JPH06505394A - ターミネーター複合物を利用するオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ伸長による核酸分類 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ターミネータ−複合物を利用するオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ伸長による 核酸分類 本発明は１９９１年３月５日出麿の米国特許出願第６６４　、８３７号の一部係 属出願であり、それは本明細書に参考として組入れる。

発明の背景 本発明は核酸配列の検定の分野に関連する。核酸配列の検定は２通りの一般的な 状況に利用することができる。第１に、核酸配列の検定は特定の遺伝子要素の有 無を決定するために利用できる。第２に、核酸配列の検定は存在している特定の 遺伝子要素の特定のタイプを決定するために利用できる。様々な遺伝子要素が通 常存在している。数多くの技術が、（１）特定の核酸配列の存在を調べるために 、及び（２）核酸配列の相同性セグメントを対比させてそれらのセグメントが同 一であるか又は１又は複数のヌクレオチドが異なっているかどうかを調べるため に開発されてきている。これらの技術の実際の用途には遺伝病診断、感染病診断 、法医学技術、身元の決定及びゲノムマツピングが挙げられる。

一般に、サンプル中の核酸及びそのサブタイプの検定は特異的核酸ハイブリダイ ゼーションの技法であって、オリゴヌクレオチドプローブをサンプル中の核酸と 高緊縮条件のもとてアニールせしめ、そして有効にアニールしたプローブを次に 検出する技法に依存している（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ、　Ｓ、の５ｃｉｅｎｔｉ ｆｉｃ　Ａｖｘｅｒｉｃａｎ第２１０巻、頁４Ｂ（１９６４）を参照のこと）。

ＤＮＡセグメントを対比させるための最も具体的な方法は各セグメントの完全ヌ クレオチド配列を決定することにある。ヒトの遺伝子における突然変異を研究す るためにどのようにシーケンシングが利用されてきたかの例はＥｎｇｅｌｋｅ　 らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ８５：５４４ −５４８（１９８８）及び−ｏｎｇらＮａｔｕｒｅ３３０：３８４−３８６（１ ９８７）に含まれている。現時点で、わずかなりＮＡ上セグメントみを対比する ために長いシーケンシングを利用することは実用的でなく、なぜなら配列情報を 決定、解釈及び対比するのに必要な作業は時間がかかるからである。

ＤＮＡ配列の変異より生ずるＤＮＡの多形態（ｐｏｌｙｓｏｒｐｈｉｓ■）につ いての一般に利用されているスクリーンは、ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで 消化し、次いで得られるフラグメントをＢｏｓｔｅｆｎ　らＡ＋ｗ、　Ｊ。

Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、３２：３１４−３３１（１９８０）及び−ｂｉｔｅ　 らＳｃｉ、　Ａｍ、、２５８：４Ｏ−４８（１９８Ｂ）に記載のサザンプロット により分析することより構成される。

エンドヌクレアーゼの認識配列に影響を及ぼす突然変異はその部位での酵素切断 を妨げ、それ故そのＤＮＡの切断パターンを変えてしまう、それらのＤＮＡは制 限フラグメントの長さにおける相違について調べることにより対比される。この 方法（制限フラグメント長多形態マツピング又はＲＦＬＰマツピングとして知ら れる）に関する主たる問題は、制限エンドヌクレアーゼによる切断に影響を及ぼ さない突然変異をそれが検出できないことにある。従って、数多くの突然変異は この方法によって見逃されている。　ＪｅｆｆｒｅｙｓのＣｅ１ｌ、　１８：１ −１８（１９７９）の一つの研究は、０．７％の突然変異のみがヒトＤＮＡの４ ０．０００塩基対の領域において存在するものと予測されることを検定するにす ぎなかった。他の問題は、制限フラグメント長多形態を検定するのに用いる方法 、特にサザンプロット分析を包括する技術が非常にめんどうであることにある。

任意のＤＮＡセグメントにおける特定の突然変異を検定するための技術は−ａｌ ｌａｃｅらＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　９：８７９−８９４（１９８１ ）に記載されている。これは分析すべきＤＮＡ　（標的ＤＮＡ）の相補性ラベル 化オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイズを包括する。一つの塩基対誤 対合しか含まないときでさえものＤＮＡ二本鎖の熱的不安定性に基づき、プロー ブと完璧に相補する標的ＤＮＡを１個のヌクレオチド程度しか相違しない標的Ｄ ＮＡから区別するのに示差融解温度が利用できる。　Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら５ｃ ｉｅｎｃｅ　４１：１０７７−１０８０（１９８８）に記載の関連の技術におい ては、オリゴヌクレオチドプローブをペアーで作製してそれらの連結部位が突然 変異について分析すべきＤＮＡの部位に対応するようにしている０次にこれらの オリゴヌクレオチドを分析すべきＤＮＡにハイブリダイズさせる。いづれかのオ リゴヌクレオチドと標的ＤＮＡとのこの連結領域での塩基対誤対合はＤＮＡリガ ーゼによるこれら２本のオリゴヌクレオチドプローブの有効な連結を妨げてしま う。

Ａ、核酸ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション反応における核酸の塩基対合はほとんどの核酸の分析的 及び診断的技術の基礎を成す、実際、核酸ハイブリダイゼーシッンのパラメータ ーをのみ基礎とする試験は、試験サンプルの配列複雑度が高い場合にはあまりよ く機能しない。これはある程度、−個のヌクレオチド変化により生ずるバイブリ ドの安定性におけるわずかな熱力学的相違、及びプローブを長くすることにより 特異性を高めることがこの示差的安定性を更に小さくする効果を有することに基 づく、従って核酸ハイブリダイゼーションは一般に分析及び診断目的のためにい （つかの他の選択的又は富化的手順と組合される。

ハイブリダイゼーションを選別技術としてのハイブリダイズ分子のサイズ分別と 組合せることは一般的な診断手法の１つである。サイズ選別はハイブリダイゼー ションの前に行うことができる。最もよく知られた事前サイズ選別技術はサザン ブロッテイングである（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、’、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚ　ｓ＋ｏｌｏ　６９：１５２（１９８０）を参照のこと）、この技術に おいては、ＤＮＡサンプルを、制限酵素による消化に付して、各酵素にとって特 徴的な短いヌクレオチド配列の部位での又はその付近でのホスホジエステル骨格 における二本鎖破断をもたらしている。得られるＤＮＡフラグメントの不均質混 合物を次にゲル電気泳動により分け、変性させ、そして固相へと移し、ここでそ れらをラベル化核酸プローブを用いてその場でハイブリダイゼーション分析にか ける。ラベル化プローブに相補する配列を含むフラグメントはハイブリダイズし たラベルのバンドとして目視で又はデンシロメトリーで示される。この方法の変 法はＲＮＡ分子についてのノーザンプロッティングである。サイズ選別は数多く の技法におけるハイブリダイゼーションの後に、特にバイブリド保護技術により 、サイズ分析にかける前にプローブ／核酸バイブリドを酵素消化に付することに より利用されてもいる。

Ｂ、二量体、プライマー二鋳型の複合体のポリメラーゼ伸長プライマーとＤＮＡ 標的とのバイブリドは、これらのバイブリドのポリメラーゼ伸長によって分析す ることができる。この方法論の改良はポリメラーゼ連鎖反応であり、その精製物 は逆平行プライマーの連続ハイブリダイゼーシぢン反応、それに続＜　ＤＮＡポ リメラーゼによる酵素的増幅によって提供される（Ｓａｉｋｉ　ら、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３９：４８７−４９１　（１９８８）を参照のこと）、２通りのハイブ リダイゼーション反応に関して選択することにより、この方法論は単独のハイブ リダイゼーション反応にのみ依存する技法に欠ける特異性を提供する。

プライマー依存性ＤＮＡポリメラーゼは長い間一般的に、鋳型に対して相補性な ヌクレオチドの付加について低いエラー率を有することで知られてきた。この特 徴は子孫に有害な影響を及ぼすであろう遺伝的誤りの防ぐために生物界において 必須である。この酵素学的反応に固有な特異性は究極的な核酸分類実験法である 「サンガー」又はジデオキシ連鎖停止シーケンシング方法論に基づいて幅広く利 用されている。１つのタイプのサンガーＤＮＡ　シーケンシング法は通常のＤＮ Ａ前駆体である４種のデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物、及びこの４種の 考えられるジデオキシヌクレオシド三リン酸のうちの１種が、そのヌクレオシド のリボース糖成分の３′炭素原子に結合しているヒドロキシル基の代わりに水素 を有するものを利用する。５′から３′方向（「下流」）におけるＤＮＡ　ｌ伸 長はこのヒドロキシル基を必要とする。従って、ジデオキシヌクレオチドがこの 成長ＤＮＡ　ｌｌに取り込まれると、更なる伸長が起きなくなってしまう、この 混合物中の１種のジデオキシヌクレオチドにより、ＤＮ＾ポリメラーゼはプライ マー：鋳型の組合せに由来する様々な長さの分子の集団を提供せしめることがで き、その全てはこの４種の考えられるヌクレオチドのうちの１種の付加の後に停 止したものである。

一連の４つの独立した反応（それぞれは異なるジデオキシヌクレオチドによる） はフラグメントの入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）セットを作り上げ、全てはプライミン グＤＮＡ分子の同じ５′末端から始まり、そして考えられる全ての３′ヌクレオ チド位にて終結している。

ＤＮＡの分析におけるジデオキシヌクレオシド三リン酸とポリメラーゼの他の用 途は分子の３′末端のラベル化を包括する。ある突飛なこの技術の出現はマキサ ム−ギルバート法を利用する、ＤＮＡ分子のその３′末端からのシーケンシング のための手段を提供する。この技術において、突き出し３′末端を有する分子を 放射性ジデオキシ−ＡＴＰの存在下において末端トランスフェラーゼにより処理 する。

１種の放射性ヌクレオチドを付加し、この分子をシーケンシングにの電気泳動分 離を必要とする。はとんどの方法は各分類決定のためドを、ＤＮＡポリメラーゼ 及び４１１のデオキシヌクレオシド三リン酸（そのうちの１種はα−チオヌクレ オチドである）の存在下においてプライマー伸長に付する。次にこのバイブリド を、エキソヌクレレオチドがこの反応混合物中の一種のチオヌクレオチドに相補 性でいバイブリドは分解されてしまうであろう、誘導化されていない分子を除く ための適当な酵素消化の後、このチオ誘導化分子はゲル電気泳動又はその他の選 別技術によって検定されうる。

象の変異ヌクレオチドに対応している。このプライマーの３′末端ヌクレオチド においてのプライマーと鋳型の誤対合は伸長にとっての方法はＩ）ＮＡポリメラ ーゼ、例えばＤＮＡ逆転写酵素であって関連の３′〜５′エキソヌクレアーゼ活 性を有さないものの利用に依存する。

Ｍｕｎｄｙ及びＶａｒｙとＤｉａｓ＋ｏｎｄの方法は欠点を有している。Ｍｕｎ ｄｙの方法は有用であるが、誘導化されていないバイブリドを消化する第２の別 の酵素系の必要性によりめんどうである。Ｖａｒｙの方法は別々の反応生成物を 作りあげないことにより複雑である。ｒ不良コブライミングはかかる系において 顕著なノイズをもたらし、これは真性シグナルと区別するのが難しいであろう。

本発明は特定のヌクレオチドについての核酸を分類するＭｕｎｄｙ及びＶａｒｙ とＤｉａ麟ｏｎｄの方法に関連する問題を解消する。プライマー伸長及びＤＮＡ ポリメラーゼを利用する方法により、本発明はそのプライマー自体よりも一塩基 長い別の分子物質をもたらすであろう、数多くの方法、特にポリメラーゼ連鎖反 応を利用する方法において、第１工程において対象の核酸を精製するために用い るタイプの反応は、次の検出工程において用いることもできる。最後に、異なる 検出用成分（例えば異なるスペクトル特性を有する蛍光物質）によってラベルさ れているターミネータ−により、全ての配列検定実験のために１種の試薬のみを 利用することが可能となるであろう。更に、反応後に終結したプライマーを分離 する技術を利用すると、複数の遺伝子座での配列検定実験を同じチューブの中で 行うことができる。

Ｍｕｌｌｉｓによる最近の論文（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｓｅｒｉｃａｎ＋　 １９９０年４月、頁５６−６５）は、明らかに実施されていないであろう、二本 ［ＤＮＡの断片における標的塩基対の同一性の決定の実験を提案している。

Ｍｕｌｌｉｓは４タイプのジデオキシヌクレオシド三リン酸と、放射性ラベルさ れた１タイプのジデオキシヌクレオシド三リン酸の利用を提案している。

本発明は感染病の診断、遺伝病の診断、並びに個人及びその身元の同定に有用で ありうる核酸配列の分析を可能とする。

これらの目的のために数多くの方法が開発されている。有用であるにもかかわら ず、かかる方法論はめんどうであり、且つ、費用がかさみ、一般にゲル電気泳動 、プロッティング、ハイブリダイゼーション及びオートラジオグラフィー又は非 アイソトープ暴露のような技法の組合せを包括する。より幅広い核酸分析の利用 を可能とするより簡単な技術が要望されている。更に、核酸を基礎とする試験は 、現状量も費用のかかる実験手順に属し、そしてこの理由のためルーチンベース には利用されることができていない、最後に、現状の技術は大量のサンプルの分 析、従って更には費用を下げることを可能とするのに必要であろう自動化手順に 適用できない。

本発明は核酸物質のゲル電気泳動サイズ選別に顧ることなく生物学的サンプル中 の核酸の診断又は特性化に利用できる方法を提供する。この特徴はこの方法を自 動に容易に適用できることをもたらし、従って比較的低価格にて大量のサンプル を分析することを可能にする。核酸は生命の本質的な青写真であるため、各生物 又は個体は核酸の同定可能な配列によって個別に特性化されうる。従って、これ らの特異的な核酸配列を検出することによって、特定の生物の存在を同定する又 は一定のサンプルの生物起源を実証することが可能となる。

発明の概要 本発明は、水性担体と、核酸鋳型依存性プライマー伸長反応の少なくとも２種類 の異なるターミネータ−の混合物とを含んで成る試薬組成物を提供する。それぞ れのターミネータ−は、このプライマーの３′末端に隣接し、且つ、その下流に ある、鋳型における対をなしていないヌクレオチド塩基の同一性に厳格に依存す る状況において伸長反応を特異的に停止せしめることが可能である。更に、この ターミネータ−の少なくとも一種は検出マーカーによりラベルさの４種の異なる ターミネータ−の混合物とを含んで成る試薬組成物を提供する。それぞれのター ミネータ−は、上記のように伸長反応を特異的に停止せしめることが可能であり 、そしてこれらのターミネータ−のうちの１種、２種、３種又は４種が検出マー カーによりラベルされている。

