CN109735607A - 一种双脱氧核苷封闭的寡核苷酸的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种双脱氧核苷封闭的寡核苷酸的制备方法及其应用，具体地，本发明首次利用末端转移酶(TdT)催化脱氧核苷酸(dNTPs)或双脱氧核苷酸(ddNTPs)结合到DNA分子的3'羟基端的特性，将引物与四种双脱氧核苷酸(ddATP，ddTTP，ddCTP或ddGTP)中的任何一种混合，TdT可以将双脱氧核苷酸添加到引物的3’端，所获得的这种被ddNTP修饰的引物不能被DNA聚合酶催化延伸。本发明所制备的双脱氧封闭的寡核苷酸(引物)可以与等位基因PCR、校读(proof‑reading)PCR等扩增方法联用，用于检测突变。

Description

一种双脱氧核苷封闭的寡核苷酸的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，更具体地说，涉及一种双脱氧核苷封闭的寡核苷酸的制备方法及其应用。

背景技术

点突变也称作单碱基替换，指由单个碱基改变发生的突变，可以分为转换和颠换两类。转换是指嘌呤和嘌呤之间的替换或嘧啶和嘧啶之间的替换；颠换是指嘌呤和嘧啶之间的替换。DNA分子中单碱基突变广泛存在于生物体遗传信息的编码中，是导致遗传性疾病的重要原因之一。就人类基因组而言，在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，主要是指在染色体基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，而其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1％。这种多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致，但通常所说的SNP并不包括后两种情况。SNP的检测分析，可应用于医学上疾病易感性研究，解释个体间的表型差异对疾病的易感程度；可应用于药物基因组学及临床耐药研究，分析不同基因型个体对药物反应的差异，指导药物开发及临床合理用药；可应用于种族遗传学和连锁不平衡性分析；还在基因组制图以及遗传育种等方面有重大意义。

点突变、缺失和插入突变所造成的基因理化特性改变甚微，无疑使与之相关的检测非常困难，目前对单核苷酸突变位点的检测技术主要包括：单链构象多态性(Single-Strand Conformational Polymorphism，SSCP)技术、异源双链分析(hereroduplexanalysis，HA)技术、变性高效液相色谱法(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)、变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)、化学错配裂解法(chemical mismatch cleavage，CMC)、焦磷酸序列(Pyrosequencing)分析技术、质谱法(mass spectrometry)、DNA芯片(DNA chip)技术、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、等位基因特异性PCR(allele specific PCR，ASPCR)、分子信标(molecular beacons)技术等。这些传统的检测方法大多操作复杂、费时繁琐且特异性、灵敏性及准确性较差。

因此，本领域迫切需要开发简单、准确和花费少的制备双脱氧核苷的方法，应用于快速进行基因突变检测。

发明内容

本发明的目的在于提供简单、准确和花费少的制备双脱氧核苷的方法，应用于快速进行基因突变检测。

本发明的第一方面提供了一种检测突变体的试剂，所述的试剂包括以下组分：

(a)第一引物，所述第一引物结构如下式I所示：

Z₁-F₁(I)

式中，

F₁为任选的荧光基团或淬灭基团；

Z₁为互补结合区，长度为L₁个核苷酸；

其中，Z₁任选的与F₂相连，其中F₂为任选的荧光基团或淬灭基团；并且F₁和F₂两者中一个为荧光基团，另一个为淬灭基团；

(b)第二引物，所述第二引物为正常引物或与第一引物结构相同；

(c)高保真DNA聚合酶，所述高保真DNA聚合酶为具有外切活性的DNA聚合酶；和

(d)非高保真DNA聚合酶，所述非高保真DNA聚合酶不具有外切活性的DNA聚合酶；

(e)末端转移酶；和

(f)ddNTP。

在另一优选例中，L1为15-30，较佳地18-22，更佳地20。

在另一优选例中，第一引物和第二引物的长度为15-50个核苷酸；较佳地，20-40个核苷酸。

在另一优选例中，所述扩增体系中有M种引物对，其中M为≥1的正整数，较佳地，所述M为≥2的正整数，更佳地，所述M为≥3的正整数，更佳地，所述M为≥4的正整数，更佳地，所述M为≥5的正整数。

