JPH06505394A - ターミネーター複合物を利用するオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ伸長による核酸分類 - Google Patents

ターミネーター複合物を利用するオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ伸長による核酸分類

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ターミネータ−複合物を利用するオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ伸長による 核酸分類 本発明は1991年3月5日出麿の米国特許出願第664 、837号の一部係 属出願であり、それは本明細書に参考として組入れる。
発明の背景 本発明は核酸配列の検定の分野に関連する。核酸配列の検定は2通りの一般的な 状況に利用することができる。第1に、核酸配列の検定は特定の遺伝子要素の有 無を決定するために利用できる。第2に、核酸配列の検定は存在している特定の 遺伝子要素の特定のタイプを決定するために利用できる。様々な遺伝子要素が通 常存在している。数多くの技術が、(1)特定の核酸配列の存在を調べるために 、及び(2)核酸配列の相同性セグメントを対比させてそれらのセグメントが同 一であるか又は1又は複数のヌクレオチドが異なっているかどうかを調べるため に開発されてきている。これらの技術の実際の用途には遺伝病診断、感染病診断 、法医学技術、身元の決定及びゲノムマツピングが挙げられる。
一般に、サンプル中の核酸及びそのサブタイプの検定は特異的核酸ハイブリダイ ゼーションの技法であって、オリゴヌクレオチドプローブをサンプル中の核酸と 高緊縮条件のもとてアニールせしめ、そして有効にアニールしたプローブを次に 検出する技法に依存している(Spiegelman、 S、の5cienti fic Avxerican第210巻、頁4B(1964)を参照のこと)。
DNAセグメントを対比させるための最も具体的な方法は各セグメントの完全ヌ クレオチド配列を決定することにある。ヒトの遺伝子における突然変異を研究す るためにどのようにシーケンシングが利用されてきたかの例はEngelke  らのProc、 Natl、 Acad、 Sci、 U、S、A85:544 −548(1988)及び−ongらNature330:384−386(1 987)に含まれている。現時点で、わずかなりNA上セグメントみを対比する ために長いシーケンシングを利用することは実用的でなく、なぜなら配列情報を 決定、解釈及び対比するのに必要な作業は時間がかかるからである。
DNA配列の変異より生ずるDNAの多形態(polysorphis■)につ いての一般に利用されているスクリーンは、DNAを制限エンドヌクレアーゼで 消化し、次いで得られるフラグメントをBostefn らA+w、 J。
Hum、 Genet、、32:314−331(1980)及び−bite  らSci、 Am、、258:4O−48(198B)に記載のサザンプロット により分析することより構成される。
エンドヌクレアーゼの認識配列に影響を及ぼす突然変異はその部位での酵素切断 を妨げ、それ故そのDNAの切断パターンを変えてしまう、それらのDNAは制 限フラグメントの長さにおける相違について調べることにより対比される。この 方法(制限フラグメント長多形態マツピング又はRFLPマツピングとして知ら れる)に関する主たる問題は、制限エンドヌクレアーゼによる切断に影響を及ぼ さない突然変異をそれが検出できないことにある。従って、数多くの突然変異は この方法によって見逃されている。 JeffreysのCe1l、 18:1 −18(1979)の一つの研究は、0.7%の突然変異のみがヒトDNAの4 0.000塩基対の領域において存在するものと予測されることを検定するにす ぎなかった。他の問題は、制限フラグメント長多形態を検定するのに用いる方法 、特にサザンプロット分析を包括する技術が非常にめんどうであることにある。
任意のDNAセグメントにおける特定の突然変異を検定するための技術は−al laceらNucl、 Ac1d Res、、 9:879−894(1981 )に記載されている。これは分析すべきDNA (標的DNA)の相補性ラベル 化オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイズを包括する。一つの塩基対誤 対合しか含まないときでさえものDNA二本鎖の熱的不安定性に基づき、プロー ブと完璧に相補する標的DNAを1個のヌクレオチド程度しか相違しない標的D NAから区別するのに示差融解温度が利用できる。 Landegrenら5c ience 41:1077−1080(1988)に記載の関連の技術におい ては、オリゴヌクレオチドプローブをペアーで作製してそれらの連結部位が突然 変異について分析すべきDNAの部位に対応するようにしている0次にこれらの オリゴヌクレオチドを分析すべきDNAにハイブリダイズさせる。いづれかのオ リゴヌクレオチドと標的DNAとのこの連結領域での塩基対誤対合はDNAリガ ーゼによるこれら2本のオリゴヌクレオチドプローブの有効な連結を妨げてしま う。
A、核酸ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション反応における核酸の塩基対合はほとんどの核酸の分析的 及び診断的技術の基礎を成す、実際、核酸ハイブリダイゼーシッンのパラメータ ーをのみ基礎とする試験は、試験サンプルの配列複雑度が高い場合にはあまりよ く機能しない。これはある程度、−個のヌクレオチド変化により生ずるバイブリ ドの安定性におけるわずかな熱力学的相違、及びプローブを長くすることにより 特異性を高めることがこの示差的安定性を更に小さくする効果を有することに基 づく、従って核酸ハイブリダイゼーションは一般に分析及び診断目的のためにい (つかの他の選択的又は富化的手順と組合される。
ハイブリダイゼーションを選別技術としてのハイブリダイズ分子のサイズ分別と 組合せることは一般的な診断手法の1つである。サイズ選別はハイブリダイゼー ションの前に行うことができる。最もよく知られた事前サイズ選別技術はサザン ブロッテイングである(Southern、 E、’、 Methods in  Enz s+olo 69:152(1980)を参照のこと)、この技術に おいては、DNAサンプルを、制限酵素による消化に付して、各酵素にとって特 徴的な短いヌクレオチド配列の部位での又はその付近でのホスホジエステル骨格 における二本鎖破断をもたらしている。得られるDNAフラグメントの不均質混 合物を次にゲル電気泳動により分け、変性させ、そして固相へと移し、ここでそ れらをラベル化核酸プローブを用いてその場でハイブリダイゼーション分析にか ける。ラベル化プローブに相補する配列を含むフラグメントはハイブリダイズし たラベルのバンドとして目視で又はデンシロメトリーで示される。この方法の変 法はRNA分子についてのノーザンプロッティングである。サイズ選別は数多く の技法におけるハイブリダイゼーションの後に、特にバイブリド保護技術により 、サイズ分析にかける前にプローブ/核酸バイブリドを酵素消化に付することに より利用されてもいる。
B、二量体、プライマー二鋳型の複合体のポリメラーゼ伸長プライマーとDNA 標的とのバイブリドは、これらのバイブリドのポリメラーゼ伸長によって分析す ることができる。この方法論の改良はポリメラーゼ連鎖反応であり、その精製物 は逆平行プライマーの連続ハイブリダイゼーシぢン反応、それに続< DNAポ リメラーゼによる酵素的増幅によって提供される(Saiki ら、5cien ce 239:487−491 (1988)を参照のこと)、2通りのハイブ リダイゼーション反応に関して選択することにより、この方法論は単独のハイブ リダイゼーション反応にのみ依存する技法に欠ける特異性を提供する。
プライマー依存性DNAポリメラーゼは長い間一般的に、鋳型に対して相補性な ヌクレオチドの付加について低いエラー率を有することで知られてきた。この特 徴は子孫に有害な影響を及ぼすであろう遺伝的誤りの防ぐために生物界において 必須である。この酵素学的反応に固有な特異性は究極的な核酸分類実験法である 「サンガー」又はジデオキシ連鎖停止シーケンシング方法論に基づいて幅広く利 用されている。1つのタイプのサンガーDNA シーケンシング法は通常のDN A前駆体である4種のデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物、及びこの4種の 考えられるジデオキシヌクレオシド三リン酸のうちの1種が、そのヌクレオシド のリボース糖成分の3′炭素原子に結合しているヒドロキシル基の代わりに水素 を有するものを利用する。5′から3′方向(「下流」)におけるDNA l伸 長はこのヒドロキシル基を必要とする。従って、ジデオキシヌクレオチドがこの 成長DNA llに取り込まれると、更なる伸長が起きなくなってしまう、この 混合物中の1種のジデオキシヌクレオチドにより、DN^ポリメラーゼはプライ マー:鋳型の組合せに由来する様々な長さの分子の集団を提供せしめることがで き、その全てはこの4種の考えられるヌクレオチドのうちの1種の付加の後に停 止したものである。
一連の4つの独立した反応(それぞれは異なるジデオキシヌクレオチドによる) はフラグメントの入れ子(nested)セットを作り上げ、全てはプライミン グDNA分子の同じ5′末端から始まり、そして考えられる全ての3′ヌクレオ チド位にて終結している。
DNAの分析におけるジデオキシヌクレオシド三リン酸とポリメラーゼの他の用 途は分子の3′末端のラベル化を包括する。ある突飛なこの技術の出現はマキサ ム−ギルバート法を利用する、DNA分子のその3′末端からのシーケンシング のための手段を提供する。この技術において、突き出し3′末端を有する分子を 放射性ジデオキシ−ATPの存在下において末端トランスフェラーゼにより処理 する。
1種の放射性ヌクレオチドを付加し、この分子をシーケンシングにの電気泳動分 離を必要とする。はとんどの方法は各分類決定のためドを、DNAポリメラーゼ 及び411のデオキシヌクレオシド三リン酸(そのうちの1種はα−チオヌクレ オチドである)の存在下においてプライマー伸長に付する。次にこのバイブリド を、エキソヌクレレオチドがこの反応混合物中の一種のチオヌクレオチドに相補 性でいバイブリドは分解されてしまうであろう、誘導化されていない分子を除く ための適当な酵素消化の後、このチオ誘導化分子はゲル電気泳動又はその他の選 別技術によって検定されうる。
象の変異ヌクレオチドに対応している。このプライマーの3′末端ヌクレオチド においてのプライマーと鋳型の誤対合は伸長にとっての方法はI)NAポリメラ ーゼ、例えばDNA逆転写酵素であって関連の3′〜5′エキソヌクレアーゼ活 性を有さないものの利用に依存する。
Mundy及びVaryとDias+ondの方法は欠点を有している。Mun dyの方法は有用であるが、誘導化されていないバイブリドを消化する第2の別 の酵素系の必要性によりめんどうである。Varyの方法は別々の反応生成物を 作りあげないことにより複雑である。r不良コブライミングはかかる系において 顕著なノイズをもたらし、これは真性シグナルと区別するのが難しいであろう。
本発明は特定のヌクレオチドについての核酸を分類するMundy及びVary とDia麟ondの方法に関連する問題を解消する。プライマー伸長及びDNA ポリメラーゼを利用する方法により、本発明はそのプライマー自体よりも一塩基 長い別の分子物質をもたらすであろう、数多くの方法、特にポリメラーゼ連鎖反 応を利用する方法において、第1工程において対象の核酸を精製するために用い るタイプの反応は、次の検出工程において用いることもできる。最後に、異なる 検出用成分(例えば異なるスペクトル特性を有する蛍光物質)によってラベルさ れているターミネータ−により、全ての配列検定実験のために1種の試薬のみを 利用することが可能となるであろう。更に、反応後に終結したプライマーを分離 する技術を利用すると、複数の遺伝子座での配列検定実験を同じチューブの中で 行うことができる。
Mullisによる最近の論文(Scientific Aserican+  1990年4月、頁56−65)は、明らかに実施されていないであろう、二本 [DNAの断片における標的塩基対の同一性の決定の実験を提案している。
Mullisは4タイプのジデオキシヌクレオシド三リン酸と、放射性ラベルさ れた1タイプのジデオキシヌクレオシド三リン酸の利用を提案している。
本発明は感染病の診断、遺伝病の診断、並びに個人及びその身元の同定に有用で ありうる核酸配列の分析を可能とする。
これらの目的のために数多くの方法が開発されている。有用であるにもかかわら ず、かかる方法論はめんどうであり、且つ、費用がかさみ、一般にゲル電気泳動 、プロッティング、ハイブリダイゼーション及びオートラジオグラフィー又は非 アイソトープ暴露のような技法の組合せを包括する。より幅広い核酸分析の利用 を可能とするより簡単な技術が要望されている。更に、核酸を基礎とする試験は 、現状量も費用のかかる実験手順に属し、そしてこの理由のためルーチンベース には利用されることができていない、最後に、現状の技術は大量のサンプルの分 析、従って更には費用を下げることを可能とするのに必要であろう自動化手順に 適用できない。
本発明は核酸物質のゲル電気泳動サイズ選別に顧ることなく生物学的サンプル中 の核酸の診断又は特性化に利用できる方法を提供する。この特徴はこの方法を自 動に容易に適用できることをもたらし、従って比較的低価格にて大量のサンプル を分析することを可能にする。核酸は生命の本質的な青写真であるため、各生物 又は個体は核酸の同定可能な配列によって個別に特性化されうる。従って、これ らの特異的な核酸配列を検出することによって、特定の生物の存在を同定する又 は一定のサンプルの生物起源を実証することが可能となる。