本発明は更に前記した試薬であって、そのターミネータ−がヌクレオチド、ヌク レオチド類似体、ジデオキシヌクレオチド又はアラビノース三リン酸を含んで成 る試薬を更に提供する。本発明はまた試薬であって、そのターミネータ−が１又 は複数のジデオキシアデノシン三リン酸（ｄｄＡＴＰ）　、ジデオキシシトシン 三リン酸（ｄｄＣＴＰ）、ジデオキシグアノシン三リン酸（ｄｄＧＴＰ）、ジデ オキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）又はジデオキシウリジン三リン酸（ｄｄ ＵＴＰ）を含んで成る試薬を提供する。

本発明は更に対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決 定するための方法を提供する。第１に、もし対象の核酸が二本鎖であるならばか かる核酸を含むサンプルを処理して特定の位置にわたって対をなしていないヌク レオチド塩基を獲得する。

もし対象の核酸が一本鎖であるならこの工程は必要ではない。第２に、対象の核 酸を含むサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとてオリゴヌクレオチドブ ライマーと接触させる。このオリゴヌクレオチドブライマーは、同定すべきヌク レオチド塩基のすぐ隣りの、対象の核酸に存在しているヌクレオチド塩基の鎖と ハイブリダイズして、プライマーと対象の核酸との二量体を形成することができ 、従って同定すべきヌクレオチド塩基は、プライマーと対象の核酸との二量体に おける、このプライマーの３′末端のすぐ下流にあるこの鋳型における最初の対 をなしていない塩基となる。従って、例えばＤＮＡポリメラーゼにより触媒され る、一つのヌクレオチドのかたわらで生ずる二量体におけるオリゴヌクレオチド ブライマーの酵素的伸長は、同定すべきヌクレオチド塩基に付加されたヌクレオ チドの正しい塩基対合に依存する。

プライマーと対象の核酸との二量体を次に４種のラベル化ターミネータ−を含む 試薬と接触させる。各ターミネータ−は異なる検出可能マーカーによりラベルさ れている。プライマーと対象の核酸との二量体を、この試薬の中に存在する相補 性ターミネータ−と同定すべきヌクレオチド塩基との塩基対合を可能にし、且つ 、このプライマーの３′末端においてこのターミネータ−が一体化されるような 鋳型依存性プライマー伸長反応の発生を可能とする条件のもとて該試薬と接触さ せる。目的（ネット）の結果は、オリゴヌクレオチドプライマーが１個のターミ ネータ−によって伸長されることにある０次に、伸長化プライマーの３′末端に 存在している検出マーカーの同一性を決定する。検出マーカーの同一性は、どの ターミネータ−が対象の核酸における次の塩基と塩基対合したかを示唆する。

このターミネータ−は対象の核酸における次の塩基と相補するため、対象の核酸 における次の塩基の同一性がそれ故決定される。

本発明はまた対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決 定するための別の方法を提供する。この更なる方法は４種のターミネータ−のう ち１種のターミネータ−のみが検出マーカーを有するものを含む試薬を利用する 。

本発明はまた、１又は複数の特定の位置それぞれにて存在している塩基又は複数 の塩基を同定することを含んで成る核酸のサンプルの分類方法を提供し、かかる ヌクレオチド塩基それぞれは前記した通りの対象の核酸における特定の位置での ヌクレオチド塩基の一致を決定するための方法のうちのいづれかを利用して同定 される。対象の核酸におけるそれぞれの特定の位置は異なるプライマーを用いて 決定される。各位置での各ヌクレオチド塩基又は複数の塩基の同一性を独立して 決定することができ、又は種々の位置でのヌクレオチド塩基の同定を同時に決定 することができる。

本発明は更に、１又は複数の特定の位置それぞれにて存在している塩基又は複数 の塩基を同定することを含んで成る、核酸を含むサンプル中の種々の対立遺伝子 を同定するための方法を提供する。各ヌクレオチドの同一性は前記した対象の核 酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定するための方法によ り決定される。

本発明はまた、ｌ又は複数の特定の遺伝子座での生物のゲッタイブを決定するた めの方法を提供し、この方法はゲノムＤＮＡを含むサンプルを生物から獲得し、 次いで対象の核酸における１又は複数の特定の位置それぞれに存在するヌクレオ チド塩基又は複数の塩基を同定することを含んで成る。かかる塩基それぞれの同 一性は前記した通りの対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同 一性を決定するための方法のいづれかを利用して決定される。ヌクレオチド塩基 の一致は種々の対立遺伝子を決定、それ故１又は複数−トラジオグラフィーによ りアッセイした。

図４．プライマーＴＧＬ３４６及びＴＧＬ３９１のラベル化伸長生成物のゲル電 気泳動分析、ビーズ：結合型オリゴヌクレオチド鋳型ＴＧＬ３８２と、ＴＧＬ３ ４６又はＴＧＬ３９１との生産プライマー−鋳型複合体を４種の異なる〔α−土 、１　１ｓ３）ジデオキシヌクレオシド三リン酸混合物によりプライマー伸長ラ ベル反応にかけた。ラベル化プライマーＤＮＡを洗浄ビーズから遊離させ、次い で８％のポリアクリルアミド／８Ｍの尿素のＤＮＡシーケンシングゲル上で電気 泳動にかけ（２，５ｐｍｏｌｅのプライマー／レーン）、次いでオートラジオグ ラフィーにより分析した。プライマーＴＧＬ３４６についての４本のレーンはラ ベル化がｄｄｅｄ合物により優先的に生ずることを示し、ＴＧＬ３８２鋳型にお けるＴＧＬ３４６の３′末端に隣り合う次の対をなしていない塩基がＧであるこ とを示唆している（実施例４に示す配列を参照のこと）、プライマー↑ＧＬ３９ １についての４本のレーンはラベル化がｄｄＴｄ合物により優先的に生ずること を示し、ＴＧＬ３８２鋳型におけるＴＧＬ３９１の３′末端に隣り合う次の対を なしていない塩基がＡであることを示唆している。

図５．ビーズに結合した全放射性活性のオートラジオグラフ分析。

図５に記載の伸長反応の生成物を含むビーズ懸濁物を濾紙の上にスポットしくス ポット当り１　ｐｍｏｌｅのプライマー）、そして全ビーズ結合化放射性活性を アシセイするためにＸ、＊フィルムに暴露させた。

示す通り、ＴＧＬ３４６はｄｄＣｄ合物からのラベルを主に取り込み、そしてＴ ＧＬ３９１はｄｄ↑混合物からのラベルを主に取り込んだ。

図６゜哺乳動物ＤＮＡのＰＣＲ増幅化多形態遺伝座、　ＰＣＲプライマーＴＧＬ ２４０　（ビオチニル化）及びＴＧＬ２３９　（ビオチニル化していない）を用 いてゲノムＤＮ＾のサンプルから増幅せしめた３２７塩基対の哺乳動物ＤＮＡの セグメントを示す。２種類のホモ接合個体、ＥＳＢ１６４　（ゲッタイブＡＡ） 及びＥＡ２０１４　（ゲッタイブＢＢ）由来のＤＮＡのサンプルを実施例５に記 載の分析に付した。この遺伝子座でのＡ対立遺伝子の完全ＤＮＡ配列を、このＡ 配列の下の塩基により示すＢ対立遺伝子配列がＡ対立遺伝子配列と異なっている 箇所の多形態部位と共に示す。

検出プライマーＴＧＬ３０８はビオチニル化プライマーから伸長させた鋳型鎖と 塩基対合させて示す、Ａ対立遺伝子について、ＴＧＬ３０８の３′末端のすぐ下 流の対をなしていない鋳型塩基はＣであり、そしてＢ対立遺伝子については、こ の塩基はＡである。従って、Ａ対立遺伝子はｄｄＧｄ合物によってのみＴＧＬ３ ０８のラベル化がもたらされ、そしてＢ対立遺伝子はｄｄ丁丁合合物よってのみ ラベル化がもたらされるであろう。

図７．２種の異なるホモ接合個体に由来するＰＣＲ生成物のゲル電気泳動分析、 ２種の個体、ＥＳＢ１６４及びＥＡ２０１４からゲノム［ｌＮＡ　（血液より獲 得）を増幅させるためにプライマーＴＧＬ２４０及びＴＧＬ２３９を用いた。図 ７に概略する通り、ビーズ結合型ＰＣＲ作製化鋳型にアニールさせたプライマー ＴＧＬ３０８に関する伸長反応の生成物を、図５に概略した通りの８％のポリア クリルアミド／８Ｍの尿素のＤＮＡ　シーケンシングゲル上で電気泳動により分 析した０個体ＥＳＢ１６４　（ゲッタイブＡＡ　：　ｄｄＧｄ合物よりラベル化 が予測）については、４種の異なるｄｄＮＴＰｄベル化反応に由来する２５０ｆ ｍｏｌｅの伸長化プライマーを示す。

個体εＡ２０１４　（ゲッタイブＢＢ　：　ｄｄＴｄ合物よりラベル化が予測） については、４種の異なるｄｄＮＴＰｄベル化反応に由来する２５．７５及び２ ５０ｆｍｏｌｅの伸長化プライマーの添加を示す。

図８　、　ＴＧＬ３０８プライマー伸長反応に由来する生及びＮａＯＨ溶離化放 射活性のオートラジオグラフ分析。プライマーＴＧＬ３０Ｂは、実施例５並びに 図７及び８に概略する通り、個体ＥＳＢ２１４及びＥＡ２０１４のゲッタイブを 分析するために用いた。全ビーズ結合化放射活性は、７５ｆｍｏｌｅのプライマ ーを含むビーズ懸濁物を濾紙上に直接スポットし、続いてこのスポット中のラベ ルのオートラジオグラフィー検出によって決定した。ＴＧＬ３０Ｂプライマーに 特異的に結合した放射活性は、このビーズを磁気的に固定化し、実施例４及び５ に記載の通りプライマーをＮａＯＨで溶離させ、次いで７５ｆｍｏｌｅに相当す る量を濾紙上にスポットすることによって決定した。これらのスポット中のラベ ルもオートラジオグラフィーにより検出した。

図９゜種々のゲッタイブのヒトＤＮＡサンプル由来の非対称型ＰＣＲにより作っ た一本鎖核酸に基づ＜　ＧＢＡからのデーターを示す。調べたＤＮＡ配列はＤＰ アルファー鎖のアミノ酸３１についてコードする多形態配列でのＨＬＡ　ＤＰＡ Ｉ遺伝子座（Ｍａｒｓｈ、　Ｓ、Ｇ、！、とＢｏｄ＋ｗｅｒ、　Ｊ、Ｇ、、　Ｈ ＬＡＣｌａｓｓ　Ｕ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ、１９９１． 　Ｈｕ＋ｗａｎ　ｌ５ｎｕｎｏ１．　３Ｌ　２０７−２２７　（１９９１）　） に由来し、そしてこの図の中央に示している。プライマーのすぐ下流のヌクレオ チドの同定は酵素結合化検出により行われ、そしてＴ７　ＤＮＡポリメラーゼに よって挿入されたヌクレオチドに対応するウェルにおいて橙色の色調変化として 識別された。ホモ接合体は１つの陽性ウェルしかなく、ヘテロ接合体は２つであ った。

ＧＢＡプライマーの配列を矢印で示し、その尾部はオリゴヌクレオチドの５′で あり、そしてその頭部は３′である。

図１０゜種々のゲッタイブのウマＤＮＡサンプル由来の非対称型ＰＣＨにより作 った一本鎖核酸に基づ＜　ＧＢＡからのデーターを示す。調べたＤＮＡ配列はＤ Ｐアルファー鎖のアミノ酸５０についてコードする多形態配列でのＨＬＡ　ＤＰ ＡＩ遺伝子座（門ａｒｓｈ、　Ｓ、Ｇ、Ｅ、とＢｏｄｍｅｒ、　Ｊ、Ｇ、、　） ＩＬＡＣｌａｓｓ　Ｕ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ、１９９１ ．　Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、３Ｌ　２０７−２２７　［１９！ｌ１ｌ）　 ）に由来し、そしてこの図の中央に示している。

図１１．種々のゲッタイブのウマＤＮＡサンプル由来の非対称型ＰＣＲにより作 った一本鎖核酸に基づ＜　ＧＢＡからのデーターを示す。調べたＤＮＡ配列はは じめにクローンしたゲノム断片に関するヌクレオチド番１２２での多形態配列で の不明の遺伝子座ＪＨ１８５（未発表結果）に由来し、そして図の中央に示す。

この位置で、ｒＢ、対立遺伝子は一個の追加塩基を含む。従って、別のヌクレオ チド位置を＃３０８と対比させてプライマー＃３０７により調べた。どちらにし ても、両鎖の調査結果は正確な分類をもたらした。

図１２゜ウマ遺伝子座ＪＨ８５の定量的ＧＢＡの結果のデーターを示す、基質の 添加後、ｒ　Ｖｍａｘ　Ｊモデル９６穴分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅ ｖｉｃｅｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ）においてマイクロプレートを速度 論的に読み取った。値はミリＯＤ単位／分においてＶｍａｘとして表わした。Ａ Ａホモ接合（べた塗り捧）　、ＡＢヘテロ接合（白抜き棒）及びＢＢホモ接合（ 網かけ捧）の−末鎖鋳型についてのＧＢＡ結果を別々のウェルにおいて分析した ４種のビオチニル化ｄｄＮＴＰに関して示す、獲得した数値を各棒の上に示す。

発明の詳細な説明 本発明は、水性担体と、核酸鋳型依存性プライマー伸長反応の少なくとも２種類 の異なるターミネータ−の混合物とを含んで成る試薬組成物を提供する。それぞ れのターミネータ−は、このプライマーの３′末端に隣接し、且つ、その下流に ある、鋳型における対をなしていないヌクレオチド塩基の同一性に厳格に依存す る状況において伸長反応を特異的に停止せしめることが可能である。更に、この ターミネータ−の少なくとも一方は検出可能マーカーによりラベルされている。

本発明は更に、水性担体と、核酸鋳型依存性プライマー伸長反応の４種の異なる ターミネータ−の混合物とを含んで成る試薬組成物を提供する。それぞれのター ミネータ−は、上記のように伸長反応を特異的に停止せしめることが可能であり 、そしてこれらのターミネーターのうちの少なくとも１種が検出マーカーにより ラベルされている。

本発明は更に、水性担体と、核酸依存性プライマー伸長反応の４種の異なるター ミネータ−の混合物とを含んで成る試薬組成物を提供する。それぞれのターミネ ータ−は前記の通り伸長反応を特異的に停止せしめることができ、そしてターミ ネータ−の２，３又は４種が異なる検出可能マーカーによってラベル化されてい る。