在另一优选例中，所述高保真DNA聚合酶选自下组：KOD^TMDNA聚合酶、HS DNA聚合酶、Q5^TM超保真DNA聚合酶，pfu DNA聚合酶，Blend Taq DNA聚合酶、Phi9DNA聚合酶、Klenow酶、或其组合。

在另一优选例中，所述非高保真DNA聚合酶选自下组：Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、或其组合。

在另一优选例中，所述正常引物是未经任何基团(包括荧光和淬灭基团)修饰的引物，其与模板序列完全互补配对。

在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：FAM、Cy5、Texas Red、HEX、VIC、TET、JOE、TAMRA、ROX、LC Red610、LC Red640、LCCyan500、Yakima Yel low、或其组合。

在另一优选例中，所述高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶的比例为(0.01-0.5):1，较佳地为(0.03-0.2):1；更佳地为(0.04-0.08):1。

在另一优选例中，高保真DNA聚合酶的添加量为0.0004-0.04U/μl，较佳地为0.002-0.02U/μl。

在另一优选例中，所述F₁为荧光基团，所述F₂为淬灭基团。

在另一优选例中，所述末端转移酶包括末端转移酶(小牛胸腺)。

在另一优选例中，所述末端转移酶的添加量为0.3-1U/μl，较佳地，0.6-0.95U/μl，更佳地，0.80-0.93U/μl。

在另一优选例中，所述ddNTP选自下组：ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP、或其组合。

在另一优选例中，所述ddNTP的添加量为0.2-1mM，较佳地，0.2-0.5mM，更佳地，0.25-0.3mM。

在另一优选例中，所述试剂还包括选自下组的一种或多种组分：

(a1)dNTP；

(a2)末端转移酶；

(a3)TdT buffer；

(a4)1％BSA；

(a5)ddNTP；

(a6)引物；

(a7)磷酸酶。

本发明第二方面提供了一种核酸扩增体系，所述的体系包括：用于扩增的缓冲体系和位于所述体系中的本发明第一方面所述的试剂。

本发明第三方面提供了一种核酸扩增方法，所述方法包括步骤：利用如本发明第一方面所述的试剂或如本发明第二方面所述的扩增体系，对待测样品进行核酸扩增。

在另一优选例中，利用不同荧光和淬灭基团标记针对不同待测位点的荧光引物。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的方法。

本发明第四方面提供了一种非治疗性和非诊断性检测突变体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)利用如本发明第一方面所述的试剂、本发明第二方面所述的体系或本发明第三方面所述的方法，对待测样品进行实时荧光核酸扩增；和(b)分析实时荧光核酸扩增反应扩增曲线，从而判定所述待测样品是否存在突变、和/或确定所述待测样品的突变位点。

在另一优选例中，反应结果可以通过荧光定量PCR检测反应中出现的荧光信号或扩增曲线，或者通过电泳检测扩增产物。

在另一优选例中，通过标准曲线和扩增曲线的Ct(阈循环数)值来确定基因的表达量，或者通过比较目的基因和参照基因的Ct值进行相对定量。

本发明第五方面提供了一种如本发明第一方面所述的试剂、本发明第二方面所述的体系或本发明第三方面所述的方法的用途，用于点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变的单重或多重检测。

本发明第六方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：(a)如本发明第一方面所述的试剂；(b)容器。

在另一优选例中，所述试剂盒用于检测待测基因(疾病相关基因、药物代谢、药物治疗相关基因等)的待测突变位点上是否存在突变。

在另一优选例中，所述试剂盒用于检测人类遗传性疾病、长寿衰老相关的基因、健康风险相关的基因、疾病易感基因、肿瘤个性化治疗相关SNP、病原体耐药检测。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了利用末端转移酶可以制备ddNTP封闭的引物。