発明の概要 本発明は、水性担体と、核酸鋳型依存性プライマー伸長反応の少なくとも2種類 の異なるターミネータ−の混合物とを含んで成る試薬組成物を提供する。それぞ れのターミネータ−は、このプライマーの3′末端に隣接し、且つ、その下流に ある、鋳型における対をなしていないヌクレオチド塩基の同一性に厳格に依存す る状況において伸長反応を特異的に停止せしめることが可能である。更に、この ターミネータ−の少なくとも一種は検出マーカーによりラベルさの4種の異なる ターミネータ−の混合物とを含んで成る試薬組成物を提供する。それぞれのター ミネータ−は、上記のように伸長反応を特異的に停止せしめることが可能であり 、そしてこれらのターミネータ−のうちの1種、2種、3種又は4種が検出マー カーによりラベルされている。
本発明は更に前記した試薬であって、そのターミネータ−がヌクレオチド、ヌク レオチド類似体、ジデオキシヌクレオチド又はアラビノース三リン酸を含んで成 る試薬を更に提供する。本発明はまた試薬であって、そのターミネータ−が1又 は複数のジデオキシアデノシン三リン酸(ddATP) 、ジデオキシシトシン 三リン酸(ddCTP)、ジデオキシグアノシン三リン酸(ddGTP)、ジデ オキシチミジン三リン酸(ddTTP)又はジデオキシウリジン三リン酸(dd UTP)を含んで成る試薬を提供する。
本発明は更に対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決 定するための方法を提供する。第1に、もし対象の核酸が二本鎖であるならばか かる核酸を含むサンプルを処理して特定の位置にわたって対をなしていないヌク レオチド塩基を獲得する。
もし対象の核酸が一本鎖であるならこの工程は必要ではない。第2に、対象の核 酸を含むサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとてオリゴヌクレオチドブ ライマーと接触させる。このオリゴヌクレオチドブライマーは、同定すべきヌク レオチド塩基のすぐ隣りの、対象の核酸に存在しているヌクレオチド塩基の鎖と ハイブリダイズして、プライマーと対象の核酸との二量体を形成することができ 、従って同定すべきヌクレオチド塩基は、プライマーと対象の核酸との二量体に おける、このプライマーの3′末端のすぐ下流にあるこの鋳型における最初の対 をなしていない塩基となる。従って、例えばDNAポリメラーゼにより触媒され る、一つのヌクレオチドのかたわらで生ずる二量体におけるオリゴヌクレオチド ブライマーの酵素的伸長は、同定すべきヌクレオチド塩基に付加されたヌクレオ チドの正しい塩基対合に依存する。
プライマーと対象の核酸との二量体を次に4種のラベル化ターミネータ−を含む 試薬と接触させる。各ターミネータ−は異なる検出可能マーカーによりラベルさ れている。プライマーと対象の核酸との二量体を、この試薬の中に存在する相補 性ターミネータ−と同定すべきヌクレオチド塩基との塩基対合を可能にし、且つ 、このプライマーの3′末端においてこのターミネータ−が一体化されるような 鋳型依存性プライマー伸長反応の発生を可能とする条件のもとて該試薬と接触さ せる。目的(ネット)の結果は、オリゴヌクレオチドプライマーが1個のターミ ネータ−によって伸長されることにある0次に、伸長化プライマーの3′末端に 存在している検出マーカーの同一性を決定する。検出マーカーの同一性は、どの ターミネータ−が対象の核酸における次の塩基と塩基対合したかを示唆する。
このターミネータ−は対象の核酸における次の塩基と相補するため、対象の核酸 における次の塩基の同一性がそれ故決定される。
本発明はまた対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決 定するための別の方法を提供する。この更なる方法は4種のターミネータ−のう ち1種のターミネータ−のみが検出マーカーを有するものを含む試薬を利用する 。
本発明はまた、1又は複数の特定の位置それぞれにて存在している塩基又は複数 の塩基を同定することを含んで成る核酸のサンプルの分類方法を提供し、かかる ヌクレオチド塩基それぞれは前記した通りの対象の核酸における特定の位置での ヌクレオチド塩基の一致を決定するための方法のうちのいづれかを利用して同定 される。対象の核酸におけるそれぞれの特定の位置は異なるプライマーを用いて 決定される。各位置での各ヌクレオチド塩基又は複数の塩基の同一性を独立して 決定することができ、又は種々の位置でのヌクレオチド塩基の同定を同時に決定 することができる。
本発明は更に、1又は複数の特定の位置それぞれにて存在している塩基又は複数 の塩基を同定することを含んで成る、核酸を含むサンプル中の種々の対立遺伝子 を同定するための方法を提供する。各ヌクレオチドの同一性は前記した対象の核 酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定するための方法によ り決定される。
本発明はまた、l又は複数の特定の遺伝子座での生物のゲッタイブを決定するた めの方法を提供し、この方法はゲノムDNAを含むサンプルを生物から獲得し、 次いで対象の核酸における1又は複数の特定の位置それぞれに存在するヌクレオ チド塩基又は複数の塩基を同定することを含んで成る。かかる塩基それぞれの同 一性は前記した通りの対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同 一性を決定するための方法のいづれかを利用して決定される。ヌクレオチド塩基 の一致は種々の対立遺伝子を決定、それ故1又は複数−トラジオグラフィーによ りアッセイした。
図4.プライマーTGL346及びTGL391のラベル化伸長生成物のゲル電 気泳動分析、ビーズ:結合型オリゴヌクレオチド鋳型TGL382と、TGL3 46又はTGL391との生産プライマー−鋳型複合体を4種の異なる〔α−土 、1 1s3)ジデオキシヌクレオシド三リン酸混合物によりプライマー伸長ラ ベル反応にかけた。ラベル化プライマーDNAを洗浄ビーズから遊離させ、次い で8%のポリアクリルアミド/8Mの尿素のDNAシーケンシングゲル上で電気 泳動にかけ(2,5pmoleのプライマー/レーン)、次いでオートラジオグ ラフィーにより分析した。プライマーTGL346についての4本のレーンはラ ベル化がdded合物により優先的に生ずることを示し、TGL382鋳型にお けるTGL346の3′末端に隣り合う次の対をなしていない塩基がGであるこ とを示唆している(実施例4に示す配列を参照のこと)、プライマー↑GL39 1についての4本のレーンはラベル化がddTd合物により優先的に生ずること を示し、TGL382鋳型におけるTGL391の3′末端に隣り合う次の対を なしていない塩基がAであることを示唆している。
図5.ビーズに結合した全放射性活性のオートラジオグラフ分析。
図5に記載の伸長反応の生成物を含むビーズ懸濁物を濾紙の上にスポットしくス ポット当り1 pmoleのプライマー)、そして全ビーズ結合化放射性活性を アシセイするためにX、*フィルムに暴露させた。
示す通り、TGL346はddCd合物からのラベルを主に取り込み、そしてT GL391はdd↑混合物からのラベルを主に取り込んだ。
図6゜哺乳動物DNAのPCR増幅化多形態遺伝座、 PCRプライマーTGL 240 (ビオチニル化)及びTGL239 (ビオチニル化していない)を用 いてゲノムDN^のサンプルから増幅せしめた327塩基対の哺乳動物DNAの セグメントを示す。2種類のホモ接合個体、ESB164 (ゲッタイブAA) 及びEA2014 (ゲッタイブBB)由来のDNAのサンプルを実施例5に記 載の分析に付した。この遺伝子座でのA対立遺伝子の完全DNA配列を、このA 配列の下の塩基により示すB対立遺伝子配列がA対立遺伝子配列と異なっている 箇所の多形態部位と共に示す。
検出プライマーTGL308はビオチニル化プライマーから伸長させた鋳型鎖と 塩基対合させて示す、A対立遺伝子について、TGL308の3′末端のすぐ下 流の対をなしていない鋳型塩基はCであり、そしてB対立遺伝子については、こ の塩基はAである。従って、A対立遺伝子はddGd合物によってのみTGL3 08のラベル化がもたらされ、そしてB対立遺伝子はdd丁丁合合物よってのみ ラベル化がもたらされるであろう。
図7.2種の異なるホモ接合個体に由来するPCR生成物のゲル電気泳動分析、 2種の個体、ESB164及びEA2014からゲノム[lNA (血液より獲 得)を増幅させるためにプライマーTGL240及びTGL239を用いた。図 7に概略する通り、ビーズ結合型PCR作製化鋳型にアニールさせたプライマー TGL308に関する伸長反応の生成物を、図5に概略した通りの8%のポリア クリルアミド/8Mの尿素のDNA シーケンシングゲル上で電気泳動により分 析した0個体ESB164 (ゲッタイブAA : ddGd合物よりラベル化 が予測)については、4種の異なるddNTPdベル化反応に由来する250f moleの伸長化プライマーを示す。
個体εA2014 (ゲッタイブBB : ddTd合物よりラベル化が予測) については、4種の異なるddNTPdベル化反応に由来する25.75及び2 50fmoleの伸長化プライマーの添加を示す。
図8 、 TGL308プライマー伸長反応に由来する生及びNaOH溶離化放 射活性のオートラジオグラフ分析。プライマーTGL30Bは、実施例5並びに 図7及び8に概略する通り、個体ESB214及びEA2014のゲッタイブを 分析するために用いた。全ビーズ結合化放射活性は、75fmoleのプライマ ーを含むビーズ懸濁物を濾紙上に直接スポットし、続いてこのスポット中のラベ ルのオートラジオグラフィー検出によって決定した。TGL30Bプライマーに 特異的に結合した放射活性は、このビーズを磁気的に固定化し、実施例4及び5 に記載の通りプライマーをNaOHで溶離させ、次いで75fmoleに相当す る量を濾紙上にスポットすることによって決定した。これらのスポット中のラベ ルもオートラジオグラフィーにより検出した。
図9゜種々のゲッタイブのヒトDNAサンプル由来の非対称型PCRにより作っ た一本鎖核酸に基づ< GBAからのデーターを示す。調べたDNA配列はDP アルファー鎖のアミノ酸31についてコードする多形態配列でのHLA DPA I遺伝子座(Marsh、 S、G、!、とBod+wer、 J、G、、 H LAClass U Nucleotide 5equences、1991.  Hu+wan l5nuno1. 3L 207−227 (1991) ) に由来し、そしてこの図の中央に示している。プライマーのすぐ下流のヌクレオ チドの同定は酵素結合化検出により行われ、そしてT7 DNAポリメラーゼに よって挿入されたヌクレオチドに対応するウェルにおいて橙色の色調変化として 識別された。ホモ接合体は1つの陽性ウェルしかなく、ヘテロ接合体は2つであ った。
GBAプライマーの配列を矢印で示し、その尾部はオリゴヌクレオチドの5′で あり、そしてその頭部は3′である。
図10゜種々のゲッタイブのウマDNAサンプル由来の非対称型PCHにより作 った一本鎖核酸に基づ< GBAからのデーターを示す。調べたDNA配列はD Pアルファー鎖のアミノ酸50についてコードする多形態配列でのHLA DP AI遺伝子座(門arsh、 S、G、E、とBodmer、 J、G、、 ) ILAClass U Nucleotide 5equences、1991 . Human Immunol、3L 207−227 [19!l1l)  )に由来し、そしてこの図の中央に示している。
図11.種々のゲッタイブのウマDNAサンプル由来の非対称型PCRにより作 った一本鎖核酸に基づ< GBAからのデーターを示す。調べたDNA配列はは じめにクローンしたゲノム断片に関するヌクレオチド番122での多形態配列で の不明の遺伝子座JH185(未発表結果)に由来し、そして図の中央に示す。
この位置で、rB、対立遺伝子は一個の追加塩基を含む。従って、別のヌクレオ チド位置を#308と対比させてプライマー#307により調べた。どちらにし ても、両鎖の調査結果は正確な分類をもたらした。
図12゜ウマ遺伝子座JH85の定量的GBAの結果のデーターを示す、基質の 添加後、r Vmax Jモデル96穴分光光度計(Molecular De vices。
Inc、、 Menlo Park、 CA)においてマイクロプレートを速度 論的に読み取った。値はミリOD単位/分においてVmaxとして表わした。A Aホモ接合(べた塗り捧) 、ABヘテロ接合(白抜き棒)及びBBホモ接合( 網かけ捧)の−末鎖鋳型についてのGBA結果を別々のウェルにおいて分析した 4種のビオチニル化ddNTPに関して示す、獲得した数値を各棒の上に示す。
発明の詳細な説明 本発明は、水性担体と、核酸鋳型依存性プライマー伸長反応の少なくとも2種類 の異なるターミネータ−の混合物とを含んで成る試薬組成物を提供する。それぞ れのターミネータ−は、このプライマーの3′末端に隣接し、且つ、その下流に ある、鋳型における対をなしていないヌクレオチド塩基の同一性に厳格に依存す る状況において伸長反応を特異的に停止せしめることが可能である。更に、この ターミネータ−の少なくとも一方は検出可能マーカーによりラベルされている。
本発明は更に、水性担体と、核酸鋳型依存性プライマー伸長反応の4種の異なる ターミネータ−の混合物とを含んで成る試薬組成物を提供する。それぞれのター ミネータ−は、上記のように伸長反応を特異的に停止せしめることが可能であり 、そしてこれらのターミネーターのうちの少なくとも1種が検出マーカーにより ラベルされている。
本発明は更に、水性担体と、核酸依存性プライマー伸長反応の4種の異なるター ミネータ−の混合物とを含んで成る試薬組成物を提供する。それぞれのターミネ ータ−は前記の通り伸長反応を特異的に停止せしめることができ、そしてターミ ネータ−の2,3又は4種が異なる検出可能マーカーによってラベル化されてい る。
