列条件进行PCR反应。

反应体系如下：

反应热循环条件如下：

按上述反应体系和反应条件在普通PCR仪上进行反应，然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为1.5%琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的DL2,000DNA Marker(D501A)。电泳结果如图3所示。从电泳图中可看到突变型Mu1模板有目的条带(395bp)而野生型WT模板无目的条带。

实施例3、利用3’末端2-8位错配封闭引物对点突变的检测

使用与实施例1中完全相同的野生型模板序列WT(SEQ ID NO:1)和四条突变型序列Mu2(SEQ ID NO:5)、Mu3(SEQ ID NO:6)、Mu5(SEQ ID NO:7)、Mu8(SEQ ID NO:10)，这四条突变型序列和野生型序列WT相比，各存在一个单核苷酸突变位点，分别为：C→A(第21位)、G→A(第20位)、G→T(第18位)、G→C(第15位)。正向引物为实施例1中的正向引物-ddC(3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:3)，反向引物为SEQ ID NO:4，其中Mu2的突变位点位于正向引物3’末端倒数第二个碱基处、Mu3的突变位点位于正向引物3’末端倒数第三个碱基处、Mu5的突变位点位于正向引物3’末端倒数第五个碱基处、Mu8的突变位点位于正向引物3’末端倒数第八个碱基处(如表2所示)，按以下条件进行PCR反应。

表2

反应体系如下：

反应热循环条件如下：

按上述反应体系和反应条件在普通PCR仪上进行反应，然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为1.5%琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的DL2,000DNA Marker(D501A)。电泳结果如图3所示。从电泳图中可看到四种突变型模板都有目的条带(395bp)，而野生型模板无目的条带。

实施例4、高保真酶介导的3’末端封闭切除的扩增方法对单碱基插入突变的检测

使用与实施例1中完全相同的野生型模板序列WT(SEQ ID NO:1)和突变型模板序列Mu-Insert5(SEQ ID NO:8)。Mu-Insert5与WT相比，插入了一个碱基T(相应于SEQ ID NO:1第17-18位之间)。正向引物为实施例1中的正向引物-ddC(3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:3)，反向引物为SEQ ID NO:4；其中插入的碱基T位于上游引物3’末端倒数第5位和第6位碱基之间(如表3所示)。按实施例2中的反应体系和反应热循环条件进行PCR反应。

表3

结果如图3所示，插入突变型模板Mu-Insert5有目的条带(395bp)而野生型模板WT无目的条带，由此可判断有无插入突变。

实施例5、高保真酶介导的3’末端封闭切除的扩增方法对单碱基缺失突变的检测

使用与实施例1中完全相同的野生型模板序列WT(SEQ ID NO:1)和突变型模板序列Mu-Deletion5(SEQ ID NO:9)。Mu-Deletion5与WT相比，缺失了一个单核苷酸G。正向引物为实施例1中的正向引物-ddC，反向引物为SEQ ID NO:4；其中缺失的单核苷酸G位于上游引物3’末端倒数第五位碱基处(如表4所示)。按实施例2中的反应体系和反应热循环条件进行PCR反应。

表4

结果如图3所示：缺失突变型模板Mu-Deletion5有目的条带(395bp)而野生型模板无目的条带，由此可判断有无缺失突变。

实施例6、高保真酶介导的3’末端封闭切除的实时定量PCR方法对点突变的检测

使用与实施例1中完全相同的野生型与突变型模板序列，正向引物为实施例1中的正向引物-ddC，反向引物为SEQ ID NO:4，进行Real-time PCR检测。反应体系如下：

反应热循环条件如下：

按上述反应体系和反应条件在荧光定量PCR仪(如

System)上进行反应得到野生型和突变型模板的扩增曲线如图4所示，突变型模板可观察到扩增曲线而野生型模板则无扩增曲线，由此可以清楚地辨别是否存在点突变。

实施例7、高保真酶介导的3’末端封闭切除的扩增方法对点突变检测的灵敏度分析

使用与实施例1中完全相同的野生型模板序列WT(SEQ ID NO:1)和突变型序列Mu1(SEQ ID NO:2)，将这两个序列片段分别连接到

18-T Vector(Takara Code：D101A)，把重组质粒转化入实验室感受态细胞，挑取单菌落扩大培养，菌液PCR筛选阳性克隆，最后送上海博尚生物技术有限公司测序挑选出序列完全正确的重组质粒。用BamHI对两种重组质粒进行单酶切，并对线性质粒进行纯化，用超微量紫外分光光度计测量各线性质粒的OD值，并换算为拷贝/ml。用1×TE以10倍为一个梯度对两种线性质粒进行稀释，制备成10⁸-10²拷贝/μl的系列标准品。按以下条件进行Real-time PCR反应。