本発明は更に前記した試薬であって、そのターミネータ−がヌクレオチド、ヌク レオチド類似体、ジデオキシヌクレオチド又はアラビノース三リン酸を含んで成 る試薬を更に提供する０本発明はまた試薬であって、そのターミネータ−が１又 は複数のジデオキシアデノシン三リン酸（ｄｄＡＴＰ）　、ジデオキシシトシン 三リン酸（ｄｄｅＴＰ　）、ジデオキシグアノシン三リン酸（ｄｄＧＴＰ）、ジ デオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ　）又はジデオキシウリジン三リン酸（ ｄｄＵＴＰ　）を含んで成る試薬を提供する。

本発明は更に上記した試薬であって、そのターミネータ−に付加された検出マー カーそれぞれがアイソトープ性ラベル化成分、発色団、蛍光団、タンパク質成分 、又は成分であってそれにアイソトープ性ラベル化成分、発色団、蛍光団もしく はタンパク質成分が付加されうるものである試薬を提供する０本発明は種々の検 出マーカーそれぞれが異なる蛍光団である試薬も提供する。

本発明は前記した試薬がピロホスファターゼを更に含んで成る試薬も提供する。

発明した試薬は２種以上の連鎖ターミネータ−より成り、ここでこの連鎖ターミ ネータ−のうちの１種以上は同定可能なようにタッグされている。この試薬は１ 種以上のオリゴヌクレオチドブライマーに相補性である対象の核酸配列を分類す るＤＮＡポリメラーゼプライマー伸長反応に利用することができ、これはポリメ ラーゼ伸長させたプライマーを連鎖ターミネータ−試薬より化学的に又は物理的 に分け、次いで末端の付加物を分析することにより行われる。更なる伸長を阻止 する任意の種類のターミネータ−１例えばジデオキシヌクレオシド三リン酸が利 用できる。ターミネータ−をラベル化及び検出するためにいくつかの手法が利用 できる：　（１）放射活性、及びオートラジオグラフィーもしくはシンチレーシ ッン計測のいづれかによるその検出、（２）蛍光もしくは吸収分光学、（３）質 量分析、又は（４）タンパク質成分を用いる酵素活性、各ターミネータ−の同一 性は個々に、即ち、１つづつ決定できる。加えて、各ターミネータ−の独立分析 を可能とする方法は、４種までのターミネータ−の一体化を同時に分析すること を可能とする。

本発明は更に対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決 定するための方法を提供する。第１に、もし対象の核酸が二本鎖であるならばか かる核酸を含むサンプルを処理して特定の位置にわたって対をなしていないヌク レオチド塩基を獲得する。

もし対象の核酸が一本鎖であるならこの工程は必要ではない、第２に、対象の核 酸を含むサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとてオリゴヌクレオチドプ ライマーと接触させる。このオリゴヌクレオチドブライマーは、同定すべきヌク レオチド塩基のすぐ隣りの、対象の核酸に存在しているヌクレオチド塩基の鎖と ハイブリダイズして、プライマーと対象の核酸との二量体を形成することができ 、従って同定すべきヌクレオチド塩基は、プライマーと対象の核酸との二量体に おける、このプライマーの３′末端のすぐ下流にあるこの鋳型における最初の対 をなしていない塩基となる。従って、例えばＤＮＡポリメラーゼにより触媒され る、一つのヌクレオチドのかたわらで生ずる二量体におけるオリゴヌクレオチド ブライマーの酵素的伸長は、同定すべきヌクレオチド塩基に付加されたヌクレオ チドの正しい塩基対合に依存する。

プライマーと対象の核酸との二量体を次に４１１のラベル化ターミネータ−を含 む試薬と接触させる。各ターミネータ−は異なる検出可能マーカーによりラベル されている。プライマーと対象の核酸との二量体を、この試薬の中に存在する相 補性ターミネータ−と同定すべきヌクレオチド塩基との塩基対合を可能にし、且 つ、このプライマーの３′末端においてこのターミネータ−が取り込まれるよう な鋳型依存性プライマー伸長反応の発生を可能とする条件のもとて該試薬と接触 させる。目的の結果は、オリゴヌクレオチドブライマーが１個のターミネータ− によって伸長されることにある０次に、伸長化プライマーの３′末端に存在して いる検出マーカーの同一性を決定する。検出マーカーの同一性は、どのターミネ ータ−が対象の核酸における次の塩基と塩基対合したかを示唆する。このターミ ネータ−は対象の核酸における次の塩基と相補するため、対象の核酸における次 の塩基の同一性がそれ故決定される。

本発明は更に対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決 定するための別の方法を提供する。第１に、もし対象の核酸が二本鎖であるなら ばかかる核酸を含むサンプルを処理して特定の位置にわたって対をなしていない ヌクレオチド塩基を獲得する。もし対象の核酸が一本鎖であるならこの工程は必 要ではない。

第２に、対象の核酸を含むサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとてオリ ゴヌクレオチドプライマーと接触させる。このオリゴヌクレオチドプライマーは 、同定すべきヌクレオチド塩基のすぐ隣りの、対象の核酸に存在しているヌクレ オチド塩基の鎖とハイブリダイズして、プライマーと対象の核酸との二量体を形 成することができ、従って同定すべきヌクレオチド塩基は、プライマーと対象の 核酸との二量体における、このプライマーの３′末端のすぐ下流にあるこの鋳型 における最初の対をなしていない塩基となる。

プライマーと対象の核酸との二量体を次に４種のラベル化ターミネータ−を含む 試薬と接触させ、ここでそれらのターミネータ−のうちの１種のみが検出マーカ ーを有するプライマーと対象の核酸との二量体を、この試薬の中に存在する相補 性ターミネータ−と同定すべきヌクレオチド塩基との塩基対合を可能にし、且つ 、このプライマーの３′末端においてこのターミネータ−が一体化されるような 鋳型依存性プライマー伸長反応の発生を可能とする条件のもとて該試薬と接触さ せる。目的の結果は、オリゴヌクレオチドプライマーが１個のターミネータ−に よって伸長されることにある。

プライマーと対象の核酸との最初の二量体を次に３種類の異なる試薬と接触させ 、ここでこの４通りの平行反応工程それぞれにおいて、４種のターミネータ−の うちの１種づつがラベルされている。

次に、この４通りの平行鋳型依存性プライマー伸長反応の生成物を、どの生成物 が検出マーカーを有しているかを決定するために調べる。

検出マーカーを有する生成物は、どのターミネータ−が対象の核酸における次の 塩基と塩基対合したかを示す、ターミネータ−は対象の核酸における次の塩基に 相補するため、これにより対象の核酸における次の塩基の同一性が決定される。

対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定するこの両 方の方法は、プライマーと鋳型とのハイブリダイゼーションの後にプライマーを ラベルしている。もし鋳型−依存性酵素がエキソヌクレアーゼ機能を有さないな ら、ターミネータ−によるラベル化が起こるためにこのプライマーの３′未満を 塩基対合すべきである。

本発明は更に核酸のサンプルにおける特定のヌクレオチド配列の有無を決定する ための方法を提供する。第１に、もし対象の核酸が二本鎖であるならばかかる核 酸を含むサンプルを処理して特定の位置にわたって対をなしていないヌクレオチ ド塩基を獲得する。もし対象の核酸が一本鎖であるならこの工程は必要ではない 。第２に、核酸のサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとてオリゴヌクレ オチドプライマーと接触させる。このオリゴヌクレオチドブライマーは、もし特 定のヌクレオチド配列が存在しているならばその特定のヌクレオチド配列とハイ ブリダイズすることができ、このプライマーと特定のヌクレオチド配列との二量 体を形成することができる。

存在するならば、プライマーと特定のヌクレオチド配列との二量体を次に４種の ラベル化ターミネータ−を含む試薬と接触させる。

各ターミネータ−は異なる検出可能マーカーによってラベルされている。存在す るならば、プライマーと特定のヌクレオチド配列との二量体を該試薬と、該試薬 中に存在している相補性ターミネータ−とこのプライマーの３′末端の下流の対 をなしていない鋳型ヌクレオチド塩基とを塩基対合させ（このプライマーはこの 鋳型における特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズしている）、そして鋳型 依存性プライマー伸長反応が起こることを可能とする条件のもとで接触させて、 このプライマーの３′末端にてターミネータ−を一体化させる。検出マーカーの 有無はこのプライマーがこの鋳型にノ＼イブリダイスしたかを示唆する。もし検 出マーカーが存在していないなら、このプライマーはこの鋳型にハイブリダイズ していなく、従って特定のヌクレオチド配列がこの核酸サンプルの中に存在して いないことになる。もし検出マーカーが存在しているなら、このプライマーは鋳 型にハイブリダイズしていな（、従って特定のヌクレオチド配列がこの核酸サン プルの中に存在していることになる。

本発明は更に核酸のサンプルにおける特定のヌクレオチド配列の有無を決定する ための別の方法を提供する。第１に、もし対象の核酸が二本鎖であるならばかか る核酸を含むサンプルを処理して特定の位置にわたって対をなしていないヌクレ オチド塩基を獲得する。

第２に、核酸のサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとてオリゴヌクレオ チドブライマーと接触させる。このオリゴヌクレオチドブライマーは、もし特定 のヌクレオチド配列が存在しているならばその特定のヌクレオチド配列とハイブ リダイズすることができ、このプライマーと特定のヌクレオチド配列との二量体 を形成することができる。

存在するならば、プライマーと特定のヌクレオチド配列との二量体を次に４種の ラベル化ターミネータ−を含む試薬と接触させる。

ターミネータ−のうちの一種のみが検出可能マーカーによってラベルされている 。存在するならば、プライマーと特定のヌクレオチド配列との二量体を該試薬と 、該試薬中に存在している相補性ターミネータ−とこのプライマーの３′末端の 下流の対をなしていない鋳型ヌクレオチド塩基とを塩基対合させ（このプライマ ーはこの鋳型における特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズしている）、そ して鋳型依存性プライマー伸長反応が起こることを可能とする条件のもとで接触 させる。目的の結果は、プライマーの３′末端でのターミネータ−の一体化であ る。

存在しているならば、プライマーと特定のヌクレオチド配列との最初の二量体を 次に３種類の異なる試薬接触させる。ここでこの４通りの平行反応工程において 、４１１Ｉのターミネータ−のうちの１種づつがラベルされている０次に、この ４通りの平行の鋳型依存性プライマー伸長反応の生成物を、存在しているなら、 どの生成物が検出マーカーを有しているかの決定にかける。検出マーカーの同一 性の有無は、プライマーが鋳型にハイブリダイズしているかどうかを示唆する。

もし検出マーカーがどの生成物においても存在していないなら、このプライマー は鋳型にハイブリダイズしていないことになり、従って特定のヌクレオチド配列 が核酸サンプルの中に存在していないことになる。もし検出マーカーがいづれか の生成物において存在しているなら、このプライマーは鋳型にハイブリダイズし ていることになり、従って、特定のヌクレオチド配列が核酸サンプルの中に存在 していることになる。

対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定するための 方法及び核酸のサンプル中の特定のヌクレオチド配列の有無の決定のための方法 の種々のバージョンが可能である。第１バージヨンにおいては、鋳型はデオキシ リボ核酸であり、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌ クレオチド又はデオキシリボヌクレオチドとりボヌクレオチドとの共重合体であ り、そして鋳型依存性酵素はＤＮＡポリメラーゼである。このバージョンはＤＮ Ａ生成物を供する。第２バージロンにおいては、鋳型はリボ核酸であり、プライ マーはオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド又はデオキシ リボヌクレオチドとりポヌクレオチドとの共重合体であり、そして鋳型依存性酵 素は逆転写酵素である。このバージョンはＤＮＡ生成物を供する。第３のバージ ョンにおいては、鋳型はデオキシリボ核酸であり、プライマーはオリゴリボヌク レオチドであり、そして酵素はＲＮ＾ポリメラーゼである。

このバージジンはＲＮＡ生成物を供する。第４のバージョンにおいては、鋳型は リボ核酸であり、プライマーはオリゴリボヌクレオチドであり、そして鋳型依存 性酵素は、ＲＮＡＮプレカーゼである。このバージョンはＲＮＡ生成物を供する 。

好ましくは、プライマー伸長反応を行う前に、この鋳型の３′末端へのターミネ ータ−の付加によってこの鋳型にキャップを付す。

このターミネータ−は鋳型依存性プライマー伸長反応を停止させることができる 。この鋳型はキャップが付されて更なるラベル化ターミネータ−がこの鋳型の３ ′末端に付加されないようになっている。

伸長反応は鋳型ではなく、プライマーに基づいて生ずるべきである。

鋳型にキャップを付するためのターミネータ−としてジデオキシヌクレオチドが 利用できる。

対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の囮−性を決定するための 方法の別の改良法は、伸長反応後に適当な変性条件を用いて対象の核酸からプラ イマーを分けることにある。この変性条件は熱、アルカリ、ホルムアミド、尿素 、グリオキサル、酵素及びそれらの組合せを含んで成りうる。変性条件は２．Ｏ ＮのＮａＯＨによる処理も含んで成りうる。

対象の核酸は非天然ヌクレオチド類似体、例えばデオキシイノシン又は７−ジア ザ−２′−デオキシグアノシンを含んで成りうる。

これらの類似体はＤＮＡ二量体を不安定にし、従って鎖の完全な分離を伴うこと なく二本鎖サンプル中でプライマーのアニーリング及び伸長反応が生ずることを 可能にしうる。

核酸のサンプルは任意の起源に由来してよい。核酸のサンプルは天然でも合成で もよい（即ち、インビトロで酵素的に合成されたもの）。核酸のサンプルはデオ キシリボ核酸、リボ核酸、又はデオキシリボ核酸とリボ核酸との共重合体を含ん で成りうる。対象の核酸はデオキシリボ核酸、リボ核酸、又はデオキシリボ核酸 とリボ核酸との共重合体であってよい。対象の核酸はインビボで酵素的に合成、 インビトロで酵素的に合成、又は非酵素的に合成されたものでよい。

対象の核酸又は複数の核酸を含むサンプルは生物に由来するゲノムＤＮＡ　、そ のＲＮＡ転写体、又はそのＲＮＡ転写体より調製したｃＤＮＡを含んで成りうる 。対象の核酸又は複数の核酸を含むサンプルは生物に由来するゲノム外ＤＮＡ　 、そのＲＮＡ転写体、又はそのＲＮＡ転写体より調製したｃＤＮ＾を含んで成り うる。また、対象の核酸又は複数の核酸はポリメラーゼ連鎖反応により合成され たものであってよい。

このサンプルは任意の生物から採取できる０本発明の方法を適用することのでき る生物のいくつかの例は植物、微生物、ウィルス、鳥類、を推動物、無を推動物 、哺乳動物、人類、馬、犬、牛、猫、豚又は羊である。

