CN110172500B - 一种单核苷酸多态性的等温分型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，提供一种等温条件下单核苷酸多态性(SNP)分型方法。该方法首先根据含SNP位点的目标序列设计相应的环介导等温扩增(LAMP)引物，保证SNP位点能出现在LAMP中间产物的单链环上除内引物互补序列外的大环区域。同时通过SNP所在的单链环区设计可特异性识别野生型和突变型SNP位点的短链寡核苷酸探针，利用不同类型寡核苷酸探针与LAMP中间产物的单链环区杂交稳定性的不同导致的扩增效率的显著差异来实现SNP的高分辨分型。该方法在等温条件下进行，无需精密的变温设备，便捷、准确、分辨率高，分型过程无需开盖操作，可以实现一步分型，适合于现场检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及单核苷酸多态性的等温检测与分型，具体涉及一种普适的利用短链寡核苷酸探针与环介导等温扩增中间产物的含SNP位点的单链环区的特异性杂交互补，将单核苷酸多态性的分型与探针对环介导等温扩增反应效率的作用相联系的方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是由单个核苷酸突变引发的个体之间的差异。SNP是人类基因组中最常见的突变形式，当前已经报导的SNP超过了900万。随着SNP概念的广泛使用，当前SNP不仅包含单个核苷酸的转换与颠换，还包含了位点的插入、缺失，且这些突变形式在人群中的频率不低于1％。由于SNP在基因中的广泛分布，出现在不同位置的SNP能够影响机体的生理与病理相关变化。当前SNP已经作为第三代分子标记帮助研究人员及临床医生进行更明确的诊断，如利用SNP对某些肿瘤的易感性做出预测。在药物基因组学检测中，SNP能够用于预测某些药物在不同个体的有效性，例如华法林的给药剂量就与CYP2C9基因多态性密切相关。SNP的分型是对纯合型与杂合型的SNP位点进行有效的区分，这种精确的分型能够有效的确定基因组中某一基因的功能状态，对于临床检测以及药物基因组学研究均具有重要意义。
核酸的扩增是分子检测领域的主要内容，当前最常用的方法是聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)。PCR是一种变温扩增手段，通过高温变性、低温退火、中温延伸对靶分子实现扩增。核酸分子的等温扩增是不依赖于变温过程，通过特定的酶在恒定温度下的对核酸分子进行扩增。2000年日本研究人员Notomi及其同事报导了一种新型的环介导的等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。LAMP是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增方法，利用两对特殊设计的引物(内引物与外引物)分别针对靶分子序列的六个不同区域，在具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下产生带有“茎环”结构的初始扩增产物，该产物能够以自身为模板进行延伸。与此同时，内引物也能结合到该初始产物的单链环区引发扩增。最终，经过不断的链置换以及内引物的结合，LAMP反应最终产生大量带有交替反向重复序列的不同长度的DNA大分子片段。除了内引物外，2002年Notomi等人根据LAMP产物的单链环区的不同于内引物结合区的区域设计了环引物(loopprimer)，环引物的引入能够使LAMP反应的效率得到显著增强。该方法具有高特异性、高扩增效率以及成本低的特点，目前LAMP方法已经成为最常用的等温扩增手段之一。LAMP反应的监控可以通过实时荧光报告的方式以及终点荧光报告法，近年来，有报导利用金属离子指示剂萘酚蓝(hydroxy naphthol blue，HNB)以及pH指示剂中性红(neutral red,N-red)作为一步可视化的报告方法，使LAMP技术在床边检测(POCT)领域具有更大的潜能。
当前SNP的分型方法主要基于PCR的扩增，例如TaqMan技术、高分辨溶解曲线分析(HRM)、位点特异性PCR等等。尽管这些方法具有高灵敏度、高特异性等特点，然而其对于精密的变温设备的依赖使其在床边检测(POCT)中受到一定的限制，而基于等温扩增的检测方法能够排除该限制，在POCT领域具有广泛的应用前景。近年来，基于LAMP的SNP检测方法也受到越来越多的关注，其中报导最多的是位点特异性的LAMP(AS-LAMP)。AS-LAMP通过将检测SNP位点的碱基设计在LAMP内引物的末端，当内引物末端碱基与待检测SNP位点碱基互补，内引物与模板可发生完美的互补配对，那么LAMP就能正常进行，而内引物末端碱基不与待检测SNP位点碱基互补，那么就会影响DNA聚合酶在该位置的有效延伸，从而停止LAMP反应的进行。总的来说，AS-LAMP的原理是依赖于DNA聚合酶对于错配的识别能力，但是，很多用于等温扩增的DNA聚合酶能够在出现末端错配的情况下继续延伸，这在一定程度上限制了AS-LAMP的准确性。此外，AS-LAMP必须要求SNP固定于内引物的末端，这增加了LAMP引物设计的复杂性。
