CN108368557A - 包含用于核酸等温扩增的报告染料、猝灭剂的基于等温的双功能性寡聚核苷酸及利用其的核酸扩增和测定方法 - Google Patents

包含用于核酸等温扩增的报告染料、猝灭剂的基于等温的双功能性寡聚核苷酸及利用其的核酸扩增和测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含用于核酸等温扩增的报告染料、猝灭剂的基于等温的双功能性寡聚核苷酸及利用其的核酸扩增和测定方法，本发明具有如下的效果，即，作为为了进行LAMP的核酸扩增反应，除了4～6种寡聚核苷酸之外，无需设计额外的寡聚核苷酸，通过对基于与DNA和RNA有关的靶(target)基因的特异性序列的核酸扩增的荧光量进行检测，反应结束后还可进行检测且能够实时检测荧光量的方法并根据靶基因来使报告染料不同，从而在一个试管中使反应结束后或者实时检测荧光量来可同时进行多重检测。

Description

包含用于核酸等温扩增的报告染料、猝灭剂的基于等温的双 功能性寡聚核苷酸及利用其的核酸扩增和测定方法
技术领域
本发明涉及包含用于核酸等温扩增的报告染料、猝灭剂的基于等温的双功能性寡聚核苷酸及利用其的核酸扩增和测定方法，更详细地，涉及当进行等温核酸扩增反应时，通过实时荧光检测来在每反应时间通过核酸扩增与否的测定及终点(end-point)步骤中的荧光量检测检测反应产物是否进行核酸扩增反应的基于等温的双功能性寡聚核苷酸的用途和利用其的核酸扩增方法及测定方法。
背景技术
核酸扩增技术为主要在分子生物学及生命工程领域中使用的技术，为可检测少量的核酸并进行分析的方法。为了进行核酸扩增，使用热稳定酶(thermostable enzyme)来分析DNA/RNA的聚合酶链反应(PCR，Polymerase chain reaction)技术最为广泛使用的方法，为反复进行如下过程的方法：在高温条件下，将双链DNA变性为单链DN A后，降低温度来在单链结合引物(primer)，并利用Taq聚合酶(Taq polymerase)(热稳定酶)使单链DNA延伸至双链DNA。
利用荧光物质的实时PCR方法为在PCR过程中根据荧光的发光强度检测核酸的方法，在PCR反应物中间位置添加利用具有相应的互补序列的寡聚核苷酸在5’末端附着报告染料且在3’末端附着猝灭剂的单链的探针(probe)，通过Taq聚合酶的5’→3’核酸外切酶(exo nuclase)活性来进行PCR反应时，单链的探针与互补序列相结合并通过Taq聚合酶的延伸反应来使探针从5’末端水解，使报告染料远离猝灭剂来使荧光发光，从而利用实时PCR设备的荧光检测器来显示荧光量。通过实时PCR设备的荧光检测器来使荧光波长不同，从而可检测出两个以上的靶的同时进行多重检测，因而此技术为在病原体检测及突变检测等诊断领域中经常使用的技术，但具有需要高价的实时PCR设备和熟练的技术人员的缺点。
无需高价的实时PCR设备而在等温条件下检测DNA/RNA且在比PCR方法更快的时间内检测核酸的等温扩增法(Isothermal amplificati on method)正在开发当中。为了RNA扩增利用使用如RNA聚合酶、逆转录酶(reverse transcriptase)、核糖核酸酶H(Rnase H)等酶(en zyme)的转录介导的扩增(TMA，Transcription Mediated Amplificati on)、依赖核酸序列的扩增(NASBA，Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)方法，链替代扩增(SDA，Strand Displacement Ampli fication)为如下的方法：核酸外切酶缺乏DNA聚合酶(exonuclase-de ficient DNA polymerase)为了合成双链的核酸而置换(displacement)原来的一个链并利用限制性内切酶(restriction enzyme)来形成缺口(nick)，反复这种过程来使核酸扩增，与此类似的切口和延伸扩增反应(NEAR，Nicking andExtension Amplification Reaction)为以切口酶(nicking enzyme)代替限制性内切酶来使用的方法。核酸恒温扩增(HDA，Helicase-Dependent Amplification)为使用从5’末端和3’末端使双链解链的解螺旋酶(Helicase)的功能的方法，与此类似的重组酶聚合酶扩增(RPA，Recombinase Polymerase Amplification)为利用使双链解链的重组酶(recombinase)的方法。
环介导等温核酸扩增反应(LAMP，Loop-mediated isothermal am plification)为利用具有4～6个特异性引物(specific primer)和链置换活性(strand displacementactivity)的DNA聚合酶的核酸扩增技术(Patent.No.PCT/JP2000/001919)。
在LAMP的测定方法中，通过琼脂糖凝胶电泳分析来确认涂抹图案(smearedpattern)的带(band)，来可分析是否进行特定基因核酸扩增反应，但是当进行琼脂糖凝胶电泳分析时，由于开放反应试管，会成为核酸被污染的根源。
因此，为了防止核酸被污染，不开放反应试管也可以进行测定的技术正在开发当中，通常，LAMP中所使用的浊度测定法(Mori.Y.etal.，Biochemical and BiophysicalResearch Communications，2001，289：150-154)中，随着等温核酸扩增反应物的增加，基于焦磷酸镁(Magnesium pyrophosphate，Mg2P2O7)的白色沉淀物被积累，从而可通过测定400nM的波长的浊度来进行实时检测及终点检测，因此无需开放反应试管也可以确认是否进行核酸扩增。但是存在无法同时进行如辨别两个以上靶(target)等多重检测且由于需要测定的焦磷酸镁的沉淀而测定法的准确度降低的缺点。
在LAMP中，用于实时检测是否进行核酸扩增的荧光检测法中，无需开放反应试管而仅测定荧光物质，从而具有消除污染发生并消除因产生沉淀物而使准确度下降的现象的优点。
在LAMP中，向反应物中添加如SYBR Green I等双链特异性嵌入物(Intercalater)并可通过荧光强度随着核酸扩增反应物的增加而增大的现象来进行实时检测。实时PCR扩增反应中所使用的SYBR Gre en I中，无法确认核酸扩增产物的序列的特异性，因此，在引物二聚体(primer dimer)中也测定出荧光度，为了辨别非特异性反应，进行实时检测之后，使温度缓慢上升至95℃，并通过测定核酸扩增反应物的解链温度来判断是否进行非特异性反应，从而可确认检测与否，且无法同时进行如辨别两个以上靶等多重检测。
用于进行基于LAMP的核酸扩增序列特异性荧光检测的技术已被开发。同化探针(Assimilating probe)为使用对核酸扩增序列进行特异性设计的两根探针并利用荧光共振能量转移(FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer)原理来进行实时检测的方法(Patent.No.PCR/US11/41540)。两根探针中的一根中，报告染料附着于5’末端，另一根中，猝灭剂位于3’末端。LAMP核酸扩增中所使用的寡聚核苷酸为6种，包含多个引物，同化探针将其中的环引物(loop primer)的一个作为对象来设计在5’末端附着报告染料的一根探针，并设计与其互补的部分序列，来设计在3’末端附着猝灭剂的另一根探针，从而需要合成7种寡聚核苷酸，同化探针在LAMP反应之间使两个探针从高温缓慢降温至低温来合成一对探针并使用于核酸扩增。在LAMP中，当为了进行基因序列特异性实时检测而使用同化探针来进行核酸扩增反应时，在LAMP反应中产生抑制效果，从而导致检测时间和实时检测时间变长。
使用于同化探针类似的探针的荧光检测法为以使荧光探针(fluor ephore-labeled primer/probe)和猝灭剂探针(quencher-labeled probe)具有互补序列的方式设计来使用一对探针的方法(Patent No.PCT/JP2012/077596)。上述方法如下：以使荧光探针和猝灭剂探针的解链温度不同的方式设计来在LAMP核酸扩增反应中仅使荧光探针与靶(target)基因特异性序列进行退火反应，LAMP核酸扩增反应结束后，降低温度来使残留的荧光探针与猝灭剂探针相结合后，检测荧光量。这一对探针无法确认实时检测，因此与同化探针相同地，也需要添加一个寡聚核苷酸来进行设计。