本発明は更に前記した試薬であって、そのターミネータ−がヌクレオチド、ヌク レオチド類似体、ジデオキシヌクレオチド又はアラビノース三リン酸を含んで成 る試薬を更に提供する0本発明はまた試薬であって、そのターミネータ−が1又 は複数のジデオキシアデノシン三リン酸(ddATP) 、ジデオキシシトシン 三リン酸(ddeTP )、ジデオキシグアノシン三リン酸(ddGTP)、ジ デオキシチミジン三リン酸(ddTTP )又はジデオキシウリジン三リン酸( ddUTP )を含んで成る試薬を提供する。
本発明は更に上記した試薬であって、そのターミネータ−に付加された検出マー カーそれぞれがアイソトープ性ラベル化成分、発色団、蛍光団、タンパク質成分 、又は成分であってそれにアイソトープ性ラベル化成分、発色団、蛍光団もしく はタンパク質成分が付加されうるものである試薬を提供する0本発明は種々の検 出マーカーそれぞれが異なる蛍光団である試薬も提供する。
本発明は前記した試薬がピロホスファターゼを更に含んで成る試薬も提供する。
発明した試薬は2種以上の連鎖ターミネータ−より成り、ここでこの連鎖ターミ ネータ−のうちの1種以上は同定可能なようにタッグされている。この試薬は1 種以上のオリゴヌクレオチドブライマーに相補性である対象の核酸配列を分類す るDNAポリメラーゼプライマー伸長反応に利用することができ、これはポリメ ラーゼ伸長させたプライマーを連鎖ターミネータ−試薬より化学的に又は物理的 に分け、次いで末端の付加物を分析することにより行われる。更なる伸長を阻止 する任意の種類のターミネータ−1例えばジデオキシヌクレオシド三リン酸が利 用できる。ターミネータ−をラベル化及び検出するためにいくつかの手法が利用 できる: (1)放射活性、及びオートラジオグラフィーもしくはシンチレーシ ッン計測のいづれかによるその検出、(2)蛍光もしくは吸収分光学、(3)質 量分析、又は(4)タンパク質成分を用いる酵素活性、各ターミネータ−の同一 性は個々に、即ち、1つづつ決定できる。加えて、各ターミネータ−の独立分析 を可能とする方法は、4種までのターミネータ−の一体化を同時に分析すること を可能とする。
本発明は更に対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決 定するための方法を提供する。第1に、もし対象の核酸が二本鎖であるならばか かる核酸を含むサンプルを処理して特定の位置にわたって対をなしていないヌク レオチド塩基を獲得する。
もし対象の核酸が一本鎖であるならこの工程は必要ではない、第2に、対象の核 酸を含むサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとてオリゴヌクレオチドプ ライマーと接触させる。このオリゴヌクレオチドブライマーは、同定すべきヌク レオチド塩基のすぐ隣りの、対象の核酸に存在しているヌクレオチド塩基の鎖と ハイブリダイズして、プライマーと対象の核酸との二量体を形成することができ 、従って同定すべきヌクレオチド塩基は、プライマーと対象の核酸との二量体に おける、このプライマーの3′末端のすぐ下流にあるこの鋳型における最初の対 をなしていない塩基となる。従って、例えばDNAポリメラーゼにより触媒され る、一つのヌクレオチドのかたわらで生ずる二量体におけるオリゴヌクレオチド ブライマーの酵素的伸長は、同定すべきヌクレオチド塩基に付加されたヌクレオ チドの正しい塩基対合に依存する。
プライマーと対象の核酸との二量体を次に411のラベル化ターミネータ−を含 む試薬と接触させる。各ターミネータ−は異なる検出可能マーカーによりラベル されている。プライマーと対象の核酸との二量体を、この試薬の中に存在する相 補性ターミネータ−と同定すべきヌクレオチド塩基との塩基対合を可能にし、且 つ、このプライマーの3′末端においてこのターミネータ−が取り込まれるよう な鋳型依存性プライマー伸長反応の発生を可能とする条件のもとて該試薬と接触 させる。目的の結果は、オリゴヌクレオチドブライマーが1個のターミネータ− によって伸長されることにある0次に、伸長化プライマーの3′末端に存在して いる検出マーカーの同一性を決定する。検出マーカーの同一性は、どのターミネ ータ−が対象の核酸における次の塩基と塩基対合したかを示唆する。このターミ ネータ−は対象の核酸における次の塩基と相補するため、対象の核酸における次 の塩基の同一性がそれ故決定される。
本発明は更に対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決 定するための別の方法を提供する。第1に、もし対象の核酸が二本鎖であるなら ばかかる核酸を含むサンプルを処理して特定の位置にわたって対をなしていない ヌクレオチド塩基を獲得する。もし対象の核酸が一本鎖であるならこの工程は必 要ではない。
第2に、対象の核酸を含むサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとてオリ ゴヌクレオチドプライマーと接触させる。このオリゴヌクレオチドプライマーは 、同定すべきヌクレオチド塩基のすぐ隣りの、対象の核酸に存在しているヌクレ オチド塩基の鎖とハイブリダイズして、プライマーと対象の核酸との二量体を形 成することができ、従って同定すべきヌクレオチド塩基は、プライマーと対象の 核酸との二量体における、このプライマーの3′末端のすぐ下流にあるこの鋳型 における最初の対をなしていない塩基となる。
プライマーと対象の核酸との二量体を次に4種のラベル化ターミネータ−を含む 試薬と接触させ、ここでそれらのターミネータ−のうちの1種のみが検出マーカ ーを有するプライマーと対象の核酸との二量体を、この試薬の中に存在する相補 性ターミネータ−と同定すべきヌクレオチド塩基との塩基対合を可能にし、且つ 、このプライマーの3′末端においてこのターミネータ−が一体化されるような 鋳型依存性プライマー伸長反応の発生を可能とする条件のもとて該試薬と接触さ せる。目的の結果は、オリゴヌクレオチドプライマーが1個のターミネータ−に よって伸長されることにある。
プライマーと対象の核酸との最初の二量体を次に3種類の異なる試薬と接触させ 、ここでこの4通りの平行反応工程それぞれにおいて、4種のターミネータ−の うちの1種づつがラベルされている。
次に、この4通りの平行鋳型依存性プライマー伸長反応の生成物を、どの生成物 が検出マーカーを有しているかを決定するために調べる。
検出マーカーを有する生成物は、どのターミネータ−が対象の核酸における次の 塩基と塩基対合したかを示す、ターミネータ−は対象の核酸における次の塩基に 相補するため、これにより対象の核酸における次の塩基の同一性が決定される。
対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定するこの両 方の方法は、プライマーと鋳型とのハイブリダイゼーションの後にプライマーを ラベルしている。もし鋳型−依存性酵素がエキソヌクレアーゼ機能を有さないな ら、ターミネータ−によるラベル化が起こるためにこのプライマーの3′未満を 塩基対合すべきである。
本発明は更に核酸のサンプルにおける特定のヌクレオチド配列の有無を決定する ための方法を提供する。第1に、もし対象の核酸が二本鎖であるならばかかる核 酸を含むサンプルを処理して特定の位置にわたって対をなしていないヌクレオチ ド塩基を獲得する。もし対象の核酸が一本鎖であるならこの工程は必要ではない 。第2に、核酸のサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとてオリゴヌクレ オチドプライマーと接触させる。このオリゴヌクレオチドブライマーは、もし特 定のヌクレオチド配列が存在しているならばその特定のヌクレオチド配列とハイ ブリダイズすることができ、このプライマーと特定のヌクレオチド配列との二量 体を形成することができる。
存在するならば、プライマーと特定のヌクレオチド配列との二量体を次に4種の ラベル化ターミネータ−を含む試薬と接触させる。
各ターミネータ−は異なる検出可能マーカーによってラベルされている。存在す るならば、プライマーと特定のヌクレオチド配列との二量体を該試薬と、該試薬 中に存在している相補性ターミネータ−とこのプライマーの3′末端の下流の対 をなしていない鋳型ヌクレオチド塩基とを塩基対合させ(このプライマーはこの 鋳型における特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズしている)、そして鋳型 依存性プライマー伸長反応が起こることを可能とする条件のもとで接触させて、 このプライマーの3′末端にてターミネータ−を一体化させる。検出マーカーの 有無はこのプライマーがこの鋳型にノ\イブリダイスしたかを示唆する。もし検 出マーカーが存在していないなら、このプライマーはこの鋳型にハイブリダイズ していなく、従って特定のヌクレオチド配列がこの核酸サンプルの中に存在して いないことになる。もし検出マーカーが存在しているなら、このプライマーは鋳 型にハイブリダイズしていな(、従って特定のヌクレオチド配列がこの核酸サン プルの中に存在していることになる。
本発明は更に核酸のサンプルにおける特定のヌクレオチド配列の有無を決定する ための別の方法を提供する。第1に、もし対象の核酸が二本鎖であるならばかか る核酸を含むサンプルを処理して特定の位置にわたって対をなしていないヌクレ オチド塩基を獲得する。
第2に、核酸のサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとてオリゴヌクレオ チドブライマーと接触させる。このオリゴヌクレオチドブライマーは、もし特定 のヌクレオチド配列が存在しているならばその特定のヌクレオチド配列とハイブ リダイズすることができ、このプライマーと特定のヌクレオチド配列との二量体 を形成することができる。
存在するならば、プライマーと特定のヌクレオチド配列との二量体を次に4種の ラベル化ターミネータ−を含む試薬と接触させる。
ターミネータ−のうちの一種のみが検出可能マーカーによってラベルされている 。存在するならば、プライマーと特定のヌクレオチド配列との二量体を該試薬と 、該試薬中に存在している相補性ターミネータ−とこのプライマーの3′末端の 下流の対をなしていない鋳型ヌクレオチド塩基とを塩基対合させ(このプライマ ーはこの鋳型における特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズしている)、そ して鋳型依存性プライマー伸長反応が起こることを可能とする条件のもとで接触 させる。目的の結果は、プライマーの3′末端でのターミネータ−の一体化であ る。
存在しているならば、プライマーと特定のヌクレオチド配列との最初の二量体を 次に3種類の異なる試薬接触させる。ここでこの4通りの平行反応工程において 、411Iのターミネータ−のうちの1種づつがラベルされている0次に、この 4通りの平行の鋳型依存性プライマー伸長反応の生成物を、存在しているなら、 どの生成物が検出マーカーを有しているかの決定にかける。検出マーカーの同一 性の有無は、プライマーが鋳型にハイブリダイズしているかどうかを示唆する。
もし検出マーカーがどの生成物においても存在していないなら、このプライマー は鋳型にハイブリダイズしていないことになり、従って特定のヌクレオチド配列 が核酸サンプルの中に存在していないことになる。もし検出マーカーがいづれか の生成物において存在しているなら、このプライマーは鋳型にハイブリダイズし ていることになり、従って、特定のヌクレオチド配列が核酸サンプルの中に存在 していることになる。
対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定するための 方法及び核酸のサンプル中の特定のヌクレオチド配列の有無の決定のための方法 の種々のバージョンが可能である。第1バージヨンにおいては、鋳型はデオキシ リボ核酸であり、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌ クレオチド又はデオキシリボヌクレオチドとりボヌクレオチドとの共重合体であ り、そして鋳型依存性酵素はDNAポリメラーゼである。このバージョンはDN A生成物を供する。第2バージロンにおいては、鋳型はリボ核酸であり、プライ マーはオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド又はデオキシ リボヌクレオチドとりポヌクレオチドとの共重合体であり、そして鋳型依存性酵 素は逆転写酵素である。このバージョンはDNA生成物を供する。第3のバージ ョンにおいては、鋳型はデオキシリボ核酸であり、プライマーはオリゴリボヌク レオチドであり、そして酵素はRN^ポリメラーゼである。
このバージジンはRNA生成物を供する。第4のバージョンにおいては、鋳型は リボ核酸であり、プライマーはオリゴリボヌクレオチドであり、そして鋳型依存 性酵素は、RNANプレカーゼである。このバージョンはRNA生成物を供する 。
好ましくは、プライマー伸長反応を行う前に、この鋳型の3′末端へのターミネ ータ−の付加によってこの鋳型にキャップを付す。
このターミネータ−は鋳型依存性プライマー伸長反応を停止させることができる 。この鋳型はキャップが付されて更なるラベル化ターミネータ−がこの鋳型の3 ′末端に付加されないようになっている。
伸長反応は鋳型ではなく、プライマーに基づいて生ずるべきである。
鋳型にキャップを付するためのターミネータ−としてジデオキシヌクレオチドが 利用できる。
対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の囮−性を決定するための 方法の別の改良法は、伸長反応後に適当な変性条件を用いて対象の核酸からプラ イマーを分けることにある。この変性条件は熱、アルカリ、ホルムアミド、尿素 、グリオキサル、酵素及びそれらの組合せを含んで成りうる。変性条件は2.O NのNaOHによる処理も含んで成りうる。