反应体系如下：

反应热循环条件如下：

按上述反应体系和反应条件在荧光定量PCR仪(如

System)上进行反应，当反应体系中的突变型质粒含量为3×10²-3×10⁸拷贝时，其扩增曲线如图5a所示。当反应体系中的突变型质粒含量为2×10⁴--2×10⁷拷贝时，其扩增曲线如图5b所示，从图中可看出野生型模板(2×10⁸拷贝)无扩增而2×10⁴-2×10⁷拷贝的突变型模板有明显的扩增曲线。

实施例8、高保真酶介导的3’末端封闭切除的扩增方法对点突变检测的特异性分析

使用与实施例6中相同的野生型和突变型重组质粒，按实施例6中的反应体系和反应条件进行Real-time PCR反应，反应体系中加入0.495ng的重组质粒，其中突变型质粒Mu的含量分别占总模板量的0%、1%、10%和100%。

结果如图6a所示，当突变型质粒分别为1%、10%和100%时都有明显的扩增曲线，而当不含突变型质粒(0%)即所加模板均为野生型质粒时则无扩增曲线。由此说明该检测方法的特异性可达到1%。

将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图6b所示。从图中可看到当突变型质粒分别为1%、10%和100%时都有明显的目的条带，而当不含突变型质粒(0%)即所加模板均为野生型质粒时则无目的条带。该结果和上述Real-time PCR的结果相一致。

实施例9、单用高保真DNA聚合酶与高保真和非高保真DNA聚合酶混合酶对点突变检测效果的比较

使用与实施例1中完全相同的野生型模板序列WT(SEQ ID NO:1)和突变型序列Mu1(SEQ ID NO:2)，使用实施例1中的正向引物-ddC、正向引物-N(SEQ ID NO:4)和反向引物Reverse Primer，进行下列PCR反应。

第一，反应体系：

反应条件：

结果如图7a所示：当反应体系中只含高保真酶且高保真酶的使用量为1U时，使用双脱氧-ddC或氨基化修饰的辨别性引物进行反应时，野生型和突变型模板均有目的条带且条带亮度差异不大，无法区分野生型和突变型模板。

第二，使用上述反应中的野生型和突变型模板，正向引物为：正向引物-ddC，反向引物为SEQ ID NO:4，当高保真酶

HS DNA Polymerase的加入量分别为0.5、1、1.5、2U时结果如图7b所示：当高保真酶使用量小于1U时，野生型和突变型模板均无目的条带；当高保真酶使用量≥1U时，野生型和突变型模板均有目的条带且条带亮度差异不大。

第三，高保真酶与非高保真酶混合使用，当非高保真酶(Taq DNA聚合酶)的加入量为1U，高保真酶

HS DNA Polymerase的加入量分别为0.05、0.1、0.3U时(反应体系与反应条件如实施例3所示)，结果如图7c所示：当混合的高保真酶量为0.05U时，只有突变型模板有目的条带但条带较弱；当高保真酶量为0.1、0.3U时，野生型和突变型模板均有目的条带，但突变型模板的条带显著亮于野生型模板，可通过优化退火温度和高保真酶的混合比例等，达到突变型模板显著扩增而野生型模板无扩增的效果，也说明高保真酶的使用量在0.05-0.3U之间。

第四，优化退火温度。当非高保真酶(Taq DNA聚合酶)的加入量为1U，高保真酶

HS DNA Polymerase的加入量为0.1U时，做温度梯度PCR，退火温度分别为：61.5、61.8、62.2、62.6、63.0、63.3、63.6、63.8℃时结果如图7d所示：当退火温度<62.2℃时野生型和突变型模板均有目的条带，而当退火温度≥62.2℃，只有突变型模板有目的条带而野生型模板无目的条带，但随着温度的升 高突变型模板的条带亮度逐渐变弱，故反应的最佳温度为：62.2℃，此时野生型模板无扩增，而突变型模板有显著扩增。