图2显示了磷酸酶可以被热灭活。

图3显示了热敏磷酸酶对ddATP发挥作用。

图4显示了ddNTP对普通PCR影响很小。

图5显示了利用末端转移酶制备ddATP封闭的引物。

图6显示了利用校正PCR(proofreading PCR)对突变体进行区分。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种可简便、快速、灵敏、准确地检测突变体的试剂及方法。具体地，本发明首次利用末端转移酶(TdT)催化脱氧核苷酸(dNTPs)或双脱氧核苷酸(ddNTPs)结合到DNA分子的3'羟基端的特性，将引物与四种双脱氧核苷酸(ddATP，ddTTP，ddCTP或ddGTP)中的任何一种混合，TdT可以将双脱氧核苷酸添加到引物的3’端，所获得的这种被ddNTP修饰的引物不能被DNA聚合酶催化延伸。本发明所制备的双脱氧封闭的寡核苷酸(引物)可以与等位基因PCR、校读(proof-reading)PCR等扩增方法联用，用于检测突变(单核苷酸多态性，耐药突变，插入和缺失突变等)、病原体或者用于基因表达定量等。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，碱基的“匹配”或“配对”是指两条核苷酸序列中相应的碱基按照A与T，G与C配对的原则形成反向互补的双链结构。

如本文所用，本文所用“完全匹配”是指引物与模板之间序列完全互补，不存在任何碱基错配。

如本文所用，本发明中，“3号C”是指戊糖上的一个C，其编号是以戊糖上连接碱基的C为1号，顺时针依次编号(如式(I))，位于第3位的C即称为“3号C”。

可以利用本发明的方法对引物3’末端进行双脱氧封闭，同时可以应用高保真DNA聚合酶3’-5’外切酶校读活性对突变体进行检测。DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3号C上缺少一个羟基。如果引物与模板(野生型或突变型)完全互补配对，则高保真DNA聚合酶将不对引物进行3’-5’校对，封闭的引物由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此不能启动DNA合成；当引物与模板(突变型或野生型)不完全匹配，高保真DNA聚合酶将发挥其3’-5’校对功能，利用其3’-5’外切酶活性，切除3’羟基被封闭的核苷，暴露出正常3’羟基，可以在非高保真DNA聚合酶催化下形成3-5磷酸二酯键，从而进行DNA合成(即PCR扩增)。

制备ddNTP封闭引物3’末端的方法

本发明是利用末端转移酶(TdT)不依赖模板催化脱氧核苷酸(dNTPs)或双脱氧核苷酸(ddNTPs)结合到DNA分子的3'羟基端的特性，将寡核苷酸与四种双脱氧核苷酸(ddATP，ddTTP，ddCTP或ddGTP)中的任何一种混合，TdT可以将双脱氧核苷酸添加到寡核苷酸的3’端。得到的这种被ddNTP修饰的寡核苷酸3’由于缺乏3’-OH，故而不能被DNA聚合酶催化延伸。磷酸酶(如碱性磷酸酶等)可以催化核酸分子或核苷酸(包括NTPs，dNTPs和ddNTPs)脱掉5’磷酸基团，将双脱氧核苷酸(ddNTP)的5’磷酸基团切除，成为5’-OH末端。利用磷酸酶和核酸纯化的方式可以破坏多余的双脱氧核苷酸。本方法制备的双脱氧封闭的寡核苷酸(引物)可以与等位基因PCR，校读(proof-reading)PCR等扩增方法联用，用于检测突变(单核苷酸多态性，耐药突变，插入和缺失突变等)、病原体或者用于基因表达定量等。

本发明提供了一种制备ddNTP封闭引物3’末端的方法。

具体地，在本发明中，制备ddNTP封闭引物3’末端步骤如下：

步骤1，根据基因序列设计正向和反向引物，利用末端转移酶对其中一条引物3’末端进行催化反应。末端转移酶(TdT)的特性是不依赖模板直接将ddNTPs添加到引物3’末端最后一个核苷戊糖上3号C上的羟基上，从而封闭3’末端核苷戊糖的3号羟基；

步骤2，用所述的磷酸酶对反应体系中多余的ddNTP进行灭活，抑制其对正常PCR的影响。磷酸酶可以催化ddNTPs脱掉5’磷酸基团，虽然也会切割引物5’末端的磷酸基团，但是对反应没有影响。