対象の核酸は非天然ヌクレオチド類似体、例えばデオキシイノシン又は7−ジア ザ−2′−デオキシグアノシンを含んで成りうる。
これらの類似体はDNA二量体を不安定にし、従って鎖の完全な分離を伴うこと なく二本鎖サンプル中でプライマーのアニーリング及び伸長反応が生ずることを 可能にしうる。
核酸のサンプルは任意の起源に由来してよい。核酸のサンプルは天然でも合成で もよい(即ち、インビトロで酵素的に合成されたもの)。核酸のサンプルはデオ キシリボ核酸、リボ核酸、又はデオキシリボ核酸とリボ核酸との共重合体を含ん で成りうる。対象の核酸はデオキシリボ核酸、リボ核酸、又はデオキシリボ核酸 とリボ核酸との共重合体であってよい。対象の核酸はインビボで酵素的に合成、 インビトロで酵素的に合成、又は非酵素的に合成されたものでよい。
対象の核酸又は複数の核酸を含むサンプルは生物に由来するゲノムDNA 、そ のRNA転写体、又はそのRNA転写体より調製したcDNAを含んで成りうる 。対象の核酸又は複数の核酸を含むサンプルは生物に由来するゲノム外DNA  、そのRNA転写体、又はそのRNA転写体より調製したcDN^を含んで成り うる。また、対象の核酸又は複数の核酸はポリメラーゼ連鎖反応により合成され たものであってよい。
このサンプルは任意の生物から採取できる0本発明の方法を適用することのでき る生物のいくつかの例は植物、微生物、ウィルス、鳥類、を推動物、無を推動物 、哺乳動物、人類、馬、犬、牛、猫、豚又は羊である。
対象の核酸は一体化されなかった試薬及び/又はプライマーからの対象の核酸の アフィニティー分離を可能にするl又は複数の成分を含んで成りうる。対象の核 酸は一体化されなかった試薬及び/又はプライマーからの核酸のアフィニティー 分離を可能とするビオチンを含んで成ることができる。この分離は固相支持体に 結合されたストレプトアビジンへのビオチンの結合を介する。対象の核酸の配列 はDN^配列であって、固相支持体に結合された核酸において存在している相補 鎖との塩基対合を介して、一体化されなかった試薬及び/又はプライマーから対 象の核酸のアフィニティー分離を可能とするものを含んで成ることができる。対 象の核酸は検出マーカーでラベルされていてよい;この検出マーカーはこの試薬 の中に存在している又はプライマーに結合したどの検出マーカーとも異なってい てよい。
該オリゴヌクレオチドブライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリ ボヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチドとりボヌクレオチドとの共重合 体でありうる。このオリゴヌクレオチドブライマーは天然でも合成でもよい。こ のオリゴヌクレオチドブライマーはインビボで酵素的に合成、インビトロで酵素 的に合成、又はインビトロで非酵素的に合成されたものでよい、このオリゴヌク レオチドブライマーは検出マーカーでラベル化されていてよい;この検出可能マ ーカーは試薬の中に存在している、又は対象の核酸に結合している任意の検出可 能マーカーと異なっていてよい。更に、このオリゴヌクレオチドブライマーは、 同定すべきヌクレオチド塩基のすぐ隣りの、且つ、上流の対象の核酸において存 在しているヌクレオチドとハイブリダイズ又はアニールすることが可能であるべ きである。所望のハイブリダイゼーションを達成するための手段は、同定すべき 塩基のすぐ隣りの既知の塩基配列と実質的に相補性の、又は完全に相補性の鋳型 依存性プライマーを獲得することにある。
オリゴヌクレオチドブライマーは一体化されなかった試薬及び/又は対象の核酸 からのプライマーのアフィニティー分離を可能にする1又は複数の成分を含んで 成りうる。オリゴヌクレオチドブライマーは一体化されなかった試薬及び/又は 対象の核酸からのプライマーのアフィニティー分離を可能とするビオチンを含ん で成ることができる、この分離は固相支持体に結合されたストレプトアビジンへ のビオチンの結合を介する。オリゴヌクレオチドブライマーの配列はDNA配列 であって、面相支持体に結合された核酸において存在している相補鎖との塩基対 合を介して、一体化されなかった試薬及び/又は対象の核酸からプライマーのア フィニティー分離を可能とするものを含んで成ることができる。
本発明はまた、■又は複数の特定の位置それぞれにて存在している塩基又は複数 の塩基を同定することを含んで成る核酸のサンプルの分類方法を提供し、かかる ヌクレオチド塩基それぞれは前記した通りの対象の核酸における特定の位置での ヌクレオチド塩基の同一性を決定するための方法のうちのいづれかを利用して同 定される。
対象の核酸におけるそれぞれの特定の位置は異なるプライマーを用いて決定され る。各位置での各ヌクレオチド塩基又は複数の塩基の同一性を独立して決定する ことができ、又は種々の位置でのヌクレオチド塩基の同定を同時に決定すること ができる。
本発明はまた、l又は複数の特定のヌクレオチド配列の有無を決定することを含 んで成る核酸のサンプルを分類する別の方法を提供し、かかるヌクレオチド配列 のそれぞれの有無は、前記した澹≠央通りの核酸のサンプル中の特定のヌクレオ チド配列の有無を決定するための方法のいづれかを利用して決定される。
本発明はまた、核酸を含むサンプルを分類する別の方法を提供する。第1に、1 又は複数の特定のヌクレオチド配列の有無を決定する;かかるヌクレオチド配列 のそれぞれの有無は、前記した通した通りの核酸のサンプル中の特定のヌクレオ チド配列の有無を決定するための方法のいづれかを利用して決定される。次に、 1又は複数の特定の位置に存在しているヌクレオチド塩基又は複数の塩基を同定 する;かかる塩基それぞれは、前記した通りの対象の核酸における特定位置での ヌクレオチド塩基の同一性を決定するための方法のいづれかを利用して同定され る。
本発明は更に、核酸を含むサンプルにおける種々の対立遺伝子を同定するための 方法を提供し、この方法は1又は複数の特定の位置それぞれでの塩基又は複数の 塩基を同定することを含んで成る。各ヌクレオチド塩基の同一性は、前記した通 り、対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定するた めの方法により決定される。
本発明はまた、1又は複数の特定の遺伝子座での生物のゲッタイブを決定するた めの方法を提供し、この方法はゲノムDN^を含むサンプルを生物から獲得し、 次いで対象の核酸におけるl又は複数の特定の位置それぞれにて存在しているヌ クレオチド塩基又は複数の塩基を同定することを含んで成る。かかる塩基それぞ れの同定は、前記した通りの対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩 基の同一性を決定するための方法のいづれがを用いて決定される。
ヌクレオチド塩基の同一性は種々の対立遺伝子を決定し、それ故l又は複数の特 定の遺伝子座での生物のゲノムタイプを決定する。
適当なオリゴヌクレオチドブライマー、並びに付随した3′から5′に至るエキ ソヌクレアーゼ機能を有する又は有さないDNAポリメラーゼ、並びに適当な塩 及び補因子混合物との組合せにおける連鎖停止剤は、適当なハイブリダイゼーシ ョン条件のもとで、適当なプライマー選別技術を用いたなら、核酸の診断又は分 類のためのキットとして利用できる。プライマー選別及び末端ヌクレオチド付加 分析を簡素化するため、本発明はアフィニティー選別及びポリメラーゼ伸長を可 能とするように改良されたオリゴヌクレオチドを利用する0合成オリゴヌクレオ チドの5′末端及び内部ヌクレオチドは種々のアフィニティー選別手法を可能と する数多くの様々な方法、例えばビオチニル化において改良されうる。これらの アフィニティー試薬は伸長せしめた(複数の)オリゴヌクレオチドの分析を促進 せしめるために下記の2通りの方法においてターミネータ−混合物と共に用いる ことができる: (1)もし単一のアフィニティー基を(複数の)オリゴヌクレオチド上に用いる なら、(複数の)オリゴヌクレオチドは、一体化されていないターミネータ−試 薬から分けることができる。これは物理的又はサイズ的選別の必要をなくす。
(2)複数のアフィニティー基を用いるなら、複数のオリゴヌクレオチドはター ミネータ−試薬から分離されて同時に分析されることができる。これは伸長反応 当り複数の核酸物質の分析又はより多くの核酸配列情報を可能とする。
この(複数の)アフィニティー基はプライムに付されたオリゴヌクレオチド上に ある必要はなく、他方、鋳型上にあってよい、このプライマーがアフィニティー 選別工程中に鋳型に水素結合している限り、このことは一体化されていないター ミネータ−試薬からのプライマーの効率的な分離を可能とするであろう、このこ とは付加成分の好適な連結のために、プライマー上に自由な部位を残す更なる利 点をも有している0例えば、このプライマーの5′末端はそれに適当な蛍光基、 例えばローダミンを結合させることにより改質されることができ、このことはア フィニティー選別工程の後にプライマー:鋳型複合体におけるプライマーの量が 簡単に定量されることを可能にする。従って3′末端化ターミネータ−の量はア ニール化プライマーの全量に対して標準化されうる。
このオリゴヌクレオチドプライマー及び鋳型は任意の長さもしくは配列であって よく、DNAもしくはRNAであってよく、又はそれらの任意の改良体であって よい、しかしながら必要ならば、対象の標的配列に対するプライマー緊縮ハイプ リダイゼーシッンを最適化する条件を選ぶ。
鋳型依存性プライマー伸長反応の発生のための条件は、適当な鋳型依存性酵素の 存在下によりある程度作られうる。いくつかの適当な鋳型依存性酵素はDNAポ リメラーゼである。このDNAポリメラーゼは複数のイタブでありうる。しかし ながら、このDNAポリメラーゼはプライマー及び鋳型依存性でな(ではならな い0例えば、LユfiDNAポリメラーゼIもしくはその「フレノウフラグメン ト」、T4DN^ポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ(「シーケナーゼ」 )、Lアクア−カス(T、 a uaticus) DNAポリメラーゼ、又は レトロウィルス逆転写酵素が利用できる。 RN^ポリメラーゼ、例えばT3又 はT7 RNAポリメラーゼはいくつかのプロトコールにおいて用いることもで きる。ポリメラーゼに依存して、種々の条件を利用しなくてはならず、そして種 々の温度域がハイブリダイゼーション及び伸長反応のために必要でありうる。
本発明の試薬は、特定のハイブリダイゼーション及びポリメラーゼ連鎖伸長条件 のもとでプライマー又は複数のプライマーに対するターミネータ−の3′末端付 加の分析を促進せしめることにより、対象の核酸の分類を可能とする。ヌクレオ チドミリン酸基質としてのターミネータ−混合物のみを利用することは、ポリメ ラーゼ反応におけるプライマーの3′末端に対する1個のヌクレオチド残基のみ の付加を確実にする。同時に4種のターミネータ−を全て用いることは、精度、 即ち、誤解説の抑制を確実にする。
1又は複数のターミネータ−を特異的にラベル化することにより、伸長化プライ マー配列を推定することができる。原理的には、もし複数のターミネータ−が特 異的にラベル化されているなら、複数の反応生成物を一回の反応当りに分析する ことができる。
(複数の)オリゴヌクレオチドプライマー又は(複数の)鋳型に、3′伸長反応 には影響を及ぼさないがアフィニティー選別を可能とする成分を特異的につなげ ることにより、反応後に、一体化されていないターミネータ−1この試薬の他の 成分及び/又は鋳型鎖から(複数の)伸長生成物を分離せしめることができる。
もし複数のアフィニティー因子を利用するなら、複数のオリゴヌクレオチドを伸 長反応当り分析することができる。
原理的には、4種の異なるラベル化ターミネータ−と、異なる基のつなげられた 数多くのプライマー又は鋳型との組合せは、数多くの異なる核酸配列の同時分類 を可能とする。
この診断反応における特異性は、 (1)オリゴヌクレオチドハイプリダイゼーシッンの緊縮度、及び(2)単一残 基伸長により獲得される配列情報によって決定される。
A、一般的方法 1、オリゴデオキシヌクレオチドのビオチニル化。
第一アミノ基によってその5′末端が終結しているオリゴデオキシヌクレオチド をMidland Certified Reagents、 Midland 、 Texasより注量した。ビオチン−N−ビトロキシスクシンイミドの誘導 体でをあるビオチン−XX −NHSエステル(C1ontech Labor atories+ Inc、。
Pa1o Alto、 Ca1ifornia)を用いてこれらをビオチニル化 した。典型的には、このオリゴヌクレオチド(9ナノモル)を0.1MのNaH COz/NazCO3(pFI9 ) 100μmに溶かし、次いで2.5mg のビオチン−XX−NIIS−エステルを含むN、N−ジメチルホルムアミド2 5μlを加えた。この混合物を室温で一夜インキユベートした0次にこれを!( ,0で平衡にした6mlのセファデックスのG−25カラム(rDNAグレード J −Pharvacia)に通した。 [lNAを含む溶離画分は、4μ+の アリコートを等容量のエチジウムプロミド(2Mg/ml)と混合し、次いでD NA誘発化蛍光物質をUVトランスイルミネーターでモニターすることによって 同定する。未反応エステルを220nmにてUV吸収により検出する。 DNA を含むチューブをプールし、Centricon −3マイクロコンセントレー タ−(八−1con)で濃縮し、次いで再びセファデックスに通した。