第五，优化高保真酶的混合比例。当非高保真酶(Taq DNA聚合酶)的加入量为1U，高保真酶

HS DNA Polymerase的加入量分别为0.05、0.1、0.15、0.2U时，按下面反应程序：94℃，2min；94℃15s，62.2℃20s，72℃25s(30cycles)；72℃2min进行PCR反应。结果如图7e所示随着高保真酶量的增加突变型模板的目的条带逐渐变亮，但是当高保真酶的加入量为0.2U时野生型模板产生了很弱的目的条带，出现假阳性结果，故在此反应中高保真酶的最佳使用量为0.15U。

经过优化的检测点突变的反应体系与反应条件为：

反应条件:

综上所述，由于高保真酶的3’→5’Exonuclease(Proof reading)活性不是完全特异性的，不仅可以切除并校正与模板不匹配的引物，对与模板完全匹配的引物也有外切酶活性。因此如果在反应体系中只单独使用高保真酶的话不能达到选择性扩增的效果，即对于突变型和野生型模板都能扩增，容易造成假阳性结果(图7a、 b)，但是高保真酶对与模板不匹配引物的外切酶校正活性比匹配引物更强，此外，过高的高保真酶量反而会抑制PCR扩增的效果，因此需要配合非高保真DNA聚合酶的使用，在控制两酶含量及优化反应条件后即可达到只有突变型模板显著扩增而野生型模板无任何扩增的效果，从而可应用于SNP和点突变的检测(图7c、d、e)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种检测待测基因的待测突变位点上是否存在突变的方法，所述的检测是非疾病诊断性的检测，其特征在于，所述方法包括：

(1)以待测基因为模板，以正向引物和反向引物为引物，以高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶混合酶进行PCR扩增；所述的高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶的比例是(0.05-0.3):1；

所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物，以其3’末端碱基起算第1-8位的任意1个或多个碱基对应待测突变位点，但与野生型序列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所述的辨别性引物的3’末端核苷戊糖3号C的羟基进行双脱氧修饰；

所述的正向或反向引物中辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游且与相应区段上碱基序列完全匹配；

(2)分析PCR扩增产物，若获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点存在突变；若未获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点不存在突变。

2.一种检测基因突变的方法，所述的检测是非疾病诊断性的检测，其特征在于，所述方法包括：

(1)’以待测基因为模板，以正向引物和反向引物为引物，以高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶混合酶进行PCR扩增；所述的高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶的比例是(0.05-0.3):1；

其中，所述的正向或反向引物中任一条为辨别性引物，以其3’末端碱基起算第1-8位的任意1个或多个碱基对应待测突变位点，但与突变型序列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所述的辨别性引物的3’末端核苷戊糖3号C的羟基进行双脱氧修饰；

所述的正向或反向引物中辨别性引物以外的另一引物位于基因突变位点下游或上游且与相应区段上碱基序列完全匹配；

(2)’分析PCR扩增产物，若获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点不存在突变；若未获得扩增产物，则表明待测基因的待测突变位点存在突变。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的突变包括：点突变、插入突变、缺失突变。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；所述的非高保真DNA聚合酶是不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶包括：Pfu DNA聚合酶、

HS DNA聚合酶、Q5^TM超保真DNA聚合酶等。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的非高保真DNA聚合酶包括：Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶的比例是(0.1-0.2):1。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶的比例是(0.14-0.19):1。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)或(2’)中，通过电泳检测扩增产物；或通过荧光定量方法检测扩增产物。

10.一种用于检测待测基因的待测突变位点上是否存在突变的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：

正向引物和反向引物，其一作为辨别性引物，以其3’末端碱基起算第1-8位的任意1个或多个碱基对应待测突变位点，但与野生型或突变型序列相应区段上碱基序列完全匹配；且，所述的辨别性引物的3’末端核苷戊糖3号C的羟基进行双脱氧修饰；

正向引物和反向引物中另一引物位于基因突变位点下游或上游且与相应区段上碱基序列完全匹配；该引物为正常引物，不经任何修饰；以及

高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶，且所述的高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶的比例是(0.05-0.3):1。

11.权利要求10的检测试剂盒的用途，用于检测待测基因的待测突变位点上是否存在突变，所述的检测是非疾病诊断性的检测。

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