CN110628877A - 增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的方法 - Google Patents

增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的方法，涉及生物技术领域。本发明公开的增强剂具有结合荧光染料的结构域和淬灭基团，淬灭基团用于淬灭结构域所结合的荧光染料所发射的荧光。由于上述结构域与荧光染料结合的亲和力低于核酸扩增反应的目标扩增产物与荧光染料结合的亲和力，该增强剂不仅能减小高浓度的荧光染料对扩增反应的抑制；还能增强基于微流控芯片的核酸扩增反应中荧光染料的信号强度，提高荧光染料作为扩增指示剂在微流控芯片上应用的可靠性。

Description

增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的方法。
背景技术
链式聚合酶反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种应用广泛的分子生物学技术。该技术可以对特定的核酸片段进行指数型扩增。为了实时监控PCR反应，可以通过熔解曲线分析方法(high resolution melting analysis，HRM)来鉴定PCR产物，或在PCR反应液中加入荧光指示剂。用于PCR反应的荧光指示剂主要分为两大类：一类是荧光探针，如Taqman探针，分子信标探针；另一类是能与双链DNA结合的荧光染料，如EtBr，SYBRGreen I(SGI)，EvaGreen，Sytox Green。虽然荧光探针能够与PCR产物特异性结合，并用于多重PCR反应中，但荧光探针的合成费用通常较贵。此外，荧光探针应用于不同的目标核酸序列时，需要进行复杂的设计并对反应条件进行优化。
而另一方面，核酸染料价格低廉，与双链DNA的非特异性结合使得其可以不受限的应用于任何双链核酸序列。当核酸染料与双链DNA结合时，其荧光强度可以增强至1000倍，灵敏度极高。然而，此类核酸染料在较高浓度下会抑制扩增反应，使得其应用被局限于低浓度范围内。因此，高浓度核酸染料对扩增反应的抑制限制了其在PCR以及相关技术中的应用。
双链DNA荧光染料的另一缺陷是其与微流控系统的不相容。近年来，由于微流控系统低试剂损耗、反应快速、设备尺寸微型等诸多优势，在微流控芯片上进行PCR反应(on-chip PCR)已成为一个研究热点。然而，我们观察到在某些微流控系统中，SGI这种核酸染料会产生假阴性PCR结果。即便琼脂糖电泳已鉴定出扩增产物，证实扩增成功，SGI也没有给出阳性扩增信号。这种现象可能是由于染料分子扩散到周围的油环境中，也有可能是染料分子被芯片表面吸附所导致。Kong等研究人员(Kong,J.E.,Wei,Q.,Tseng,D.,Zhang,J.,Pan,E.,Lewinski,M.,Garner,O.B.,Ozcan,A.and Di Carlo,D.(2017)Highly Stable andSensitive Nucleic Acid Amplification and Cell-Phone-Based Readout.ACS nano,11,2934-2943.)在其开发的用于环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)的微流控芯片上也遇到了荧光染料可靠性和灵敏度降低的问题。对此，他们的解决办法是在反应液中加入羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)，然而HNB的效用依赖于离子浓度，而且只能通过有限地改变HNB浓度来调节其增强PCR的功能。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的方法。本发明所提供的增强核酸扩增反应的增强剂不仅能减小高浓度的荧光染料对扩增反应的抑制；还能增强基于微流控芯片的核酸扩增反应中荧光染料的信号强度，提高荧光染料作为核酸扩增反应指示剂在微流控芯片上应用的可靠性，避免假阴性结果。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种增强核酸扩增反应的增强剂，其适用于含有荧光染料的核酸扩增反应，所述荧光染料能与所述核酸扩增反应的双链扩增产物结合；
所述增强剂具有结合所述荧光染料的结构域和淬灭基团，所述淬灭基团用于淬灭所述结构域所结合的荧光染料所发射的荧光，所述结构域与所述荧光染料结合的亲和力低于所述核酸扩增反应的目标扩增产物与所述荧光染料结合的亲和力。
本发明实施例提供的增强核酸扩增反应的增强剂，其结合荧光染料的亲和力低于目标扩增产物与荧光染料结合的亲和力，将其应用于核酸扩增反应时，核酸扩增反应体系如果存在较高浓度的荧光染料分子时，该增强剂的结构域能够结合反应体系部分荧光染料分子并可通过淬灭基因淬灭这些被结合的荧光染料分子所发射的荧光。该增强剂能够临时存储荧光染料分子，避免大量荧光染料分子游离于溶液中干扰扩增过程。
而随着扩增进行，与荧光染料亲和力更高的扩增产物诞生，由于扩增产物对荧光染料更具亲和力，临时存储于该增强剂中的荧光染料分子主动转移至扩增产物上，并释放高强度荧光。通过这种临时存储、按需释放的机理，本发明实施例提供的增强剂能在不影响荧光染料作为核酸扩增反应指示剂的功能的前提下，有效地减少高浓度核酸染料对扩增的抑制，进而增强核酸扩增反应的效果。
对于基于微流控的核酸扩增反应而言，本发明实施例提供的增强剂能够有效吸附核酸扩增反应体系中的荧光染料分子，为这些荧光染料分子提供保护，防止其在结合扩增产物前受损而影响作为指示剂的功能，进而增强核酸扩增反应的效果。
本发明实施例所提供的增强剂可适用任何需要进行核酸扩增反应的方法，只要该核酸扩增反应涉及使用结合核酸的荧光染料作为指示剂，即可在核酸扩增反应体系中添加本发明实施例所提供的增强剂以增强核酸扩增反应的效果，例如荧光核酸扩增反应，基于微流控的核酸扩增反应，也可以用于高分辨率熔解曲线分析中。
在可选的实施方式中，所述增强剂为DNA核酸分子，所述DNA核酸分子具有通过碱基互补配对原则结合的双链结构区，与所述荧光染料结合的所述结构域为所述双链结构区；所述淬灭基团位于所述双链结构区的5’端或3’端。
