JP2003534812A - 制限プライマー伸長によるヌクレオチド配列変異の検出 - Google Patents
制限プライマー伸長によるヌクレオチド配列変異の検出Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、例えば点突然変異および単一ヌクレオチド多形を含む、関心のある標的核酸における変異部位のヌクレオチドの素性を決定するための方法及びキットを提供する。これらの方法は、変異部位を潜在的に占めるヌクレオチドに相補的であるように選択される少なくとも1の標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1の標識非伸長性ヌクレオチドを含むヌクレオチド混合物の存在下でテンプレート依存性伸長反応を行うことを含む。伸長産生物に取り込まれる標識ヌクレオチドは変位部位のヌクレオチドに特徴的である。点突然変異および単一ヌクレオチド多形の分析におけるそれらの有用性に加えて、本発明の方法及びキットには、例えば父子鑑定論争、出生前試験、法医学的分析および病原体の検出を含む、特定のヌクレオチド配列情報に価値がある様々な他の用途における有用性がある。
Description
【０００１】関連出願の相互参照
本願は、2000年6月2日出願の米国出願09／586,125号（これは、すべての目的
のためにその全体が本明細書に組み込まれる）の一部継続出願である。
のためにその全体が本明細書に組み込まれる）の一部継続出願である。
【０００２】発明の分野
本発明は、特定のヌクレオチド配列の同定及び検出を含む分子遺伝学の分野に
関する。
関する。
【０００３】発明の背景
生物のゲノムを含む核酸はその生物の遺伝情報を含む。これらの核酸の翻訳ま
たは発現は、その生物内で多様な方法で機能するタンパク質を生じる。一塩基対
置換を含むヌクレオチド配列の微小な変化でさえタンパク質の品質または量にお
いて有意の効果を有し得る。単一のヌクレオチドの変化は単一ヌクレオチド多型
または単にSNPと呼ばれ、SNPが生じる部位は典型的には多型部位と呼ばれる。
たは発現は、その生物内で多様な方法で機能するタンパク質を生じる。一塩基対
置換を含むヌクレオチド配列の微小な変化でさえタンパク質の品質または量にお
いて有意の効果を有し得る。単一のヌクレオチドの変化は単一ヌクレオチド多型
または単にSNPと呼ばれ、SNPが生じる部位は典型的には多型部位と呼ばれる。
【０００４】
多くのSNPは、より多くの核酸の変化と同様に、生物の表現型に影響を及ぼす
ことができ、幾つかの場合には疾患の発症を生じる。例えば、SNPに関連する疾
患には、鎌状赤血球貧血、β−地中海貧血症、糖尿病、嚢胞性線維症、高リポタ
ンパク血症、様々な自己免疫疾患、および癌遺伝子の形成が含まれる。疾患状態
の発生またはそれに対する影響に加えて、点突然変異は病原性の変更と特定の微
生物を標的とする治療に対する耐性を生じ得る。
ことができ、幾つかの場合には疾患の発症を生じる。例えば、SNPに関連する疾
患には、鎌状赤血球貧血、β−地中海貧血症、糖尿病、嚢胞性線維症、高リポタ
ンパク血症、様々な自己免疫疾患、および癌遺伝子の形成が含まれる。疾患状態
の発生またはそれに対する影響に加えて、点突然変異は病原性の変更と特定の微
生物を標的とする治療に対する耐性を生じ得る。
【０００５】
DNA配列における特定のヌクレオチド変化または突然変異を検出する能力は幾
つかの医学的および非医学的有用性を有する。例えば、ヌクレオチド変化を同定
することが可能な方法は、SNPに関連する多くの一般的な疾患をスクリーニング
および診断するための手段を提供する。そのような変化または突然変異を迅速に
同定することが可能な方法は、予防的処置の実施、疾患の傾向の評価、並びに患
者のカウンセリングおよび教育においても価値がある。非医学的用途に関しては
、そのような方法は微生物の検出、父子鑑定論争の解決および犯罪の加害者を同
定する法医学的分析において価値がある。
つかの医学的および非医学的有用性を有する。例えば、ヌクレオチド変化を同定
することが可能な方法は、SNPに関連する多くの一般的な疾患をスクリーニング
および診断するための手段を提供する。そのような変化または突然変異を迅速に
同定することが可能な方法は、予防的処置の実施、疾患の傾向の評価、並びに患
者のカウンセリングおよび教育においても価値がある。非医学的用途に関しては
、そのような方法は微生物の検出、父子鑑定論争の解決および犯罪の加害者を同
定する法医学的分析において価値がある。
【０００６】
変異部位の配列情報を得るために様々な方法が開発されている。そのような方
法には、標的核酸と対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブとの
ハイブリダイゼーション反応（例えば、欧州特許公開EP−237362およびEP−3293
11を参照）、対立遺伝子特異的増幅（例えば、米国特許第5,521,301号；第5,639
,611号；および第5,981,176号）、ミニ配列決定法、定量的RT−PCR法（例えば、
いわゆる「TaqManアッセイ」；例えば、Gelfandの米国特許第5,210,015号、Liva
kらの第5,538,848号、およびHaalandの第5,863,736号に加えて、Heid, C.A., et
al., Genome Research, 6:986-994 (1996)；Gibson, U.E.M, et al., Genome R
esearch 6:995-1001 (1996)；Holland, P. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 88:7276-7280, (1991)；およびLivak, K.J., et al., PCR Methods and A
pplication 357-362 (1995)を参照）、並びに様々な一塩基対伸長（SBPE）およ
び関連伸長アッセイが含まれる。
法には、標的核酸と対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブとの
ハイブリダイゼーション反応（例えば、欧州特許公開EP−237362およびEP−3293
11を参照）、対立遺伝子特異的増幅（例えば、米国特許第5,521,301号；第5,639
,611号；および第5,981,176号）、ミニ配列決定法、定量的RT−PCR法（例えば、
いわゆる「TaqManアッセイ」；例えば、Gelfandの米国特許第5,210,015号、Liva
kらの第5,538,848号、およびHaalandの第5,863,736号に加えて、Heid, C.A., et
al., Genome Research, 6:986-994 (1996)；Gibson, U.E.M, et al., Genome R
esearch 6:995-1001 (1996)；Holland, P. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 88:7276-7280, (1991)；およびLivak, K.J., et al., PCR Methods and A
pplication 357-362 (1995)を参照）、並びに様々な一塩基対伸長（SBPE）およ
び関連伸長アッセイが含まれる。
【０００７】
伸長アッセイは、典型的には、標的核酸に相補的であるプライマーを、そのプ
ライマーの3’末端が変異部位のすぐ5’側となるか、またはそれらに隣接するよ
うにハイブリダイズさせることを含む。伸長は、変異部位を占めるヌクレオチド
（1つもしくは複数）に相補的である1以上の標識非伸長性ヌクレオチドおよびポ
リメラーゼの存在下で行う。この非伸長性ヌクレオチドは、ひとたびプライマー
に組み込まれるとポリメラーゼによるさらなる伸長を阻止するヌクレオチド類似
体である。追加された非伸長性ヌクレオチド（1つもしくは複数）が変位部位の
ヌクレオチドに相補的である場合、標識非伸長性ヌクレオチドはプライマーの3
’末端に組み込まれ、標識伸長産生物を産生する。したがって、伸長したプライ
マーはどのヌクレオチドが標的核酸の変位部位に存在するのかの指標を提供する
。このような方法は、例えば、米国特許第5,846,710号；第6,004,744号；第5,88
8,819号；第5,856,092号；第5,710,028号；および第6,013,431号；並びにPCT公
開WO 92／16657において考察されており、これらの各々は参照することにより組
み込まれる。
ライマーの3’末端が変異部位のすぐ5’側となるか、またはそれらに隣接するよ
うにハイブリダイズさせることを含む。伸長は、変異部位を占めるヌクレオチド
（1つもしくは複数）に相補的である1以上の標識非伸長性ヌクレオチドおよびポ
リメラーゼの存在下で行う。この非伸長性ヌクレオチドは、ひとたびプライマー
に組み込まれるとポリメラーゼによるさらなる伸長を阻止するヌクレオチド類似
体である。追加された非伸長性ヌクレオチド（1つもしくは複数）が変位部位の
ヌクレオチドに相補的である場合、標識非伸長性ヌクレオチドはプライマーの3
’末端に組み込まれ、標識伸長産生物を産生する。したがって、伸長したプライ
マーはどのヌクレオチドが標的核酸の変位部位に存在するのかの指標を提供する
。このような方法は、例えば、米国特許第5,846,710号；第6,004,744号；第5,88
8,819号；第5,856,092号；第5,710,028号；および第6,013,431号；並びにPCT公
開WO 92／16657において考察されており、これらの各々は参照することにより組
み込まれる。
【０００８】
特定のSBPE伸長反応は様々な欠点を被る。幾つかの方法は、標的核酸の2つ以
上の対立遺伝子形態の1つのみについて標識伸長産生物を産生する。これは、失
敗した実験を試料が標的核酸の特定の対立遺伝子形態を含まない状況と確信を持
って区別することができないため、問題となり得る。しばしば、これらの伸長法
は、標的核酸の異なる対立遺伝子形態について同じサイズの伸長産生物も産生す
る。したがって、異なる対立遺伝子は、たびたび、標的核酸の異なる対立遺伝子
形態から産生した伸長産生物がいかに標識されるかに基づいてのみ区別される（
例えば、異なる伸長産生物が異なる標識を担持するか、または一方の伸長産生物
が標識されるのに対して他方の伸長産生物が無標識である）。これは、異なる対
立遺伝子形態を1つの基準だけで区別できることを意味する。
上の対立遺伝子形態の1つのみについて標識伸長産生物を産生する。これは、失
敗した実験を試料が標的核酸の特定の対立遺伝子形態を含まない状況と確信を持
って区別することができないため、問題となり得る。しばしば、これらの伸長法
は、標的核酸の異なる対立遺伝子形態について同じサイズの伸長産生物も産生す
る。したがって、異なる対立遺伝子は、たびたび、標的核酸の異なる対立遺伝子
形態から産生した伸長産生物がいかに標識されるかに基づいてのみ区別される（
例えば、異なる伸長産生物が異なる標識を担持するか、または一方の伸長産生物
が標識されるのに対して他方の伸長産生物が無標識である）。これは、異なる対
立遺伝子形態を1つの基準だけで区別できることを意味する。
【０００９】発明の要約
本発明は、関心のある標的核酸の変異部位に存在するヌクレオチドを検出およ
び同定するための方法及びキットを提供する。これらの方法及びキットは研究、
臨床および研究室という背景において利用することができる。一般には、これら
の方法は、標識伸長性及び標識非伸長性ヌクレオチドの混合物の存在下で伸長反
応を行うことを含む。標識ヌクレオチドの取り込みの検出は、取り込まれたヌク
レオチドが変位部位のヌクレオチドに相補的であることから、変位部位のヌクレ
オチドの素性の指標を提供する。これらの方法はジェノタイピング分析の実施に
おいて用いることができ、かつ多重化形式で行うことができる。これらの方法及
びキットは、例えば、点突然変異および単一ヌクレオチド多形の分析、病原体の
検出、父子鑑定論争、出生前試験並びに法医学的調査を含む多様な用途において
有用性を有する。
び同定するための方法及びキットを提供する。これらの方法及びキットは研究、
臨床および研究室という背景において利用することができる。一般には、これら
の方法は、標識伸長性及び標識非伸長性ヌクレオチドの混合物の存在下で伸長反
応を行うことを含む。標識ヌクレオチドの取り込みの検出は、取り込まれたヌク
レオチドが変位部位のヌクレオチドに相補的であることから、変位部位のヌクレ
オチドの素性の指標を提供する。これらの方法はジェノタイピング分析の実施に
おいて用いることができ、かつ多重化形式で行うことができる。これらの方法及
びキットは、例えば、点突然変異および単一ヌクレオチド多形の分析、病原体の
検出、父子鑑定論争、出生前試験並びに法医学的調査を含む多様な用途において
有用性を有する。
【００１０】
本発明の特定の方法は標的核酸の変位部位を分析する方法であり、かつテンプ
レート依存性伸長反応を実施することを含み、この反応は標的核酸、並びに少な
くとも1つの標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1つの標識非伸長性ヌクレ
オチドを含む標識ヌクレオチドの混合物の存在下でプライマーを伸長させること
を含み、ヌクレオチドの各々は標的核酸の異なる対立遺伝子形態に相補的である
。プライマーは標的核酸の1セグメントに、そのプライマーの3’末端が標的核酸
の変異部位に隣接してハイブリダイズするようにハイブリダイズする。標識伸長
性ヌクレオチドが変異部位を占めるヌクレオチドに相補的である場合、プライマ
ーはその標識伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長する。これに対し
て、標識非伸長性ヌクレオチドが変異部位を占めるヌクレオチドに相補的である
場合、プライマーはその標識非伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長
する。次に、伸長したプライマーへの標識ヌクレオチドの取り込みを検出し、プ
ライマーに取り込まれた標識ヌクレオチドの素性が変異部位のヌクレオチドの素
性を示す。幾つかの場合には、変位部位は二重対立遺伝子（bi-allelic）部位で
あり、混合物は1つの標識伸長性ヌクレオチドおよび1つの標識非伸長性ヌクレオ
チド、例えば、ジデオキシヌクレオチドまたはアラビノシド三リン酸を含む。
レート依存性伸長反応を実施することを含み、この反応は標的核酸、並びに少な
くとも1つの標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1つの標識非伸長性ヌクレ
オチドを含む標識ヌクレオチドの混合物の存在下でプライマーを伸長させること
を含み、ヌクレオチドの各々は標的核酸の異なる対立遺伝子形態に相補的である
。プライマーは標的核酸の1セグメントに、そのプライマーの3’末端が標的核酸
の変異部位に隣接してハイブリダイズするようにハイブリダイズする。標識伸長
性ヌクレオチドが変異部位を占めるヌクレオチドに相補的である場合、プライマ
ーはその標識伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長する。これに対し
て、標識非伸長性ヌクレオチドが変異部位を占めるヌクレオチドに相補的である
場合、プライマーはその標識非伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長
する。次に、伸長したプライマーへの標識ヌクレオチドの取り込みを検出し、プ
ライマーに取り込まれた標識ヌクレオチドの素性が変異部位のヌクレオチドの素
性を示す。幾つかの場合には、変位部位は二重対立遺伝子（bi-allelic）部位で
あり、混合物は1つの標識伸長性ヌクレオチドおよび1つの標識非伸長性ヌクレオ
チド、例えば、ジデオキシヌクレオチドまたはアラビノシド三リン酸を含む。
【００１１】
本発明は、さらに、複数の変位部位を同時に分析する多重化方法を提供する。
これらの方法の特定のものは、複数のテンプレート依存性伸長反応を複数の異な
るプライマーの存在下で実施することを含み、ここで、異なるプライマーは1以
上の標的核酸の異なる変異部位に隣接してハイブリダイズし、かつ差別的に標識
される。各々の伸長反応は標的核酸を含む試料を異なるプライマーのうちの1つ
の複数コピーと接触させることを含み、ここで、プライマーは標識を担持し、か
つプライマーの3’末端は標的核酸のうちの1つの変異部位に隣接はするがそれを
含まずにハイブリダイズする。次に、これらのプライマーのコピーを、少なくと
も1つの標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1つの標識非伸長性ヌクレオチ
ドを含むヌクレオチドの混合物に、標識伸長性ヌクレオチドが変位部位を占める
ヌクレオチドに相補的である場合にはプライマーの少なくとも1つのコピーが標
識伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長し、これに対して標識非伸長
性ヌクレオチドが変異部位を占めるヌクレオチドに相補的である場合にはプライ
マーの少なくとも1つのコピーが標識非伸長性ヌクレオチドを取り込むことによ
って伸長する条件下で露出する。集合的には、これらの伸長反応は複数の異なる
伸長産生物を産生し、異なる変異部位から産生される伸長産生物は伸長したプラ
イマーが担持する異なる標識に基づいて区別することができる。標識ヌクレオチ
ドの伸長産生物への取り込みは、標的核酸中の変異部位を占めるヌクレオチドの
指標として検出される。
これらの方法の特定のものは、複数のテンプレート依存性伸長反応を複数の異な
るプライマーの存在下で実施することを含み、ここで、異なるプライマーは1以
上の標的核酸の異なる変異部位に隣接してハイブリダイズし、かつ差別的に標識
される。各々の伸長反応は標的核酸を含む試料を異なるプライマーのうちの1つ
の複数コピーと接触させることを含み、ここで、プライマーは標識を担持し、か
つプライマーの3’末端は標的核酸のうちの1つの変異部位に隣接はするがそれを
含まずにハイブリダイズする。次に、これらのプライマーのコピーを、少なくと
も1つの標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1つの標識非伸長性ヌクレオチ
ドを含むヌクレオチドの混合物に、標識伸長性ヌクレオチドが変位部位を占める
ヌクレオチドに相補的である場合にはプライマーの少なくとも1つのコピーが標
識伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長し、これに対して標識非伸長
性ヌクレオチドが変異部位を占めるヌクレオチドに相補的である場合にはプライ
マーの少なくとも1つのコピーが標識非伸長性ヌクレオチドを取り込むことによ
って伸長する条件下で露出する。集合的には、これらの伸長反応は複数の異なる
伸長産生物を産生し、異なる変異部位から産生される伸長産生物は伸長したプラ
イマーが担持する異なる標識に基づいて区別することができる。標識ヌクレオチ
ドの伸長産生物への取り込みは、標的核酸中の変異部位を占めるヌクレオチドの
指標として検出される。
【００１２】
本発明の特定の方法を実施するためのキットも本発明によって提供される。幾
つかのキットは少なくとも1つの標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1つの
標識非伸長性ヌクレオチドを含むヌクレオチドの混合物を含み、これらのヌクレ
オチドは標的核酸の異なる対立遺伝子形態に相補的である。少なくとも1つのプ
ライマーも含まれ、各々のプライマーは標的核酸の1セグメントに、そのプライ
マーの3’末端が標的核酸の変異部位に隣接するようにハイブリダイズする。幾
つかの場合には、これらのプライマーおよび標識ヌクレオチドは、特定の疾患に
相関するSNPと共に用いるために選択される。
つかのキットは少なくとも1つの標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1つの
標識非伸長性ヌクレオチドを含むヌクレオチドの混合物を含み、これらのヌクレ
オチドは標的核酸の異なる対立遺伝子形態に相補的である。少なくとも1つのプ
ライマーも含まれ、各々のプライマーは標的核酸の1セグメントに、そのプライ
マーの3’末端が標的核酸の変異部位に隣接するようにハイブリダイズする。幾
つかの場合には、これらのプライマーおよび標識ヌクレオチドは、特定の疾患に
相関するSNPと共に用いるために選択される。
【００１３】詳細な説明
Ｉ．定義
「核酸」は一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌ
クレオチドポリマーであり、これには、他に指示されない限り、天然ヌクレオチ
ドの既知類似体が含まれる。
クレオチドポリマーであり、これには、他に指示されない限り、天然ヌクレオチ
ドの既知類似体が含まれる。
【００１４】
「ポリヌクレオチド」はデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩
基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。
基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。
【００１５】
「オリゴヌクレオチド」は、典型的には長さが2ないし約500塩基の範囲の、一
本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドはしばしば合成のものであるが、天然ポリ
ヌクレオチドから生成することもできる。オリゴヌクレオチドはあらゆる適切な
方法によって調製することができ、これには、例えば、適切な配列のクローン化
および制限並びにNarang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979)のホスホト
リエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979)のホスホジエ
ステル法；Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)のジエチ
ルホスホロアミダイト法；および米国特許第4,458,066号に記載される固体支持
法のような方法による直接化学合成が含まれる。
本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドはしばしば合成のものであるが、天然ポリ
ヌクレオチドから生成することもできる。オリゴヌクレオチドはあらゆる適切な
方法によって調製することができ、これには、例えば、適切な配列のクローン化
および制限並びにNarang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979)のホスホト
リエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979)のホスホジエ
ステル法；Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)のジエチ
ルホスホロアミダイト法；および米国特許第4,458,066号に記載される固体支持
法のような方法による直接化学合成が含まれる。
【００１６】
「プライマー」は、適切な条件下（すなわち、4種類の異なるヌクレオシド三
リン酸および重合用作用物質、例えば、DNAもしくはRNAポリメラーゼまたは逆転
写酵素の存在下）、適切なバッファ中および適切な温度で、テンプレート指向性
DNA合成の開始点として作用可能な一本鎖オリゴヌクレオチドである。プライマ
ーの適切な長さはそのプライマーの目的とする用途に依存するが、典型的には、
15ないし30ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、一般には、テン
プレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要
とする。プライマーはテンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、テン
プレートとハイブリダイズするのに十分な相補性でなければならない。「プライ
マー部位」または「プライマー結合部位」という用語はプライマーがハイブリダ
イズする標的DNAのセグメントを指す。「プライマー対」という用語は、増幅し
ようとするDNAの5’末端の相補体とハイブリダイズする5’「上流プライマー」
および増幅しようとする配列の3’末端とハイブリダイズする3’「下流プライマ