LAMP核酸扩增反应中通过实时检测及荧光量测定，无需开放反应试管也可以确认是否进行核酸扩增，从而解决由污染产生的假阳性反应，用于灵活地测定以低浓度存在的靶核酸的扩增与否的技术已被开发，如浊度测定及嵌入物荧光检测等对靶核酸序列具有非特异性的方法具有无法确认非特异性扩增与否且无法同时进行多重核酸检测的限制性，在使用探针的方法中可对靶基因序列进行特异性设计且使用多种报告染料和猝灭剂，因此可同时进行多重核酸检测。然而，除了LAMP中所使用的6种寡聚核苷酸之外还需要设计用于形成一对探针的猝灭剂探针的寡聚核苷酸，因此还需要在配制反应物之前合成一对探针来向反应物中添加的过程。并且，需要以环引物代替一对探针的设计位置来设计成荧光引物。环引物当进行LAMP反应时形成哑铃结构的环(loop)之后进行退火并进行下个过程，因此，荧光检测时间在测定荧光的时间点比核酸实际扩增的时间点延迟。同化探针对LAMP的反应性具有抑制效果，在使用荧光探针和猝灭剂探针的方法的情况下，具有无法进行实时检测且在反应结束后必须在温度降低之后进行检测的限制性。
发明内容
技术问题
本发明为了解决如上所述的问题并根据如上所述的必要性而提出，本发明的目的在于，开发如下的技术，即，为了进行LAMP的核酸扩增反应，除了4～6种寡聚核苷酸之外，无需设计额外的寡聚核苷酸，且能够特异性地检测出靶基因序列，并且可以进行实时检测，而并非在反应结束后进行检测，而且提供对LAMP等温扩增过程中所呈现的扩增产物进行实时检测并可同时进行多重检查的方法。
解决问题的方案
为了实现如上所述的目的，本发明提供如下的寡聚核苷酸，即，与靶基因的特定序列有关的环介导等温核酸扩增反应用引物中的正向内侧引物(Forward Inner Primer)或反向内侧引物(Reverse Inner Primer)作为对象，使除了3’末端之外的序列中的部分序列变换为内侧(internal)dT序列、内侧(internal)dG序列、内侧(internal)dC序列、内侧(internal)dA序列、内侧(internal)dU序列或内侧(internal)dR序列，并使报告染料或猝灭剂位于其部位，在规定温度以下，全部或部分序列形成双链，泡沫结构为一个以上。
根据本发明的一实例，优选地，在上述寡聚核苷酸中，报告染料与猝灭剂之间的间距为21～33mer以内，但不限定于此。
根据本发明的另一实例，优选地，上述寡聚核苷酸单独使用或并用正向内侧探针和反向内侧探针，但不限定于此。
根据本发明的一实施例，优选地，上述寡聚核苷酸的报告染料为FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXAS RED、CY3及CY5中的一种或者具有450～685nm的发光波长范围的染料，
并且，优选地，上述寡聚核苷酸的猝灭剂为TAMRA、DABCYL、黑洞猝灭剂(BlackHole Quencher)1或黑洞猝灭剂2或者具有500～705nm的吸光波长范围的猝灭剂，但不限定于此。
根据本发明的一实例，优选地，上述寡聚核苷酸具有1个至4个泡沫结构。
优选地，在上述寡聚核苷酸中，双链解链成单链的解链温度为30～70℃，但不限定于此。
根据本发明的一实施例，优选地，上述寡聚核苷酸为序列号5至序列号8及序列号15至序列号16中的寡聚核苷酸中记载的一种，但不限定于此。
并且，本发明提供在等温条件下，使用本发明的上述寡聚核苷酸来进行实时核酸扩增荧光检测的执行环介导等温核酸扩增反应或逆转录(RT)-环介导等温核酸扩增反应的方法。
并且，本发明提供在等温或两种以上的温度条件下，使用上述本发明的寡聚核苷酸来进行终点核酸扩增荧光检测的执行环介导等温核酸扩增反应或逆转录-环介导等温核酸扩增反应的方法。
在本发明的方法中，优选地，上述寡聚核苷酸单独使用或并用正向内侧探针和反向内侧探针，
并且，优选地，上述方法的等温条件在50～75℃的范围内，但不限定于此。
在本发明的方法中，优选地，上述方法以DNA及cDNA核酸作为对象来执行，并且，上述方法以RNA核酸作为对象来进行逆转录反应后，对特定基因执行一步反应，但不限定于此。
并且，本发明提供单独或同时对包含上述本发明的寡聚核苷酸的与感染性疾病、遗传性疾病、耐药性、药物抵抗性或敏感性检体有关的特定基因进行多重扩增的试剂盒。
并且，本发明提供包含上述本发明的寡聚核苷酸作为有效成分的埃博拉病毒(Ebola virus)核酸扩增用组合物。
并且，本发明提供包含上述本发明的寡聚核苷酸作为有效成分的等温核酸扩增反应用组合物。
根据本发明的一实例，优选地，上述组合物包含序列号1至序列号18的寡聚核苷酸，但不限定于此。
并且，本发明提供并用上述本发明的寡聚核苷酸和反义探针来执行与DNA、RNA或cDNA有关的等温核酸扩增反应的方法。
根据本发明的一实例，优选地，在55～65℃的温度范围内设计及使用上述反义探针，但不限定于此。
根据本发明的再一实例，优选地，在正向位置和反向位置单独使用或并用上述寡聚核苷酸和反义探针，但不限定于此。
根据本发明的另一实例，优选地，上述反义探针包括序列号19至序列号23中所记载的序列中的一种，但不限定于此。
以下，说明本发明。
在本发明中所使用的简称为如下：
Internal dT：Internal Amino-C6(or C2)-deoxythymine
Internal dA：Internal Amino-C6-deoxyadenocine
Internal dC：Internal Amino-C6-deoxycytidine
Internal dG：Internal Amino-C6-deoxyguanosine
Internal dU：Internal Amino-C6-deoxyuridine
Internal dR：Internal Amino-C6-deoxyribose
本发明提供如下的基于等温的双功能性寡聚核苷酸的用途和利用其的核酸扩增方法及测定方法，即，在环介导等温核酸扩增反应方法的正向内侧引物(FIP，ForwardInner Primer)和反向内侧引物(RIP，Reverse Inner Primer)中，分别与两个靶基因部位有关的引物被设计成为一个寡聚核苷酸，且在这两个靶基因部位之间形成一个以上泡沫结构，并使除了3’末端之外的5’末端或胸腺嘧啶(Thymine)部位变换为内侧dT，作为用于附着报告染料或猝灭剂的结构，使一个报告染料和一个猝灭剂位于一个IB-DFO，来执行引物和探针的两种功能，当进行等温核酸扩增反应时，通过实时荧光检测来在每反应时间通过核酸扩增与否的测定及终点步骤(end point)的荧光检测来对反应产物进行荧光检测，从而检测是否进行等温核酸扩增反应。
本发明提供如下的寡聚核苷酸，即，以与靶基因的特定序列有关的LAMP等温核酸扩增反应用引物中的正向内侧引物或反向内侧引物作为对象，在除了3’末端之外的序列中的部分序列中，使胸腺嘧啶碱基变换为内侧dT或者使腺嘌呤(Adenine)、胸腺嘧啶、鸟嘌呤(Guanine)、胞核嘧啶(Cytosine)、尿嘧啶(Uridine)碱基变换为内侧dR，并使报告染料或猝灭剂位于其部位，在规定温度以下，全部或部分序列形成双链，泡沫结构为一个以上。
本发明提供为了对靶DNA及cDNA、RNA的特定基因序列进行等温核酸扩增而包含一种以上基于等温的双功能性寡聚核苷酸的等温核酸扩增反应混合物。
本发明的上述反应混合物为包含DNA聚合酶(polymerase)和IB-DFO的LAMP核酸扩增反应用混合物，上述DNA聚合酶包含Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2、MgSO4、甜菜碱(Betaine)、二硫苏糖醇(DTT，Dithiothreitol)、Triton X-100、Tween-20、dNTPs、牛血清白蛋白(BSA，Bovine serum albumin)、二甲亚砜(DMSO，Dimethyl sulfoxide)、甲酰胺(Formamide)、单链结合蛋白(Single strand binding protein)、焦磷酸盐(Pyrophosphate)、焦磷酸酶(Pyrophosphatase)等并具有5’→3’核酸外切酶(-)、3’→5’核酸外切酶(-)、链置换(strand displacement)活性。而且，使用包含RNA酶抑制剂(RNaseinhibitor)；如禽类成髓细胞瘤病毒(AMV，Avian Myeloblastosis Virus)逆转录酶、鼠白血病病毒(MMLV，Molony Murine Leukemia Virus)逆转录酶等逆转录酶；具有耐热性逆转录酶(thermostable Reverse transcritpase)；具有逆转录酶功能的DNA聚合酶及B-DFO的RT-LAMP核酸扩增反应用混合物。