〔3H〕−ビオチンの磁性M−280ストレプトアビジンダイナビーズ(Dyn al)への結合の阻止を、オリゴヌクレオチドのビオチニル化の程度を定量的に アッセイするために用いた。エッペンドルブチュープ及びピペットチップをシリ コン処理した。0.1MのNaC110μl中の既知量(5〜Lop−ole) のビオチンラベル化オリゴヌクレオチドを、0.1MのNaC1中のl:4のビ ーズ懸濁物25μmを含むチューブに加えた。これらのチューブをLabqua keシューカー(Labindustries、 Inc、)で1時間振盪させ た。このチューブに0.1MのNaC120μm中の〔3H〕−ビオチンを量を 増やしながら(5〜35pmole)加え、そしてこれらを再び1時間にわたっ て振盪させた。
チューブをDynal NPC−Eマグネット上に載せて懸濁物からビーズを除 去し、この上清液の10μ!のアリコートを取り出し、そしてこれら中の放射活 性の値をBeck腸an LS 5000 TD液体シンチレーシッンカウンタ ーを用いて測定した。そのカウント数を、オリゴヌクレオチドを加えていないチ ューブのそれと対比した。他方、いくつかのプライマーに関しては、ビオチニル 化は0.8Mの尿素の存在下における分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動を 用いて反応生成物のサイズ分別によってモニターした。
2−鋳型依存性プライマー伸長/停止反応。
約5 pmoleの5′−ビオチニル化オリゴデオキシヌクレオチド鋳型(前記 参照)を約3pmoleのプライマーと、rXのシーケンス用緩衝液(Sequ enase Version 2.0キツト、US Biochemical  Corp、由来)(最終容量10u I )の中で混合し、この混合物を65℃ で2分間インキュベートし、次いで室温にまで冷やして、プライマーと鋳型をア ニールさせた。アニールした鋳型−プライマーを含む溶液をAとBの5μlづつ に2つに分け、これに以下のものを加えた:反応物A (II準準用用鋳型濃度 −100seHのジチオスレイトール0.5μm 10μMのdATP、 dG TP、 ddCTPをそれぞれlμl、rMn緩衝液J(Sequenaseν ersion 2.0キツト、 US Biochesical Corp、由 来)0.5a 1. (”S) −α−%f −dTTP(10mCi/ml、  1180Ci/vwole)(Dupont−MEN)’ 0.5111、シ ーケナーゼIμl(1:8希釈、USBiochemical Corp、 )  ;反応物B(プライマー3′末端の鋳型特異性ラベル化)−反応物Aの添加物 と同じ、ただし用いたヌクレオチドはddCTP、 ddGTP、 DDTTP 及ヒ(”S) −α−+t−ddATP トL/た。
反応は37℃で5分とした。プライマー又はシーケナーゼを省いたコントロール も実施した。アリコートを取り出し、そして15%のポリアクリルアミド、8M の尿素のDNA シーケンシングゲル上泳動により分析した(Maniatis 、 ?、らMo1ecular C1onin a照のこと)。ゲルを10%の メタノール、10%の酢酸で固定し、Whatmanの3MM紙で乾かし、そし てKodak X−0sat ARフィルムに曝露させた。他方、液体シンチレ ーシッンカウンティングによる生成物の分析のため、ビオチニル化鋳型又は鋳型 プライマーをシーケナーゼ反応の前後にて過剰量のM−280ストレプトアビジ ンダイナビーズ((lynal)に結合させた(結合条件については、前記のr l、オリゴデオキシヌクレオチドのビオチニル化」を参照のこと)。ビーズを0 .1MのNaC1で3回洗って一体化されていないラベルを除去し、次いでシン チレーション液体を加え、そして液体シンチレーションカウンティングによって 放射活性を測定した。
3、ポリメラーゼ連鎖反応生成物からの鋳型の作製。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の反応は、DNAの標的鎖にフランクする1又 は複数の増幅プライマーを前記の通りにビオチニル化させて行った。これらのプ ライマー(最終濃度2μ5of)及び標的DNAC1ugまで)を2.5単位の Taqポリメラーゼ(Perkin E1mer/Cetus) 、20011  MのdATP、 dCTP、 dGTP及びdTTP、 10s+Mのトリス −HCI(pH8,3) 、 5.0mMのKCI 、 1.5mMのMgCI  Z及びO,01%のゼラチン(Sigma)とインキュベートした0反応混合 物の上にパラフィン油をかぶせ、そしてPerkin EImer/Cetus サーモサイクラ−で30周期にわたってインキュベートした0反応生成物をフェ ノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製し、次いでポリアクリ ルアミドゲルでの電気泳動の後にコチジウムブロミド染色によって分析した。二 量体PCR生成物の収量は典型的には約Lougであった。
このPCR生成物約5μgを、0.1MのNaC1中の予備洗浄したM−280 グイナビーズの懸濁物50μlと、ゆっくり撹拌しながら60分にわたってイン キュベートした。結合DNA (約15pmole)を有するビーズを次に0. 15MのNaOHと25°Cで5分間インキュベートした。このビーズを0.1 5MのNaOHで1回洗い、一体化していない[lNA IIを除去し、次いで HzOで3回洗った。このビーズをH,Oに再懸濁させ、ビオチン−ストレプト アビジン結合を介してビーズに結合した鎖を更なるプライマー伸長反応物のため の鋳型として用いた。
B、実施例 実施例1゜ プライマーオリゴ182 : ” GCCTTGGCGTTGTAGAA”鋳型 オリゴ 180(C)/181(T) : ” TCGGGTCGGAACCGCAAC ATCTTC/TATAGACTA”オリゴヌクレオチド180及び181を、 その5′末端に第一アミノ基を付加させて合成した。これらを前述の通りにビオ チンと複合させた。オリゴヌクレオチド182をプライマーとしてアニールさせ 、そして伸長反応「A」と「B」 (前記参照)を実施した。オリゴヌクレオチ 1″182に至る予測の鋳型依存性3′−末端伸長を下記に示す(ヌクレオチド の前の「*」は放射活性ラベルを表わす):鐘呈 反息へ 厘息旦 180 −dG−”dT−dA−”dT−dde −ddG181 −dA−” dT−dA−”dT−ddC−”ddk従って反応「A」においては、両鋳型ヌ クレオチドは放射活性ラベルされた5個のヌクレオチドのプライマー伸長をもた らすであろう;ラベル化の程度は反応系において存在している効率的にプライム された鋳型の量に比例するであろう0反応rB、においては、両鋳型はプライマ ーの1個のヌクレオチド伸長をもたらすであろうが、しかしながらプライマーの ラベル化において鋳型181に関してのみこのことが得られるであろう、従って 反応「B」は、生産プライマー−鋳型複合体のDNAポリメラーゼ触媒化伸長を 介するオリゴヌクレオチドの鋳型依存性配列特異性ラベル化の例である。
反応生成物を15%のポリアクリルアミド/8Mの尿素のシーケンシングゲル上 でサイズ分別し、そしてオートラジオグラフで識別した。結果(図I)は、予測 通り、反応「Aノが両プライマーのラベル化及び伸長をもたらし、他方、反応r B、が鋳型181に強く偏ったラベル化をもたらすことを示した0図1のパネル CはパネルBと同じ反応生成物のゲル分析を示すが、ただしその反応生成物はM −280ストレプトアビジンダイナビーズを用いて前記した通りにまず精製しで ある。
依存性ラベル化を示し、ここでそのラベル化はオリゴヌクレオチド又はポリアク リルアミドゲル上で同じように泳動する他の物質に対して特異的である。ゲル泳 動とは無関係に他の全てのラベル化物質に対するオリゴヌクレオチド182の鋳 型依存性特異的ラベル化をより一般的に評価するため、一体化させた放射活性の 直接的な測定を行った。この実験において、両方の反応’AJとrB、を行い、 反応生成物をグイナビースを用いて精製し、次いでアリコート中の全放射活性を 液体シンチレーションカウンティングによって測定した。
この手順は他の物質の中へのラベルの誤まった一体化、及びそれに加えて、一体 化されていないヌクレオチドについてのグイナビーズ洗浄手順の効率の両方を評 価せしめる。実際には、プライマーの特異的な鋳型依存性ラベル化を評価するた めの簡単で、ゲルをベースとしない手順を得るために、非特異的なラベルの両起 源を最少限にすることが興味深いとされるであろう、Mi磁性ビーズ基づく洗浄 後の反応生成物を直接的に計測する結果を下記に示す(全ての結果を353のc psとして表わス): 反皇 鐘二ュ観 誇!」■ A、完全 325.782 441,823A、ポリメラーゼなし 5.18?  5,416A、プライマーなし 4.351 12.386B、完全 5.6 74 176.291B、ポリメラーゼなし 2.988 1,419B、プラ イマーなし 1 、889 1 、26にれらの結果かられかる通り、プライマ ー182の特異的な鋳型依存性ラベル化は、未反応のヌクレオチドを取り除くた めの磁性ビーズを伴う洗浄後の反応生成物の全放射活性を測定することによって 決定することもできる0本実験におけるバックグランドは全ての起源に由来する 非特異的なラベルに基づいて約3〜4%である(「B。
完全」反応における鋳型180と181を比較のこと)、コントロール実験(「 ポリメラーゼなし」及び「プライマーなし」)は、バックグランドラベルの値が 、洗浄工程によって完璧に除去されなかった一体化されていないヌクレオチドに おそらく原因することを示す。
「A、完全」反応は、両方の鋳型に関する、生産鋳型ニプライマー複合体が依存 していることを示す。
実施例3 2種類の増幅プライマー、TGL105及びTGL206 (図2)を、2種類 のDNA配列多形態を含む牛DNAのクローン鎖を増幅させるために用いた:位 置114にてA又はT、そして位置190にてA又はG(図2)。
これらの多形態を含むDNAは分子クローンされ、そして以下のプラスミドに基 づいて獲得できるニブラスミドp183. C114及びA190 ;プラスミ ドp624. T114及びA109 ;プラスミドp814. C114及び G190.ビオチニル化プライマーを伴う4通りのPCR反応を行って、鋳型と して利用するためのこれらのプラスミドの特定の鎖を増幅及び精製した。
プライマー プラスミド 技量1蓋漏仁乙二105ビオチニル化 p183とp 624 TGL182106ビオチニル化なし 105ビオチニル化なし p183とp814 TGL166106ビオチニル 化 二量体PCR生成物を磁性微粒子に結合させ、NaOHで変性させ、そして前記 の通りにビオチニル化鎖を精製した。ビオチニル化TGL105によって調製し た鋳型をビオチニル化されていないプライマーTGL106によるDNAシーケ ンシングによる分析にかけ、存在している鋳型の量を測定した。同様に、ビオチ ニル化TGL106を用いて調製した鋳型をビオチニル化していないTGL10 5によるシーケンス化により分析した。
はぼ等容量の鋳型(2pmole)を多形態検出プライマー、丁GL1B2とT GL166に65°Cで5分間アニールさせた(前記及び図2を参照のこと)。
これらのプライマーは鋳型に、配列特異的状況において水素結合し、それらの3 ′末端はそれぞれ位置114と190のヌクレオチドの隣りとなっている(図2 )、4種類のddNTP (その1つ(ddATP)はラベル化されている)の 存在下においてこれらのプライマー:鋳型複合体に基づいて鋳型依存性プライマ ー伸長反応(反応「B」条件)を行った。これらの伸長反応生成物を15%のポ リアクリルアミド/8Mの尿素のゲルでの電気泳動、それに続くオートラジオグ ラフィーによって分析した(図3)。
実施例4 プライマーオリゴTGL391: ”TGTTTTGCACAAAAGCA”プ ライマーオリゴTGL346: s′GTTTTGCACAAAAGCAT”鋳 型オリゴ TGL3B2: 3′CACAAAACGTGTTTTCGTAGG AS′−ビオスチン= (ストレプトアビジンビーズ)オリゴヌクレオチドTG L382をMidland Certified Reagent Compa ny。
Midland、 Texasより購入した。これを5′末端ヌクレオチド位置 において、自動化DNA合成における利用に適するMidland Derti fiedReagent Companyの「ビオチンdXJ試薬(ビオチン誘 導型ホスホラミジット)を用いてビオチニル化した0次にこのビオチニル化オリ ゴヌクレオチドを陰イオン交換HPLCにより精製した。ストレプトアビジン複 合化M−280ダイナビーズをTNET緩衝液(10mMのトリス−HCl、  pH7,5,1005MのNaC1,1抛門のEDTA、0.1%のトリトンX −100)で洗い、そして同じ緩衝液の中で7X10@ビ一ズ/mlの濃度にお いて再懸濁させた。10〜100p100pのビオチニル化オリゴヌクレオチド TGL382をTNET中の100μlのグイナビーズ懸濁物と30分間20℃ でインキュベートして、ビオチン成分をストレプトアビジンに結合させた。この ビーズを次に(それらを固定する磁石を用いて)200μmのTNETで3回洗 い、そして100μlのTNETに再懸濁させた。アニール化のため、付加した 鋳型オリゴヌクレオチドを有するグイナビーズのこの懸濁物25μIを磁石で固 定し、TNETを除去し、そして2gMのオリゴヌクレオチドブライマー346 又は391を含む4抛門のトリス−HCl、 pH7,5,20mMのMgC1 g、 50mMのNaC125μlを加えた。
この鋳型及び各プライマーを65℃で5分間インキュベートし、次いで室温にま で20分かけてゆっくり冷やすことによってアニールさせた。鋳型−プライマー −複合体を含むビーズをTNET 200μlで2回洗い、続いて40mMのト リス−HCl、 pH7,5,205MのMgC1z、 50mMのNaC12 5μlの中に再懸濁させた。