ー」を含む一組のプライマーを意味する。
リン酸および重合用作用物質、例えば、DNAもしくはRNAポリメラーゼまたは逆転
写酵素の存在下）、適切なバッファ中および適切な温度で、テンプレート指向性
DNA合成の開始点として作用可能な一本鎖オリゴヌクレオチドである。プライマ
ーの適切な長さはそのプライマーの目的とする用途に依存するが、典型的には、
15ないし30ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、一般には、テン
プレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要
とする。プライマーはテンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、テン
プレートとハイブリダイズするのに十分な相補性でなければならない。「プライ
マー部位」または「プライマー結合部位」という用語はプライマーがハイブリダ
イズする標的DNAのセグメントを指す。「プライマー対」という用語は、増幅し
ようとするDNAの5’末端の相補体とハイブリダイズする5’「上流プライマー」
および増幅しようとする配列の3’末端とハイブリダイズする3’「下流プライマ
ー」を含む一組のプライマーを意味する。
【００１７】
「完全に相補的」であるプライマーはそのプライマーの全長にわたって完全に
相補的な配列を有し、不一致はない。このプライマーは、典型的には、標的配列
の一部（下位配列）に対して完全に相補的である。「不一致」は、プライマー中
のヌクレオチドとそれが並列する標的核酸中のヌクレオチドが相補的ではない部
位を指す。
相補的な配列を有し、不一致はない。このプライマーは、典型的には、標的配列
の一部（下位配列）に対して完全に相補的である。「不一致」は、プライマー中
のヌクレオチドとそれが並列する標的核酸中のヌクレオチドが相補的ではない部
位を指す。
【００１８】
「実質的に相補的」という用語は、プライマーがその標的配列と完全に相補的
ではないことを意味する；その代わり、そのプライマーは、望ましいプライマー
結合部位でそれぞれの鎖に選択的にハイブリダイズするのに十分に相補的なだけ
である。ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性の完全な欠如よりも選択的
であるハイブリダイゼーションが生じるときに存在する。典型的には、少なくと
も14−25ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも55％の同一性、好まし
くは少なくとも65％、より好ましくは少なくとも75％、最も好ましくは少なくと
も90％が存在するときに選択的ハイブリダイゼーションが生じる。好ましくは、
ある核酸が他の核酸に選択的にハイブリダイズする。M. Kanehisa, Nucleic Aci
ds Res., 12:203 (1984)を参照。
ではないことを意味する；その代わり、そのプライマーは、望ましいプライマー
結合部位でそれぞれの鎖に選択的にハイブリダイズするのに十分に相補的なだけ
である。ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性の完全な欠如よりも選択的
であるハイブリダイゼーションが生じるときに存在する。典型的には、少なくと
も14−25ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも55％の同一性、好まし
くは少なくとも65％、より好ましくは少なくとも75％、最も好ましくは少なくと
も90％が存在するときに選択的ハイブリダイゼーションが生じる。好ましくは、
ある核酸が他の核酸に選択的にハイブリダイズする。M. Kanehisa, Nucleic Aci
ds Res., 12:203 (1984)を参照。
【００１９】
ハイブリダイゼーションは、通常、オリゴヌクレオチドと標的核酸との特異的
結合を許容する厳格な条件下で行う。厳格な条件は、オリゴヌクレオチドの相補
的核酸への特異的ハイブリダイゼーションを許容するあらゆる適切なバッファ濃
度および温度である。「〜に特異的にハイブリダイズする」という句および関連
する句は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物中に存在するとき、厳格な条件
下でその配列のみに対して分子が結合、二重鎖化、またはハイブリダイズするこ
とを指す。M. Kanehisa, Nucleic Acids Res., 12:203 (1984)を参照。厳格な条
件は配列依存性であり、異なる環境においては異なる。配列が長いほどより高い
温度で特異的にハイブリダイズする。一般には、厳格な条件は、定義されたイオ
ン強度およびpHでの特定の配列の融点（Tm）を約5℃下回るように選択される。T
mは、標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドの50％が平衡状態で標的配列にハ
イブリダイズする（定義されたイオン強度、pH、および核酸濃度の下での）温度
である。典型的には、厳格な条件は、塩濃度がpH7.0ないし8.3で約1.0M Naイオ
ン未満、典型的には約0.01ないし1.0M Naイオン濃度（または他の塩）であり、
かつ温度が短いオリゴヌクレオチド（例えば、10ないし50ヌクレオチド）につい
ては少なくとも約30℃、長いプローブ（例えば、50を超えるヌクレオチド）につ
いては少なくとも約60℃であるものである。厳格な条件は脱安定化剤、例えば、
ホルムアミドを添加することで達成することもできる。
結合を許容する厳格な条件下で行う。厳格な条件は、オリゴヌクレオチドの相補
的核酸への特異的ハイブリダイゼーションを許容するあらゆる適切なバッファ濃
度および温度である。「〜に特異的にハイブリダイズする」という句および関連
する句は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物中に存在するとき、厳格な条件
下でその配列のみに対して分子が結合、二重鎖化、またはハイブリダイズするこ
とを指す。M. Kanehisa, Nucleic Acids Res., 12:203 (1984)を参照。厳格な条
件は配列依存性であり、異なる環境においては異なる。配列が長いほどより高い
温度で特異的にハイブリダイズする。一般には、厳格な条件は、定義されたイオ
ン強度およびpHでの特定の配列の融点（Tm）を約5℃下回るように選択される。T
mは、標的配列に相補的なオリゴヌクレオチドの50％が平衡状態で標的配列にハ
イブリダイズする（定義されたイオン強度、pH、および核酸濃度の下での）温度
である。典型的には、厳格な条件は、塩濃度がpH7.0ないし8.3で約1.0M Naイオ
ン未満、典型的には約0.01ないし1.0M Naイオン濃度（または他の塩）であり、
かつ温度が短いオリゴヌクレオチド（例えば、10ないし50ヌクレオチド）につい
ては少なくとも約30℃、長いプローブ（例えば、50を超えるヌクレオチド）につ
いては少なくとも約60℃であるものである。厳格な条件は脱安定化剤、例えば、
ホルムアミドを添加することで達成することもできる。
【００２０】
「変異の部位」または「変位部位」は、核酸に関して用いられるとき、別の点
で類似の配列を有する核酸の間でヌクレオチドの素性が変化する部位を広範に指
す。二本鎖核酸については、変位部位は一方の鎖に可変ヌクレオチドを、他方の
鎖に相補的ヌクレオチドを含む。変位部位は単一ヌクレオチド多形の部位であっ
ても、または体性突然変異の部位であってもよく、これには、例えば、点突然変
異、欠失、挿入、および再配置が含まれる。
で類似の配列を有する核酸の間でヌクレオチドの素性が変化する部位を広範に指
す。二本鎖核酸については、変位部位は一方の鎖に可変ヌクレオチドを、他方の
鎖に相補的ヌクレオチドを含む。変位部位は単一ヌクレオチド多形の部位であっ
ても、または体性突然変異の部位であってもよく、これには、例えば、点突然変
異、欠失、挿入、および再配置が含まれる。
【００２１】
「多形マーカー」または「多形部位」は相違が生じる遺伝子座である。好まし
いマーカーは少なくとも2つの対立遺伝子を有し、各々が選択された集団の1％を
上回る頻度、より好ましくは10％または20％を上回る頻度で生じる。最初に同定
される対立遺伝子形態は参照形態として任意に命名され、他の対立遺伝子形態は
代替または変異対立遺伝子として命名される。選択された集団において最も頻繁
に生じる対立遺伝子形態は時には野生型と呼ばれ、これに対してより少ない頻度
で生じる対立遺伝子形態は突然変異対立遺伝子と呼ばれる。二倍体生物は対立遺
伝子形態についてホモ接合であってもヘテロ接合であってもよい。ジアレリック
（diallelic）多形は2つの形態を有し、トリアレリック（triallelic）多形は3
つの形態を有し、かつテトラアレリック（tetra-allelic）多型は4つの形態を有
する。
いマーカーは少なくとも2つの対立遺伝子を有し、各々が選択された集団の1％を
上回る頻度、より好ましくは10％または20％を上回る頻度で生じる。最初に同定
される対立遺伝子形態は参照形態として任意に命名され、他の対立遺伝子形態は
代替または変異対立遺伝子として命名される。選択された集団において最も頻繁
に生じる対立遺伝子形態は時には野生型と呼ばれ、これに対してより少ない頻度
で生じる対立遺伝子形態は突然変異対立遺伝子と呼ばれる。二倍体生物は対立遺
伝子形態についてホモ接合であってもヘテロ接合であってもよい。ジアレリック
（diallelic）多形は2つの形態を有し、トリアレリック（triallelic）多形は3
つの形態を有し、かつテトラアレリック（tetra-allelic）多型は4つの形態を有
する。
【００２２】
「単一ヌクレオチド多形」（SNP）は、対立遺伝子配列間での変動部位である
、単一のヌクレオチドで占められる多形部位で生じる。この部位には、通常、そ
の対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団の1／100または1／1000未
満のメンバーにおいて変化する配列）が先行し、かつ後に続く。単一ヌクレオチ
ド多形は、通常、多形部位で1つのヌクレオチドが別のものに取って代わるため
に生じる。転位は別のプリンによる1つのプリンの、または別のピリミジンによ
る1つのピリミジンの置換である。塩基転換はピリミジンによるプリンの置換ま
たはその逆である。単一ヌクレオチド多形は参照対立遺伝子に対する1ヌクレオ
チドの欠失または1ヌクレオチドの挿入からも生じ得る。
、単一のヌクレオチドで占められる多形部位で生じる。この部位には、通常、そ
の対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団の1／100または1／1000未
満のメンバーにおいて変化する配列）が先行し、かつ後に続く。単一ヌクレオチ
ド多形は、通常、多形部位で1つのヌクレオチドが別のものに取って代わるため
に生じる。転位は別のプリンによる1つのプリンの、または別のピリミジンによ
る1つのピリミジンの置換である。塩基転換はピリミジンによるプリンの置換ま
たはその逆である。単一ヌクレオチド多形は参照対立遺伝子に対する1ヌクレオ
チドの欠失または1ヌクレオチドの挿入からも生じ得る。
【００２３】
「天然」という用語は、ある対象に適用される場合、その対象を自然界に見出
すことができることを意味する。
すことができることを意味する。
【００２４】
「被検体」および「個体」という用語はあらゆるタイプの生物を指すのに本明
細書で交換可能に用いられるが、最も典型的にはヒトを指すのに用いられる。
細書で交換可能に用いられるが、最も典型的にはヒトを指すのに用いられる。
【００２５】
II．概観
本発明は、標的核酸の変異部位に存在するヌクレオチドの素性を決定するため
の方法及びキットを提供する。これらの方法は、1以上の標識伸長性ヌクレオチ
ドおよび1以上の標識非伸長性ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド
）の混合物の存在下でプライマー伸長反応を行い、標的核酸の変位部位を占める
ヌクレオチドに特徴的な標識プライマー伸長産生物を生成することを含む。変位
部位の下流の配列の性質および反応中に存在する伸長性ヌクレオチドの素性に依
存して、幾つかの場合には、これらの反応は標的核酸の異なる対立遺伝子形態に
ついて異なるサイズの伸長産生物を生成する。したがって、特定の標識ヌクレオ
チドを慎重に選択し、かつ差別的に標識されたヌクレオチドを用いることにより
、これらの方法は、幾つかの場合において、2つの基準、すなわちサイズおよび
標識の素性に従って対立遺伝子形態を区別することができる。これらの方法は関
心のある標的核酸のすべての対立遺伝子形態について標識伸長産生物を生成する
ように設計できるため、他の方法の欠点である否定的な結果の誤った解釈（例え
ば、産生物の欠如が実際には実験の失敗のためであるとき、伸長産生物の欠如を
試料中の対立遺伝子形態の不在と混同すること）を減少させることができる。本
発明の方法は高い試料処理能力をも可能にする。
の方法及びキットを提供する。これらの方法は、1以上の標識伸長性ヌクレオチ
ドおよび1以上の標識非伸長性ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド
）の混合物の存在下でプライマー伸長反応を行い、標的核酸の変位部位を占める
ヌクレオチドに特徴的な標識プライマー伸長産生物を生成することを含む。変位
部位の下流の配列の性質および反応中に存在する伸長性ヌクレオチドの素性に依
存して、幾つかの場合には、これらの反応は標的核酸の異なる対立遺伝子形態に
ついて異なるサイズの伸長産生物を生成する。したがって、特定の標識ヌクレオ
チドを慎重に選択し、かつ差別的に標識されたヌクレオチドを用いることにより
、これらの方法は、幾つかの場合において、2つの基準、すなわちサイズおよび
標識の素性に従って対立遺伝子形態を区別することができる。これらの方法は関
心のある標的核酸のすべての対立遺伝子形態について標識伸長産生物を生成する
ように設計できるため、他の方法の欠点である否定的な結果の誤った解釈（例え
ば、産生物の欠如が実際には実験の失敗のためであるとき、伸長産生物の欠如を
試料中の対立遺伝子形態の不在と混同すること）を減少させることができる。本
発明の方法は高い試料処理能力をも可能にする。
【００２６】
本発明の一般的な方法は、異なる変位部位の複数のヌクレオチドの素性を1つ
の反応において問いただす多重化形式に適合させることができる。このような方
法は、調査する異なる変位部位について差別的に標識されたプライマーを用いる
ことによって行うことができる。したがって、例えば、本発明の方法は、1つも
しくは複数の標的核酸上の複数の異なる変位部位のヌクレオチドの素性を決定す
るのに用いることができる。
の反応において問いただす多重化形式に適合させることができる。このような方
法は、調査する異なる変位部位について差別的に標識されたプライマーを用いる
ことによって行うことができる。したがって、例えば、本発明の方法は、1つも
しくは複数の標的核酸上の複数の異なる変位部位のヌクレオチドの素性を決定す
るのに用いることができる。
【００２７】
これらの方法は幾つかの異なる用途において用いることができる。例えば、医
学分野においては、どの対立遺伝子が単一ヌクレオチド多形（SNP）部位に存在
するのかを決定し、または特定の部位での突然変異を検出するのに本発明の方法
を用いることができる。多くの疾患がSNPまたは突然変異と関連するため、これ
らの方法は様々な診断、研究および予後判定用途において用いることができる。
加えて、二倍体被検体については、その個体が特定の対立遺伝子についてホモ接
合であるのかまたはヘテロ接合であるのかを決定するのに、すなわち、その個体
の遺伝子型を決定するのにこれらの方法を用いることができる。疾患に関連する
対立遺伝子についてホモ接合である個体はヘテロ接合またはその疾患に関連しな
い対立遺伝子についてホモ接合である個体よりも危険性が高いため、これは重要
な能力である。さらに、特定の疾患に関連する対立遺伝子についてホモ接合であ
る個体は、時折、ヘテロ接合体よりも大きな程度にその疾患の症状を被る。特定
の部位を問いただすこれらの方法の能力には、例えば、法医学的および父子鑑定
事例の解決におけるものを含む、同定目的に価値が見出される。これらの方法は
、特定の病原体（例えば、特定のウイルス、細菌または真菌）に由来する核酸の
存在の決定においても有用性を有する。
学分野においては、どの対立遺伝子が単一ヌクレオチド多形（SNP）部位に存在
するのかを決定し、または特定の部位での突然変異を検出するのに本発明の方法
を用いることができる。多くの疾患がSNPまたは突然変異と関連するため、これ
らの方法は様々な診断、研究および予後判定用途において用いることができる。
加えて、二倍体被検体については、その個体が特定の対立遺伝子についてホモ接
合であるのかまたはヘテロ接合であるのかを決定するのに、すなわち、その個体
の遺伝子型を決定するのにこれらの方法を用いることができる。疾患に関連する
対立遺伝子についてホモ接合である個体はヘテロ接合またはその疾患に関連しな
い対立遺伝子についてホモ接合である個体よりも危険性が高いため、これは重要
な能力である。さらに、特定の疾患に関連する対立遺伝子についてホモ接合であ
る個体は、時折、ヘテロ接合体よりも大きな程度にその疾患の症状を被る。特定
の部位を問いただすこれらの方法の能力には、例えば、法医学的および父子鑑定
事例の解決におけるものを含む、同定目的に価値が見出される。これらの方法は
、特定の病原体（例えば、特定のウイルス、細菌または真菌）に由来する核酸の
存在の決定においても有用性を有する。
【００２８】
III．変異部位のヌクレオチドの決定
A．一般的な方法
本発明の特定の方法は、一般には、関心のある標的核酸をテンプレートとして
用いるプライマー伸長反応の実施を含む。「標的核酸」という用語は、本明細書
で用いられる場合、少なくとも1つの問いただす変異部位を含む一本鎖または二
本鎖核酸を指す。二本鎖核酸については、変異部位は検査する部位にヌクレオチ
ドを、および相補鎖に相補的ヌクレオチドを含む。二本鎖標的核酸が変性して2
本の一本鎖を形成する場合、各々の鎖を標的核酸と考えることができ、かついず
れかの鎖が本発明の方法におけるテンプレートとして機能し得る。プライマーは
、そのプライマーがひとたび標的核酸にアニールするとその3’末端が標的核酸
の変異部位の5’側でそれに隣接して位置するように設計される。
用いるプライマー伸長反応の実施を含む。「標的核酸」という用語は、本明細書
で用いられる場合、少なくとも1つの問いただす変異部位を含む一本鎖または二
本鎖核酸を指す。二本鎖核酸については、変異部位は検査する部位にヌクレオチ
ドを、および相補鎖に相補的ヌクレオチドを含む。二本鎖標的核酸が変性して2
本の一本鎖を形成する場合、各々の鎖を標的核酸と考えることができ、かついず
れかの鎖が本発明の方法におけるテンプレートとして機能し得る。プライマーは
、そのプライマーがひとたび標的核酸にアニールするとその3’末端が標的核酸
の変異部位の5’側でそれに隣接して位置するように設計される。
【００２９】
伸長反応は、少なくとも1の標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1の標識
非伸長性ヌクレオチドを含むヌクレオチド混合物に加えて、プライマーの3’末
端への1以上の標識ヌクレオチドの取り込みを触媒するポリメラーゼの存在下で
行う。標識ヌクレオチドは、典型的には、標的核酸のテンプレート鎖の変位部位
を潜在的に占める異なるヌクレオチドに相補的であるように選択される。混合物
中に存在する標識伸長性ヌクレオチドが問いただす変位部位を占めるヌクレオチ
ドに相補的である場合、伸長反応内で標識核酸にアニールした少なくとも1つの
プライマーが伸長して標識伸長産生物を産生する。しかしながら、伸長反応に加
えられた標識非伸長性ヌクレオチドが変異部位のヌクレオチドに相補的である場
合、その標識非伸長性ヌクレオチドが取り込まれて異なる伸長産生物を産生する
。プライマーに取り込まれる標識ヌクレオチドはテンプレートの変異部位のヌク
レオチドに相補的であるため、どの標識ヌクレオチドがプライマーに取り込まれ
るのかを決定することにより、変位部位に存在するヌクレオチドを同定すること
ができる。
非伸長性ヌクレオチドを含むヌクレオチド混合物に加えて、プライマーの3’末
端への1以上の標識ヌクレオチドの取り込みを触媒するポリメラーゼの存在下で
行う。標識ヌクレオチドは、典型的には、標的核酸のテンプレート鎖の変位部位
を潜在的に占める異なるヌクレオチドに相補的であるように選択される。混合物
中に存在する標識伸長性ヌクレオチドが問いただす変位部位を占めるヌクレオチ
ドに相補的である場合、伸長反応内で標識核酸にアニールした少なくとも1つの
プライマーが伸長して標識伸長産生物を産生する。しかしながら、伸長反応に加
えられた標識非伸長性ヌクレオチドが変異部位のヌクレオチドに相補的である場
合、その標識非伸長性ヌクレオチドが取り込まれて異なる伸長産生物を産生する
。プライマーに取り込まれる標識ヌクレオチドはテンプレートの変異部位のヌク
レオチドに相補的であるため、どの標識ヌクレオチドがプライマーに取り込まれ
るのかを決定することにより、変位部位に存在するヌクレオチドを同定すること
ができる。
【００３０】
プライマー伸長反応の文脈内で用いられる場合、「ヌクレオチド」という用語
は、そのヌクレオチドがテンプレート依存性プライマー伸長の間にプライマーの
3’末端で取り込まれ得る限り、天然デオキシヌクレオチド（すなわち、dATP、d
TTP、dGTPおよびdCTP）、ジデオキシヌクレオチド、または前者の誘導体のいず
れをも指す。したがって、ヌクレオチドは伸長性ヌクレオチドおよび／または非
伸長性ヌクレオチドであり得る。「伸長性ヌクレオチド」は別のヌクレオチドが
リボース部分の3’位で結合可能であるヌクレオチドを指す。したがって、伸長
性ヌクレオチドには、天然デオキシヌクレオチドdATP、dTTP、dCTPおよびdGTPに
加えて、伸長性である、これらのヌクレオチドの誘導体が含まれる。
は、そのヌクレオチドがテンプレート依存性プライマー伸長の間にプライマーの
3’末端で取り込まれ得る限り、天然デオキシヌクレオチド（すなわち、dATP、d
TTP、dGTPおよびdCTP）、ジデオキシヌクレオチド、または前者の誘導体のいず
れをも指す。したがって、ヌクレオチドは伸長性ヌクレオチドおよび／または非
伸長性ヌクレオチドであり得る。「伸長性ヌクレオチド」は別のヌクレオチドが
リボース部分の3’位で結合可能であるヌクレオチドを指す。したがって、伸長
性ヌクレオチドには、天然デオキシヌクレオチドdATP、dTTP、dCTPおよびdGTPに
加えて、伸長性である、これらのヌクレオチドの誘導体が含まれる。
【００３１】
「非伸長性ヌクレオチド」は、ひとたびプライマーに取り込まれるとさらに伸
長することができない、すなわち、3’ヒドロキシル基が存在しないか、または
別のヌクレオチドが3’位で結合することができないように3’ヒドロキシル基が
修飾されているヌクレオチド類似体を指す。したがって、適切な非伸長性ヌクレ
オチドには、ひとたびその非伸長性ヌクレオチドがプライマーに取り込まれると
別のヌクレオチドがそのプライマーに結合できないように3’ヒドロキシル基が
異なる部分で置換されているヌクレオチドが含まれる。そのような部分には、こ
れらに限定されるものではないが、−H、−SH及び他の置換基が含まれる。非伸
長性ヌクレオチドの具体的な例にはジデオキシヌクレオチドおよびアラビノシド
三リン酸が含まれる。
長することができない、すなわち、3’ヒドロキシル基が存在しないか、または
別のヌクレオチドが3’位で結合することができないように3’ヒドロキシル基が
修飾されているヌクレオチド類似体を指す。したがって、適切な非伸長性ヌクレ
オチドには、ひとたびその非伸長性ヌクレオチドがプライマーに取り込まれると
別のヌクレオチドがそのプライマーに結合できないように3’ヒドロキシル基が
異なる部分で置換されているヌクレオチドが含まれる。そのような部分には、こ
れらに限定されるものではないが、−H、−SH及び他の置換基が含まれる。非伸
長性ヌクレオチドの具体的な例にはジデオキシヌクレオチドおよびアラビノシド
三リン酸が含まれる。
【００３２】
標的核酸と接触するヌクレオチドの各々は標識形態を含む。「標識された」と
いう用語は、伸長反応において用いられるヌクレオチドまたは標識を担持するか