本发明提供在本发明的寡聚核苷酸中，报告染料与猝灭剂之间的间距为21～33mer以内的寡聚核苷酸，但不限定于此。
本发明提供以单独使用或并用本发明的寡聚核苷酸的作为正向探针(forwardprobe)的FIP-IB-DFO和作为反向探针(reverse probe)的RIP-IB-DFO为特征的寡聚核苷酸。
本发明提供的寡聚核苷酸中，寡聚核苷酸的报告染料为FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5中的一种并具有450～685nm的发光波长范围，但不限定于此。
本发明提供的寡聚核苷酸中，寡聚核苷酸的猝灭剂为TAMRA、DABCYL、黑洞猝灭剂1及黑洞猝灭剂2并具有500～705nm的吸光波长范围，但不限定于此。
本发明提供在等温条件下使用本发明的寡聚核苷酸来进行实时核酸扩增荧光检测的LAMP和RT-LAMP反应方法。
本发明提供在等温或两种以上的温度条件下使用本发明的寡聚核苷酸来进行终点核酸扩增荧光检测的LAMP和RT-LAMP反应方法。
上述方法提供包含浓度为0.2～1.6uM的正向内侧引物(FIP)、反向内侧引物(RIP)或者正向内侧引物及反向内侧引物(FIP and RIP)作为寡聚核苷酸的IB-DFO的混合物，但不限定于此。
本发明提供使用本发明的寡聚核苷酸的LAMP反应方法的等温条件在50～75℃的范围内的方法，但不限定于此。
本发明提供以DNA及cDNA核酸作为对象使用本发明的寡聚核苷酸来执行的方法。
本发明提供以RNA核酸作为对象使用本发明的寡聚核苷酸来进行逆转录反应后对特定基因执行一步反应的方法。
本发明提供本发明的寡聚核苷酸具有1个至4个泡沫结构的寡聚核苷酸。
本发明提供的寡聚核苷酸的特征在于，在本发明的寡聚核苷酸中，双链解链成单链的解链温度为30～70℃，但不限定于此。
本发明提供单独或同时对包含本发明的寡聚核苷酸的与感染性疾病、遗传性疾病、耐药性、药物抵抗性或敏感性检体的DNA及cDNA、RNA有关的特定基因进行多重扩增的试剂盒。
本发明提供与作为埃博拉病毒的子类型(subtype)的本迪布焦型(Bundibugyo)和莱斯顿型(Reston)有关的序列号1～18的寡聚核苷酸序列和LAMP和RT-LAMP引物序列。
发明的效果
通过本发明可知，本发明具有如下的效果，即，作为为了进行LAMP的核酸扩增反应，除了4～6种寡聚核苷酸之外，无需设计额外的寡聚核苷酸，通过对基于与DNA和RNA有关的靶基因的特异性序列的核酸扩增的荧光量进行检测，反应结束后还可进行检测且能够实时检测荧光量的方法并根据靶基因来使报告染料不同，从而在一个试管中使反应结束后或者实时检测荧光量来可同时进行多重检测。
附图说明
图1为根据本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)的报告染料与猝灭剂之间的mer数(距离)为33mer、25mer、21mer，对LAMP核酸扩增反应进行实时荧光检测的结果。
图2为单独使用利用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)的正向内侧引物和反向内侧引物设计的IB-DFO来对LAMP核酸扩增反应进行实时荧光检测的结果。
图3为单独使用或并用利用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)的正向内侧引物和反向内侧引物设计的IB-DFO来对LAMP核酸扩增反应进行实时荧光检测的结果。
图4为利用FIP和FIP的序列设计的IB-DFO并以0：1.6uM/0.4：1.2uM/0.8：0.8uM/1.2：0.4uM/1.4：0.2uM/1.6：0uM的FIP：FIP-IB-DFO的比例对本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)的LAMP核酸扩增反应进行实时荧光检测的结果。
图5为利用FIP和FIP的序列设计的IB-DFO并以0：1.6uM/0.4：1.2uM/0.8：0.8uM/1.2：0.4uM/1.4：0.2uM/1.6：0uM的FIP：FIP-IB-DFO的比例对本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)的LAMP核酸扩增反应进行终点荧光检测的结果。
图6为使用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)并将质粒(plasmid)DNA作为模板来对LAMP核酸扩增反应进行实时荧光检测的结果。
图7为使用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)并将质粒DNA作为模板来对LAMP核酸扩增反应进行终点荧光检测的结果。
图8为使用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)并将RNA转录物(transcrip)作为模板来对一步RT-LAMP核酸扩增反应进行实时荧光检测的结果。
图9为使用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)并将RNA转录物作为模板来对一步RT-LAMP核酸扩增反应进行终点荧光检测的结果。
图10至图13为使用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)和包含按温度(55℃、60℃、65℃、70℃)设计的猝灭剂的反义(anti-sense)探针并将质粒DNA作为模板来对LAMP核酸扩增反应进行实时荧光检测的结果。
图14为使用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)和包含按温度(55℃、60℃、65℃、70℃)设计的猝灭剂的反义探针并将质粒DNA作为模板来对LAMP核酸扩增反应进行实时荧光检测的结果的Rn vs min(non-normalization)型(type)的结果。
图15至图17为使用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)和包含使用forward或reverse或者forward(F)和reverse(R)且将与它们互补的序列以60℃的温度设计的猝灭剂的反义探针并将质粒DNA作为模板来对LAMP核酸扩增反应进行实时荧光检测的结果。
具体实施方式
以下，通过实施列详细说明本发明。但是，下述实施例仅用于例示本发明，而本发明的内容并不限定于下述实施例。
实施例1：根据本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)的报告染料与猝灭剂之间的距离(mer数)的荧光检测效果分析
为了观察根据本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)的报告染料与猝灭剂之间的距离(mer数)的LAMP等温核酸扩增反应的荧光检测效果，利用引物设计软件V4(PrimerExplorerV4Software)(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)对埃博拉病毒的子类型之一的本迪布焦型的L片段(segment)(聚合酶)部位序列设计4种LAMP等温核酸扩增用引物。