因此，开发一种等温、精确、经济、便捷的SNP分型方法在实现POCT中具有长足的意义。
发明内容
本发明提供一种等温条件下的SNP分型方法，该方法在LAMP扩增基础上借鉴环引物设计思想设计SNP特异性寡核苷酸探针，使SNP能够通过探针对LAMP扩增效率的显著影响得到更好的分型效果。其技术方案如下：选择含SNP位点的DNA片段作为目标DNA，根据LAMP引物设计原理进行引物设计，并确保SNP位点位于环引物设计区域(LAMP扩增中间产物的单链环区上除内引物互补序列外的大环序列)；以SNP位点所在大环序列为基础，设计能特异性识别SNP位点并与含SNP位点的目标序列互补的短链寡核苷酸探针，使探针上与SNP位点对应的碱基表现出与SNP位点互补或错配的特性；采用通用LAMP反应条件，利用LAMP引物和SNP寡核苷酸探针对目标DNA进行扩增；由于SNP位点的突变与否可显著影响环引物短链杂交探针与单链环结合的稳定性，而环引物的延伸能够显著提高LAMP的扩增效率，故当短链杂交探针与对应的含SNP的单链环序列完美互补时，短链探针可正常延伸，能够显著增强LAMP反应的效率，而当短链杂交探针与对应的含SNP的单链环出现单个碱基的错配时，短链探针则无法稳定的结合到单链环上，故不能对LAMP反应产生增强效果，由此，便可通过扩增效率的显著差异实现高分辨率的SNP分型。
本发明所涉及的短链寡核苷酸探针应根据SNP位点对应的碱基类型不同而同时设计不同类型的探针，使其能够对纯合野生型、纯合突变型和杂合性的基因型进行特异性区分。进行SNP分型时，运用针对于SNP位点的不同类型的探针对同一核酸样本进行平行检测，分型结果通过平行反应之间的信号差异来判断。针对同一核酸样本用不同类型探针平行检测，存在显著信号差异为纯合型，不存在显著差异为杂合型；纯合型中，与野生型SNP位点互补的探针参与的反应获得较高信号时，判断为纯合野生型，与突变型SNP位点互补的探针参与的反应获得较高信号时，判断为纯合突变型。
本发明所涉及寡核苷酸探针是一种短链杂交探针，长度依赖于环介导等温扩增反应温度对探针与含SNP的目标序列的杂交互补程度的控制，故在设计时，需保证探针能在LAMP反应温度条件下与目标DNA的杂交能够通过单个碱基的差异来控制，以实现高分辨的SNP分型；长度优选为10-12个核苷酸。
本发明所涉及寡核苷酸探针在设计时，对应SNP的核苷酸位点可设计在探针的任意位置，以保证探针与目标序列的互补结合能够通过单个碱基差异实现高分辨SNP分型为宜；将SNP置于探针的中间位置，可以获得最佳的SNP分型效果。
本发明所涉及的短链寡核苷酸探针以环引物设计区域即LAMP反应中间产物单链环上区别于内引物设计区域的大环序列为对象进行设计，相对于AS-LAMP将SNP位点设计于内引物末端的方案，受模板序列、LAMP引物设计规则的影响较小，且该设计能够使LAMP引物的设计更为灵活、简单。
AS-LAMP对SNP的分型依赖于DNA聚合酶对于错配的识别能力，但是，很多用于等温扩增的DNA聚合酶能够在出现末端错配的情况下继续延伸，这在一定程度上限制了AS-LAMP的准确性。本发明涉及的SNP分型方法依赖于LAMP反应温度下短链寡核苷酸探针与含SNP位点的目标序列的杂交，SNP位点可设计在探针序列的任意位置，只需满足探针与含SNP位点的目标序列的杂交互补即可，不受DNA聚合酶保真性的影响，能够获得更准确的分型结果。
在本发明对SNP进行分型的过程中，代表SNP对应核苷酸类型的探针分别对相同的待测模板进行扩增。扩增反应与探针的杂交不需要分管进行，可以实现一步检测。整个LAMP反应的温度一般在60℃至63℃，较高的反应温度有利于筛选Tm值合适的短链探针，从而降低非互补的探针产生的背景。
本发明所述SNP等温分型方法在引物设计、扩增反应体系、反应条件和仪器设备方面可依循普通环介导等温扩增。
本发明中所涉及的DNA聚合酶是既不具有5’-3’外切酶活性，也不具有3’-5’的外切酶活性，能够满足引物与模板结合并延伸、扩增的工作条件即可。