需要说明的是，本发明对增强剂具体的结构不作限定，例如其可以具有DNA双链结构，但也可以是具有其他可结合荧光染料的结构；只要其具有能够结合荧光染料的结构且其结合荧光染料的亲和力低于PCR扩增产物与荧光染料的亲和力即落入本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述DNA核酸分子为单链DNA核酸分子，所述单链DNA核酸分子具有至少一个茎结构区；所述茎结构区由5’端茎杆区和3’端茎杆区通过碱基互补配对结合构成；所述双链结构区为所述茎结构区；所述淬灭基团位于所述5’端茎杆区的5’端或所述3’端茎杆区的3’端。
需要说明的是，本发明对所述DNA核酸分子的链数不作限定，例如可以是单链DNA核酸分子即只有一个5’端和一个3’端，只要其通过碱基互补配对原则形成由可结合荧光染料的双链结构区即可；在其他的一些实施例中所述DNA核酸分子也可以是双链DNA核酸分子即由两条单链核酸分子通过碱基互补配对结合而成；其具有两个5’端和两个3’端。
单链DNA核酸分子形成的双链结构属于分子内配对，因此PCR高温变性使得双链解开后，当温度降低时，单链DNA核酸分子的分子内对应序列能迅速精准地重新配对为双链结构区。而普通的双链DNA，其解链后重新配对的效率较低。此外，双链DNA核酸分子加入扩增反应中，很可能会干扰扩增进程，产生非特异扩增。而单链DNA核酸分子的自身互补形成的双链结构区的“自闭性”使其既具有双链结构区，又不容易干扰扩增反应。
在可选的实施方式中，所述茎结构区的长度短于所述扩增产物的长度。本发明对扩增产物的长度不作限定，通常来说，只要扩增产物的长度大于茎结构区长度即可。优选地，所述扩增产物的长度为50-1000bp。荧光染料更易结合长片段的DNA片段，控制茎结构区的长度短于扩增产物的长度，在随着扩增的进行，茎结构区所结合的荧光染料更易迁移至扩增产物中，有利于释放荧光染料，提高荧光强度。
在可选的实施方式中，所述茎结构区的长度与所述目标扩增产物的长度的比值为2-16:100。
茎结构区的长度与目标扩增产物的长度的比值在合适的范围内例如2-16:100，可以明显改善核酸扩增反应的扩增效果，有效减少高浓度荧光染料的抑制作用，提高基于微流控芯片的核酸扩增反应中荧光染料的信号强度。优选地，所述茎结构区的长度与所述目标扩增产物的长度的比值为2-9:100或10-16:100。更优选地，所述茎结构区的长度与所述目标扩增产物的长度的比值为8.5:100。
茎结构区的长度是影响扩增效果的一个因素，在可选的实施方式中，所述茎结构区的长度2-20bp，该长度范围下茎结构区能够实现达到减少高浓度荧光染料的抑制作用，实现提高微流控芯片的核酸扩增反应中荧光染料的信号强度的目的。
优选地，所述茎结构区的长度为2-8bp；更优选地，茎结构区的长度为8bp。茎结构区在2-8bp的长度优选为8bp的长度下，本发明实施例提供的增强剂能够在高浓度荧光染料的环境中，显著地提高核酸扩增反应效果，克服高浓度荧光染料带来的抑制作用，能够实现对靶序列的成功扩增，也可以显著提高基于微流控芯片的核酸扩增反应的荧光信号强度。
在可选的实施方式中，所述茎结构区的所述5’端茎杆区的碱基序列从5’端至3’端为CC、CCGC、CCGCTG、CCGCTGCG、CCGCTGCGCG或CGTGCCGCTGGTCGC。
在可选的实施方式中，所述单链DNA核酸分子还具有环结构区。
在本发明对环结构区的长度不作限定，在可选的实施方式中，所述环结构区的长度为10-14nt。
在本发明对环结构区的碱基序列不作限定，在可选的实施方式中，所述环结构区的任意位置的碱基选自A、T、C和G中的任意一种。
在可选的实施方式中，所述环结构区的任意位置的碱基为A。
在可选的实施方式中，所述单链DNA核酸分子的线性化的碱基序列如SEQ IDNO.1-7中任意一种所示。
SEQ ID NO.1-7中任意一种所示单链DNA核酸分子均能够减少克服高浓度荧光染料带来的抑制作用，能够实现对靶序列的成功扩增，也可以显著提高基于微流控芯片的核酸扩增反应的荧光信号强度。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据实际的核酸扩增反应的需要，选择合适的结合扩增产物的荧光染料，例如包括但不限于SYBR Green I、EvaGreen、Sytox Green、EtBr、SYBR Green II、SYBR Gold、SYBR Safe、LC Green、GelGreen、GelRed、DAPI、Syto 9、Sytox Blue、Sytox Red、Sytox Orange和Thiazole Orange。无论选择何种荧光染料，均落入本发明的保护范围。
当然，本领域技术人员可以根据荧光染料的类型，选择适宜的可通过FRET机制吸收所述荧光染料发射荧光的基团，例如包括但不限于BHQ、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl和TAMRA中任意一种。无论选择何种淬灭基团，均落入本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，上述的核酸扩增反应选自链式聚合酶反应(PCR)和等温扩增反应中的任意一种。
本发明所提供的增强剂可以适用于所有的扩增产物是双链DNA的核酸扩增反应，这些扩增反应并不限于上述的PCR和LAMP，也可以是其他的核酸扩增反应，无论用于何种核酸扩增反应，均属于本发明的保护范围。
第二方面，本发明实施例提供了一种核酸扩增反应液，其含有如上任一项实施方式所述的增强剂。
第三方面，本发明实施例提供了一种可进行核酸扩增反应的数字微流控芯片，其装载有上述的核酸扩增反应液或具有装载上述核酸扩增反应液的结构。
第四方面，本发明实施例提供了一种核酸扩增反应试剂盒，其含有如上任一项实施方式所述的增强核酸扩增反应的增强剂或如上所述的核酸扩增反应液。
第五方面，本发明实施例提供了一种进行核酸扩增反应的方法，其包括：在核酸扩增反应体系中加入如上任一项实施方式所述的增强核酸扩增反应的增强剂或如上所述的核酸扩增反应液。
在可选的实施方式中，所述核酸扩增反应体系中的所述增强剂的浓度为50-2000nM，优选为100-900nM。
在可选的实施方式中，所述核酸扩增反应体系中含有荧光染料，所述荧光染料选自SYBR Green I、EvaGreen、Sytox Green、EtBr、SYBR Green II、SYBR Gold、SYBR Safe、LCGreen、GelGreen、GelRed、DAPI、Syto 9、Sytox Blue、Sytox Red、Sytox Orange和ThiazoleOrange中任意一种。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据实际的核酸扩增反应的需要，选择合适的结合扩增产物的荧光染料，例如包括但不限于SYBR Green I、EvaGreen、Sytox Green、EtBr、SYBR Green II、SYBR Gold、SYBR Safe、LC Green、GelGreen、GelRed、DAPI、Syto 9、Sytox Blue、Sytox Red、Sytox Orange和Thiazole Orange。无论选择何种荧光染料，均落入本发明的保护范围。