设计出的引物为EB_B_F3(序列号1)、EB_B_R3(序列号2)、EB_B_FIP(序列号3)、EB_B_RIP(序列号4)，IB-DFO为在EB_B_FIP引物序列中将胸腺嘧啶变换为内侧dT，将其部位变换为作为报告染料的FAM，将33(EB_B_FIP_P2，序列号5)、25(EB_B_FIP_P2.5，序列号6)、21mer(EB_B_FIP_P3，序列号7)间距位置的胸腺嘧啶变换为内侧dT，在其部位附着BHQ1猝灭剂。呈现出3种IB-DFO由双链解链为单链的温度(Melting temperature)为54℃。
在与上述IB-DFO寡聚核苷酸有关的等温核酸扩增反应中使用20mM的Tris-HCl(pH8.8)、50mM的KCl、10mM的MgSO4、10mM的(NH4)2SO4、0.1％的Tween-20、1.4mM的dNTPeach、0.5M的甜菜碱、8U Bst DNA聚合酶(MCLAB，CA，USA)、0.2uM的EB_B_F3和EB_B_R3，向混合物中添加1.2uM的EB_B_FIP、1.6uM的EB_B_RIP，并添加0.4uM的IB-DFO。通过基因合成来制作埃博拉病毒的本迪布焦型L片段(gb：FJ217161，521bp)，使用浓度为1×10^7、1×10^5、1×10^3、0copies/reaction。为了对等温核酸扩增反应进行实时荧光检测，在65℃的温度下执行60分钟，使用CFX-96(Bio-Rad，CA，USA)实时荧光检测仪并以一分钟为单位测定荧光量。
图1为与寡聚核苷酸的报告染料与猝灭剂之间的距离有关的LAMP等温核酸扩增反应结果，使用以33mer、25mer、21mer间距设计的IB-DFO，在1×10^7copies/reaction分别呈现为11.98分钟、12.03分钟、12.16分钟，在1×10^5copies/reaction分别呈现为15.3分钟、15.28分钟、15.73分钟，在1×10^3copies/reaction分别呈现为20.42分钟、20.09分钟、22.29分钟，观察到类似荧光检测时间，以0copies/reaction仅添加D.W.的反应中，未检测出荧光信号。因此，IB-DFO的报告染料和猝灭剂在21～33mer以内测定出荧光量，其中，25mer IB-DFO中确认到最高的相对荧光单位(RFU，Relative fluorescence unit)。
实施例2：本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)在正向位置、反向位置中的使用效果分析
为了观察当在正向位置或反向位置使用本发明的IB-DFO时，基于LAMP等温核酸扩增反应的荧光检测效果，利用引物设计软件V4(http：//primerexplorer.jp/eLAMP4.0.0/index.html)对埃博拉病毒的子类型之一的本迪布焦型的L片段(聚合酶)部位序列设计4种LAMP等温核酸扩增用引物。设计出的引物为EB_B_F3(序列号1)、EB_B_R3(序列号2)、EB_B_FIP(序列号3)、EB_B_RIP(序列号4)，使用如下的IB-DFO：在EB_B_FIP引物序列中将胸腺嘧啶变换为内侧dT，将其部位变换为作为报告染料的FAM，在将33mer间距位置的胸腺嘧啶变换为内侧dT并在其部位附着BHQ1猝灭剂的EB_B_FIP_P2(序列号5)和EB_B_RIP引物序列中将FAM报告染料和BHQ1猝灭剂以30mer间距设计的EB_B_RIP_P2(序列号8)。
在与上述IB-DFO寡聚核苷酸有关的等温核酸扩增反应中使用20mM的Tris-HCl(pH8.8)、50mM的KCl、10mM的MgSO4，10mM的(NH4)2SO4、0.1％的Tween-20，1.4mM的dNTPeach、0.5M的甜菜碱、8U Bst DNA聚合酶(MCLAB，CA，USA)、0.2uM的EB_B_F3和EB_B_R3，向混合物中添加1.2uM或1.6uM的EB_B_FIP、1.2uM或1.6uM的EB_B_RIP，并单独添加0.4uM的EB_B_FIP_P2和0.4uM的EB_B_RIP_P2。通过基因合成来制作埃博拉病毒的本迪布焦型L片段(gb：FJ217161，521bp)，使用浓度为1×10^7、1×10^5、1×10^3、0copies/reaction。为了对等温核酸扩增反应进行实时荧光检测，在65℃的温度下执行60分钟，使用CFX-96(Bio-Rad，CA，USA)实时荧光检测仪并以一分钟为单位测定荧光量。
图2为单独使用利用FIP和RIP设计的IB-DFO来进行LAMP等温核酸扩增反应的结果，在包含EB_B_FIP_P2或包含EB_B_RIP_P2的反应中，在1×10^7copies/reaction分别呈现为12.3分钟、13.02分钟，在1×10^5copies/reaction分别呈现为15.92分钟、16.13分钟，在1×10^3copies/reaction分别呈现为18.94分钟、18.59分钟，观察到类似荧光检测时间，以0copies/reaction仅添加D.W.的反应中，未检测出荧光信号。因此，当设计IB-DFO时，确认到类似的与LAMP等温核酸扩增有关的实时荧光检测，而与FIP和RIP的位置无关。
实施例3：在正向位置、反向位置单独使用或并用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)时的荧光检测效果分析
为了观察当在正向位置、反向位置并用本发明的IB-DFO时，基于LAMP等温核酸扩增反应的荧光检测效果，利用引物设计软件V4(http：//primerexplorer.jp/eLAMP4.0.0/index.html l)对埃博拉病毒的子类型之一的莱斯顿型的L片段(聚合酶)部位序列设计6种LAMP等温核酸扩增用引物。设计出的引物为EB_R_F3(序列号9)、EB_R_R3(序列号10)、EB_R_FIP(序列号11)、EB_R_RIP(序列号12)、Res_LP(序列号13)、Res_RLP(序列号14)，使用如下的IB-DFO：在EB_R_FIP引物序列中将胸腺嘧啶变换为内侧dT，将其部位变换为作为报告染料的FAM，在将31mer间距位置的胸腺嘧啶变换为内侧dT并在其部位附着BHQ1猝灭剂的EB_R_FIP_P2(序列号15)和EB_R_RIP引物的序列中将FAM报告染料和BHQ1猝灭剂以33mer间距的EB_R_RIP_P2(序列号16)。
在与上述IB-DFO寡聚核苷酸有关的等温核酸扩增反应中使用20mM的Tris-HCl(pH8.8)、50mM的KCl、10mM的MgSO4、10mM的(NH4)2SO4、0.1％的Tween-20、1.4mM的dNTPeach、0.5M的甜菜碱、8U Bst DNA聚合酶(MCLAB，CA，USA)、0.2uM的EB_R_F3和EB_R_R3、0.8uM的Res_LP和Res_RLP，向混合物中添加1.2uM或1.6uM的EB_R_FIP、1.2uM或1.6uM的EB_R_RIP，并单独添加0.4uM的EB_R_FIP_P2和0.4uM的EB_R_RIP_P2。在并用EB_R_FIP_P2和EB_R_RIP_P2的条件下，分别添加0.2uM，并分别使用1.4uM的EB_R_FIP和EB_R_RIP引物。通过基因合成来制作埃博拉病毒的莱斯顿型L片段(gb：JX477166，410bp)，使用浓度为1×10^4、1×10^3、0copies/reaction。为了对等温核酸扩增反应进行实时荧光检测，在65℃的温度下执行30分钟，使用CFX-96(Bio-Rad，CA，USA)实时荧光检测仪并以一分钟为单位测定荧光量。
图3为单独使用或并用利用FIP和RIP设计的IB-DFO来进行LAMP等温核酸扩增反应的结果，在包含EB_R_FIP_P2或包含EB_B_RIP_P2的的反应和并用EB_R_FIP_P2和EB_B_RIP_P2的反应中，在1×10^4copies/reaction分别呈现为16.02分钟、16.95分钟、16.40分钟，在1×10^3copies/reaction分别呈现为18.41分钟、18.65分钟、20.64分钟，观察到类似荧光检测时间，以0copies/reaction仅添加D.W.的反应中，未检测出荧光信号。因此，即使单独使用或并用与FIP和RIP有关的IB-DFO，也确认到类似的与LAMP等温核酸扩增有关的实时荧光检测。
实施例4：根据以与本发明的寡聚核苷酸相同的序列设计的内侧引物的比例的荧光检测效果分析