步骤3，通过SYBR Green I检测扩增曲线和电泳检测扩增产物可以判断是否制备ddNTP封闭的引物得到成功。

所述步骤1中，使用的磷酸酶包括任何任何来源的、具有催化核酸分子或核苷酸(包括NTPs，dNTPs和ddNTPs)脱掉5’磷酸基团，将底物成为5’端成为-OH末端的酶(例如热敏磷酸酶、虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、人碱性磷酸酶等)。本发明的方法可以轻易实现四种ddNTP封闭的引物。

在一优选实施方式中，本发明提供了一种利用末端转移酶和碱性磷酸酶制备双脱氧封闭的寡核苷酸(引物)方法，所述方法包括：

(1)以待测基因为模板，以正向引物和反向引物为引物，以非高保真DNA聚合酶进行实时荧光PCR扩增；

所述的正向或反向引物中任一条为辨识性引物，其3’末端碱基对应待测突变位点的前一个碱基，即与野生型模板完全一样，所述的辨别性引物是由末端转移酶将双脱氧核苷酸添加到引物的3’端而来的，即通过末端转移酶对其的3’末端核苷戊糖3号C的羟基进行双脱氧修饰；

(2)利用磷酸酶对体系中多于的ddNTP进行脱磷酸反应，抑制其对正常PCR反应的影响；

(3)分析PCR荧光曲线和扩增产物，若获得扩增产物，则表明末端转移酶对引物末端进行ddNTP封闭成功。

本发明人在研究中发现，碱性磷酸酶的buffer会对普通PCR反应产生抑制作用，同时磷酸酶活性很强可以适合相应PCR试剂盒中的buffer，若是体系中不加入磷酸酶的buffer，磷酸酶照常发生催化作用。另外，由于ddNTP对普通PCR的影响本身就很微弱，因此，体系中可以不用加入磷酸酶，这样简化的制备步骤，也节约了时间和提高了效率。

通过本发明所述制备方法对引物3’末端进行ddNTP封闭过程中，实验操作简便快捷，检测结果准确可靠。与现有所有制备此种封闭引物的方法相比，本发明在实际操作的简易程度以及实验结果的准确度上均具有明显的优越性。

探针

探针是一种寡核苷酸序列，与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对，探针5’端一般连接荧光基团，3’端连接淬灭基团。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系，呈现一种S型曲线。

本发明在这里将荧光引物命名为HFman探针，以区分于普通荧光定量中TaqMan探针。

荧光引物

在本发明检测试剂中，所述的引物对中，至少一个引物是特殊结构的荧光引物对。

在本发明中，通常在引物的3’端进行修饰或封闭。典型地，引物3’羟基被修饰和封闭的类型可以是荧光基团也可以是封闭基团。

荧光基团可以标记在荧光引物的5’端，也可以标记在3’端，相应地，其淬灭基团标记在荧光引物的3’端或5’端，标记在荧光引物3’端的荧光基团或淬灭基团封闭3’端的-OH(羟基)，使其在正常PCR扩增反应中无法延伸。

代表性的荧光基团的例子包括(但并不限于)：FAM、Cy5、Texas Red、HEX、VIC、TET、JOE、TAMRA、ROX、LC Red610、LC Red640、LCCyan500、YakimAYellow、或其组合。

代表性的封闭基团的例子包括(但并不限于)：BHQ1、BHQ3、Ecl ipse、TAMRA、BHQ2、Dabcyl、或其组合。

在本发明中，被修饰的核苷酸种类没有特别限制，可以是：A、T、C、G或其组合。

在本发明中，优化的反应体系可以使用单荧光引物或多重荧光引物。

在优选例中，采用在3’端标记荧光基团方式，这样可获得最佳的检测效果，并且可以进一步提高检测的灵敏度，更容易和更灵敏地反映高保真DNA聚合酶对荧光引物的3’末端切割和延伸。

实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。

高保真DNA聚合酶

在本发明中，一个重要的特征是采用少量的高保真DNA聚合酶。如本文所用，“高保真DNA聚合酶”指具有识别发生错配的“引物-模板”复合物并从所述复合物中切除发生错配的引物的错配区(或错配碱基)的DNA聚合酶。该术语优选识别和切除位于错配引物的3’端的错配碱基的DNA聚合酶。