、もしくはそれに結合するヌクレオチドに関して用いられる場合、それらのヌク
レオチドが検出可能な標識（下記参照）を担持するか、または伸長反応に続いて
そのヌクレオチドの標識化が許容されるように修飾／誘導体化されていることを
意味する。ヌクレオチドが修飾される場合、異なるヌクレオチドの選択的な差別
化標識が許容されるように異なる方法で異なるヌクレオチドを修飾することがで
きる。例えば、異なるヌクレオチドを、特定の標識と会合する特定の官能基と選
択的に反応する異なる官能基を担持するように誘導体化することができる。
いう用語は、伸長反応において用いられるヌクレオチドまたは標識を担持するか
、もしくはそれに結合するヌクレオチドに関して用いられる場合、それらのヌク
レオチドが検出可能な標識（下記参照）を担持するか、または伸長反応に続いて
そのヌクレオチドの標識化が許容されるように修飾／誘導体化されていることを
意味する。ヌクレオチドが修飾される場合、異なるヌクレオチドの選択的な差別
化標識が許容されるように異なる方法で異なるヌクレオチドを修飾することがで
きる。例えば、異なるヌクレオチドを、特定の標識と会合する特定の官能基と選
択的に反応する異なる官能基を担持するように誘導体化することができる。
【００３３】
上に示されるように、伸長反応において用いられるヌクレオチド混合物は、一
般には、少なくとも1の標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1の標識非伸長
性ヌクレオチドを含む。しかしながら、具体的な分析は様々な異なる形式で構成
することができる。以下のリストは、利用可能な伸長性および非伸長性ヌクレオ
チドの特定の組合せの具体的な例を提供する。 1 dNTP、1 ddNTP 2 dNTP、1 ddNTP 3 dNTP、1 ddNTP 1 dNTP、2 ddNTP 2 dNTP、2 ddNTP 3 dNTP、2 ddNTP 1 dNTP、3 ddNTP 2 dNTP、3 ddNTP 3 dNTP、3 ddNTP 1 dNTP、4 ddNTP 2 dNTP、4 ddNTP 3 dNTP、4 ddNTP
般には、少なくとも1の標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1の標識非伸長
性ヌクレオチドを含む。しかしながら、具体的な分析は様々な異なる形式で構成
することができる。以下のリストは、利用可能な伸長性および非伸長性ヌクレオ
チドの特定の組合せの具体的な例を提供する。 1 dNTP、1 ddNTP 2 dNTP、1 ddNTP 3 dNTP、1 ddNTP 1 dNTP、2 ddNTP 2 dNTP、2 ddNTP 3 dNTP、2 ddNTP 1 dNTP、3 ddNTP 2 dNTP、3 ddNTP 3 dNTP、3 ddNTP 1 dNTP、4 ddNTP 2 dNTP、4 ddNTP 3 dNTP、4 ddNTP
【００３４】
しばしば、分析はビアレリック変位部位のものである。そのような部位の分析
の幾つかは単一標識非伸長性ヌクレオチドを単一標識伸長性ヌクレオチドとの組
合せで用いる。トリアレリックおよびテトラアレリック変位部位については、特
定の方法において、非伸長性ヌクレオチドの数がそれぞれ2および3に増加される
（下記参照）。
の幾つかは単一標識非伸長性ヌクレオチドを単一標識伸長性ヌクレオチドとの組
合せで用いる。トリアレリックおよびテトラアレリック変位部位については、特
定の方法において、非伸長性ヌクレオチドの数がそれぞれ2および3に増加される
（下記参照）。
【００３５】
B．鎖分離およびアニーリング
1．鎖分離
本発明の特定の方法の様々な主要工程が図1Aに示されており、これは2つの対
立遺伝子形態（例えば、ビアレリックSNP）を有する標的核酸を分析するための
方法を示す。しかしながら、同じ一般工程がより多くの対立遺伝子形態を有する
標的核酸に当てはまる（図2−4を参照）。文字W／w；X／x；Y／yおよびZ／zは、
図1A−4において、鎖デオキシヌクレオチド（すなわち、A、T、GまたはC）のい
ずれをも表すのに用いられ、異なる文字は異なるヌクレオチドを表す。小文字は
標的核酸の一方の鎖の変異部位のヌクレオチドを表し、大文字はその相補鎖の相
補的ヌクレオチドを表す。したがって、W／wは、X／x、Y／yおよびZ／zと同様に
、標的核酸の対向する鎖の相補的塩基を表す。図中の矢印はプライマーを表す。
立遺伝子形態（例えば、ビアレリックSNP）を有する標的核酸を分析するための
方法を示す。しかしながら、同じ一般工程がより多くの対立遺伝子形態を有する
標的核酸に当てはまる（図2−4を参照）。文字W／w；X／x；Y／yおよびZ／zは、
図1A−4において、鎖デオキシヌクレオチド（すなわち、A、T、GまたはC）のい
ずれをも表すのに用いられ、異なる文字は異なるヌクレオチドを表す。小文字は
標的核酸の一方の鎖の変異部位のヌクレオチドを表し、大文字はその相補鎖の相
補的ヌクレオチドを表す。したがって、W／wは、X／x、Y／yおよびZ／zと同様に
、標的核酸の対向する鎖の相補的塩基を表す。図中の矢印はプライマーを表す。
【００３６】
本発明の方法は、二重鎖標的核酸を含む試料を処理して少なくとも関心のある
変異部位全体にわたる不対ヌクレオチドを得るか、またはその代わりに、分離鎖
を得ることで開始する。もちろん、標的核酸が既に一本鎖である場合にはそのよ
うな工程は不必要である。鎖分離は当該技術分野において公知の様々な変性条件
を用いて達成することができ、これには、例えば、熱、アルカリ、ホルムアミド
、尿素、グリオキサールおよびそれらの組合せが含まれる。典型的には、鎖分離
は、80℃ないし約105℃の範囲の温度で約1ないし10分の範囲の時間の熱変性を用
いて達成する。その代わりに、エキソヌクレアーゼによる二本鎖のうちの一方の
鎖の変性により一本鎖テンプレートを得ることもできる（例えば、Somers et al
, Biochimica et Biophysica Acta 1379:42-52 (1998)；Nikiforov et al., PCR
Methods and Applications 3:285-291 (1994)；Higuchi and Ochman, Nucleic
Acids Research 17: 5865 (1989)；およびStraus and Zagursky, Biotechniques
10: 376-384 (1991)を参照）。
変異部位全体にわたる不対ヌクレオチドを得るか、またはその代わりに、分離鎖
を得ることで開始する。もちろん、標的核酸が既に一本鎖である場合にはそのよ
うな工程は不必要である。鎖分離は当該技術分野において公知の様々な変性条件
を用いて達成することができ、これには、例えば、熱、アルカリ、ホルムアミド
、尿素、グリオキサールおよびそれらの組合せが含まれる。典型的には、鎖分離
は、80℃ないし約105℃の範囲の温度で約1ないし10分の範囲の時間の熱変性を用
いて達成する。その代わりに、エキソヌクレアーゼによる二本鎖のうちの一方の
鎖の変性により一本鎖テンプレートを得ることもできる（例えば、Somers et al
, Biochimica et Biophysica Acta 1379:42-52 (1998)；Nikiforov et al., PCR
Methods and Applications 3:285-291 (1994)；Higuchi and Ochman, Nucleic
Acids Research 17: 5865 (1989)；およびStraus and Zagursky, Biotechniques
10: 376-384 (1991)を参照）。
【００３７】
2．アニーリング
プライマー（検出プライマーとも呼ばれる）を、ハイブリダイズする条件下で
、変性の間に形成された一本鎖標的核酸／テンプレート鎖にアニールする。この
プライマーは、その3’末端が標的核酸の変位部位に隣接するように標的核酸の
セグメントに特異的にハイブリダイズする（図1Aを参照）。本明細書で用いられ
る場合、「隣接する」という用語は、プライマーと標的核酸とのハイブリダイゼ
ーションに関して用いられる場合、典型的には、そのプライマーが標的核酸にハ
イブリダイズしてその3’末端が変異部位のすぐ5’側にあることを意味する。し
かしながら、プライマーの3’末端と変異部位との間のヌクレオチドが潜在的に
その変異部位を占めるヌクレオチドと同じではない限り、3’末端が変異部位の
数ヌクレオチド5’側に位置することも可能である。
、変性の間に形成された一本鎖標的核酸／テンプレート鎖にアニールする。この
プライマーは、その3’末端が標的核酸の変位部位に隣接するように標的核酸の
セグメントに特異的にハイブリダイズする（図1Aを参照）。本明細書で用いられ
る場合、「隣接する」という用語は、プライマーと標的核酸とのハイブリダイゼ
ーションに関して用いられる場合、典型的には、そのプライマーが標的核酸にハ
イブリダイズしてその3’末端が変異部位のすぐ5’側にあることを意味する。し
かしながら、プライマーの3’末端と変異部位との間のヌクレオチドが潜在的に
その変異部位を占めるヌクレオチドと同じではない限り、3’末端が変異部位の
数ヌクレオチド5’側に位置することも可能である。
【００３８】
3．プライマー
様々な異なるタイプのプライマーを本発明で用いることができる。適切なプラ
イマーには、例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチ
ド、ペプチド核酸またはそれらの共重合体が含まれる。プライマーは天然核酸で
あっても合成法を用いて調製されてもよい。合成する場合、プライマーはイン・
ビトロで酵素的に、イン・ビボで酵素的に、またはイン・ビトロで非酵素的に合
成することができる。
イマーには、例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチ
ド、ペプチド核酸またはそれらの共重合体が含まれる。プライマーは天然核酸で
あっても合成法を用いて調製されてもよい。合成する場合、プライマーはイン・
ビトロで酵素的に、イン・ビボで酵素的に、またはイン・ビトロで非酵素的に合
成することができる。
【００３９】
標的核酸の性質（下記試料に関するセクションを参照）に依存して、プライマ
ー／標的核酸二重鎖の様々な組合せが形成され得る。例えば、幾つかの方法にお
いては、テンプレートがデオキシリボ核酸であり、かつプライマーがオリゴデオ
キシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、またはそれらの共重合体であ
る。そのような場合、DNAポリメラーゼを用いてDNA産生物を産生させる。特定の
他の方法においては、テンプレートがリボ核酸であり、かつプライマーがオリゴ
デオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、またはそれらの共重合体
である。DNA産生物の形成に逆転写酵素を用いることができる。さらに別の方法
においては、テンプレートがデオキシリボ核酸であり、かつプライマーがオリゴ
リボヌクレオチドである。添加したRNAポリメラーゼがそのような二重鎖からRNA
産生物を産生することができる。最後に、テンプレートがリボ核酸であり、かつ
プライマーがオリゴリボヌクレオチドである場合、RNAレプリカーゼがRNA産生物
を形成することができる。
ー／標的核酸二重鎖の様々な組合せが形成され得る。例えば、幾つかの方法にお
いては、テンプレートがデオキシリボ核酸であり、かつプライマーがオリゴデオ
キシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、またはそれらの共重合体であ
る。そのような場合、DNAポリメラーゼを用いてDNA産生物を産生させる。特定の
他の方法においては、テンプレートがリボ核酸であり、かつプライマーがオリゴ
デオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、またはそれらの共重合体
である。DNA産生物の形成に逆転写酵素を用いることができる。さらに別の方法
においては、テンプレートがデオキシリボ核酸であり、かつプライマーがオリゴ
リボヌクレオチドである。添加したRNAポリメラーゼがそのような二重鎖からRNA
産生物を産生することができる。最後に、テンプレートがリボ核酸であり、かつ
プライマーがオリゴリボヌクレオチドである場合、RNAレプリカーゼがRNA産生物
を形成することができる。
【００４０】
プライマーは適切な標的核酸に特異的にハイブリダイズし、かつ伸長反応条件
下で安定なハイブリダイゼーション複合体を形成するのに十分な長さである。典
型的には、プライマーは長さが15ないし50ヌクレオチドである；別の場合には、
プライマーは20ないし30ヌクレオチド長である。プライマーの長さは、プライマ
ーがハイブリダイズする配列に依存して、より長くまたは幾らか短く調整するこ
とができる（例えば、高G／C含量のプライマーは、典型的には、低G／C含量のも
のよりも短いものであり得る）。最も典型的には、プライマーはそれらの全長に
わたってテンプレート鎖と完全に相補的であるように設計される。しかしながら
、特定の方法においては、プライマーは標的核酸に対して実質的に相補的である
；しかしながら、そのような場合、不一致がプライマー／標的核酸ハイブリダイ
ゼーション複合体の安定性に悪影響を及ぼすべきではない。
下で安定なハイブリダイゼーション複合体を形成するのに十分な長さである。典
型的には、プライマーは長さが15ないし50ヌクレオチドである；別の場合には、
プライマーは20ないし30ヌクレオチド長である。プライマーの長さは、プライマ
ーがハイブリダイズする配列に依存して、より長くまたは幾らか短く調整するこ
とができる（例えば、高G／C含量のプライマーは、典型的には、低G／C含量のも
のよりも短いものであり得る）。最も典型的には、プライマーはそれらの全長に
わたってテンプレート鎖と完全に相補的であるように設計される。しかしながら
、特定の方法においては、プライマーは標的核酸に対して実質的に相補的である
；しかしながら、そのような場合、不一致がプライマー／標的核酸ハイブリダイ
ゼーション複合体の安定性に悪影響を及ぼすべきではない。
【００４１】
特定の方法において、プライマーは、試験試料中の組み込まれていない試薬お
よび／または標的核酸および／または他の核酸からの伸長産生物のアフィニティ
分離を可能にする1以上の部分を含むことができる。そのようなアタッチメント
部分は下記検出に関するセクションにおいてさらに説明されている。加えて、プ
ライマーは、伸長したプライマーの検出を容易にする標識を含むことができる。
その代わりに、プライマーは、伸長反応後の選択的標識を容易にする修飾ヌクレ
オチドを含むこともできる。したがって、プライマーが担持する標識に関して用
いられるときの「標識」という用語、または「標識プライマー」という用語、す
なわち標識を担持するプライマーへの言及は、実際に標識を担持するプライマー
に加えて、伸長反応に続いて標識を結合させるための修飾ヌクレオチドを含むプ
ライマーを包含する。適切な標識は、標識ヌクレオチドに関するセクションにお
いて以下に説明されるものから選択することができる。
よび／または標的核酸および／または他の核酸からの伸長産生物のアフィニティ
分離を可能にする1以上の部分を含むことができる。そのようなアタッチメント
部分は下記検出に関するセクションにおいてさらに説明されている。加えて、プ
ライマーは、伸長したプライマーの検出を容易にする標識を含むことができる。
その代わりに、プライマーは、伸長反応後の選択的標識を容易にする修飾ヌクレ
オチドを含むこともできる。したがって、プライマーが担持する標識に関して用
いられるときの「標識」という用語、または「標識プライマー」という用語、す
なわち標識を担持するプライマーへの言及は、実際に標識を担持するプライマー
に加えて、伸長反応に続いて標識を結合させるための修飾ヌクレオチドを含むプ
ライマーを包含する。適切な標識は、標識ヌクレオチドに関するセクションにお
いて以下に説明されるものから選択することができる。
【００４２】
C．伸長
引き続き図1Aを参照して、プライマーおよび標的核酸を含む二重鎖を標識ヌク
レオチドおよびポリメラーゼの混合物と接触させてプライマーの伸長を開始させ
る。前述のように、ヌクレオチドの混合物は少なくとも1の標識伸長性ヌクレオ
チドおよび少なくとも1の標識非伸長性ヌクレオチドを含む。これらの標識ヌク
レオチドは、研究中の標的核酸の変位部位に潜在的に存在するヌクレオチドのう
ちの1つに相補的であるように選択される。添加されたヌクレオチドが標的核酸
の変位部位のヌクレオチドに相補的である場合、ポリメラーゼがこのヌクレオチ
ドの取り込みを触媒して伸長されたプライマーが産生される。取り込まれたヌク
レオチドは変位部位を占めるヌクレオチドに相補的であるため、取り込まれたヌ
クレオチドは変位部位のヌクレオチドを同定するための基礎を提供する。
レオチドおよびポリメラーゼの混合物と接触させてプライマーの伸長を開始させ
る。前述のように、ヌクレオチドの混合物は少なくとも1の標識伸長性ヌクレオ
チドおよび少なくとも1の標識非伸長性ヌクレオチドを含む。これらの標識ヌク
レオチドは、研究中の標的核酸の変位部位に潜在的に存在するヌクレオチドのう
ちの1つに相補的であるように選択される。添加されたヌクレオチドが標的核酸
の変位部位のヌクレオチドに相補的である場合、ポリメラーゼがこのヌクレオチ
ドの取り込みを触媒して伸長されたプライマーが産生される。取り込まれたヌク
レオチドは変位部位を占めるヌクレオチドに相補的であるため、取り込まれたヌ
クレオチドは変位部位のヌクレオチドを同定するための基礎を提供する。
【００４３】
プライマー伸長は伸長性ヌクレオチドの存在下で行われるため、変位部位下流
のテンプレート（すなわち、伸長プライマーの重合の方向）の配列に依存して、
プライマー伸長は変位部位を越えて伸長することができる。例えば、変位部位の
すぐ下流の1以上のヌクレオチドが変位部位のヌクレオチドと同じ場合、反応が
変位部位のヌクレオチドに相補的な伸長性ヌクレオチドを用いて行われるときに
伸長が変位部位の下流に及んでこれらのヌクレオチドを含む。変異部位を越える
伸長は特定の場合において有利なものであり得、これはその正味の結果が、異な
る対立遺伝子形態が異なるサイズの伸長産生物を産生し、それにより対立遺伝子
識別の別の基準が得られるというものであるためである。したがって、伸長反応
を差別的に標識されたヌクレオチドの存在下で行う場合、幾つかの場合には、伸
長産生物に取り込まれる標識の素性に基づき、かつ伸長産生物のサイズにより、
異なる対立遺伝子形態を区別することができる。
のテンプレート（すなわち、伸長プライマーの重合の方向）の配列に依存して、
プライマー伸長は変位部位を越えて伸長することができる。例えば、変位部位の
すぐ下流の1以上のヌクレオチドが変位部位のヌクレオチドと同じ場合、反応が
変位部位のヌクレオチドに相補的な伸長性ヌクレオチドを用いて行われるときに
伸長が変位部位の下流に及んでこれらのヌクレオチドを含む。変異部位を越える
伸長は特定の場合において有利なものであり得、これはその正味の結果が、異な
る対立遺伝子形態が異なるサイズの伸長産生物を産生し、それにより対立遺伝子
識別の別の基準が得られるというものであるためである。したがって、伸長反応
を差別的に標識されたヌクレオチドの存在下で行う場合、幾つかの場合には、伸
長産生物に取り込まれる標識の素性に基づき、かつ伸長産生物のサイズにより、
異なる対立遺伝子形態を区別することができる。
【００４４】
変異部位下流のヌクレオチドが変異部位のヌクレオチドと同じである状況にお
いて形成される伸長産生物の例が図1Bに示される。この図は、変異部位下流の異
なる例示的配列について、図1Aに示される対立遺伝子IIから生じ得る異なる伸長
産生物の例を示す。SEQ Iの場合、変異部位のすぐ下流のヌクレオチド（「w」で
表される）は反応混合物中に存在する標識ヌクレオチド（X1およびY2）のいずれ
とも相補的ではないヌクレオチドである。したがって、伸長は、変異部位に存在
するヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを取り込むと直ちに停止する。しかし
ながら、SEQ IIおよびSEQ IIIは、変異部位の下流の1以上のヌクレオチドが変異
部位のヌクレオチドと同じである状況を示す。このような場合、伸長は変異部位
の下流まで継続される。伸長は、添加されたヌクレオチドの1つに相補的ではな
いヌクレオチドにひとたび到達すると（SEQ IIを用いた場合）、または伸長反応
混合物中に存在する非伸長性ヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドに到達す
るとき（SEQ IIIを用いる場合）に停止する。
いて形成される伸長産生物の例が図1Bに示される。この図は、変異部位下流の異
なる例示的配列について、図1Aに示される対立遺伝子IIから生じ得る異なる伸長
産生物の例を示す。SEQ Iの場合、変異部位のすぐ下流のヌクレオチド（「w」で
表される）は反応混合物中に存在する標識ヌクレオチド（X1およびY2）のいずれ
とも相補的ではないヌクレオチドである。したがって、伸長は、変異部位に存在
するヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを取り込むと直ちに停止する。しかし
ながら、SEQ IIおよびSEQ IIIは、変異部位の下流の1以上のヌクレオチドが変異
部位のヌクレオチドと同じである状況を示す。このような場合、伸長は変異部位
の下流まで継続される。伸長は、添加されたヌクレオチドの1つに相補的ではな
いヌクレオチドにひとたび到達すると（SEQ IIを用いた場合）、または伸長反応
混合物中に存在する非伸長性ヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドに到達す
るとき（SEQ IIIを用いる場合）に停止する。
【００４５】
標識伸長性ヌクレオチドがプライマーに取り込まれるときの伸長反応の程度を
制御するのに様々な技術を用いることができる。適切な条件下で、反応を制御し
て、たとえテンプレートの配列がさらなるデオキシヌクレオチドの取り込みを許
容するとしても、変異部位で取り込まれるデオキシヌクレオチドの数を制限する
ことができる。そのような技術には、これらに限定されるものではないが、ポリ
メラーゼ濃度の制御、伸長反応時間の制限および低温（例えば、ポリメラーゼTa
q FS（Perkin Elmer）を用いて約40℃ないし60℃）での伸長反応の実施が含まれ
る。そのような制御は、異なる対立遺伝子形態をサイズによって区別することが
有利であるとき、伸長産生物のサイズを制御する上で有用であり得る。
制御するのに様々な技術を用いることができる。適切な条件下で、反応を制御し
て、たとえテンプレートの配列がさらなるデオキシヌクレオチドの取り込みを許
容するとしても、変異部位で取り込まれるデオキシヌクレオチドの数を制限する
ことができる。そのような技術には、これらに限定されるものではないが、ポリ
メラーゼ濃度の制御、伸長反応時間の制限および低温（例えば、ポリメラーゼTa
q FS（Perkin Elmer）を用いて約40℃ないし60℃）での伸長反応の実施が含まれ
る。そのような制御は、異なる対立遺伝子形態をサイズによって区別することが
有利であるとき、伸長産生物のサイズを制御する上で有用であり得る。
【００４６】
特定の方法においては、標識ヌクレオチドの幾つかまたは各々を標識および非
標識形態の混合物として提供することができる。特定のヌクレオチドについての
非標識形態の、そのヌクレオチドについての標識および非標識形態の総濃度に対
する濃度は、モル濃度ベースで少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％
、50％、55％または60％である。両形態の総量に対する非標識形態の濃度に関す
る上限は、典型的には、モル濃度ベースで80％、85％、90％または95％である。
特定の方法においては、非標識濃度は、典型的には、モル濃度ベースで30％ない
し95％である。別の方法においては、非標識形態は、一般には、モル濃度ベース
で50％ないし90％である。さらに別の方法においては、モル濃度ベースでの非標
識形態の標識形態に対する比は1：2である。商業的に入手可能な標識ヌクレオチ
ド（例えば、TAMRA−ddATP）は、時折、比較的低レベルの非標識形態（一般には
、約5％）を含むことがあるが、本発明において用いられる非標識形態の濃度は