本发明的IB-DFO和内侧引物以相同的序列设计而成，为了观察当根据它们两个的比例使用时，基于LAMP等温核酸扩增反应的荧光检测效果，利用引物设计软件V4(http：//primerexplorer.jp/eLAMP4.0.0/index.html)对埃博拉病毒的子类型之一的本迪布焦型的L片段(聚合酶)部位序列设计4种LAMP等温核酸扩增用引物。设计出的引物为EB_B_F3(序列号1)、EB_B_R3(序列号2)、EB_B_FIP(序列号3)、EB_B_RIP(序列号4)，使用如下的IB-DFO：在EB_B_FIP引物序列中将胸腺嘧啶变换为内侧dT，将其部位变换为作为报告染料的FAM，在将33mer间距位置的胸腺嘧啶变换为内侧dT并在其部位附着BHQ1猝灭剂的EB_B_FIP_P2(序列号5)。
在与上述IB-DFO寡聚核苷酸有关的等温核酸扩增反应中使用20mM的Tris-HCl(pH8.8)、50mM的KCl、10mM的MgSO4、10mM的(NH4)2SO4、0.1％的Tween-20、1.4mM的dNTPeach、8U Bst DNA聚合酶(MCLAB，CA，USA)、0.2uM的EB_B_F3和EB_B_R3，使用1.6uM的EB_B_RIP，分别以0：1.6uM，0.4：1.2uM，0.8：0.8uM，1.2：0.4uM，1.6：0uM的EB_B_FIP：EB_B_FIP_P2比例向混合物中添加。通过基因合成来制作埃博拉病毒的本迪布焦型L片段(gb：FJ217161，521bp)，使用浓度为1×10^7copies/reaction。为了对等温核酸扩增反应进行实时荧光检测，在65℃的温度下执行60分钟，使用CFX-96(Bio-Rad，CA，USA)实时荧光检测仪并以一分钟为单位测定荧光量。而且，为了进行终点荧光检测，在65℃的温度下执行60分钟后，在30℃的温度下进行反应10次(cycles)，每次进行1分钟，来测定荧光量。
图4和图5的结果中，内侧引物：IB-DFO的比例为0：1.6uM，因此即使不使用内侧引物也确认到与添加有内侧引物的条件类似的荧光检测时间，观察到RFU随着IB-DFO的浓度的减少而减少的结果。
图4为实时荧光检测结果，图5为终点荧光检测结果，确认到RFU随着IB-DFO的浓度的减少而减少的相同趋势。因此，确认到IB-DFO同时执行引物及探针的两种功能，具有可执行实时荧光检测及终点荧光检测的优点。
实施例5：适用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)并将质粒DNA作为模板来进行LAMP等温核酸扩增荧光检测效果分析
为了在FIP位置添加本发明的IB-DFO来使用并将质粒DNA作为模板，来观察基于LAMP等温核酸扩增反应的荧光检测效果，利用引物设计软件V4(http：//primerexplorer.jp/eLAMP4.0.0/index.html)对埃博拉病毒的子类型之一的本迪布焦型的L片段(聚合酶)部位序列设计6种LAMP等温核酸扩增用引物。设计出的引物为EB_B_F3(序列号1)、EB_B_R3(序列号2)、EB_B_FIP(序列号3)、EB_B_RIP(序列号4)、EB_BLP_F(序列号17)、EB_B_LP_R(序列号18)，使用如下的IB-DFO：在EB_B_FIP引物序列中将胸腺嘧啶变换为内侧dT，将其部位变换为作为报告染料的FAM，在将33mer间距位置的胸腺嘧啶变换为内侧dT并在其部位附着BHQ1猝灭剂的EB_B_FIP_P2(序列号5)。
在与上述IB-DFO寡聚核苷酸有关的等温核酸扩增反应中使用20mM的Tris-HCl(pH8.8)、50mM的KCl、10mM的MgSO4、10mM的(NH4)2SO4、0.1％的Tween-20、1.4mM的dNTPeach、8U Bst DNA聚合酶(MCLAB，CA，USA)、0.2uM的EB_B_F3和EB_B_R3、0.8uM的EB_B_LP_F和EB_B_LP_R，向混合物中添加1.2uM的EB_B_FIP、1.6uM的EB_R_RIP，并向混合物中添加0.4uM的作为本发明的的IB-DFO的EB_B_FIP_P2。通过基因合成来制作埃博拉病毒的本迪布焦型L片段(gb：FJ217161，521bp)，使用浓度为1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4、1×10^3、1×10^2、1×10^1、0copies/reaction。为了对等温核酸扩增反应进行实时荧光检测，在65℃的温度下执行60分钟，使用CFX-96(Bio-Rad，CA，USA)实时荧光检测仪并以一分钟为单位测定荧光量。而且，为了进行终点荧光检测，在65℃的温度下执行60分钟后，在30℃的温度下进行反应10次(cycles)，每次进行1分钟，来测定荧光量。
图6为通过使用IB-DFO来对与质粒DNA有关的低浓度区间的敏感度执行实时荧光检测的结果，确认在1×10^7～1×10^2copies/reaction检测出阳性，经确认，在1×10^1和0copies/reaction检测出阴性。检测时间从高浓度分别为6.29分钟、8.01分钟、9.12分钟、10.12分钟、11.73分钟、13.17分钟，观察到荧光检测时间。
图7中，终点荧光检测结果与实时荧光检测结果相同，确认在1×10^7～1×10^2copies/reaction检测出阳性，在1×10^1和0copies/reaction检测出阴性。
图6及图7的结果中，当使用本发明的IB-DFO时，根据模板的浓度，同样可确认出实时荧光检测及终点荧光检测的检测与否。在使用实时荧光检测方法的情况下，可缩短LAMP核酸扩增反应时间。
实施例6：适用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)并RNA转录物作为模板来进行RT-LAMP等温核酸扩增荧光检测效果分析
为了在FIP位置添加本发明的IB-DFO来使用并将RNA转录物作为模板，来观察基于RT-LAMP等温核酸扩增反应的荧光检测效果，利用引物设计软件V4(http：//primerexplorer.jp/eLAMP4.0.0/index.html)对埃博拉病毒的子类型之一的本迪布焦型的L片段(聚合酶)部位序列设计6种RT-LAMP等温核酸扩增用引物。设计出的引物为EB_B_F3(序列号1)、EB_B_R3(序列号2)、EB_B_FIP(序列号3)、EB_B_RIP(序列号4)、EB_BLP_F(序列号17)、EB_B_LP_R(序列号18)，使用如下的IB-DFO：在EB_B_FIP引物序列中将胸腺嘧啶变换为内侧dT，将其部位变换为作为报告染料的FAM，在将25mer间距位置的胸腺嘧啶变换为内侧dT并在其部位附着BHQ1猝灭剂的EB_B_FIP_P2.5(序列号6)。
在与上述IB-DFO寡聚核苷酸有关的等温核酸扩增反应中使用20mM的Tris-HCl(pH8.8)、50mM的KCl、10mM的MgSO4、10mM的(NH4)2SO4、0.1％的Tween-20、5mM DTT、5U RNaseinhibitor(New England Biolabs，MA，USA)、1.4mM的dNTP each、8U Bst DNA聚合酶(MCLAB，CA，USA)，0.2uM的EB_B_F3和EB_B_R3、0.8uM的EB_B_LP_F和EB_B_LP_R，向混合物中添加1.4uM的EB_B_FIP、1.6uM的EB_R_RIP，并向混合物中添加0.2uM的作为本发明的的IB-DFO的EB_B_FIP_P2.5。通过基因合成来将埃博拉病毒的本迪布焦型L片段(gb：FJ217161，521bp)制作为质粒DNA，将此质粒DNA使用MEGAscript T7Transcription Kit(AppliedBiosystems，CA，USA)并通过体外转录(in vitro transcription)来合成RNA转录物。本迪布焦型RNA转录物的使用浓度为1×10^5、1×10^4、1×10^3、0copies/reaction。为了对等温核酸扩增反应进行实时荧光检测，在65℃的温度下执行30分钟，使用CFX-96(Bio-Rad，CA，USA)实时荧光检测仪并以一分钟为单位测定荧光量。而且，为了进行终点荧光检测，在65℃的温度下执行60分钟后，在30℃的温度下进行反应10次(cycles)，每次进行1分钟，来测定荧光量。