在本发明中，所述的高保真DNA聚合酶没有特别限制，可以包括任何具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶。代表性的例子包括(但并不限于)：KOD^TMDNA聚合酶、HSDNA聚合酶、Q5^TM超保真DNA聚合酶，pfu DNA聚合酶，Blend Taq DNA聚合酶、Phi9DNA聚合酶、Klenow酶、或其组合。

非高保真DNA聚合酶

在本发明中，一个重要的特征是采用大量非高保真DNA聚合酶。如本文所用，“非高保真DNA聚合酶”具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，但不能识别和切除位于错配引物的3’端的错配碱基的DNA聚合酶。

在本发明中，所述的非高保真DNA聚合酶没有特别限制，可以包括任何不具有或基本不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶。代表性的例子包括(但并不限于)：Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、或其组合。

本发明的应用

本发明可广泛用于诊断和非诊断性的检测，并且可用于点突变(耐药)、单核苷酸多态性、插入和缺失突变的检测。

在另一类优选例中，本发明的检测可以是针对食品、病原微生物(细菌、病毒等)的检测。

在一优选实施方式中，本发明用于检测待测基因(疾病相关基因、药物代谢、药物治疗相关基因等)的待测突变位点上是否存在突变。

此外，本发明可广泛用于人类遗传性疾病、长寿衰老相关的基因、健康风险相关的基因、疾病易感基因、肿瘤个性化治疗相关SNP、病原体耐药检测。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次提供一种双脱氧核苷封闭的寡核苷酸的制备方法，可以与等位基因PCR，校读(proof-reading)PCR等扩增方法联用，用于检测突变(单核苷酸多态性，耐药突变，插入和缺失突变等)、病原体或者用于基因表达定量等相关的领域。

(2)通过本发明所述制备方法对引物3’末端进行ddNTP封闭过程中，实验操作简便快捷，检测结果准确可靠。与现有所有制备此种封闭引物的方法相比，本发明在实际操作的简易程度以及实验结果的准确度上均具有明显的优越性。

(3)与现有所有应用于点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变检测方法相比，本发明引物设计简单，实验操作简便快捷，检测结果准确可靠。

(4)本发明在实际操作的简易程度以及实验结果的准确度上均具有明显的优越性，并且无论是针对转录本RNA的检测还是DNA的检测都能够实现准确的分辨突变。

(5)本发明的方法使可以广泛用于病原微生物(细菌、病毒等)的核酸检测，以及人类遗传性疾病、长寿衰老相关的基因、健康风险相关的基因、疾病易感基因、肿瘤个性化治疗相关SNP、病原体耐药检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。

实施例1利用末端转移酶可以制备ddNTP封闭的引物

本发明人选取并克隆了人源乙醛脱氢酶(ALDH2)rs671的一个基因组DNA片段，该序列包含一个亚洲人常见的点突变，常作为解酒基因检测的靶标。该区域的显性纯合子为GG等位基因，杂合子为GA等位基因，隐形纯合子为AA等位基因。我们将显性突变序列命名为ALDH-G，隐形基因突变命名为ALDH-A。根据模板设计两个引物，上游引物F2和下游引物R1。上游引物F2与突变位点前的序列完全相同，下游引物与模板完全互补配对。利用末端转移酶(TdT)将ddGTP转移到F2引物末端，再用这个封闭引物进行正常PCR扩增。正常情况下，TaqDNA聚合酶不能切割ddNTP封闭的引物，故而不能扩增产物。

引物序列如下

ALDH-F2：5-agtacgggctgcaggcatacact-3(SEQ ID NO.3)

ALDH-R1：5-cgagccaccagcagaccctc-3(SEQ ID NO.2)

反应体系：ALDH-F2、R1(10uM)1ul,5*TdT buffer 3ul，0.1％BSA 1.5ul，ddGTP(10mM)0.4ul，TdT酶(14U/ul)1ul，加水至20ul。