以下のddNTP混合物を用いた: 3SS−ラベル化ジデオキシヌクレオシド三リン酸す合物(ラベル化ヌクレオチ ドはddN”TPで示す):ddG混合物: 5gM ddG”TP 10μM  ddATP 10μM ddTTP10μM ddeTP ddA混合物=lOμM ddGTP 5μ阿ddA”TP 10μM ddT TP10μM ddeTP ddT混合物:10μM ddGTP 10μM ddATP 5gM ddT ”↑P10μM ddCTP dde混合物=lOμM ddGTP 10μM ddATP 10μM dd TTP5μM dde”TP ddN”TPは4種のそれぞれの〔α−+、t−”S)ジデオキシヌクレオシド 三リン酸である(New England NZ、1earより購入)。
各ビーズ結合化鋳型プライマー複合体につき、4通りの伸長反応を実施した(各 ddNTP混合物につき1反応)。伸長反応物は下記の成分を含んだニアニール した鋳型プライマー複合体を含む5.0μlのビーズ懸濁物、100mMのジチ オスレイトール0.5gIrMn+″溶液JO,5tt I (100mMのM nC1z、 150+wMのDL−イソシトレート、 pH7,0iU、S、  Biochemicals、 C1eveland、 0hioより購入)、  1.0μmのddG。
ddA、 ddT又はddC混合物、2.0μmのHlO及び1.0μmの77  DNAポリメラーゼ(「シーケンス化」バージョン2.0.υ、S、 Bio chesicals。
5〇−阿のトリス−HCl、 pH7,5,10mMの2−メルカプトエタノー ル。
ll+g/mlの牛血清アルブミン中でT625単位/w+1)。
反応を20°Cで15分間行わせ、次いで50μmのTNETで3回、磁性固定 化ビーズを洗うことにより停止させた。これらのビーズを検定アッセイ前に25 μlの最終容量のTNETの中に再懸濁させた。
プライマー伸長反応によるラベル化ジデオキシヌクレオチドの一体化を2通りの 方法、即ち、ゲル電気泳動、それに続くオートラジオグラフィー、及びラベル化 DNAの直接オートラジオグラフィーによりアッセイした。
■、ゲル電気泳動、それに続くオートラジオグラフィー(35S−ラベル化物質 のみ)。洗浄せしめたビーズ結合化DNAを10μIのホルムアミド装填用緩衝 液(80%のホルムアミド、101Mのトリス−HCl。
pH8、1+*Mのl1iDTA、 0.02%のプロチフェノールブルー)の 中で94℃で5分間熱し、そしてプライマー二鋳型複合体からラベル化プライマ ーを遊離させた。サンプル8又は12.5%のポリアクリルアミド/8Mの尿素 シーケンシングゲル(19:1のアクリルアミド:ビス−アクリルアミド比;  100mMのトリス−HCl、 100wMのボレート、2抛門のEDTA、  pH8,3のランニング緩衝液;60ワツトの定常出力)での電気泳動により分 析した。電気泳動後、ゲルを濾紙上で乾かすか、又は−80℃で凍結して拡散を 防ぎ、プラスチックラップをかぶせ、そしてX線フィルムに曝露して、オートラ ジオグラフィーによりラベル化DNAを識別化させた(図4)。
2、ラベル化DNAの直接オートラジオグラフィー分析。
ビーズに対する全放射活性結合の分析のため、TNET中のビーズ懸濁物の10 μIのアリコートを濾紙又はナイロン膜上に直接スポットした。フィルター又は 膜を白熱電球のもとで乾かし、プラスチックラップをかぶせ、そしてX線フィル ムに曝露した(図5)。
実施例5 TGL240: ”AGATGATGCTTTTGTGCAAAACAC”TG L239: ” TCAATACCTGAGTCCCGACACCCTG3 ’ TGL308: ”AGCCTCAGACCGCGTGGTGCC丁GGT3′ オリゴヌクレオチドTGL240を、その5′末端に第一アミノ基を付け、そし て前記した通りビオチンを複合させて合成した。TGL240(ビオチニル化) 及びTGL239 (ビオチニル化されていない)を、ポリメラーゼ連鎖反応手 順(「A、一般的方法」を参照のこと)を介して哺乳動物ゲノムDNAのサンプ ル中の特定の遺伝子座を含んで成るDNA ffi域を増幅させるために利用し た。それぞれが特定の組の連結化配列多形態(「A」対立遺伝子及び「B」対立 遺伝子−図6参照のこと)に対してホモ接合性である2種類の別々の個体に由来 するDNAを調べた。 PCR反応の後、2〜20p曽oleの二量体PCRD NAをTNET!l衝液中で100μlのストレプトアビジン複合化M−280 ダイナビーズ(7X10”ビーズ/ 111 )とインキュベートして、ビーズ にビオチニル化鎖を結合させた。結合後、ビーズを磁性的に固定化し、200μ lのTltETで3回洗い、次いで100μlのTNETに再懸濁させた。
ビオチニル化されていない鎖を除去するため、0.15NのNaOH500μl を加え、次いでこの懸濁物を20°Cで30分間インキュベートした。これらの ビーズを磁性的に固定化、そして0.15NのNaOH250μlで1回、50 0μlのTNETで3回洗い、次いで100μlのTNETに再懸濁させた。
検出プライマーであるオリゴヌクレオチドTGL30B (図6)を実施例4に 記述の通りにビーズ結合化PCR作製鋳型にアニールさせた。
更なる洗浄、伸長反応及び検出ア・ンセイも実施例4に記載の通りに実施した。
2種類のホモ接合個体、ESB164 (r^A」ゲッタイブ)及びEA201 4 (’BBJゲッタイブ)についてのラベル化プライマー伸長生成物のゲルオ ートラジオグラフィー分析を図7に示す。全ビーズ結合化放射性活性又はNaO H溶離の後のプライマー会合化放射活性のオートラジオグラフィー分析を、フィ ルタースポツティングアッセイを用いて、これらと同一の個体について示す(図 8)、プライマーのみの分析については、0.4NのNaOH10μlを10μ lのビーズ懸濁物に加えた。室温で10分間インキュベートした後、これらのビ ーズを磁性的に固定化し、そしてその上清液を抜き取り、次いでナイロンブロッ ティング膜の上にスポットした。
実施例6 遺伝ビット分析 DNAサンプル、ゲノムDNAを、血液を3倍過剰容量のACK溶解緩衝液(0 ,15Mの塩化アンモニウム、1mMの炭酸水素カリウム、O,b+MのEDT A )で希釈することによって行われる選択的溶解によって赤血球から富化せし めたヒト又はウマの抹消血液有核細胞より、SDS/プロティナーゼに手順(M aniatis、 T、のMo1ecular Cloning、 ALabo ratory Manual、 Co1d Spring Harbor La boratory Pres、 ColdSpring Harbor+ 19 89 )を利用して単離した。オリゴヌクレオチドはApplied Bios ystems+ Inc、 (Foster C1ty、 CA)モデル391  自動化DNA合成装置を利用し2面相ホスホラミジット化学により調製した。
遺伝ビット分析(GBA )反応において用いるプライマーの場合は、合成の最 終サイクルの後に脱トリメチル化を行わず、そして全長オリゴヌクレオチドはA pplied Biosystemsオリゴヌクレオチド精製カートリッジ(O PC’)を用い、その製造業者の推奨する通りに精製した。
はとんどのPCR反応については、プライマーは脱保護基反応物を乾かすことに よって直接利用した。5′アミノ基の誘導されたオリゴヌクレオチドは、App lied Biosystemsより購入したアミノリング2をその製造業者の 推奨に従って用いて調製した。
オリゴヌクレオチド配列、ウマ遺伝子座Jr185の第1周期増幅のためのプラ イマーは#91: 5’ CGTCTGCAGAATCCACTGGCTTCTTGAG 3’及び #92:5’ GCAGGATCCTGGAACTACTCATTTGCCT  3’ とした、ウマ遺伝子座の第2周期増幅は入れ子プライマー# 239 : 5’ TCAATACCTGAGTCCCGACACCCTG 3’及び#24 0:5’ AGGATGATGCTTTTGTGCAAAACAC3’を用いて 行った。
HLA DPAI 配列(Marsh、 S、G、[+、、 Bodmer、  J、G、 HLA C1ass IINucleotide 5equence s+ 1991. Hu+wan Immunol、 31:207−227) はプライマー#46’7: 5’ GCGGACCATGTGTCAACTTAT 3’及び#445:5’  GCCTGAGTGTGGTTGGAACTG 3’により得た。
鋳型の調製。ゲノム配列の増幅はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて実施 した(Saiki、 R,に、、 Ge1fand、 D、H,、5toffs l S、、 5charf。
Sj、、 Htguchi、 11.I Horn、 G、?、+ Mulli s+ K、B、+ Er1ich、 H,A、。
Primer Directed Enzymatic Amplificat ion of DNA with aThe++ostable DNA po lyverase、 5cience 239:487−491)、第1工程に おいて、1100nのゲノムDNAを、各第1周期プライマーを2μM/10− MのトリスpH8,3150g+MのにC1/1.5mMのMgC1g/ 0. 1%のゼラチン/μ、1当りTaq DNAポリメラーゼ(A*plitag、  Perkin Elwer(etus、 Norwalk、 CT) 0.0 5単位、の濃度で含む、反応混合物の中で用いた。反応物を集め、そして94℃ で1.5分、続いて94°C/1分を30サイクル、60℃/2分、72°C/ 3分インキュベートした。第2「非対称型J PCR(その中には第1反応の生 成物が1 /1000に希釈されである)において一本MDNAが調製された。
これらのプライマーのうちの1つは2μMの標準濃度で用い、そして他方は0. 08MMで用いた。これらの条件のもとで、反応中に一本鎖及び二本鎖の両方の 分子が合成された。
核酸の固相固定化、96穴プレート(Nunc Nunclonプレート、Ro skilde、 Denmart)においてGBA反応を行った。ウェル当り、 5′アミノ基を有する10Mmoleのプライマーを、3gMのリン酸ナトリウ ム緩衝液、pH6、20mMの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル )−カルボジイミド(EDC)の中で、室温で一夜インキュベートすることによ ってGBAプライマーをプレートに共有結合させた。
結合後、このプレートを10mMのトリスpH7,5/150mMのNaC1/  0.05%のツイーン20 (TNTw)で3回洗った。
ビオチニル化ddNTP、ビオチニル化ddNTPを米国特許第5,047,5 19号に従って合成した。
マイクロウェルプレート中でのGBA096穴プレートに共有結合したプライマ ーへの一本1[DNAのハイブリダイゼーシヨンを、等容量の3MのNaNaC l15(1のEDTAを第2周期非対称型PCRに付加し、次いで各ウェルを2 0μIのこの混合物と55°Cで30分間インキュベートすることによって行っ た。このプレートを次にTNTwで3回洗った。 ddNTP(3−Mづつ;そ のうちの1つはビオチニル化15醜HのDTT/ 7.5mMのイソクエン酸ナ トリウム15mMのMnC1g /μl当り0.04単位の改質化T7 DNA ポリメラーゼである)を含む20μmのポリメラーゼ伸長混合物を室温で5分イ ンキュベートした。ウェルを0.2NのNaOH50μlで室温で5分間インキ ュベートし、次いでウェルを更に0.2NのNaOH50μIで洗うことにより 鋳型鎖を除去した。このプレートを次にTXT−で3回洗った。ビオチニル化d dNTPの一体化を酵素結合化アッセイにより測定した。各ウェルを室温で30 分間振盪しながら20μlのストレプトアビジン−複合化西洋クサビペルオキシ ダーゼ(BRL、 Gaithersburg、 MDより購入した製品のTX T−における1/1000希釈物)とインキュベートした。 TNTwで5回洗 った後に、0.012%のHtOxを含む100ulの0−フェニレンジアミン (OPD。
0.1Mのクエン酸、pH4,5中でlng/ml)を各ウェルに加えた。結合 した酵素の量は、反応を停止させた後にプレートを撮影することにより、又はモ レキュラー デバイス モデルrVmaXJ 96穴分光光度計を用いて定量的 に決定した。
この手順の一般性を実証するため、2種類の異なる鋳型分子上にある3種類の異 なる部位を分類する能力を示す。図9〜11の中央には、これらの遺伝子座の多 形態領域を、DNAサンプルのゲッタイブのために用いたGBAプライマーの配 列と共に示す。試験DNAサンプルのゲッタイブは予め、制限分析及びゲル電気 泳動(ウマのサンプル)又は対遺伝子特異的ハイブリダイゼーシジン(ヒトのサ ンプル)を用いて決定しである。
図9〜11の上及び下は、これらの部位の非放射性GBA分析の写真である。「 プラス」1lj(これはHLA DPAIについての−RNAに相当するが、ウ マ遺伝子座JI185のために任意的に選択されている)の分析を図の上方に示 し、そして「マイナス」鎖の分析は下方の写真に示している。西洋ワサビペルオ キシダーゼ活性を用いて、ゲッタイブデーターを目視的に観察した0両鎖ともG BAのための適当な鋳型であるため、2種類の異なるプライマーを用いることに よりゲッタイブの確認を得ることが可能であった。HLA DPAI遺伝子座に ついては、2つの部位のバリエーションが分類された(図9と10)。同一性の 結果が得られた。ウマの遺伝子座JF185を包括する別の実験の分光光度定量 を図12に示す。獲得されたシグナル、対、不適切な塩基の一体化の平均比は6 2.2であった。
0.1!様 本発明を実施するための方法の一例は、好適な起源、例えば血液、上皮細胞、毛 髪又はその他の組織からDNA又はRNAのサンプルを獲得し、次いでポリメラ ーゼ連鎖反応転写ベース増幅(Kwohら、Proc。