图8为通过使用IB-DFO来执行与RNA转录物有关的RT-LAMP等温核酸扩增实时荧光检测的结果，确认在1×10^5～1×10^3copies/reaction检测出阳性，在使用D.W的0copies/reaction检测出阴性。检测时间从高浓度分别为8.72分钟、10.03分钟、10.98分钟，观察到荧光检测时间。
图9中，终点荧光检测结果与实时荧光检测结果相同，确认在1×10^5～1×10^3copies/reaction检测出阳性，在使用D.W的0copies/reaction检测出阴性。
图8及图9的结果中，当使用本发明的IB-DFO来进行一步RT-LAMP反应时，根据模板的浓度，同样可确认出实时荧光检测及终点荧光检测的检测与否。在使用实时荧光检测方法的情况下，与使用DNA的LAMP相同地，同样可以缩短一步RT-LAMP核酸扩增反应的时间。
实施例7：适用本发明的寡聚核苷酸(IB-DFO)和包含按温度(55℃、60℃、65℃、70℃)设计的猝灭剂的反义探针并将质粒DNA作为模板来进行LAMP等温核酸扩增荧光检测荧光检测效果分析
在FIP位置添加本发明的IB-DFO并将从IB-DFO的报告染料序列至3’末端的互补反义序列按温度(55℃、60℃、65℃、70℃)设计来使猝灭剂位于反义序列的3’末端，从而设计反义探针。而且，在RIP位置添加IB-DFO并在60℃的温度下设计反义探针。为了利用其并将质粒DNA作为模板在LAMP等温核酸扩增反应中观察按浓度设计的反义探针的实时荧光检测效果，利用引物设计软件V4(http：//primerexplorer.jp/eLAMP4.0.0/index.html)对埃博拉病毒的子类型之一的本迪布焦型的L片段(聚合酶)部位序列设计6种RT-LAMP等温核酸扩增用引物。设计出的引物为EB_B_F3(序列号1)、EB_B_R3(序列号2)、EB_B_FIP(序列号3)、EB_B_RIP(序列号4)、EB_BLP_F(序列号17)、EB_B_LP_R(序列号18)，使用如下的IB-DFO：在EB_B_FIP引物序列将胸腺嘧啶变换为内侧dT，将其部位变换为作为报告染料的FAM，在将25mer间距位置的胸腺嘧啶变换为内侧dT并在其部位附着BHQ1猝灭剂的EB_B_FIP_P2(序列号5)。作为反义探针，使用在55℃的温度下设计的EB_B_FIP_P2_Q2_55(序列号19)、在60℃的温度下设计的EB_B_FIP_P2_Q2_60(序列号20)、在65℃的温度下设计的EB_B_FIP_P2_Q2_65(序列号21)、在70℃的温度下设计的EB_B_FIP_P2_Q2_70(序列号22)。而且，使用在60℃的温度下对与EB_B_RIP_P2(序列号8)的IB-DFO互补的反义探针进行设计的EB_B_RIP_P2_Q60(序列号23)。
在与上述IB-DFO寡聚核苷酸有关的等温核酸扩增反应中使用20mM的Tris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO4、10mM的(NH4)2SO4、0.1％的Tween-20、1.4mM的dNTP each、8UBst DNA聚合酶(MCLAB，CA，USA)、0.2uM的EB_B_F3和EB_B_R3、0.4uM的EB_B_LP_F和EB_B_LP_R，向混合物中添加1.2uM的EB_B_FIP、1.6uM的EB_R_RIP，并分别使用EB_B_FIP_P2_Q2_55、EB_B_FIP_P2_Q2_60、EB_B_FIP_P2_Q2_65、EB_B_FIP_P2_Q2_70来制备0.4uM的作为本发明的的IB-DFO的EB_B_FIP_P2和1.6uM的反义探针的混合物，而且，以0.4uM的EB_B_RIP_P2代替IB-DFO，并混合1.6uM的与其有关的作为反义探针的EB_B_RIP_P2_Q_60，对IB-DFO与0.4uM的EB_B_FIP_P2和0.4uM的EB_B_RIP_P2以及1.6uM的EB_B_FIP_P2_Q2_6和1.6uM的EB_B_RIP_P2_Q_60进行混合。通过基因合成来制作埃博拉病毒的本迪布焦型L片段(gb：FJ217161，521bp)，来使用农的为1×10^5，1×10^4，1×10^3copies/reaction的质粒DNA。为了对等温核酸扩增反应进行实时荧光检测，在65℃的温度下执行60分钟，使用AB7500(Applied Biosystems，CA，USA)实时荧光检测仪并以一分钟为单位测定荧光量。
图10至图13为按温度设计反义探针并与IB-DFO并用来执行LAMP等温核酸扩增实时荧光检测的结果，在55℃的温度下，在1×10^5～1×10^3copies/reaction的检测时间为从高浓度分别为13.4分钟、15.3分钟、18.4分钟，观察到荧光检测时间。在60℃的温度下，分别荧光检测出20.3分钟、22.7分钟、24.6分钟，在65℃的温度下，分别检测出47.7分钟、49.7分钟，在1×10^3未检测出。在70℃的温度下，全部未荧光检测出。相比于在60℃的温度下的反义探针，荧光量在55℃的温度下为约50％左右，检测时间为约6～7分钟，比较快。
如图14所示的Rn vs min(non-normalization)型结果中，在55℃的温度下的反义探针的background Rn比在60℃的温度下的反义探针的background Rn高出2倍。由此，可根据反义探针的设计温度来调节background Rn及delta Rn。
图15至图17中，在IB-DFO使用FIP或RIP或者分别使用FIP和RIP，包含与其有关的在60℃的温度下的反义探针来进行反应后，在分别代替FIP和RIP的情况下，呈现出类似的荧光量，但是RIP的IB-DFO的呈现出荧光量的速度比FIPIB-DFO呈现出荧光量的速度快约10分钟。
[序列表]
序列号1：EB_B_F3
5'-GTGTGTTCAAGTACAGCATT-3'
序列号2：EB_B_R3
5'-ATAAGGGAGGATGATCAAGG-3'
序列号3：EB_B_FIP
5'-ACCTGGTGTTAGATGTTTATCTGAGGCCAAACATTATTTTGATAGCC-3'
序列号4：EB_B_RIP
5'-TACATTAAGAGGAACCAATTTCCGCTGATAGAATTCCCACAATAA GTCTT-3'
序列号5：EB_B_FIP_P2
5'-ACCTGG(internal dT-FAM)GTTAGATGTTTATCTGAGGCCAAACAT TATTT(internaldT-BHQ1)GATAGCC-3'
序列号6：EB_B_FIP_P2.5
5'-ACCTGGTGT(internal dT-FAM)AGATGTTTATCTGAGGCCAAACAT(internal dT-BHQ1)ATTTTGATAGCC-3'
序列号7：EB_B_FIP_P3
5'-ACCTGGTGTTAGA(internal dT-FAM)GTTTATCTGAGGCCAAACAT(internal dT-BHQ1)ATTTTGATAGCC-3'
序列号8：EB_B_RIP_P2
5'-TACA(internal dT-FAM)TAAGAGGAACCAATTTCCGCTGATAGAAT(internal dT-BHQ1)CCCACAATAA GTCTT-3'
序列号9：EB_R_F3
5'-GCCTCACAATGTTAATCTTAGC-3'
序列号10：EB_R_R3
5'-GATTGTCTCCCATGACCG-3'
序列号11：EB_R_FIP
5'-CCTCTATGCCTCCTAAGTGCCAATCGAGAATATCCTCCTGAA-3'
序列号12：EB_R_RIP
5'-GATTACAACAAAAACTGTGGACGAGCTGATCGTAACTTAAAACCAGT-3'
序列号13：Res_LP
5'-GGTACGAACTCGGGC-3'
序列号14：Res_RLP
5'-TGTGCACAAATCTCCTTAGT-3'
序列号15：EB_R_FIP_P2
5'-CCTC(internal dT-FAM)ATGCCTCCTAAGTGCCAATCGAGAATATCC(internal dT-BHQ1)CCTGAA-3'
序列号16：EB_R_RIP_P2