当然，本领域技术人员可以根据荧光染料的类型，选择适宜的可通过FRET机制吸收所述荧光染料发射荧光的基团，例如包括但不限于BHQ、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl和TAMRA中任意一种。无论选择何种淬灭基团，均落入本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述荧光染料为SYBR Green I，所述荧光染料在所述核酸扩增反应体系的浓度0.2×-2×。
在可选的实施方式中，所述核酸扩增反应选自链式聚合酶反应和等温扩增反应中的任意一种。
在可选的实施方式中，所述链式聚合酶反应为实时荧光链式聚合酶反应、基于微流控芯片的链式聚合酶反应、或者高分辨率熔解曲线分析。在可选的实施方式中，所述方法为实时荧光核酸扩增反应、基于微流控芯片的核酸扩增反应或高分辨率熔解曲线分析法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1.本发明实施例1提供的增强剂(CRoA，图1-图7中的CRoA代表本发明的增强剂)增强核酸扩增反应的机理示意图。
图2.增强剂对off-chip PCR和on-chip PCR的增强作用。此实验中使用的增强剂为500nM的A4Q。(A)Off-chip PCR中，当SGI浓度分别为0.4×，0.8×，1.2×，1.6×时，不含增强剂的样本和含有增强剂的样本的扩增曲线对比。(B，C)本实验中所用数字微流控芯片的俯视示意图和侧面示意图。(D)On-chip PCR中，当SGI浓度分别为0.4×，0.8×，1.2×，1.6×时，不含增强剂的样本和含有增强剂的样本其荧光强度变化的对比。(E)当SGI浓度为0.4×时，不含增强剂的样本和含有增强剂的样本在on-chip PCR前后的荧光显微照片对比。(F)图2中E的on-chip PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析图。每一列融合了对应条件下的3个平行样。M表示DNA标记。
图3.增强剂的茎长度、浓度对off-chip PCR和on-chip PCR的影响。实验中SGI浓度为0.4×。(A)增强剂茎长度从0bp到20bp(A0Q～A20Q)时，对off-chip PCR的增强效果。(B)增强剂茎长度从0bp到20bp(A0Q～A20Q)时，对on-chip PCR的增强效果。(C)不同浓度的A8Q(100nM～900nM)对off-chip PCR的增强效果。(D)不同浓度的A8Q(100nM～900nM)对on-chip PCR的增强效果。
图4.增强剂的淬灭基团、环序列对off-chip PCR和on-chip PCR的影响。(A)A4spacer的结构示意图，原本3’端的淬灭基团被C3 spacer取代。(B)F-CRoA的结构示意图，环结构中，原本的AAAAAAAAAAAAAA序列被一段与目标核酸互补的特异性序列所取代。(C)A4spacer、A4Q、F-CRoA在0.4×SGI、0.8×SGI时对off-chip PCR的增强作用。(D)A4spacer、A4Q、F-CRoA在0.4×SGI时对on-chip PCR的增强作用。
图5.在不同SGI浓度(0.8×～2.0×)下，对增强剂进行优化后的off-chip PCR扩增结果(A)，以及其对应的on-chip PCR扩增结果(B)。0.2×SGI、0.4×SGI、不含增强剂的样本作为对照组。
图6.增强剂对基于其它核酸染料(Sytox Green、EvaGreen)的PCR系统的增强作用。(A)Off-chipPCR中，当Sytox Green浓度为200nM～500nM时，不含增强剂的样本和含有增强剂的样本的扩增曲线对比。(B)On-chip PCR中，当Sytox Green浓度为200nM时，不含增强剂的样本和含有增强剂的样本的扩增结果对比。(C)Off-chip PCR中，当EvaGreen浓度分别为1×、3×、4×、5×时，不含增强剂的样本和含有增强剂的样本的扩增曲线对比。(D)on-chip PCR中，当EvaGreen浓度为1×时，不含增强剂的样本和含有增强剂的样本的扩增结果对比。
图7.增强剂对于LAMP扩增系统的增强作用。在Off-chip LAMP中，当SGI浓度分别为0.4×，0.8×，1.2×时，不含CRoA的样本与含有CRoA的样本的扩增曲线对比。在0.4×SGI时，含CRoA的样本采用100nM A8Q；在0.8×SGI时，含CRoA的样本采用300nM A8Q；在1.2×SGI时，含CRoA的样本采用500nM A8Q。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的增强核酸扩增反应的增强剂，其为单链DNA核酸分子，该单链DNA核酸分子整体呈发夹结构，其5’端的部分序列作为5’端茎杆区，3’端的部分序列作为5’端茎杆区，5’端茎杆区通过碱基互补配对与3’端茎杆区结合，形成可结合荧光染料的茎结构区，茎结构区的长度为2bp，5’端茎杆区从5’端至3’端的碱基序列为CC，5’端茎杆区与3’端茎杆区之间具有10nt长的环结构区，环结构区的任意位置的碱基为A；另外，3’端茎杆区的3’端具有荧光淬灭基因BHQ。
本实施例提供的单链DNA核酸分子的线性化的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体序列见表1。
实施例2-7
实施例2-7所提供的增强核酸扩增反应的增强剂与实施例1基本相同，不同之处在于茎结构区的长度和序列不同，以及环结构区的长度不同，具体序列见表1。
对比例1
对比例1所提供的增强核酸扩增反应的增强剂与实施例1基本相同，不同之处在于茎结构区的长度和序列不同，以及环结构区的长度不同，具体序列见表1。
对比例2
对比例2所提供的增强核酸扩增反应的增强剂与实施例4基本相同，不同之处在于其淬灭基团被C3spacer代替，具体序列见表1。
对比例3
对比例3所提供的增强核酸扩增反应的增强剂与实施例1基本相同，不同之处在于不具有茎结构区，具体序列见表1。