本发明可结合多种报告方式，如结合荧光染料或探针的实时荧光报告方式或者预先加入pH指示剂进行可视化检测。后者可以是利用中性红进行比色分析，原理为LAMP反应的pH值伴随扩增由碱性(pH8.8)降低到酸性(pH6.0)，而中性红在碱性条件(pH8.0)下呈橙色，其在酸性条件(pH6.8)下呈红色，中性红依赖于LAMP反应导致的pH变化即可实现对SNP检测结果的可视化报告。
如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。
“DNA”：脱氧核糖核酸。是一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核糖核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。
“单核苷酸多态性”：全称Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看，根据核苷酸种类的不同，每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，主要包括转换(C→T)和颠换(C→A，G→T，C→G，A→T)。
“LAMP”：环介导的等温扩增。是一种体外等温扩增DNA特意片段的技术，扩增过程分为初始产物形成阶段以及循环扩增阶段，最终产生具有大量反向重复序列的DNA大分子片段，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
“环引物”：LAMP反应中引入的针对于其中间产物单链环上区别于内引物区的特异性引物，可以显著的增强LAMP反应的效率。
“杂交”：两条单链DNA或RNA的碱基配对。
“探针”：一段短的单链DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其作用是区分SNP，将SNP检测与LAMP反应效率相联系。
“Tm值”：DNA双链的熔解温度。双链DNA解链至一半时的温度，主要受到DNA链中碱基数量以及碱基组成的影响。
本发明所公开的方法关键在于根据LAMP中间产物的单链环区设计能够特异性与之杂交的短链探针，通过探针的杂交状态来影响LAMP反应的扩增效率，从而根据扩增效率来实现对SNP的分型。分型结果可通过荧光实时报告或利用pH指示剂进行比色报告，该方法准确、灵敏、简单、分辨率高且成本低，具有应用于现场快速检测的潜力，特别是在药物基因组学的检测以及非集中型医疗中具有很高的实用价值。本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：
1.新颖性。现有的基于LAMP的SNP分型技术主要是依赖于DNA聚合酶的错配识别能力，难以保证分型的准确性，本发明成功将LAMP技术与探针杂交结合，利用探针杂交的特异性对LAMP反应的增强效应来对SNP分型，在国内尚为首创。
2.通用性。本发明所涉及的PE-LAMP分型方法，针对不同样品中的待检测SNP位点，只需设计相应LAMP引物以及与目标SNP位点对应的特异性短链探针，可操作性强。
3.实用性。现有的SNP分型技术多依赖于精密的变温设备以及荧光采集设备，从而使SNP分型在POCT领域的应用有一定的限制，而本发明分型方法仅需要简单的恒温仪，因此，更加适合于现场检测。
4.经济性。现有的SNP分型技术多依赖于荧光基团以及淬灭基团的标记，或利用昂贵的饱和染料，探针的合成和试剂及检测仪器的费用都较高，而本发明可兼容多种报告方式，当结合中性红等pH指示剂进行比色检测时，便无需对引物及探针序列进行修饰，合成方便，且可实现一步可视化的比色检测，从而大大降低检测成本。
附图说明
图1是具体实施例1对SNP位点序列设计LAMP引物示意图。
图2是具体实施例1对H19基因标志性SNP rs3741219进行分型示意图。
图3是具体实施例1对H19基因标志性SNP rs3741219分型的结果图，a:实时荧光分型结果，b:可视化分型结果。
图4是具体实施例2对氯吡格雷药物代谢相关SNP rs4244285分型的结果图，a:实时荧光分型结果，b:可视化分型结果。
具体实施方式
下面结合附图，通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1、用通用的LAMP扩增引物结合两组短链探针对H19基因标志性SNPrs3741219(突变碱基为C，正常碱基为T)进行分型。