5'-GAT(internal dT-FAM)ACAACAAAAACTGTGGACGAGCTGATCGTAAC(internal dT-BHQ1)TAAAACCAGT-3'
序列号17：EB_B_LP_F
5'-ATTACACTATACCATGACCCTT-3'
序列号18：EB_B_LP_R
5'-CACTGCCTATGATTAAAGACT-3'
序列号19：EB_B_FIP_P2-Q2_55
5'-CCTCAGATAAACATCTAAC-BHQ1-3'
序列号20：EB_B_FIP_P2-Q2_60
5'-GGCCTCAGATAAACATCTAAC-BHQ1-3'
序列号21：EB_B_FIP_P2-Q2_65
5'-TGTTTGGCCTCAGATAAACATCTAAC-BHQ1-3'
序列号22：EB_B_FIP_P2-Q2_70
5'-GGCTATCAAAATAATGTTTGGCCTCAGATAAACATCTAAC-BHQ1-3'
序列号23：EB_B_RIP_P2-Q_60
5'-CGGAAATTGGTTCCTCTTA-BHQ1-3'

Claims (23)

1.一种寡聚核苷酸，其特征在于，以与靶基因的特定序列有关的环介导等温核酸扩增反应用引物中的正向内侧引物或反向内侧引物作为对象，使除了3’末端之外的序列中的部分序列变换为内侧dT序列、内侧dG序列、内侧dC序列、内侧dA序列、内侧dU序列或内侧dR序列，并使报告染料或猝灭剂位于其部位，在规定温度以下，全部或部分序列形成双链，泡沫结构为一个以上。
2.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，在上述寡聚核苷酸中，报告染料与猝灭剂之间的间距为21～33mer以内。
3.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，上述寡聚核苷酸单独使用或并用正向内侧探针和反向内侧探针。
4.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，上述寡聚核苷酸的报告染料为FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXAS RED、CY3及CY5中的一种或者具有450～685nm的发光波长范围的染料。
5.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，上述寡聚核苷酸的猝灭剂为TAMRA、DABCYL、黑洞猝灭剂1或黑洞猝灭剂2或者具有500～705nm的吸光波长范围的猝灭剂。
6.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，上述寡聚核苷酸具有1个至4个泡沫结构。
7.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，在上述寡聚核苷酸中，双链解链成单链的解链温度为30～70℃。
8.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸，其特征在于，上述寡聚核苷酸为序列号5至序列号8及序列号15至序列号16中所记载的寡聚核苷酸中的一种。
9.一种执行环介导等温核酸扩增反应或逆转录-环介导等温核酸扩增反应的方法，其特征在于，在等温条件下，使用权利要求1所述的寡聚核苷酸来进行实时核酸扩增荧光检测。
10.一种执行环介导等温核酸扩增反应或逆转录-环介导等温核酸扩增反应的方法，其特征在于，在等温或两种以上的温度条件下，使用权利要求1所述的寡聚核苷酸来进行终点核酸扩增荧光检测。
11.根据权利要求9和10中任一项所述的方法，其特征在于，上述寡聚核苷酸单独使用或并用正向内侧探针和反向内侧探针。
12.根据权利要求9和10中任一项所述的方法，其特征在于，上述方法的等温条件在50～75℃的范围内。
13.根据权利要求9和10中任一项所述的方法，其特征在于，上述方法以DNA及cDNA核酸作为对象来执行。
14.根据权利要求9和10中任一项所述的方法，其特征在于，上述方法以RNA核酸作为对象来进行逆转录反应后，对特定基因执行一步反应。
15.一种试剂盒，其特征在于，单独或同时对包含权利要求1所述的寡聚核苷酸的与感染性疾病、遗传性疾病、耐药性、药物抵抗性或敏感性检体有关的特定基因进行多重扩增。
16.一种等温核酸扩增反应用组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的寡聚核苷酸作为有效成分。
17.根据权利要求16所述的等温核酸扩增反应用组合物，其特征在于，上述等温核酸扩增反应用组合物包含序列号1至序列号18的寡聚核苷酸。
18.一种埃博拉病毒核酸扩增用组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的寡聚核苷酸作为有效成分。
19.根据权利要求18所述的埃博拉病毒核酸扩增用组合物，其特征在于，上述埃博拉病毒核酸扩增用组合物包含序列号1至序列号18的寡聚核苷酸。
20.一种执行与DNA、RNA或cDNA有关的等温核酸扩增反应的方法，其特征在于，并用权利要求1所述的寡聚核苷酸和反义探针来执行。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，在55～65℃的温度范围内设计及使用上述反义探针。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，在正向位置和反向位置单独使用或并用上述寡聚核苷酸和反义探针。
23.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，上述反义探针包括序列号19至序列号23中所记载的序列中的一种。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109504744A (zh) * 2019-01-14 2019-03-22 陕西科技大学 基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒
WO2023093060A1 (zh) * 2021-11-23 2023-06-01 广州达安基因股份有限公司 基于重组酶聚合酶扩增技术的逆转录扩增系统和方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110628877A (zh) * 2019-05-17 2019-12-31 澳门大学 增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的方法
CN111118223A (zh) * 2020-02-27 2020-05-08 江苏宏微特斯医药科技有限公司 通过等温扩增技术检测样品中核酸的方法及其试剂盒
KR102286597B1 (ko) * 2020-03-25 2021-08-05 하이브리드테크놀로지 주식회사 타겟과 표지된 프로브의 결합 효율 개선 및 미결합 프로브와 결합 프로브의 효율적인 분리 방법
KR20220127175A (ko) 2021-03-10 2022-09-19 전북대학교산학협력단 피로인산염 검출용 구리 착물, 이를 포함하는 핵산 검출 키트 및 핵산 검출을 위한 정보제공방법
WO2022225851A1 (en) * 2021-04-19 2022-10-27 Yale University Colorimetric covid-19 rapid-test and methods of using same

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003530893A (ja) * 2000-04-25 2003-10-21 ディーエヌエー サイエンシーズ インコーポレーテッド ポリメラーゼのプルーフリーディング活性によるヌクレオチド配列変異の検出
CN101575642A (zh) * 2009-06-19 2009-11-11 华南理工大学 竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法