表1本发明实施例、对比例以及实验例所涉及的核酸序列
表中，下划线代表茎杆区序列。
其中，实施例1-7提供的增强核酸扩增反应的增强剂的各自具体名称见表1中名称。本发明实施例1-7所提供的增强剂起到减少高浓度荧光染料抑制作用的机理见图1。如图1所示，这些增强剂是一段具有发夹结构的核酸序列，其3’端带有一个淬灭基团。发夹结构的茎结构区是一段双链DNA，可以结合核酸荧光染料，充当临时的荧光核酸染料储蓄池，而淬灭基团的存在使得这些荧光染料不发光。随着扩增反应进行，荧光染料会跳到双链DNA更长的扩增产物上，并发出高强度荧光。通过一系列实验，我们证实了实施例1-7的增强剂对核酸扩增反应的增强功效，其不仅能减小高浓度核酸染料对扩增反应的抑制，还能增强微流控芯片上的核酸扩增反应。
实验例1
(1)材料：
核酸模板为人氨基已糖苷酶A(human hexosaminidase A)基因G269等位子中一段长度为311bp的序列，如下：
5’-CGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCCGGGGTATCCGTGTGCTTGCAGAGTTTGACACTCCTGGCCACACTTTGTCCTGGGGACCAGGTAAGAATGATGTCTGGGACCAGAGGGACTCTGCTTGTTATGCTCAGAGTGAAGC TTCAGGGCACTGGCTCATGGAAGTGGCATATCCCAGCTTGGTCCTTAGAAGAATGTTTTCCATCGACTTCTTCCACCTGGGAATTTAGATAGGAAGAACTCACTTTGGACAATGGAGGCTGCTTCTTACTATTAAAATATGTACTGTTAGACTATGTAAGGGCACAGCGC-3’。
下划线为目标扩增区域，PCR目标扩增产物为长度为94bp的双链DNA。
扩增该基因的序列所用引物如下：
上游引物序列：5’GAATGATGTCTGGGACCAGA3’；
下游引物序列：5’GACCAAGCTGGGATATGCC3’。
所有核酸片段皆由生工(上海)合成。
表1中各种增强剂与目标产物的长度比值如表2所示：
表2
名称 茎结构区长度/bp 目标扩增产物长度/bp 长度比值
A2Q 2 94 2.1:100
A4Q 4 94 4.3:100
A6Q 6 94 6.4:100
A8Q 8 94 8.5:100
A10Q 10 94 10.6:100
A15Q 15 94 16:100
A20Q 20 94 20:100
(2)方法：
(a)实时荧光PCR(off-chip PCR)
本实验中实时荧光核酸扩增反应液体积为10μL，包含1×PCR缓冲液(Invitrogen,USA)、3mM MgCl2(Invitrogen,USA)、200nM dNTP(Invitrogen,USA)、200nM上游引物和200nM下游引物、0.04μL PlatinumTM Taq DNA聚合酶(Invitrogen,USA)。对于阳性样本，反应液中加入了1×106个拷贝的模板，而阴性样本反应液中加入超纯水来代替模板。根据实验设计，反应液还包含了不同浓度的SGI(购自Invitrogen，为10000X concentrate inDMSO，货号S7563)或EvaGreen(购自Biotium，为2000X in DMSO，货号#31019)、SytoxGreen。除非特别说明，增强剂的浓度为500nM。Off-chip反应在Biorad CFX96实时荧光PCR仪上进行，扩增程序为：2min 95℃热启动，95℃ 5s、58℃ 15s、50个循环，随后的熔解曲线分析程序为：35℃至95℃，间隔1℃，每个温度停留2s。每个off-chip核酸扩增反应都做三个平行样。
(b)基于微流控芯片的核酸扩增反应(on-chip PCR)
将实时荧光PCR所用反应液取1.1μL加到数字微流控芯片上，用于on-chip核酸扩增反应。芯片上的液滴被2cSt的硅油包围。反应前，将芯片置于荧光显微镜之下，采集GFP通道的荧光。随后芯片被放置于AmpliSpeed平面温度循环仪上，进行扩增所需的温度循环。扩增结束后，待芯片冷却至常温后，再次于荧光显微镜下采集GFP通道的荧光。On-chip核酸扩增反应每次同时做三个平行样。
对于早期的少数几次实验，扩增结束后将液滴从芯片上取出，用于琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。琼脂糖凝胶浓度为3％，作为对照的分子标记为25bp至766bp的小分子量DNA标记。
数字微流控芯片的制备及操作
本实验中所用的数字微流控芯片如图2中B及2中C所示。大小为2mm×2mm的铬电极排列在玻璃底板上，在电极之上通过光刻技术涂布一层厚度约10μm的SU-8 3010作为介电层。另一层厚度为50-60μm的SU-8 3050同样通过光刻技术涂布于介电层之上，作为防止液滴漂移的“栅栏”。顶板同样为玻璃，其中一面镀有ITO作为接地电极。底板和顶板都经过Teflon疏水处理后，利用厚度为300μm的双面胶将上下两部分组装在一起，其中顶板有ITO的一面朝下。装载和移动液滴时，用于驱动电极的电信号为90-100Vrms、1kHz的正弦波。
On-chip PCR的数据处理及结果鉴定
对于on-chip核酸扩增反应，扩增前后的荧光数据皆通过荧光显微镜及配套软件在室温采集。通过将每个液滴的平均荧光强度减去周围至少3个点的背景荧光，得到对应样本的荧光数据。扩增前后的荧光强度分别记“F前”和“F后”。由于不同样本受多因素影响会导致扩增前荧光强度“F前”不一致，为了便于比较不同样本的on-chip PCR扩增结果，我们将每次扩增反应的荧光强度变化通过(F后-F前)/F前×100％计算得出，以此将数据做归一化处理。
(3)结果
(a)实施例1-7的增强剂通过减少高浓度核酸染料对扩增反应的抑制来增强PCR
如图2中A所示，高浓度的SGI会抑制PCR。与常用的0.4×SGI相比，SGI浓度提高至0.8×时Cq值有3个循环的延迟。继续提高SGI浓度至1.2×直接导致扩增失败。
但本发明实施例提供的增强剂使得这种高浓度核酸染料导致的抑制效应被大大降低。对于反应液中包含上述增强剂的样本，0.8×SGI不再抑制扩增反应，1.2×SGI虽然仍有Cq值的延迟，但扩增成功。上述增强剂这方面的作用归功于其结构。当溶液中存在较高浓度的核酸染料分子时，上述增强剂的双链茎结构能够临时存储染料分子，避免大量染料游离于溶液中干扰扩增过程。而随着扩增进行，较长的双链DNA核酸产物诞生，由于较长的双链DNA对核酸染料更具亲和力，临时存储于上述增强剂的染料分子主动转移至扩增产物上，并释放高强度荧光。通过这种临时存储、按需释放的机理，上述增强剂能在不影响核酸染料作为PCR指示剂的功能的前提下，减少高浓度核酸染料对扩增的抑制。