対象の核酸は一体化されなかった試薬及び／又はプライマーからの対象の核酸の アフィニティー分離を可能にするｌ又は複数の成分を含んで成りうる。対象の核 酸は一体化されなかった試薬及び／又はプライマーからの核酸のアフィニティー 分離を可能とするビオチンを含んで成ることができる。この分離は固相支持体に 結合されたストレプトアビジンへのビオチンの結合を介する。対象の核酸の配列 はＤＮ＾配列であって、固相支持体に結合された核酸において存在している相補 鎖との塩基対合を介して、一体化されなかった試薬及び／又はプライマーから対 象の核酸のアフィニティー分離を可能とするものを含んで成ることができる。対 象の核酸は検出マーカーでラベルされていてよい；この検出マーカーはこの試薬 の中に存在している又はプライマーに結合したどの検出マーカーとも異なってい てよい。

該オリゴヌクレオチドブライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリ ボヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチドとりボヌクレオチドとの共重合 体でありうる。このオリゴヌクレオチドブライマーは天然でも合成でもよい。こ のオリゴヌクレオチドブライマーはインビボで酵素的に合成、インビトロで酵素 的に合成、又はインビトロで非酵素的に合成されたものでよい、このオリゴヌク レオチドブライマーは検出マーカーでラベル化されていてよい；この検出可能マ ーカーは試薬の中に存在している、又は対象の核酸に結合している任意の検出可 能マーカーと異なっていてよい。更に、このオリゴヌクレオチドブライマーは、 同定すべきヌクレオチド塩基のすぐ隣りの、且つ、上流の対象の核酸において存 在しているヌクレオチドとハイブリダイズ又はアニールすることが可能であるべ きである。所望のハイブリダイゼーションを達成するための手段は、同定すべき 塩基のすぐ隣りの既知の塩基配列と実質的に相補性の、又は完全に相補性の鋳型 依存性プライマーを獲得することにある。

オリゴヌクレオチドブライマーは一体化されなかった試薬及び／又は対象の核酸 からのプライマーのアフィニティー分離を可能にする１又は複数の成分を含んで 成りうる。オリゴヌクレオチドブライマーは一体化されなかった試薬及び／又は 対象の核酸からのプライマーのアフィニティー分離を可能とするビオチンを含ん で成ることができる、この分離は固相支持体に結合されたストレプトアビジンへ のビオチンの結合を介する。オリゴヌクレオチドブライマーの配列はＤＮＡ配列 であって、面相支持体に結合された核酸において存在している相補鎖との塩基対 合を介して、一体化されなかった試薬及び／又は対象の核酸からプライマーのア フィニティー分離を可能とするものを含んで成ることができる。

本発明はまた、■又は複数の特定の位置それぞれにて存在している塩基又は複数 の塩基を同定することを含んで成る核酸のサンプルの分類方法を提供し、かかる ヌクレオチド塩基それぞれは前記した通りの対象の核酸における特定の位置での ヌクレオチド塩基の同一性を決定するための方法のうちのいづれかを利用して同 定される。

対象の核酸におけるそれぞれの特定の位置は異なるプライマーを用いて決定され る。各位置での各ヌクレオチド塩基又は複数の塩基の同一性を独立して決定する ことができ、又は種々の位置でのヌクレオチド塩基の同定を同時に決定すること ができる。

本発明はまた、ｌ又は複数の特定のヌクレオチド配列の有無を決定することを含 んで成る核酸のサンプルを分類する別の方法を提供し、かかるヌクレオチド配列 のそれぞれの有無は、前記した澹≠央通りの核酸のサンプル中の特定のヌクレオ チド配列の有無を決定するための方法のいづれかを利用して決定される。

本発明はまた、核酸を含むサンプルを分類する別の方法を提供する。第１に、１ 又は複数の特定のヌクレオチド配列の有無を決定する；かかるヌクレオチド配列 のそれぞれの有無は、前記した通した通りの核酸のサンプル中の特定のヌクレオ チド配列の有無を決定するための方法のいづれかを利用して決定される。次に、 １又は複数の特定の位置に存在しているヌクレオチド塩基又は複数の塩基を同定 する；かかる塩基それぞれは、前記した通りの対象の核酸における特定位置での ヌクレオチド塩基の同一性を決定するための方法のいづれかを利用して同定され る。

本発明は更に、核酸を含むサンプルにおける種々の対立遺伝子を同定するための 方法を提供し、この方法は１又は複数の特定の位置それぞれでの塩基又は複数の 塩基を同定することを含んで成る。各ヌクレオチド塩基の同一性は、前記した通 り、対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定するた めの方法により決定される。

本発明はまた、１又は複数の特定の遺伝子座での生物のゲッタイブを決定するた めの方法を提供し、この方法はゲノムＤＮ＾を含むサンプルを生物から獲得し、 次いで対象の核酸におけるｌ又は複数の特定の位置それぞれにて存在しているヌ クレオチド塩基又は複数の塩基を同定することを含んで成る。かかる塩基それぞ れの同定は、前記した通りの対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩 基の同一性を決定するための方法のいづれがを用いて決定される。

ヌクレオチド塩基の同一性は種々の対立遺伝子を決定し、それ故ｌ又は複数の特 定の遺伝子座での生物のゲノムタイプを決定する。

適当なオリゴヌクレオチドブライマー、並びに付随した３′から５′に至るエキ ソヌクレアーゼ機能を有する又は有さないＤＮＡポリメラーゼ、並びに適当な塩 及び補因子混合物との組合せにおける連鎖停止剤は、適当なハイブリダイゼーシ ョン条件のもとで、適当なプライマー選別技術を用いたなら、核酸の診断又は分 類のためのキットとして利用できる。プライマー選別及び末端ヌクレオチド付加 分析を簡素化するため、本発明はアフィニティー選別及びポリメラーゼ伸長を可 能とするように改良されたオリゴヌクレオチドを利用する０合成オリゴヌクレオ チドの５′末端及び内部ヌクレオチドは種々のアフィニティー選別手法を可能と する数多くの様々な方法、例えばビオチニル化において改良されうる。これらの アフィニティー試薬は伸長せしめた（複数の）オリゴヌクレオチドの分析を促進 せしめるために下記の２通りの方法においてターミネータ−混合物と共に用いる ことができる： （１）もし単一のアフィニティー基を（複数の）オリゴヌクレオチド上に用いる なら、（複数の）オリゴヌクレオチドは、一体化されていないターミネータ−試 薬から分けることができる。これは物理的又はサイズ的選別の必要をなくす。

（２）複数のアフィニティー基を用いるなら、複数のオリゴヌクレオチドはター ミネータ−試薬から分離されて同時に分析されることができる。これは伸長反応 当り複数の核酸物質の分析又はより多くの核酸配列情報を可能とする。

この（複数の）アフィニティー基はプライムに付されたオリゴヌクレオチド上に ある必要はなく、他方、鋳型上にあってよい、このプライマーがアフィニティー 選別工程中に鋳型に水素結合している限り、このことは一体化されていないター ミネータ−試薬からのプライマーの効率的な分離を可能とするであろう、このこ とは付加成分の好適な連結のために、プライマー上に自由な部位を残す更なる利 点をも有している０例えば、このプライマーの５′末端はそれに適当な蛍光基、 例えばローダミンを結合させることにより改質されることができ、このことはア フィニティー選別工程の後にプライマー：鋳型複合体におけるプライマーの量が 簡単に定量されることを可能にする。従って３′末端化ターミネータ−の量はア ニール化プライマーの全量に対して標準化されうる。

このオリゴヌクレオチドプライマー及び鋳型は任意の長さもしくは配列であって よく、ＤＮＡもしくはＲＮＡであってよく、又はそれらの任意の改良体であって よい、しかしながら必要ならば、対象の標的配列に対するプライマー緊縮ハイプ リダイゼーシッンを最適化する条件を選ぶ。

鋳型依存性プライマー伸長反応の発生のための条件は、適当な鋳型依存性酵素の 存在下によりある程度作られうる。いくつかの適当な鋳型依存性酵素はＤＮＡポ リメラーゼである。このＤＮＡポリメラーゼは複数のイタブでありうる。しかし ながら、このＤＮＡポリメラーゼはプライマー及び鋳型依存性でな（ではならな い０例えば、ＬユｆｉＤＮＡポリメラーゼＩもしくはその「フレノウフラグメン ト」、Ｔ４ＤＮ＾ポリメラーゼ、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ（「シーケナーゼ」 ）、Ｌアクア−カス（Ｔ、　ａ　ｕａｔｉｃｕｓ）　ＤＮＡポリメラーゼ、又は レトロウィルス逆転写酵素が利用できる。　ＲＮ＾ポリメラーゼ、例えばＴ３又 はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼはいくつかのプロトコールにおいて用いることもで きる。ポリメラーゼに依存して、種々の条件を利用しなくてはならず、そして種 々の温度域がハイブリダイゼーション及び伸長反応のために必要でありうる。

本発明の試薬は、特定のハイブリダイゼーション及びポリメラーゼ連鎖伸長条件 のもとでプライマー又は複数のプライマーに対するターミネータ−の３′末端付 加の分析を促進せしめることにより、対象の核酸の分類を可能とする。ヌクレオ チドミリン酸基質としてのターミネータ−混合物のみを利用することは、ポリメ ラーゼ反応におけるプライマーの３′末端に対する１個のヌクレオチド残基のみ の付加を確実にする。同時に４種のターミネータ−を全て用いることは、精度、 即ち、誤解説の抑制を確実にする。

１又は複数のターミネータ−を特異的にラベル化することにより、伸長化プライ マー配列を推定することができる。原理的には、もし複数のターミネータ−が特 異的にラベル化されているなら、複数の反応生成物を一回の反応当りに分析する ことができる。

（複数の）オリゴヌクレオチドプライマー又は（複数の）鋳型に、３′伸長反応 には影響を及ぼさないがアフィニティー選別を可能とする成分を特異的につなげ ることにより、反応後に、一体化されていないターミネータ−１この試薬の他の 成分及び／又は鋳型鎖から（複数の）伸長生成物を分離せしめることができる。

もし複数のアフィニティー因子を利用するなら、複数のオリゴヌクレオチドを伸 長反応当り分析することができる。

原理的には、４種の異なるラベル化ターミネータ−と、異なる基のつなげられた 数多くのプライマー又は鋳型との組合せは、数多くの異なる核酸配列の同時分類 を可能とする。

この診断反応における特異性は、 （１）オリゴヌクレオチドハイプリダイゼーシッンの緊縮度、及び（２）単一残 基伸長により獲得される配列情報によって決定される。

Ａ、一般的方法 １、オリゴデオキシヌクレオチドのビオチニル化。

第一アミノ基によってその５′末端が終結しているオリゴデオキシヌクレオチド をＭｉｄｌａｎｄ　Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ、　Ｍｉｄｌａｎｄ 、　Ｔｅｘａｓより注量した。ビオチン−Ｎ−ビトロキシスクシンイミドの誘導 体でをあるビオチン−ＸＸ　−ＮＨＳエステル（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ＋　Ｉｎｃ、。

Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いてこれらをビオチニル化 した。典型的には、このオリゴヌクレオチド（９ナノモル）を０．１ＭのＮａＨ ＣＯｚ／ＮａｚＣＯ３（ｐＦＩ９　）　１００μｍに溶かし、次いで２．５ｍｇ のビオチン−ＸＸ−ＮＩＩＳ−エステルを含むＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド２ ５μｌを加えた。この混合物を室温で一夜インキユベートした０次にこれを！（ ，０で平衡にした６ｍｌのセファデックスのＧ−２５カラム（ｒＤＮＡグレード Ｊ　−Ｐｈａｒｖａｃｉａ）に通した。　［ｌＮＡを含む溶離画分は、４μ＋の アリコートを等容量のエチジウムプロミド（２Ｍｇ／ｍｌ）と混合し、次いでＤ ＮＡ誘発化蛍光物質をＵＶトランスイルミネーターでモニターすることによって 同定する。未反応エステルを２２０ｎｍにてＵＶ吸収により検出する。　ＤＮＡ を含むチューブをプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　−３マイクロコンセントレー タ−（八−１ｃｏｎ）で濃縮し、次いで再びセファデックスに通した。

〔３Ｈ〕−ビオチンの磁性Ｍ−２８０ストレプトアビジンダイナビーズ（Ｄｙｎ ａｌ）への結合の阻止を、オリゴヌクレオチドのビオチニル化の程度を定量的に アッセイするために用いた。エッペンドルブチュープ及びピペットチップをシリ コン処理した。０．１ＭのＮａＣ１１０μｌ中の既知量（５〜Ｌｏｐ−ｏｌｅ） のビオチンラベル化オリゴヌクレオチドを、０．１ＭのＮａＣ１中のｌ：４のビ ーズ懸濁物２５μｍを含むチューブに加えた。これらのチューブをＬａｂｑｕａ ｋｅシューカー（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）で１時間振盪させ た。このチューブに０．１ＭのＮａＣ１２０μｍ中の〔３Ｈ〕−ビオチンを量を 増やしながら（５〜３５ｐｍｏｌｅ）加え、そしてこれらを再び１時間にわたっ て振盪させた。

チューブをＤｙｎａｌ　ＮＰＣ−Ｅマグネット上に載せて懸濁物からビーズを除 去し、この上清液の１０μ！のアリコートを取り出し、そしてこれら中の放射活 性の値をＢｅｃｋ腸ａｎ　ＬＳ　５０００　ＴＤ液体シンチレーシッンカウンタ ーを用いて測定した。そのカウント数を、オリゴヌクレオチドを加えていないチ ューブのそれと対比した。他方、いくつかのプライマーに関しては、ビオチニル 化は０．８Ｍの尿素の存在下における分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動を 用いて反応生成物のサイズ分別によってモニターした。

２−鋳型依存性プライマー伸長／停止反応。

約５　ｐｍｏｌｅの５′−ビオチニル化オリゴデオキシヌクレオチド鋳型（前記 参照）を約３ｐｍｏｌｅのプライマーと、ｒＸのシーケンス用緩衝液（Ｓｅｑｕ ｅｎａｓｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０キツト、ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏｒｐ、由来）（最終容量１０ｕ　Ｉ　）の中で混合し、この混合物を６５℃ で２分間インキュベートし、次いで室温にまで冷やして、プライマーと鋳型をア ニールさせた。アニールした鋳型−プライマーを含む溶液をＡとＢの５μｌづつ に２つに分け、これに以下のものを加えた：反応物Ａ　（ＩＩ準準用用鋳型濃度 −１００ｓｅＨのジチオスレイトール０．５μｍ　１０μＭのｄＡＴＰ、　ｄＧ ＴＰ、　ｄｄＣＴＰをそれぞれｌμｌ、ｒＭｎ緩衝液Ｊ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅν ｅｒｓｉｏｎ　２．０キツト、　ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、由 来）０．５ａ　１．　（”Ｓ）　−α−％ｆ　−ｄＴＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍｌ、 　１１８０Ｃｉ／ｖｗｏｌｅ）（Ｄｕｐｏｎｔ−ＭＥＮ）’　０．５１１１、シ ーケナーゼＩμｌ（１：８希釈、ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　） 　；反応物Ｂ（プライマー３′末端の鋳型特異性ラベル化）−反応物Ａの添加物 と同じ、ただし用いたヌクレオチドはｄｄＣＴＰ、　ｄｄＧＴＰ、　ＤＤＴＴＰ 及ヒ（”Ｓ）　−α−＋ｔ−ｄｄＡＴＰ　トＬ／た。