反应条件：37℃30min，75℃20min灭活

之后在以上反应产物中加入CIP 2ul、3ul H2O，混匀，总体积20ul，37℃1h脱磷，95℃20min灭活进行后续PCR实验。

后续PCR反应体系如下：

反应热循环条件如下：

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为2％琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的50bp DNA Marker。PCR扩增曲线及产物电泳结果如图1所示，实验组1是普通PCR对照，即引物不经过任何处理；实验组2(引物未经过末端转移酶处理，但是经过碱性磷酸酶处理)有扩增曲线和目的产物，实验组3(引物经过末端转移酶和碱性磷酸酶处理)则无扩增和目的产物，说明末端转移酶可以制备ddNTP修饰的引物。

实施例2磷酸酶可以被热灭活

本次实施实例中选取和实施例1中完全一样的ALDH-A模板质粒，根据选取序列设计一个上游引物F1和一个下游引物R1。

引物序列如下：

上游引物F1：5’-ttcaaattacagggtcaact-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物R1：5’-cgagccaccagcagaccctc-3’(SEQ ID NO.2)

反应体系:ddATP(10mM)2ul，普通磷酸酶和热敏磷酸酶各20U，10*buffer2ul，加水至10ul。

反应条件：先是37℃反应一小时，接下来再对含有普通磷酸酶的实验组95℃加热10min，对加有热敏磷酸酶的实验组80℃加热10min。

按照上述反应体系和体系在PCR仪上进行反应，其中反应体系中的ddATP(#12068)为Sigma公司的产品，小牛碱性磷酸酶(#M0290V)和热敏磷酸酶(#M0289V)均采自NEB公司。

反应体系：

反应条件：

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，其中反应体系中的buffer,dNTP和Enzyme mix是Qiagen onestep RT-PCR kit(210210)中的成分，属于Qiagen公司的产品。反应终点时，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为2％琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的DL 2000DNA Marker(3427A)。荧光定量PCR扩增曲线及产物电泳结果如图2，1组和3组(灭活组)产物相当多于2和4组(未灭活组)，灭活组的扩增曲线也明显高于未灭活组，这些结果说明热敏磷酸酶和碱性磷酸酶都可以被热失活。

实施例3热敏磷酸酶对ddATP发挥作用

使用与实施例2中完全相同的一对引物和模板，利用实施例2中被磷酸酶处理过的ddATP进行onestep RT-PCR荧光定量实验，证明热敏磷酸酶对ddATP发挥作用。

反应体系如下：

反应热循环条件如下：

反应条件：

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为2％琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的DL 2000DNA Marker(3427A)。PCR扩增曲线及产物电泳结果如图3所示，加入正常的dNTP同时不加入ddATP的实验组扩增曲线最好，而将dATP置换成ddATP的实验组无扩增；其次，加入正常的dNTP同时加入ddATP(经过磷酸酶处理，但是磷酸酶被灭活)的实验组扩增曲线较好，而加入dNTP同时加入ddATP(经过磷酸酶处理，但是磷酸酶未被灭活)的实验组最差，表明热敏磷酸酶对ddATP发挥了作用，使其脱磷，脱磷后的ddATP不能被DNA polymerase利用。

实施例4ddNTP对普通PCR影响很小

本实施例中使用与实施例2中完全相同的一对引物和模板，设置相应的实验组证明少量ddATP对正常反应体系(PCR)的影响很微弱，同时证明CIP(碱性磷酸酶)和其buffer的加入反而会较严重影响PCR扩增反应，降低扩增效率。