そのようなレベルを上回るものであり、上記範囲に従うものである。標識および
非標識形態の混合物の使用は、伸長産生物へのヌクレオチドの取り込みの失敗を
減少させ、かつ異なる伸長産生物の信号強度を調節する上で有用であり得る。ヌ
クレオチドの標識および非標識形態の混合物の使用は、同時係属中の共通に所有
される米国特許出願第09／585,768号において説明されており、これは参照する
ことによりその全体が組み込まれる。
標識形態の混合物として提供することができる。特定のヌクレオチドについての
非標識形態の、そのヌクレオチドについての標識および非標識形態の総濃度に対
する濃度は、モル濃度ベースで少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％
、50％、55％または60％である。両形態の総量に対する非標識形態の濃度に関す
る上限は、典型的には、モル濃度ベースで80％、85％、90％または95％である。
特定の方法においては、非標識濃度は、典型的には、モル濃度ベースで30％ない
し95％である。別の方法においては、非標識形態は、一般には、モル濃度ベース
で50％ないし90％である。さらに別の方法においては、モル濃度ベースでの非標
識形態の標識形態に対する比は1：2である。商業的に入手可能な標識ヌクレオチ
ド（例えば、TAMRA−ddATP）は、時折、比較的低レベルの非標識形態（一般には
、約5％）を含むことがあるが、本発明において用いられる非標識形態の濃度は
そのようなレベルを上回るものであり、上記範囲に従うものである。標識および
非標識形態の混合物の使用は、伸長産生物へのヌクレオチドの取り込みの失敗を
減少させ、かつ異なる伸長産生物の信号強度を調節する上で有用であり得る。ヌ
クレオチドの標識および非標識形態の混合物の使用は、同時係属中の共通に所有
される米国特許出願第09／585,768号において説明されており、これは参照する
ことによりその全体が組み込まれる。
【００４７】
上述のように、幾つかの場合には、プライマーの3’末端が変位部位の数ヌク
レオチド5’側にある。この間隙内の標的核酸のヌクレオチドは分析する変位部
位を潜在的に占めるヌクレオチドを含むべきではない。そのような状況において
は、プライマーの3’末端と変位部位との間のヌクレオチドに相補的なデオキシ
ヌクレオチド三リン酸（dNTP）が伸長反応に含まれるべきである。
レオチド5’側にある。この間隙内の標的核酸のヌクレオチドは分析する変位部
位を潜在的に占めるヌクレオチドを含むべきではない。そのような状況において
は、プライマーの3’末端と変位部位との間のヌクレオチドに相補的なデオキシ
ヌクレオチド三リン酸（dNTP）が伸長反応に含まれるべきである。
【００４８】
まさに説明された鎖分離、アニーリングおよび伸長プロセスに対して成分を添
加するタイミングは変化し得る。例えば、反応は、まず標的核酸を変換して一本
鎖を形成し、プライマーを一本鎖の一方にアニールした後、ヌクレオチドおよび
ポリメラーゼの混合物を添加することによって行うことができる。その代わりに
、幾つかの方法においては、標的核酸、ヌクレオチドおよびポリメラーゼの混合
物を鎖分離およびプライマー・アニーリングに先立ってすべて組み合わせる。
加するタイミングは変化し得る。例えば、反応は、まず標的核酸を変換して一本
鎖を形成し、プライマーを一本鎖の一方にアニールした後、ヌクレオチドおよび
ポリメラーゼの混合物を添加することによって行うことができる。その代わりに
、幾つかの方法においては、標的核酸、ヌクレオチドおよびポリメラーゼの混合
物を鎖分離およびプライマー・アニーリングに先立ってすべて組み合わせる。
【００４９】
D．検出
伸長産生物の形成は、様々な直接または間接法によってプライマーへの標識の
取り込みを検出することにより検出する（図1Aを参照）。幾つかの場合には、最
初に伸長産生物を伸長反応混合物中の未反応反応体から分離した後に伸長産生物
を検出する。しかしながら、特定の技術を用いることで、そのような分離は不必
要であり、かつそれら方法を均一形式で行うことができる。
取り込みを検出することにより検出する（図1Aを参照）。幾つかの場合には、最
初に伸長産生物を伸長反応混合物中の未反応反応体から分離した後に伸長産生物
を検出する。しかしながら、特定の技術を用いることで、そのような分離は不必
要であり、かつそれら方法を均一形式で行うことができる。
【００５０】
1．分離ベースの方法
ひとたび伸長反応が完了したら、幾つかの場合には、分析を容易にするために
伸長プライマー産生物を非伸長プライマーおよび取り込まれなかった標識ヌクレ
オチドから分離する。検出工程を妨げるであろう成分を除去した後、伸長したプ
ライマーを標識の有無について分析することができる；伸長したプライマーに取
り込まれた標識ヌクレオチドは変位部位を占めるヌクレオチドの指標として役立
つ。
伸長プライマー産生物を非伸長プライマーおよび取り込まれなかった標識ヌクレ
オチドから分離する。検出工程を妨げるであろう成分を除去した後、伸長したプ
ライマーを標識の有無について分析することができる；伸長したプライマーに取
り込まれた標識ヌクレオチドは変位部位を占めるヌクレオチドの指標として役立
つ。
【００５１】
伸長したプライマーの他の反応成分からの分離は様々な方法で達成することが
できる。アプローチの1つにおいては、プライマーがアタッチメント部分を含み
、これはアフィニティ対の一方の成分であり、かつ伸長反応の他の成分からの伸
長したプライマーのアフィニティ精製を可能にする。典型的には、アタッチメン
ト部分はプライマーの5’末端またはその近傍に位置する。アフィニティ対の他
方のメンバーは、頻繁には、そのアフィニティ対の結合したメンバーによって標
識ヌクレオチドを含む伸長したプライマーが支持体に結合できるように、固体支
持体に固着される。
できる。アプローチの1つにおいては、プライマーがアタッチメント部分を含み
、これはアフィニティ対の一方の成分であり、かつ伸長反応の他の成分からの伸
長したプライマーのアフィニティ精製を可能にする。典型的には、アタッチメン
ト部分はプライマーの5’末端またはその近傍に位置する。アフィニティ対の他
方のメンバーは、頻繁には、そのアフィニティ対の結合したメンバーによって標
識ヌクレオチドを含む伸長したプライマーが支持体に結合できるように、固体支
持体に固着される。
【００５２】
伸長したプライマーの他の成分からの精製を達成するのに、様々な異なるアタ
ッチメント部分をアフィニティ対の一部として用いることができる。一般的な観
点では、アタッチメント部分およびアフィニティ対の他方の成分は互いに特異的
に結合することができる2つの作用物質を含む。そのような結合対の例には、こ
れらに限定されるものではないが、ポリヌクレオチド／相補的ポリヌクレオチド
、ビオチン／アビジン、抗原／抗体および重金属／チオール基が含まれる。幾つ
かの場合には、アフィニティ対の一方のメンバーは固体支持体に固着される。次
に、そのアフィニティ対の相補的メンバーを担持するプライマーを含む（または
潜在的に含む）溶液をその支持体と接触させる。2種類の成分に結合して複合体
を形成する機会を与えた後、伸長反応混合物中の他の種を支持体から洗い流すこ
とができる。
ッチメント部分をアフィニティ対の一部として用いることができる。一般的な観
点では、アタッチメント部分およびアフィニティ対の他方の成分は互いに特異的
に結合することができる2つの作用物質を含む。そのような結合対の例には、こ
れらに限定されるものではないが、ポリヌクレオチド／相補的ポリヌクレオチド
、ビオチン／アビジン、抗原／抗体および重金属／チオール基が含まれる。幾つ
かの場合には、アフィニティ対の一方のメンバーは固体支持体に固着される。次
に、そのアフィニティ対の相補的メンバーを担持するプライマーを含む（または
潜在的に含む）溶液をその支持体と接触させる。2種類の成分に結合して複合体
を形成する機会を与えた後、伸長反応混合物中の他の種を支持体から洗い流すこ
とができる。
【００５３】
したがって、例としてであって限定としてではないが、適切な配置の1つにお
いては、アタッチメント部分はプライマーへの5’伸長として機能するポリヌク
レオチドである。相補的ヌクレオチドを固体支持体に固着し、伸長プライマーを
選択的に結合することができる。その代わりに、抗原がアタッチメント部分とし
て機能し、それらに特異的な抗体が支持体に固着される。さらに別の配置におい
ては、チオール基をプライマーに連結させ、アタッチメント部分として機能させ
る。このチオール化プライマーを選択的に結合するのに固体支持体に固着された
重金属基を用いることができる。
いては、アタッチメント部分はプライマーへの5’伸長として機能するポリヌク
レオチドである。相補的ヌクレオチドを固体支持体に固着し、伸長プライマーを
選択的に結合することができる。その代わりに、抗原がアタッチメント部分とし
て機能し、それらに特異的な抗体が支持体に固着される。さらに別の配置におい
ては、チオール基をプライマーに連結させ、アタッチメント部分として機能させ
る。このチオール化プライマーを選択的に結合するのに固体支持体に固着された
重金属基を用いることができる。
【００５４】
アタッチメント部分は伸長反応を妨げることがないプライマーのあらゆる点に
固着させることができる。最も典型的には、アタッチメント部分はプライマーの
5’末端またはその近傍に固着させる。しかしながら、幾つかの場合には、アタ
ッチメント部分をより内部に位置するヌクレオチドに接続させる。
固着させることができる。最も典型的には、アタッチメント部分はプライマーの
5’末端またはその近傍に固着させる。しかしながら、幾つかの場合には、アタ
ッチメント部分をより内部に位置するヌクレオチドに接続させる。
【００５５】
アタッチメント部分をプライマーに固着させる代わりに、幾つかの方法におい
ては、アタッチメント部分はヌクレオチドの一部である。このアタッチメント部
分は、例えば、上記アフィニティ対の群から選択することができる（また、Eyal
らの米国特許第5,710,028号も参照）。その代わりに、ヌクレオチド上の蛍光色
素標識に特異的な抗体（例えば、ハプテンとしてのフルオレセインに対して誘発
された抗体）を得ることもできる。そのような抗体は考察されている（Voss, E.
W., Jr. (ed) Fluorescein Hapten: An Immunological Probeを参照）。
ては、アタッチメント部分はヌクレオチドの一部である。このアタッチメント部
分は、例えば、上記アフィニティ対の群から選択することができる（また、Eyal
らの米国特許第5,710,028号も参照）。その代わりに、ヌクレオチド上の蛍光色
素標識に特異的な抗体（例えば、ハプテンとしてのフルオレセインに対して誘発
された抗体）を得ることもできる。そのような抗体は考察されている（Voss, E.
W., Jr. (ed) Fluorescein Hapten: An Immunological Probeを参照）。
【００５６】
様々な異なるタイプの支持体をアフィニティ結合対を用いる方法において用い
ることができる。適切な支持体には、これらに限定されるものではないが、ビー
ズ、マイクロカプセル、マクロタイターウェルの表面、濾紙およびガラススライ
ドが含まれる。同様に、支持体は結合および洗浄条件に対して安定であるあらゆ
る物質から形成することができ、これには、例えば、ガラス、ポリスチレン、セ
ルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デ
キストランおよびアガロースが含まれる。
ることができる。適切な支持体には、これらに限定されるものではないが、ビー
ズ、マイクロカプセル、マクロタイターウェルの表面、濾紙およびガラススライ
ドが含まれる。同様に、支持体は結合および洗浄条件に対して安定であるあらゆ
る物質から形成することができ、これには、例えば、ガラス、ポリスチレン、セ
ルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デ
キストランおよびアガロースが含まれる。
【００５７】
アタッチメント部分およびアフィニティ結合対を用いる代わりとして、様々な
サイズベースの方法、例えば、ゲル電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィ
（例えば、HPLC）によって伸長したプライマーを他の反応成分から分離すること
ができる。幾つかの方法においては、ゲル電気泳動による成分の分離および検出
工程（典型的には、取り込まれたヌクレオチドを介して伸長したプライマーに固
着した蛍光標識からの蛍光の検出）を単一の統合機器、例えば、Applied Biosys
tems製のPrizm DNA Sequencers、およびMolecular Dynamics製のMegaBACEを用い
て行う。分離を必要としない他の選択肢は、取り込まれないヌクレオチドと会合
する標識を選択的に不活性化することである。
サイズベースの方法、例えば、ゲル電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィ
（例えば、HPLC）によって伸長したプライマーを他の反応成分から分離すること
ができる。幾つかの方法においては、ゲル電気泳動による成分の分離および検出
工程（典型的には、取り込まれたヌクレオチドを介して伸長したプライマーに固
着した蛍光標識からの蛍光の検出）を単一の統合機器、例えば、Applied Biosys
tems製のPrizm DNA Sequencers、およびMolecular Dynamics製のMegaBACEを用い
て行う。分離を必要としない他の選択肢は、取り込まれないヌクレオチドと会合
する標識を選択的に不活性化することである。
【００５８】
2．均質アッセイ
特定の方法は、伸長産生物を他の伸長反応成分（例えば、伸長していないプラ
イマーおよび組み込まれていないヌクレオチド）から分離する必要がない均質ア
ッセイにおいて行う。幾つかの方法においては、これは、蛍光共鳴エネルギー移
動対を含むドナーおよびアクセプター蛍光体を用いて達成する。これらの蛍光体
は、一方の蛍光体（すなわち、ドナー蛍光体）の発光スペクトルが他方の蛍光体
（すなわち、アクセプター蛍光体）の励起スペクトルと重複するように選択され
る。
イマーおよび組み込まれていないヌクレオチド）から分離する必要がない均質ア
ッセイにおいて行う。幾つかの方法においては、これは、蛍光共鳴エネルギー移
動対を含むドナーおよびアクセプター蛍光体を用いて達成する。これらの蛍光体
は、一方の蛍光体（すなわち、ドナー蛍光体）の発光スペクトルが他方の蛍光体
（すなわち、アクセプター蛍光体）の励起スペクトルと重複するように選択され
る。
【００５９】
そのような方法で、標識ヌクレオチドがドナー／アクセプター色素対の一方の
メンバーを担持し、他方のメンバーがプライマーに固着される。プライマーは、
標識ヌクレオチドが取り込まれるとドナーおよびアクセプターがドナーからアク
セプターに蛍光エネルギーが移動可能であるエネルギー移動関係となるような位
置で標識することができる。エネルギー移動の結果として生じる蛍光変化（例え
ば、ドナーの蛍光強度の減少またはアクセプターの蛍光強度の増加）を測定する
ことにより、伸長産生物を未反応反応体から分離させることなく、プライマーへ
の標識の取り込みを検出することができる。このような方法において用いるため
の具体的な標識は以下に標識に関するセクションにおいて論じられる。このよう
な方法に関するさらなる指針は米国特許第5,945,283号に記載されている。
メンバーを担持し、他方のメンバーがプライマーに固着される。プライマーは、
標識ヌクレオチドが取り込まれるとドナーおよびアクセプターがドナーからアク
セプターに蛍光エネルギーが移動可能であるエネルギー移動関係となるような位
置で標識することができる。エネルギー移動の結果として生じる蛍光変化（例え
ば、ドナーの蛍光強度の減少またはアクセプターの蛍光強度の増加）を測定する
ことにより、伸長産生物を未反応反応体から分離させることなく、プライマーへ
の標識の取り込みを検出することができる。このような方法において用いるため
の具体的な標識は以下に標識に関するセクションにおいて論じられる。このよう
な方法に関するさらなる指針は米国特許第5,945,283号に記載されている。
【００６０】
3．間接法
代わりの検出法は、伸長反応の間にどのヌクレオチドがプライマーに取り込ま
れるのかの指標として、反応体濃度の変化を測定することである。蛍光偏光技術
をこの目的のために都合よく用いることができる。この技術は分子タンブリング
に基づいて大および小分子を区別することができる。大分子（例えば、標識伸長
産生物）は溶液中で小分子よりもゆっくりとタンブリングする。したがって、プ
ライマーに取り込まれた標識ヌクレオチドからの信号を溶液中でフリーの標識ヌ
クレオチドからのものと区別することができる（例えば、Chen et al., Genome
Research 9:492-8 (1999)、およびWalkerらの米国特許第5,593,867号を参照。こ
れらの両者は参照することによりその全体が組み込まれる）。
れるのかの指標として、反応体濃度の変化を測定することである。蛍光偏光技術
をこの目的のために都合よく用いることができる。この技術は分子タンブリング
に基づいて大および小分子を区別することができる。大分子（例えば、標識伸長
産生物）は溶液中で小分子よりもゆっくりとタンブリングする。したがって、プ
ライマーに取り込まれた標識ヌクレオチドからの信号を溶液中でフリーの標識ヌ
クレオチドからのものと区別することができる（例えば、Chen et al., Genome
Research 9:492-8 (1999)、およびWalkerらの米国特許第5,593,867号を参照。こ
れらの両者は参照することによりその全体が組み込まれる）。
【００６１】
4．標識
標識ヌクレオチドは直接もしくは間接的に検出可能である標識を担持するか、
またはヌクレオチドは、検出に先立つある点での、典型的には伸長反応の後での
選択的かつ迅速な標識を許容するように修飾されている。 ヌクレオチド、および任意にプライマーに結合する標識は、検出可能であり、
かつ伸長反応を大きく妨げる（例えば、検出不可能な量の伸長産生物が形成され
るように大きく妨害し、および／または変位部位のヌクレオチドの素性の正確な
決定が不可能であるように不一致の割合を上昇させる）ことのないあらゆる化合
物または分子であり得る。適切な標識には、これらに限定されるものではないが
、蛍光体、発色体、化学発光を放射する分子、磁気粒子、放射性同位体、質量標
識、電子高密度粒子、電気化学的に活性の分子、酵素、補因子、酵素の基質およ
び特異的結合パートナーを有するリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）。質
量標識は様々なモノマーから調製することができる。異なる数のモノマーを一緒
に結合させることにより、異なる分子量の質量標識を調製することができる。本
質的には、その質量標識が標的核酸へのプライマーのハイブリダイゼーションを
妨害しない限り、一緒に結合させ、次いでプライマーに固着できるあらゆるタイ
プのモノマーを用いることができる。
またはヌクレオチドは、検出に先立つある点での、典型的には伸長反応の後での
選択的かつ迅速な標識を許容するように修飾されている。 ヌクレオチド、および任意にプライマーに結合する標識は、検出可能であり、
かつ伸長反応を大きく妨げる（例えば、検出不可能な量の伸長産生物が形成され
るように大きく妨害し、および／または変位部位のヌクレオチドの素性の正確な
決定が不可能であるように不一致の割合を上昇させる）ことのないあらゆる化合
物または分子であり得る。適切な標識には、これらに限定されるものではないが
、蛍光体、発色体、化学発光を放射する分子、磁気粒子、放射性同位体、質量標
識、電子高密度粒子、電気化学的に活性の分子、酵素、補因子、酵素の基質およ
び特異的結合パートナーを有するリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）。質
量標識は様々なモノマーから調製することができる。異なる数のモノマーを一緒
に結合させることにより、異なる分子量の質量標識を調製することができる。本
質的には、その質量標識が標的核酸へのプライマーのハイブリダイゼーションを
妨害しない限り、一緒に結合させ、次いでプライマーに固着できるあらゆるタイ
プのモノマーを用いることができる。
【００６２】
多くの市販の機器が蛍光標識核酸の検出用に開発されているため、特定の方法
は蛍光分子を標識として用いる。様々な蛍光分子を標識として用いることができ
、これには、例えば、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体、ローダミン
およびローダミン誘導体、ナフチルアミンおよびナフチルアミン誘導体、シアニ
ンおよびシアニン誘導体、ベンズアミジゾール、エチジウム、プロピジウム、ア
ントラサイクリン、ミトラマイシン、アクリジン、アクチノマイシン、メロシア
ニン、クマリン、ピレン、クリセン、スチルベン、アントラセン、ナフタレン、
サリチル酸、ベンズ−2−オキサ−1−ジアゾール（別名、ベンゾフラザン）、フ
ルオレスカミンおよびbodipy色素が含まれる。
は蛍光分子を標識として用いる。様々な蛍光分子を標識として用いることができ
、これには、例えば、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体、ローダミン
およびローダミン誘導体、ナフチルアミンおよびナフチルアミン誘導体、シアニ
ンおよびシアニン誘導体、ベンズアミジゾール、エチジウム、プロピジウム、ア
ントラサイクリン、ミトラマイシン、アクリジン、アクチノマイシン、メロシア
ニン、クマリン、ピレン、クリセン、スチルベン、アントラセン、ナフタレン、
サリチル酸、ベンズ−2−オキサ−1−ジアゾール（別名、ベンゾフラザン）、フ
ルオレスカミンおよびbodipy色素が含まれる。
【００６３】
発光強度を高めるか、またはアッセイを簡単にするため検出プライマーおよび
／または検出産生物がエネルギー移動可能な蛍光色素で標識されている方法につ
いては、多くのドナー（またはレポーター）およびアクセプター（またはクエン
チャー）色素を利用することができる。ドナーおよびアクセプター色素の群の1
つはキサンテン色素、例えば、フルオレセイン色素およびローダミン色素を含む
。これらの色素の様々な誘導体を商業的に入手することができる。しばしば、こ
れらの色素のフェニル基に官能基を導入してオリゴヌクレオチドへの連結部位と
して機能させる。他の一般的な色素の群は、アルファまたはベータ位にアミノ基
を有するナフチルアミンを含む。この一般タイプの色素には、1−ジメチルアミ
ノナフチル−5−スルホネート、1−アニリノ−8−ナフタレンスルホネートおよ
び2−p−トルイジニル−6−ナフタレンスルホネートが含まれる。
／または検出産生物がエネルギー移動可能な蛍光色素で標識されている方法につ
いては、多くのドナー（またはレポーター）およびアクセプター（またはクエン
チャー）色素を利用することができる。ドナーおよびアクセプター色素の群の1
つはキサンテン色素、例えば、フルオレセイン色素およびローダミン色素を含む
。これらの色素の様々な誘導体を商業的に入手することができる。しばしば、こ
れらの色素のフェニル基に官能基を導入してオリゴヌクレオチドへの連結部位と
して機能させる。他の一般的な色素の群は、アルファまたはベータ位にアミノ基
を有するナフチルアミンを含む。この一般タイプの色素には、1−ジメチルアミ
ノナフチル−5−スルホネート、1−アニリノ−8−ナフタレンスルホネートおよ
び2−p−トルイジニル−6−ナフタレンスルホネートが含まれる。
【００６４】
他の色素には、3−フェニル−7−イソシアナトクマリン、アクリジン、例えば
、9−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ、ピレン、ベンゾ
キサジアゾール、並びにスチルベンが含まれる。さらなる色素には、3−（ε−
カルボキシペンチル）−3’−エチル−5，5’−ジメチルオキサ−カルボシアニ
ン（CYA）；6−カルボキシフルオレセイン（FAM）；5＆6−カルボキシローダミ
ン−110（R110）；6−カルボキシローダミン−6G（R6G）；N’，N’，N’，N’
−テトラメチル−6−カルボキシローダミン（TAMRA）；6−カルボキシ−X−ロー
ダミン（ROX）；2’，4’，5’，7’−テトラクロロ−4−7−ジクロロフルオレ
セイン（TET）；2’，7’−ジメトキシー4’，5’−6カルボキシローダミン（JO
