JP3897805B2 - 核酸の増幅法およびこれを利用した変異核酸の検出法 - Google Patents
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Description
本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願2003−431003号(出願日:2003年12月25日)および特願2004−313910号(出願日:2004年10月28日)に基づく優先権の主張を伴うものである。これらの先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
本発明は、遺伝子工学分野において有用な核酸配列の増幅法に関するものであり、より詳細には、鎖置換反応を利用した核酸配列の増幅法、ならびにこれらの方法を利用した変異検出法に関するものである。
本発明者らは、鎖置換反応を利用した核酸の増幅法において、標的核酸が増幅された場合にのみステム−ループ形成可能なプライマーを特定の条件を満たすように設計し、このプライマーと5’末端部分に折返し配列を有するプライマーとを組み合わせて用いることにより、特異的かつ効率的に標的核酸を増幅できることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
本発明におけるプライマーセットは、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるものである。該プライマーセットに含まれる第一のプライマーは、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac’)を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B’)を前記配列(Ac’)の5’側に含んでなるものである。また、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーは、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc’)を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D-Dc’)を前記配列(Cc’)の5’側に含んでなるものである。
(a)核酸試料を用意する工程;
(b)変異に係る部位を含む標的核酸配列を増幅しうる前記本発明のプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも1種のプライマーが、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセットを用意する工程;および
(c)ミスマッチ識別能を有する物質の存在下において、前記核酸試料を鋳型とする前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなるものである。
(a)核酸試料を用意する工程;
(b)変異に係る部位を含む標的核酸配列を増幅しうる前記本発明のプライマーセットを用意する工程;
(c)標的核酸配列にハイブリダイズする核酸断片であって、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されてなる、核酸断片を用意する工程;および
(d)ミスマッチ識別能を有する物質および前記核酸断片の存在下において、前記核酸試料を鋳型とする前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなるものである。
本例では、鋳型としてHuman Genomic DNA(Clontech社製)を使用して、その中に含まれるヒトSTS DYS237遺伝子中の標的核酸配列の増幅を行なった。プライマーとしては、下記の配列を有するプライマーペアを用いた。また、テンプレートに対する各プライマー領域の位置関係は図4(配列番号6)に示す通りとした。フォワードプライマーF1は、その3’末端側にある配列(22mer:下線部)が鋳型にアニーリングし、5’末端側にある配列(16mer:下線部以外)がその領域内で折り畳まれて図2に示す構造をとるように設計されている。リバースプライマーR1は、その3’末端側にある配列(20mer:下線部)が鋳型にアニーリングし、伸長反応の後、5’末端側にある配列(10mer:下線部以外)が、そのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの3’末端残基の16塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。
F1:GGATATATATATATCCACTGAACAAATGCCACATAAAG(配列番号1);
R1:GCAGCATCACCAACCCAAAAGCACTGAGTA(配列番号2)。
例1で得られた増幅産物が、標的核酸配列に由来するものであることを示すため、該増幅産物の制限酵素消化を行った。具体的には、例1により得られる増幅反応後の反応液0.3μLを用いて、制限酵素MboIIによる消化(37℃にて3時間)を行なった。
増幅反応溶液に融解温度調整剤を添加し、増幅効率に対するその効果を検討した。例1と同様に、鋳型としてHuman DNA(Clontech社製)を使用してヒトSTS DYS237遺伝子中の標的核酸配列の増幅を行なった。増幅反応溶液の組成は、融解温度調整剤として最終濃度0%、2%、5%、または10%のDMSOを添加する以外は、例1と同様である。また、反応条件や反応後の電気泳動条件は、例1に記載したものと同様である。
本例では、本発明によるプライマーセットを用いた一塩基変異の検出を行なった。まず、一塩基変異のモデルを作製するため、ヒトSTS DYS237遺伝子中の特定の領域において一塩基変異を含むような長鎖合成オリゴヌクレオチドと、一塩基変異を含まない長鎖合成オリゴヌクレオチドとを合成した。さらに、これら長鎖合成オリゴヌクレオチドをPCR法でそれぞれ増幅し、一塩基変異を含まない野生型DNAと一塩基変異を含む変異型DNAの増幅産物を得た。これら増幅産物を、配列決定して変異部分のヌクレオチド残基を確認した後、テンプレートとして以下の実験に使用した。これら増幅産物のヌクレオチド配列を図8(配列番号7および配列番号8)に示す。図8から明らかなように、野生型DNAではC残基である矢印の残基が、変異型DNAではG残基に置換されている。
F1:GGATATATATATATCCACTGAACAAATGCCACATAAAG(配列番号1);
R1:GCAGCATCACCAACCCAAAAGCACTGAGTA(配列番号2)。
変異型DNA検出用プライマーペア:
F1:GGATATATATATATCCACTGAACAAATGCCACATAAAG(配列番号1);
R1G:GCAGGATCACCAACCCAAAAGCACTGAGTA(配列番号3)。
例1において使用したプライマーペアに加えて、第三のプライマーを使用する核酸増幅反応を行なった。第三のプライマーとしては、以下の配列を有する2種のプライマーを用いた。これら第三のプライマーは、前記プライマーペアにより増幅される標的核酸配列上の、該プライマーペアとは異なる位置にアニ−リングするように設計されている。テンプレートに対する各プライマー領域の位置関係は図10(配列番号6)に示す通りとした。
プライマー3F:TAAGAACTCGCTTTATAC(配列番号4);
プライマー3R:TCTTCAACAGTCATTACC(配列番号5)。
鋳型として100ng、10ng、1ng、または0ngのHuman Genomic DNA(Clontech社製)を含み、第三のプライマーとして800nMのプライマー3F(配列番号4)を含むことを除き、例1と同様に反応溶液を調製した。この反応溶液を、60℃で20分間、40分間、または60分間インキュベートした。
本例では、鋳型としてHuman Genomic DNA(Clontech社製)を使用して、アルデヒドデヒドロゲナーゼ−2遺伝子(ALDH2遺伝子)のエクソン12中に存在する一塩基変異の検出を行なった。なお、鋳型とする上記DNAは、野生型ALDH2遺伝子を含むものである。