反应体系:dNTP(10mM)1ul,ddATP(10mM)2ul，普通磷酸酶(CIP)和热敏磷酸酶各20U，10*buffer 2ul，加水至10ul。

反应条件：37℃反应一小时，95℃加热10min。

按照上述反应体系和体系在PCR仪上进行反应，对ddATP进行不同的处理。接下来去取上述产物进行普通的PCR，观察扩增曲线和电泳产物。

反应体系：

反应条件：

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为2％琼脂糖凝胶。荧光定量PCR扩增曲线及产物电泳结果如图4所示，碱性磷酸酶(CIP)未热变性对后续PCR反应有很大影响，热变性后(4)对后续PCR反应仍有影响(与正常对照组1#相比)，有可能是残留的CIPbuffer缓冲液对后续的PCR反应有负面影响，但可以肯定的是残留的ddATP对PCR反应影响不大，因为实验组1(dNTP)和实验组2(dNTP+ddATP)的荧光扩增曲线相似，且电泳条带亮度也相似，表明在dNTP四种核苷酸等量共存的情况下，ddATP本身对PCR反应的影响比较小；实验组3(加入的ddATP被碱性磷酸酶处理且之后未被热失活)比实验组4(加入的ddATP被碱性磷酸酶处理且之后被热失活)的扩增曲线要差很多且电泳也弱很多，说明CIP是可以被热失活的，与实施例一中的结论一样，同样的的结论也出现在实验组5和实验组6的比较中；实验组6(无ddATP，加入被热失活的碱性磷酸酶)的扩增曲线明显比实验组1(不加入碱性磷酸酶和ddATP)的扩增曲线要若不少，电泳条带同样的暗淡一些，这说明CIP的体系对正常的PCR体系有抑制作用。因此，制备3’末端被ddNTP封闭的引物时，可以不去除体系中ddNTP即不使用磷酸酶(因为ddNTP对反应影响小)或者尽可能找到一种既适合DNA聚合酶的buffer也适合CIP的buffer。

实施例5利用末端转移酶制备ddNTP封闭的引物

本实施例中使用与实施例一中完全一样的模板ALDH-A质粒，并根据模板设计两个引物，上游引物F2和下游引物R2。上游引物F2与突变位点前的序列完全相同，下游引物与模板完全互补配对。利用末端转移酶(TdT)将ddATP/ddGTP转移到F2引物末端，再用这个封闭引物进行正常PCR扩增。正常情况下，Taq DNA聚合酶不能切割ddNTP封闭的引物，故而不能扩增产物。

引物序列如下

ALDH-F2：5-agtacgggctgcaggcatacact-3(SEQ ID NO.3)

ALDH-R1：5-cgagccaccagcagaccctc-3(SEQ ID NO.2)

反应体系：ALDH-F2、R1(10uM)1ul,5*TdT buffer 3ul，0.1％BSA 1.5ul，ddATP(10mM)0.4ul，TdT酶(14U/ul)1ul，加水至20ul。

反应条件：37℃30min，75℃20min灭活

之后在以上反应产物中加入CIP cutsmart buffer 2ul和CIP 2ul、1ul H2O，混匀，总体积20ul，37℃1h脱磷，95℃20min灭活进行后续PCR实验。

后续PCR反应体系如下：

反应热循环条件如下：

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为2％琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的DL2000DNA Marker(3427A)。PCR扩增曲线及产物电泳结果如图5所示，实验组1(加入未经过处理的ALDH-F)扩增曲线和电泳条带最好，未加TdT的反应可以得到比较好的扩增；而实验组3和5(均加入TdT)无扩增曲线和电泳条带，说明TdT的末端转移酶活性相当好，ddATP被加到引物末端后对PCR实验有强烈的抑制，即引物末端被ddATP封闭使其无法进行扩增；其次，实验组4(未加入CIP buffer)的扩增曲线和电泳条带比实验组2(加入CIP buffer)要略好，说明CIP buffer会抑制扩增反应，同时也表明CIP活性很强，可以在TdT的buffer中发挥比较好的活性。

以上均表明末端转移酶(TdT)可以不依赖模板催化双脱氧核苷(ddNTPs)结合到DNA分子的3'羟基端，得到的这种被ddNTP修饰的寡核苷酸3’由于缺乏3’-OH，故而不能被DNA聚合酶催化延伸。磷酸酶(如碱性磷酸酶等)可以催化ddNTPs脱掉5’磷酸基团，将双脱氧核苷酸(ddNTP)的5’磷酸基团切除，成为5’-OH末端，利用磷酸酶可以破坏多余的双脱氧核苷酸。同时还表明碱性磷酸酶可以不用加入，因为体系中多余的ddNTP对反应体系影响很小。本方法应用前景很广泛，可以联合其他方法如校准PCR对突变进行检测。