E）；6−カルボキシ−2’4，4’，5’，7，7’−ヘキサクロロフルオレセイン（
HEX）；ALEXA；Cy3およびCy5が含まれる。これらの色素は様々な供給者、例えば
、Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corporation（Foster City、
CA）、Amersham Pharmacia Biotech（Piscataway、NJ）、およびMolecular Prob
es, Inc.（Eugene、OR）から商業的に入手することができる。
、9−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ、ピレン、ベンゾ
キサジアゾール、並びにスチルベンが含まれる。さらなる色素には、3−（ε−
カルボキシペンチル）−3’−エチル−5，5’−ジメチルオキサ−カルボシアニ
ン（CYA）；6−カルボキシフルオレセイン（FAM）；5＆6−カルボキシローダミ
ン−110（R110）；6−カルボキシローダミン−6G（R6G）；N’，N’，N’，N’
−テトラメチル−6−カルボキシローダミン（TAMRA）；6−カルボキシ−X−ロー
ダミン（ROX）；2’，4’，5’，7’−テトラクロロ−4−7−ジクロロフルオレ
セイン（TET）；2’，7’−ジメトキシー4’，5’−6カルボキシローダミン（JO
E）；6−カルボキシ−2’4，4’，5’，7，7’−ヘキサクロロフルオレセイン（
HEX）；ALEXA；Cy3およびCy5が含まれる。これらの色素は様々な供給者、例えば
、Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corporation（Foster City、
CA）、Amersham Pharmacia Biotech（Piscataway、NJ）、およびMolecular Prob
es, Inc.（Eugene、OR）から商業的に入手することができる。
【００６５】
本発明の方法と共に有効に用いることができるドナーおよびアクセプター対の
選択に関するさらなる指針には、Fluorescence Spectroscopy (Pesce et al., E
ds.) Marcel Dekker, New York, (1971)；White et al., Fluorescence Analysi
s: A Practical Approach, Marcel Dekker, New York, (1970)；Berlman, Handb
ook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd ed., Academic Pre
ss, New York, (1971)；Griffiths, Colour and Constitution of Organic Mole
cules, Academic Press, New York, (1976)；Indicators (Bishop, Ed.). Perga
mon Press, Oxford, 19723；および Haugland, Handbook of Fluorescent Probe
s and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene (1992)が含まれる。
選択に関するさらなる指針には、Fluorescence Spectroscopy (Pesce et al., E
ds.) Marcel Dekker, New York, (1971)；White et al., Fluorescence Analysi
s: A Practical Approach, Marcel Dekker, New York, (1970)；Berlman, Handb
ook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd ed., Academic Pre
ss, New York, (1971)；Griffiths, Colour and Constitution of Organic Mole
cules, Academic Press, New York, (1976)；Indicators (Bishop, Ed.). Perga
mon Press, Oxford, 19723；および Haugland, Handbook of Fluorescent Probe
s and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene (1992)が含まれる。
【００６６】
IV．トリアレリックおよびテトラアレリック変異部位
トリアレリックまたはテトラアレリック変異部位を有する標的核酸は、それぞ
れ、3種類および4種類の対立遺伝子形態を含む。換言すると、変異部位を潜在的
に占める異なるヌクレオチドの数は、それぞれ、3および4である。そのような標
的核酸の変異部位を分析するための方法は、一般には、ビアレリック変異部位を
分析するための方法に類似する。
れ、3種類および4種類の対立遺伝子形態を含む。換言すると、変異部位を潜在的
に占める異なるヌクレオチドの数は、それぞれ、3および4である。そのような標
的核酸の変異部位を分析するための方法は、一般には、ビアレリック変異部位を
分析するための方法に類似する。
【００６７】
例えば、図2に示されるように、トリアレリック変異部位を有する標的核酸を
分析するための特定の方法は、2種類の標識非伸長性ヌクレオチド（ddX1TP、ddY2 TP）および1種類の標識伸長性ヌクレオチド（dZ3TP）の存在下で伸長反応を行
うことを含む。これらのヌクレオチドは、テンプレート鎖の変異部位を潜在的に
占めるヌクレオチドに相補的であるように選択される（それぞれ、x、yおよびz
）。このような場合、伸長性ヌクレオチドは対立遺伝子形態のいずれに相補的で
あってもよい。しかしながら、変異部位下流のヌクレオチド（1つもしくは複数
）が潜在的に変異部位に存在するヌクレオチドのうちの1つと同じ場合、伸長性
ヌクレオチドをその変異部位下流のヌクレオチド（1つもしくは複数）に相補的
であるものとして選択することが有利であり得る。そのような実験環境において
は、プライマーの伸長は変異部位に位置するヌクレオチドと同じである下流ヌク
レオチドの各々まで変異部位の下流方向に継続する。前述のように、異なる対立
遺伝子に対する異なるサイズの伸長産生物の形成は、差別的標識のような他の基
準に加えて、サイズに基づいて異なる対立遺伝子形態を区別することを可能にす
ることにより、分析を簡単にすることができる。
分析するための特定の方法は、2種類の標識非伸長性ヌクレオチド（ddX1TP、ddY2 TP）および1種類の標識伸長性ヌクレオチド（dZ3TP）の存在下で伸長反応を行
うことを含む。これらのヌクレオチドは、テンプレート鎖の変異部位を潜在的に
占めるヌクレオチドに相補的であるように選択される（それぞれ、x、yおよびz
）。このような場合、伸長性ヌクレオチドは対立遺伝子形態のいずれに相補的で
あってもよい。しかしながら、変異部位下流のヌクレオチド（1つもしくは複数
）が潜在的に変異部位に存在するヌクレオチドのうちの1つと同じ場合、伸長性
ヌクレオチドをその変異部位下流のヌクレオチド（1つもしくは複数）に相補的
であるものとして選択することが有利であり得る。そのような実験環境において
は、プライマーの伸長は変異部位に位置するヌクレオチドと同じである下流ヌク
レオチドの各々まで変異部位の下流方向に継続する。前述のように、異なる対立
遺伝子に対する異なるサイズの伸長産生物の形成は、差別的標識のような他の基
準に加えて、サイズに基づいて異なる対立遺伝子形態を区別することを可能にす
ることにより、分析を簡単にすることができる。
【００６８】
図2は、変異部位下流に位置する1つ以上のヌクレオチドが変異部位を潜在的に
占めるヌクレオチドのうちの1つと同じであり、かつ伸長反応混合物中に含まれ
る伸長性ヌクレオチドがこれらのヌクレオチドに相補的であるときに形成され得
る、異なるタイプの伸長産生物を示す。一般には、反応混合物中に含まれる標識
非伸長性ヌクレオチドが変異部位のヌクレオチドのうちの1つに相補的である場
合、伸長は変異部位で終止する（プライマー−X1、プライマー−Y2およびプライ
マー−Z3で表される産生物）。しかしながら、テンプレートの変異部位のヌクレ
オチドが伸長反応に含まれる標識伸長性ヌクレオチドに相補的であるとき、下流
ヌクレオチドが変位部位のヌクレオチドと同じである限り、伸長は変位部位の下
流方向に継続し得る。
占めるヌクレオチドのうちの1つと同じであり、かつ伸長反応混合物中に含まれ
る伸長性ヌクレオチドがこれらのヌクレオチドに相補的であるときに形成され得
る、異なるタイプの伸長産生物を示す。一般には、反応混合物中に含まれる標識
非伸長性ヌクレオチドが変異部位のヌクレオチドのうちの1つに相補的である場
合、伸長は変異部位で終止する（プライマー−X1、プライマー−Y2およびプライ
マー−Z3で表される産生物）。しかしながら、テンプレートの変異部位のヌクレ
オチドが伸長反応に含まれる標識伸長性ヌクレオチドに相補的であるとき、下流
ヌクレオチドが変位部位のヌクレオチドと同じである限り、伸長は変位部位の下
流方向に継続し得る。
【００６９】
ひとたびテンプレート鎖中のヌクレオチドが変位部位のヌクレオチドとは異な
るものに遭遇すると、伸長は終止する。その異なるヌクレオチドが添加された非
伸長性ヌクレオチドのうちの1つに相補的である場合、伸長はその相補的非伸長
性ヌクレオチドを取り込むことで終止する（そのような産生物は図2においてプ
ライマー−（Z3）nX1またはプライマー−（Z3）nY1と表される（nは1以上である
））。しかしながら、テンプレート鎖中の異なるヌクレオチドが伸長反応中に存
在するヌクレオチドのいずれとも相補的ではない場合、伸長は、変異部位のヌク
レオチドと同じであるテンプレート鎖中の最後のヌクレオチドに対応する伸長性
ヌクレオチドの取り込みで終止する（この産生物は図2においてプライマー−（Z3 ）nで表され、ここでもnは1以上である）。
るものに遭遇すると、伸長は終止する。その異なるヌクレオチドが添加された非
伸長性ヌクレオチドのうちの1つに相補的である場合、伸長はその相補的非伸長
性ヌクレオチドを取り込むことで終止する（そのような産生物は図2においてプ
ライマー−（Z3）nX1またはプライマー−（Z3）nY1と表される（nは1以上である
））。しかしながら、テンプレート鎖中の異なるヌクレオチドが伸長反応中に存
在するヌクレオチドのいずれとも相補的ではない場合、伸長は、変異部位のヌク
レオチドと同じであるテンプレート鎖中の最後のヌクレオチドに対応する伸長性
ヌクレオチドの取り込みで終止する（この産生物は図2においてプライマー−（Z3 ）nで表され、ここでもnは1以上である）。
【００７０】
幾つかの場合においては、上述の技術（例えば、反応時間の制限、低濃度のポ
リメラーゼおよび低温）を用いることにより、変異部位の下流方向に継続した伸
長を伸長したプライマーが異なるヌクレオチドに到達する前に停止させることが
できる。異なる伸長産生物はヌクレオチドが担持する異なる標識により、および
任意にサイズにより、区別することができる（例えば、図2における対立遺伝子I
IIは対立遺伝子ＩおよびIIから生じるものとはサイズが異なる伸長産生物を生じ
得る）。
リメラーゼおよび低温）を用いることにより、変異部位の下流方向に継続した伸
長を伸長したプライマーが異なるヌクレオチドに到達する前に停止させることが
できる。異なる伸長産生物はヌクレオチドが担持する異なる標識により、および
任意にサイズにより、区別することができる（例えば、図2における対立遺伝子I
IIは対立遺伝子ＩおよびIIから生じるものとはサイズが異なる伸長産生物を生じ
得る）。
【００７１】
テトラアレリック変異部位を有する核酸を分析するための関連法が図3に示さ
れる。テトラアレリック部位を分析するための方法の一例においては、3種類の
標識非伸長性ヌクレオチド（ddX1TP、ddY2TPおよびddZ3TP）および1種類の標識
伸長性ヌクレオチド（dW4TP）を用いて反応を行う。ビアレリックおよびトリア
レリック状況について説明されるように、伸長反応に含まれる標識非伸長性ヌク
レオチドのうちの1つが変異部位のヌクレオチドに相補的である場合、伸長は変
異部位で終止する（このような産生物は、図3においてプライマー−X1、プライ
マー−Y2およびプライマー−Z3で表される）。しかしながら、伸長反応に含まれ
る標識伸長性ヌクレオチドが標的核酸の変異部位のヌクレオチドに相補的である
場合、伸長は変位部位の下流方向に継続し得る。この場合、変異部位の3’側の
伸長は非伸長性ヌクレオチドの取り込みで終止する。そのような産生物はプライ
マー−（W4）nX1、プライマー−（W4）nY2およびプライマー−（W4）nZ3で表さ
れ、nは1以上である。これらの様々な産生物は異なるヌクレオチドの差別的標識
、および任意に、伸長産生物の異なるサイズによって区別することができる。
れる。テトラアレリック部位を分析するための方法の一例においては、3種類の
標識非伸長性ヌクレオチド（ddX1TP、ddY2TPおよびddZ3TP）および1種類の標識
伸長性ヌクレオチド（dW4TP）を用いて反応を行う。ビアレリックおよびトリア
レリック状況について説明されるように、伸長反応に含まれる標識非伸長性ヌク
レオチドのうちの1つが変異部位のヌクレオチドに相補的である場合、伸長は変
異部位で終止する（このような産生物は、図3においてプライマー−X1、プライ
マー−Y2およびプライマー−Z3で表される）。しかしながら、伸長反応に含まれ
る標識伸長性ヌクレオチドが標的核酸の変異部位のヌクレオチドに相補的である
場合、伸長は変位部位の下流方向に継続し得る。この場合、変異部位の3’側の
伸長は非伸長性ヌクレオチドの取り込みで終止する。そのような産生物はプライ
マー−（W4）nX1、プライマー−（W4）nY2およびプライマー−（W4）nZ3で表さ
れ、nは1以上である。これらの様々な産生物は異なるヌクレオチドの差別的標識
、および任意に、伸長産生物の異なるサイズによって区別することができる。
【００７２】
V．変異部位の評点
特定の方法は、他の対立遺伝子を具体的に特定はしないものの同時に検出はす
るが、1つの特定の対立遺伝子を同定および検出するように設計される。このよ
うな方法は変異部位の評点と呼ばれる。このような評点法の一般的なアプローチ
が図4に示される。このような方法における反応は、典型的には、関心のある対
立遺伝子について標的核酸中に存在するヌクレオチドに相補的である単一の非伸
長性ヌクレオチド（ddX1TP）および3種類の伸長性ヌクレオチド（dNTP）を用い
て行う。集合的には、伸長性ヌクレオチドおよび非伸長性ヌクレオチドは、一般
に、4種類の塩基（すなわち、A、T、GおよびC）のすべてを含むように選択され
る。
るが、1つの特定の対立遺伝子を同定および検出するように設計される。このよ
うな方法は変異部位の評点と呼ばれる。このような評点法の一般的なアプローチ
が図4に示される。このような方法における反応は、典型的には、関心のある対
立遺伝子について標的核酸中に存在するヌクレオチドに相補的である単一の非伸
長性ヌクレオチド（ddX1TP）および3種類の伸長性ヌクレオチド（dNTP）を用い
て行う。集合的には、伸長性ヌクレオチドおよび非伸長性ヌクレオチドは、一般
に、4種類の塩基（すなわち、A、T、GおよびC）のすべてを含むように選択され
る。
【００７３】
試料が関心のある対立遺伝子（対立遺伝子Ｉ；ヌクレオチドxで表される）を
有する標的核酸のコピーを含む場合、プライマーは非伸長性ヌクレオチド（X）
を取り込むことによって伸長する。非伸長性ヌクレオチドの取り込みは伸長反応
を終止させ、3’末端にその非伸長性ヌクレオチドを含む伸長産生物（すなわち
、図4におけるプライマー−X1）の形成を生じる。他の対立遺伝子を含む標的核
酸は関心のある対立遺伝子に対応する伸長産生物とはサイズが異なる伸長産生物
を産生する。他の対立遺伝子の場合、プライマーは、まず、テンプレート鎖の変
異部位を占める塩基に相補的である伸長性ヌクレオチドを取り込むように伸長す
る。この伸長反応はテンプレートにおける関心のある対立遺伝子に対応する塩基
に到達するまで継続する。この点で、非伸長性ヌクレオチドが取り込まれ、伸長
反応が終止する。このような反応産生物が図4においてプライマー−（N）mX1と
表されており、ここでNはヌクレオチドX以外のヌクレオチドを表し、mは1以上で
ある。このように、関心のある対立遺伝子の伸長産生物は1ヌクレオチドだけ伸
長し、標的核酸の他の対立遺伝子形態は関心のある対立遺伝子の伸長産生物より
も少なくとも1塩基対長い伸長産生物を産生する。したがって、関心のある対立
遺伝子を、伸長産生物のサイズにより、試料中に存在する他の対立遺伝子から区
別する（すなわち、評点する）ことができる。
有する標的核酸のコピーを含む場合、プライマーは非伸長性ヌクレオチド（X）
を取り込むことによって伸長する。非伸長性ヌクレオチドの取り込みは伸長反応
を終止させ、3’末端にその非伸長性ヌクレオチドを含む伸長産生物（すなわち
、図4におけるプライマー−X1）の形成を生じる。他の対立遺伝子を含む標的核
酸は関心のある対立遺伝子に対応する伸長産生物とはサイズが異なる伸長産生物
を産生する。他の対立遺伝子の場合、プライマーは、まず、テンプレート鎖の変
異部位を占める塩基に相補的である伸長性ヌクレオチドを取り込むように伸長す
る。この伸長反応はテンプレートにおける関心のある対立遺伝子に対応する塩基
に到達するまで継続する。この点で、非伸長性ヌクレオチドが取り込まれ、伸長
反応が終止する。このような反応産生物が図4においてプライマー−（N）mX1と
表されており、ここでNはヌクレオチドX以外のヌクレオチドを表し、mは1以上で
ある。このように、関心のある対立遺伝子の伸長産生物は1ヌクレオチドだけ伸
長し、標的核酸の他の対立遺伝子形態は関心のある対立遺伝子の伸長産生物より
も少なくとも1塩基対長い伸長産生物を産生する。したがって、関心のある対立
遺伝子を、伸長産生物のサイズにより、試料中に存在する他の対立遺伝子から区
別する（すなわち、評点する）ことができる。
【００７４】
VI．多重化／プーリング
本発明の特定の方法を、複数の変異部位のヌクレオチドの素性を単一の反応に
おいて決定する多重化形式に拡張することができる。このような形式は、迅速な
配列決定を多くの遺伝子座および／または個体において同時に行うことを可能に
する。複数の部位は同じ標的核酸上の複数の部位であり得、そのような部位は同
じ遺伝子内に存在するか、または異なる遺伝子中の部位である。その代わりに、
複数の部位は異なる個体から得た標的核酸上の異なる部位でもあり得る。
おいて決定する多重化形式に拡張することができる。このような形式は、迅速な
配列決定を多くの遺伝子座および／または個体において同時に行うことを可能に
する。複数の部位は同じ標的核酸上の複数の部位であり得、そのような部位は同
じ遺伝子内に存在するか、または異なる遺伝子中の部位である。その代わりに、
複数の部位は異なる個体から得た標的核酸上の異なる部位でもあり得る。
【００７５】
特定の多重化法においては、異なる変異部位の各々に対するプライマーをそれ
らそれぞれの結合部位にアニールさせる。プライマーの一般構造および伸長反応
を実施するための方法は上述の通りである。ここでもやはり、伸長したプライマ
ーに取り込まれる標識ヌクレオチド（1つもしくは複数）が標的核酸の変異部位
に存在するヌクレオチド（1つもしくは複数）を同定するのに役立つ。
らそれぞれの結合部位にアニールさせる。プライマーの一般構造および伸長反応
を実施するための方法は上述の通りである。ここでもやはり、伸長したプライマ
ーに取り込まれる標識ヌクレオチド（1つもしくは複数）が標的核酸の変異部位
に存在するヌクレオチド（1つもしくは複数）を同定するのに役立つ。
【００７６】
複数の伸長産生物を様々な部位と相関させるため、幾つかの異なる策を用いて
どの伸長産生物がどの変異部位に対応するかの決定を助けることができる。選択
肢の1つは、異なる標識が異なる変異部位に用いられるように、ヌクレオチドを
差別的に標識することである。別のアプローチは、異なる長さのプライマーを用
い、形成される伸長産生物が異なるサイズのものであり、かつサイズ分画によっ
て（例えば、ゲル電気泳動によって）区別することができるようにすることを含
む。このアプローチを用いる場合、典型的にはサイズの相違は異なる伸長プライ
マーの区別を容易にするためにより大きいものではあるが、プライマーは1ヌク
レオチドという小ささで異なり得る。
どの伸長産生物がどの変異部位に対応するかの決定を助けることができる。選択
肢の1つは、異なる標識が異なる変異部位に用いられるように、ヌクレオチドを
差別的に標識することである。別のアプローチは、異なる長さのプライマーを用
い、形成される伸長産生物が異なるサイズのものであり、かつサイズ分画によっ
て（例えば、ゲル電気泳動によって）区別することができるようにすることを含
む。このアプローチを用いる場合、典型的にはサイズの相違は異なる伸長プライ
マーの区別を容易にするためにより大きいものではあるが、プライマーは1ヌク
レオチドという小ささで異なり得る。
【００７７】
その代わりに、プライマーを独特の識別子タグでタグ化することができる。幾
つかの異なるタグを用いることができる。幾つかの場合、特定の変異部位に存在
するヌクレオチドを同定するのに用いられる標識と共に第2標識が用いられる。
このような第2標識は検出可能であるあらゆるタイプの分子または化合物であり
得る（前記参照）。他の場合には、タグはアフィニティ対の一部であり、上述の
ように伸長したプライマーを他の伸長反応成分から分離する機能に加えて、異な
る伸長産生物を互いに分離するのを容易にする。適切なアフィニティ対には検出
法に関するセクションにおいて前述されるものが含まれる。
つかの異なるタグを用いることができる。幾つかの場合、特定の変異部位に存在
するヌクレオチドを同定するのに用いられる標識と共に第2標識が用いられる。
このような第2標識は検出可能であるあらゆるタイプの分子または化合物であり
得る（前記参照）。他の場合には、タグはアフィニティ対の一部であり、上述の
ように伸長したプライマーを他の伸長反応成分から分離する機能に加えて、異な
る伸長産生物を互いに分離するのを容易にする。適切なアフィニティ対には検出
法に関するセクションにおいて前述されるものが含まれる。
【００７８】
異なるサイズのプライマーまたはタグ化プライマーを用いる方法を、異なる標
識を異なる変位部位に用いるスキームと共に用いることができる。この方法にお
いては、単に1つの基準ではなく2つの基準に基づいて伸長産生物を同定し、かつ
互いに区別することができる。例えば、幾つかの方法においては、異なるヌクレ
オチドを異なる標識に固着させることができる。さらに、プライマーは異なる変
位部位のための異なるタグを含む。そうすることで、異なるタグおよび異なる標
識によって異なる伸長産生物を同定および／または分離することができる。
識を異なる変位部位に用いるスキームと共に用いることができる。この方法にお
いては、単に1つの基準ではなく2つの基準に基づいて伸長産生物を同定し、かつ
互いに区別することができる。例えば、幾つかの方法においては、異なるヌクレ
オチドを異なる標識に固着させることができる。さらに、プライマーは異なる変
位部位のための異なるタグを含む。そうすることで、異なるタグおよび異なる標
識によって異なる伸長産生物を同定および／または分離することができる。
【００７９】
これらの方法はプーリング研究において研究集団における変異部位の対立遺伝
子頻度を決定するのに用いることもできる。典型的には、これらのタイプの実験
において、異なる個体に由来するDNA試料を一緒にプールする。その後、本発明
の方法を混合テンプレートにおける各対立遺伝子の存在の分析に用いることがで
きる。各対立遺伝子の信号強度を参照セット（例えば、ヘテロ接合体、ホモ接合
体または両者の既知の比の混合物）と比較することにより、その集団における対
立遺伝子の普及を決定することができる。（プーリング研究の一般的な考察につ
いては、例えば、Breen G. et al., BioTechniques 28:464-468 (2000)；Risch
N. and Teng, J., Genome Res. 8:1273-1288 (1998)；Shaw, S.H. et al., Geno
mer Res. 8:111-123 (1998)；および Scott, D.A. et al., Am. J. Hum. Genet.