除此之外，上述增强剂还能提高扩增达到饱和时的荧光强度。如图2中A所示，当SGI浓度为0.4×时，上述增强剂的存在不改变Cq值，但相比不含上述增强剂的样本，含有上述增强剂的样本在扩增平台期的荧光强度略高。这是因为淬灭基团的存在，使得结合到上述增强剂茎结构上的染料分子的荧光强度低于游离的染料分子(见图2中E)，含有上述增强剂的样本在PCR前期其荧光强度低于不含上述增强剂的样本，因此在对扩增曲线进行了基线校正之后，含有上述增强剂的样本拥有更高的饱和荧光值。
图2中A的结果还显示，由于上述增强剂的存在使SGI可以在更高浓度下使用，扩增末期的荧光强度提高了数倍，这赋予SGI应用于高分辨率熔解曲线(high-resolutionmelting,HRM)分析法的潜力。
(b)实施例1-7上述增强剂能够增强on-chip PCR的荧光强度变化，消除芯片上的假阴性扩增结果
如图2中D所示，当SGI应用于数字微流控芯片上时，其作为指示剂的效用被大大削弱。在常用的0.4×SGI浓度下，即便扩增成功(如图2中F所示)，SGI的荧光强度也没有增加，导致芯片上的假阴性结果。虽然提高SGI浓度能使其扩增后的荧光值得到一定程度的增强，消除假阴性，但其荧光强度的增加依然不到100％。这种核酸染料在芯片上荧光强度受削弱的现象可能由多种因素导致，比如染料分子渗入周围的油环境中，或者被芯片表面所吸附等等。
不管是什么原因导致了SGI在数字微流控芯片上失灵，上述增强剂能够解决这种核酸染料和微流控芯片的不相容性，重建SGI作为PCR指示剂在芯片上的应用。如图2中D所示，在样本中加入上述增强剂后，核酸染料在扩增后的荧光由降低变成增加150％(0.4×SGI)～200％(0.8×～1.6×SGI)。图2中E更直观的显示了含有上述增强剂的阳性样本在芯片上扩增后成功亮起。与在off-chipPCR中的作用机理相同，上述增强剂对于on-chip PCR的这种增强作用出自于其特殊结构，以及其临时存储、按需释放的机制。然而不同的是，减少抑制作用时上述增强剂吸附游离的染料分子是为了防止其干扰PCR进程，而在on-chipPCR中，上述增强剂吸附染料分子是为了给它们提供保护，防止其受损而影响作为指示剂的功能。
此外，上述增强剂还能降低样本在扩增前的荧光强度，提高扩增前后的荧光对比度。如图2中E所示，含有上述增强剂的液滴在PCR前比不含上述增强剂的液滴更暗，使得其扩增前后荧光强度的变化更明显。
(c)上述增强剂的茎结构长度、浓度对增强PCR的功效
图3中A和B展示了不同茎长度的上述增强剂在off-chip PCR和on-chip PCR中的功效。
在off-chip PCR中，当茎长度为2bp～8bp时，扩增效率没有显著差异。当茎长度大于或等于10bp时，上述增强剂对扩增有抑制：A10Q导致Cq值延迟3个循环，A15Q导致Cq值延迟5个循环以上，而对比例1提供的A20Q直接使得扩增失败。另一方面，在on-chip PCR中，茎长度在2bp到15bp之间的上述增强剂都产生了增强on-chip PCR扩增信号的效果。其中，A8Q的增强效果最强：含有500nM A8Q的阳性样本在芯片上扩增后荧光信号增强了500％。这个结果与off-chip PCR较为一致：随着上述增强剂的茎长度增加，上述增强剂能够给溶液中游离的SGI分子提供更多结合位点，加强上述增强剂增强PCR的功能，茎长度为8bp时上述增强剂表现最好。对比例1提供的A20Q直接导致on-chip PCR扩增失败。此外，对比例3提供的A0Q在芯片上不能改善PCR扩增信号，证明上述增强剂的茎结构是其实现增强PCR功能的关键组成部分。因此，该实验充分说明将上述增强剂的茎结构长度限定在2bp到15bp之间，其中8bp的长度为最优。
随后，以A8Q作为模型，我们测试了不同浓度的A8Q在PCR中的表现。如图3中C所示，当A8Q浓度从100nM增加到900nM时，off-chip PCR的表现没有明显区别，Cq值的变化在1～2个循环以内。然而，在on-chip PCR中，上述增强剂浓度越高，扩增信号增强得越显著，在900nM A8Q时，扩增后SGI荧光信号的增加达到了800％。在芯片上，上述增强剂浓度在一定范围内越高，能提供给游离染料分子的结合位点越多，能给核酸染料提供越强的保护，于是对on-chip PCR的增强越显著。
(d)淬灭基团和环状结构对上述增强剂的影响
上述增强剂的结构主要由一个由茎和环构成的发夹结构，和一个3’端修饰的淬灭基团组成。图3中B的结果已经证实了茎结构对上述增强剂增强PCR功能的重要性。为了测试淬灭基团的功能，我们合成了对比例2的A4spacer。A4spacer的核酸序列与A4Q完全相同，不同的是A4spacer的3’端修饰了一个C3spacer来取代淬灭基团(见表1)。C3spacer的作用在于封闭3’端，防止非特异扩增。此外，为了测试环序列对上述增强剂的影响，我们还合成了一个结构与上述增强剂类似，但其5’端部带有荧光基团的序列，且其环序列与目标核酸序列互补。
如图4中的C和D所示，A4spacer既不能增强off-chip PCR，也无法增强on-chipPCR的扩增信号。另一方面，F-CRoA不管在off-chip PCR还是on-chip PCR中，都表现出与A4Q一致的增强PCR的效果。对于off-chip PCR，在0.8×SGI时，含有A4spacer的样本的Cq值相比0.4×SGI时延迟了5个循环，而含有A4Q或F-CRoA的样本则在较高浓度的SGI下依然没有抑制扩增。对于on-chip PCR，扩增后含有A4spacer的阳性样本没有亮起，而含有A4Q或F-CRoA的阳性样本都成功亮起，说明A4spacer无法增强芯片上PCR的扩增信号，而F-CRoA能够增强on-chip PCR扩增信号。据此，上述实验说明，上述增强剂的结构中，淬灭基团是一个关键组分，而环序列的特异性不影响上述增强剂的功能，其可以是任意的序列。
(e)上述增强剂能提高SGI在PCR中可使用的浓度上限
