CN112029837A - 一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于试剂盒技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述探针的长度为46～52个碱基，其中SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃(THF)替代，探针的5’端距THF至少间隔30个碱基，3’端距THF至少间隔15个碱基。本发明提供了一种快速用于基因分型检测的LNA‑恒温扩增的新方法。RMA技术反应条件较温和，不存在DNA模板高温变性，只需常温条件下就能进行反应；反应时间也较短，在15～30min就可以得到能检测到的扩增片段；通过荧光探针的使用，可以实现快速实时检测。而锁核酸修饰探针能够提高单碱基突变检测特异性，适用于基因分型检测。
Description
技术领域
本申请属于试剂盒技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒及其检测方法。
背景技术
单核苷酸多态性(SNP)，指的是个体间DNA组序列同一位置单个核苷酸变异所引起的多态性。SNP位点是单个碱基的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，但大多数是转换。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因。SNPs的二态性，也有利于对其进行基因分型。目前，有许多方法被用来SNP的分型，如Taqman-MGB探针法、直接测序、限制性片段长度多态性分析法等。但是这些方法基本上全部依赖于PCR，操作复杂、检测周期长、需要复杂的仪器设备、成本较高。
重组酶聚合酶扩增(RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。与PCR相比，RMA具有反应温度恒定、操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。其原理是重组酶与引物结合形成复合体，并在双链DNA中识别同源序列；然后重组酶解开双链，引物与同源序列发生链交换反应并启动DNA合成，对模板进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。RMA产物的检测方法有凝胶电泳、实时荧光检测方法(real-time-RMA)、侧流层析(LFD-RMA)等。
锁核酸(LNA)是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，其结构中核糖的2'-O位和4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，提高了PCR反应中DNA分子的稳定性和亲和力。研究发现，在错配位点修饰1-3个锁核酸可明显提高单碱基错配的识别能力。LNA修饰的探针比传统的DNA探针有更高的灵敏度、稳定性、扩增效率和较低的探针浓度，是一种更为可靠的检测基因分型的方法。
本发明采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法进行基因分型检测，更加快速、简便，能够提高单碱基突变检测的特异性和灵敏度。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒及其检测方法，本申请是通过下述方案实现的：
一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述探针的长度为46～52个碱基，其中SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃(THF)替代，探针的5’端距THF至少间隔30个碱基，3’端距THF至少间隔15个碱基。
优选的，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、锁核酸修饰的检测SNP位点用的野生型探针(10μM)、锁核酸修饰的检测SNP位点用的突变型探针(10μM)、酶混合物、反应缓冲液、醋酸镁。
优选的，所述酶混合物包括大肠杆菌RecA蛋白、单链结合蛋白GP32、噬菌体UvsY蛋白、Bst聚合酶和核酸外切酶III。
优选的，所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述猝灭基团修饰在THF 3’端的T碱基上，荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上；荧光基团修饰的T碱基与猝灭基团修饰的T碱基间隔2～5个碱基。
优选的，所述荧光基团用FAM(6-羧基荧光素)或HEX(六氯-6-甲基荧光素)修饰，所述淬灭基团用BHQ(黑洞猝灭基团)修饰；所述探针3′末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。
优选的，所述SNP位点为A或C，所述SNP位点互补碱基为T或G；所述LNA探针覆盖SNP位点，在探针上SNP位点的上做LNA标记。
一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒的检测方法，步骤如下：(1)提取待测样本DNA作为模板；(2)RMA扩增体系的配制：
| 试剂 | 用量/μL |
| 上游引物(10μM) | 2.0 |
| 下游引物(10μM) | 2.0 |
| 野生型探针(10μM) | 0.6 |
| 突变型探针(10μM) | 0.6 |
| 反应的酶干粉 | 1管 |
| 缓冲液buffer | 29.5 |
| 醋酸镁(MgAc)(280mM) | 2.5 |
| 模板DNA | 2.0 |
| ddH<sub>2</sub>O | 10.8 |
| 总体积 | 50.0 |
反应体系在39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增20分钟；(3)检测结果判定：对于野生纯合型样本，只有野生型探针产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；对于突变纯合型样本，只有突变型探针产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；对于突变杂合型样本，突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。
有益效果：本发明提供了一种快速用于基因分型检测的LNA-恒温扩增的新方法。RMA技术反应条件较温和，不存在DNA模板高温变性，只需常温条件下就能进行反应；反应时间也较短，在15～30min就可以得到能检测到的扩增片段；通过荧光探针的使用，可以实现快速实时检测。而锁核酸修饰探针能够提高单碱基突变检测特异性，适用于基因分型检测。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 CYP2D6 C188T位点野生纯合型样本检测结果；
图2 CYP2D6 C188T位点突变纯合型样本检测结果；
图3 CYP2D6 C188T位点突变杂合型样本检测结果；
图4 MTHFR C677T位点野生纯合型样本检测结果；
图5 MTHFR C677T位点突变纯合型样本检测结果；
图6 MTHFR C677T位点突变杂合型样本检测结果。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