反応は３７℃で５分とした。プライマー又はシーケナーゼを省いたコントロール も実施した。アリコートを取り出し、そして１５％のポリアクリルアミド、８Ｍ の尿素のＤＮＡ　シーケンシングゲル上泳動により分析した（Ｍａｎｉａｔｉｓ 、　？、らＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　ａ照のこと）。ゲルを１０％の メタノール、１０％の酢酸で固定し、Ｗｈａｔｍａｎの３ＭＭ紙で乾かし、そし てＫｏｄａｋ　Ｘ−０ｓａｔ　ＡＲフィルムに曝露させた。他方、液体シンチレ ーシッンカウンティングによる生成物の分析のため、ビオチニル化鋳型又は鋳型 プライマーをシーケナーゼ反応の前後にて過剰量のＭ−２８０ストレプトアビジ ンダイナビーズ（（ｌｙｎａｌ）に結合させた（結合条件については、前記のｒ ｌ、オリゴデオキシヌクレオチドのビオチニル化」を参照のこと）。ビーズを０ ．１ＭのＮａＣ１で３回洗って一体化されていないラベルを除去し、次いでシン チレーション液体を加え、そして液体シンチレーションカウンティングによって 放射活性を測定した。

３、ポリメラーゼ連鎖反応生成物からの鋳型の作製。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の反応は、ＤＮＡの標的鎖にフランクする１又 は複数の増幅プライマーを前記の通りにビオチニル化させて行った。これらのプ ライマー（最終濃度２μ５ｏｆ）及び標的ＤＮＡＣ１ｕｇまで）を２．５単位の Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）　、２００１１ 　ＭのｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、　１０ｓ＋Ｍのトリス −ＨＣＩ（ｐＨ８，３）　、　５．０ｍＭのＫＣＩ　、　１．５ｍＭのＭｇＣＩ 　Ｚ及びＯ，０１％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした０反応混合 物の上にパラフィン油をかぶせ、そしてＰｅｒｋｉｎ　ＥＩｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ サーモサイクラ−で３０周期にわたってインキュベートした０反応生成物をフェ ノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製し、次いでポリアクリ ルアミドゲルでの電気泳動の後にコチジウムブロミド染色によって分析した。二 量体ＰＣＲ生成物の収量は典型的には約Ｌｏｕｇであった。

このＰＣＲ生成物約５μｇを、０．１ＭのＮａＣ１中の予備洗浄したＭ−２８０ グイナビーズの懸濁物５０μｌと、ゆっくり撹拌しながら６０分にわたってイン キュベートした。結合ＤＮＡ　（約１５ｐｍｏｌｅ）を有するビーズを次に０． １５ＭのＮａＯＨと２５°Ｃで５分間インキュベートした。このビーズを０．１ ５ＭのＮａＯＨで１回洗い、一体化していない［ｌＮＡ　ＩＩを除去し、次いで ＨｚＯで３回洗った。このビーズをＨ，Ｏに再懸濁させ、ビオチン−ストレプト アビジン結合を介してビーズに結合した鎖を更なるプライマー伸長反応物のため の鋳型として用いた。

Ｂ、実施例 実施例１゜ プライマーオリゴ１８２　：　”　ＧＣＣＴＴＧＧＣＧＴＴＧＴＡＧＡＡ”鋳型 オリゴ １８０（Ｃ）／１８１（Ｔ）　：　”　ＴＣＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＣＧＣＡＡＣ ＡＴＣＴＴＣ／ＴＡＴＡＧＡＣＴＡ”オリゴヌクレオチド１８０及び１８１を、 その５′末端に第一アミノ基を付加させて合成した。これらを前述の通りにビオ チンと複合させた。オリゴヌクレオチド１８２をプライマーとしてアニールさせ 、そして伸長反応「Ａ」と「Ｂ」　（前記参照）を実施した。オリゴヌクレオチ １″１８２に至る予測の鋳型依存性３′−末端伸長を下記に示す（ヌクレオチド の前の「＊」は放射活性ラベルを表わす）：鐘呈　反息へ　厘息旦 １８０　−ｄＧ−”ｄＴ−ｄＡ−”ｄＴ−ｄｄｅ　−ｄｄＧ１８１　−ｄＡ−” ｄＴ−ｄＡ−”ｄＴ−ｄｄＣ−”ｄｄｋ従って反応「Ａ」においては、両鋳型ヌ クレオチドは放射活性ラベルされた５個のヌクレオチドのプライマー伸長をもた らすであろう；ラベル化の程度は反応系において存在している効率的にプライム された鋳型の量に比例するであろう０反応ｒＢ、においては、両鋳型はプライマ ーの１個のヌクレオチド伸長をもたらすであろうが、しかしながらプライマーの ラベル化において鋳型１８１に関してのみこのことが得られるであろう、従って 反応「Ｂ」は、生産プライマー−鋳型複合体のＤＮＡポリメラーゼ触媒化伸長を 介するオリゴヌクレオチドの鋳型依存性配列特異性ラベル化の例である。

反応生成物を１５％のポリアクリルアミド／８Ｍの尿素のシーケンシングゲル上 でサイズ分別し、そしてオートラジオグラフで識別した。結果（図Ｉ）は、予測 通り、反応「Ａノが両プライマーのラベル化及び伸長をもたらし、他方、反応ｒ Ｂ、が鋳型１８１に強く偏ったラベル化をもたらすことを示した０図１のパネル ＣはパネルＢと同じ反応生成物のゲル分析を示すが、ただしその反応生成物はＭ −２８０ストレプトアビジンダイナビーズを用いて前記した通りにまず精製しで ある。

依存性ラベル化を示し、ここでそのラベル化はオリゴヌクレオチド又はポリアク リルアミドゲル上で同じように泳動する他の物質に対して特異的である。ゲル泳 動とは無関係に他の全てのラベル化物質に対するオリゴヌクレオチド１８２の鋳 型依存性特異的ラベル化をより一般的に評価するため、一体化させた放射活性の 直接的な測定を行った。この実験において、両方の反応’ＡＪとｒＢ、を行い、 反応生成物をグイナビースを用いて精製し、次いでアリコート中の全放射活性を 液体シンチレーションカウンティングによって測定した。

この手順は他の物質の中へのラベルの誤まった一体化、及びそれに加えて、一体 化されていないヌクレオチドについてのグイナビーズ洗浄手順の効率の両方を評 価せしめる。実際には、プライマーの特異的な鋳型依存性ラベル化を評価するた めの簡単で、ゲルをベースとしない手順を得るために、非特異的なラベルの両起 源を最少限にすることが興味深いとされるであろう、Ｍｉ磁性ビーズ基づく洗浄 後の反応生成物を直接的に計測する結果を下記に示す（全ての結果を３５３のｃ ｐｓとして表わス）： 反皇　鐘二ュ観　誇！」■ Ａ、完全　３２５．７８２　４４１，８２３Ａ、ポリメラーゼなし　５．１８？ 　５，４１６Ａ、プライマーなし　４．３５１　１２．３８６Ｂ、完全　５．６ ７４　１７６．２９１Ｂ、ポリメラーゼなし　２．９８８　１，４１９Ｂ、プラ イマーなし　１　、８８９　１　、２６にれらの結果かられかる通り、プライマ ー１８２の特異的な鋳型依存性ラベル化は、未反応のヌクレオチドを取り除くた めの磁性ビーズを伴う洗浄後の反応生成物の全放射活性を測定することによって 決定することもできる０本実験におけるバックグランドは全ての起源に由来する 非特異的なラベルに基づいて約３〜４％である（「Ｂ。

完全」反応における鋳型１８０と１８１を比較のこと）、コントロール実験（「 ポリメラーゼなし」及び「プライマーなし」）は、バックグランドラベルの値が 、洗浄工程によって完璧に除去されなかった一体化されていないヌクレオチドに おそらく原因することを示す。

「Ａ、完全」反応は、両方の鋳型に関する、生産鋳型ニプライマー複合体が依存 していることを示す。

実施例３ ２種類の増幅プライマー、ＴＧＬ１０５及びＴＧＬ２０６　（図２）を、２種類 のＤＮＡ配列多形態を含む牛ＤＮＡのクローン鎖を増幅させるために用いた：位 置１１４にてＡ又はＴ、そして位置１９０にてＡ又はＧ（図２）。

これらの多形態を含むＤＮＡは分子クローンされ、そして以下のプラスミドに基 づいて獲得できるニブラスミドｐ１８３．　Ｃ１１４及びＡ１９０　；プラスミ ドｐ６２４．　Ｔ１１４及びＡ１０９　；プラスミドｐ８１４．　Ｃ１１４及び Ｇ１９０．ビオチニル化プライマーを伴う４通りのＰＣＲ反応を行って、鋳型と して利用するためのこれらのプラスミドの特定の鎖を増幅及び精製した。

プライマー　プラスミド　技量１蓋漏仁乙二１０５ビオチニル化　ｐ１８３とｐ ６２４　ＴＧＬ１８２１０６ビオチニル化なし １０５ビオチニル化なし　ｐ１８３とｐ８１４　ＴＧＬ１６６１０６ビオチニル 化 二量体ＰＣＲ生成物を磁性微粒子に結合させ、ＮａＯＨで変性させ、そして前記 の通りにビオチニル化鎖を精製した。ビオチニル化ＴＧＬ１０５によって調製し た鋳型をビオチニル化されていないプライマーＴＧＬ１０６によるＤＮＡシーケ ンシングによる分析にかけ、存在している鋳型の量を測定した。同様に、ビオチ ニル化ＴＧＬ１０６を用いて調製した鋳型をビオチニル化していないＴＧＬ１０ ５によるシーケンス化により分析した。

はぼ等容量の鋳型（２ｐｍｏｌｅ）を多形態検出プライマー、丁ＧＬ１Ｂ２とＴ ＧＬ１６６に６５°Ｃで５分間アニールさせた（前記及び図２を参照のこと）。

これらのプライマーは鋳型に、配列特異的状況において水素結合し、それらの３ ′末端はそれぞれ位置１１４と１９０のヌクレオチドの隣りとなっている（図２ ）、４種類のｄｄＮＴＰ　（その１つ（ｄｄＡＴＰ）はラベル化されている）の 存在下においてこれらのプライマー：鋳型複合体に基づいて鋳型依存性プライマ ー伸長反応（反応「Ｂ」条件）を行った。これらの伸長反応生成物を１５％のポ リアクリルアミド／８Ｍの尿素のゲルでの電気泳動、それに続くオートラジオグ ラフィーによって分析した（図３）。

実施例４ プライマーオリゴＴＧＬ３９１：　”ＴＧＴＴＴＴＧＣＡＣＡＡＡＡＧＣＡ”プ ライマーオリゴＴＧＬ３４６：　ｓ′ＧＴＴＴＴＧＣＡＣＡＡＡＡＧＣＡＴ”鋳 型オリゴ　ＴＧＬ３Ｂ２：　３′ＣＡＣＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＧＧ ＡＳ′−ビオスチン＝　（ストレプトアビジンビーズ）オリゴヌクレオチドＴＧ Ｌ３８２をＭｉｄｌａｎｄ　Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｃｏｍｐａ ｎｙ。

Ｍｉｄｌａｎｄ、　Ｔｅｘａｓより購入した。これを５′末端ヌクレオチド位置 において、自動化ＤＮＡ合成における利用に適するＭｉｄｌａｎｄ　Ｄｅｒｔｉ ｆｉｅｄＲｅａｇｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙの「ビオチンｄＸＪ試薬（ビオチン誘 導型ホスホラミジット）を用いてビオチニル化した０次にこのビオチニル化オリ ゴヌクレオチドを陰イオン交換ＨＰＬＣにより精製した。ストレプトアビジン複 合化Ｍ−２８０ダイナビーズをＴＮＥＴ緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　 ｐＨ７，５，１００５ＭのＮａＣ１，１抛門のＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ −１００）で洗い、そして同じ緩衝液の中で７Ｘ１０＠ビ一ズ／ｍｌの濃度にお いて再懸濁させた。１０〜１００ｐ１００ｐのビオチニル化オリゴヌクレオチド ＴＧＬ３８２をＴＮＥＴ中の１００μｌのグイナビーズ懸濁物と３０分間２０℃ でインキュベートして、ビオチン成分をストレプトアビジンに結合させた。この ビーズを次に（それらを固定する磁石を用いて）２００μｍのＴＮＥＴで３回洗 い、そして１００μｌのＴＮＥＴに再懸濁させた。アニール化のため、付加した 鋳型オリゴヌクレオチドを有するグイナビーズのこの懸濁物２５μＩを磁石で固 定し、ＴＮＥＴを除去し、そして２ｇＭのオリゴヌクレオチドブライマー３４６ 又は３９１を含む４抛門のトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，２０ｍＭのＭｇＣ１ ｇ、　５０ｍＭのＮａＣ１２５μｌを加えた。

この鋳型及び各プライマーを６５℃で５分間インキュベートし、次いで室温にま で２０分かけてゆっくり冷やすことによってアニールさせた。鋳型−プライマー −複合体を含むビーズをＴＮＥＴ　２００μｌで２回洗い、続いて４０ｍＭのト リス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，２０５ＭのＭｇＣ１ｚ、　５０ｍＭのＮａＣ１２ ５μｌの中に再懸濁させた。

以下のｄｄＮＴＰ混合物を用いた： ３ＳＳ−ラベル化ジデオキシヌクレオシド三リン酸す合物（ラベル化ヌクレオチ ドはｄｄＮ”ＴＰで示す）：ｄｄＧ混合物：　５ｇＭ　ｄｄＧ”ＴＰ　１０μＭ 　ｄｄＡＴＰ　１０μＭ　ｄｄＴＴＰ１０μＭ　ｄｄｅＴＰ ｄｄＡ混合物＝ｌＯμＭ　ｄｄＧＴＰ　５μ阿ｄｄＡ”ＴＰ　１０μＭ　ｄｄＴ ＴＰ１０μＭ　ｄｄｅＴＰ ｄｄＴ混合物：１０μＭ　ｄｄＧＴＰ　１０μＭ　ｄｄＡＴＰ　５ｇＭ　ｄｄＴ ”↑Ｐ１０μＭ　ｄｄＣＴＰ ｄｄｅ混合物＝ｌＯμＭ　ｄｄＧＴＰ　１０μＭ　ｄｄＡＴＰ　１０μＭ　ｄｄ ＴＴＰ５μＭ　ｄｄｅ”ＴＰ ｄｄＮ”ＴＰは４種のそれぞれの〔α−＋、ｔ−”Ｓ）ジデオキシヌクレオシド 三リン酸である（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＮＺ、１ｅａｒより購入）。