Natl、 Acad、 Sci、 80:1173(1989)等を用いてイ ンビトロで核酸の特定の領域を増幅させることを包括する。増幅は、アフィニテ ィー基を有することにより改質された1又は複数のプライマーを用いながら、対 象の領域にフランクする特定のプライマーを用いて行われる(しかしながら任意 の一定の反応においては、かかるプライマーのうちの1種のみが一度に改質され うる)。好ましい改質は、プライマーの5′末端へのビオチン成分の連結である 。増幅サンプルのサンプル(典型的には0.5〜5 psole)を次に、この 増幅プライマー上の連結ビオチン成分を介してストレプトアビジン−複合磁性微 粒子(NtハDynal M−280’グイナビーズ」)に結合させる。この微 小球を含む水性懸濁物を十分にアルカリ性なpHに調整することによってこのD NAを変性させ、そしてビオチン−ストレプトアビジン結合を介してこの微小球 に結合した鎖を類似のアルカリ性条件のもとで洗うことにより相補鎖から分離さ せる。これを成し遂げるため、これらの微小球を遠心するか、又は磁場の適用に より固定化させる。
この微小球結合鎖を次に残りの操作において鋳型として用いた。
上記のようにして作り上げた鋳型類に、高緊縮アニーリング条件のもとて特異的 なブライマーオリゴヌクレオチドは結合した(このプライマーの配列は既知のD NA配列多形態のすぐ隣りの鋳型鎖上の部位への固有の結合性に合う)、好まし い配列及びプライマーに対する結合の態様は、このプライマーが鋳型と二量体を 形成し、従ってこのプライマーの3′末端のヌクレオチドがこの配列多形態にお ける第1ヌクレオチドの部位のすぐ隣りの鋳型ヌクレオチドと、その二量体が分 析されるべきどの多形態配列の重複を伴うことなくワトラン、クリック塩基対を 形成することを確実にする。このアレンジメントは、プライマーの鋳型依存性D NAポリメラーゼ触媒化伸長を介して付加された鋳型における多形態ヌクレオチ ド配列の隣のヌクレオチドが明確に決定されることをもたらす。
上記のプライマー二鋳型複合体を、鋳型依存性DNA合成に適合する塩、pH及 び温度の条件のもとで、適当なりNAポリメラーゼ及びこの鋳型における塩基と 特異的な塩基対合を形成することがわかっている4種類の異なる連鎖停止ヌクレ オチド類似体と接触させた。はとんどの場合、しかしながら必ずそうである必要 はないが、この鋳型及び連鎖停止類似体における塩基は一般的なヌクレオチド、 即ち、アデノシン、シトシン、グアニン又はイノシン、チミジン又はウリジンを 基礎とする。連鎖停止類似体の好ましい組は4種類のジデオキシヌクレオシド三 リン酸、ddATP、 ddCTP、 ddGTP及びddTTPであり、ここ でこの4MのddNTPそれぞれは異なる蛍光リポータ−基の連結によって改質 されている。これらの蛍光タグは分光学的に識別できる放射スペクトルを有する 特性が備っており、そしてどの場合もジデオキシヌクレオシドニリン酸の改質は 連鎖停止類似体をプライマー3′末端へのDNAポリメラーゼ触媒一体化にとっ て不適切なものにしないであろう、かかるプライマー:筏複合体を存するかかる 混合物におけるDNAポリメラーゼ触媒化連鎖伸長の結果は、プライマーの3′ 末端上への蛍光連鎖停止類似体の定量的、特異的、そして正確な一体化であり、 付加された特定の蛍光性ヌクレオチドは鋳型における多形態ヌクレオチドの配列 によってのみ示される。
磁性微粒子にまだ結合したままの蛍光物質を吊り下げたプライマー二鋳型の複合 体を次に、例えば磁性的に固定化されたビーズを適当な緩衝液の中で洗うことに より、一体化されていないヌクレオチドを含む反応混合物から分ける。更に、一 定の状況においては次にこのプライマーを固定化鋳型類からNaOHによって溶 離させ、溶離させたプライマーを別のメディウム又は容器に移し、その後一体化 されたターミネータ−の同一性を決定することが所望される0次いで連結された 蛍光基の同一性を、好ましくは適当な波長及び強さのレーザーにより供される光 をこの改質DNA鎖に当て、そして生ずる放射スペクトルを分光学的に分析する ことによって評価する。一般に、DNA配列におけるいづれかの一定の部位での 2つの対立遺伝子(二倍体)に関して、16通りの可能なホモ接合及びヘテロ接 合対合に対応して生ずる10通りの可能な正準(cononical)放射スペ クトルがある。測定したスペクトルと正準スペクトルのこのライブラリーとを適 当に合わせることにより、どの連鎖停止ヌクレオチドがプライマーの3′末端に 付加されたかを同定すること、それ故、鋳型における配列多形態の性質を同定す ることが可能となる。多重対立遺伝子系又は1:1以外の比率において存在して いる対立遺伝子により生ずるスペクトルも、寄与ヌクレオチドそれぞれの相対比 を同定及び評価するために適当な数学的処理によって解かれうる。
上記の工程は全て、自動化することのできる又はされている化学品、操作及びプ ロトコールを包括する。それ故、本発明の好ましい実施態様を適当にプログラム されたロボットワークステージ5ンに組み込むことは、生物学的サンプルに由来 する核酸における特定のヌクレオチド配列又は配列相違の検定に依存する事実上 全ての診断手順にとっての有意義な費用節約及び効率性の上昇をもたらすであろ う。
上記の方法のいくつかの特徴は本発明の好ましい態様を改善、且つ、構成する。
特に、好ましい態様である遺伝ビット分析(GBA )はより好都合な固相を提 供する。磁性微小球は効率的な洗浄及びその再懸濁のために注意を払って取扱わ れるべきである。従って、これらのビーズを利用する容量の高い自動化アッセイ をもくろむことは難しい、更に、それらの色は濃く、従って熱量又は蛍光アッセ イには適応しない。
GBA方法論は標準のポリスチレン96六マイクロプレートの利用も可能にする ために採用される。これらは臨床及び調査研究室において幅広く利用されている 。この形式に適応する、自動化系を含む数多くの液体操作系がある。これらは光 学シグナル検出法に適し、従って種々のタイプの光検出のための自動化プレート リーダーが有用となる。
GBAにとっての鋳型は常に対象の核酸サンプルに由来するであろう、これらの 核酸は感染因子を含むと予測されるサンプル、ゲッタイブを決定すべき個体、癌 を有すると予測される患者由来のサンプル等に由来しうる。伸長すべきバイブリ ド複合体の固定化パートナ−が鋳型なら、各核酸サンプルは固定化が可能となる ような方法で処理されるであろう、従って、マイクロプレートへのプライマーの 結合及びプレート結合化プライマーへの一本鎖鋳型分子のノ\イブリダイゼーシ ッンを可能とする方法がもくろまれる。このことは、RNAの直接分析を含む、 数多くの異なる方法において作られた一本鎖鋳型の利用を可能とする追加の特徴 を提供する。
放射活性法は不便であり、そして廃棄することが困難な廃棄物を生成する。従っ て、はとんどの商業的生化学検出系は非放射活性法に変えられている。ビオチン によりラベル化されたddNTPを用いることにより、GBAは様々な検出系、 例えば酵素結合型比色アッセイを利用して非放射活性的に実施されうる。
品質管理は臨床決定において用いられるように検査をデザインすることにとって の重要な問題である。 GBAは二本鎖分子に基づいて核酸配列自体を調べるた め、両方の鎖を独立に調べることによって相補性遺伝情報を得る機会がある0本 出麗人は、この手法がウマ及びヒト遺伝子変異体の両方を用いることにより可能 であることを示している。
記載の方法において、該鋳型は固相上にこの鋳型の固定化を可能とするように誘 導化されたプライマーを用いるPCHによって作られている。このプライマーが 固定されているときは鋳型の誘導化はもはや必要とされない。むしろ、他の標準 的なPCHにおいて均一でない温度のPCRを用いると、過剰な一本鎖分子又は その他が、どのプライマーが過剰であるかに依存して作り上げられることが可能 となる。これらはプレート結合化GBAプライマー分子へのハイブリダイゼーシ ョンのための好適な鋳型として働く。
FfG、IA FJG、18 FJG、IC工、増幅プライマー TGL 105: 5’−’11’l’CTTCTrGCATCTATGTrC G−3雪TGL106: 5’−TrAAGCACCACCACAGGTCCT −3’工工、 多形態検出プライマー TGLlB2= 5l−GCCTTGGCGTTGT^賜−3−TGL 166 : 5雪−AGAGAAACAAT!TCAAG−3會工I工、標的配列 工V、 多形態 FIGlfRE 2 A3CD 勤 ” 8:TGL 182/ ψ −−− C: TGL 166/ D : TGL 166/ ρ814 FIG、3 鋳型 ラベル化ddNTP FfG、4 個体 個体 FfG、7 GBA : HLA DPA 1 aa 31FfG、9 GBA: HLA DPA1aa50 FIG、10 /′+111++−二;・:仁ヱ1 、°、°^=ロ ロ ロ ロ ロ ロ ロ Co LOw C’)へ− 国際調査報告 フロントページの続き (81)指定1] EP(AT、 BE、 CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IT、LU、MC,NL、SE)、AU、CA 、FI、JP、N。
(72)発明者 アンダーラン、ステイーブンアメリカ合衆国、ニューシャーシ ー 08540 、プリンストン、スプリングゾールロード 158

Claims (59)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.水性担体と、核酸依存性プライマー伸長反応の少なくとも2種頬の異なるタ ーミネーターの混合物とを含んで成り、各ターミネーターは鋳型におけるこのプ ライマーの3′末端のすぐ隣りの、且つ、その下流の、対をなしていないヌクレ オチド塩基の同一性に厳重に依存する状況において伸長反応を特異的に停止する ことが可能であり、そしてこれらのターミネーターのうちの少なくとも1種は検 出マーカーによってラベルされている試薬組成物。
  2. 2.前記試薬が4種類の異なるターミネーターを含んで成る請求項1に記載の試 薬。
  3. 3.2種頬のターミネーターがそれぞれ別々の検出マーカーによってラベルされ ている請求項2に記載の試薬。
  4. 4.3種類のターミネーターがそれぞれ別々の検出マーカーによってラベルされ ている請求項2に記載の試薬。
  5. 5.4種類のターミネーターがそれぞれ別々の検出マーカーによってラベルされ ている請求項2に記載の試薬。
  6. 6.前記(複数の)ターミネーターがヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含 んで成る、請求項1〜5のいづれか1項に記載の試薬。
  7. 7.前記(複数の)ターミネーターがジデオキシヌクレオチドを含んで成る、請 求項6に記載の試薬。
  8. 8.前記(複数の)ターミネーターがアラビノシド三リン酸を含んで成る、請求 項6に記載の試薬。
  9. 9.前記(複数の)ターミネーターがddATP,ddCTP,ddGTP又は ddTTPのうちの1又は後数種を含んで成る、請求項7に記載の試薬。
  10. 10.別々の検出マーカーそれぞれがアイソトープ性ラベル化成分、発色団、蛍 光団、タンパク質成分、又はアイソトープ性ラペル化成分、発色団、蛍光団もし くはタンパク質成分が連結されうる成分である、請求項1〜5のいづれか1項に 記載の試薬。
  11. 11.別々の検出マーカーそれぞれが別々の蛍光団である、請求項10に記載の 試薬。
  12. 12.前記試薬がピロホスファターゼを更に含んで成る、請求項1〜5のいづれ か1項に記載の試薬。
  13. 13.対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定する 方法であって: (a)対象の核酸が二本鎖であるなら、かかる核酸を含むサンプルを処理せしめ て特定の位置にわたって対をなしていないヌクレオチド塩基を獲得するか、また は対象の核酸が一本鎖であるなら工程(b)を直接採用し; (b)工程(a)由来のサンプルをハイブリダイゼーシヨン条件のもとで、対象 の核酸において存在している同定すべきヌクレオチド塩基のすぐ隣りのヌクレオ チド塩基の鎖とハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドプライマー と接触させて前記プライマーと対象の核酸との二量体を形成せしめ、従って同定 すべきヌクレオチド塩基は前記二量体における前記プライマーの3′末端のすぐ 隣りにあるこの鋳型における第1の対をなしていない塩基となり;(c)工程( b)由来の二量体を請求項5に記載の試薬と下記の条件、即ち、前記試薬の中に 存在している相補性ターミネーターと同定すべきヌクレオチド塩基との塩基対合 を可能とし、且つ、前記プライマーの3′末端にて前記ターミネーターが一体化 されるよう鋳型依存性プライマー伸長反応が起こることを可能とする条件のもと で接触させ(目的の結果は、このプライマーが1種類のターミネーターによって 伸長されることにある);そして(d)工程(c)由来の伸長化プライマーの3 ′末端にて存在している検出マーカーの同一性を決定し、それにより対象の核酸 における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定すること、を含んで成 る方法。
  14. 14.対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定する 方法であって: (a)対象の核酸が二本鎖であるなら、かかる核酸を含むサンプルを処理せしめ て特定の位置にわたって対をなしていないヌクレオチド塩基を獲得するか、また は対象の核酸が一本鎖であるなら工程(b)を直接採用し; (b)工程(a)由来のサンプルをハイブリダイゼーション条件のもとで、対象 の核酸において存在している同定すべきヌクレオチド塩基のすぐ隣りのヌクレオ チド塩基の鎖とハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドプライマー と接触させて前記プライマーと対象の核酸との二量体を形成せしめ、従って同定 すべきヌクレオチド塩基は前記二量体における前記プライマーの3′末端のすぐ 隣りにあるこの鋳型における第1の対をなしていない塩基となり;(c)工程( b)由来の二量体を請求項2に記載の試薬(ここで前記ターミネーターのうちの 1種のみが検出マーカーを有している)と下記の条件、即ち、前記試薬の中に存 在している相補性ターミネーターと同定すべきヌクレオチド塩基との塩基対合を 可能とし、且つ、前記プライマーの3′末端にて前記ターミネーターが一体化さ れるよう鋳型依存性プライマー伸長反応が起こることを可能とする条件のもとで 接触させ(目的の結果は、このプライマーが1種類のターミネーターによって伸 長されることにある);そして(d)工程(c)を更に3回操り返し(ここでこ の4通りの平行反応工程それぞれにおいて、4種のターミネーターのうちの1種 類づつがラベルされている);そして (e)この4通りの平行鋳型依存性プライマー伸長反応の生成物のうちのいづれ が前記プライマーの3′未端にて存在している検出マーカーを有しているかを決 定して、対象の核酸における特定の位置でのヌクレオチド塩基の同一性を決定す ること;を含んで成る方法。