ALDH2F:TTTATATATATATAAACCGGGAGTTGGGCGAG(配列番号10);
ALDH2R:CGAGTACGGGCCCACACTCACAGTTTTCAC(配列番号11);
ALDH2OF:ACAAGATGTCGGGGAGTG(配列番号12);
ALDH2OR:CCTGAGCCCCCAGCAGGT(配列番号13);
ALDH2SNPg:GCAGGCATACACTGA(配列番号14);
ALDH2SNPa:GCAGGCATACACTAA(配列番号15)。
Claims (53)
- 標的核酸配列を増幅しうる少なくとも二種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の3’末端部分の配列(A)にハイブリダイズする配列(Ac’)を3’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列(A)よりも5’側に存在する配列(B)の相補配列(Bc)にハイブリダイズする配列(B’)を前記配列(Ac’)の5’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の3’末端部分の配列(C)にハイブリダイズする配列(Cc’)を3’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする2つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列(D−Dc’)を前記配列(Cc’)の5’側に含んでなるものである、プライマーセット。 - さらに、第三のプライマーを含み、前記第三のプライマーは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズし、かつ標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないプライマーであり、前記第三のプライマーは、前記第一のプライマーまたは第二のプライマーの増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的核酸配列にアニーリングすることができ、これにより前記増幅産物中の標的核酸配列に新たな相補鎖合成起点が提供されるプライマーである、請求項1記載のプライマーセット。
- 前記第一のプライマーにおいて、前記配列(Ac’)と前記配列(B’)との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列(Ac’)の塩基数をXとし、標的核酸配列中における前記配列(A)と前記配列(B)に挟まれた領域の塩基数をYとしたときに、(X−Y)/Xが−1.00〜1.00の範囲にあり、プライマー中において前記配列(Ac’)と前記配列(B’)との間に介在配列が存在する場合には、XおよびYを前記の通りとし、該介在配列の塩基数をY’としたときに、{X−(Y−Y’)}/Xが−1.00〜1.00の範囲にある、請求項1または2に記載のプライマーセット。
- 前記第二のプライマーにおいて、前記折返し配列(D−Dc’)が2〜1000ヌクレオチド長である、請求項1から3のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 前記プライマーセットに含まれる少なくとも1種のプライマーが、固相担体または固相担体と結合可能な部位を有するものである、請求項1から4のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 固相担体が、水不溶性有機高分子担体、水不溶性無機高分子担体、合成高分子担体、相転移性担体、金属コロイドおよび磁性粒子からなる群から選択されるものである、請求項5に記載のプライマーセット。
- 固相担体と結合可能な部位が、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗原、抗体、リガンド、レセプター、核酸およびタンパク質からなる群から選択されるものである、請求項5または6に記載のプライマーセット。
- 鋳型核酸中の標的核酸配列を増幅する方法であって、
(a)標的核酸配列を含む鋳型核酸を用意する工程、
(b)請求項1〜7のいずれか一項に記載のプライマーセットを用意する工程、および
(c)前記鋳型核酸の存在下において、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。 - 核酸増幅反応が等温で行われる、請求項8に記載の方法。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項8または9に記載の方法。
- 核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が酵素安定化剤の存在下で行われる、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、
(a)核酸試料を用意する工程、
(b)請求項1〜7のいずれか一項に記載のプライマーセットであって、前記変異を有するか、または該変異を有さない核酸配列を標的核酸配列とし、該変異に係るヌクレオチド残基が配列(A)、配列(B)または配列(C)に含まれるように設計されたプライマーセットを用意する工程、および
(c)前記核酸試料の存在下において、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。 - 核酸増幅反応が、ミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項13記載の方法。
- ミスマッチ結合タンパク質が、MutS、MSH2もしくはMSH6、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項14記載の方法。
- 核酸増幅反応が等温で行われる、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項13から16のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項13から17のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が酵素安定化剤の存在下で行われる、請求項13から18のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸試料中の核酸配列における配列の欠失または挿入の有無を判定する方法であって、
(a)核酸試料を用意する工程、
(b)請求項1〜7のいずれか一項に記載のプライマーセットであって、欠失または挿入に係る配列を含むか、または該配列を含まない核酸配列を標的核酸配列とし、欠失または挿入に係る部位が、配列(A)、配列(B)もしくは配列(C)に含まれるか、または配列(A)と配列(B)との間もしくは配列(A)と配列(C)との間に配置されるように設計されたプライマーセットを用意する工程、および
(c)前記核酸試料の存在下において、前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。 - 工程(b)において、欠失または挿入に係る部位が前記配列(A)と前記配列(B)との間に配置されるように設計されたプライマーセットが用意される、請求項20に記載の方法。
- 欠失または挿入に係る配列が、ゲノム上の遺伝子に含まれるイントロン配列である、請求項20または21に記載の方法。
- 標的核酸配列がmRNAである、請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が等温で行われる、請求項20から23のいずれか一項に記載の方法。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項20から24のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項20から25のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が酵素安定化剤の存在下で行われる、請求項20から26のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、