59:385-391 (1996) を参照。これらの各々は参照することによりその全体が組
み込まれる）。
子頻度を決定するのに用いることもできる。典型的には、これらのタイプの実験
において、異なる個体に由来するDNA試料を一緒にプールする。その後、本発明
の方法を混合テンプレートにおける各対立遺伝子の存在の分析に用いることがで
きる。各対立遺伝子の信号強度を参照セット（例えば、ヘテロ接合体、ホモ接合
体または両者の既知の比の混合物）と比較することにより、その集団における対
立遺伝子の普及を決定することができる。（プーリング研究の一般的な考察につ
いては、例えば、Breen G. et al., BioTechniques 28:464-468 (2000)；Risch
N. and Teng, J., Genome Res. 8:1273-1288 (1998)；Shaw, S.H. et al., Geno
mer Res. 8:111-123 (1998)；および Scott, D.A. et al., Am. J. Hum. Genet.
59:385-391 (1996) を参照。これらの各々は参照することによりその全体が組
み込まれる）。
【００８０】
VII．ジェノタイピング
二倍体生物は各遺伝子の2つのコピーを含む。二倍体生物のジェノタイピング
は、その生物が参照対立遺伝子の2つのコピーを含むのか（参照型ホモ接合体）
、参照および変異対立遺伝子の各々の1コピーを含むのか（すなわち、ヘテロ接
合体）、または変異対立遺伝子の2つのコピーを含むのか（すなわち、変異型ホ
モ接合体）を決定することを含む。ジェノタイピング分析を行うとき、1つの変
異部位を問いただすのに本発明の方法を用いることができる。しかしながら、多
重化／プーリングに関するセクションにおいて上述されるように、これらの方法
を個体群における対立遺伝子頻度に加えて、同じ遺伝子、異なる遺伝子またはそ
れらの組合せの多くの異なるDNA遺伝子座での個体の遺伝子型を決定するのに用
いることもできる。
は、その生物が参照対立遺伝子の2つのコピーを含むのか（参照型ホモ接合体）
、参照および変異対立遺伝子の各々の1コピーを含むのか（すなわち、ヘテロ接
合体）、または変異対立遺伝子の2つのコピーを含むのか（すなわち、変異型ホ
モ接合体）を決定することを含む。ジェノタイピング分析を行うとき、1つの変
異部位を問いただすのに本発明の方法を用いることができる。しかしながら、多
重化／プーリングに関するセクションにおいて上述されるように、これらの方法
を個体群における対立遺伝子頻度に加えて、同じ遺伝子、異なる遺伝子またはそ
れらの組合せの多くの異なるDNA遺伝子座での個体の遺伝子型を決定するのに用
いることもできる。
【００８１】
最も典型的には、SNPは2つの対立遺伝子形態からなり、すなわち、変異部位は
2つの異なるヌクレオチドのうちの一方を含む。試料は関心のある標的核酸の2つ
のコピーを代表する核酸を含み得る。分析はビアレリック標的核酸について前述
される通りである。特には、分析は、典型的には、異なる対立遺伝子形態に相補
的であるように選択される標識伸長性ヌクレオチドおよび標識非伸長性ヌクレオ
チドを含むヌクレオチドの混合物を用いて行われる。単一標識伸長プライマーの
形成は、その試料がホモ接合体に由来することを示す。取り込まれた標識ヌクレ
オチドが、その試料が参照型ホモ接合体に由来するのか、または変異型ホモ接合
体に由来するのかを示す。2標識伸長産生物の形成は、その試料がヘテロ接合体
に由来することを示す。
2つの異なるヌクレオチドのうちの一方を含む。試料は関心のある標的核酸の2つ
のコピーを代表する核酸を含み得る。分析はビアレリック標的核酸について前述
される通りである。特には、分析は、典型的には、異なる対立遺伝子形態に相補
的であるように選択される標識伸長性ヌクレオチドおよび標識非伸長性ヌクレオ
チドを含むヌクレオチドの混合物を用いて行われる。単一標識伸長プライマーの
形成は、その試料がホモ接合体に由来することを示す。取り込まれた標識ヌクレ
オチドが、その試料が参照型ホモ接合体に由来するのか、または変異型ホモ接合
体に由来するのかを示す。2標識伸長産生物の形成は、その試料がヘテロ接合体
に由来することを示す。
【００８２】
これらの方法は単一の反応容器内で行われるように設計される。したがって、
標的核酸の異なる対立遺伝子形態を区別するのに差別的に標識されたヌクレオチ
ドを用いる。2つを上回る対立遺伝子形態を有する変異部位については、トリア
レリックおよびテトラアレリック核酸について上述されるように反応を行うこと
ができる。
標的核酸の異なる対立遺伝子形態を区別するのに差別的に標識されたヌクレオチ
ドを用いる。2つを上回る対立遺伝子形態を有する変異部位については、トリア
レリックおよびテトラアレリック核酸について上述されるように反応を行うこと
ができる。
【００８３】
迅速なジェノタイピング決定をなすのに本発明の方法を用いる能力は、遺伝子
解析およびある疾患に対する個体の感受性の確認における強力なツールを提供す
る。特定の疾患に関連する対立遺伝子についてホモ接合である個体は、ヘテロ接
合であるか、または他の対立遺伝子についてホモ接合である者よりもその疾患に
罹患する危険性が高い。しかしながら、ヘテロ接合体は、その疾患に関する対立
遺伝子のキャリアである。そのような知識は、例えば、出生前並びに他のタイプ
の医学的および遺伝的カウンセリングにおいて有用であり得る。
解析およびある疾患に対する個体の感受性の確認における強力なツールを提供す
る。特定の疾患に関連する対立遺伝子についてホモ接合である個体は、ヘテロ接
合であるか、または他の対立遺伝子についてホモ接合である者よりもその疾患に
罹患する危険性が高い。しかしながら、ヘテロ接合体は、その疾患に関する対立
遺伝子のキャリアである。そのような知識は、例えば、出生前並びに他のタイプ
の医学的および遺伝的カウンセリングにおいて有用であり得る。
【００８４】
VIII．試料
A．標的核酸のタイプ
本発明の方法は、SNP並びに突然変異、例えば、塩基転位、塩基転換、挿入お
よび欠失を含むがこれらに限定されるものではない、様々な異なるタイプの変異
部位のヌクレオチドの素性を決定するのに用いることができる。試料中の標的核
酸の有無は、一般には、特定の部位での特定のヌクレオチドの有無として検出す
ることができる。特定の部位に位置する個々のヌクレオチドも本明細書に説明さ
れる方法によって同定することができる。
よび欠失を含むがこれらに限定されるものではない、様々な異なるタイプの変異
部位のヌクレオチドの素性を決定するのに用いることができる。試料中の標的核
酸の有無は、一般には、特定の部位での特定のヌクレオチドの有無として検出す
ることができる。特定の部位に位置する個々のヌクレオチドも本明細書に説明さ
れる方法によって同定することができる。
【００８５】
提示される方法は、一般には、デオキシリボ核酸、リボ核酸、またはそれらの
共重合体に適用可能である。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。標
的核酸には、例えばデオキシイノシンまたは7−デアザ−2−デオキシグアノシン
を含む、非天然ヌクレオチド類似体が含まれ得る。そのような類似体は二重鎖DN
Aを脱安定化し、二本鎖核酸において2本の鎖を完全に分離することなしにプライ
マーのアニーリングおよび伸長反応を生じさせる。幾つかの場合には、使用に先
立ち、RNA試料をまず逆転写してcDNAを形成させる。
共重合体に適用可能である。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。標
的核酸には、例えばデオキシイノシンまたは7−デアザ−2−デオキシグアノシン
を含む、非天然ヌクレオチド類似体が含まれ得る。そのような類似体は二重鎖DN
Aを脱安定化し、二本鎖核酸において2本の鎖を完全に分離することなしにプライ
マーのアニーリングおよび伸長反応を生じさせる。幾つかの場合には、使用に先
立ち、RNA試料をまず逆転写してcDNAを形成させる。
【００８６】
標的核酸は単により大きな核酸の断片であってもよく、または精製された別個
の分子として最初に存在していてもよい。加えて、標的核酸は核酸全体を構成し
ていてもよく、または核酸の複合混合物の画分であってもよい。標的核酸は、イ
ン・ビボで酵素的に合成することができるか、イン・ビトロで酵素的に合成する
ことができるか、または非酵素的に合成することができる。
の分子として最初に存在していてもよい。加えて、標的核酸は核酸全体を構成し
ていてもよく、または核酸の複合混合物の画分であってもよい。標的核酸は、イ
ン・ビボで酵素的に合成することができるか、イン・ビトロで酵素的に合成する
ことができるか、または非酵素的に合成することができる。
【００８７】
B．源
標的核酸はあらゆる源に由来するものであり得る。標的核酸を含む試料は天然
のものであっても、酵素もしくは有機合成技術を用いて合成されたものであって
もよい。同様に、試料はあらゆる生物から採取することができ、これには、これ
らに限定されるものではないが、植物、微生物（例えば、細菌、真菌およびウイ
ルス）、脊椎動物、無脊椎動物および哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、ウマ、
イヌ、ウシ、ブタおよびヒツジ）が含まれる。
のものであっても、酵素もしくは有機合成技術を用いて合成されたものであって
もよい。同様に、試料はあらゆる生物から採取することができ、これには、これ
らに限定されるものではないが、植物、微生物（例えば、細菌、真菌およびウイ
ルス）、脊椎動物、無脊椎動物および哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、ウマ、
イヌ、ウシ、ブタおよびヒツジ）が含まれる。
【００８８】
ゲノムDNAのアッセイについては、実質的にあらゆる生物学的試料（純粋な赤
血球細胞以外）が適切である。試料は生物（1種類もしくは複数種類）の組織ま
たは体液から得ることができる；試料は細胞培養物、組織ホモジネートから得る
こともでき、または上述のように合成することもできる。例えば、試料は全血、
血清、精液、唾液、涙、尿、糞便、汗、頬、皮膚、脊髄および毛髪から得ること
ができる。試料は、成長培地を含むイン・ビトロ細胞培養物、組換え細胞および
細胞成分から誘導することもできる。cDNAまたは逆転写されてcDNAを形成するmR
NAのアッセイについては、標的核酸が発現する器官から組織試料が得られる。例
えば、標的核酸がチトクロームP450である場合、肝臓が適切な源である。出生前
試験において用いるための試料は羊水から得ることができる。
血球細胞以外）が適切である。試料は生物（1種類もしくは複数種類）の組織ま
たは体液から得ることができる；試料は細胞培養物、組織ホモジネートから得る
こともでき、または上述のように合成することもできる。例えば、試料は全血、
血清、精液、唾液、涙、尿、糞便、汗、頬、皮膚、脊髄および毛髪から得ること
ができる。試料は、成長培地を含むイン・ビトロ細胞培養物、組換え細胞および
細胞成分から誘導することもできる。cDNAまたは逆転写されてcDNAを形成するmR
NAのアッセイについては、標的核酸が発現する器官から組織試料が得られる。例
えば、標的核酸がチトクロームP450である場合、肝臓が適切な源である。出生前
試験において用いるための試料は羊水から得ることができる。
【００８９】
標的核酸（1種類もしくは複数種類）は、生活生物に由来する物質を含むこと
が疑われる非生活の源から得ることもできる。例えば、法医学的分析のために得
られる試料の場合、衣服、家具、武器および犯罪現場で見出される他の品目から
標的核酸を得ることができる。
が疑われる非生活の源から得ることもできる。例えば、法医学的分析のために得
られる試料の場合、衣服、家具、武器および犯罪現場で見出される他の品目から
標的核酸を得ることができる。
【００９０】
C．試料の調製
幾つかの場合には、試料は、前増幅反応を行って標的核酸の濃度を高めること
が有用であるような低レベルの標的核酸を含む。試料を増幅しようとする場合、
増幅は、典型的には、公知手順に従うポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて行
う。一般には、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplif
ication (H.A. Erlich, Ed.) Freeman Press, NY, NY (1992)；PCR Protocols:
A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., Eds.) Academic Press
, San Diego, CA (1990)；Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19: 4967 (199
1)；Eckert et al., PCR Methods and Applications 1: 17 (1991)；PCR (McPhe
rson et al. Ed.), IRL Press, Oxford；並びに米国特許第4,683,202号および第
4,683,195号（これらの各々は参照することによりその全体が組み込まれる）を
参照のこと。他の適切な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（LCR）（例えば、Wu an
d Wallace, Genomics 4:560 (1989)および Landegren et al., Science 241:107
7 (1988)を参照）；転写増幅（例えば、Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:1173 (1989)を参照）；自己持続配列複製（例えば、Guatelli et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874 (1990)を参照）；および核酸ベースの配
列増幅（NABSA）（例えば、Sooknanan, R. and Malek, L., Bio Technology 13:
563-65 (1995)を参照）が含まれ、これらの各々は参照することによりその全体
が組み込まれる。
が有用であるような低レベルの標的核酸を含む。試料を増幅しようとする場合、
増幅は、典型的には、公知手順に従うポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて行
う。一般には、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplif
ication (H.A. Erlich, Ed.) Freeman Press, NY, NY (1992)；PCR Protocols:
A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., Eds.) Academic Press
, San Diego, CA (1990)；Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19: 4967 (199
1)；Eckert et al., PCR Methods and Applications 1: 17 (1991)；PCR (McPhe
rson et al. Ed.), IRL Press, Oxford；並びに米国特許第4,683,202号および第
4,683,195号（これらの各々は参照することによりその全体が組み込まれる）を
参照のこと。他の適切な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（LCR）（例えば、Wu an
d Wallace, Genomics 4:560 (1989)および Landegren et al., Science 241:107
7 (1988)を参照）；転写増幅（例えば、Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:1173 (1989)を参照）；自己持続配列複製（例えば、Guatelli et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874 (1990)を参照）；および核酸ベースの配
列増幅（NABSA）（例えば、Sooknanan, R. and Malek, L., Bio Technology 13:
563-65 (1995)を参照）が含まれ、これらの各々は参照することによりその全体
が組み込まれる。
【００９１】
核酸試料調製に関するさらなる指針は、Sambrook, et al., Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1
989)（これは参照することによりその全体が組み込まれる）に記載されている。
g: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1
989)（これは参照することによりその全体が組み込まれる）に記載されている。
【００９２】
IX．キット
本明細書で説明される配列およびジェノタイピング決定を実施するためのキッ
トも本発明によって提供される。典型的には、これらのキットは、関心のある標
的核酸のセグメントに特異的にハイブリダイズする1以上のプライマーを含む。
ひとたび標的核酸にハイブリダイズすると、プライマーの3’末端が標的核酸の
変異部位に隣接する。しばしば、プライマーは、1以上のSNP、特には疾患と関連
するもの（前記参照）の分析において用いるために設計される。キットに含まれ
るプライマーの数は変化し得る。一般には、キットは少なくとも2、3、4または5
のプライマーを含む。他のキットはより多くのプライマー、例えば、少なくとも
10、15、20または25プライマーを含むことができる。特定のキットにおいては、
検出／分離プロセスを容易にするため、プライマーは標識またはアタッチメント
部分も担持する。
トも本発明によって提供される。典型的には、これらのキットは、関心のある標
的核酸のセグメントに特異的にハイブリダイズする1以上のプライマーを含む。
ひとたび標的核酸にハイブリダイズすると、プライマーの3’末端が標的核酸の
変異部位に隣接する。しばしば、プライマーは、1以上のSNP、特には疾患と関連
するもの（前記参照）の分析において用いるために設計される。キットに含まれ
るプライマーの数は変化し得る。一般には、キットは少なくとも2、3、4または5
のプライマーを含む。他のキットはより多くのプライマー、例えば、少なくとも
10、15、20または25プライマーを含むことができる。特定のキットにおいては、
検出／分離プロセスを容易にするため、プライマーは標識またはアタッチメント
部分も担持する。
【００９３】
これらのキットは、典型的には、標識伸長性ヌクレオチドおよび標識非伸長性
ヌクレオチドも含む。任意に、これらのヌクレオチドを合わせて混合物を形成す
ることができる。含まれるヌクレオチドは、典型的には、関心のある変位部位を
潜在的に占めるヌクレオチドに相補的である。標識ヌクレオチドは上述の標識の
いずれのタイプをも担持することができる。一般には、標識は蛍光体、例えば、
FAM、ROX、TAMRA、R110、R6G、Joe、HEX、TET、Alexa、Cy3またはCy5である。
ヌクレオチドも含む。任意に、これらのヌクレオチドを合わせて混合物を形成す
ることができる。含まれるヌクレオチドは、典型的には、関心のある変位部位を
潜在的に占めるヌクレオチドに相補的である。標識ヌクレオチドは上述の標識の
いずれのタイプをも担持することができる。一般には、標識は蛍光体、例えば、
FAM、ROX、TAMRA、R110、R6G、Joe、HEX、TET、Alexa、Cy3またはCy5である。
【００９４】
これらのキットは、例えばポリメラーゼおよびバッファを含む、テンプレート
依存性伸長反応を実施するための様々な他の成分を含むことができる。キットは
、分析の間に形成される伸長産生物をサイズ分離するのに必要な電気泳動成分を
含むこともできる。このような成分には、ゲルポリマー（例えば、アガロース）
、重合剤およびバッファが含まれる。典型的には、これらのキットは様々な成分
を収容するための容器およびそのキットの構成要素を用いて分析を実施するため
の取扱説明書も含む。
依存性伸長反応を実施するための様々な他の成分を含むことができる。キットは
、分析の間に形成される伸長産生物をサイズ分離するのに必要な電気泳動成分を
含むこともできる。このような成分には、ゲルポリマー（例えば、アガロース）
、重合剤およびバッファが含まれる。典型的には、これらのキットは様々な成分
を収容するための容器およびそのキットの構成要素を用いて分析を実施するため
の取扱説明書も含む。
【００９５】
Ｘ．有用性
本発明の方法、組成物及びキットは、一般には、変位部位のヌクレオチドの素
性を決定するのに有用である。しかしながら、これらの方法には様々なより具体
的な用途において用途が見出される。用途の1つは、点突然変異（例えば、体性
点突然変異）、特には疾患と相関する突然変異の同定および検出である。例えば
、本明細書で説明される方法は、特定の被験者に由来する核酸が特定のSNP部位
に野生型対立遺伝子を含むのか、または突然変異対立遺伝子を含むのかを同定す
るのに有用である。さらに、これらの方法は、試験する個体の遺伝型を確立する
（すなわち、その個体が参照型ホモ接合体であるか、ヘテロ接合体であるのか、
または変異型ホモ接合体であるのかを区別する）のに用いることができる。
性を決定するのに有用である。しかしながら、これらの方法には様々なより具体
的な用途において用途が見出される。用途の1つは、点突然変異（例えば、体性
点突然変異）、特には疾患と相関する突然変異の同定および検出である。例えば
、本明細書で説明される方法は、特定の被験者に由来する核酸が特定のSNP部位
に野生型対立遺伝子を含むのか、または突然変異対立遺伝子を含むのかを同定す
るのに有用である。さらに、これらの方法は、試験する個体の遺伝型を確立する
（すなわち、その個体が参照型ホモ接合体であるか、ヘテロ接合体であるのか、
または変異型ホモ接合体であるのかを区別する）のに用いることができる。
【００９６】
本発明のジェノタイピング有用性は、医学的な診断および予後予測の脈絡内で
それらを有用なものとする。多くのSNPは様々な疾患に関連するため、臨床医は
この遺伝子型研究の結果を、疾患の存在、個体が疾患のキャリアであるかどうか
、個体が特定の疾患に罹患する可能性および様々な治療代替法の効力の見込みを
評価するのに用いることができる。
それらを有用なものとする。多くのSNPは様々な疾患に関連するため、臨床医は
この遺伝子型研究の結果を、疾患の存在、個体が疾患のキャリアであるかどうか
、個体が特定の疾患に罹患する可能性および様々な治療代替法の効力の見込みを
評価するのに用いることができる。
【００９７】
これらの方法は様々な非医学的用途をも有する。そのような有用性には、病原
性微生物の検出、父子鑑定試験および法医学的分析が含まれる。これらの方法は
、例えば他の動物、植物、細菌及びウイルスを含む、非ヒトにおけるSNPの同定
に用いることもできる。 これらの様々な用途を以下でより完全に説明する。
性微生物の検出、父子鑑定試験および法医学的分析が含まれる。これらの方法は
、例えば他の動物、植物、細菌及びウイルスを含む、非ヒトにおけるSNPの同定
に用いることもできる。 これらの様々な用途を以下でより完全に説明する。
【００９８】
A．相関研究
診断情報の獲得への本発明の方法の使用は、共通の疾患に罹患していることが
既知である多くの異なる個体から試料を得、スクリーニング試験を行ってそれら
が一貫して1つ以上のSNP部位で共通の遺伝子型を共有するのかどうかを決定する
ことを含む。そのようなスクリーニングの結果は特定の遺伝子型と特定の疾患と
の相関を確立するのに用いることができる。
既知である多くの異なる個体から試料を得、スクリーニング試験を行ってそれら
が一貫して1つ以上のSNP部位で共通の遺伝子型を共有するのかどうかを決定する
ことを含む。そのようなスクリーニングの結果は特定の遺伝子型と特定の疾患と
の相関を確立するのに用いることができる。
【００９９】
関連する様式においては、特定の遺伝子型と患者の予後予測との相関を開発す
るのに本発明の方法を用いることができる。例えば、共通の疾患に罹患する個体
集団の遺伝子型を1つ以上のSNP部位で決定することができる。それらの個体の健
康履歴を経時的に監視して特定の遺伝子型と疾患の結果との相関を確立すること
ができる。
るのに本発明の方法を用いることができる。例えば、共通の疾患に罹患する個体