LNA-RMA恒温扩增的方法用于人CYP2D6基因多态性的检测：
基于CYP2D6基因突变序列的互补序列设计的LNA-RMA检测引物和探针如下表所示：
(LNA修饰的突变位点碱基用斜体加粗加下划线表示；野生型探针的荧光基团用FAM(6-羧基荧光素)修饰，突变型探针的荧光基团用HEX(六氯-6-甲基荧光素)修饰，淬灭基团都用BHQ(黑洞猝灭基团)修饰。)
一种基于LNA-RMA技术检测人CYP2D6基因多态性的方法，包括以下步骤：
(1)采用血液基因组DNA提取试剂盒提取待测样本的全血DNA作为模板；
(2)采用上述检测CYP2D6*10基因突变(C188T)的引物和探针对待测样本DNA进行RMA扩增；
(3)采用50μL反应体系：向装有检测干粉的反应管中加入缓冲液Buffer 29.5μL，10μM的上下游引物各2.0μL，10μM的野生型和突变型探针各0.6μL，DNA 2.0μL，280mM醋酸镁(MgAc)2.5μL，dd H2O补足至50μL。在39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增20分钟；
RMA扩增体系的如下：
| 试剂 | 用量/μL |
| 上游引物(10μM) | 2.0 |
| 下游引物(10μM) | 2.0 |
| 野生型探针(10μM) | 0.6 |
| 突变型探针(10μM) | 0.6 |
| 反应的酶干粉 | 1管 |
| 缓冲液buffer | 29.5 |
| 醋酸镁(MgAc)(280mM) | 2.5 |
| 模板DNA | 2.0 |
| ddH<sub>2</sub>O | 10.8 |
| 总体积 | 50.0 |
(4)检测结果判定：通过实时恒温荧光检测器上显示的FAM和HEX探针的Ct值确定所检测的C188T位点的基因型。只有野生型探针检出阳性的样本为野生纯合型CC，如图1所示，蓝色曲线表示野生型探针为阳性；只有突变型探针检出阳性的为突变纯合型TT，如图2所示，紫色曲线表示突变型探针为阳性；而野生型探针和突变型探针都检出阳性的为突变杂合型CT(图3)。
实施例2
LNA-RMA恒温扩增的方法用于人MTHFR基因多态性的检测：
基于MTHFR基因突变序列的互补序列设计的LNA-RMA检测引物和探针如下表所示：
(LNA修饰的突变位点碱基用斜体加粗加下划线表示；野生型探针的荧光基团用FAM(6-羧基荧光素)修饰，突变型探针的荧光基团用HEX(六氯-6-甲基荧光素)修饰，淬灭基团都用BHQ(黑洞猝灭基团)修饰。)
一种基于LNA-RMA技术检测人MTHFR基因多态性的方法，包括以下步骤：
(1)采用血液基因组DNA提取试剂盒提取待测样本的全血DNA作为模板；
(2)采用上述检测MTHFR基因突变(C677T)的引物和探针对待测样本DNA进行RPA扩增；
(3)采用50μL反应体系：向装有检测干粉的反应管中加入缓冲液Buffer 29.5μL，10μM的上下游引物各2.0μL，10μM的野生型和突变型探针各0.6μL，DNA 2.0μL，280mM醋酸镁(MgAc)2.5μL，dd H2O补足至50μL，在39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增20分钟；
RMA扩增体系的如下：
| 试剂 | 用量/μL |
| 上游引物(10μM) | 2.0 |
| 下游引物(10μM) | 2.0 |
| 野生型探针(10μM) | 0.6 |
| 突变型探针(10μM) | 0.6 |
| 反应的酶干粉 | 1管 |
| 缓冲液buffer | 29.5 |
| 醋酸镁(MgAc)(280mM) | 2.5 |
| 模板DNA | 2.0 |
| ddH<sub>2</sub>O | 10.8 |
| 总体积 | 50.0 |
(4)检测结果判定：
通过实时恒温荧光检测器上显示的FAM和HEX探针的Ct值确定所检测的C677T位点的基因型。如图4所示，蓝色曲线表示野生型探针为阳性，而突变型探针没有产生荧光信号，说明该样本的基因型为野生纯合型(CC型)；如图5所示，绿色曲线表示突变型探针为阳性，而野生型探针没有产生荧光信号，说明该样本的基因型为突变纯合型(TT型)；而如图6所示，突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号，则说明该样本的基因型为突变杂合型(CT型)。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述探针的长度为46～52个碱基，其中SNP位点后一位碱基或SNP位点互补碱基的后一位碱基被四氢呋喃(THF)替代，探针的5’端距THF至少间隔30个碱基，3’端距THF至少间隔15个碱基。
2.如权利要求1所述的一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上游引物、下游引物、锁核酸修饰的检测SNP位点用的野生型探针(10μM)、锁核酸修饰的检测SNP位点用的突变型探针(10μM)、酶混合物、反应缓冲液、醋酸镁。
3.如权利要求2所述的一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述酶混合物包括大肠杆菌RecA蛋白、单链结合蛋白GP32、噬菌体UvsY蛋白、Bst聚合酶和核酸外切酶III。
4.如权利要求1所述的一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述探针修饰有荧光基团和猝灭基团，所述猝灭基团修饰在THF 3’端的T碱基上，荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上；荧光基团修饰的T碱基与猝灭基团修饰的T碱基间隔2～5个碱基。
5.如权利要求4所述的一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团用FAM(6-羧基荧光素)或HEX(六氯-6-甲基荧光素)修饰，所述淬灭基团用BHQ(黑洞猝灭基团)修饰；所述探针3′末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。
6.如权利要求1所述的一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述SNP位点为A或C，所述SNP位点互补碱基为T或G；所述LNA探针覆盖SNP位点，在探针上SNP位点的上做LNA标记。
7.如权利要求1所述的一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测SNP位点的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤如下：(1)提取待测样本DNA作为模板；(2)RMA扩增体系的配制：
反应体系在39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增20分钟；(3)检测结果判定：对于野生纯合型样本，只有野生型探针产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；对于突变纯合型样本，只有突变型探针产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；对于突变杂合型样本，突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。
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