  15. 15.核酸のサンプル中の特定のヌクレオチド配列の有無を決定するための方法 であって: (a)核酸のサンプルが二本鎖の核酸を含むなら、かかる核酸のサンプルを処理 せしめて一本鎖の核酸を獲得するか、又は核酸のサンプルが一本鎖の核酸のみを 含むならば工程(b)を直接採用し;(b)工程(a)由来のサンプルをハイブ リダイゼーション条件のもとで、特定のヌクレオチド配列が存在しているならば その特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることの可能なオリゴヌクレオ チドプライマーと接触させて前記プライマーとこの特定のヌクレオチド配列との 二量体を形成せしめ;(c)存在しているならば工程(b)由来の二量体を請求 項5に記載の試薬と下記の条件、即ち、前記試薬の中に存在している相補性ター ミネーターと前記プライマーの3′末端のすぐ下流にある対をなしていない鋳型 のヌクレオチド塩基との塩基対合を可能とし(このプライマーはこの鋳型におけ る前記の特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズしている)、且つ、前記プラ イマーの3′末端にてターミネーターが一体化されるよう鋳型依存性プライマー 伸長反応が起こることを可能とする条件のもとで接触させ;そして(d)工程( c)由来のプライマーの3′未端での検出マーカーの有無及び同一性を決定して 、核酸のサンプル中の前記の特定のヌクレオチド配列の有無を決定すること;を 含んで成る方法。
  16. 16.核酸のサンプル中の特定のヌクレオチド配列の有無を決定するための方法 であって: (a)核酸のサンプルが二木鎖の核酸を含むなら、かかる核酸のサンプルを処理 せしめて一本鎖の核酸を獲得するか、又は核酸のサンプルが一本鎖の核酸のみを 含むならば工程(b)を直接採用し;(b)工程(a)由来のサンプルをハイブ リダイゼーシヨン条件のもとで、特定のヌクレオチド配列が存在しているならば その特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることの可能なオリゴヌクレオ チドプライマーと接触させて前記プライマーとこの特定のヌクレオチド配列との 二量体を形成せしめ;(c)存在しているならば工程(b)由来の二量体を請求 項2(ここで前記ターミネーターのうちの1種のみが検出マーカーを有している )に記載の試薬と下記の条件、即ち、前記試薬の中に存在している相補性ターミ ネーターと前記プライマーの3′末端のすぐ下流にある対をなしていない鋳型の ヌクレオチド塩基との塩基対合を可能とし(このプライマーはこの鋳型における 前記の特定のヌクレオチド配列とハイプリダイズしている)、且つ、前記プライ マーの3′末端にてターミネーターが一体化されるよう鋳型依存性プライマー伸 長反応が起こることを可能とする条件のもとで接触させ;そして (d)工程(c)を更に3回操り返し(ここでこの4通りの平行反応工程それぞ れにおいて、4種のターミネーターのうちの一種類づつがラベルされている); そして (e)この4通りの平行鋳型依存性プライマー伸長反応の生成物におけるプライ マーの3′末端での検出マーカーの有無及び同一性を決定して、この核酸のサン プル中の前記の特定のヌクレオチド配列の有無を決定すること; を含んで成る方法。
  17. 17.核酸を含んで成るサンプルを分類する方法であって、1又は複数の特定の 位置それぞれにて存在しているヌクレオチド塩基又は複数の塩基を同定すること を含んで成り、かかるヌクレオチド塩基はそれぞれ、請求項13又は14に記載 の方法を用いて同定され、そしてかかる特定の位置それぞれは異なるプライマー を用いて決定される方法。
  18. 18.各位置での各ヌクレオチド塩基又は複数の塩基の同一性を独立して決定す るか、又は種々の位置での複数のヌクレオチド塩基の同一性を同時に決定する、 請求項17に記載の方法。
  19. 19.核酸を含むサンプルを分類する方法であって、1又は複数のヌクレオチド 配列の有無を決定することを含んで成り、かかるヌクレオチド配列それぞれは請 求項15又は16に記載の方法によって決定される方法。
  20. 20.核酸を含むサンプルを分類する方法であって:(a)1又は複数の特定の ヌクレオチド配列の有無を決定し(ここでかかるヌクレオチド配列それぞれの有 無は請求項15又は16に記載の方法によって決定される)、そして(b)1又 は複数の特定の位置に存在しているヌクレオチド塩基又は複数の塩基を同定する (ここでかかるヌクレオチド塩基それぞれは、請求項13又は14に記載の方法 を用いて同定され、そしてかかる特定の位置は別々のプライマーを用いて決定さ れる)、ことを含んで成る方法。
  21. 21.核酸を含むサンプル中の種々の対立遺伝子を同定するための方法であって 、1又は複数の特定の位置それぞれに存在しているヌクレオチド塩基又は複数の 塩基を同定することを含んで成り、かかるヌクレオチド塩基それぞれは請求項1 3又は14に記載の方法によって同定する方法。
  22. 22.1又は複数の特定の遺伝子座での生物のゲノタイプを決定するための方法 であって: (a)ゲノムDNAを含むサンプルを生物から獲得し;そして(b)対象の核酸 における1又は複数の特定の位置それぞれにて存在しているヌクレオチド塩基又 は複数の塩基を同定して(ここでかかる塩基又は複数の塩基は請求項13又は1 4に記載の方法を用いて同定される)、種々の対立遺伝子を同定する、即ち、1 又は複数の特定の遺伝子座での生物のゲノタイプを決定すること、を含んで成る 方法。
  23. 23.工程(c)における鋳型依存性プライマー伸長反応を起こす条件をある程 度、適当な鋳型依存性酵素の存在により作り上げる、請求項13又は14に記載 の方法。
  24. 24.前記鋳型依存性酵素がE.コリDNAポリメラーゼIもしくはその「クレ ノウフラグメント」、T4DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ(「 シーケナーゼ」)、T.アクアテイカスDNAポリメラーゼ、レトロウイルス逆 転写酵素、又はそれらの組合せである、請求項23に記載の方法。
  25. 25.対象の核酸がデオキシリボ核酸、リボ核酸、又はデオキシリボ核酸とリボ 核酸との共重合体である、請求項13又は14に記載の方法。
  26. 26.前記プライマーがオリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオ チド、又はデオキシリボ核酸とリボ核酸との共重合体である、請求項13又は1 4に記載の方法。
  27. 27.前記鋳型がデオキシリボ核酸であり、前記プライマーがオリゴデオキシリ ボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチドとリ ボヌクレオチドとの共重合体であり、そして前記鋳型依存性酸素がDNAポリメ ラーゼである、請求項13又は14に記載の方法。
  28. 28.前記鋳型がリボ核酸であり、前記プライマーがオリゴデオキシリボヌクレ オチド、オリゴリボヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレ オチドとの共重合体であり、そして前記鋳型依存性酵素が逆転写酸素である、請 求項13又は14に記載の方法。
  29. 29.前記鋳型がデオキシリボ核酸であり、前記プライマーがオリゴリボヌクレ オチドであり、そして前記酵素がRNAポリメラーゼである請求項13又は14 に記載の方法。
  30. 30.前記鋳型がリボ核酸であり、前記プライマーがオリゴリボヌクレオチドで あり、そして前記酸素がRNAレプリカーゼである請求項13又は14に記載の 方法。
  31. 31.工程(c)におけるプライマー伸長反応の前に、前記鋳型に、この鋳型の 3′未端にてターミネーターを付加することによってキュツプを付し、ここで前 記ターミネーターは鋳型依存性プライマー伸長反応を停止せしめることのできる 、請求項13又は14に記載の方法。
  32. 32.前記ターミネーターがジデオキシヌクレオチドである、請求項31に記載 の方法。
  33. 33.対置の核酸がインビボで酸素的に合成、インビトロで酵素的に合成、又は 非酵素的に合成されたものである、請求項13又は14に記載の方法。
  34. 34.前記オリゴヌクレオチドプライマーがインビボで酵素的に合成、インビト ロで酵素的に合成、又は非酵素的に合成されたものである請求項13又は14に 記載の方法。
  35. 35.前記オリゴヌクレオチドプライマーが、一体化されていない試薬及び/又 は対象の核酸からこのプライマーのアフィニティー分離を可能とする1又は複数 の成分を含んで成る、請求項13又は14に記載の方法。
  36. 36.固相に結合しているストレプトアビジンに対するビオチンの結合性を介し て、一体化されていない試薬及び/又は対象の核酸からオリゴヌクレオチドプラ イマーをアフィニティー分離させることを可能とするビオチンを前記プライマー が含んで成る、請求項35に記載の方法。
  37. 37.固相に結合している核酸において存在している相補性配列に対する塩基対 合を介して、一体化されていない試薬及び/又は対象の核酸からオリゴヌクレオ チドプライマーをアフィニティー分離させることを可能とするDNA配列を前記 プライマーが含んで成る、請求項13又は14に記載の方法。
  38. 38.対象の核酸が、一体化されていない試薬及び/又はプライマーからの対象 の核酸のアフィニティー分離を可能とする1又は複数の成分を含んで成ろ、請求 項13又は14に記載の方法。
  39. 39.固相に結合しているストレプトアビジンに対するビオチンの結合性を介し て、一体化されていない試薬及び/又はプライマーから対象の核酸をアフィニテ ィー分離させることを可能とするビオチンを前記対象の核酸が含んで成る、請求 項38に記載の方法。
  40. 40.固相に結合している核酸において存在している相補性配列に対する塩基結 合を介して、一体化されていない試薬及び/又はプライマーから対象の核酸をア フィニティー分離させることを可能とするDNA配列を前記対象の核酸が含んで 成る、請求項13又は14に記載の方法。
  41. 41.前記オリゴヌクレオチドプライマーが検出マーカーによってラベルされて いる、請求項13又は14に記載の方法。
  42. 42.前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記試薬中に存在しているか、又 は対象の核酸に結合しているどの検出マーカーとも異なる、請求項41に記載の 方法。
  43. 43.前記対象の核該が検出マーカーによってラベルされている、請求項13又 は14に記載の方法。
  44. 44.前記対象の核酸が、前記試薬中に存在しているか、又は対象の核酸に結合 しているどの検出マーカーとも異なる、請求項43に記載の方法。
  45. 45.前記対象の核酸が天然でないヌクレオチド類似体である、請求項13又は 14に記載の方法。
  46. 46.前記の天然でないヌクレオチド類似体がデオキシイノシン又は7−デアザ −2′−デオキシグアノシンを含んで成る、請求項45に記載の方法。
  47. 47.前記対象の核酸がポリメラーゼ連鎖反応によって合成される、請求項13 又は14に記載の方法。
  48. 48.前記サンプルが、生物に由来するゲノムDNA、そのRNA転写体、又は そのRNA転写体より作られたcDNAを含んで成る請求項13又は14に記載 の方法。
  49. 49.前記サンプルが生物に由来するゲノム外DNA、そのRNA転写体、又は そのRNA転写体より作られたcDNAを含んで成る請求項13又は14に記載 の方法。
  50. 50.前記プライマーが、同定すべき塩基のすぐ隣りの既知の塩基配列と実質的 相違性である、請求項13又は14に記載の方法。
  51. 51.前記プライマーが、同定すべき塩基のすぐ隣りの既知の塩基配列と完全に 相補性である、請求項13又は14に記載の方法。
  52. 52.適当な変性条件を利用することにより、工程(c)におけるプライマー伸 長反応の後に対象の核酸から前記プライマーを分離させる、請求項13又は14 に記載の方法。
  53. 53.前記変性条件が熱、アルカリ、ホルムアミド、尿素、グリオキサル、酵素 及びそれらの組合せを含んで成る、請求項52に記載の方法。
  54. 54.前記変性条件が0.2NのNaOHによる処理を含んで成る、請求項53 に記載の方法。
  55. 55.前記生物が植物、微生物、ウィルス又は烏類である、請求項48に記載の 方法。
  56. 56.前記生物が脊椎動物又は無脊椎動物である、請求項48に記載の方法。
  57. 57.前記生物が哺乳動物である、請求項48に記載の方法。
  58. 58.前記哺乳動物が人類である、請求項57に記載の方法。
  59. 59.前記哺乳動物が馬、犬、牛、猫、豚又は羊である、請求項57に記載の方 法。
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