通过以上实验结果我们发现，在扩增成功的前提下，在PCR中使用的SGI浓度越高，终末荧光信号越强。为了探索SGI在PCR中使用浓度的上限，我们在不同的SGI浓度(0.8×～2.0×)下，进一步对上述增强剂的使用进行了优化，测试出每个SGI浓度下扩增效果最好时所需的A8Q浓度，并将其对应的扩增曲线汇总在图5中的A中。图5中A还包含0.2×SGI以及0.4×SGI时，不含上述增强剂的样本的扩增结果，作为对照组。通过这一系列实验，可以看出在PCR中使用浓度高达1.2×的SGI，并且不对扩增效率产生抑制，而其终末荧光强度为0.4×SGI时的3倍，为0.2×SGI时的8倍。增加SGI的浓度至1.6×和2.0×，虽无法避免对扩增的抑制，造成Cq值延迟，但其终末荧光强度仍进一步增加。因此，将上述增强剂引入核酸扩增反应液中，能将SGI可使用浓度的上限提升至2.0×，并成倍提升扩增信号的强度。
此外，我们将经off-chip PCR的较优反应条件应用于数字微流控芯片上，得到了对应的on-chip PCR扩增结果，图5中B所示。与0.2×SGI以及0.4×SGI、不含上述增强剂的对照组相比，含有不同浓度A8Q的样本在0.8×～2.0×SGI的条件下，其on-chip PCR扩增信号都得到增强。
(f)上述增强剂对其它核酸荧光染料的作用
上述实验证实了上述增强剂对基于SGI这种核酸染料的PCR系统的增强作用。为了验证上述增强剂对基于其它核酸染料的PCR系统的有效性，我们分别测试了在含有SytoxGreen、EvaGreen的PCR系统中，上述增强剂对off-chip PCR和on-chip PCR的增强效果。
如图6中A所示，Sytox Green在浓度大于或等于400nM时，表现出与SGI类似的、对扩增的抑制。而引入上述增强剂减少了这种抑制。此外，图6中B的on-chip PCR结果显示，上述增强剂能够增强on-chip PCR的Sytox信号，含有上述增强剂的样本的on-chip PCR扩增信号的变化强度是不含上述增强剂样本的两倍。
另一方面，由于EvaGreen在推荐使用的1×浓度下不对扩增产生抑制，我们测试了在更高浓度(3×～5×)的EvaGreen下，引入上述增强剂对扩增结果的影响。如图6中C所示，当样本中不含上述增强剂时，4×EvaGreen开始对扩增产生抑制，导致Cq值延迟超过10个循环，5×EvaGreen则导致扩增失败。而在反应液中引入上述增强剂后，4×EvaGreen对PCR的抑制减弱，Cq值延迟不到2个循环，5×EvaGreen时也扩增成功。在on-chip PCR中，引入上述增强剂也将扩增后EvaGreen荧光信号的变化放大了不止一倍。
以上实验结果充分说明，本发明实施例1-7提供的增强剂不仅对基于SGI的PCR系统有增强作用，对基于其它核酸染料的PCR系统同样有效。实施例1-7提供的增强剂是作为一种广谱的PCR增强剂，对off-chip PCR以及on-chip PCR的增强效果在上述实验例得以确认。
实验例2
验证本发明实施例的增强剂在环介导等温扩增反应(LAMP)中的作用
为测试本发明实施例的增强剂在PCR以外的其它核酸扩增反应系统中的有效性，我们在off-chip以布氏锥虫(Trypanosoma.brucei)的核酸为模板，进行了环介导等温扩增反应(LAMP)，测试了CRoA增强剂对该扩增反应的影响。
材料：
本实验所用的核酸模板为布氏锥虫的基因组DNA。
扩增该基因序列所用引物如下：
上游引物序列(FP)：5’CTGTCCGGTGATGTGGAAC3’；
上游引物序列(BP)：5’CGTGCCTTCGTGAGAGTTTC3’；
上游内部引物序列(FIP)：
5’GGAATACAGCAGATGGGGCGAGGCCAATTGGCATCTTTGGGA3’；
下游内部引物序列(BIP)：
5’AAGGGAGACTCTGCCACAGTCGTCAGCCATCACCGTAGAGC3’；
环上游引物序列(LFP)：5’GCCTCCCACCCTGGACTC3’；
环下游引物序列(LBP)：5’AGACCGATAGCATCTCAG3’。
方法：
本实验中实时荧光LAMP反应液体积为10μL，包含1×LAMP缓冲液(NEB,USA)、6mMMgCl2(Invitrogen,USA)、1.4mM dNTP(Invitrogen,USA)、400nM上游引物和400nM下游引物、1600nM上游内部引物和1600nM下游内部引物、800nM环上游引物和800nM环下游引物、16单位的Bst聚合酶(Invitrogen,USA)、不同浓度(0.4×、0.8×或1.2×)的SGI和A8Q(在0.4×SGI时，采用100nM A8Q；在0.8×SGI时，采用300nM A8Q；在1.2×SGI时，采用500nMA8Q。)。对于阳性样本，反应液中加入了1×105个拷贝的核酸模板，而阴性样本反应液中加入超纯水来代替模板。Off-chip反应在BioradCFX96实时荧光扩增仪上进行，在65℃进行60min，随后的熔解曲线分析程序为：35℃至95℃，间隔1℃，每个温度停留2s。每个off-chipLAMP反应都做三个平行样。
结果
如图7所示，在LAMP扩增系统中，高浓度的SGI同样对扩增产生抑制。与0.4×SGI相比，SGI浓度提高至0.8×时Cq值有3个循环的延迟；继续提高SGI浓度至1.2×时Cq值有近10个循环的延迟。
本发明实施例提供的增强剂的效果在LAMP这种核酸扩增系统中同样有效。当SGI浓度为0.4×时，不含CRoA(A8Q)的样本与含有CRoA的样本曲线基本一致；随着SGI浓度逐渐提高，反应液中CRoA的存在使得SGI对扩增反应的抑制几乎消失。0.8×SGI时，与0.4×SGI时相比Cq值几乎没有延迟；1.2×SGI时，与0.4×SGI时相比Cq值的延迟仅在2个循环以内，而同时扩增反应平台期的荧光强度可达0.4×SGI时的2倍以上。
综上，我们验证了本发明实施例提供的增强剂对off-chip PCR和on-chip PCR以及LAMP的增强作用。通过调节溶液中游离的染料分子的浓度，本发明实施例提供的增强剂能够减少高浓度染料对扩增效率的削弱。同时，在数字微流控芯片上，本发明实施例提供的增强剂作为染料分子的临时结合位点，能够避免核酸染料受损，从而增强on-chip PCR的扩增信号。此外，图2中F中的凝胶电泳结果预示着本发明实施例提供的增强剂可能还能够减少非特异性扩增产物、提高PCR特异性。由于高浓度SGI会使得引物和核酸模板的非特异结合变得稳定，那么引入本发明实施例提供的增强剂、减少溶液中的游离SGI分子，很可能会提高扩增特异性。研究人员也探索了多种针对核酸染料来增强PCR的方法。例如，Kong等人(Kong,J.E.,Wei,Q.,Tseng,D.,Zhang,J.,Pan,E.,Lewinski,M.,Garner,O.B.,Ozcan,A.and Di Carlo,D.