集団の遺伝子型を1つ以上のSNP部位で決定することができる。それらの個体の健
康履歴を経時的に監視して特定の遺伝子型と疾患の結果との相関を確立すること
ができる。
【０１００】
本発明の方法は特定の疾患に最適な治療プロトコルを処方するのに用いること
もできる。例えば、特定の薬物を代謝する個体の能力を特定の遺伝子型（1つも
しくは複数）に関連付けることができる。本明細書で説明される方法を、共通の
表現型および遺伝子型を共有する群に個体を配分するのに用いることができる。
これらの群は、次に、各々が異なる形態の治療を受ける様々な群に細分すること
ができる。異なる治療群の健康状態を全時間にわたって監視することにより、特
定の遺伝子型に対して最も有効な治療プログラムを確立することができる。
もできる。例えば、特定の薬物を代謝する個体の能力を特定の遺伝子型（1つも
しくは複数）に関連付けることができる。本明細書で説明される方法を、共通の
表現型および遺伝子型を共有する群に個体を配分するのに用いることができる。
これらの群は、次に、各々が異なる形態の治療を受ける様々な群に細分すること
ができる。異なる治療群の健康状態を全時間にわたって監視することにより、特
定の遺伝子型に対して最も有効な治療プログラムを確立することができる。
【０１０１】
B．スクリーニングおよび治療用ツールとしての現行法の使用
特定の遺伝子型と疾患状態または薬物応答との相関が既に確立されている場合
、本発明の方法を診断用ツール、予後予測ツールおよび治療を最適化するための
手段として用いることができる。
、本発明の方法を診断用ツール、予後予測ツールおよび治療を最適化するための
手段として用いることができる。
【０１０２】
疾患の症状を示す患者に対して、その患者が示す症状を共通に生じる疾患に関
連することが知られる遺伝子型をその患者が有するかどうかを決定するのに本発
明の方法を用いることができる。例えば、本発明のジェノタイピング法が、その
個体がその疾患に関連する遺伝子型を有し、さらにその遺伝子型が回復の見込み
が薄いことに関連する（例えば、変異型ホモ接合体）ことを示す場合、医師は患
者に、積極的治療の選択肢に見込まれる有効性および、特にその疾患が非常に進
行している場合、そのような治療を単に見送る選択肢に関して助言することがで
きる。他方、遺伝子型が良好な回復に関連する場合、医師は、単に疾患を監視し
て状態が悪化するかどうかを診ることから悪化する前に疾患が攻撃されることを
保証するより積極的な測定までを変化する治療選択肢の範囲を説明することがで
きる。
連することが知られる遺伝子型をその患者が有するかどうかを決定するのに本発
明の方法を用いることができる。例えば、本発明のジェノタイピング法が、その
個体がその疾患に関連する遺伝子型を有し、さらにその遺伝子型が回復の見込み
が薄いことに関連する（例えば、変異型ホモ接合体）ことを示す場合、医師は患
者に、積極的治療の選択肢に見込まれる有効性および、特にその疾患が非常に進
行している場合、そのような治療を単に見送る選択肢に関して助言することがで
きる。他方、遺伝子型が良好な回復に関連する場合、医師は、単に疾患を監視し
て状態が悪化するかどうかを診ることから悪化する前に疾患が攻撃されることを
保証するより積極的な測定までを変化する治療選択肢の範囲を説明することがで
きる。
【０１０３】
本発明の方法は、疾患に罹患し易いことが知られる個体（例えば、罹患履歴を
有する家族からの個体）の実際の危険性を評価するのにも有用である。その個体
が疾患に関連するSNPについてホモ接合であるのかまたはヘテロ接合であるのか
を決定することにより、医師は、その患者が罹患し始める可能性、疾患の誘発に
関与する因子および異なる治療代替法に関する可否に関してより現実的に評価し
、かつ患者に助言することができる。
有する家族からの個体）の実際の危険性を評価するのにも有用である。その個体
が疾患に関連するSNPについてホモ接合であるのかまたはヘテロ接合であるのか
を決定することにより、医師は、その患者が罹患し始める可能性、疾患の誘発に
関与する因子および異なる治療代替法に関する可否に関してより現実的に評価し
、かつ患者に助言することができる。
【０１０４】
同様に、本発明の特定の方法は疾患の危険性のある個体を同定するのに、たと
えそれらに疾患の症状がなく、または疾患に対する既知の感受性がないとしても
用いることができる。この範疇にある個体は、一般に、疾患の症状がなく、かつ
疾患の家族歴がない。そのような場合、本発明の方法を有用な予防的スクリーニ
ングツールとして用いることができる。本発明の方法を用いることで、特定の疾
患に関連することが知られる幾つかの選択されたSNP部位を問い合わせてその個
体のそれらの部位での遺伝子型を同定することができる。特定の疾患に関連する
ことが知られる遺伝子型が同定された場合、医師はその個体に、その疾患が現れ
る可能性および利用可能な治療選択肢の範囲に関して助言することができる。
えそれらに疾患の症状がなく、または疾患に対する既知の感受性がないとしても
用いることができる。この範疇にある個体は、一般に、疾患の症状がなく、かつ
疾患の家族歴がない。そのような場合、本発明の方法を有用な予防的スクリーニ
ングツールとして用いることができる。本発明の方法を用いることで、特定の疾
患に関連することが知られる幾つかの選択されたSNP部位を問い合わせてその個
体のそれらの部位での遺伝子型を同定することができる。特定の疾患に関連する
ことが知られる遺伝子型が同定された場合、医師はその個体に、その疾患が現れ
る可能性および利用可能な治療選択肢の範囲に関して助言することができる。
【０１０５】
さらに別の用途においては、本発明は患者に最適な治療の処方において有用で
あり得る。例えば、薬物に対する個体の応答を彼または彼女の遺伝子型に基づい
て予測することができる。この情報は、副作用が最小限である最も有効な医薬を
医師が処方することを可能にする。
あり得る。例えば、薬物に対する個体の応答を彼または彼女の遺伝子型に基づい
て予測することができる。この情報は、副作用が最小限である最も有効な医薬を
医師が処方することを可能にする。
【０１０６】
C．監視することができる疾患の例
多数の疾患がSNPの特定の対立遺伝子形態と相関することが示されている。多
数のそのようなSPNがWO 93／02216およびCooperら（Hum. Genet. 85:55-74 (199
0)）に列挙されており、これらの両者は参照することによりそれらの全体がここ
に組み込まれる。SNPに関連する疾患の具体的な例には：鎌状赤血球貧血および
β−地中海貧血症（β−グロビン遺伝子における突然変異；Antonarakis, New E
ng. J. Med., 320:153-163 (1989)）、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜受容体（C
FTR）における突然変異；Kerem, et al., Science 245:1073-1080 (1989)を参照
）、高リポタンパク血症（アポリポタンパク質E遺伝子における突然変異；Mahle
y, Science 240:622-630 (1988)を参照）、様々な自己免疫疾患（ヒト主要組織
適合複合体における突然変異；Thomson, Ann. Rev. Genet., 22:31-50 (1988)；
Morel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8111-8115 (1988)；および Sc
harf, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:3504-3508 (1988)を参照）並
びに癌遺伝子の形成（ヒトras遺伝子ファミリーに対する突然変異；例えば、Bos
et al., Nature, 315:726-730 (1985)；Farr et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 85:1629-1633 (1988)；および Neri, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 85:9268-9272 (1988)を参照）が含まれる。疾患に関連するSNPを含む他の遺
伝子には、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン変換酵素、コレステロー
ルエステル転移タンパク質、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、およびHIV
逆転写酵素（RT）をコードする遺伝子が含まれる。
数のそのようなSPNがWO 93／02216およびCooperら（Hum. Genet. 85:55-74 (199
0)）に列挙されており、これらの両者は参照することによりそれらの全体がここ
に組み込まれる。SNPに関連する疾患の具体的な例には：鎌状赤血球貧血および
β−地中海貧血症（β−グロビン遺伝子における突然変異；Antonarakis, New E
ng. J. Med., 320:153-163 (1989)）、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜受容体（C
FTR）における突然変異；Kerem, et al., Science 245:1073-1080 (1989)を参照
）、高リポタンパク血症（アポリポタンパク質E遺伝子における突然変異；Mahle
y, Science 240:622-630 (1988)を参照）、様々な自己免疫疾患（ヒト主要組織
適合複合体における突然変異；Thomson, Ann. Rev. Genet., 22:31-50 (1988)；
Morel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8111-8115 (1988)；および Sc
harf, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:3504-3508 (1988)を参照）並
びに癌遺伝子の形成（ヒトras遺伝子ファミリーに対する突然変異；例えば、Bos
et al., Nature, 315:726-730 (1985)；Farr et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 85:1629-1633 (1988)；および Neri, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 85:9268-9272 (1988)を参照）が含まれる。疾患に関連するSNPを含む他の遺
伝子には、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン変換酵素、コレステロー
ルエステル転移タンパク質、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、およびHIV
逆転写酵素（RT）をコードする遺伝子が含まれる。
【０１０７】
D．他の使用
本明細書で説明される方法は、変化した病原性または特定の治療に対する耐性
を潜在的に生じ得る病原体における点突然変異の同定に用いることもできる。ま
た、これらの方法は、様々なバイオテクノロジー用途において用いるのに望まし
い遺伝的構成を有する細胞及び株の同定に用いることもできる。本明細書で説明
される方法は、例えば癌を含む、様々な疾患を生じ得る体性突然変異の存在を検
出することもできる。
を潜在的に生じ得る病原体における点突然変異の同定に用いることもできる。ま
た、これらの方法は、様々なバイオテクノロジー用途において用いるのに望まし
い遺伝的構成を有する細胞及び株の同定に用いることもできる。本明細書で説明
される方法は、例えば癌を含む、様々な疾患を生じ得る体性突然変異の存在を検
出することもできる。
【０１０８】
本明細書で説明される方法のジェノタイピング法から獲得された知識を用いて
、臨床医は胎児から得られた細胞を用いる出生前試験を行って様々な遺伝的疾患
、例えば、上に列挙されるSNPに関連する疾患についてチェックすることができ
る。これらの方法は突然変異対立遺伝子のキャリアの同定に用いることもできる
。そのような情報は、受胎前のカップルにとって、特定の奇形または遺伝的疾患
を伴う子供を授かる危険性が評価されるため有用であり得る。
、臨床医は胎児から得られた細胞を用いる出生前試験を行って様々な遺伝的疾患
、例えば、上に列挙されるSNPに関連する疾患についてチェックすることができ
る。これらの方法は突然変異対立遺伝子のキャリアの同定に用いることもできる
。そのような情報は、受胎前のカップルにとって、特定の奇形または遺伝的疾患
を伴う子供を授かる危険性が評価されるため有用であり得る。
【０１０９】
本発明の方法は様々な同定用途、例えば、法医学または父子鑑定の分野におい
て利用することもできる。法医学的分析の場合、例えば、犯罪現場から得られた
血液または精液中で特定の遺伝子における多形を決定し、特定の被疑者がその犯
罪に関与したかどうかを示すことができる。同様の方法で、特定の個体が特定の
子供の親であるかどうかを決定するのを助けるため、多形分析を父子論争におい
て利用することができる。
て利用することもできる。法医学的分析の場合、例えば、犯罪現場から得られた
血液または精液中で特定の遺伝子における多形を決定し、特定の被疑者がその犯
罪に関与したかどうかを示すことができる。同様の方法で、特定の個体が特定の
子供の親であるかどうかを決定するのを助けるため、多形分析を父子論争におい
て利用することができる。
【０１１０】
別の用途においては、本発明の特定の方法を血液型分類または組織分類におい
て用いる。例えば、組織分類は、特定の個体に特異的な多形を同定することによ
って決定することができる。
て用いる。例えば、組織分類は、特定の個体に特異的な多形を同定することによ
って決定することができる。
【０１１１】
以下の例は本発明の特定の側面を説明するために提供されるものであり、いか
なる意味でも本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
なる意味でも本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【０１１２】実施例1
CYP4.2D6.G4268C SNPのジェノタイピング
Ｉ．材料および方法
A．標的核酸の増幅
アンプリマーをPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）によりQiagen製のHotStart Taq
システムを用いて生成した。分析するSNPのためのPCRプライマー結合部位、CYP4
.2D6.G4268Cが図5にボールド体で示されている。このSNPはG／C多形部位であり
、文字Sで示される。増幅は製造者の推奨に従って行った。プライマーはOperon
Technologies, Incから得るか、または ABI3948 Nucleic Acid Synthesis & Pur
ification System を用いて合成した。典型的には、40サイクルのPCRを行って5
−20ng／μl DNAの収量を得た。
システムを用いて生成した。分析するSNPのためのPCRプライマー結合部位、CYP4
.2D6.G4268Cが図5にボールド体で示されている。このSNPはG／C多形部位であり
、文字Sで示される。増幅は製造者の推奨に従って行った。プライマーはOperon
Technologies, Incから得るか、または ABI3948 Nucleic Acid Synthesis & Pur
ification System を用いて合成した。典型的には、40サイクルのPCRを行って5
−20ng／μl DNAの収量を得た。
【０１１３】
エキソヌクレアーゼＩおよびエビアルカリホスファターゼ（USB）を1単位／10
μlで添加することにより過剰のdNTPおよびプライマーをPCR産生物から除去した
。適切な混合の後、管を37℃で1時間、次いで80℃で15分インキュベートした。
この段階で、各試料の小画分をアガロースゲル電気泳動によって分析し、PCR産
生物の量および品質を決定した。
μlで添加することにより過剰のdNTPおよびプライマーをPCR産生物から除去した
。適切な混合の後、管を37℃で1時間、次いで80℃で15分インキュベートした。
この段階で、各試料の小画分をアガロースゲル電気泳動によって分析し、PCR産
生物の量および品質を決定した。
【０１１４】
B．プライマー伸長
プライマー伸長のため、約10ngの各PCRアンプリマーを以下のものを含む5μl
反応液中で用いた；Perkin Elmerによって推奨されるTaq FS用の1×バッファ、0
.2μM伸長プライマー、0.25単位Taq FS（Perkin Elmer）、および図の説明に指
示される濃度の色素標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸（NEN Life Science P
roducts, Inc.）。伸長は GeneAmp PCR System 9700（Perkin Elmer）において3
0サイクル行った。研究されるSNPのためのプライマー結合部位には図5において
下線が付される。
反応液中で用いた；Perkin Elmerによって推奨されるTaq FS用の1×バッファ、0
.2μM伸長プライマー、0.25単位Taq FS（Perkin Elmer）、および図の説明に指
示される濃度の色素標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸（NEN Life Science P
roducts, Inc.）。伸長は GeneAmp PCR System 9700（Perkin Elmer）において3
0サイクル行った。研究されるSNPのためのプライマー結合部位には図5において
下線が付される。
【０１１５】
C．伸長産生物の分析
エタノール沈殿によって脱塩した後、試料を配列決定ゲルでABI 377 Sequence
rを用いて分析した。結果は蛍光強度対時間としてプロットした。示される結果
（図6Aおよび6B）は用いられた2種類の色素のスペクトル重複について補正され
ている。
rを用いて分析した。結果は蛍光強度対時間としてプロットした。示される結果
（図6Aおよび6B）は用いられた2種類の色素のスペクトル重複について補正され
ている。
【０１１６】
II．ジェノタイピングの結果
7固体を用いて、CYP4.2D6.G4268C SNP（Sachse et al., Am. J. Hum. Genet.
6:284-295 (1997)、これは参照することによりその全体が組み込まれる）で一組
のジェノタイピング実験を行った。このSNPを取り巻く配列が図5に示される。こ
の実験は、標識および非標識形態のデオキシヌクレオチドの混合物をジデオキシ
ヌクレオチドと組み合わせて用いる能力を調べた。
6:284-295 (1997)、これは参照することによりその全体が組み込まれる）で一組
のジェノタイピング実験を行った。このSNPを取り巻く配列が図5に示される。こ
の実験は、標識および非標識形態のデオキシヌクレオチドの混合物をジデオキシ
ヌクレオチドと組み合わせて用いる能力を調べた。
【０１１７】
A．ジデオキシヌクレオチドの組合せ
実験の1つは、2種類のジデオキシヌクレオチド、具体的には、10nM R110−ddC
TP／90nM ddCTPおよび30nM TAMRA−ddGTP／70nM ddGTPの混合物を用いて行った
。図6Aは異なる個体について得られたエレクトロフェログラムを示す。R110を取
り込み、かつC対立遺伝子に対応する伸長産生物からの信号がCと表示される軌跡
によって表される。TAMRAで標識され、かつG対立遺伝子に対応する伸長産生物が
Gと表示される軌跡によって表される。括弧内に示される遺伝子型は、アンプリ
マーを直接配列決定することによっても確認した。
TP／90nM ddCTPおよび30nM TAMRA−ddGTP／70nM ddGTPの混合物を用いて行った
。図6Aは異なる個体について得られたエレクトロフェログラムを示す。R110を取
り込み、かつC対立遺伝子に対応する伸長産生物からの信号がCと表示される軌跡
によって表される。TAMRAで標識され、かつG対立遺伝子に対応する伸長産生物が
Gと表示される軌跡によって表される。括弧内に示される遺伝子型は、アンプリ
マーを直接配列決定することによっても確認した。
【０１１８】
B．ジデオキシヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドの組合せ
別の実験をジデオキシヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドの混合物を用
いて行った。実験は10nM R110−dCTP／90nM dCTPの混合物および30nM TAMRA−dd
GTP／70nM ddGTPの混合物を用いて行った。図6Bは、試験した7個体の各々につい
て得られたエレクトロフェログラムを示す。R110を取り込み、かつC対立遺伝子
から生じた伸長産生物はCと表示される軌跡によって表される。TAMRAで標識され
、かつG対立遺伝子から生じた伸長産生物はGと表示される軌跡によって表される
。正しい遺伝子型は括弧内に示される通りである。図6Aおよび6Bの比較は、正し
い遺伝子型を得るのに、プライマー伸長反応においてデオキシヌクレオチドを用
いることもできることを示す。
いて行った。実験は10nM R110−dCTP／90nM dCTPの混合物および30nM TAMRA−dd
GTP／70nM ddGTPの混合物を用いて行った。図6Bは、試験した7個体の各々につい
て得られたエレクトロフェログラムを示す。R110を取り込み、かつC対立遺伝子
から生じた伸長産生物はCと表示される軌跡によって表される。TAMRAで標識され
、かつG対立遺伝子から生じた伸長産生物はGと表示される軌跡によって表される
。正しい遺伝子型は括弧内に示される通りである。図6Aおよび6Bの比較は、正し
い遺伝子型を得るのに、プライマー伸長反応においてデオキシヌクレオチドを用
いることもできることを示す。
【０１１９】
本明細書で説明される例および態様は説明のためだけのものであり、それらの
観点からの変形および変更が当業者に示唆され、かつ本願の精神および範囲並び
に添付の請求の範囲の範囲内に含まれることは理解される。本明細書で引用され
るすべての刊行物、特許および特許出願は、参照することによりそれらの全体が
すべての目的で、個々の刊行物、特許または特許出願の各々が参照することによ
りそのように組み込まれるものと具体的かつ個別的に指示されたのと同じ程度ま
でここに組み込まれる。
観点からの変形および変更が当業者に示唆され、かつ本願の精神および範囲並び
に添付の請求の範囲の範囲内に含まれることは理解される。本明細書で引用され
るすべての刊行物、特許および特許出願は、参照することによりそれらの全体が
すべての目的で、個々の刊行物、特許または特許出願の各々が参照することによ
りそのように組み込まれるものと具体的かつ個別的に指示されたのと同じ程度ま
でここに組み込まれる。
【図１Ａ】
図1Aは本発明の特定の伸長方法の主要工程を示す。
【図１Ｂ】
図1Bは本発明の特定の方法に従って形成され得る異なるサイズの伸長産生物の
例を示し、ここで、伸長反応は、伸長が変位部位を越えて進行するように、変異
部位の3’側（すなわち、下流）に位置する1つ以上のヌクレオチドに相補的であ
る伸長性ヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオチド）を含むヌクレオチド混
合物の存在下で行なわれる。
例を示し、ここで、伸長反応は、伸長が変位部位を越えて進行するように、変異
部位の3’側（すなわち、下流）に位置する1つ以上のヌクレオチドに相補的であ
る伸長性ヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオチド）を含むヌクレオチド混
合物の存在下で行なわれる。
【図２】
図2は、3つの対立遺伝子形態を有する標的核酸を分析するための、本発明の特
定の方法の例を示す。
定の方法の例を示す。
【図３】
図3は、4つの対立遺伝子形態を有する標的核酸を分析するための、本発明の特
定の方法の例を示す。
定の方法の例を示す。
【図４】
図4は、標的核酸の特定の対立遺伝子形態の有無を評点するのに本発明の特定
の方法をどのように利用できるのかの例を示す。
の方法をどのように利用できるのかの例を示す。
【図５】
図5は、CYP4.2D6.G4268C SNP（G／C多型部位）（Sachse et al. Am. J. Hum.