各ビーズ結合化鋳型プライマー複合体につき、４通りの伸長反応を実施した（各 ｄｄＮＴＰ混合物につき１反応）。伸長反応物は下記の成分を含んだニアニール した鋳型プライマー複合体を含む５．０μｌのビーズ懸濁物、１００ｍＭのジチ オスレイトール０．５ｇＩｒＭｎ＋″溶液ＪＯ，５ｔｔ　Ｉ　（１００ｍＭのＭ ｎＣ１ｚ、　１５０＋ｗＭのＤＬ−イソシトレート、　ｐＨ７，０ｉＵ、Ｓ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏより購入）、　 １．０μｍのｄｄＧ。

ｄｄＡ、　ｄｄＴ又はｄｄＣ混合物、２．０μｍのＨｌＯ及び１．０μｍの７７ 　ＤＮＡポリメラーゼ（「シーケンス化」バージョン２．０．υ、Ｓ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｓｉｃａｌｓ。

５〇−阿のトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，１０ｍＭの２−メルカプトエタノー ル。

ｌｌ＋ｇ／ｍｌの牛血清アルブミン中でＴ６２５単位／ｗ＋１）。

反応を２０°Ｃで１５分間行わせ、次いで５０μｍのＴＮＥＴで３回、磁性固定 化ビーズを洗うことにより停止させた。これらのビーズを検定アッセイ前に２５ μｌの最終容量のＴＮＥＴの中に再懸濁させた。

プライマー伸長反応によるラベル化ジデオキシヌクレオチドの一体化を２通りの 方法、即ち、ゲル電気泳動、それに続くオートラジオグラフィー、及びラベル化 ＤＮＡの直接オートラジオグラフィーによりアッセイした。

■、ゲル電気泳動、それに続くオートラジオグラフィー（３５Ｓ−ラベル化物質 のみ）。洗浄せしめたビーズ結合化ＤＮＡを１０μＩのホルムアミド装填用緩衝 液（８０％のホルムアミド、１０１Ｍのトリス−ＨＣｌ。

ｐＨ８、１＋＊Ｍのｌ１ｉＤＴＡ、　０．０２％のプロチフェノールブルー）の 中で９４℃で５分間熱し、そしてプライマー二鋳型複合体からラベル化プライマ ーを遊離させた。サンプル８又は１２．５％のポリアクリルアミド／８Ｍの尿素 シーケンシングゲル（１９：１のアクリルアミド：ビス−アクリルアミド比；　 １００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、　１００ｗＭのボレート、２抛門のＥＤＴＡ、　 ｐＨ８，３のランニング緩衝液；６０ワツトの定常出力）での電気泳動により分 析した。電気泳動後、ゲルを濾紙上で乾かすか、又は−８０℃で凍結して拡散を 防ぎ、プラスチックラップをかぶせ、そしてＸ線フィルムに曝露して、オートラ ジオグラフィーによりラベル化ＤＮＡを識別化させた（図４）。

２、ラベル化ＤＮＡの直接オートラジオグラフィー分析。

ビーズに対する全放射活性結合の分析のため、ＴＮＥＴ中のビーズ懸濁物の１０ μＩのアリコートを濾紙又はナイロン膜上に直接スポットした。フィルター又は 膜を白熱電球のもとで乾かし、プラスチックラップをかぶせ、そしてＸ線フィル ムに曝露した（図５）。

実施例５ ＴＧＬ２４０：　”ＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＣ”ＴＧ Ｌ２３９：　”　ＴＣＡＡＴＡＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧ３　’ ＴＧＬ３０８：　”ＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＣ丁ＧＧＴ３′ オリゴヌクレオチドＴＧＬ２４０を、その５′末端に第一アミノ基を付け、そし て前記した通りビオチンを複合させて合成した。ＴＧＬ２４０（ビオチニル化） 及びＴＧＬ２３９　（ビオチニル化されていない）を、ポリメラーゼ連鎖反応手 順（「Ａ、一般的方法」を参照のこと）を介して哺乳動物ゲノムＤＮＡのサンプ ル中の特定の遺伝子座を含んで成るＤＮＡ　ｆｆｉ域を増幅させるために利用し た。それぞれが特定の組の連結化配列多形態（「Ａ」対立遺伝子及び「Ｂ」対立 遺伝子−図６参照のこと）に対してホモ接合性である２種類の別々の個体に由来 するＤＮＡを調べた。　ＰＣＲ反応の後、２〜２０ｐ曽ｏｌｅの二量体ＰＣＲＤ ＮＡをＴＮＥＴ！ｌ衝液中で１００μｌのストレプトアビジン複合化Ｍ−２８０ ダイナビーズ（７Ｘ１０”ビーズ／　１１１　）とインキュベートして、ビーズ にビオチニル化鎖を結合させた。結合後、ビーズを磁性的に固定化し、２００μ ｌのＴｌｔＥＴで３回洗い、次いで１００μｌのＴＮＥＴに再懸濁させた。

ビオチニル化されていない鎖を除去するため、０．１５ＮのＮａＯＨ５００μｌ を加え、次いでこの懸濁物を２０°Ｃで３０分間インキュベートした。これらの ビーズを磁性的に固定化、そして０．１５ＮのＮａＯＨ２５０μｌで１回、５０ ０μｌのＴＮＥＴで３回洗い、次いで１００μｌのＴＮＥＴに再懸濁させた。

検出プライマーであるオリゴヌクレオチドＴＧＬ３０Ｂ　（図６）を実施例４に 記述の通りにビーズ結合化ＰＣＲ作製鋳型にアニールさせた。

更なる洗浄、伸長反応及び検出ア・ンセイも実施例４に記載の通りに実施した。

２種類のホモ接合個体、ＥＳＢ１６４　（ｒ＾Ａ」ゲッタイブ）及びＥＡ２０１ ４　（’ＢＢＪゲッタイブ）についてのラベル化プライマー伸長生成物のゲルオ ートラジオグラフィー分析を図７に示す。全ビーズ結合化放射性活性又はＮａＯ Ｈ溶離の後のプライマー会合化放射活性のオートラジオグラフィー分析を、フィ ルタースポツティングアッセイを用いて、これらと同一の個体について示す（図 ８）、プライマーのみの分析については、０．４ＮのＮａＯＨ１０μｌを１０μ ｌのビーズ懸濁物に加えた。室温で１０分間インキュベートした後、これらのビ ーズを磁性的に固定化し、そしてその上清液を抜き取り、次いでナイロンブロッ ティング膜の上にスポットした。

実施例６　遺伝ビット分析 ＤＮＡサンプル、ゲノムＤＮＡを、血液を３倍過剰容量のＡＣＫ溶解緩衝液（０ ，１５Ｍの塩化アンモニウム、１ｍＭの炭酸水素カリウム、Ｏ，ｂ＋ＭのＥＤＴ Ａ　）で希釈することによって行われる選択的溶解によって赤血球から富化せし めたヒト又はウマの抹消血液有核細胞より、ＳＤＳ／プロティナーゼに手順（Ｍ ａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＡＬａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　１９ ８９　）を利用して単離した。オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ＋　Ｉｎｃ、　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）モデル３９１ 　自動化ＤＮＡ合成装置を利用し２面相ホスホラミジット化学により調製した。

遺伝ビット分析（ＧＢＡ　）反応において用いるプライマーの場合は、合成の最 終サイクルの後に脱トリメチル化を行わず、そして全長オリゴヌクレオチドはＡ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓオリゴヌクレオチド精製カートリッジ（Ｏ ＰＣ’）を用い、その製造業者の推奨する通りに精製した。

はとんどのＰＣＲ反応については、プライマーは脱保護基反応物を乾かすことに よって直接利用した。５′アミノ基の誘導されたオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入したアミノリング２をその製造業者の 推奨に従って用いて調製した。

オリゴヌクレオチド配列、ウマ遺伝子座Ｊｒ１８５の第１周期増幅のためのプラ イマーは＃９１： ５’　ＣＧＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧＡＧ　３’及び ＃９２：５’　ＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＴ　 ３’　とした、ウマ遺伝子座の第２周期増幅は入れ子プライマー＃　２３９　： ５’　ＴＣＡＡＴＡＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧ　３’及び＃２４ ０：５’　ＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＣ３’を用いて 行った。

ＨＬＡ　ＤＰＡＩ　配列（Ｍａｒｓｈ、　Ｓ、Ｇ、［＋、、　Ｂｏｄｍｅｒ、　 Ｊ、Ｇ、　ＨＬＡ　Ｃ１ａｓｓ　ＩＩＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ｓ＋　１９９１．　Ｈｕ＋ｗａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　３１：２０７−２２７） はプライマー＃４６’７： ５’　ＧＣＧＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＴＡＴ　３’及び＃４４５：５’ 　ＧＣＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＡＡＣＴＧ　３’により得た。

鋳型の調製。ゲノム配列の増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施 した（Ｓａｉｋｉ、　Ｒ，に、、　Ｇｅ１ｆａｎｄ、　Ｄ、Ｈ，、５ｔｏｆｆｓ ｌ　Ｓ、、　５ｃｈａｒｆ。

Ｓｊ、、　Ｈｔｇｕｃｈｉ、　１１．Ｉ　Ｈｏｒｎ、　Ｇ、？、＋　Ｍｕｌｌｉ ｓ＋　Ｋ、Ｂ、＋　Ｅｒ１ｉｃｈ、　Ｈ，Ａ、。

Ｐｒｉｍｅｒ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈ　ａＴｈｅ＋＋ｏｓｔａｂｌｅ　ＤＮＡ　ｐｏ ｌｙｖｅｒａｓｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７−４９１）、第１工程に おいて、１１００ｎのゲノムＤＮＡを、各第１周期プライマーを２μＭ／１０− ＭのトリスｐＨ８，３１５０ｇ＋ＭのにＣ１／１．５ｍＭのＭｇＣ１ｇ／　０． １％のゼラチン／μ、１当りＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ａ＊ｐｌｉｔａｇ、 　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｗｅｒ（ｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ）　０．０ ５単位、の濃度で含む、反応混合物の中で用いた。反応物を集め、そして９４℃ で１．５分、続いて９４°Ｃ／１分を３０サイクル、６０℃／２分、７２°Ｃ／ ３分インキュベートした。第２「非対称型Ｊ　ＰＣＲ（その中には第１反応の生 成物が１　／１０００に希釈されである）において一本ＭＤＮＡが調製された。

これらのプライマーのうちの１つは２μＭの標準濃度で用い、そして他方は０． ０８ＭＭで用いた。これらの条件のもとで、反応中に一本鎖及び二本鎖の両方の 分子が合成された。

核酸の固相固定化、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ　Ｎｕｎｃｌｏｎプレート、Ｒｏ ｓｋｉｌｄｅ、　Ｄｅｎｍａｒｔ）においてＧＢＡ反応を行った。ウェル当り、 ５′アミノ基を有する１０Ｍｍｏｌｅのプライマーを、３ｇＭのリン酸ナトリウ ム緩衝液、ｐＨ６、２０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル ）−カルボジイミド（ＥＤＣ）の中で、室温で一夜インキュベートすることによ ってＧＢＡプライマーをプレートに共有結合させた。

結合後、このプレートを１０ｍＭのトリスｐＨ７，５／１５０ｍＭのＮａＣ１／ 　０．０５％のツイーン２０　（ＴＮＴｗ）で３回洗った。

ビオチニル化ｄｄＮＴＰ、ビオチニル化ｄｄＮＴＰを米国特許第５，０４７，５ １９号に従って合成した。

マイクロウェルプレート中でのＧＢＡ０９６穴プレートに共有結合したプライマ ーへの一本１［ＤＮＡのハイブリダイゼーシヨンを、等容量の３ＭのＮａＮａＣ ｌ１５（１のＥＤＴＡを第２周期非対称型ＰＣＲに付加し、次いで各ウェルを２ ０μＩのこの混合物と５５°Ｃで３０分間インキュベートすることによって行っ た。このプレートを次にＴＮＴｗで３回洗った。　ｄｄＮＴＰ（３−Ｍづつ；そ のうちの１つはビオチニル化１５醜ＨのＤＴＴ／　７．５ｍＭのイソクエン酸ナ トリウム１５ｍＭのＭｎＣ１ｇ　／μｌ当り０．０４単位の改質化Ｔ７　ＤＮＡ ポリメラーゼである）を含む２０μｍのポリメラーゼ伸長混合物を室温で５分イ ンキュベートした。ウェルを０．２ＮのＮａＯＨ５０μｌで室温で５分間インキ ュベートし、次いでウェルを更に０．２ＮのＮａＯＨ５０μＩで洗うことにより 鋳型鎖を除去した。このプレートを次にＴＸＴ−で３回洗った。ビオチニル化ｄ ｄＮＴＰの一体化を酵素結合化アッセイにより測定した。各ウェルを室温で３０ 分間振盪しながら２０μｌのストレプトアビジン−複合化西洋クサビペルオキシ ダーゼ（ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤより購入した製品のＴＸ Ｔ−における１／１０００希釈物）とインキュベートした。　ＴＮＴｗで５回洗 った後に、０．０１２％のＨｔＯｘを含む１００ｕｌの０−フェニレンジアミン （ＯＰＤ。

０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ４，５中でｌｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに加えた。結合 した酵素の量は、反応を停止させた後にプレートを撮影することにより、又はモ レキュラー　デバイス　モデルｒＶｍａＸＪ　９６穴分光光度計を用いて定量的 に決定した。

この手順の一般性を実証するため、２種類の異なる鋳型分子上にある３種類の異 なる部位を分類する能力を示す。図９〜１１の中央には、これらの遺伝子座の多 形態領域を、ＤＮＡサンプルのゲッタイブのために用いたＧＢＡプライマーの配 列と共に示す。試験ＤＮＡサンプルのゲッタイブは予め、制限分析及びゲル電気 泳動（ウマのサンプル）又は対遺伝子特異的ハイブリダイゼーシジン（ヒトのサ ンプル）を用いて決定しである。