利用本发明对SNP进行分型时，需要对该SNP序列进行LAMP引物设计，设计思路参见图1。首先针对SNP序列区域设计一组通用LAMP引物(内引物与外引物)对模板序列进行扩增，内引物设计时需确保SNP位点在扩增时出现在LAMP中间产物的单链环上。同时针对于该单链环上SNP区域设计相应的短链探针，杂交探针设计时将SNP对应的碱基设置在探针的中间位置。在LAMP引物对模板进行扩增时，首先形成哑铃状的初始扩增产物，之后在内引物的作用下产生带有单链环的中间产物，单链环区域携带有对应的SNP核苷酸。当利用探针对SNP进行分型时，具体分型步骤见图2，在形成带有单链环的LAMP中间产物增后，当杂交探针特异性的识别SNP所在的单链环并与之完美互补，则探针能够显著的促进整个LAMP反应的效率，反之，则探针不能对LAMP反应有增益效果。基于该原则，SNP的分型可以根据不同探针同时对相同模板进行检测时产生的阳性扩增的情况来完成，当只有其中一条探针所在的反应管出现了阳性的扩增，则该模板为对应的纯合型，若两条探针对应的反应管均出现了阳性扩增，则证明该模板是杂合型。需要注意的是当模板含量大于105拷贝时，LAMP反应的背景扩增较强，此时可以通过两个探针反应之间的时间窗来对SNP进行分型。在扩增反应中，探针与引物可以在反应初始时同时加入，故可以实现一步检测。此外，结合预先加入的pH指示剂中性红，该方法可以实现一步可视化的分型。
(1)用于对H19基因标志性SNP rs3741219进行分型的LAMP引物与探针。
外引物1：5’-GGAGAC GGC CTT GAG TCT-3’
外引物2：5’-GGG CGT AAT GGA ATG CTT GA-3’
内引物1：5’-GTC ACC CGG CCC AGA TGG AGC AGT ACG AGT GTG CGT GAG-3’
内引物2：5’-CTG TGT GCC CGA GGC CTC AGC TCC GTG ATG TCG GTC G-3’
寡核苷酸探针LP(G)：5’-CCT GCG CAG GC-3’
寡核苷酸探针LP(A)：5’-CCT GCA CAG GC-3’
rs3741219位点部分野生型/突变型DNA序列：
5’-ctgaatttaatttgcactaagtcatttgcactggttggagttgtggagacggccttgagtctcagtacgagtgtgcgtgagtgtgagcca ccttggcaagtgcctg[c/t]gcagggcccggccgccctccatctgggccgggtgactgggcgccggctgtgtgcccgaggcctcaccctgc cctcgcctagtctggaagctccgaccgacatcacggagcagccttcaagcattccattacgccccatctcgctctgtgcccct-3’
(2)反应体系及反应条件
当加入利用实时荧光报告系统时，荧光染料SYBR Green I加入的浓度为1/50000
当利用比色分析报告体系时，pH指示剂中性红加入的浓度为100μM。
最终将反应体系用超纯水补足至25μL。
LAMP反应条件是：62℃反应1h。
对一个模板的SNP进行分型时，设置两个平行反应，每个反应管中加入一种寡核苷酸探针。
两个阴性对照为：加相当于模板体积的超纯水于两个分别含不同寡核苷酸探针的反应管。
(3)检测方法
利用实时荧光报告时，利用实时荧光PCR仪，设置SYBR Green I通道在1h内进行实时记录。利用中性红进行比色分析时，将整个反应放置在恒温仪或水浴锅中反应1h后直接取出肉眼观察。
(4)检测结果
如附图3所示，利用实时荧光报告显示，对纯合型的野生型模板、纯合型的突变型模板进行区分时，只有对应的完美互补的探针产生了阳性信号；对于杂合型模板进行分型时，两种探针所在的反应均产生了阳性信号。利用中性红比色分析时，纯合野生型模板以及纯合突变型模板只有对应的反应管颜色变红，而杂合型模板的两个反应管颜色均变红了。
实施例2、对氯吡格雷药物代谢相关SNP位点rs4244285分型。
按照实施例1中的设计原则，针对氯吡格雷药物代谢相关SNP rs4244285位点设计一系列的LAMP引物以及特异性探针。LAMP引物(外引物3和4以及内引物3和4)首先对模板序列进行扩增，得到带有单链环的中间产物，SNP位于中间产物的单链环上。之后针对于SNP位点的短链探针(LPW和LPM)分别对中间产物进行杂交，最终仅有完美互补的探针能够对后续的LAMP反应产生增强效果。最终结果利用荧光报告体系以比色分析体系进行报告。
(1)用于对氯吡格雷药物代谢相关SNP位点rs4244285分型的LAMP引物与探针。
外引物3：5’-TCA GAG AAT TAC TAC ACA TG-3’
外引物4：5’-ACT TTC TCC AAA ATA TCA CT-3’
内引物3：5’-AGC TCT GGT TGT AAT TTA AAA CTA CAA TAA AAA TTT C
CC CAT C-3’