WO2010048615A2 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services, Center For Disease Control And Prevention Human ebola virus species and compositions and methods thereof
WO2011056933A1 (en) * 2009-11-05 2011-05-12 Becton, Dickinson And Company Sequence-specific methods for homogenous, real-time detection of lamp products
CN103045755A (zh) * 2011-10-14 2013-04-17 中国农业科学院上海兽医研究所 一种检测埃博拉病毒的荧光定量pcr检测方法及其引物和试剂盒
DE102011055247A1 (de) * 2011-11-10 2013-05-16 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Multianalyt-Reportersystem
CN103540660A (zh) * 2013-10-10 2014-01-29 中国人民解放军疾病预防控制所 基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒
CN104962607A (zh) * 2015-04-07 2015-10-07 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种单一或多重目的基因片段恒温扩增的检测方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7841363B1 (en) 2007-04-03 2010-11-30 Spx Corporation Modular upgradeable pneumatic/hydraulic manifold
CA2803161C (en) * 2010-06-22 2019-09-24 University Of Hawaii Sequence specific real-time monitoring of loop-mediated isothermal amplification (lamp)
CN107190078A (zh) * 2011-05-06 2017-09-22 凯杰有限公司 包含内部标记引物的核酸的测序、扩增和检测方法
GB201319180D0 (en) * 2013-10-30 2013-12-11 Mast Group Ltd Nucleic acid probe
US20170044631A1 (en) * 2014-04-14 2017-02-16 The Unite States of America, as represented by the Secretary, Dept. of Health and Human Services Methods for rapid detection and identification of viral nucleic acids

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003530893A (ja) * 2000-04-25 2003-10-21 ディーエヌエー サイエンシーズ インコーポレーテッド ポリメラーゼのプルーフリーディング活性によるヌクレオチド配列変異の検出
WO2010048615A2 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services, Center For Disease Control And Prevention Human ebola virus species and compositions and methods thereof
CN101575642A (zh) * 2009-06-19 2009-11-11 华南理工大学 竞争性交替结合猝灭探针环介导等温扩增快速检测方法
WO2011056933A1 (en) * 2009-11-05 2011-05-12 Becton, Dickinson And Company Sequence-specific methods for homogenous, real-time detection of lamp products
CN103045755A (zh) * 2011-10-14 2013-04-17 中国农业科学院上海兽医研究所 一种检测埃博拉病毒的荧光定量pcr检测方法及其引物和试剂盒
DE102011055247A1 (de) * 2011-11-10 2013-05-16 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Multianalyt-Reportersystem
CN103540660A (zh) * 2013-10-10 2014-01-29 中国人民解放军疾病预防控制所 基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒
CN104962607A (zh) * 2015-04-07 2015-10-07 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种单一或多重目的基因片段恒温扩增的检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINGYUE JU ET AL.: "Fluorescence energy transfer dye-labeled primers for DNA sequencing and analysis", 《PROC NATL ACAD SCI USA》 *
NATHAN A. TANNER ET AL.: "Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification", 《BIOTECHNIQUES》 *
NICOLAS DI FIORI ET AL.: "The Effect of Dye-Dye Interactions on the Spatial Resolution of Single-Molecule FRET Measurements in Nucleic Acids", 《BIOPHYSICAL JOURNAL》 *
XIONG DING ET AL.: "A mixed dye-based label-free and sensitive dualfluorescence for the product detection of nucleic acid isothermal multiple-self-matching-initiated amplification", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
林文慧等: "多重环介导等温扩增技术研究进展", 《遗传》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109504744A (zh) * 2019-01-14 2019-03-22 陕西科技大学 基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒
CN109504744B (zh) * 2019-01-14 2022-11-29 陕西科技大学 基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒
WO2023093060A1 (zh) * 2021-11-23 2023-06-01 广州达安基因股份有限公司 基于重组酶聚合酶扩增技术的逆转录扩增系统和方法

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