図９〜１１の上及び下は、これらの部位の非放射性ＧＢＡ分析の写真である。「 プラス」１ｌｊ（これはＨＬＡ　ＤＰＡＩについての−ＲＮＡに相当するが、ウ マ遺伝子座ＪＩ１８５のために任意的に選択されている）の分析を図の上方に示 し、そして「マイナス」鎖の分析は下方の写真に示している。西洋ワサビペルオ キシダーゼ活性を用いて、ゲッタイブデーターを目視的に観察した０両鎖ともＧ ＢＡのための適当な鋳型であるため、２種類の異なるプライマーを用いることに よりゲッタイブの確認を得ることが可能であった。ＨＬＡ　ＤＰＡＩ遺伝子座に ついては、２つの部位のバリエーションが分類された（図９と１０）。同一性の 結果が得られた。ウマの遺伝子座ＪＦ１８５を包括する別の実験の分光光度定量 を図１２に示す。獲得されたシグナル、対、不適切な塩基の一体化の平均比は６ ２．２であった。

０．１！様 本発明を実施するための方法の一例は、好適な起源、例えば血液、上皮細胞、毛 髪又はその他の組織からＤＮＡ又はＲＮＡのサンプルを獲得し、次いでポリメラ ーゼ連鎖反応転写ベース増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８０：１１７３（１９８９）等を用いてイ ンビトロで核酸の特定の領域を増幅させることを包括する。増幅は、アフィニテ ィー基を有することにより改質された１又は複数のプライマーを用いながら、対 象の領域にフランクする特定のプライマーを用いて行われる（しかしながら任意 の一定の反応においては、かかるプライマーのうちの１種のみが一度に改質され うる）。好ましい改質は、プライマーの５′末端へのビオチン成分の連結である 。増幅サンプルのサンプル（典型的には０．５〜５　ｐｓｏｌｅ）を次に、この 増幅プライマー上の連結ビオチン成分を介してストレプトアビジン−複合磁性微 粒子（ＮｔハＤｙｎａｌ　Ｍ−２８０’グイナビーズ」）に結合させる。この微 小球を含む水性懸濁物を十分にアルカリ性なｐＨに調整することによってこのＤ ＮＡを変性させ、そしてビオチン−ストレプトアビジン結合を介してこの微小球 に結合した鎖を類似のアルカリ性条件のもとで洗うことにより相補鎖から分離さ せる。これを成し遂げるため、これらの微小球を遠心するか、又は磁場の適用に より固定化させる。

この微小球結合鎖を次に残りの操作において鋳型として用いた。

上記のようにして作り上げた鋳型類に、高緊縮アニーリング条件のもとて特異的 なブライマーオリゴヌクレオチドは結合した（このプライマーの配列は既知のＤ ＮＡ配列多形態のすぐ隣りの鋳型鎖上の部位への固有の結合性に合う）、好まし い配列及びプライマーに対する結合の態様は、このプライマーが鋳型と二量体を 形成し、従ってこのプライマーの３′末端のヌクレオチドがこの配列多形態にお ける第１ヌクレオチドの部位のすぐ隣りの鋳型ヌクレオチドと、その二量体が分 析されるべきどの多形態配列の重複を伴うことなくワトラン、クリック塩基対を 形成することを確実にする。このアレンジメントは、プライマーの鋳型依存性Ｄ ＮＡポリメラーゼ触媒化伸長を介して付加された鋳型における多形態ヌクレオチ ド配列の隣のヌクレオチドが明確に決定されることをもたらす。

上記のプライマー二鋳型複合体を、鋳型依存性ＤＮＡ合成に適合する塩、ｐＨ及 び温度の条件のもとで、適当なりＮＡポリメラーゼ及びこの鋳型における塩基と 特異的な塩基対合を形成することがわかっている４種類の異なる連鎖停止ヌクレ オチド類似体と接触させた。はとんどの場合、しかしながら必ずそうである必要 はないが、この鋳型及び連鎖停止類似体における塩基は一般的なヌクレオチド、 即ち、アデノシン、シトシン、グアニン又はイノシン、チミジン又はウリジンを 基礎とする。連鎖停止類似体の好ましい組は４種類のジデオキシヌクレオシド三 リン酸、ｄｄＡＴＰ、　ｄｄＣＴＰ、　ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰであり、ここ でこの４ＭのｄｄＮＴＰそれぞれは異なる蛍光リポータ−基の連結によって改質 されている。これらの蛍光タグは分光学的に識別できる放射スペクトルを有する 特性が備っており、そしてどの場合もジデオキシヌクレオシドニリン酸の改質は 連鎖停止類似体をプライマー３′末端へのＤＮＡポリメラーゼ触媒一体化にとっ て不適切なものにしないであろう、かかるプライマー：筏複合体を存するかかる 混合物におけるＤＮＡポリメラーゼ触媒化連鎖伸長の結果は、プライマーの３′ 末端上への蛍光連鎖停止類似体の定量的、特異的、そして正確な一体化であり、 付加された特定の蛍光性ヌクレオチドは鋳型における多形態ヌクレオチドの配列 によってのみ示される。

磁性微粒子にまだ結合したままの蛍光物質を吊り下げたプライマー二鋳型の複合 体を次に、例えば磁性的に固定化されたビーズを適当な緩衝液の中で洗うことに より、一体化されていないヌクレオチドを含む反応混合物から分ける。更に、一 定の状況においては次にこのプライマーを固定化鋳型類からＮａＯＨによって溶 離させ、溶離させたプライマーを別のメディウム又は容器に移し、その後一体化 されたターミネータ−の同一性を決定することが所望される０次いで連結された 蛍光基の同一性を、好ましくは適当な波長及び強さのレーザーにより供される光 をこの改質ＤＮＡ鎖に当て、そして生ずる放射スペクトルを分光学的に分析する ことによって評価する。一般に、ＤＮＡ配列におけるいづれかの一定の部位での ２つの対立遺伝子（二倍体）に関して、１６通りの可能なホモ接合及びヘテロ接 合対合に対応して生ずる１０通りの可能な正準（ｃｏｎｏｎｉｃａｌ）放射スペ クトルがある。測定したスペクトルと正準スペクトルのこのライブラリーとを適 当に合わせることにより、どの連鎖停止ヌクレオチドがプライマーの３′末端に 付加されたかを同定すること、それ故、鋳型における配列多形態の性質を同定す ることが可能となる。多重対立遺伝子系又は１：１以外の比率において存在して いる対立遺伝子により生ずるスペクトルも、寄与ヌクレオチドそれぞれの相対比 を同定及び評価するために適当な数学的処理によって解かれうる。

上記の工程は全て、自動化することのできる又はされている化学品、操作及びプ ロトコールを包括する。それ故、本発明の好ましい実施態様を適当にプログラム されたロボットワークステージ５ンに組み込むことは、生物学的サンプルに由来 する核酸における特定のヌクレオチド配列又は配列相違の検定に依存する事実上 全ての診断手順にとっての有意義な費用節約及び効率性の上昇をもたらすであろ う。

上記の方法のいくつかの特徴は本発明の好ましい態様を改善、且つ、構成する。

特に、好ましい態様である遺伝ビット分析（ＧＢＡ　）はより好都合な固相を提 供する。磁性微小球は効率的な洗浄及びその再懸濁のために注意を払って取扱わ れるべきである。従って、これらのビーズを利用する容量の高い自動化アッセイ をもくろむことは難しい、更に、それらの色は濃く、従って熱量又は蛍光アッセ イには適応しない。

ＧＢＡ方法論は標準のポリスチレン９６六マイクロプレートの利用も可能にする ために採用される。これらは臨床及び調査研究室において幅広く利用されている 。この形式に適応する、自動化系を含む数多くの液体操作系がある。これらは光 学シグナル検出法に適し、従って種々のタイプの光検出のための自動化プレート リーダーが有用となる。

ＧＢＡにとっての鋳型は常に対象の核酸サンプルに由来するであろう、これらの 核酸は感染因子を含むと予測されるサンプル、ゲッタイブを決定すべき個体、癌 を有すると予測される患者由来のサンプル等に由来しうる。伸長すべきバイブリ ド複合体の固定化パートナ−が鋳型なら、各核酸サンプルは固定化が可能となる ような方法で処理されるであろう、従って、マイクロプレートへのプライマーの 結合及びプレート結合化プライマーへの一本鎖鋳型分子のノ＼イブリダイゼーシ ッンを可能とする方法がもくろまれる。このことは、ＲＮＡの直接分析を含む、 数多くの異なる方法において作られた一本鎖鋳型の利用を可能とする追加の特徴 を提供する。

放射活性法は不便であり、そして廃棄することが困難な廃棄物を生成する。従っ て、はとんどの商業的生化学検出系は非放射活性法に変えられている。ビオチン によりラベル化されたｄｄＮＴＰを用いることにより、ＧＢＡは様々な検出系、 例えば酵素結合型比色アッセイを利用して非放射活性的に実施されうる。

品質管理は臨床決定において用いられるように検査をデザインすることにとって の重要な問題である。　ＧＢＡは二本鎖分子に基づいて核酸配列自体を調べるた め、両方の鎖を独立に調べることによって相補性遺伝情報を得る機会がある０本 出麗人は、この手法がウマ及びヒト遺伝子変異体の両方を用いることにより可能 であることを示している。

記載の方法において、該鋳型は固相上にこの鋳型の固定化を可能とするように誘 導化されたプライマーを用いるＰＣＨによって作られている。このプライマーが 固定されているときは鋳型の誘導化はもはや必要とされない。むしろ、他の標準 的なＰＣＨにおいて均一でない温度のＰＣＲを用いると、過剰な一本鎖分子又は その他が、どのプライマーが過剰であるかに依存して作り上げられることが可能 となる。これらはプレート結合化ＧＢＡプライマー分子へのハイブリダイゼーシ ョンのための好適な鋳型として働く。

ＦｆＧ、ＩＡ　ＦＪＧ、１８　ＦＪＧ、ＩＣ工、増幅プライマー ＴＧＬ　１０５：　５’−’１１’ｌ’ＣＴＴＣＴｒＧＣＡＴＣＴＡＴＧＴｒＣ Ｇ−３雪ＴＧＬ１０６：　５’−ＴｒＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＴＣＣＴ −３’工工、　多形態検出プライマー ＴＧＬｌＢ２＝　５ｌ−ＧＣＣＴＴＧＧＣＧＴＴＧＴ＾賜−３−ＴＧＬ　１６６ ：　５雪−ＡＧＡＧＡＡＡＣＡＡＴ！ＴＣＡＡＧ−３會工Ｉ工、標的配列 工Ｖ、　多形態 ＦＩＧｌｆＲＥ　２ Ａ３ＣＤ 勤　”　８：ＴＧＬ　１８２／ ψ　−−− Ｃ：　ＴＧＬ　１６６／ Ｄ　：　ＴＧＬ　１６６／ ρ８１４ ＦＩＧ、３ 鋳型 ラベル化ｄｄＮＴＰ ＦｆＧ、４ 個体　個体 ＦｆＧ、７ ＧＢＡ　：　ＨＬＡ　ＤＰＡ　１　ａａ　３１ＦｆＧ、９ ＧＢＡ：　ＨＬＡ　ＤＰＡ１ａａ５０ ＦＩＧ、１０ ／′＋１１１＋＋−二；・：仁ヱ１　、°、°＾＝ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ Ｃｏ　ＬＯｗ　Ｃ’）へ− 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定１］　ＥＰ（ＡＴ、　ＢＥ、　ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ 、ＦＩ、ＪＰ、Ｎ。

（７２）発明者　アンダーラン、ステイーブンアメリカ合衆国、ニューシャーシ ー ０８５４０　、プリンストン、スプリングゾールロード　１５８

Claims (59)