内引物4：5’-GAT ATG CAA TAA TTT TCC CAC TAT CTT CCA TAA AAG C
AA GGT T-3’
寡核苷酸探针LPW：5’-TTT CCC GGG AAC-3’
寡核苷酸探针LPM：5’-TTT CCC AGG AAC-3’
rs4244285位点部分野生型/突变型DNA序列：
5’-tcagagaattactacacatgtacaataaaaatttccccatcaagatatacaatatattttatttatatttatagttttaaattacaaccagagct tggcatattgtatctatacctttattaaatgcttttaatttaataaattattgttttctcttagatatgcaataattttcccactatcattgattatttccc[g/a]g gaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagtaaaagaacacc-3’
(2)反应体系及反应条件
当加入利用实时荧光报告系统时，荧光染料SYBR Green I加入的浓度为1/50000
当利用比色分析报告体系时，pH指示剂中性红加入的浓度为100μM。
最终将反应体系用超纯水补足至25μL。
LAMP反应条件是：62℃反应75min。
对一个模板的SNP进行分型时，设置两个平行反应，每个反应管中加入一种寡核苷酸探针。
两个阴性对照为：加相当于模板体积的超纯水于两个分别含不同寡核苷酸探针的反应管。
(3)检测方法
利用实时荧光报告时，利用实时荧光PCR仪，设置SYBR Green I通道在70min内进行实时记录。利用中性红进行比色分析时，将整个反应放置在恒温仪或水浴锅中反应70min后直接取出肉眼观察。
(4)检测结果
如附图4所示，利用实时荧光报告显示，对纯合型的野生型模板、纯合型的突变型模板进行区分时，只有对应的完美互补的探针产生了阳性信号；对于杂合型模板进行分型时，两种探针所在的反应均产生了阳性信号。利用中性红比色分析时，纯合野生型模板以及纯合突变型模板只有对应的反应管颜色变红，而杂合型模板的两个反应管颜色均变红了。
Claims (7)
1.一种单核苷酸多态性（SNP）等温分型方法，其特征是：选择含SNP位点的DNA片段作为目标DNA，根据SNP位点所在区域设计环介导等温扩增反应的外引物、内引物，引物的设计应确保SNP位点位于环介导等温扩增中间产物的单链环上除内引物互补序列外的大环区域；根据单链环上除内引物互补序列外的大环序列设计对应的能够特异性识别SNP位点的短链寡核苷酸探针，所述短链寡核苷酸探针与环介导等温扩增中间产物的SNP区域完全互补，使环介导等温扩增反应效率获得增益效果；所述短链寡核苷酸探针的长度依赖于环介导等温扩增反应温度对探针与含SNP的目标序列的杂交互补程度的控制，保证探针与目标序列的互补结合能够通过单个碱基的差异实现高分辨的SNP分型，长度为10-12个核苷酸；应同时针对野生型和突变型的SNP位点设计不同类型的短链寡核苷酸探针；运用针对于野生型和突变型的SNP位点的不同类型的短链寡核苷酸探针对同一核酸样本进行平行检测，结合信号报告方法对检测结果进行报告，分型结果通过平行反应之间的信号差异来判断；本方法不以疾病诊断和治疗为目的。
2.根据权利要求1所述的SNP等温分型方法，其特征是：对应SNP的核苷酸位置设计在短链寡核苷酸探针中间。
3.根据权利要求1所述的SNP等温分型方法，其特征是：所述方法适用于纯合野生型、纯合突变型、杂合型的判断；针对同一核酸样本用针对于野生型和突变型的SNP位点的不同类型的短链寡核苷酸探针进行平行检测，存在显著信号差异为纯合型，不存在显著差异为杂合型；纯合型中，与野生型SNP位点互补的探针参与的反应获得较高信号时，判断为纯合野生型，与突变型SNP位点互补的探针参与的反应获得较高信号时，判断为纯合突变型。
4.根据权利要求1所述的SNP等温分型方法，其特征是：引物设计、扩增反应体系、反应条件和仪器设备依循普通环介导等温扩增。
5.根据权利要求1所述的SNP等温分型方法，其特征是：利用实时荧光报告体系进行报告，通过两个平行反应之间的时间窗对SNP类型进行确定。
6.根据权利要求1所述的SNP等温分型方法，其特征是：结合pH指示剂中性红进行报告，利用比色分析对SNP分型结果进行肉眼观察。
7.根据权利要求1所述的SNP等温分型方法，其特征是：短链寡核苷酸探针与环介导等温扩增反应的外引物、内引物以及报告分子同时加入到反应管中，实现一步等温的SNP分型。
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