(a)核酸試料を用意する工程、
(b)変異に係る部位を含む標的核酸配列を増幅しうる請求項1から7のいずれか一項に記載のプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも1種のプライマーが、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセットを用意する工程、および
(c)ミスマッチ結合タンパク質の存在下において、前記核酸試料を鋳型とする前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。 - 前記プライマーセットが前記標的核酸配列を等温下で増幅しうるものであり、核酸増幅反応が等温で行われる、請求項28に記載の方法。
- ミスマッチ結合タンパク質が、MutS、MSH2もしくはMSH6、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項28または29に記載の方法。
- 第一のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって、前記配列(A)と前記配列(Ac’)との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたもの、または、前記変異の存在または不存在によって、前記配列(Bc)と前記配列(B’)との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、請求項28から30のいずれか一項に記載の方法。
- 第二のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって、前記配列(C)と前記配列(Cc’)との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、請求項28から30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーセットが、請求項2記載のプライマーセットであって、第三のプライマーが、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、請求項28から30のいずれか一項に記載の方法。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項28から33のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項28から34のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が酵素安定化剤の存在下で行われる、請求項28から35のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するためのキットであって、
(a)ミスマッチ結合タンパク質、および
(b)変異に係る部位を含む標的核酸配列を増幅しうる請求項1から7のいずれか一項に記載のプライマーセットであって、該プライマーセットに含まれる少なくとも1種のプライマーが、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、プライマーセット
を含んでなる、キット。 - 前記プライマーセットが前記標的核酸配列を等温下で増幅しうるものである、請求項37に記載のキット。
- ミスマッチ結合タンパク質が、MutS、MSH2もしくはMSH6、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項37または38に記載のキット。
- 第一のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって、前記配列(A)と前記配列(Ac’)との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたもの、または、前記変異の存在または不存在によって、前記配列(Bc)と前記配列(B’)との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、請求項37から39のいずれか一項に記載のキット。
- 第二のプライマーが、前記変異の存在または不存在によって、前記配列(C)と前記配列(Cc’)との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、請求項37から39のいずれか一項に記載のキット。
- プライマーセットが請求項2記載のプライマーセットであり、第三のプライマーが、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されたものである、請求項37から39のいずれか一項に記載のキット。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項37から42のいずれか一項に記載のキット。
- 核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定する方法であって、
(a)核酸試料を用意する工程、
(b)変異に係る部位を含む標的核酸配列を増幅しうる請求項1から7のいずれか一項に記載のプライマーセットを用意する工程、
(c)標的核酸配列にハイブリダイズする核酸断片であって、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されてなる、核酸断片を用意する工程、および
(d)ミスマッチ結合タンパク質および前記核酸断片の存在下において、前記核酸試料を鋳型とする前記プライマーセットによる核酸増幅反応を行う工程
を含んでなる、方法。 - 前記プライマーセットが標的核酸配列を等温下で増幅しうるものであり、核酸増幅反応が等温で行なわれる、請求項44に記載の方法。
- ミスマッチ結合タンパク質が、MutS、MSH2もしくはMSH6、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項44または45に記載の方法。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項44から46のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項44から47のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸増幅反応が酵素安定化剤の存在下で行われる、請求項44から48のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸試料中の核酸配列における変異の有無を判定するためのキットであって、
(a)ミスマッチ結合タンパク質、
(b)変異に係る部位を含む標的核酸配列を増幅しうる請求項1から7のいずれか一項に記載のプライマーセット、および
(c)標的核酸配列にハイブリダイズする核酸断片であって、前記核酸試料中の核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズしたときに、前記変異の存在または不存在によって前記核酸配列またはその相補配列との間で1以上のミスマッチを生じるように設計されてなる、核酸断片
を含んでなる、キット。 - 前記プライマーセットが前記標的核酸配列を等温下で増幅しうるものである、請求項50に記載のキット。
- ミスマッチ結合タンパク質が、MutS、MSH2もしくはMSH6、またはこれらの2種以上の混合物である、請求項50または51に記載のキット。
- 鎖置換能を有するポリメラーゼをさらに含んでなる、請求項50から52のいずれか一項に記載のキット。
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