【特許請求の範囲】
1. １．水性担体と、核酸依存性プライマー伸長反応の少なくとも２種頬の異なるタ ーミネーターの混合物とを含んで成り、各ターミネーターは鋳型におけるこのプ ライマーの３′末端のすぐ隣りの、且つ、その下流の、対をなしていないヌクレ オチド塩基の同一性に厳重に依存する状況において伸長反応を特異的に停止する ことが可能であり、そしてこれらのターミネーターのうちの少なくとも１種は検 出マーカーによってラベルされている試薬組成物。
2. ２．前記試薬が４種類の異なるターミネーターを含んで成る請求項１に記載の試 薬。
3. ３．２種頬のターミネーターがそれぞれ別々の検出マーカーによってラベルされ ている請求項２に記載の試薬。
4. ４．３種類のターミネーターがそれぞれ別々の検出マーカーによってラベルされ ている請求項２に記載の試薬。
5. ５．４種類のターミネーターがそれぞれ別々の検出マーカーによってラベルされ ている請求項２に記載の試薬。
6. ６．前記（複数の）ターミネーターがヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含 んで成る、請求項１〜５のいづれか１項に記載の試薬。
7. ７．前記（複数の）ターミネーターがジデオキシヌクレオチドを含んで成る、請 求項６に記載の試薬。
8. ８．前記（複数の）ターミネーターがアラビノシド三リン酸を含んで成る、請求 項６に記載の試薬。
9. ９．前記（複数の）ターミネーターがｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ又は ｄｄＴＴＰのうちの１又は後数種を含んで成る、請求項７に記載の試薬。
10. １０．別々の検出マーカーそれぞれがアイソトープ性ラベル化成分、発色団、蛍 光団、タンパク質成分、又はアイソトープ性ラペル化成分、発色団、蛍光団もし くはタンパク質成分が連結されうる成分である、請求項１〜５のいづれか１項に 記載の試薬。
11. １１．別々の検出マーカーそれぞれが別々の蛍光団である、請求項１０に記載の 試薬。
12. １２．前記試薬がピロホスファターゼを更に含んで成る、請求項１〜５のいづれ か１項に記載の試薬。
13. １３．対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定する 方法であって： （ａ）対象の核酸が二本鎖であるなら、かかる核酸を含むサンプルを処理せしめ て特定の位置にわたって対をなしていないヌクレオチド塩基を獲得するか、また は対象の核酸が一本鎖であるなら工程（ｂ）を直接採用し； （ｂ）工程（ａ）由来のサンプルをハイブリダイゼーシヨン条件のもとで、対象 の核酸において存在している同定すべきヌクレオチド塩基のすぐ隣りのヌクレオ チド塩基の鎖とハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドプライマー と接触させて前記プライマーと対象の核酸との二量体を形成せしめ、従って同定 すべきヌクレオチド塩基は前記二量体における前記プライマーの３′末端のすぐ 隣りにあるこの鋳型における第１の対をなしていない塩基となり；（ｃ）工程（ ｂ）由来の二量体を請求項５に記載の試薬と下記の条件、即ち、前記試薬の中に 存在している相補性ターミネーターと同定すべきヌクレオチド塩基との塩基対合 を可能とし、且つ、前記プライマーの３′末端にて前記ターミネーターが一体化 されるよう鋳型依存性プライマー伸長反応が起こることを可能とする条件のもと で接触させ（目的の結果は、このプライマーが１種類のターミネーターによって 伸長されることにある）；そして（ｄ）工程（ｃ）由来の伸長化プライマーの３ ′末端にて存在している検出マーカーの同一性を決定し、それにより対象の核酸 における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定すること、を含んで成 る方法。
14. １４．対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定する 方法であって： （ａ）対象の核酸が二本鎖であるなら、かかる核酸を含むサンプルを処理せしめ て特定の位置にわたって対をなしていないヌクレオチド塩基を獲得するか、また は対象の核酸が一本鎖であるなら工程（ｂ）を直接採用し； （ｂ）工程（ａ）由来のサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとで、対象 の核酸において存在している同定すべきヌクレオチド塩基のすぐ隣りのヌクレオ チド塩基の鎖とハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドプライマー と接触させて前記プライマーと対象の核酸との二量体を形成せしめ、従って同定 すべきヌクレオチド塩基は前記二量体における前記プライマーの３′末端のすぐ 隣りにあるこの鋳型における第１の対をなしていない塩基となり；（ｃ）工程（ ｂ）由来の二量体を請求項２に記載の試薬（ここで前記ターミネーターのうちの １種のみが検出マーカーを有している）と下記の条件、即ち、前記試薬の中に存 在している相補性ターミネーターと同定すべきヌクレオチド塩基との塩基対合を 可能とし、且つ、前記プライマーの３′末端にて前記ターミネーターが一体化さ れるよう鋳型依存性プライマー伸長反応が起こることを可能とする条件のもとで 接触させ（目的の結果は、このプライマーが１種類のターミネーターによって伸 長されることにある）；そして（ｄ）工程（ｃ）を更に３回操り返し（ここでこ の４通りの平行反応工程それぞれにおいて、４種のターミネーターのうちの１種 類づつがラベルされている）；そして （ｅ）この４通りの平行鋳型依存性プライマー伸長反応の生成物のうちのいづれ が前記プライマーの３′未端にて存在している検出マーカーを有しているかを決 定して、対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定す ること；を含んで成る方法。
15. １５．核酸のサンプル中の特定のヌクレオチド配列の有無を決定するための方法 であって： （ａ）核酸のサンプルが二本鎖の核酸を含むなら、かかる核酸のサンプルを処理 せしめて一本鎖の核酸を獲得するか、又は核酸のサンプルが一本鎖の核酸のみを 含むならば工程（ｂ）を直接採用し；（ｂ）工程（ａ）由来のサンプルをハイブ リダイゼーション条件のもとで、特定のヌクレオチド配列が存在しているならば その特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることの可能なオリゴヌクレオ チドプライマーと接触させて前記プライマーとこの特定のヌクレオチド配列との 二量体を形成せしめ；（ｃ）存在しているならば工程（ｂ）由来の二量体を請求 項５に記載の試薬と下記の条件、即ち、前記試薬の中に存在している相補性ター ミネーターと前記プライマーの３′末端のすぐ下流にある対をなしていない鋳型 のヌクレオチド塩基との塩基対合を可能とし（このプライマーはこの鋳型におけ る前記の特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズしている）、且つ、前記プラ イマーの３′末端にてターミネーターが一体化されるよう鋳型依存性プライマー 伸長反応が起こることを可能とする条件のもとで接触させ；そして（ｄ）工程（ ｃ）由来のプライマーの３′未端での検出マーカーの有無及び同一性を決定して 、核酸のサンプル中の前記の特定のヌクレオチド配列の有無を決定すること；を 含んで成る方法。
16. １６．核酸のサンプル中の特定のヌクレオチド配列の有無を決定するための方法 であって： （ａ）核酸のサンプルが二木鎖の核酸を含むなら、かかる核酸のサンプルを処理 せしめて一本鎖の核酸を獲得するか、又は核酸のサンプルが一本鎖の核酸のみを 含むならば工程（ｂ）を直接採用し；（ｂ）工程（ａ）由来のサンプルをハイブ リダイゼーシヨン条件のもとで、特定のヌクレオチド配列が存在しているならば その特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることの可能なオリゴヌクレオ チドプライマーと接触させて前記プライマーとこの特定のヌクレオチド配列との 二量体を形成せしめ；（ｃ）存在しているならば工程（ｂ）由来の二量体を請求 項２（ここで前記ターミネーターのうちの１種のみが検出マーカーを有している ）に記載の試薬と下記の条件、即ち、前記試薬の中に存在している相補性ターミ ネーターと前記プライマーの３′末端のすぐ下流にある対をなしていない鋳型の ヌクレオチド塩基との塩基対合を可能とし（このプライマーはこの鋳型における 前記の特定のヌクレオチド配列とハイプリダイズしている）、且つ、前記プライ マーの３′末端にてターミネーターが一体化されるよう鋳型依存性プライマー伸 長反応が起こることを可能とする条件のもとで接触させ；そして （ｄ）工程（ｃ）を更に３回操り返し（ここでこの４通りの平行反応工程それぞ れにおいて、４種のターミネーターのうちの一種類づつがラベルされている）； そして （ｅ）この４通りの平行鋳型依存性プライマー伸長反応の生成物におけるプライ マーの３′末端での検出マーカーの有無及び同一性を決定して、この核酸のサン プル中の前記の特定のヌクレオチド配列の有無を決定すること； を含んで成る方法。
17. １７．核酸を含んで成るサンプルを分類する方法であって、１又は複数の特定の 位置それぞれにて存在しているヌクレオチド塩基又は複数の塩基を同定すること を含んで成り、かかるヌクレオチド塩基はそれぞれ、請求項１３又は１４に記載 の方法を用いて同定され、そしてかかる特定の位置それぞれは異なるプライマー を用いて決定される方法。
18. １８．各位置での各ヌクレオチド塩基又は複数の塩基の同一性を独立して決定す るか、又は種々の位置での複数のヌクレオチド塩基の同一性を同時に決定する、 請求項１７に記載の方法。
19. １９．核酸を含むサンプルを分類する方法であって、１又は複数のヌクレオチド 配列の有無を決定することを含んで成り、かかるヌクレオチド配列それぞれは請 求項１５又は１６に記載の方法によって決定される方法。
20. ２０．核酸を含むサンプルを分類する方法であって：（ａ）１又は複数の特定の ヌクレオチド配列の有無を決定し（ここでかかるヌクレオチド配列それぞれの有 無は請求項１５又は１６に記載の方法によって決定される）、そして（ｂ）１又 は複数の特定の位置に存在しているヌクレオチド塩基又は複数の塩基を同定する （ここでかかるヌクレオチド塩基それぞれは、請求項１３又は１４に記載の方法 を用いて同定され、そしてかかる特定の位置は別々のプライマーを用いて決定さ れる）、ことを含んで成る方法。
21. ２１．核酸を含むサンプル中の種々の対立遺伝子を同定するための方法であって 、１又は複数の特定の位置それぞれに存在しているヌクレオチド塩基又は複数の 塩基を同定することを含んで成り、かかるヌクレオチド塩基それぞれは請求項１ ３又は１４に記載の方法によって同定する方法。
22. ２２．１又は複数の特定の遺伝子座での生物のゲノタイプを決定するための方法 であって： （ａ）ゲノムＤＮＡを含むサンプルを生物から獲得し；そして（ｂ）対象の核酸 における１又は複数の特定の位置それぞれにて存在しているヌクレオチド塩基又 は複数の塩基を同定して（ここでかかる塩基又は複数の塩基は請求項１３又は１ ４に記載の方法を用いて同定される）、種々の対立遺伝子を同定する、即ち、１ 又は複数の特定の遺伝子座での生物のゲノタイプを決定すること、を含んで成る 方法。
23. ２３．工程（ｃ）における鋳型依存性プライマー伸長反応を起こす条件をある程 度、適当な鋳型依存性酵素の存在により作り上げる、請求項１３又は１４に記載 の方法。
24. ２４．前記鋳型依存性酵素がＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩもしくはその「クレ ノウフラグメント」、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ（「 シーケナーゼ」）、Ｔ．アクアテイカスＤＮＡポリメラーゼ、レトロウイルス逆 転写酵素、又はそれらの組合せである、請求項２３に記載の方法。
25. ２５．対象の核酸がデオキシリボ核酸、リボ核酸、又はデオキシリボ核酸とリボ 核酸との共重合体である、請求項１３又は１４に記載の方法。
26. ２６．前記プライマーがオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオ チド、又はデオキシリボ核酸とリボ核酸との共重合体である、請求項１３又は１ ４に記載の方法。
27. ２７．前記鋳型がデオキシリボ核酸であり、前記プライマーがオリゴデオキシリ ボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチドとリ ボヌクレオチドとの共重合体であり、そして前記鋳型依存性酸素がＤＮＡポリメ ラーゼである、請求項１３又は１４に記載の方法。
28. ２８．前記鋳型がリボ核酸であり、前記プライマーがオリゴデオキシリボヌクレ オチド、オリゴリボヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレ オチドとの共重合体であり、そして前記鋳型依存性酵素が逆転写酸素である、請 求項１３又は１４に記載の方法。
29. ２９．前記鋳型がデオキシリボ核酸であり、前記プライマーがオリゴリボヌクレ オチドであり、そして前記酵素がＲＮＡポリメラーゼである請求項１３又は１４ に記載の方法。
30. ３０．前記鋳型がリボ核酸であり、前記プライマーがオリゴリボヌクレオチドで あり、そして前記酸素がＲＮＡレプリカーゼである請求項１３又は１４に記載の 方法。
31. ３１．工程（ｃ）におけるプライマー伸長反応の前に、前記鋳型に、この鋳型の ３′未端にてターミネーターを付加することによってキュツプを付し、ここで前 記ターミネーターは鋳型依存性プライマー伸長反応を停止せしめることのできる 、請求項１３又は１４に記載の方法。
32. ３２．前記ターミネーターがジデオキシヌクレオチドである、請求項３１に記載 の方法。
33. ３３．対置の核酸がインビボで酸素的に合成、インビトロで酵素的に合成、又は 非酵素的に合成されたものである、請求項１３又は１４に記載の方法。
34. ３４．前記オリゴヌクレオチドプライマーがインビボで酵素的に合成、インビト ロで酵素的に合成、又は非酵素的に合成されたものである請求項１３又は１４に 記載の方法。
35. ３５．前記オリゴヌクレオチドプライマーが、一体化されていない試薬及び／又 は対象の核酸からこのプライマーのアフィニティー分離を可能とする１又は複数 の成分を含んで成る、請求項１３又は１４に記載の方法。
36. ３６．固相に結合しているストレプトアビジンに対するビオチンの結合性を介し て、一体化されていない試薬及び／又は対象の核酸からオリゴヌクレオチドプラ イマーをアフィニティー分離させることを可能とするビオチンを前記プライマー が含んで成る、請求項３５に記載の方法。
37. ３７．固相に結合している核酸において存在している相補性配列に対する塩基対 合を介して、一体化されていない試薬及び／又は対象の核酸からオリゴヌクレオ チドプライマーをアフィニティー分離させることを可能とするＤＮＡ配列を前記 プライマーが含んで成る、請求項１３又は１４に記載の方法。
38. ３８．対象の核酸が、一体化されていない試薬及び／又はプライマーからの対象 の核酸のアフィニティー分離を可能とする１又は複数の成分を含んで成ろ、請求 項１３又は１４に記載の方法。
39. ３９．固相に結合しているストレプトアビジンに対するビオチンの結合性を介し て、一体化されていない試薬及び／又はプライマーから対象の核酸をアフィニテ ィー分離させることを可能とするビオチンを前記対象の核酸が含んで成る、請求 項３８に記載の方法。
40. ４０．固相に結合している核酸において存在している相補性配列に対する塩基結 合を介して、一体化されていない試薬及び／又はプライマーから対象の核酸をア フィニティー分離させることを可能とするＤＮＡ配列を前記対象の核酸が含んで 成る、請求項１３又は１４に記載の方法。
41. ４１．前記オリゴヌクレオチドプライマーが検出マーカーによってラベルされて いる、請求項１３又は１４に記載の方法。
42. ４２．前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記試薬中に存在しているか、又 は対象の核酸に結合しているどの検出マーカーとも異なる、請求項４１に記載の 方法。
43. ４３．前記対象の核該が検出マーカーによってラベルされている、請求項１３又 は１４に記載の方法。
44. ４４．前記対象の核酸が、前記試薬中に存在しているか、又は対象の核酸に結合 しているどの検出マーカーとも異なる、請求項４３に記載の方法。
45. ４５．前記対象の核酸が天然でないヌクレオチド類似体である、請求項１３又は １４に記載の方法。
46. ４６．前記の天然でないヌクレオチド類似体がデオキシイノシン又は７−デアザ −２′−デオキシグアノシンを含んで成る、請求項４５に記載の方法。
47. ４７．前記対象の核酸がポリメラーゼ連鎖反応によって合成される、請求項１３ 又は１４に記載の方法。
48. ４８．前記サンプルが、生物に由来するゲノムＤＮＡ、そのＲＮＡ転写体、又は そのＲＮＡ転写体より作られたｃＤＮＡを含んで成る請求項１３又は１４に記載 の方法。
49. ４９．前記サンプルが生物に由来するゲノム外ＤＮＡ、そのＲＮＡ転写体、又は そのＲＮＡ転写体より作られたｃＤＮＡを含んで成る請求項１３又は１４に記載 の方法。
50. ５０．前記プライマーが、同定すべき塩基のすぐ隣りの既知の塩基配列と実質的 相違性である、請求項１３又は１４に記載の方法。
51. ５１．前記プライマーが、同定すべき塩基のすぐ隣りの既知の塩基配列と完全に 相補性である、請求項１３又は１４に記載の方法。
52. ５２．適当な変性条件を利用することにより、工程（ｃ）におけるプライマー伸 長反応の後に対象の核酸から前記プライマーを分離させる、請求項１３又は１４ に記載の方法。
53. ５３．前記変性条件が熱、アルカリ、ホルムアミド、尿素、グリオキサル、酵素 及びそれらの組合せを含んで成る、請求項５２に記載の方法。
54. ５４．前記変性条件が０．２ＮのＮａＯＨによる処理を含んで成る、請求項５３ に記載の方法。
55. ５５．前記生物が植物、微生物、ウィルス又は烏類である、請求項４８に記載の 方法。
56. ５６．前記生物が脊椎動物又は無脊椎動物である、請求項４８に記載の方法。
57. ５７．前記生物が哺乳動物である、請求項４８に記載の方法。
58. ５８．前記哺乳動物が人類である、請求項５７に記載の方法。
59. ５９．前記哺乳動物が馬、犬、牛、猫、豚又は羊である、請求項５７に記載の方 法。