(2017)Highly Stable and Sensitive Nucleic Acid Amplificationand Cell-Phone-Based Readout.ACS nano,11,2934-2943.)发现，HNB能够与EvaGreen相互作用，降低背景荧光的同时提高扩增效率。另外，Nath等人(Nath,K.,Sarosy,J.W.,Hahn,J.and Di Como,C.J.(2000)Effects of ethidium bromide and SYBR Green I ondifferent polymerase chain reaction systems.J Biochem Biophys Methods,42,15-29.)发现，氯化镁能够部分逆转EtBr和SGI对扩增的抑制效应。然而，这些PCR添加物的增强作用都受离子浓度影响，并且只能通过改变这些添加物的浓度来有限地调节其增强PCR的功效。与之不同的是，本发明实施例提供的增强剂的作用机理在于其双链茎结构对染料分子的吸引，不受离子浓度影响，其作用效果不仅能通过本发明实施例提供的增强剂的浓度来调节，还能通过微调本发明实施例提供的增强剂结构来灵活调节。
本发明实施例提供的增强剂除了能够增强off-chip PCR和on-chip PCR，还可增强LAMP，这些增强剂也有应用于其它方法如HRM中的潜力。由于高浓度荧光染料对PCR的抑制使得它只能在低浓度范围使用，以往荧光染料并不适合应用于HRM等需要高灵敏度信号的方法中。但本发明实施例提供的增强剂提高了荧光染料例如SGI可使用浓度的上限，使得SGI的信号强度和分辨率得以成倍增加，赋予了荧光染料应用于HRM的潜力。
本发明实施例提供的增强剂临时存储核酸染料分子，其在随着扩增进行的过程中，按需释放核酸染料分子的作用机理是一种简单但有效的增强核酸扩增反应的方法。通过在核酸扩增反应液中引入上述本发明实施例提供的增强剂，我们消除了双链DNA荧光染料的缺点，使得它们能够更好地应用于传统的PCR、off-chip PCR、基于微流控芯片的on-chip PCR和LAMP等核酸扩增反应当中。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 澳门大学
<120> 增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的方法
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccaaaaaaaa aagg 14
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgcaaaaaa aaaaaaaagc gg 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgctgaaaa aaaaaaaaaa cagcgg 26
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgctgcgaa aaaaaaaaaa aacgcagcgg 30
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccgctgcgcg aaaaaaaaaa aaaacgcgca gcgg 34
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgtgccgctg gtcgcaaaaa aaaaaaaaag cgaccagcgg cacg 44
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccggactctg cttgttatgc cgg 23

Claims (16)

1.一种增强核酸扩增反应的增强剂，其特征在于，其适用于含有荧光染料的核酸扩增反应，所述荧光染料能与所述核酸扩增反应的双链扩增产物结合；
所述增强剂具有结合所述荧光染料的结构域和淬灭基团，所述淬灭基团用于淬灭所述结构域所结合的荧光染料所发射的荧光，所述结构域与所述荧光染料结合的亲和力低于所述核酸扩增反应的目标扩增产物与所述荧光染料结合的亲和力。
2.根据权利要求1所述的增强剂，其特征在于，所述增强剂为DNA核酸分子，所述DNA核酸分子具有通过碱基互补配对原则结合的双链结构区，与所述荧光染料结合的所述结构域为所述双链结构区；所述淬灭基团位于所述双链结构区的5’端或3’端；
优选地，所述DNA核酸分子为单链DNA核酸分子，所述单链DNA核酸分子具有至少一个茎结构区；所述茎结构区由5’端茎杆区和3’端茎杆区通过碱基互补配对结合构成；所述双链结构区为所述茎结构区；所述淬灭基团位于所述5’端茎杆区的5’端或所述3’端茎杆区的3’端。
3.根据权利要求2所述的增强剂，其特征在于，所述茎结构区的长度短于所述扩增产物的长度；
优选地，所述茎结构区的长度与所述目标扩增产物的长度的比值为2-16:100；
优选地，所述茎结构区的长度与所述目标扩增产物的长度的比值为2-9:100或10-16:100；
优选地，所述茎结构区的长度与所述目标扩增产物的长度的比值为8.5:100。
4.根据权利要求2所述的增强剂，其特征在于，所述茎结构区的长度2-20bp；
优选地，所述茎结构区的长度为2-8bp或10-15bp；
优选地，所述茎结构区的长度为8bp；
优选地，所述扩增产物的长度为50-1000bp。
5.根据权利要求2-4任一项所述的增强剂，其特征在于，所述茎结构区的所述5’端茎杆区的碱基序列从5’端至3’端为CC、CCGC、CCGCTG、CCGCTGCG、CCGCTGCGCG或CGTGCCGCTGGTCGC。
6.根据权利要求5所述的增强剂，其特征在于，所述单链DNA核酸分子还具有环结构区；
所述环结构区的长度为10-14nt；
优选地，所述环结构区的任意位置的碱基选自A、T、C和G中的任意一种；
优选地，所述环结构区的任意位置的碱基为A。
7.根据权利要求6所述的增强剂，其特征在于，所述单链DNA核酸分子的线性化的碱基序列如SEQ ID NO.1-7中任意一种所示。
8.根据权利要求2-4任一项所述的增强剂，其特征在于，所述荧光染料选自SYBR GreenI、EvaGreen、Sytox Green、EtBr、SYBR Green II、SYBR Gold、SYBR Safe、LC Green、GelGreen、GelRed、DAPI、Syto 9、Sytox Blue、Sytox Red、Sytox Orange和ThiazoleOrange中任意一种；