Genet. 60:284-295 (1997)）を含むアンプリマーの配列を示す。SNP部位はボー
ルド体の「S」によって示され、これはその変異部位がGまたはCによって占めら
れることを示す。フォワードおよびリバースPCRプライマー結合部位はボールド
体で示され、検出プライマー用の結合部位には下線が付される。
Genet. 60:284-295 (1997)）を含むアンプリマーの配列を示す。SNP部位はボー
ルド体の「S」によって示され、これはその変異部位がGまたはCによって占めら
れることを示す。フォワードおよびリバースPCRプライマー結合部位はボールド
体で示され、検出プライマー用の結合部位には下線が付される。
【図６Ａ】
図6Aは、7名の異なる個体を用いてCYP4.2D6.G4268C SNP部位で実施したジェノ
タイピング実験についての蛍光強度対時間のプロットとしてのエレクトロフェロ
グラムを示す。この実験のセットは非伸長性ヌクレオチド、特にはddCTPおよびd
dGTPの混合物（10nM R110−ddCTP／90nM ddCTP混合物および30nM TAMRA−ddGTP
／70nM ddGTP混合物）のみの存在下で行った。R110標識を取り込み、C対立遺伝
子に対応する伸長産生物からの信号がCで表示される軌跡で表される。TAMRAで標
識され、G対立遺伝子に対応する伸長産生物がGと表示される軌跡で表される。括
弧内に示される遺伝子型はアンプリマーを直接配列決定することによっても確認
した。
タイピング実験についての蛍光強度対時間のプロットとしてのエレクトロフェロ
グラムを示す。この実験のセットは非伸長性ヌクレオチド、特にはddCTPおよびd
dGTPの混合物（10nM R110−ddCTP／90nM ddCTP混合物および30nM TAMRA−ddGTP
／70nM ddGTP混合物）のみの存在下で行った。R110標識を取り込み、C対立遺伝
子に対応する伸長産生物からの信号がCで表示される軌跡で表される。TAMRAで標
識され、G対立遺伝子に対応する伸長産生物がGと表示される軌跡で表される。括
弧内に示される遺伝子型はアンプリマーを直接配列決定することによっても確認
した。
【図６Ｂ】
図6Bは、図6Aに示されるものと同じ7名の個体に由来する試料を用いてCYP4.2D
6.G4268C SNP部位で実施したジェノタイピング実験についての蛍光強度対時間の
プロットとしてのエレクトロフェログラムを示す。しかしながら、この実験は標
識伸長性および非伸長性ヌクレオチドの混合物を用いて行った。より具体的には
、10nM R110−dCTP／90nM dCTP混合物および30nM TAMRA−ddGTP／70nM ddGTP混
合物を用いて実験を行った。R110を取り込み、C対立遺伝子から生じた伸長産生
物がCと表示される軌跡で表される。TAMRAで標識され、G対立遺伝子から生じた
伸長産生物がGと表示される軌跡で表される。正しい遺伝子型は括弧内に示され
る通りである。
6.G4268C SNP部位で実施したジェノタイピング実験についての蛍光強度対時間の
プロットとしてのエレクトロフェログラムを示す。しかしながら、この実験は標
識伸長性および非伸長性ヌクレオチドの混合物を用いて行った。より具体的には
、10nM R110−dCTP／90nM dCTP混合物および30nM TAMRA−ddGTP／70nM ddGTP混
合物を用いて実験を行った。R110を取り込み、C対立遺伝子から生じた伸長産生
物がCと表示される軌跡で表される。TAMRAで標識され、G対立遺伝子から生じた
伸長産生物がGと表示される軌跡で表される。正しい遺伝子型は括弧内に示され
る通りである。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年１月２日（２００２．１．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図1Aは本発明の特定の伸長方法の主要工程を示す。
【図１Ｂ】
図1Bは本発明の特定の方法に従って形成され得る異なるサイズの伸長産生物の
例を示し、ここで、伸長反応は、伸長が変位部位を越えて進行するように、変異
部位の3’側（すなわち、下流）に位置する1つ以上のヌクレオチドに相補的であ
る伸長性ヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオチド）を含むヌクレオチド混
合物の存在下で行なわれる。
例を示し、ここで、伸長反応は、伸長が変位部位を越えて進行するように、変異
部位の3’側（すなわち、下流）に位置する1つ以上のヌクレオチドに相補的であ
る伸長性ヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオチド）を含むヌクレオチド混
合物の存在下で行なわれる。
【図２】
図2は、3つの対立遺伝子形態を有する標的核酸を分析するための、本発明の特
定の方法の例を示す。
定の方法の例を示す。
【図３】
図3は、4つの対立遺伝子形態を有する標的核酸を分析するための、本発明の特
定の方法の例を示す。
定の方法の例を示す。
【図４】
図4は、標的核酸の特定の対立遺伝子形態の有無を評点するのに本発明の特定
の方法をどのように利用できるのかの例を示す。
の方法をどのように利用できるのかの例を示す。
【図５】
図5は、CYP4.2D6.G4268C SNP（G／C多型部位）（Sachse et al. Am. J. Hum.
Genet. 60:284-295 (1997)）を含むアンプリマーの配列(SEQ ID No:1)を示す。S
NP部位はボールド体の「S」によって示され、これはその変異部位がGまたはCに
よって占められることを示す。フォワードおよびリバースPCRプライマー結合部
位はボールド体で示され、検出プライマー用の結合部位には下線が付される。
Genet. 60:284-295 (1997)）を含むアンプリマーの配列(SEQ ID No:1)を示す。S
NP部位はボールド体の「S」によって示され、これはその変異部位がGまたはCに
よって占められることを示す。フォワードおよびリバースPCRプライマー結合部
位はボールド体で示され、検出プライマー用の結合部位には下線が付される。
【図６Ａ】
図6Aは、7名の異なる個体を用いてCYP4.2D6.G4268C SNP部位で実施したジェノ
タイピング実験についての蛍光強度対時間のプロットとしてのエレクトロフェロ
グラムを示す。この実験のセットは非伸長性ヌクレオチド、特にはddCTPおよびd
dGTPの混合物（10nM R110−ddCTP／90nM ddCTP混合物および30nM TAMRA−ddGTP
／70nM ddGTP混合物）のみの存在下で行った。R110標識を取り込み、C対立遺伝
子に対応する伸長産生物からの信号がCで表示される軌跡で表される。TAMRAで標
識され、G対立遺伝子に対応する伸長産生物がGと表示される軌跡で表される。括
弧内に示される遺伝子型はアンプリマーを直接配列決定することによっても確認
した。
タイピング実験についての蛍光強度対時間のプロットとしてのエレクトロフェロ
グラムを示す。この実験のセットは非伸長性ヌクレオチド、特にはddCTPおよびd
dGTPの混合物（10nM R110−ddCTP／90nM ddCTP混合物および30nM TAMRA−ddGTP
／70nM ddGTP混合物）のみの存在下で行った。R110標識を取り込み、C対立遺伝
子に対応する伸長産生物からの信号がCで表示される軌跡で表される。TAMRAで標
識され、G対立遺伝子に対応する伸長産生物がGと表示される軌跡で表される。括
弧内に示される遺伝子型はアンプリマーを直接配列決定することによっても確認
した。
【図６Ｂ】
図6Bは、図6Aに示されるものと同じ7名の個体に由来する試料を用いてCYP4.2D
6.G4268C SNP部位で実施したジェノタイピング実験についての蛍光強度対時間の
プロットとしてのエレクトロフェログラムを示す。しかしながら、この実験は標
識伸長性および非伸長性ヌクレオチドの混合物を用いて行った。より具体的には
、10nM R110−dCTP／90nM dCTP混合物および30nM TAMRA−ddGTP／70nM ddGTP混
合物を用いて実験を行った。R110を取り込み、C対立遺伝子から生じた伸長産生
物がCと表示される軌跡で表される。TAMRAで標識され、G対立遺伝子から生じた
伸長産生物がGと表示される軌跡で表される。正しい遺伝子型は括弧内に示され
る通りである。
6.G4268C SNP部位で実施したジェノタイピング実験についての蛍光強度対時間の
プロットとしてのエレクトロフェログラムを示す。しかしながら、この実験は標
識伸長性および非伸長性ヌクレオチドの混合物を用いて行った。より具体的には
、10nM R110−dCTP／90nM dCTP混合物および30nM TAMRA−ddGTP／70nM ddGTP混
合物を用いて実験を行った。R110を取り込み、C対立遺伝子から生じた伸長産生
物がCと表示される軌跡で表される。TAMRAで標識され、G対立遺伝子から生じた
伸長産生物がGと表示される軌跡で表される。正しい遺伝子型は括弧内に示され
る通りである。
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 グレイザー アレクサンダー エヌ
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94563、オリンダ、 キャノン ドライブ
135
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 HA11
4B063 QA01 QA17 QA18 QQ42 QQ52
QR08 QR42 QR62 QR66 QS16
QS25 QS36 QX02
Claims (45)
- 【請求項１】 標的核酸の変異部位を分析する方法であって、 （a）標的核酸、並びに少なくとも1の標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくと
も1の標識非伸長性ヌクレオチドを含むヌクレオチド混合物の存在下でプライマ
ーを伸長させることを含み、各標識伸長性ヌクレオチドおよび標識非伸長性ヌク
レオチドは標的核酸の異なる対立遺伝子形態に相補的であり、かつ任意に、差別
的に標識されている、テンプレート依存性伸長反応を実施し、ここでプライマー
は標的核酸のセグメントに、プライマーの3’末端が標的核酸の変異部位に隣接
してハイブリダイズするようにハイブリダイズし、それにより、 標識伸長性ヌクレオチドが変異部位を占めるヌクレオチドに相補的である場合
、プライマーは該標識伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長し、かつ
変異部位の下流の1以上のヌクレオチドが混合物中のヌクレオチドの1つに相補的
である場合にはさらに伸長することが可能であり、 標識非伸長性ヌクレオチドが変位部位を占めるヌクレオチドに相補的である場
合、プライマーは該標識非伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長し；
並びに （b）伸長したプライマーへの標識ヌクレオチドの取り込みを検出し、プライ
マーに取り込まれた標識ヌクレオチドの素性は変異部位のヌクレオチドの素性を
示し、ここで取り込まれたヌクレオチドの素性は取り込まれたヌクレオチドが担
持する標識および／または伸長したプライマーのサイズから決定する、 ことを含む方法。 - 【請求項２】 少なくとも1の標識伸長性ヌクレオチドがdATP、dTTP、dGTPおよびdCTPからな
る群より選択される標識デオキシヌクレオチドである請求項１の方法。 - 【請求項３】 少なくとも1の標識非伸長性ヌクレオチドが標識ジデオキシヌクレオチドであ
る請求項１の方法。 - 【請求項４】 少なくとも1の標識伸長性ヌクレオチドがdATP、dTTP、dGTPおよびdCTPからな
る群より選択される標識デオキシヌクレオチドであり、かつ少なくとも1の標識
非伸長性ヌクレオチドが標識ジデオキシヌクレオチドである請求項１の方法。 - 【請求項５】 標識ヌクレオチドが差別的に標識されている請求項４の方法。
- 【請求項６】 変異部位がバイアレリック部位であり、かつ混合物が1種類の標識デオキシヌ
クレオチドおよび1種類の標識非伸長性ヌクレオチドを含む請求項５の方法。 - 【請求項７】 変位部位がトリアレリック部位であり、かつ混合物が1種類の標識デオキシヌ
クレオチドおよび2種類の標識非伸長性ヌクレオチドを含む請求項５の方法。 - 【請求項８】 変位部位がトリアレリック部位であり、かつ混合物が2種類の標識デオキシヌ
クレオチドおよび1種類の標識非伸長性ヌクレオチドを含む請求項５の方法。 - 【請求項９】 変位部位がテトラアレリック部位であり、かつ混合物が1種類の標識デオキシ
ヌクレオチドおよび3種類の標識非伸長性ヌクレオチドを含む請求項５の方法。 - 【請求項１０】 変位部位がテトラアレリック部位であり、かつ混合物が2種類の標識デオキシ
ヌクレオチドおよび2種類の標識非伸長性ヌクレオチドを含む請求項５の方法。 - 【請求項１１】 変位部位がテトラアレリック部位であり、かつ混合物が3種類の標識デオキシ
ヌクレオチドおよび1種類の標識非伸長性ヌクレオチドを含む請求項５の方法。 - 【請求項１２】 プライマーの3’末端が変位部位のすぐ隣にハイブリダイズする請求項１の方
法。 - 【請求項１３】 伸長反応を熱サイクリング条件下で行う請求項１の方法。
- 【請求項１４】 標識ヌクレオチドが担持する標識が蛍光体、発色体、化学発光剤、放射性同位
体、酵素基質、電子高密度試薬、磁気粒子、電気化学的に活性の部分および質量
標識からなる群より選択される請求項１の方法。 - 【請求項１５】 標識ヌクレオチドが担持する標識が蛍光色素である請求項１４の方法。
- 【請求項１６】 蛍光色素がFAM、ROX、TAMRA、R110、R6G、Joe、HEX、TET、Alexa、Cy3およびC
y5からなる群より選択される請求項１５の方法。 - 【請求項１７】 プライマーへの標識ヌクレオチドの取り込みを検出する前に、伸長したプライ
マーを標識ヌクレオチドから分離する請求項１の方法。 - 【請求項１８】 サイズベースの分離技術によって分離を達成する請求項１７の方法。
- 【請求項１９】 サイズベースの分離技術がゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィであ
る請求項１８の方法。 - 【請求項２０】 伸長したプライマーを標識ヌクレオチドから分離する前に、伸長したプライマ
ーを標的核酸から変性する請求項１７の方法。 - 【請求項２１】 プライマーが結合対の第1メンバーであるアタッチメント部分を担持し、かつ
分離が、プライマーを結合対の第2メンバーに固着する支持体と接触させ、それ
によりプライマーが第1および第2結合対メンバー間の相互作用によって支持体に
固定されるようになることを含む、請求項１７の方法。 - 【請求項２２】 伸長したプライマーがプライマー標識および取り込まれた標識ヌクレオチドに
由来する標識を担持するように、標識ヌクレオチドが担持する標識とは異なるプ
ライマー標識をプライマーが担持する請求項１の方法。 - 【請求項２３】 プライマー標識および取り込まれたヌクレオチドに由来する標識がドナー蛍光
体およびアクセプター蛍光体を含み、かつ検出がドナーおよび／またはアクセプ
ターにおける蛍光の変化の検出を含む請求項２２の方法。 - 【請求項２４】 取り込みの検出を蛍光偏光によって行う請求項１５の方法。
- 【請求項２５】 （a）プライマーの複数のコピーを提供し、かつ標的核酸が二倍体被検体に由
来する試料中に含まれる第1および／または第2標的核酸であり、第1および／ま
たは第2標的核酸は変位部位で異なり、それにより第1標的核酸が存在する場合に
はプライマーの少なくとも1つのコピーは標識デオキシヌクレオチドを取り込む
ことによって伸長し、かつ第2標的核酸が存在する場合にはプライマーの少なく
とも1つは標識非伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長し；並びに （b）検出がプライマーのコピーへの標識デオキシヌクレオチドおよび／また
は標識非伸長性ヌクレオチドの取り込みの検出を含み、標識デオキシヌクレオチ
ドまたは標識非伸長性ヌクレオチドのみの取り込みは被検体がホモ接合であるこ
とを示し、それに対して標識デオキシヌクレオチドおよび標識非伸長性ヌクレオ
チドの取り込みはその被検体がヘテロ接合であることを示す、 請求項５の方法。 - 【請求項２６】 標識デオキシヌクレオチドおよび標識非伸長性ヌクレオチドが異なる波長で発
光する異なる蛍光標識を担持し、かつ検出が蛍光の検出を含み、1波長での蛍光
の検出は被検体がホモ接合であることを示し、かつ2波長での蛍光の検出は被検
体がヘテロ接合であることを示す、請求項２５の方法。 - 【請求項２７】 （a）標的核酸の変位部位のすぐ下流の1以上のヌクレオチドが変位部位に潜在
的に存在するヌクレオチドと同じであり、かつ標識デオキシヌクレオチドが該1
以上の下流ヌクレオチドに相補的であるように選択され、それにより標識デオキ
シヌクレオチドが第1または第2標的核酸のいずれかの変位部位のヌクレオチドに
相補的である場合には第1および第2標的核酸が異なるサイズの伸長産生物を生じ
るようにプライマーがさらに伸長してさらなる標識デオキシヌクレオチドを含み
；並びに （b）検出が異なるサイズの伸長産生物の有無の検出を含む、 請求項２５の方法。 - 【請求項２８】 1以上の標的核酸における変異部位を分析するための方法であって、 （a）複数のテンプレート依存性伸長反応を複数の異なるプライマーの存在下
で行い、ここで異なるプライマーは1以上の標的核酸の異なる変位部位に隣接し
てハイブリダイズし、かつ差別的に標識され、各伸長反応は以下を含み、 （i）標的核酸（1種類もしくは複数種類）を含む試料を異なる標識プライマー
のうちの1つと接触させ、ここでプライマーの3’末端は標的核酸のうちの1つの
変異部位に隣接して、しかしながらそれは含まずにハイブリダイズし；並びに （ii）プライマーを少なくとも1の標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1
の標識非伸長性ヌクレオチドを含むヌクレオチド混合物に、 標識伸長性ヌクレオチドが変異部位を占めるヌクレオチドに相補的である場合
、プライマーは該標識伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長し、かつ
変異部位の下流の1以上のヌクレオチドが混合物中のヌクレオチドの1つに相補的
である場合にはさらに伸長することが可能であり、 標識非伸長性ヌクレオチドが変位部位を占めるヌクレオチドに相補的である場
合、プライマーは該標識非伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長し、 それにより、伸長反応は複数の異なる伸長産生物を産生し、異なる変位部位か
ら生じた伸長産生物は伸長したプライマーが担持する異なる標識に基づいて区別
可能である、 条件下で露出する；並びに （ｂ）伸長産生物への標識ヌクレオチドの取り込みを標的核酸中の変異部位を
占めるヌクレオチドの指標として検出し、ここで取り込まれたヌクレオチドの素
性は取り込まれたヌクレオチドが担持する標識および／または伸長したプライマ
ーのサイズから決定する、 ことを含む方法。 - 【請求項２９】 異なる変異部位が同じ標的核酸上の異なる変異部位または異なる標的核酸上の
異なる部位であり、かつ伸長反応を1反応容器内で行う請求項２８の方法。 - 【請求項３０】 標識ヌクレオチドが担持する標識および標識プライマーが担持する標識が蛍光
体、発色体、化学発光剤、放射性同位体、酵素基質、電子高密度試薬、磁気粒子
、電気化学的に活性の部分および質量標識からなる群より選択される請求項２８
の方法。 - 【請求項３１】 異なるプライマーが異なる質量標識を担持し、かつ検出が異なる伸長産生物を
サイズによって分離することを含む請求項２８の方法。 - 【請求項３２】 （a）伸長産生物が担持する蛍光体がドナーおよびアクセプター対を形成する
ように、異なるプライマーが担持する異なる標識が異なる蛍光体であり、かつ標
識ヌクレオチドが異なる蛍光体を担持し；並びに （b）検出が異なるドナーおよびアクセプター対についてドナーおよび／また
はアクセプターからの発光の変化を検出することを含む、 請求項２８の方法。 - 【請求項３３】 検出を蛍光偏光によって行う請求項２８の方法。
- 【請求項３４】 標的核酸における変異部位を分析するためのキットであって、 （a）少なくとも1の標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくとも1の標識非伸長
性ヌクレオチド；並びに （b）少なくとも1のプライマー、 を含み、該ヌクレオチドは標的核酸の異なる対立遺伝子形態に相補的であり、各
プライマーは標的核酸のセグメントにプライマーの３’末端が標的核酸の変異部
位に隣接してハイブリダイズするようにハイブリダイズするキット。 - 【請求項３５】 ポリメラーゼをさらに含む請求項３４のキット。
- 【請求項３６】 標識ヌクレオチドが担持する標識が蛍光体である請求項３４のキット。
- 【請求項３７】 蛍光体がFAM、ROX、TAMRA、R110、R6G、Joe、HEX、TET、Alexa、Cy3およびCy5
からなる群より選択される請求項３６の方法。 - 【請求項３８】 プライマーがプライマー標識を担持する請求項３４のキット。
- 【請求項３９】 プライマー標識が蛍光体であり、ヌクレオチドが担持する蛍光体およびプライ
マーが担持する蛍光体がドナーおよびアクセプター対を構成する請求項３８のキ
ット。 - 【請求項４０】 プライマーが少なくとも5種類のプライマーであり、各プライマーは標的核酸
中の異なる変異部位に隣接してハイブリダイズする請求項３４のキット。 - 【請求項４１】 各変異部位が疾患と相関する部位である請求項４０のキット。
- 【請求項４２】 標識ヌクレオチドを伸長したプライマーから分離することなしに取り込まれた
標識ヌクレオチドの検出を行う請求項１の方法。 - 【請求項４３】 標的核酸の変異部位を分析する方法であって、 （a）標的核酸、並びに少なくとも1の標識伸長性ヌクレオチドおよび少なくと
も1の標識非伸長性ヌクレオチドを含むヌクレオチド混合物の存在下でプライマ
ーの伸長を行うことを含み、各標識伸長性ヌクレオチドおよび標識非伸長性ヌク
レオチドは標的核酸の異なる対立遺伝子形態に相補的であり、かつ差別的に標識
されているテンプレート依存性伸長反応を実施し、ここでプライマーは標的核酸
のセグメントにプライマーの3’末端が標的核酸の変異部位に隣接してハイブリ
ダイズするようにハイブリダイズし、それにより、 標識伸長性ヌクレオチドが変異部位を占めるヌクレオチドに相補的である場合
、プライマーは該標識伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長し、およ
び 標識非伸長性ヌクレオチドが変位部位を占めるヌクレオチドに相補的である場
合、プライマーは該標識非伸長性ヌクレオチドを取り込むことによって伸長し；
並びに、 （b）伸長したプライマーへの標識ヌクレオチドの取り込みを検出し、プライ
マーに取り込まれた標識ヌクレオチドの素性は変異部位のヌクレオチドの素性を
示し、取り込まれたヌクレオチドの素性は取り込まれたヌクレオチドが担持する
標識から決定する、 ことを含む方法。 - 【請求項４４】 少なくとも1の標識非伸長性ヌクレオチドが標識ジデオキシヌクレオチドであ
る請求項４３の方法。 - 【請求項４５】 標識ヌクレオチドが担持する標識が蛍光体、発色体、化学発光剤、放射性同位
体、酵素基質、電子高密度試薬、磁気粒子、電気化学的に活性の部分および質量
標識からなる群より選択される請求項４３の方法。
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