实施例6利用校正PCR(proof-reading PCR)对突变体进行区分

本实施例中选用和实施例1中一样的模板ALDH-G、ALDH-A质粒和上下游引物ALDH-F2和ALDH-R1进行实验。利用本方法对引物进行ddGTP的修饰，然后再使用proof-readingPCR对模板ALDH-A和ALDH-G质粒进行进行检测，从而区分突变体，证明本方法的应用性。选取赛默飞世尔科技(中国)有限公司的高保真酶High Fidelity PCR Enzyme Mix(#K0191)和Qiagen公司的Qiagen onestep RT-PCR kit(210210)中的非高保真酶进行实验。

反应体系：ALDH-F2、R1(10uM)1ul,5*TdT buffer 3ul，0.1％BSA 1.5ul，ddGTP(10mM)0.4ul，TdT酶(14U/ul)1ul，加水至20ul。

反应条件：37℃30min，75℃20min灭活

后续PCR反应体系如下：

反应热循环条件如下：

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为2％琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的50bp DNA Marker。PCR扩增曲线及产物电泳结果如图6所示，引物利用本方法被ddGTP修饰后，模板ALDH-G不能被扩增，模板ALDH-A可以被扩增。当被ddNTP修饰的引物末端碱基与模板错配时，高保真酶会识别错配碱基并将其切除，从而可以继续扩增，若是引物和模板完全匹配，则高保真酶难以识别ddNTP修饰的碱基，故而难以扩增。同样地，引物被ddATP修饰后，ALDH-A模板扩增曲线和条带明显比ALDH-G弱很多。以上实验说明本方法可以制备ddNTP修饰的引物，并且可以应用proof-reading PCR对突变体进行区分，很多实用性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海巴斯德研究所

<120> 一种双脱氧核苷封闭的寡核苷酸的制备方法及其应用

<130> P2017-0438

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

ttcaaattac agggtcaact 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

cgagccacca gcagaccctc 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

agtacgggct gcaggcatac act 23

Claims (10)

1.一种检测突变体的试剂，其特征在于，所述的试剂包括以下组分：

(a)第一引物，所述第一引物结构如下式I所示：

Z₁-F₁ (I)

式中，

F₁为任选的荧光基团或淬灭基团；

Z₁为互补结合区，长度为L₁个核苷酸；

其中，Z₁任选的与F₂相连，其中F₂为任选的荧光基团或淬灭基团；并且F₁和F₂两者中一个为荧光基团，另一个为淬灭基团；

(b)第二引物，所述第二引物为正常引物或与第一引物结构相同；

(c)高保真DNA聚合酶，所述高保真DNA聚合酶为具有外切活性的DNA聚合酶；和

(d)非高保真DNA聚合酶，所述非高保真DNA聚合酶不具有外切活性的DNA聚合酶；

(e)末端转移酶；和

(f)ddNTP。

2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶选自下组：KOD^TMDNA聚合酶、HS DNA聚合酶、Q5^TM超保真DNA聚合酶，pfu DNA聚合酶，Blend Taq DNA聚合酶、Phi9DNA聚合酶、Klenow酶、或其组合。

3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述非高保真DNA聚合酶选自下组：Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、或其组合。

4.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶的比例为(0.01-0.5):1，较佳地为(0.03-0.2):1；更佳地为(0.04-0.08):1。

5.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述末端转移酶的添加量为0.3-1U/μl，较佳地，0.6-0.95U/μl，更佳地，0.80-0.93U/μl。

6.一种核酸扩增体系，其特征在于，所述的体系包括：用于扩增的缓冲体系和位于所述体系中的权利要求1所述的试剂。

7.一种核酸扩增方法，其特征在于，所述方法包括步骤：利用如权利要求1所述的试剂或如权利要求6所述的扩增体系，对待测样品进行核酸扩增。

8.一种非治疗性和非诊断性检测突变体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)利用如权利要求1所述的试剂、权利要求6所述的体系或权利要求7所述的方法，对待测样品进行实时荧光核酸扩增；和(b)分析实时荧光核酸扩增反应扩增曲线，从而判定所述待测样品是否存在突变、和/或确定所述待测样品的突变位点。

9.一种如权利要求1所述的试剂、权利要求6所述的体系或权利要求7所述的方法的用途，其特征在于，用于点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变的单重或多重检测。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：(a)如权利要求1所述的试剂；(b)容器。