优选地，所述淬灭基团为能够通过FRET机制吸收所述荧光染料发射荧光的基团；
优选地，所述淬灭基团选自BHQ、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl和TAMRA中任意一种。
9.根据权利要求1所述的增强剂，其特征在于，所述核酸扩增反应选自链式聚合酶反应和等温扩增反应的任意一种。
10.一种核酸扩增反应液，其特征在于，其含有权利要求1-9中任一项所述的增强剂。
11.一种可进行核酸扩增反应的数字微流控芯片，其特征在于，其装载有权利要求10所述的核酸扩增反应液或具有装载所述核酸扩增反应液的结构。
12.一种核酸扩增反应试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-9中任一项所述的增强核酸扩增反应的增强剂或权利要求10所述的核酸扩增反应液。
13.一种进行核酸扩增反应的方法，其特征在于，其包括：在核酸扩增反应体系中加入权利要求1-9中任一项所述的增强核酸扩增反应的增强剂或权利要求10所述的核酸扩增反应液。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增反应体系中的所述增强剂的浓度为50-2000nM，优选为100-900nM。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增反应体系中含有荧光染料，所述荧光染料选自SYBR Green I、EvaGreen、Sytox Green、EtBr、SYBR Green II、SYBRGold、SYBR Safe、LC Green、GelGreen、GelRed、DAPI、Syto 9、Sytox Blue、Sytox Red、Sytox Orange和Thiazole Orange中任意一种；
优选地，所述淬灭基团选自BHQ、BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl和TAMRA中任意一种。
16.根据权利要求13-15任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸扩增反应选自链式聚合酶反应和等温扩增反应中的任意一种；
优选地，所述链式聚合酶反应为实时荧光链式聚合酶反应、基于微流控芯片的链式聚合酶反应、或者高分辨率熔解曲线分析。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111426661A (zh) * 2020-04-09 2020-07-17 基蛋生物科技股份有限公司 一种核酸扩增阶段的荧光数据采集及判别方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101321877A (zh) * 2005-10-03 2008-12-10 阿普里拉股份有限公司 用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒
WO2017201060A1 (en) * 2016-05-17 2017-11-23 The Regents Of The University Of California Enhanced fluorescence readout and reduced inhibition for nucleic acid amplification tests
EP3385396A1 (en) * 2015-12-01 2018-10-10 SD Biosensor Inc. Reporter dye for isothermal nucleic acid amplification, isothermal-based dual functional oligonucleotide containing quencher, and method for nucleic acid amplification and measurement using same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101321877A (zh) * 2005-10-03 2008-12-10 阿普里拉股份有限公司 用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒
EP3385396A1 (en) * 2015-12-01 2018-10-10 SD Biosensor Inc. Reporter dye for isothermal nucleic acid amplification, isothermal-based dual functional oligonucleotide containing quencher, and method for nucleic acid amplification and measurement using same
WO2017201060A1 (en) * 2016-05-17 2017-11-23 The Regents Of The University Of California Enhanced fluorescence readout and reduced inhibition for nucleic acid amplification tests

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGSHAN XIANG等: "Highly sensitive fluorescence quantitative detection of specific DNA sequences with molecular beacons and nucleic acid dye SYBR Green I", 《TALANTA》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111426661A (zh) * 2020-04-09 2020-07-17 基蛋生物科技股份有限公司 一种核酸扩增阶段的荧光数据采集及判别方法
CN111426661B (zh) * 2020-04-09 2022-10-18 基蛋生物科技股份有限公司 一种核酸扩增阶段的荧光数据采集及判别方法

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